Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ШЕХОВЦОВА ОКСАНА ВИКТОРОВНА
Влияние грибов рода Candida на механизм формирования госпитальных штаммов возбудителей внутрибольничных инфекций и экспериментальное обоснование способа
его предупреждения
03.02.03 Ц микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва Ц 2012
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации |
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор | Шаталова Елена Васильевна |
Официальные оппоненты: |
Пашков Евгений Петрович, доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова |
| Червинец Вячеслав Михайлович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии ГБОУ ВПО Тверская медицинская академия |
Ведущая организация:
ГБОУ ВПО Ярославская государственная медицинская академия
Защита состоится л___ _______________ 2012 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.040.08 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Первый МГМУ им. И.М. Сеченова по адресу: 119992, г. Москва, ул. Трубецкая,
д. 8, стр. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в ЦНМБ ГБОУ ВПО Первый МГМУ
им. И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.
Автореферат разослан л____ _______________ 2012 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор Миронов Андрей Юрьевич
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Одной из компонент, характеризующих линдекс здоровья нации, является уровень инфекционной заболеваемости, в формировании которого важную роль играют внутрибольничные инфекции (ВБИ). Заболеваемость ВБИ в определенной степени отражает качество медицинской помощи, оказываемой населению, и является одной из важных составляющих экономического ущерба в практическом здравоохранении (Акимкин В.Г., 2005; Семина Н.А., 2007; Покровский В.И., 2011).
Несмотря на обилие новых препаратов с антимикробным действием, выборочные исследования, проведенные на различных территориях нашей страны и за рубежом, свидетельствуют о значительном распространении ВБИ, большом медицинском и социально-эконо-мическом ущербе, наносимом ими (Венцель Р.П., 2004; Зайцев С.Н., 2010). Это в основном отделения для ожоговых больных, онкологии, гематологии, кардиохирургии, трансплантации органов и тканей, интенсивной терапии, неонатологии, СПИД и др.
Снижение антиинфекционной защиты у таких пациентов приводит к созданию для микроорганизмов новых экологических ниш, в которых происходит селекция микроорганизмов с новым набором детерминант вирулентности и устойчивости к факторам внешней среды. Итогом этих процессов является появление и значительное распространение лекарственно-устойчивых госпитальных штаммов условно-патогенных микроорганизмов.
Этиологическая структура возбудителей ВБИ многообразна и отличается своим разнообразием не только между регионами, но и между отдельными ЛПУ и зависит от его профиля, политики применения антибиотиков и оказываемой лечебной помощи. Как правило, это госпитальные штаммы условно-патогенных грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов с нарастающей тенденцией дрожжеподобных грибов рода Candida spp. Однако особое беспокойство у врачей разных специальностей вызывают смешанные Кандида-бактериальные инфекции, которые из потенциальных болезней будущего превратились в актуальные болезни настоящего (Серге-
ев А.Ю., 2003; Шкарин В.В., 2006; Wingard E.J., 2007).
Сложные и неоднозначные взаимоотношения между разными видами возбудителей при гнойно-воспалительных процессах смешанной этиологии могут оказывать существенное влияние на характер инфекционного процесса, усугубление иммуносупрессии у больных и соответственно на формирование штаммов с признаками госпитальных.
Между тем до сих пор роль дрожжеподобных грибов рода Candida spp. во взаимоотношениях с другими видами бактерий, равно как и влияние их на механизм формирования госпитальных штаммов микроорганизмов, течение и исход инфекционного процесса Кандида-бактериальной природы изучено недостаточно.
Учитывая высокую значимость ВБИ, все вышеизложенное требует комплексного подхода к изучению данной проблемы и поиска способов предупреждения формирования штаммов с признаками госпитальных в условиях гнойно-воспалительных процессов Кандида-бактериальной этиологии.
Работа выполнена по плану НИР Курского государственного медицинского университета (номер государственной регистрации 01.2.00950632).
Цель исследования: изучить влияние дрожжеподобных грибов рода Candida spp. на формирование структуры популяций ведущих возбудителей ВБИ по клинически значимым признакам в условиях иммуносупрессии организма и разработать способ предупреждения формирования штаммов с признаками госпитальных.
Задачи исследования.
1. Изучить мониторинг видового состава возбудителей внутрибольничных инфекций в отделениях многопрофильных стационаров города Курска за период 2007 - 2011 гг.
2. Изучить некоторые факторы вирулентности (гемолитическая и протеолитическая активность, адгезивные свойства) и факторы персистенции (антилизоцимная и антилактоферриновая активность), способствующие проявлению патогенности клинических штаммов микроорганизмов, и профиль их устойчивости к антимикробным препаратам.
3. Изучить структуру популяций основных возбудителей (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans) нозокомиальных инфекций в городе Курске по клинически значимым признакам.
4. Изучить влияние дрожжеподобных грибов рода Candida spp. на формирование структуры популяции Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa по признакам патогенности, персистенции и устойчивости к антимикробным препаратам в условиях иммуносупрессии in vivo.
5. Оценить выраженность связи между механизмом формирования популяций ведущих госпитальных штаммов возбудителей в условиях мико-ассоциаций и течением и исходом гнойно-воспалитель-ного процесса Кандида-бактериальной природы.
