Geum.ru
Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по химии

На правах рукописи

Дышловой Сергей Анатольевич

Выделение, установление структуры и изучение биологической активности ааптаминовых алкалоидов из губки Aaptos sp.

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б.

Елякова Дальневосточного отделения РАН (Владивосток, Россия) и Университетской клинике Эппендорф при университете Гамбурга (Гамбург, Германия).

Научный консультант:

Кандидат химических наук, старший научный сотрудник Фёдоров Сергей Николаевич

Официальные оппоненты:

Светашев Василий Иванович Доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН, ведущий научный сотрудник Лаборатории сравнительной биохимии Ермакова Светлана Павловна Кандидат химических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б.

Елякова Дальневосточного отделения РАН, старший научный сотрудник Лаборатории химии ферментов

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится л 01 июня 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail:

dissovet@piboc.dvo.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru.

Автореферат разослан л апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Черников О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По данным Всемирной организации здравоохранения в 2010 году онкологические заболевания стали основной причиной смертности в мире, обогнав по количеству летальных случаев сердечно-сосудистые заболевания. Несмотря на многочисленные исследования последних десятилетий по поиску и разработке новых противоопухолевых препаратов следует признать, что на настоящий момент лечение этих заболеваний все еще остается весьма проблематичным. Поэтому поиск и изучение новых противоопухолевых препаратов по-прежнему является актуальной проблемой современной науки. Известно, что около половины всех имеющихся лекарственных препаратов создано на основе природных соединений. Это связано с тем, что природные биологически активные соединения нередко являются очень активными и малотоксичными. Следует также отметить, что эти биомолекулы были отобраны в ходе эволюционных процессов как наиболее эффективные, и поэтому они являются хорошими моделями для дальнейших синтетических модификаций.

Известно, что биохимия вторичного обмена морских организмов существенно отличается от процессов, происходящих в наземных организмах.

За последние 25 лет из морских гидробионтов было выделено более 200морских природных соединений, несколько десятков из которых находятся на различных стадиях клинических испытаний в качестве потенциальных противоопухолевых препаратов.

Наиболее богатым источником морских биологически активных соединений продолжают оставаться губки. Данный факт связывают с неподвижным образом жизни этих животных и, как следствие, необходимостью вырабатывать защитные химические вещества, которые могут не только играть определённую экологическую и физиологическую роль, но и выполнять другие биологические функции.

Таким образом, поиск и выделение вторичных метаболитов морских губок, исследование их химических структур, а также молекулярных механизмов биологического действия является актуальным с точки зрения получения новых веществ с уникальной активностью, в том числе противоопухолевой.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было выделение, установление структуры, а также изучение противоопухолевой активности и некоторых аспектов молекулярных механизмов действия ааптаминовых алкалоидов из морской губки Aaptos sp. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать схемы и провести выделение в индивидуальном виде ааптаминовых алкалоидов, ответственных за противоопухолевую активность экстракта губки Aaptos sp.;

2. Установить строение выделенных соединений;

3. Исследовать канцерпревентивную, цитотоксическую и цитостатическую противоопухолевую активность выделенных алкалоидов, а также возможные механизмы этой активности;

4. С помощью методов протеомики и молекулярной биологии исследовать влияние выделенных алкалоидов на протеом опухолевых клеток человека и экспрессию некоторых генов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Морская губка Aaptos sp. содержит 3-(N-морфолинил)деметилоксиааптамин, 3-(метиламино)-деметилоксиааптамин, 2,3-дигидро-2,3диоксоааптамин и 6-(N-морфолинил)-4,5-дигидро-5-оксодеметилоксиааптамин, являющиеся новыми представителями класса ааптаминовых алкалоидов.

2. Ааптаминовые алкалоиды, выделенные из морской губки Aaptos sp.

обладают канцерпревентивной и цитотоксической противоопухолевой активностью. Ааптамин, деметилоксиааптамин и изоааптамин проявляют одинаковую цитотоксическую активность по отношению к лекарственноустойчивым NT2-R и лекарственно-чувствительным NT2 опухолевым клеткам человека.

3. Исследуемые алкалоиды по-разному влияют на транскрипционную активность ядерных факторов АР-1, NFB и р53. Этот эффект зависит от концентрации и химической структуры соединений.

4. Ааптамин в нецитотоксических концентрациях оказывает антипролиферативный эффект на опухолевые NT2 клетки, останавливая клеточный цикл в фазе G2/M.

5. Цитотоксическое действие ааптамина обусловлено активированием фосфорилирования ERKs, повышением уровня транскрипционной активности АР-1, NFB и р53 ядерных факторов с последующей индукцией апоптоза опухолевых клеток.

6. Под воздействием нецитотоксических концентраций ааптамина на NT2 клетки происходит гипузинирование эукариотического фактора инициации трансляции 5A-1, фосфорилирование кофилина-1, ап-регуляция CRABP2 с одновременным увеличением количества кодирующей его мРНК, а также изменение соотношения изоформ альфа-энолазы.

7. Ааптамин, деметилоксиааптамин и изоааптамин по-разному влияют на протеом NT2-R опухолевых клеток, что выражается в воздействии на внутриклеточные уровни разных белков. Ааптамин в первую очередь проявляет свою антипролиферативную активность, тогда как деметилоксиааптамин и изоааптамин - цитотоксическую активность, реализующуюся по апоптотическому пути.

Научная новизна и практическая ценность работы. Из губки Aaptos sp. выделено 4 новых алкалоида ааптаминового ряда. Изучены ЯМР- и массспектры новых соединений, а также их некоторые химические свойства.

