Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

ОСМАНОВА СУВАР ОМАРОВНА

ВЛИЯНИЕ ИМБАЛАНСА АМИНОКИСЛОТ И ПРОТЕИНА В РАЦИОНАХ НА БЕЛКОВЫЙ ОБМЕН И ПОТРЕБНОСТЬ ПОРОСЯТ В ЛИЗИНЕ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Дубровицы - 2012

Работа выполнена на кафедре биохимии ГОУ ВПО Дагестанская государственная медицинская академия

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор   Нагиев Эйзудин Рамазанович

Официальные оппоненты: Нарижный Александр Григорьевич доктор биологических наук,  профессор ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии заведующий лабораторией биологии воспроизведения и искусственного осеменения свиней Епифанов Виктор Геннадьевич доктор биологических наук, ФГБОУ ВПО РГАУ-МСХА им. К. А. Тимирязева, профессор кафедры кормления животных Ведущая организация:  Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина Защита состоится л_03_ __июля_ 2012 г. в  10-00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук. Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы, ГНУ ВИЖ, тел./факс (4967) 65-11-01. www.vij.ru. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии. Автореферат разослан л_31_  __мая___ 2012 г. Ученый секретарь Совета Д 006.013.03                                         И.В. Гусев

1.Введение.

1.1.

Актуальность работы.

Основным кормом для свиней является зерно злаковых культур, которое характеризуется низким уровнем протеина и незаменимых аминокислот - лизина, метионина, треонина, триптофана и изолейцина.

Между аминокислотами и другими биологически активными веществами в организме существует тесная взаимосвязь, в частности, между нуклеиновыми кислотами и аминокислотами имеется прямая зависимость.

Добавки лизина к рациону, дефицитному по этой аминокислоте, приводит к  ускорению роста, улучшению общего состояния, повышению аппетита, укреплению костей и улучшению функций различных органов. Однако, в случае передозировки лизина, возникают нежелательные последствия, вызывающие в организме дисбаланс аминокислот, который при высоких дозах приводит к нарушению обмена веществ, ухудшению физиологического состояния и в результате к снижению интенсивности роста.

В последние годы балансирование протеинового и аминокислотного питания в отраслях интенсивного животноводства, к которым относятся свиноводство и птицеводство, осуществляется на основе так называемого лидеального протеина, в котором баланс аминокислот удовлетворяет потребности организма того или иного генотипа и в течение того или иного периода онтогенеза. В связи с этим лидеальный протеин должен быть линдивидуальным и корректироваться в соответствии с генотипом и физиологическим статусом организма животного. При этом критерием оценки сбалансированности протеина по аминокислотам, а также его уровень в рационе является степень его конверсии и содержание протеина в продукции. Однако, при этом не всегда получают однозначные результаты, что может быть следствием влияния других факторов, таких как уровень протеина, так и его соотношение с энергией  рациона (Н.А. Ниязов, 2005, О. Аверкиева, 2007, В.М. Голушко и др., 2008, G.W. Smith et al., 1998, T.A. Krowles et al., 1998, М.В. Каширина и др., 2005).

В настоящее время возможные варианты аминокислотного состава рационов классифицированы на пять категорий по их действию на организм животных: баланс, дефицит, имбаланс (дисбаланс), антагонизм и токсичность (A.E. Harper et al., 1970, В.Г. Рядчиков, 1981, М.О. Омаров, 2001)

Наиболее характерным признаком последних четырех форм является ухудшение аппетита и, как следствие, снижение роста животных. Вместе с тем, наблюдается довольно значительное разнообразие по степени проявления этого признака в зависимости от специфичности лимитирующей или избыточной аминокислоты.

Отрицательные последствия, характерные для имбаланса, встречаются в практике свиноводства и птицеводства вследствие неправильного применения кристаллических аминокислот на фоне низкобелкового и монозернового питания.

Для всех злаковых культур, в частности в зерне ячменя и пшеницы, первой лимитирующей (по степени дефицита) аминокислотой является лизин, второй - треонин, третьей - метионин. В зерне кукурузы - второй лимитирующей аминокислотой является - триптофан. Изучение эффективности синтетических препаратов аминокислот (лизина, треонина, метионина) в питании и обмене веществ, разработка норм потребности моногастричных животных представляет теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи исследований. Целью исследований явилось: изучение имбаланса аминокислотного питания и влияния лизина на конверсию протеина рациона и определение потребности поросят в лизине при их выращивании на зерновых рационах.

В связи с этим решались следующие задачи:

1. В опытах на лабораторных животных (белых крысах линии Вистар) изучить влияние:

- сбалансированности диеты по лизину на биосинтез и обмен аминокислот и на химический состав мягких тканей тушки;

- разного уровня лизина и протеина в диете на активность ферментов переаминирования, лизин-кетоглютарат редуктазы, РНК-аз в печени и его химический состав.

2. В опытах на поросятах в возрасте 20-60 дней:

- изучить влияние разного уровня лизина на морфологические и биохимические показатели крови, физиологические (переваримость питательных веществ рациона) и зоотехнические показатели (интенсивность роста, конверсия корма и протеина рациона);

- установить потребность поросят в лизине при оптимальном уровне протеина.

  1.2.Научная новизна.

Впервые изучено влияние имбаланса аминокислот и дефицита лизина в рационах белых крыс и поросят  на морфологические и  биохимические показатели крови, тканей и органов животных, интенсивность роста и конверсию питательных веществ.

  1.3.Практическая значимость работы.

На основании результатов исследований были разработаны рекомендации производству по балансированию лизина в рационах поросят и рецептура комбикорма, позволяющие существенно сократить затраты на протеин без ущерба их продуктивности.

1.4. Основные положения диссертации выносимые на защиту:

1. Имбаланс лизина вызывает ухудшение аппетита и, как следствие, снижение интенсивности роста и анаболических процессов в организме поросят.

2. Дефицит незаменимых аминокислот в рационе приводит к снижению содержания их в крови и повышению - в печени. Для мышечной ткани характерна более стабильная концентрация свободных аминокислот независимо от степени дефицита и сбалансированности аминокислотного питания.

3. Уровень тотальной РНК в печени формируется в соответствии с количеством и качеством субстрата (аминокислот). При имбалансе лизина существенно повышается стабильность м-РНК.