6. Экспериментально обосновать применение препаратов, обеспечивающих высокоэффективную коррекцию антиинфекционной резистентности организма, с целью предупреждения формирования штаммов с признаками госпитальных через иммунокомпрометированный организм.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Высокая степень проявления пенетрантности и экспрессии по клинически значимым признакам в популяциях бактерий в условиях ассоциации с дрожжеподобными грибами рода Сandida spp. способствует более длительной персистенции микроорганизмов в организме хозяина, угнетает развитие иммунного ответа у экспериментальных животных и влияет на течение и исход инфекционного процесса.
2. Дрожжеподобные грибы рода Candida albicans индуцируют формирование популяций бактерий-ассоциантов с признаками госпитальных, однако выраженность этого эффекта зависит от принадлежности их к таксономической группе.
3. Система гетерогенность популяций микроорганизмов - состояние иммунной системы макроорганизма имеет диагностическое значение и может быть использована для прогнозирования и профилактики возникновения внутрибольничных инфекций.
4. Галавит (отечественный препарат с иммуномодулирующим, противовоспалительным и регенерирующим эффектами -
200 мкг/мышь) индуцирует возникновение иммуностимулирующего эффекта при Кандида-бактериальной инфекции у животных с иммуносупрессией, вызванной термической травмой. Однако выраженность этого эффекта зависит от вариантов бактерий-ассоциантов.
5. Сочетанное применение галавита (200 мкг/мышь) с лидокаином (ингибитор фосфолипаз - 5 мкг/кг) эффективно корригирует иммунологическую реактивность экспериментальных животных и приводит к полной сапрофитизации возбудителей гнойно-воспалитель-ного процесса Кандида-бактериальной природы всех изученных вариантов.
Научная новизна.
Впервые:
- научно обосновано разнонаправленное влияние дрожжеподобных грибов рода Candida albicans на механизм формирования структуры популяций ведущих возбудителей госпитальных инфекций. Установлено, что грибы рода C.albicans способствуют нарастанию и достоверно увеличивают количество клонов с высокими показателями клинически значимых признаков в популяциях E.coli и S.аureus соответственно в условиях in vivo у иммунодепрессированных животных.
В тех же условиях штаммы Ps.аeruginosa формируют однородные популяции по содержанию высоковирулентных и панрезистентных клонов;
- установлена высокая корреляционная связь между механизмом формирования штаммов возбудителей ВБИ с признаками госпитальных и течением и исходом гнойно-воспалительных процессов Candida-бактериальной природы;
- научно доказано, что система гетерогенность популяций микроорганизмов - состояние иммунной системы макроорганизма имеет диагностическое значение и может быть использована для прогнозирования возникновения ВБИ.
Показано, что микроорганизмы с высоковирулентными и пан-резистентными клонами в популяциях, которые формируются под влиянием грибов рода C.albicans, подавляют регенераторные потенции тканей макроорганизма, способствуют длительному функционированию естественного ингибирующего фактора (ЕИФ) в организме и обусловливают развитие тяжелой формы инфекционного процесса с высоким уровнем летальных исходов у экспериментальных животных.
Установлено, что применение галавита с лидокаином обеспечивает выраженный протективный эффект за счет высокоэффективной коррекции антиинфекционной резистентности организма животных с Кандида-бактериальной инфекцией в условиях термической травмы и способствует достоверной сапрофитизации возбудителей в организме.
Практическая значимость. Установлено прямое разнонаправленное влияние дрожжеподобных грибов рода C.albicans на механизм формирования госпитальных штаммов E.coli, S.aureus, P.aeruginosa на устойчивость их ассоциаций с грибами, длительность циркуляции последних в организме экспериментальных животных, продолжительность и исход инфекционного процесса.
Полученные данные расширяют теоретические представления о механизмах формирования штаммов с признаками госпитальных, способствуют более детальной расшифровке эпидемиологии внутрибольничных инфекций и обусловливают настоятельную необходимость дифференцированного подхода при разработке рациональных схем терапии гнойно-воспалительных осложнений Candida-бактериальной природы.
Существенно расширены представления о состоянии гетерогенности популяций исходных штаммов условно-патогенных микроорганизмов, что способствует более точной диагностике инфекционных процессов, позволяет предупредить изменение свойств госпитальных штаммов микроорганизмов в сторону повышения их вирулентности и резистентности к антибактериальным препаратам, прогнозировать течение и исход инфекционного процесса и оценить эффективность терапии гнойно-септических осложнений.
Практическое значение исследований определяется разработкой способа предупреждения формирования госпитальных штаммов возбудителей гнойно-септических процессов в условиях ожоговой травмы, включающего экспериментальное обоснование возможности применения галавита с лидокаином, восстанавливающих антиинфекционную резистентность экспериментальных животных и способствующих элиминации из состава популяций микроорганизмов вирулентных и резистентных к антибиотикам особей, что приводит к сапрофитизации возбудителей в организме, предупреждая формирование штаммов с признаками госпитальных и соответственно возникновение ВБИ.