Впервые выявлена сильная канцерпревентивная активность соединений этого ряда. Получены новые ценные данные о противоопухолевой активности ааптаминовых алкалоидов in vitro, в частности, их про-апоптотической активности, влиянии на клеточный цикл и транскрипционную активность некоторых ядерных факторов. Исследование протеома клеток, обработанных ааптаминовыми алкалоидами, выявило некоторые уникальные изменения в белковом составе этих клеток. В частности, в обработанных ааптамином NT2 и NT2-R клетках была зафиксирована активация эукариотического фактора инициации трансляции 5A-1 (eIF5A), подобный эффект никогда ранее не наблюдался при действии низкомолекулярных веществ на клетки. Впервые были охарактеризованы некоторые особенности механизма действия ааптаминовых алкалоидов. Всё это создаёт основу для дальнейших исследований веществ этого типа как потенциальных хемопревентивных и терапевтических противоопухолевых препаратов.

Апробация работы. Результаты работы представлены на международных симпозиумах Targeted Anticancer Therapies-2012 в 2012 г., Амстердам, Нидерланды, и Targeted Anticancer Therapies-2011 в 2011 г., Париж, Франция; на Второй международной российско-корейской конференции Current issues of natural products chemistry and biotechnology в 2010 г., Новосибирск, Россия; на Международном симпозиуме по морским биоресурсам Вьетнама, 2010 г., Ханой, Вьетнам; на XII Всероссийской молодёжной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, 2009 г., Владивосток, Россия; на Первом дальневосточном международном симпозиуме, посвященном наукам о жизни Life Science, 2008 г., Владивосток, Россия; на X Международной молодёжной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, 2007 г., Владивосток, Россия; а также на других конференциях.

Публикации. Всего опубликовано 27 работ - 9 научных статей, 1 патент и 17 тезисов докладов. Из них по теме диссертации 13 работ, в том числе научных статьи, 1 патент и 9 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 144 цитируемых работы. Работа изложена на 145 страницах, содержит 35 рисунков и 14 таблиц.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю к.х.н. Фёдорову С.Н. Автор благодарит также к.х.н.

Шубину Л.К. за неоценимый вклад в химическую часть настоящего исследования; академика Стоника В.А. и д.х.н. Макарьеву Т.Н. - за ценные консультации; м.н.с. Кузьмич А.С. и н.с. Радченко О.С. - за помощь в проведении ряда экспериментов; д.х.н. Калиновского А.И. и к.х.н. Дмитренка П.С. - за получение и помощь в обработке спектральных данных; н.с.

Красохина В.Б. - за определение видовой принадлежности изученных морских организмов; к.х.н. Ермакову С.П. за ряд советов по организации биологической части исследования и чл.-корр. РАН Васьковского В.Е. - за помощь в работе с научной литературой и сборе информации. Автор также выражает глубокую признательность своим немецким коллегам из Университетской клиники Эппендорф при университете Гамбурга (Гамбург, Германия), и в особенности, доктору Фридману Хонекеру, доктору Штефану Балабанову и профессору Карстену Букамаеру.

Используемые сокращения. 2D-Вестерн-блоттинг - двумерный Вестерн-блоттинг; 2D-PAGE - двумерный электрофорез в полиакриламидном геле, используемый при анализе протеома клеток; AP-1 - активаторный белок1, транскрипционный фактор; CRABP2 - клеточный ретиноевая кислотасвязывающий белок 2; DHS - деоксигипузин синтаза; DOHH - деоксигипузин гидроксилаза; eIF5A - эукариотический фактор инициации трансляции 5A-1;

EGF - эпидермальный фактор роста; GC7 - N1-гупнил-1,7-диаминогептан; IC - (Inhibition concentration 50), концентрация исследуемого вещества, при которой происходит уменьшение количества жизнеспособных клеток на 50%;

INCC50 - (Inhibition of the number of the colonies C50) концентрация вещества, при которой происходит ингибирование колонеобразования (трансформации) клеток JB6 P+ Cl41 в мягком агаре на 50%; MG-132 - N-(бензилоксикарбонил)лейциниллейциниллейциналь; MTS - 5-(3-карбоксиметоксифенил) - 2Ц(4,5-диметилтиазолил)-3-(4-сульфофенил) тетразолий, внутренняя соль;

NFB - ядерный фактор B, транскрипционный фактор; pI - изоэлектрическая точка; противоопухолевая активность - в данной работе - активность вещества по отношению к опухолевым клеткам, так или иначе приводящая к их гибели или замедлению пролиферации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектом исследования являлись ааптаминовые алкалоиды, выделенные из водно-этанольного экстракта морской губки Aaptos sp., отобранной в ходе скрининга морских губок на противоопухолевую цитотоксическую активность.

1. Выделение и установление химического строения ааптаминовых алкалоидов Ааптаминовые алкалоиды выделяли из двух сборов морской губки Aaptos sp. Из водно-этанольного экстракта губки первого сбора Aaptos sp.1, с помощью колоночной хроматографии на полихроме-1, силикагеле и последующей ВЭЖХ на обращенной фазе, был выделен новый ааптаминовый алкалоид - 3-(N-морфолинил)-деметилоксиааптамин (6), а также пять ранее известных соединений: ааптамин (1), деметилоксиааптамин (2), изоааптамин (3), 3-(изопентиламино)-деметилоксиааптамин (4) и 3-(фенетиламино)деметилоксиааптамин (5) (рис. 1). Из второго сбора губки Aaptos sp.2, собранного в том же месте, что и губка Aaptos sp.1, но двумя годами ранее, наряду с известными были выделены еще 3 новых ааптаминовых алкалоида: 3(метиламино)-деметилоксиааптамин (7), 2,3-дигидро-2,3-диоксоааптамин (8), 6(N-морфолинил)-4,5-дигидро-5-оксо-деметилоксиааптамин (9) (рис. 1).