4. Научное и  практическое обоснование норм лизина в рационе поросят в возрасте 20-60 дней при выращивании на монозерновых рационах.

1.5. Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены :

- международной научной конференции Биохимия - медицине (Махачкала, 2002);

- ежегодных внутривузовских научно-практических конференциях ДГУ и ДГМА (Махачкала, 2008, 2009, 2010, 2011).

- международной научно-практической конференции Актуальные проблемы зоотехнии, аквакультуры, биотехнологии и биоэкологи (Саратов, 2009);

- конференции профессорско-преподавательского состава, посвященной 80-летию доктора ветеринарных наук, Заслуженного деятеля наук РФ Г.П. Демкина (Саратов, 2011);

- VI Саратовском салоне изобретений, инноваций и инвестиций (Саратов, 2011);

- расширенном заседании кафедры Кормление, зоогигиена и аквакультура ФГОУ ВПО Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова (2011).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе - 4 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методики исследований, результатов исследования, обсуждения, выводов, предложения производству, списка литературы. Список литературы включает 216 источников, в том числе 125 на иностранных языках. Диссертация содержит 31 таблицу.

2. Материалы и методы исследований.

Для изучения действия дисбаланса, дефицита и баланса в рационе лизина на биосинтез белка, обмена веществ и роста животных проведен опыт на трех группах крыс-отъемышей породы Вистар в возрасте 20 - 24 дней с живой массой 56 г, в каждой группе по 14 голов (поровну самок и самцов).

Основной контрольный рацион состоял из зерносмеси (50% ячменя, 35% пшеницы,15%кукурузы). Рационы обогащали всеми необходимыми витаминами и  минеральными веществами по нормам для крыс. В этом рационе первой лимитирующей аминокислотой по степени дефицита (в % от норм потребности) является лизин (дефицит 62%), второй - метионин (- 37,4%), третьей - треонин (-33,8%),четвертой - изолейцин (-32,4%),пятой - триптофан(-16%). Остальные аминокислоты в пределах отклонений 5-10% от норм потребности.

Животные 1-ой группы получали контрольный рацион, в котором содержание незаменимых аминокислот относительно лизина было избыточным (дисбаланс). Животных 2-ой группы кормили по тому же рациону, но дополненному смесью недостающих аминокислот точно до норм потребности без одной лимитирующей - лизину (имбаланс). Животных 3-ой группы кормили по рациону, скорректированному по всем аминокислотам точно до 100% потребности (баланс).

Продолжительность опыта 14 дней. Животных кормили сухими кормосмесями, поедаемость учитывали ежедневно. Определение переваримости протеина, коэффициентов утилизации белка, свободных аминокислот в крови, состав тела крыс проводили в соответствии с методиками в прописи В.Г. Рядчикова, 1978, 1981 г. Аминокислоты в кормах, крови , теле определяли на анализаторе Т - 339.

Содержание суммарных ДНК, РНК в печени определяли по методу Шмидта и Тангаузера в модификации М.Г.Трудолюбова.

Активность аспартат - и аланинаминотрансфераз определяли по методу Райтман и Френкеля.

Активность РНК-аз (щелочной и кислой) определяли по методу, описанному Р.Т.Татарской, в модификации М.М.Лемешевой.

Для изучения действия уровня лизина и протеина в рационе на активность фермента деградации лизина - лизин-кетоглюкотарат-редуктазы проведено два опыта на белых крысах линии Вистар в возрасте 20-24 дней с живой массой 53 г. В опыте по 14 голов в каждой группе. Разница между опытами состояла в том, что в первом уровень протеина составил 8,4-9,5%, во втором - 15,9-16,4%.

Основной контрольный рацион (ОР) 1-го опыта состоял из дерти кукурузной обогащенной витаминами, макро- и микроэлементами, жиром. Во втором опыте кукурузу обогащали 20% соевым жмыхом. Животные второй группы получали рацион первой + смесь незаменимых аминокислот до удовлетворения норм физиологической потребности, но без лизина. Животные третьей, четвертой, пятой, шестой, седьмой, восьмой, девятой групп скармливали 0,2;0,4;0,6;0,8;1,0;1,2;1,4;1,6 % соответственно. Продолжительность опыта 14 дней.

Активность лизин-кетоглютарат-редуктазы определяли в печени белых крыс по методу Struck и Sizer в модификации  Kachman и Boyer.

Определение потребности поросят в 21-60 дневного возраста в лизине методом возрастающих добавок проводили на СТФ ОПХ Ладожское Краснодарского края на пяти группах помесного молодняка свиней (крупная белая Ландрас) по 20 голов в каждой. Основной рацион в период 21-40 дней содержал 18,2% протеина,в период 41-60 дней -16,9% дефицит лизина составил 46,7 и 49,4 %, соответственно.

Недостаток всех аминокислот за исключением лизина добавляли в состав кормосмеси в виде кристаллических препаратов. Животным 2-5 групп скармливали тот же рацион, но с включением исследуемой аминокислоты - лизина в возрастающей дозе 0,10; 0,2; 0,3; 0,5 % от сухого вещества рациона. Потребность в лизине у поросят изучена по периодам 21-40 дней и 41-60 дней. Исследования по переваримости питательных веществ, отложение азота проведены в соответствии с общепринятыми методиками.

Изучение эффективности препаратов незаменимых аминокислот в кормлении поросят изучали в двух опытах. Изучение препарата аминокислот на фоне низкобелковых рационов проводили по следующим причинам: во - первых, чтобы получить ощутимый эффект от добавок аминокислот при существенном их недостатке в рационе; во - вторых, учитывая факт, что у поросят в возрасте 21 день, еще недостаточно развита система пищеварительных протеаз, замена большого количества белка на свободные аминокислоты окажется более эффективным.

3. Результаты исследований и их обсуждение

3.1. Влияние сбалансированности рационов лизином на биосинтез и обмен аминокислот у белых крыс

3.1.1. Потребление корма и рост животных

Поедаемость крысами 1 группы зернового рациона была минимальной (табл. 1). Во второй группе, при дефиците лизина (62%) добавление смеси аминокислот без лизина не вызвало отрицательного действия. Потребление корма, хотя не сильно, но тем не менее повысилось на 12%, среднесуточные приросты - на 39% (Р<0,05). Сбалансированность рациона крыс по всем аминокислотам привела к получению высоких результатов по среднесуточным привесам и потреблению корма у животных 3 группы.