Внедрение в практику результатов работы. Полученные материалы использованы в методических рекомендациях для врачей и научных работников Условно-патогенные бактерии в этиологии внутрибольничных инфекций в г. Курске и мониторинг их чувствительности к антибактериальным препаратам. Результаты исследования внедрены в практику бактериологической лаборатории ОБУЗ Курская городская клиническая больница скорой медицинской помощи, ОБУЗ Областная клиническая инфекционная больница им. Семашко, хирургического отделения БМУ Курская областная клиническая больница, в учебный процесс на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии Курского государственного медицинского университета, в лекционный курс на факультете повышения квалификации для врачей.
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на научных региональных конференциях молодых ученых (Курск, 2009; 2011); межвузовской научно-практической конференции Проблемы и перспективы современной науки (Томск, 2009); Международной научной конференции Студент и научно-технический прогресс (Новосибирск, 2009); Международной научно-практической конференции Инфекции и паразитарные болезни в практике клинициста (Харьков, 2010); научной сессии отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН (Курск, 2010); научно-практической конференции по медицинской микологии (VIII Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2010); совместном заседании кафедр микробиологии, вирусологии, иммунологии, инфекционных болезней и эпидемиологии, биохимии, клинической иммунологии и аллергологии Курского государственного медицинского университета.
Публикации. Основные положения диссертации отражены
в 13 научных публикациях, включая 3 публикации в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, методических рекомендациях для врачей и научных работников лечебно-профилактических учреждений. Получен патент на изобретение
№ 2458138 от 10.08.2012 г. Зарегистрировано 5 внедрений.
ичный вклад автора. Автором составлен план и дизайн исследования, проведен анализ отечественных и зарубежных источников литературы по теме диссертации. Лично проведены исследования, сбор материала, проанализированы полученные результаты, сделаны выводы и практические рекомендации. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей личного участия автора 75-95%.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на
155 страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 рисунками и 24 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 263 работы: 147 из них отечественных и 116 зарубежных авторов. Диссертация содержит 5 приложений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты выполнены на мышах линии СВА (980) и крысах Вистар (120), полученных из опытно-племенных питомников АМН РФ Светлые горы и Столбовая, прошедших карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме, при свободном доступе к воде и пище. В контрольные и опытные группы входили животные одной массы и одного пола, полученные из вивария одновременно. Все исследования проводили в одно и то же время суток (с 8 до 13 час.). Из опыта животных выводили декапитацией под эфирным наркозом.
Требования, изложенные в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (город Страсбург, Франция, 18 марта 1986), в работе полностью соблюдены.
Видовую принадлежность выделенных микроорганизмов определяли с помощью диагностических биохимических тест-систем Microla-Test ("Lachema", Чехия). Гемолитическую и протеолитическую активность определяли по общепринятым методикам.
Каталазную и цитохромоксидазную активность определяли согласно приказу № 535 от 22 апреля 1985 г. Чувствительность к антимикробным препаратам определяли с помощью метода диффузии в агар с применением элективных сред и дисков НИЦФ, Санкт-Петербург; интерпретация результатов согласно указаниям производителя дисков. При этом использовали антибиотики, к которым изучаемые микроорганизмы обладают природной чувствительностью: для синегнойных бактерий использовали тобрамицин, гентамицин, амикацин, цефтазидим, ципрофлоксацин, полимиксин М, карбенициллин, стрептомицин, имипенем; чувствительность кишечных палочек изучали по отношению к тобрамицину, амикацину, цефтазидиму, ципрофлоксацину, имипенему, карбенициллину и стрептомицину; стафилококка - по отношению к тобрамицину, гентамицину, амикацину, цефтазидиму, ципрофлоксацину, имипенему и стрептомицину; грибов рода Кандида - по отношению к амфотерицину В, леворину и нистатину.
В отношении части культур (синегнойных бактерий) определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) методом серийных разведений в чашках Петри с плотной питательной средой, содержащей вышеперечисленные антибиотики в концентрации 25, 50, 100, 200, 400 мкг/мл.
Способность к адгезии изучаемых микроорганизмов определяли с помощью экспресс-метода по В.И. Брилис и соавт. (1986). Антилактоферриновую активность (АЛФА) микроорганизмов изучали по методике И.В. Валышевой и соавт. (2003) с использованием лактоферрина из коровьевого молока фирмы "Fluca" (Швейцария), номер по каталогу 61323 с применением твердофазного иммуноферментного метода и использованием реагентов ЗАО Вектор-БЕСТ, город Новосибирск. Способность микроорганизмов к инактивации лизоцима определяли по методу О.В. Бухарина (1985).
Ожог III-В степени площадью около 30% поверхности тела животного получали под легким эфирным наркозом на депиллированном участке кожи спины животного с помощью устройства, поддерживающего температуру обжигающей поверхности на уровне 1000С при экспозиции 8 сек (Минухин В.В., 1985).