Известные алкалоиды идентифицировали сравнением их спектральных данных с опубликованными в литературе, структура новых соединений была установлена при помощи анализа их масс-спектров, спектров 1Н и С ЯМР а также на основании данных экспериментов HMBC, HSQC и 1D NOE.

OCH3 OCHOCHHO O CH3O 9 9a 6a 9b HN N HN 3a N N N (3) (1) R OCHOCH(2) R = H O CH3O O 5' N 3' (4) R = NH 1' CHN 4' HN 2' 6' CHNH O O N 3' 5' (5) R = NH 2' 4' 1' 6' (8) (9) O OCH9' 7' O 8' O 1' N 5' 2' N (6) R = 3' 4' O N N 2' (6a) (7) R = NH CH1' Рисунок 1. Ааптаминовые алкалоиды из губок Aaptos sp.1 и Aaptos sp.Однако полученные спектральные данные для соединения 6 не позволяли сделать однозначного заключения о его строении и предполагали две равновероятные структуры 6 и 6а (рис. 1). Поэтому было проведено восстановление соединения 6 / 6a дитионитом натрия с последующей обработкой диазометаном (рис. 2), которое привело к образованию ааптамина (1) и подтвердило скелетную систему соединения 6. К настоящему времени известно лишь несколько морфолиновых производных, выделенных из морских организмов. Алкалоид 6 является первым ааптаминовым алкалоидом, содержащим морфолинильный фрагмент.

OCH3 OCHO CH3O 1. Na2S2O4, CH3CN+H2O комн. т., 30 мин N HN 2. CH2N2, (C2H5)2O, 60 мин N N (6) (1) N O Рисунок 2. Схема восстановления соединения 2. Изучение биологической активности ааптаминовых алкалоидов 2.1. Исследование цитотоксической активности Цитотоксическую активность выделенных алкалоидов 1-9 по отношению к десяти линиям опухолевых клеток человека и мыши, а также одной линии нормальных мышиных эпителиальных клеток изучали MTSметодом. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Цитотоксическая активность алкалоидов 1-Клеточная Вещество (IC50, мкM) Тип опухоли Линия 1 2 3 4 5 6 7 8 Моноцитарная THP-1 161.3 40.9 32.2 66.3 99.6 181.6 150.2 >200 >2лейкемия Промиелоцитарная HL-60 14.8 2.4 2.7 30.4 - 15.7 - - - лейкемия Рак шейки матки HeLa 151.1 18.6 50.7 82.3 120.5 101.9 - - - Рак кишечника DLD-1 177.8 24.1 - - - - - - - Рак кишечника SNU C-4 267 22.3 35.8 58.2 181.8 237.6 - - - Меланома SK-MEL-28 156.5 35 70.3 121.2 189.1 432.7 - - - Рак молочной MDA-MB-231 147.2 9.1 10.6 42.3 251.2 26.3 - - - железы Нейробластома* Neuro2a 63.2 5 3.3 - - 51.2 - - - Мышиные эпителиальные JB6 P+ Cl41 42.6 7.3 18.8 57.8 151.8 107.6 >200 - - клетки** Тестикулярная NT2 100.5 4.4 13.2 - - - - - - карцинома Тестикулярная карцинома NT2-R 106.2 4.5 12.5 - - - - - - (цисплатин устойчивая линия) * опухолевые мышиные клетки; ** нормальные мышиные клетки Наибольшую цитотоксическую активность из выделенных веществ проявлял деметилоксиааптамин (2), немногим менее активен был изоааптамин (3), остальные алкалоиды проявляли значительно более слабую цитотоксическую активность. Кроме того, как видно из таблицы 1, изученные вещества проявляли более сильное цитотоксическое действие по отношению к клеткам промиелоцитарной лейкемии (HL-60). Также примечательно, что ааптамин (1), деметилоксиааптамин (2) и изоааптамин (3) показывали одинаковую цитотоксическую активность как по отношению к чувствительным NT2, так и по отношению к лекарственно устойчивым NT2-R клеточным линиям.

2.2. Исследование канцерпревентивной активности Потенциальную канцерпревентивную активность ааптамина (1) и его аналогов 2-6 исследовали методом мягкого агара. Метод основан на способности мышиных эпителиальных JB6 P+ Cl41 клеток трансформироваться в опухолевые под действием эпидермального фактора роста (EGF) в качестве промотора и образовывать колонии в мягком агаре. Канцерпревентивную активность веществ описывают с помощью концентраций, вызывающих 50% ингибирование числа колоний трансформированных клеток (INCC50).

Проведённые эксперименты показывали, что исследуемые алкалоиды способны ингибировать злокачественную трансформацию JB6 P+ Cl41 клеток в нецитотоксических концентрациях. Чем больше относительная разница между IC50 и INCC50, тем больший потенциал имеет вещество в качестве профилактического препарата. Отношение IC50/INCC50 представлено в таблице 2. Лучший результат по этому показателю демонстрировал ааптамин (1), IC50/INCC50 = 20.3, наиболее слабый - деметилоксиааптамин (2) с IC50/INCC50=4.1, для остальных алкалоидов значение IC50/INCC50 было около 10. Эти результаты свидетельствовали о достаточно высоком потенциале ааптаминовых алкалоидов в качестве потенциальных средств профилактики опухолевых заболеваний.