Таблица 1

Динамика живой массы и потребление корма крысами

Продолжительность опыта, дней	Группа	Диета	Живая масса, г		Потреблено		Затраты корма на 1г прироста, г.
			в начале	в  конце	корма, г	азота, мг
0 - 7	1	основная	55,851,68	64,682,17	8,95	155	7,10
	2	дефицит лизина	55,821,58	68,342,09	9,8	176	5,50
	3	скорректированная	54,841,59	81,721,78	11,60	213	3,15
8 - 14	1	основная	64,682,17	75,102,57	9,20	159	6,21
	2	дефицит лизина	68,342,09	82,492,69	10,5	188	5,20
	3	скорректированная	81,721,78	109,603,59	13,92	259	3,50
0 - 14	1	основная	55,851,68	75,102,57	9,07	157	6,62
	2	дефицит лизина	55,821,58	82,492,69	10,17	182	5,35
	3	скорректированная	58,841,59	109,603,59	12,77	235	3,33

3.1.2. Содержание воды, белка, жира в теле и печени белых крыс

При дефиците лизина (2группа) и несбалансированной диете (1 группа) отмечено наименьшее содержание белка в теле (18,93 и 19,23% против 21,55% на скорректированной диете (3 группа) (табл. 2). Однако эти различия недостоверны.

Таблица 2

Содержание воды, белка и жира в свежей тушке и печени крыс, %

Показатель	Группа
	1 (основная диета)		2 (дефицит лизина)			3 (скорректированная)
Тушка
Вода		69,31,2		69,00,9	67,90,7
Белок		19,230,36		18,930,41	21,550,92
Жир		6,50,20		7,10,34	6,60,39
Печень
Вода		70,40		69,20	68,70
Белок		21,30		19,50	22,70
Жир		4,43		5,03	3,90

Содержание жира самое высокое (7,1%) отмечено в тушке животных при дефиците лизина, на основной диете (6,5%), на скорректированной диете (6,6%).

Анализ печени на содержание белка и жира выявил примерно такую же тенденцию, как при анализе тушки. Наиболее высокий процент жира был в печени крыс 2-ой группы (дефицит лизина).

Известно, что недостаток незаменимых аминокислот по-разному влияет на отложение жира в теле и печени. При недостатке лизина наблюдается ожирение печени. Лизин является предшественником карнитина, а карнитин играет основную роль в окислении жирных кислот. В опытах Н.Г. Григорьева и др. на цыплятах отмечено более высокое содержание жира в теле и печени при недостатке лизина.

3.1.3. Переваримость протеина и использование азота

Не отмечено существенных различий в показателях переваримости азота в зависимости от сбалансированности рационов по аминокислотам (табл.3). По группам коэффициенты оказались в пределах от 81,15 до 86,62%.

Таблица 3

Переваримость протеина и отложение азота у крыс за период 0-14 дней (М m)

Показатель	Группа
	1 (основная диета)	2 (дефицит лизина)	3 (скорректированная)
Коэффициент переваримости, %	85,151,10	86,600,90	86,621,20
Отложено азота:
г/гол	0,47	0,55	0,76
мг/г потреблённого белка	34	36	32,6
КУБ	39,13,09	45,83,40	57,22,54

У крыс при имбалансе лизина эндогенные потери азота были ниже, чем в других группах. Известно, что эндогенные потери азота с калом в % относительно количестве потреблённого снижается, а в абсолютном количестве несколько возрастает с увеличением белка в рационах крыс.

Наилучшее использование азота было у животных на скорректированной диете. Снижение этого показателя наблюдалось у животных 1 и 2 групп. Где он на 38,2 и 27,6% был ниже, чем на скорректированной диете. Эти данные свидетельствуют о том, что недостаток лимитирующих аминокислот (лизина, метионина, треонина и изолейцина) в рационе снижает его биологическую ценность. Свидетельством тому является уменьшения коэффициентов утилизации белка (КУБ).

Самое низкое значение КУБ наблюдалось на несбалансированной диете (39,1), при имбалансе лизина (45,8), чему и свидетельствует самый низкий среднесуточный прирост. Высокий показатель утилизации белка наблюдался у животных на скорректированной диете (57,2), где и прирост был самым высоким.

3.1.4. Содержание нуклеиновых кислот и активность РНК-аз в печени белых крыс

Известно, что по уровню и структуре нуклеиновых кислот в печени можно судить о состоянии белкового обмена в организме животных. Недостаток незаменимых аминокислот оказывает влияние на содержание суммарных РНК и ДНК.

У животных третьей группы, которые лучше других росли и откладывали в теле больше азота, концентрация суммарной РНК в печени была наиболее высокой - 7,81 мг/г сырой ткани (табл. 4). Самая низкая её концентрация была на основной диете (1-я группа) 6,34 мг/г.

Содержание РНК повышалось у животных при дефиците лизина (вторая группа) - 6,55мг/г, против 6,34 мг/г в первой группе (Р<0,1).

Таким образом, эти данные ещё раз подтверждает тот факт, что даже при остром дефиците лизина, но хорошем балансе остальных аминокислот биосинтетические процессы в организме животных интенсифицируются. Об этом свидетельствуют данные по уровню суммарной РНК.

  Таблица 4

Динамика содержания суммарных РНК и ДНК в печени белых крыс

Группа	Диета	РНК, мг/г	ДНК, мг/г	РНК:ДНК	Масса печени, г	Тотальное содержание, мг		Отложение азота в теле, мг/г тотальной РНК печени
						РНК	ДНК
1	основная	6,340,04	2,830,02	2,24	3,10	19,70,04	8,770,01	23,9
2	дефицит изина	6,550,11	2,860,07	2,29	3,60	23,60,10	10,30,07	23,3
3	скоррекнтированная	7,81*0,28	2,520,02	3,1	4,80	37,60,2	12,10,01	20,2

* Р < 0,05

Различия в концентрации ДНК в печени животных в группах были незначительны.        