Структуру популяций микроорганизмов изучали по признакам лекарственной устойчивости и патогенности путем рассева 0,1 мл суточной бульонной культуры исследуемых штаммов на чашки с МПА для получениях изолированных колоний, после чего петлей пересевали 100 изолированных колоний на чашки с МПА с различными концентрациями антибиотиков (от 25 до 400 мкг/мл) или другими субстратами и на чашку с МПА без них (контроль). Чашки с посевами инкубировали в течение суток при 370С. При сравнении популяций микроорганизмов учитывали процент колоний, выросших на чашках с антибиотиками в максимальных концентрациях. При этом использовали антибиотики, к которым изучаемые микроорганизмы обладают природной чувствительностью: для синегнойных бактерий использовали карбенициллин, полимиксин М и тобрамицин; чувствительность кишечных палочек изучали по отношению к карбенициллину, стрептомицину и тобрамицину; стафилококка - по отношению к тобрамицину, ципрофлоксацину и стрептомицину.
Популяцию микробов-ассоциантов из ожоговой раны получали путем отпечатков с помощью стерильных бархатных штампов размером 11 см2 на поверхность агаризованных элективных питательных сред: среда, содержащая N-цетилпиридинийхлорид (ЦПХ), служила для псевдомонад; молочно-солевой агар служил для выделения стафилококка; среда Эндо - для кишечных палочек.
Иммунологические исследования. Процесс фагоцитоза полиморфноядерными лейкоцитами периферической крови изучали по общепринятой методике с вычислением относительного содержания активных фагоцитов (активность, %) и количества фагоцитируемых микроорганизмов в расчете на один фагоцит (фагоцитарное число, интенсивность). При этом кровь у мышей брали из супраорбитальной вены.
С целью определения завершенности фагоцитарного процесса применяли методику З.Е. Матусис и С.П. Пылаевой (1978).
Активность кислороднезависимых бактерицидных систем изучали по наличию лизосомальных катионных белков в цитоплазме лейкоцитов периферической крови в мазках, окрашенных бромфеноловым синим по методике, предложенной М.Г. Шубич (1974) с определением среднего гистохимического показателя (СГП).
Выраженность гуморального иммунного ответа (ГИО) оценивали по двум интегральным показателям: а) количеству антителообразующих клеток (АОК) селезенки после иммунизации эритроцитами барана (ЭБ) (Мальберг К., 1987) и б) эффекту подавляющего действия на образование антител естественного ингибирующего фактора (ЕИФ), отличительной чертой которого является ингибирование активности циркулирующих в крови макромолекулярных (IgM) антител различной специфичности в присутствии 2-меркаптоэтанола (Родосская Н.К., 2003).
Неспецифическое ингибирование активности Ig определяли с помощью реакции ингибирования агглютинации (РИА) с применением брюшнотифозной агглютинирующей неадсорбированной диагностической сыворотки (тест-сыворотка) с вычислением индекса ингибирования (ИИ) - отношение суммарного титра контрольного ряда к суммарному титру опытного ряда. РИА считали положительной, если ИИ был равен 1,2 и более (Журавлева Н.В., 1985).
Интенсивность реакции (ИР) гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) определяли путем сенсибилизации мышей ЭБ в дозе 1107 с последующим введением разрешающей дозы ЭБ (Черноу-
сов А.Д., Фонталин Л.Н., 1979).
Способ введения изучаемых препаратов в организм животных соответствовал инструкциям и положению по применению, дозы экспериментально обоснованы по данным литературы. Препараты вводили сразу после воспроизведения ожоговой травмы и ее инфицирования 1 раз в сутки в течение 3 дней: галавит в дозе 200 мкг/мышь в объеме 0,1 мл внутримышечно, лидокаин - 5 мкг/кг внутрибрюшинно.
В качестве контрольных были следующие группы:
- интактные, которым по тем же схемам вводили стерильный изотонический раствор хлорида натрия;
- животные с чистым ожогом;
- животные с ожоговой травмой и Кандида-бактериальной инфекцией.
Все полученные данные подвергнуты статистической обработке с определением критерия Стьдента, Х2 и Вилкоксона-Манна-Уитни с помощью пакета прикладных программ "Microsoft Office XP".
Для доказательства связи некоторых признаков был использован корреляционный анализ с помощью программного комплекса "Microsoft Exel - 97" для IBМ РС с вычислением коэффициента корреляции и его ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние грибов рода C.albicans на формирование госпитальных штаммов возбудителей ВБИ и исход инфекционного процесса Кандида-бактериальной этиологии у животных
Невозможно полностью экстраполировать на конкретный стационар не только данные комплексных исследований о ВБИ, полученные в других странах (США и европейских странах), но и данные, полученные в других стационарах нашей страны и даже в городе. В связи с этим блок параметров, связанных с микробиологическим мониторингом, имеет в отделении стационаров любого профиля первостепенное значение.
Нами было изучено 380 штаммов микроорганизмов, выделенных из патологического материала от больных многопрофильных стационаров г. Курска за период 2007-2011 гг. По видовому составу это были: Staphylococcus spp. - 120 штаммов, Pseudomonas aeruginosa - 90 штаммов, дрожжеподобных грибов рода Candida spp. -
105 штаммов и 65 штаммов Escherichia coli. Из них 235 (61,8%) культур входили в состав различных ассоциаций (табл. 1).
Этиологическая структура и уровень резистентности возбудителей ВБИ имеют принципиальное значение, т.к. между отдельными исследованиями и географическими регионами отмечаются значительные вариации этих показателей (Яковлев С.В. и др., 2008).