Таблица 2. Значения IC50, Вещество 1 2 3 4 5 INCC50 и IC50/INCC50 для IC50, мкM 42.6 2.9 18.8 151.8 57.8 107.алкалоидов 1-6 по отноINCC50, мкM 2.1 0.7 2.1 15.7 5.7 10.шению к JB6 P+ Cl41 клетIC50/INCC50 20.3 4.1 9.0 9.7 10.1 10.кам Для выявления возможных механизмов канцерпревентивного действия ааптаминовых алкалоидов провели исследование влияния веществ на процессы активирования и ингибирования митоген-активируемых протеинкиназ ERKs, которые, как известно, играют важную роль в процессе EGF-индуцируемой опухолевой трансформации JB6 P+ Cl41 клеток, а ингибиторы фосфорилирования ERKs считаются потенциальными противоопухолевыми веществами. Однако в наших экспериментах не было зафиксировано ингибирования EGF-индуцируемого фосфорилирования ERKs в ходе предварительной обработки в течение 12 ч JB6 P+ Cl41 клеток ааптамином (1), деметилоксиааптамином (2) или изоааптамином (3). Напротив, через 1 ч обработки алкалоидами 1, 2 или 3 было зафиксировано повышение внутриклеточного уровня фосфорилированых ERKs, причем в неактивированных с помощью EGF JB6 P+ Cl41 клетках и только в цитотоксических концентрациях. Это свидетельствует о том, что ERKs, вероятно, играют важную роль в клеточном ответе на воздействие цитотоксических концентраций исследуемых алкалоидов, но, скорее всего, не опосредуют канцерпревентивный эффект, демонстрируемый алкалоидами 1, 2 и 3.

Мы исследовали также влияние выделенных ааптаминовых алкалоидов на транскрипционную активность ядерных факторов AP-1, NFB и p53. Было показано, что после 24 ч инкубирования с клетками, вещества 1, 2 и активировали транскрипционную активность AP-1 в концентрациях 400, 10 и 10 мкМ, соответственно. Для соединений 4, 5, 6 и 7 в пределах всех исследованных концентраций (до 100-200 мкМ) через 24 ч инкубирования с клетками наблюдалось ингибирование AP-1 транскрипционной активности.

Таким образом, изученные алкалоиды дифференцированно влияют на активность ядерного фактора транскрипции АР-1.

Также дифференцировано действовали исследуемые алкалоиды и на транскрипционную активность ядерного фактора NFB. Вещества 1, 2, 3, 5 и через 24 ч инкубирования с клетками, активировали NFB-зависимую транскрипционную активность. С другой стороны, алкалоиды 4 и 7 также через 24 часа, напротив, ингибировали транскрипционную активность ядерного фактора NFB.

При исследовании влияния алкалоидов 1-7 на транскрипционную активность белка-супрессора опухолей р53 было показано, что ааптамин (1) в концентрации 400 мкМ, через 24 ч инкубирования с клетками активировал транскрипционную активность белка p53. Все остальные соединения 2-7 в диапазоне всех исследованных концентраций ингибировали транскрипционную активность p53 после 24 ч воздействия на клетки.

2.3. Исследование влияния ааптамина на способность к пролиферации и жизнеспособность NT2 опухолевых клеток человека С помощью трипанового синего установили, что при обработке NTклеток ааптамином в концентрации 50 мкМ в течение 48 часов происходит ингибирование скорости клеточного роста (снижение общего количества клеток до 40.99.9%, по сравнению с контролем). При этом не наблюдалось значительного снижения жизнеспособности клеток (85.820.8% живых клеток по сравнению с контролем). Определённое MTS-методом значение IC50 для ааптамина по отношению к NT2 клеткам составило 54.5 мкМ, что хорошо согласуется с результатом, полученным методом трипанового синего.

Вестерн-блоттинг показал, что ааптамин (1) в концентрациях от 1 до мкМ не активирует в NT2 клетках про-апоптотические белки PARP и каспазу-3, которые в активированном виде являются маркерами апоптоза. С помощью метода проточной цитометрии и двойного окрашивания клеток красителями аннексин-V-FLUOS и пропидий йодидом (рис. 3 А) или анализа фрагментации ДНК с использованием окрашивания пропидий-йодидом (рис. 3 Б) также было показано, что ааптамин даже в концентрациях до 100 мкМ включительно не вызывает значительного увеличения количества апоптотических NT2 клеток по сравнению с контролем.

Таким образом, с помощью методов трипанового синего, Вестернблоттинга и проточной цитометрии было показано, что ааптамин в концентрациях по крайней мере до 50 мкМ включительно проявляет антипролиферативные, но не цитотоксические свойства.

контроль ааптамин, 50 мкM p < 0.05 p < 0.н.д.

G1 S G2/M Рисунок 3. Результаты экспериментов по Рисунок 4. Диаграмма исследовананию способности ааптамина индуциро- распределения обрабовать апоптоз NT2 клеток. Использовали метод танных ааптамином NTпроточной цитометрии с использованием двойного клеток по фазам окрашивания аннексином-V-FLUOS и PI (А) и клеточного цикла окрашивание ДНКс помощью PI (Б) Анализ распределения по фазам клеточного цикла NT2 клеток, обработанных 50 мкМ ааптамина в течение 48 ч, выявил остановку клеточного цикла в фазе G2/M, то есть на стадии подготовки к митозу/стадии митоза (рис.