       Самое высокое тотальное содержание РНК у животных третьей группы - 37,6 мг. Низкое содержание наблюдалось у животных первой и второй групп - 19,7 и 23,6 мг, соответственно.

Отношение РНК:ДНК, отражающее метаболическую активность клеток печени, наиболее высоким было у животных третьей группы (3,1), что косвенно указывает на высокую интенсивность биосинтетических процессов в печени и в организме. Низкий показатель наблюдался у животных на основной диете (2,24) и при дефиците лизина (2, 29).

В наших опытах наблюдалось неодинаковое влияние разных форм аминокислотного питания  на активность РНК-аз в печени (табл. 5).

Таблица 5

Активность РНК-аз в печени белых крыс

Группа	Диета	РНК-аз, уд. активность
		щелочная	кислая	суммарная
1	Основная	0,0740,03	0,3140,05	0,388
2	Дефицит лизина	1,2040,19	0,2890,08	1,493
3	Скорректированная	0,0160,03	0,4800,02	0,496

Из полученных данных активность РНК-аз, следует отметить низкий её уровень в печени крыс на основной диете и высокий при дефиците лизина. Можно полагать, что при остром дефиците лизина возрастают, как процессы синтеза, так и распада белка, а, следовательно, синтеза и распада РНК. Такой процесс позволяет иметь определённый фонд свободного лизина в жидкостях организма - крови, цитоплазме, органов и тканей за счёт интенсификации основного обмена. Видимо, этим можно объяснить высокий уровень РНК-аз в печени крыс 2-ой группы.

Наблюдаются существенные различия по уровню активности щелочной РНК-азы между 2-ой группой с одной стороны и 1 и 3 группами с другой.

3.1.5. Стабильность m-РНК в печени белых крыс

Уровень суммарной РНК в печени крыс на скорректированном рационе был выше, чем у крыс на низкобелковом основном рационе (р < 0,05), однако достоверных различий с уровнем РНК в печени животных, получавших рацион с имбалансом лизина, не отмечено (таблица 6). Не было различий между группами по количеству ДНК. Транскрипционная активность, выраженная отношением РНК/ДНК, была более высокой у крыс на скорректированном рационе по сравнению с таковой на основном. Однако не  отличалась от активности у крыс с дефицитом лизина. Как в наших, так и опытах других авторов, тесная прямая зависимость отмечалась между содержанием лизина в рационе и ростом крыс или цыплят. В то же время не было прямой зависимости между ростом и уровнем суммарной РНК в печени.

При дефиците лизина индекс стабильности m РНК был ниже, по сравнению с таковым у животных на основном рационе (Р<0,05). Следовательно, имбаланс лизина не угнетает сколько-нибудь существенно транскрипционную активность генома печени, однако, оказывает заметное отрицательное действие на стабильность цитоплазматической m РНК. Активность РНК-азы наименьшая в печени крыс  на скорректированном рационе, что согласуется с высоким уровнем у них поли (А)+m-РНК. Высокая РНК-азная активность у лизина имбаласных крыс, при достаточно высоком уровне суммарной поли (А)+ m РНК, трудно объяснимо.

Представляло интерес рассмотреть действие разных форм сбалансированности на количество и стабильность m РНК фактора элонгации трансляции е ЕF - 1. Оказалось, что общий уровень поли (А)+ m-РНК еЕF - 1 в печени при имбалансе лизина у крыс более высокий, чем у крыс на основной и скорректированной диетах, что находится в полном несоответствии с низким ростом крыс, содержание белка в печени, отложением азота в тушке, в то же время концентрация поли (А)++ и индекс стабильности фактора элонгации трансляции оказались наиболее высокими у крыс, получавших скорректированную диету - 35,8 тыс.имп. и 164,6%, соответственно (таблица  6).

Касаясь уровня суммарной РНК, надо знать, что помимо m- РНК; р- РНК, существуют т РНК некодирующие РНК (нк РНК) и, что у эукариот число генов нк РНК превышает число известных предсказанных генов, кодирующие белки (Макаров Ю.А. и Крамеров Д.А.,2007). Анализ транскрипционной активности генома свидетельствует о том, что транскрибируется  большая часть генов, что предполагалась ранее, причём основная часть новых локусов, даёт начало длинным полиаденилированным и неполиаденилированным нк-РНК. Учитывая этот факт, можно полагать, что в состав фракции суммарной m-РНК могут входить нк-РНК. По-нашему, определение количества суммарной РНК вряд ли может быть достаточно надёжным тестом для оценки интенсивности биосинтеза белка.

Таблица 6

Содержание и стабильность m РНК е ЕF - 1 печени крыс

Показатель	Группа
	1 (основная диета)	2 (дефицит изина)	3 (скорректированная диета)
Концентрация поли (А)+ m РНК (1)	20,0 1,1	26,3 0,9**	21,7 0,8
Концентрация поли (А)++ m РНК	27,5 0,7	20,7 1,4**	35,8 1,1**
Индекс стабильности, %	135,5 7,0	78,7 4,8**	164,6 8,8*

Разница достоверна относительно показателей 1-ой группы: * Р<0,05; ** Р<0,01. Достоверность относительно - 3 - ей группы: * Р<0,01.

1. - концентрация m -РНК еЕF - 1 выражается числом радиоактивных импульсов тысяч/минута/ 0,5мг суммарной РНК при гибридизации поли (А) m РНК на поли (У) - сефарозе.

Следует также отметить  более высокую стабильность фактора элонгации трансляции у крыс на основной диете (137.5%). У крыс на рационе с дефицитом лизина стабильность быстро снижается (78,7%).