Таблица 1
Структура ведущих возбудителей нозокомиальных инфекций
Возбудители | Выделенные | Итого | |
в монокультуре | из ассоциации | ||
Staphylococcus spp. | 50/13,2 | 70/18,4 | 120/31,6 |
Pseudomonas aeruginosa | 40/10,5 | 50/13,2 | 90/23,7 |
Candida spp. | 20/5,3 | 85/22,3 | 105/27,6 |
Escherichia coli | 35/9,2 | 30/7,9 | 65/17,1 |
Итого | 145/38,2 | 235/61,8 | 380/100 |
Примечание. Числитель - абсолютное число; знаменатель - %.
Все изученные нами штаммы обладали разными антибиотикограммами к традиционным препаратам и значительной вариабельностью к современным антибиотикам с выраженной полирезистентностью у псевдомонад.
Наименьшей активностью в отношении штаммов Staphyloccocus spp. обладает гентамицин (24,2%). Наиболее активными были имипенем и тобрамицин (80,8% и 85,0% чувствительных штаммов соответственно).
Штаммы грибов рода Candida spp. были более чувствительными к амфотерицину В (97,9%).
В отношении грамотрицательных возбудителей (E.coli и P.aeruginosa) наиболее активным является препарат из группы карбапенемов - имипенем (96,9% и 80,0% чувствительных штаммов соответственно), что противоречит данным литературы.
Длительное выживание возбудителя в организме хозяина и, соответственно, формирование высоковирулентных штаммов, обеспечивают различные механизмы персистенции последних (Буха-
рин О.В., 2009). С учетом этого у всех культур было изучено распространение признака антилизоцимной (АЛА), АЛФА активности и способности к адгезии. Изученные нами микроорганизмы обладают в разной степени АЛА, АЛФА и способностью к адгезии, распространенность и выраженность которых зависит от принадлежности к виду.
Так, АЛА обладали 8,3%; 87,7%; 91,1% и 93,3% стафилококков, кишечных палочек, псевдомонад и грибов рода Кандида соответственно. 100% изученных штаммов P.aeruginosa и E.coli обладали способностью к адгезии; среди грибов рода Candida spp. активных культур было 81,0%, и всего лишь 21,2% Staphyloccocus spp. обладали способностью к адгезии, причем с низкой интенсивностью (СПА=1,70,4).
При изучении АЛФА было установлено, что распространенность этого признака находится в пределах от 29,2% у стафилококков до 68,6% - у грибов с низким уровнем выраженности у всех культур, что не совпадает с данными литературы.
Такая дивергентность изученных признаков у штаммов, выделенных от больных, еще раз подтверждает данные литературы об обязательном включении блока параметров микробиологического мониторинга с целью своевременного выявления новых эпидемических штаммов возбудителей ВБИ.
Из всех изученных культур 61,8% штаммов были выделены в ассоциации с грибами рода C.albicans, особенности взаимодействия между которыми также могут влиять на проявление значимых признаков для госпитальных штаммов.
Проведенные нами исследования показали, что по возрастанию степени пенетрантности и экспрессии по клинически значимым признакам и тяжести вызываемой иммуносупрессии у животных изученные ассоциации возбудителей располагаются в следующей последовательности: C.albicans+E.сoli C.albicans+S.aureus C.albicans+ P.aeruginosa. Это подтверждается и впервые полученными нами данными о влиянии грибов C.albicans на выживаемость и формирование структуры популяции ведущих бактерий-ассоциантов, а также на исход инфекционного процесса Кандида-бактериальной этиологии. При одновременном орошении одинаковым количеством микробных клеток грибов и кишечных палочек, грибов и стафилококка, грибов и синегнойной палочки (по 0,2 мл 1 млрд взвеси) экспериментальной ожоговой раны уже на 4 сутки исследования отмечалось достоверное увеличение колониеобразующих единиц (КОЕ) E.сoli (450 на 1см2), S.aureus - (460 на 1 см2) и P.aeruginosa (680 на 1 см2) относительно монокультур при высеве их на элективные питательные среды. При этом высеваемость монокультур из раны прекратилась на 12 сутки для E.сoli и на 16 и 20 сутки для S.aureus и P.aeruginosa соответственно, в то время как из ассоциации с грибами высеваемость сохранялась до 14 сутки для E.сoli и до 22 - для S.aureus. В этих же условиях высеваемость P.aeruginosa сохранялась до 28 суток на уровне
100 КОЕ/см2 (рис. 1).
Рис. 1. Выживаемость P.aeruginosa в ассоциации с C.albicans in vivo.
Полученные данные позволили установить широкий диапазон влияния грибов на выживаемость бактерий в ассоциациях и устойчивость последних в иммуносупрессированном организме животных.
Принципиально новым этапом в разработке проблемы ВБИ стало изучение грибов рода C.albicans на механизм формирования популяций бактерий-ассоциантов при гнойно-воспалительных процессах Кандида-бактериальной этиологии.