4). Это согласуется с ранее опубликованными двумя независимыми группами исследователей данными, в которых была показана остановка клеточного цикла MG63 клеток в G2/M фазе и ап-регуляция белка p21 - ингибитора циклинзависимой киназы CDK4, при обработке клеток ааптамином. Однако, выполненный нами Вестерн-блоттинг и ПЦР анализ для NT2 клеток выявили только едва уловимое увеличение экспрессии белка p21 и кодирующей его мРНК под действием на клетки ааптамина. Можно предположить, что разные клеточные линии неодинаково реагируют на воздействие ааптамином.

2.4. Исследование белков, регулируемых при действии нецитотоксических концентраций ааптамина на NT2 клетки Следующей нашей целью было выявление белков-мишеней ааптамина в NT2 клетках. NT2 клетки были обработаны ааптамином в нецитотоксической концентрации 50 мкМ в течение 48 ч. Полученный с помощью 2D-PAGE двумерный гель, представляющий картину экспрессии различных белков в виде окрашенных кумасси бриллиантовым синим G-250 белковых пятен (рис. 5), отсканировали и сравнили с картиной экспрессии белков в необработанных веществом клетках. Сравнение и анализ проводили с помощью программы Delta 2D.

% клеток в данной фазе клеточного цикла Рисунок 5. 2D-электрофореграмма экстракта NT2 клеток, обработанных ааптамином. На 2D-геле отмечены регулируемые белки, представлены названия соответствующих им генов Всего было выявлено 909 белковых пятен, интенсивность окраски 10 из которых изменилась в 2 раза и более при обработке клеток ааптамином.

Интенсивность окраски пяти пятен 1-5, при обработке клеток веществом уменьшалась, других пяти пятен 6-10 увеличивалась (табл. 3). Все 10 белковых пятен вырезали из геля, и обработали трипсином с целью получения набора пептидов, которые далее проанализировали с помощью тандемной массспектрометрии. Содержащиеся в вырезанных пятнах белки были идентифицированы на основании сравнения полученных масс-спектров образующихся из них пептидов с информацией из баз данных. В результате выяснили, что ап-регулируемые под действием ааптамина пятна на 2D-PAGE геле соответствовали белкам, кодируемым генами PEA15, TPT1, CTSD CRABP2 и CFL1, даун-регулируемые пятна - белкам, кодируемым генами EIF5A, ENO1, CSDE1, ACL6A и SRSF3 (табл. 3). Пятно 11 на рисунке соответствует одной из изоформ белка eIF5A (гипузинированная изоформа), что было выяснено в ходе дальнейших экспериментов.

Далее более подробно исследовали изменения, происходящие с четырьмя белками, наиболее существенно регулируемыми при действии ааптамина на NT2 клетки согласно результатам 2D-PAGE. Ими были: даунрегулируемые эукариотический фактор инициации трансляции 5A-1 (eIF5A) и альфа-энолаза, а также ап-регулируемые кофилин-1 и клеточный ретиноевая кислота-связывающий белок 2 (CRABP2) (табл. 3).

Таблица 3. Белки, регулируемые в NT2 клетках под действием ааптамина.

Номера белков соответствуют номерам пятен на рисунке Номер Относительное Назва- Теор.

Номер в базе Теор. изменение ние Название белка Mw Функция белка пятна Swiss- pI интенсивности гена (кДа) Prot окраски пятна Эукариотический фактор 1 EIF5A инициации трансляции 5A-1 P63241 16821 5.1 0.16 Биосинтез белка (eIF5A) Связывание ДНК, Регуляция 2 ENO1 Альфа-энолаза P06733 47139 7.0 0.транскрипции и метаболизм углеводов Белок E1, содержащий Регуляция трансляции 3 CSDE1 O75534 88829 5.9 0.домен холодового шока (связывание РНК) Регуляция трансляции 4 ACL6A Актин-подобный белок 6A O96019 47430 5.4 0.(связывание РНК) Аргинин/серинРегуляция трансляции 5 SRSF3 обогащенный P84103 19318 11.6 0.(процессинг РНК) фактор сплайсинга Фосфопротеин 6 PEA15 Q15121 15031 4.9 2.03 Передача сигналов астроцитов PEA-Трансляционно- Цитоскелет и 7 TPT1 контролируемый P13693 19583 4.8 2.клеточное движение опухолевый белок Метаболизм 8 CTSD Катепсин D P07339 44524 6.1 2.20 (внутриклеточное разрушение белков) Клеточный ретиноевая Передача сигналов / 9 CRABP2 кислота-cвязывающий P29373 15683 5.4 2.дифференциация белок 2 (CRABP2) Цитоскелет и 10 CFL1 Кофилин-1 P23528 18491 8.2 3.клеточное движение Регуляция интенсивости белкового пятна на 2D-PAGE геле, а, следовательно, и общего внутриклеточного уровня соответствующего белка или одной из его изоформ, может быть вызвана изменением концентрации кодирующей белок соответствующей мРНК (транскрипционный уровень), изменением уровня экспрессии белка (трансляционный уровень), посттрансляционной модификацией белка (в случае изменения интенсивности пятна, соответствующей одной из изоформ белка), а также деградацией белка, либо одной из его изоформ. Для того чтобы понять, какие процессы стали причиной наблюдаемой регуляции внутриклеточных уровней четырёх вышеупомянутых белков, применили метод полимеразно-цепной реакции в реальном времени с обратной транскриптазой (ПЦР-РВ). Результаты ПЦР-РВ выявили ап-регуляцию уровня мРНК, соответствующей двум из четырёх белков - CRABP2 и кофилину-1 (рис. 6). Для белка CRABP2 была выявлена апрегуляция мРНК на 400% по сравнению с контролем. Увеличение количества мРНК, кодирующей кофилин-1, было не столь велико - около 50% (рис. 6).