3.1.6. Активность ферментов переаминирования

Исследования показали, что существенной разницы в активности АСТ в крови подопытных групп не было, хотя у крыс, получавших основную диету (1 группа), просматривалась тенденция более высокой активности по отношению к таковой у животных на скорректированной диете (3 группа). В то же время активность АЛТ у животных первой группы заметно ниже её активности в крови животных на скорректированной диете (табл.7

Таблица 7

Активность ферментов переаминирования в крови и печени белых крыс

Показатели	Группы
	1 (основная диета)	2 (дефицит изина)	3 (скорректированная диета)
кровь
Аспаратаминотрансфераза, мкм/мл/час	1,870,13	1,6250,09	1,7750,10
Аланинаминотрансфераза, мкм/мл/час	0,300,09	0,400,03	0,480,05
Общий белок, г%	4,680,17	5,170,25	6,010,34
Щелочной резерв, мг%	45020	47515	50016
печень
Аспаратаминотрансфераза, мкм/мл/час	228,811,6	315,0 9,6	265 9,6
Аланинаминотрансфераза, мкм/мл/час	342 11,8	452,5 10,3*	465,0 5,0*

       * Р< 0,05

Содержание общего белка в плазме крови было наиболее высокое у животных на скорректированной диете (6,01%). Некоторое его снижение отмечено при дефиците лизина (5,17%) и на основной диете (4,68%). По-видимому, существует прямая зависимость между скоростью роста и концентрацией общего белка в плазме крови у растущих животных. Аналогичная закономерность наблюдается и в отношении щелочного резерва крови.

  Активность АСТ и АЛТ в печени крыс проявляется иначе. Так, на скорректированной диете она была ниже, чем при дефиците лизина (Р<0,05). Видимо, это связано с увеличением количества свободных, не лимитирующих аминокислот в печени и необходимостью усиления обменных процессов в организме. Высокая каталитическая активность АЛТ характерна при дефиците лизина (вторая группа) и на скорректированной диете (третья группа) и низкая - на основной диете (первая группа).

3.1.7. Содержание свободных аминокислот в крови, мышцах и печени у белых крыс

У животных третьей группы, получавших скорректированную диету, общая сумма свободных аминокислот в плазме крови и мышцах существенно  не отличалась от таковой у животных первой и второй группы, несмотря на то, что они потребляли протеина на 50 и 29% больше.

В печени суммарная концентрация свободных аминокислот у них ниже, чем у животных первой и второй групп - 128 против 152 и 144 мг%, соответственно.

Если рассматривать концентрацию свободных аминокислот относительно их потребления с кормом, то такое соотношение будет самым низким в плазме крови, печени и мышцах у животных на скорректированной диете. По-видимому, правильное соотношение аминокислот в скорректированной диете способствовало более эффективному использованию свободных аминокислот на синтез белков тела.

Уровень свободного лизина был чрезвычайно низким при дефиците лизина - 0,56 мг%. Животные 1-ой группы получали рацион с таким же содержанием лизина, потребляли меньше корма, но содержание свободного лизина в крови у них было заметно больше -1,95 мг%. Эти данные ещё раз подтверждают факт, что свободный лизин плазмы при 100% обеспеченности другими аминокислотами использовался у животных 2-ой группы более эффективно, чем у животных первой группы, где недоставало до норм потребности незаменимых аминокислот.

Интересен тот факт, что в плазме животных 2-ой группы (дефицит лизина) наблюдается высокое содержание свободного треонина. В печени несколько другая картина по содержанию свободных аминокислот. Так, уровень свободного лизина у животных при дефиците лизина мало отличался от его концентрации в печени животных 1 и 3 групп.

Обращает внимание высокое содержание свободных незаменимых аминокислот в печени животных 1 и 2 групп, у которых наблюдался наиболее низкий рост.

В мышцах можно отметить только незначительную тенденцию снижения уровня свободного лизина, по сравнению с таковыми в других группах.

Уровень незаменимых, заменимых и общая сумма аминокислот при всех формах аминокислотного баланса оказалась очень близкой. По-видимому, в мышцы транспортируется оптимальный набор аминокислот в качестве субстрата для осуществления синтеза внутриклеточных белковых структур. Барьерные и регуляторные функции вероятнее всего обеспечиваются плазматической  мембраной миоцитов.

Обращает внимание взаимозависимость концентрации одних аминокислот крови, печени и мышц с концентрацией других. Так, у животных при дефиците лизина (вторая группа) вместе со снижением уровня лизина в плазме крови заметно повышается содержание свободного треонина, серина и валина.

3.1.8. Действие разного уровня лизина и протеина на активность фермента лизин Ц кетоглютарат Ц редуктазы в печени белых крыс

Опыт 1. Добавление незаменимых аминокислот (метионина, треонина, триптофана и изолейцина) до 100% нормы, но без 1-ой лимитирующей аминокислоты - лизина к низкобелковому кукурузному рациону не вызвало отрицательных последствий. Поросята 2-ой группы повысили потребление корма. Между потреблением корма, суточным приростом и коэффициентом утилизации белка (КУБ) наблюдается прямая зависимость: основная диета 1,0 г и 36,4%, 2-ая группа - 1,37 г и 33,6% на скорректированной диете - 5,24 г и 70.6 %, соответственно.

Добавление лизина сверх нормы физиологической потребности приводило к несущественному снижению суточных приростов. При всех уровнях лизина не наблюдалось существенных различий коэффициентов переваримости белка.

Опыт 2. При высоком содержании белка в диете добавка различных уровней лизина в рационы приводила к несущественному повышению суточных приростов, коэффициентов утилизации белка (КУБ). Существенной зависимости между содержанием белка и лизина в диете с одной стороны и накоплением жира в тушке с другой стороны не отмечено.

Результаты изучения активности лизин-деградирующего фермента кетоглютарат-редуктазы показали, что дефицит лизина (первый опыт) приводит к некоторому снижению его активности.

С увеличением количества субстрата (лизина) активность его резко возрастает. При увеличении в рационе лизина в два раза активность фермента увеличивается в четыре раза (126,4 мк/мол против 30,6 мк/мол).

Аналогичная тенденция повышения активности, но менее выражено, наблюдалось у животных во втором опыте.

Таким образом, фермент, деградирующий лизин обладает субстратной индукцией.

По-видимому, снижение активности фермента деградации лизина при дефиците не единственный механизм его экономии. Уровень протеина незначительно сказывался на его активности. Это подтверждает близкими показателями в 9 и 10 группах первого  второго опыта.

Видимо, низкой активностью фермента можно объяснить более эффективным использованием белка при ограниченном его потреблении.

Ряд исследователей считают, что характерным признаком при остром дефиците лизина является то, что синтез белка в более важных органах (печень, сердце, мозг) продолжает оставаться высоким, за счёт аминокислот, освобождаемых в результате деградации белков менее важных органов и, прежде всего, таких как мускулы (Waterlow V. C., et el, 1966).