Принимая во внимание полученные нами данные, в следующей серии экспериментов, было изучено влияние грибов рода Кандида на формирование популяций E.coli, S.aureus и P.aeruginosa, так как, согласно теории, выдвинутой академиком В.Д. Беляковым (1987), популяционный подход в разработке проблемы механизмов формирования штаммов с признаками госпитальных является перспективным и единственно верным.
Изучение распределения колоний в популяциях бактерий проводили в динамике инфекционного процесса: на 12 сутки исследования для E.сoli, на 16 и 20 сутки для S.aureus и P.aeruginosa соответственно, т.е. к концу срока прекращения высеваемости из ожоговой раны соответствующих монокультур.
Установлено, что популяции E.сoli и S.aureus из ассоциации с грибами invivo по признакам вирулентности и лекарственной устойчивости не претерпевали достоверных изменений. В то же время по признакам персистенции (АЛФА и адгезивно-активных) число колоний достоверно повышалось относительно популяций монокультур.
Причем следует отметить, что степень интенсивности адгезии у стафилококков повышалась с низкой (1,7 0,4 у монокультур) до средней (2,20,6 у культур из ассоциации).
Особого внимания заслуживают данные по изучению формирования структуры популяции P.aeruginosa в условиях с грибами рода C.albicans.
В популяциях псевдомонад, выделенных из ассоциации с грибами, наблюдалось достоверное увеличение особей, обладающих лекарственной устойчивостью, признаками вирулентности и персистенции. В этих условиях популяции псевдомонад на 20 сутки исследования становятся однородными по проявлению гемолитических, протеолитических и адгезивных свойств с высокой степенью интенсивности (рис. 2), что, по-видимому, обеспечивает устойчивость данного микобиоценоза и высокий уровень иммуносупрессии организма
животных.
Рис. 2. Распределение клонов в популяциях P.aeruginosa.
Примечание. Распределение по степени лекарственной устойчивости, гемолитически-, протеолитически-, АЛФА- и адгезивно-активных особей (в % из
100 колоний); *- достоверность различий с данными монокультуры (Р<0,01).
Впервые полученные нами данные о корреляционном анализе выживаемости, механизмах формирования популяций псевдомонад в условиях ассоциации с грибами и клиническим течением инфицированной ожоговой раны позволили установить наличие сильной прямой связи между изучаемыми параметрами (r=0,8920,094 и 0,9820,090 соответственно).
Разработка способа предупреждения формирования
штаммов микроорганизмов с признаками госпитальных
Полученные результаты послужили основанием для изучения состояния антиинфекционной защиты иммуносупрессированного организма животных, инфицированных вышеописанными вариантами Кандида-бактериальной инфекции. Для создания иммуносупрессии организма нами была выбрана модель ожоговой травмы, т.к. известно (Парамонов Б.А., 2003; Алексеев А.А., 2004), что в патогенезе обширных термических повреждений большую роль играют механизмы дестабилизации иммунного статуса с развитием иммунодефицита, влекущего за собой возникновение комплекса патологических изменений практически во всех внутренних органах, вызванных как самой травмой (через механизм стресса), так и интоксикацией, связанной с повреждением тканей (Перетягин С.П. и др., 2009).
Учитывая вышеизложенное, были изучены показатели фагоцитарного процесса и бактерицидных систем лейкоцитов (катионные белки), так как известно, что основной в защите от инфекции, вызванной условно-патогенными микроорганизмами, является фагоцитарная система, обладающая ауторегулирующими свойствами.
У всех животных с Кандида-бактериальной инфекцией на фоне ожоговой травмы наблюдалось статистически достоверное (Р<0,01) снижение уровней всех исследуемых показателей фагоцитоза по сравнению с интактными и животными с ожогом, что согласуется с данными литературы. Неферментные КБ нейтрофилов периферической крови у таких животных не обнаруживались на всех сроках исследования, в то время как у животных с чистым ожогом они обнаруживались в виде пылевидных отложений. Причем следует отметить, что наиболее выраженное угнетение изучаемых показателей у обожженных животных вызывала ассоциация возбудителей из грибов с псевдомонадами.
ГИО к Candida spp. имеет ряд особенностей, отличающих его от ответа на многие другие антигены. Клеточная стенка Candida spp. обладает прочной структурой, и активация системы комплемента не приводит к лизису клеток грибов. Протективный эффект антител при кандидозах осуществляется в основном опосредованно за счет их опсонизирующих свойств, что только ограничивает размножение гриба в организме (Лебедева Т.Н., 2004). Однако широкое распространение условно-патогенных Candida spp. в окружающей среде, наличие у них общих внутривидовых антигенов, а также антигенов, перекрестно реагирующих с Saccharomyces cerevisiae (истинными дрожжами, широко применяемыми в пищевой промышленности), способствует накоплению естественных антител, реагирующих с Candida spp. Такие антитела присутствуют в сыворотке практически всех здоровых людей, и их особенность состоит в высокой нейтрализующей активности по отношению к Candida (Шабашова Н.В., 2009).
В связи с вышеизложенным выраженность ГИО оценивали по двум интегральным показателям: а) количеству АОК селезенки после иммунизации эритроцитами барана и б) эффекту подавляющего действия на образование антител ЕИФ.