Рисунок 6. Диаграмма уровней экспрессий мРНК, кодирующих четыре белка, наиболее сильно регулируемых под действием ааптамина на NT2 клетки (согласно рузельтатам 2DPAGE). Данные получены с помощью ПЦР-РВ. н.д.:

не достоверно (статистически недостоверное отличие значений друг от друга, p > 0.05, t-тест Стьюдента) Затем изменения, происходящие с белками eIF5A, альфа-энолаза, кофилин-1 и CRABP2, были исследованы с помощью Вестерн-блоттинга и 2DВестерн-блоттинга, который позволяет разделять белки не только по их молекулярной массе, но и по изоэлектрической точке (pI, рис. 7). Различия в pI часто бывают вызваны посттрансляционными модификациями белка, такими как фосфорилирование или ацетилирование.

В результате для белка eIF5A было показано его гипузинирование под действием ааптамина на NT2 клетки (рис. 7 А). Процесс гипузинирования представляет собой присоединение остатка спермидина к лизину50 с образованием гипузина (рис. 8). Этот процесс приводит к активации eIF5A.

Содержание негипузинированной модификации белка (pI = 5.0) уменьшалось в обработанных ааптамином NT2 клетках (рис. 7 А), в то время как определённое методом Вестерн-блоттинга общее количество белка оставалось неизменным.

Этот факт хорошо коррелировал с данными ПЦР-РВ (рис. 6) и свидетельствовал о накоплении гипузинированной формы eIF5A (pI = 5.2, рис.

7 А), то есть активации белка.

2D-Вестерн-блоттинг выявил несколько пятен, соответствующих нескольким изоформам белка альфа-энолаза. Было показано увеличение внутриклеточных уровней одних изоформ альфа-энолазы с одновременным уменьшением других (рис. 7 Б) по сравнению в контролем. В то же время Вестерн-блоттинг не выявил никаких существенных изменений в общем количестве альфа-энолазы (рис. 7 Б), что согласуется с данными ПЦР-РВ (рис.

6).

Рисунок 7. Результаты анализа методом Вестерн-блоттинга и 2D-Вестернблоттинга изменений, происходящих с белками eIF5A (А), альфа-энолазой (Б), CRABP2 (В) и кофилином-1 (Г) под действием ааптамина на NT2 клетки Для белка CRABP2 с помощью 2D-Вестерн-блоттинга было выявлено пятна с Mw = 16 кДа, но с разными значениями pI (pI = 5.3 и pI = 5.5, рис. 7 В).

Дальнейшие исследования показали, что пятно, находящееся в более кислой области значений pI (pI = 5.3), принадлежит белку CRABP1 и было распознано поликлональными антителами против CRAPB2 вследствие их перекрёстной реактивности. В результате пятно с pI = 5.5, интенсивность которого увеличивается после обработки NT2 клеток ааптамином, было идентифицировано как CRAPB2 (рис. 7 В). Поскольку ПЦР-РВ анализ также показал значительное увеличение уровня соответствующей белку CRAPBмРНК (рис. 6), то очевидно, что ап-регуляция белка CRABP2 в NT2 клетках под действием ааптамина происходит на транскрипционном уровне.

Для кофилина-1 2D-Вестерн-блоттинг показал наличие двух пятен с pI = 6.7 и pI = 7.0 (рис. 7 Г). Известно, что кофилин-1 способен претерпевать такую посттрансляционную модификацию, как фосфорилирование. Ранее пятно, располагающееся в более кислой области pI (pI = 6.7), было описано как фосфорилированная (неактивная) форма кофилина-1, а в менее кислой области (pI = 7.0) - как нефосфорилированная (активная) форма. Таким образом, наблюдаемое увеличение интенсивности окраски пятна с pI = 6.свидетельствует о стимулировании фосфорилирования, то есть о накоплении неактивной формы кофилина-1 вследствие обработки NT2 клеток ааптамином (рис. 7 Г).

2.5. Исследование процесса гипузинирования белка eIF5A при действии ааптамина на NT2 клетки Известно, что eIF5A способен претерпевать уникальный процесс гипузинирования - включения в структуру белка (по положению лизин50) остатка спермидина с дальнейшим гидроксилированием последнего.

Описанные выше процессы контролируются ферментами деоксигипузин синтазой (DHS) и деоксигипузин гидроксилазой (DOHH), соответственно.

имитирующей стадией процесса является катализируемое DHS присоединение остатка спермидина. Схема процесса гипузинирования представлена на рисунке 8. Гипузинирование необходимо для активирования белка eIF5A и дальнейшего его участия в процессах клеточной пролиферации и дифференциации.

Рисунок 8. Процесс гипузинирования белка eIF5A (Meier et al., 2010) Нами был исследован процесс гипузинирования белка eIF5A под действием ааптамина в концентрации 50 мкМ на NT2 клетки. С помощью массспектров продуктов расщепления белков, содержащихся в пятнах (негипузинированная форма eIF5A) и 11 (гипузинированная форма eIF5A, см.