По-видимому, в организме существует гомеостатический механизм, играющий важную роль в поддержании необходимого уровня лизина, чтобы исключить отрицательные последствия.

3.2. Потребность поросят в лизине

Результаты научно-хозяйственного опыта показали, что животные всех опытных групп увеличили свою живую массу с 5,8 кг до 16,3-19,7 кг.

Разница между группами объясняется только степенью сбалансированности рационов по лизину (табл.8).

Обогащение рационов животных лизином способствовало увеличению среднесуточных приростов живой массы при этом максимальной в 4-ой группе (356г за опыт), что на 32,3 % выше по сравнению с контролем.

Дальнейшее повышение уровня лизина не имело положительного действия на рост поросят. Живая масса в 60 дней на столь небогатом по набору полноценных белковых добавок рационе была довольно высокой -19,7 кг за счёт препарата лизина.

учшие показатели по приростам были у животных четвёртой группы. Поэтому, можно считать, что здесь достигалось оптимальное содержание лизина.

Таким образом, можно считать, что потребность поросят в лизине, определяемая ростовым методом, составляет 13,5г/кг сухого корма (1,35%) в возрасте 21-40 дней, 11,5 г/кг (1,15%) в возрасте 41-60 дней и 12,0 г (1,2%)- в период 21-60 дней.

Таблица 8

Рост поросят и затраты кормов при разных уровнях лизина

Показатели	Возраст, дней	Группы
		1 ОР (контроль)	2 ОР+0,1% изина	3 ОР+0,2% изина	4 ОР+0,3% лизина	5 ОР+0,5% изина
Общее содержание лизина, %	21-40	0,92	1,02	1,12	1,22	1,42
	41-60	0,77	0,87	0,97	1,07	1,27
	21-60	0,084	0,96	1,09	1,15	1,33
Живая масса, кг	21-40	5,80,14	5,80,15	5,80,15	5,80,15	5,80,3
	41-60	9,150,60	10,20,34	10,50,67	11,20,37	11,00,73
	21-60	16,30,71	18,50,78	19,10,59	19,70,19	18,70,76
Среднесуточный прирост, г	21-40	16811	2209*	23513*	2709*	260*
	41-60	37610	43713	4539*	44711*	405*
	21-60	2697	32611*	34112*	3565*	33117*
Затраты корма на 1 кг прироста живой массы, кг	21-40	2,10	1,93	1,78	1,85	2,01
	41-60	2,02	1,71	1,68	1,87	1,94
	21-60	2,04	1,80	1,76	1,83	1,96

*P < 0,05

3.2.1. Переваримость и использование питательных веществ рациона у поросят при различных уровнях лизина

Во время физиологических обменных опытов изучение переваримости питательных веществ рационов, содержащих в своём составе различное количество лизина, рассматривалось как основной элемент многосторонней оценки их питательных и кормовых достоинств.

На основании данных обменного опыта произведены расчёты коэффициентов переваримости питательных веществ рационов (таблица 9).

С повышением уровня лизина в рационе наблюдалась тенденция улучшения переваримости питательных веществ, например сырого протеина с 86,1 до 84,9%, клетчатки - с 42,3 до 63,2%.

Таблица 9

Коэффициенты переваримости питательных веществ рационов у поросят в 60-дневного возраста (М m),%

Показатели	Группы
	1 (ОР)	2 (ОР+0,1% лизина)	4 (ОР+0,3% лизина)	5 (ОР+0,5% лизина)
Сухое вещество	92,30,70	93,51,87	93,11,00	94,60,60
Зола	81,11,21	81,55,10	80,62,80	84,92,31
Органическое вещество	93,00,63	94,21,60	93,60,80	95,10,52
Протеин	86,11,40	90,13,10	90,21,22	90,11,35
Жир	88,31,71	89,92,68	90,20,72	91,61,20
Клетчатка	42,36,50	51,614,12	57,24,47	63,23,91
(БЭВ)	96,60,40	97,00,87	96,40,47	97,50,24

Повышение переваримости сырого протеина сопровождалось повышением отложения азота в теле поросят. Так, при скармливании поросятам рационов без добавок лизина было отложено в организме 5,10г в сутки, а при скармливании 0,3% лизина (4 группа) отложение азота увеличилось на 60,8% (8,20г против 5,10г в сутки) (таблица 10).

Таким образом, полученные коэффициенты переваримости питательных веществ и использования азота поросятами в балансовом опыте находятся в полном соответствии с интенсивностью роста в опыте.

Здесь же, можно отметить, что балансирование рационов поросят синтетическими препаратами аминокислот является целесообразным приёмом, улучшающим обменные процессы в организме.

3.3. Эффективность применения синтетических препаратов

аминокислот на фоне низкобелковых рационов для поросят

Первый опыт. Добавление смеси аминокислот по-разному повлияло на отложение азота. Снижение количества протеина в рационе (вторая группа) с 210 до 150 г/кг корма способствовало снижению отложения азота в туше с 6,9 до 5,1 г/сутки или на 35% (таблица10).Снижение уровня протеина в опытном рационе привело к резкому ухудшению (на 26%) роста поросят (таблица 11). Суточный прирост у животных второй группы составил 217 против 272 г в контроле, затраты корма на каждый килограмм прироста выросли почти на 13% (2,10 против 1,82 кг).

Таблица 10

Отложение азота в туше поросят, г/сутки

Возраст, дней	группы
	1 контроль (+)	2 контроль (-) (ОР)	3 ОР+смесь аминокислот без лизина	4 ОР + смесь НА Цдо 100% потребности
21 - 40	4,80	4,10	4,60	5,72
41 - 60	9,00	6,00	8,90	10,60
21 - 60	6,90	5,10	6,75	8,20

Обогащение низкобелкового рациона смесью аминокислот, состоящий из метионина и треонина, но без лизина (третья группа) оказало положительное влияние на рост поросят (+6%).

Добавление в корм ещё и лизина (четвёртая группа) способствовало дальнейшему улучшению роста поросят до 334г (+54% к контролю), затраты корма на кг прироста при этом снизились на 23% (1,62 против 2,10 кг).