Изучение числа АОК селезенки и ЕИФ сыворотки крови у животных показало, что активность ЕИФ в организме больных животных находится в обратной зависимости относительно количества АОК. Выраженная активность ЕИФ в сыворотке крови с Кандида-бактериальной инфекцией на фоне ожоговой травмы (ИИ=от 2,0 до 3,9) сопровождалась резким снижением числа иммунных АОК в селезенке (от 14,1 при C.albicans+E.сoli до 5,5 - при C.albicans + P.aeruginosa) (количество АОК на селезенку в тыс. на орган).
Важным, а иногда и ведущим звеном в патогенезе разнообразных инфекционных осложнений (особенно грибковой этиологии), является формирование ГЗТ (Караев З.О., 2007).
Стойкое угнетение ГИО у обожженных животных с Кандида-бактериальной инфекцией сопровождается достоверным (Р<0,01) разнонаправленным изменением реакции формирования ГЗТ. Установлено, что у мышей в ответ на ожоговую травму происходит угнетение ГЗТ (Р<0,05). На присоединившуюся Кандида-бактериальную инфекцию организм обожженных животных по-разному реагировал относительно формирования ГЗТ. Это зависело от видовой принадлежности бактерий-ассоциантов. Так, у животных с ожогом C.albicans+E.сoli и C.albicans+S.aureus вызывали резкое угнетение ГЗТ (ИР=19,01,3 и 12,01,2 соответственно). В то время как ассоциация C.albicans+P.aeruginosa формировала у последних гиперергическую реакцию ГЗТ (ИР=68,03,3) (рис. 3).
Таким образом, результаты проведенных нами исследований показали, что влияние грибов рода C.albicans на формирование однородных популяций с высоковирулентными и лекарственно-устойчивыми клонами и тяжести вызываемой иммуносупрессии у животных зависит от видовой принадлежности бактерий-ассоциантов и убывает в ряду: C.albicans+P.aeruginosa C.albicans+S.aureus C.albicans+E.сoli.
Рис. 3. Интенсивность реакции ГЗТ у животных с ожоговой травмой, осложненной Кандида-бактериальной инфекцией.
Примечание. Группы животных: 1 - интактные; 2 - ожог; 3 - ожог инфицирован C.albicans + P.aeruginosa; 4 - ожог инфицирован C.albicans + S.aureus;
5 - ожог инфицирован C.albicans + E.coli. Достоверность различий с данными контрольной группы (интактные) *P<0,05, **-P<0,01.
Однако проводить исследования, доказывающие госпитальную природу штаммов и их ассоциаций, без применения иммунокоррекции супрессированного организма животных является не достоверно доказывающим фактором.
В связи с этим нами была поставлена задача изучить в эксперименте возможность восстановления нарушенной иммунологической реактивности организма иммуносупрессированных животных с Кандида-бактериальной инфекцией с помощью галавита и лидокаина.
Выбор препаратов был обусловлен не только механизмом их действия, но и выбранной нами моделью иммуносупрессии. Галавит - отечественный иммуномодулятор, обладающий иммуномодулирующим, противовоспалительным и регенерирующим эффектами (Абидов М.Т., 1999).
Трехкратное введение только галавита (200 мкг/мышь/ в/мышечно) оказывало позитивное влияние на депрессированную активность антиинфекционной резистентности у животных, однако восстановления изучаемых показателей до уровня интактных животных нами не отмечено (Р>0,05).
Принимая во внимание патогенез развития ожоговой болезни, в следующей серии экспериментов галавит применяли совместно с лидокаином (5 мкг/кг в/брюшинно) (как ингибитор фосфолипаз), который не только препятствует поступлению в сосудистое русло токсических и иммуносупрессирующих субстанций (Грек О.Р., 1998), но и купирует проявление болезненного синдрома (Машковский М.Д., 1998). А как известно, болевой шок, который развивается в первые дни болезни при ожоговых травмах, также вызывает супрессию иммунного ответа. Кроме того, в малых концентрациях лидокаин является нетоксичным, он медленно метаболизируется в организме и таким образом оказывает продолжительное действие.
Нами установлено, что у всех животных, получавших галавит с лидокаином, все изучаемые показатели были достоверно выше относительно уровней показателей интактных животных.
Несмотря на то что развитие ГЗТ отличается от ГИО по свойствам основных клеток и выделяемым ими факторам, параллельно с ГИО отмечалась нормализация ГЗТ. Введение галавита с лидокаином достоверно снижало сенсибилизацию организма у инфицированных C.albicans+P.aeruginosa животных до 39,0% и достоверно повышало ИР ГЗТ до 41,0% и 42,0% у животных, инфицированных C.albicans+S.aureus и C.albicans+E.сoli соответственно (при норме у интактных животных - 35,0%) (рис. 4).
Сочетанное применение препаратов способствовало достоверной элиминации из состава популяций вирулентных и резистентных к антибиотикам особей уже на 7 сутки исследования, что приводило к сапрофитизации возбудителей в организме при всех вариантах Кандида-бактериальной инфекции и 100% выживаемости животных.