рис. 5), было показано наличие остатка гипузина в белке, содержащемся в пятне 11 и его отсутствие в пятне 1. Для подтверждения факта увеличения гипузинирования eIF5A под действием ааптамина на NT2 клетки провели эксперимент, основанный на уникальном свойстве белка eIF5A включать в свою молекулу остаток спермидина в процессе гипузинирования как in vitro, так и in vivo. В полном соответствии с результатами 2D-Вестерн-блоттинга, а также масс-спектрометрического анализа, обработка NT2 клеток ааптамином в концентрациях 1-50 мкМ в присутствии 3H-сперминдина в течение 48 ч привела к доза-зависимому повышению уровня радиоактивности общего белкового экстракта, что свидетельствовало о повышении уровня потребления спермидина, а, следовательно, и о накоплении гипузинированной (активной) формы белка eIF5A. С целью выяснения причины происходящего увеличения гипузинирования белка eIF5A, нами было исследовано влияние ааптамина в NT2 клетках на уровни экспрессии DHS и DOHH - ключевых ферментов процесса гипузинирования, а также на активность in vitro выделенного в чистом виде DHS - фермента, катализирующего лимитирующую стадию процесса гипузинирования (рис. 8). Однако Вестерн-блоттинг не показал существенных изменений в уровнях экспрессии ферментов DHS и DOHH в NT2 клетках под действием ааптамина в концентрации до 50 мкМ. Кроме того, не было выявлено изменения уровня in vitro ферментативной активности DHS в присутствии ааптамина. В то же время, не исключено, что ааптамин является модулятором активности DHS в живых клетках NT2, действуя на какие-то иные факторы, отсутствующие в нашем эксперименте по исследованию in vitro ферментативной активности очищенного DHS.

Кроме того, активирование процесса гипузинирования под действием ааптамина на клетки NT2 может быть связано с протеасом-ингибирующей активностью ааптамина, сообщение о которой было опубликовано недавно. В самом деле, нами было показано, что известный ингибитор протеасом MG-1при воздействии на NT2 клетки вызывал похожие изменения в соотношении изоформ белка eIF5A. Однако это наблюдение ожидает дополнительной проверки.

Следовательно, активирование процесса гипузинирования eIF5A при действии ааптамина на NT2 клетки - это первый случай активирования гипузинирования, зафиксированный для низкомолекулярного соединения. Для того чтобы понять вклад активации белка eIF5A в производимый ааптамином антипролиферативный эффект, мы исследовали скорость пролиферации NTклеток со сверхэкспрессированным DHS. Сверхэкспрессия фермента DHS ожидаемо вызвала повышение уровня гипузинированого (активного) eIF5A на ~20%, однако это не привело ни к активированию пролиферации NT2 клеток, ни к ее ингибированию. Таким образом, активирование eIF5A не обуславливает антипролиферативные свойства ааптамина в NT2 клетках.

2.6. Возможные механизмы противоопухолевого действия ааптамина Согласно результатам проведенных экспериментов по воздействию ааптамина на трансформированные JB6 Cl41 и опухолевые NT2 клетки можно предложить механизм его канцерпревентивной, цитостатической и цитотоксической активностей. Ааптамин проявляет канцерпревентивную и цитостатическую активность в нецитотоксических концентрациях. Механизм такого действия ааптамина на трансформируемые или опухолевые клетки связан с проявлением ааптамином антипролиферативного действия, выражающегося в аресте клеточного цикла в фазе G2/М, а также с регулированием внутриклеточных уровней и активности белков eIF5A, альфаэнолаза, кофилин-1 и CRABP2. Эти белки участвуют в таких процессах, как регулирование клеточного роста (eIF5A и альфа-энолаза), апоптоз, дифференциация, и пролиферация (кофилин-1 и CRABP2). Механизм канцерпревентивного действия ааптамина не связан с ингибированием фосфорилирования ERKs.

Цитотоксический эффект ааптамина, скорее всего, реализуется через активирование фосфорилирования ERKs, с последующим увеличением транскрипционной активности АР-1 и NF-B ядерных факторов, активированием белка-суппрессора опухолей р53 и дальнейшей индукцией апоптоза.

2.7. Исследование воздействия ааптамина, деметилоксиааптамина и изоааптамина на лекарственно-устойчивые NT2-R клетки тестикулярной карциномы человека По сравнению с нормальными NT2 клетками клетки NT2-R проявляют высокую устойчивость к противоопухолевому препарату цисплатину, применяемому для лечения тестикулярной карциномы человека. С помощью MTS-метода было показано, что алкалоиды 1, 2 и 3, в отличие от цисплатина, проявляют одинаковую цитотоксическую и/или антипролиферативную активность по отношению к клеткам NT2 и NT2-R. С использованием метода трипанового синего определили, что ааптамин (1), деметилоксиааптамин (2) и изоааптамин (3) уменьшают количество жизнеспособных (трипановый синий-отрицательных) NT2-R клеток на 50% через 48 ч обработки в концентрациях 50 мкМ, 4.5 мкМ и 12.5 мкМ соответственно. Далее исследовали действие алкалоидов 1, 2 и 3 на NT2-R клетки в этих концентрациях.

Рисунок 9. Результаты экспериментов по исследованию способности алкалоидов 1, 2 и 3 индуцировать апоптоз NT2-R клеток. Применяли метод проточной цитометрии с использованием двойного окрашивания аннексиномV-FLUOS и PI (А) и окрашивания ДНК с помощью PI (Б) С помощью проточной цитометрии была показана способность деметилоксиааптамина и изоааптамина индуцировать апоптоз в NT2-R клетках в концентрациях 4.5 мкМ и 12.5 мкМ, соответственно (рис. 9 А, Б). Ааптамин в концентрации 50 мкМ практически не индуцировал апоптоз в NT2-R клетках (рис. 9) и, следовательно, его воздействие на NT2-R клетки в этой концентрации также, как и на NT2 клетки, является антипролиферативным, но не апоптоз-индуцирующим или не цитотоксическим.