Результаты опыта доказывают возможность существенной экономии белка соевых бобов за счёт введения препаратов аминокислот. Это доказано тем, что среднесуточные приросты поросят (4 группа) были выше, а затраты кормов ниже по сравнению с таковыми в контроле (334 против 272 г, 1,62 против 1,82 кг/кг прироста).

Таблица 11

Эффективность препаратов аминокислот при кормлении поросят от 21 до 60 дневного возраста (опыт 1)

Группа	Содержание в рационе, %		Добавка аминокислот, % от массы корма	Суточный прирост, г		Затраты корма на 1 кг прироста		Потреблено корма, кг/гол/сут
	протеина	сои		(Мm)	в % к 2 группе	кг	в % к 2 группе
1	21,0	40,8	Контроль	27213	126	1,82	87	0,495
2	15,0	11,5	Опытный рацион (ОР)	21711	100	2,10	100	0,456
3	15,0	11,5	ОР+0,23% Т+0,24% М	22910	106	2,05	98	0,487
4	15,1	11,5	ОР+0,23% Т+0,24% М+0,65% Л	33420	154	1,62	77	0,542

Примечание: Т - треонин; М - метионин; Л - лизин.

Добавление в рацион третьей группы смеси аминокислот без лизина способствовало повышению отложения азота до 6,75 г по сравнению со второй группой, однако оно не достигало уровня отложения у поросят первой контрольной группы. У животных четвёртой группы, в рацион которых добавили смесь аминокислот (лизина, метионина и треонина) отмечено повышение отложения азота в тушке на 3,1 г или на 61 % по сравнению с таковым у животных второй группы, хотя разница в потреблении азота с кормом была несущественной.

Эти факты свидетельствуют о том, что балансирование рационов по аминокислотам способствует существенному улучшению использования азота и тем самым повышению биологической ценности протеина корма.

Второй опыт. Снижение количества протеина в рационе у животных второй группы с 219 до 156 г/кг корма в возрасте 21 - 40 дней, с 200 до 144 - в 41 -60 дней и с 174 до 138 г в возрасте 61 - 90 дней способствовало уменьшению суточных приростов на 10,5; 35,3 и 5%, соответственно, по сравнению с показателями первой группы (таблица 12).

Таблица 12

Рост поросят и затраты кормов в научно-хозяйственном опыте (опыт 2)

Показатель	Возраст, дней	Группа
		1 контроль (+)	2 контроль (-) (ОР)	3 ОР+лизин +метионин +треонин
Живая масса, кг	21	5,64 0,08	5,55 0,4	5,59 0,05
	41	9,87 0,15	9,37 0,53	9,87 0,18
	61	18,45 0,48	15,70 0,72	19,74 0,31
	90	36,22 0,95	33,27 1,70	38,79 0,55
Среднесуточный прирост, г	21-40	211 10	191 20	213 4
	41-60	429 12*	317 13	494 9*
	21-60	320 10*	250 20	354 9*
	61-90	614 14	585 20	635 12*
	21-90	446 8*	396 20	474 10*
Затраты корма на 1 кг прироста живой массы, кг	21-40	1,70	2,10	1,90
	41-60	1,91	2,52	1,63
	21-60	1,84	2,40	1,70
	61-90	2,97	2,96	2,70
	21-90	2,51	2,73	2,28

Обогащение рациона животных третьей группы комплексом препаратов аминокислот (лизина, метионина, треонина) до полной физиологической потребности в них способствовало увеличению суточного прироста живой массы на 41.6% в возрасте 21-60 дней и 19,8% в возрасте 21-90 дней.

Наиболее существенная разница  наблюдалась в период кормления от 41 до 60-дневного возраста: суточный прирост живой массы у животных второй группы составил 317 г, а у поросят третьей группы-494 г или на 55,8% выше. Живая масса в 60 дней на столь бедном по набору полноценных белковых добавок в рационе оказалась довольно высокой - 19,74 и 38,74 кг в возрасте 60 и 90 дней, соответственно, за счёт введения в рацион препаратов аминокислот.

Таким образом, результаты исследований показали, что использование в качестве кормовых добавок для поросят раннего отъёма в комплексе препаратов незаменимых аминокислот - лизина, метионина и треонина, позволяет сократить затраты сои в 3-4 раза, а протеина на 34%, повысилась эффективность использования на 54-55%, корма-на 23-32% без ущерба для продуктивности животных.

ВЫВОДЫ

1. Несбалансированность рациона по аминокислотам способствует снижению концентрации белка в тушках белых крыс на 12%. Имбаланс лизина повлиял на концентрацию белка и жира в тушках и печени крыс. Снизилось содержание белка в теле на 13,8% и печени на - 16,4% и повысилось содержание жира в теле на 7,6%, в печени на - 29% по сравнению с животными на сбалансированном рационе. Это свидетельствует о липотропном действии лизина в организме.

2. Добавление недостающих аминокислот до 100-процентной потребности без одной лимитирующей (лизина) и низкобелковому зерновому рациону не приводит к феномену имбаланса, отличительными признаками которого является снижение потребления корма и, как следствие этого, роста животных. Это явление мы назвали л баланс, компенсирующий дефицит лимитирующей аминокислоты, характеризующим улучшение использования одной дефицитной аминокислоты при идеальном балансе остальных.

3. Переваримость протеина при дефиците лизина и идеальном балансе остальных, аминокислота не ухудшается, по сравнению с таковой у животных на сбалансированном по всем незаменимым аминокислотам рационе. Отложение азота и рост животных находятся в прямой зависимости от потребления корма.

4. Концентрация РНК в печени при дисбалансе аминокислот, дефиците лизина несколько снижается, по сравнению с тем у животных на сбалансированной диете. В то же время в расчете на мг тотальной РНК печени отложение азота в теле находится практически на одном и том же уровне. По-видимому, деятельность РНК печени в условиях дисбаланса и дефицита направлена на экономное использование лимитирующих аминокислот в организме животного.

5. Стабильность mРНК в печени при имбалансе лизина существенно снижается в сравнении с аналогичными показателями крыс на низкобелковом рационе и более существенно на скорректированном. Имбаланс вызывает снижение стабильности mРНК фактора элонгации трансляции eEF-1 в печени крыс. Высокий уровень стабильности mРНК характерен для хорошо сбалансированного по аминокислотам питания.