Таким образом, применение галавита с лидокаином обеспечивает выраженный протективный эффект и позволяет предупредить влияние грибов рода C.albicans на изменение свойств изученных нами E.coli, S.aureus и P.aeruginosa в сторону повышения их вирулентных и персистентных свойств и устойчивости к антибиотикам за счет высокоэффективной иммунокоррекции супрессированного организма животных.
Рис. 4. Интенсивность реакции ГЗТ у животных после сочетанного применения препаратов.
Примечание. По оси абсцисс: группы животных: 1 - интактные; 2 - ожог инфицирован C.albicans + P.aeruginosa; 3 - ожог инфицирован C.albicans + S.aureus; 4 - ожог инфицирован C.albicans + E.coli. Достоверность различий относительно применения галавита отдельно: * - P<0,01.
ВЫВОДЫ
1. В этиологической структуре гнойно-воспалительных процессов у иммунокомпрометированных больных многопрофильных стационаров г. Курска превалируют Staphylococcus spp., Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, часто обнаруживаемые в ассоциациях с дрожжеподобными грибами рода Candida spp.
2. Популяции клинических штаммов возбудителей гетерогенны по признакам вирулентности, факторам персистенции и лекарственной устойчивости, что является основой для формирования госпитальных штаммов условно-патогенных микроорганизмов.
3. Дрожжеподобные грибы рода Candida albicans способствуют нарастанию и достоверно увеличивают количество особей с высокими показателями вирулентности, персистенции по АЛФА и СПА и устойчивости к антибактериальным препаратам в популяциях E.coli и S.aureus соответственно в условиях in vivo у иммуносупрессированных животных.
4. Штаммы Pseudomonas aeruginosa в тех же условиях формируют однородные популяции по содержанию высоковирулентных и панрезистентных клонов, что является подтверждением широкого распространения в отделениях ЛПУ устойчивых биоценозов Кандида-псевдомонадной природы.
Следовательно, единственным ориентиром для выбора адекватной терапии при Candida-бактериальных инфекциях могут быть данные микробиологического мониторинга в стационарах региона и в настоящее время.
5. Выявлена высокая корреляционная связь между выживаемостью бактерий, механизмом формирования их популяций, уровнем иммуносупрессии организма животных и течением и исходом гнойно-воспалительного процесса Кандида-бактериальной этиологии.
По возрастанию степени пенетрантности и экспрессии по клинически значимым признакам в популяциях бактерий-ассоциантов и тяжести вызываемой иммуносупрессии у животных изучаемые ассоциации возбудителей располагаются в следующей последовательности: C.albicans+E.сoli C.albicans+S.aureus C.albicans+ P.aeruginosa.
6. Установлено, что система гетерогенность популяций микроорганизмов - состояние иммунной системы макроорганизма имеет диагностическое значение и может быть использована для прогнозирования возникновения ВБИ.
Высокий уровень гетерогенности клинических штаммов возбудителей гнойно-септических процессов и депрессированная активность иммунной системы макроорганизма обусловливает развитие тяжелой формы инфекционного процесса с высоким процентом летальности у экспериментальных животных.
7. Эффективность влияния галавита на депрессированную активность иммунной системы организма и сапрофитизацию популяций возбудителей Кандида-бактериальной инфекции в организме животных с термической травмой зависит от принадлежности к виду бактерий-ассоциантов.
При гнойно-воспалительных процессах, вызванных C.albicans+E.сoli и C.albicans+S.aureus, галавит вызывает достоверное повышение показателей микробицидных систем нейтрофилов и ГЗТ, но не нормализует последние у экспериментальных животных.
При Кандида-псевдомонадной этиологии галавит лишь уменьшает выраженность снижения иммунологической реактивности и слабо активирует процесс сапрофитизации в популяциях псевдомонад.
8. Сочетанное применение галавита с лидокаином обеспечивает выраженный протективный эффект за счет высокоэффективной коррекции антиинфекционной резистентности, позволяет предупредить влияние грибов рода C.albicans на изменение свойств E.сoli, S.aureus и P.aeruginosa в сторону повышения их вирулентных и персистентных свойств и устойчивости к антибактериальным препаратам. Высокий уровень элиминации таких клонов из популяций приводит к сапрофитизации возбудителей в организме и в конечном итоге - к предупреждению формирования госпитальных штаммов возбудителей ВБИ.
Результаты защищены патентом № 2458138 от 10.08.2012 г.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
- Экспериментальные данные могут использоваться в учебном процессе медицинских вузов с целью углубления изучения и расширения знаний о механизмах формирования госпитальных штаммов возбудителей ВБИ и закономерностях иммуномоду-лирующего действия иммунотропных препаратов при Кандида-бактериальных инфекциях.
- Результаты исследований, выразившиеся в разработке способа предупреждения формирования госпитальных штаммов условно-патогенных микроорганизмов, и методические реко-мендации для врачей могут быть использованы для апробации в клинической практике с целью профилактики возникновения ВБИ.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Шаталова Е.В., Шеховцова О.В. Состояние антибиотикоре-зистентности этиологически значимых возбудителей госпитальных инфекций // Материалы 74-й научной конференции КГМУ. - Курск, 2009. - Т. 1. - С. 377-379.
- Криволапова М.С., Шеховцова О.В. Экспериментальное обоснование формирования госпитальных штаммов возбу