Индукция апоптоза в NT2-R клетках под действием деметилоксиааптамина и изоааптамина была подтверждена Вестернблоттингом, который выявил активацию PARP и каспазы-3 под действием соединений 2 и 3 в указанных концентрациях (рис. 10) На основании результатов изучения антипролиферативного и апоптозиндуцирующего воздействия алкалоидов 1, 2 и 3 на NT2-R клетки можно сделать вывод о перспективности их дальнейшего изучения как потенциальных средств терапии лекарственно-устойчивых типов опухолей.

Рисунок 10. Результат анализа методом Вестерн-блоттинга способности алкалоидов 1, 2 и 3 индуцировать апоптоз NT2-R клеток Далее нами были проанализированы изменения в протеоме устойчивой к цисплатину NT2-R линии клеток, обработанных алкалоидами 1, 2 или 3 в концентрациях 50 мкМ, 4.5 мкМ и 12.5 мкМ, соответственно, в течение 48 ч.

Анализ проводили так же, как описано для ааптамина в п. 2.4.

При анализе методами протеомики экстракта NT2-R клеток после воздействия на них ааптамина на гелях было выявлено 22 белковых пятна с изменённой в 2 и более раза интенсивностью окраски. Интенсивность семи соответствующих пятен в обработанных клетках увеличивалась, пятнадцати - уменьшалась. С помощью Вестерн-блоттинга и 2D-Вестерн-блоттинга было показано, что при действии ааптамина (1) на NT2-R клетки, аналогично NTклеткам, происходит гипузинирование белка eIF5A, а также фосфорилирование кофилина-1 (рис. 11 А). Кроме того, нами показано происходящее под действием ааптамина дефосфорилирование виментина (рис. 11 А). Известно, что подобный процесс наблюдается при регулировании стадии митоза клеток и связан с дезассемблированием и реорганизацией виментиновых филаментов.

При анализе методами протеомики экстракта NT2-R клеток после воздействия на них деметилоксиааптамина (2) на гелях было выявлено белковых пятен с изменённой в 2 и более раза интенсивностью окраски.

Интенсивность шести пятен в обработанных клетках увеличивалась, десяти - уменьшалась. С помощью Вестерн-блоттинга и 2D-Вестерн-блоттинга было показано, что при действии деметилоксиааптамина на NT2-R клетки происходит увеличение общего количества шаперона Hsp70, который, взаимодействуя с другими шаперонами, стабилизирует белки, предохраняет их от агрегации и обеспечивает правильное сворачивание (фолдинг) вновь синтезируемых белков (рис. 11 Б). Кроме того, было показано изменение соотношение изоформ альфа-энолазы в NT2-R клетках при обработке клеток деметилоксиааптамином (рис. 11 Б). Интересно, что в отличие от ааптамина, обработка NT2-R клеток деметилоксиааптамином не приводила к гипузинированию белка eIF5A.

При анализе методами протеомики экстракта NT2-R клеток после воздействия на них изоааптамина (3) на гелях было выявлено 17 белковых пятен с изменённой в 2 и более раз интенсивностью окраски. Интенсивность тринадцати пятен в обработанных клетках увеличивалась, четырёх - уменьшалась. С помощью Вестерн-блоттинга и 2D-Вестерн-блоттинга было показано, что при действии изоааптамина на NT2-R клетки происходит увеличение интенсивности сигнала одной из изоформ нуклеолина (указана стрелкой на рис. 11 В) с Mw 100 кДа. 2D-Вестерн-блоттинг выявил увеличение количества изоформы нуклеолина со значением pI = 5.4 (рис. 11 В, изоформа указана стрелкой). Нуклеолин обычно находится в виде комплекса с основными белками (такими как гистон H1) и РНК-содержащими структурами. Основное количество нуклеолина, как было показано с помощью 2D-Вестерн-блоттинга, имело Mw = 110 кДа и значение pI 7.0. Появление регулируемой изоформы нуклеолина (пятна с pI = 5.4), по всей видимости, свидетельствует о разрушении вышеупомянутого комплекса при действии изоааптамина на клетки. Также как и в случае деметилоксиааптамина, обработка клеток изоааптамином не приводила к гипузинированию белка eIF5A.

По результатам анализа воздействия ааптамина, деметилоксиааптамина и изоааптамина на протеом NT2-R клеток не было выявлено ни одного одинакового белка, который бы регулировался всеми тремя исследуемыми алкалоидами 1, 2 и 3.

А С Б Рисунок 11. Результаты анализа методом Вестернблоттинга и 2D-Вестернблоттинга изменений, происходящих с некоторыми белками в NT2-R клетках, при действии алкалоидов (А), 2 (Б) или 3 (В) С помощью классификационной системы PANTHER нами был проведён функциональный анализ белков, регулируемых в NT2-R клетках при действии исследуемых алкалоидов. Примечательно, что при практически полном отсутствии совпадений в белках, регулируемых при действии на клетки соединений 1, 2 или 3, наблюдается значительное сходство в профилях распределения этих белков по молекулярным функциям и участию в биологических процессах. Установлено, что большинство регулируемых белков обладает каталитической, а также ДНК- и белок-связывающей активностями и принимает участие в таких биологических процессах, как метаболизм белков и нуклеиновых кислот, а также организация клеточных компонентов.

Анализ взаимодействий белков, регулируемых под действием алкалоидов 1, 2 и 3 в NT2-R клетках, а также белков, предположительно участвующих в клеточном ответе на воздействие исследуемых веществ, был произведён с помощью программы IPA. В центре пост

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по химии