6. Повышение активности ферментов переаминирования (АСТ, АЛТ), РНК-азной активности (особенно при дефиците лизина), свидетельствующей о более интенсивных метаболических процессах в печени при неблагоприятных условиях аминокислотного питания, направленных с одной стороны на деградацию избытка нелимитирующих аминокислот, с другой - повышению эффективности использования дефицитной аминокислоты.

7. Аминокислотный состав корма отчетливо отражается на уровне свободных аминокислот в плазме крови. В печени уровень дефицитных аминокислот оказывается не ниже, а даже выше, чем в печени крыс, получавших хорошо сбалансированный рацион. В мускулах независимо от формы сбалансированности фонд свободных аминокислот, соотношение суммы заменимых и незаменимых аминокислот сохраняется более сбалансированным. Это обстоятельство свидетельствует о наличии защитной и регуляторной функции миоцитов в своем обеспечении сбалансированным набором аминокислот.

8. Фермент деградации лизина-лизин-кетоглюторат-редуктаза обладает субстратной активностью.

9. Нормы потребности поросят в лизине определенный ростовым методом составила в возрасте 21-40 дней 13,5 г (1,35%), в возрасте 41-60 дней - 11,5 г (1,15%), а за период 21-60 дней - 12,0 г (1,2%) на 1 кг сухого корма.

10. Скармливание поросятам синтетических препаратов аминокислот - метионина и треонина в отдельности или вместе не эффективно. Добавка в рационы метионина и треонина вместе с лизином способствовало увеличению суточных приростов на 42,0 и 54%, а затраты корма на 1 кг прироста, соответственно, ниже на 23 и 32%. За счет обогащения низкобелкового рациона комплексом препаратов аминокислот - лизина, метионина и треонина становится возможным сократить затраты сои в 3-4 раза, повысить эффективность использования концентрированных кормов на 23-32% без снижения продуктивности животных.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. Для нормирования рационов поросят до 2-месячного возраста по лизину предлагаем следующие его нормы потребности: в возрасте 21-40 дней - 13,5 г (1,35%), 41-60 дней - 11,5 г (1,15%), за период 21-60 дней - 12,0 (1,20%) в расчете на 1 кг сухого корма.

2. Лизин является первой лимитирующей аминокислотой для свиней при монозерновых (ячменно-пшеничных) рационах. Лизин рекомендуем добавлять в рацион только в комплексе с метионином и треонином.

3. Белковые концентраты, разработанные с учётом концепции лидеального протеина: 21-60 дней (на 1 тонну): сухое молоко- 342 кг, рыбная мука- 120 кг, шрот соевый- 17 кг, премикс КС -3 35 кг, лизин (в расчёте на активное вещество)- 14 кг, треонин (100%)- 11 кг. В зерновой компонент вводится в количестве 30%.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Османова, С.О. Влияние различных концентраций лизина и протеина в кормах на активность фермента лизин-кетоглюкорат-редуктазы / Османова С.О., Омаров М.О.// Ветеринария Кубани. -2011. -№ 6.-С.10-12.
2. Османова, С.О. Факториальный метод определения потребности поросят в незаменимых аминокислотах./ Османова С.О., Кулинцев В.В., Омаров М.О.// Достижения науки и техники в АПК.-2011.-№ 9.-С.45-48.
3. Османова, С.О. Потребность в лизине молодняка свиней. / Османова С.О., Кулинцев В.В., Омаров М.О.// Аграрная наука. -2011.-№9.-С. 25-27.
4. Нагиев, Э.Р. Влияние лизина на обмен веществ и содержание свободных аминокислот в органах и тканях белых крыс / Нагиев Э.Р., Османова С.О./Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2012.-№1.-С. 57-62.

Статьи, опубликованные в других изданиях:

5. Османова, С.О. Изменения некоторых биохимических показателей в тканях организма / Османова С.О., Нагиев Э.Р.//Материалы м/н научной конф. Биохимия-медицине. - ИП - Полиграф-сервис. - Махачкала, 2002. - С. 111-112.

6. Османова, С.О. Энергетические субстраты и их функционирование в тканях животных /Османова С.О., Шихнабиева Н.Д., Керимханова Н.И.// Материалы международной научной конференции Биохимия - медицине. ИП - Полиграф-сервис. - Махачкала, 2002. - С. 111-112.

7. Османова, С.О. Потребность поросят в лизине / Османова С.О., Головко Е.Н.// Материалы 3-ей Всероссийской научно-практической конференции Научное обеспечение агропромышленного комплекса. - Краснодар, КубГАУ.- 2009. - С.54-57.

8. Османова, С.О. Влияние сбалансированности рационов по аминокислотам на продуктивность молодняка свиней / Османова С.О., Тарасенко О.А. // Материалы 3-ей Всероссийской научно-практической конференции Научное обеспечение агропромышленного комплекса. - Краснодар, КубГАУ.- 2009. - С. 57-59.

9. Османова, С.О. Доступность аминокислот злаковых в кормлении свиней / Османова С.О., Головко Е.Н.// Материалы 3-ей Всероссийской научно-практической конференции Научное обеспечение агропромышленного комплекса. - Краснодар, КубГАУ.- 2009. - С. 133-137.

10. Омаров, М.О. Способы улучшения конверсии белка жмыхов и шротов / Омаров М.О., Османова С.О., Тарасенко О.А., Головко Е.Н. // Эффективное Животноводство. - Информационно-аналитический журнал. - 2010, № 3(53). - С. 25 - 26.

11. Османова, С.О. Оптимизация рационов для свиней с учётом лидеального протеина и истинной доступности аминокислот. / Османова С.О., Каширина М.В.// Материалы Всероссийской научно-практической конференции Научное обеспечение агропромышленного комплекса. Краснодар, Куб ГАУ -2010.-С.62-63.

12. Османова, С.О. Баланс аминокислот и стабильность m-РНК у моногастричных животных / Османова С.О., Полежаев С.Л., Омаров М.О., Рядчиков В.Г.// Материалы Всероссийской научно-практической конференции Научное обеспечение агропромышленного комплекса. Краснодар, Куб ГАУ -2010.-с.62-63.

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии