Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по разное
На правах рукописи
КАЛЬНИЦКАЯ ОКСАНА ИВАНОВНА
ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНЫЙ КОНТРОЛЬ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АНТИБИОТИКОВ В СЫРЬЕ И ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ НА ОСНОВЕ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОЛОГИЙ
16.00.06 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук
Москва 2008
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Концепция государственной политики здорового питания населения России на период до 2010 года предусматривает совершенствование нормативно-методической базы государственного надзора за качеством и безопасностью сырья и продуктов животного происхождения, поступаемых к потребителю.
В связи с изменением характера отечественного рынка за последние годы в стране принимаются меры по интеграции российской экономики в мировую. Для этого максимально учитываются требования, предъявляемые к России странами - участницами Всемирной торговой организации (ВТО).
Увеличение производительности и, как следствие, снижение себестоимости продукции достигаются при рациональном применении антибиотиков и стимуляторов роста (в животноводстве и птицеводстве), гербицидов, инсектицидов, фунгицидов (в растениеводстве).
Отечественные производители сельскохозяйственной продукции, использующие в соответствии со своим технологическим регламентом антибиотики, пестициды и стимуляторы роста, должны гарантировать безопасность продукции для здоровья человека. То есть остаточное содержание этих потенциально опасных химических соединений в готовой продукции должно быть ниже предельно допустимых уровней, определенных законодательством (Даниленко В.Н., 2005; Демидова Л.Д., 1997).
Риск загрязнения продовольственного сырья потенциально опасными химическими соединениями может быть снижен только при эффективной системе контроля на всех стадиях - от производства до реализации. Вследствие этого к методам массового контроля вредных соединений в сырье и продуктах животного происхождения должны предъявляться весьма жесткие требования - методы должны быть надежны, просты, оперативны, они должны обеспечивать высокую чувствительность и селективность определения (Донченко Л.В., Надыкта В.Д., 1999; Elsheikh H.A., 2002; Heeschen W., Suhren G., 1993).
Попадание в организм человека антибиотиков с пищевыми продуктами крайне нежелательно, поскольку они могут оказывать токсическое действие, чаще всего в виде возникновения аллергических реакций, дисбактериозов и других неблагоприятных явлений. Все это дает основание для самого тщательного контроля сырья и продуктов животного происхождения на наличие в них остатков антибиотиков.
Проблема является предметом обсуждения как в национальных, так и в международных масштабах. В Российской Федерации действуют санитарно-эпидемиологические правила и нормативы Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов (СанПиН 2.3.2.1078-01), где четко регламентируется содержание ряда антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения.
абораториям для практической работы на сегодняшний день требуются легко доступные экспресс-методы с высокой чувствительностью и удовлетворительными метрологическими характеристиками. Такие методы позволят обнаружить остаточные количества антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения и изучить динамику их разрушения при технологических процессах, принятых на производстве.
В этом направлении имеется много работ отечественных и зарубежных исследователей (Дмитриева В.С., Семенов С.М., 1965; Дружинина Е.Н., Суворкина Д.В., 1968; Карташова В.М., 1980; Аксенов В.И., Ковалев В.Ф., Виолин Б.В., 1988; Демидова Л.Д., 1997; Grove D.C., Randall W.A., 1958; Hamann J., Tolle A., Heeschen W., 1975, 1979; Craven N., 1987; Elsheikh H.A., Taha A.A., Osman J., 2002).
Несмотря на высокую актуальность, попыток комплексной оценки всей проблемы предпринято мало и носят они фрагментарный характер.
Единая концепция и подход к применению лекарственных препаратов по принципу строжайшего контроля их использования, а также разработка и применение различных современных методов анализа антибиотиков позволят гарантировать выпуск продуктов здорового питания, свободных от присутствия лекарственных препаратов и отвечающих требованиям стандартов по качеству и безопасности.
Цель исследования - изучить и разработать методы ветеринарно-санитарного контроля остаточных количеств антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения, провести мониторинг загрязнения продукции антибиотиками, применяемыми в животноводстве и ветеринарии, модифицировать микробиологический метод определения остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства, разработать рекомендации по уменьшению количества антибиотиков в мясе, молоке и научно обосновать ветеринарно-санитарную оценку сырья, содержащего остаточные количества антибиотиков.
Задачи исследования:
Изучить уровень загрязнения сырья и продуктов животного происхождения антибиотиками, применяемыми в животноводстве, ветеринарии, мясной и молочной промышленности и определить наиболее часто встречающиеся антибиотики.
Подобрать специфичные и чувствительные тест-культуры к наиболее широкому спектру антибиотиков, применяемых в ветеринарии, животноводстве и мясомолочной промышленности.
Модифицировать метод микробиологического определения антибиотиков в субстрате с помощью унифицированных тест-культур.
Разработать способы наиболее полной экстракции антибиотиков из мышечной ткани, паренхиматозных органов, молока, яиц.
Провести сравнительный анализ чувствительности лабораторных методов выявления антибиотиков в продуктах животноводства (ИФА, ВЭЖХ, микробиологический метод).
Предложить способы технологической обработки продуктов убоя и молока для уменьшения содержания в них наиболее часто встречающихся антибиотиков.
Дать ветеринарно-санитарную оценку продукции животноводства при обнаружении остаточных количеств антибиотиков.
Разработать и предложить для внесения в ветеринарное законодательство рекомендации по снижению остаточных количеств антибиотиков в молоке и продуктах убоя в условиях перерабатывающих предприятий.
Научная новизна работы состоит в том, что впервые соискателем представлен уровень распространения сырья и продуктов животного происхождения, не отвечающих требованиям качества и безопасности СанПиН 2.3.2.1078-01 по содержанию остаточных количеств антибиотиков, а также определены наиболее часто встречающиеся антибиотики.
Подобраны унифицированные чувствительные штаммы в качестве тест-культур для определения в субстрате основных антибиотиков, применяемых в современной ветеринарии, животноводстве и пищевой промышленности для задержки порчи многих пищевых продуктов в процессе хранения.
Разработан пластинчатый метод определения антибиотиков в биологических субстратах на основании двух отобранных штаммов Bac. subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341, чувствительных к широкому спектру современных антибиотиков. Предложены методы пробоподготовки продуктов животноводства для определения в них остаточных количеств антибиотиков.
В сравнительном аспекте изучена чувствительность методов иммуноферментного анализа, высокоэффективной жидкостной хроматографии и микробиологического метода, позволяющих определять наличие антибиотиков в биологических субстратах.
Изучена чувствительность микробиологической тест-системы Дельвотест-R (Нидерланды) к широкому спектру антибиотиков, применяющихся при производстве молока. Изучена возможность использования тест-системы Дельвотест-R при различных уровнях загрязнения молока антибиотиками.
Разработаны технологические режимы обработки мяса и молока для уменьшения в них остаточных количеств антибиотиков.
Дана научно обоснованная ветеринарно-санитарная оценка мяса и молока, содержащего остаточные количества антибиотиков.
Теоретическая и практическая значимость работы.
На основе проведенных мониторинговых исследований представлен уровень распространения сырья и продуктов животного происхождения, не отвечающих требованиям качества и безопасности СанПиН 2.3.2.1078-01 по содержанию остаточных количеств антибиотиков. Материалы мониторинга по определению уровня загрязнения пищевых продуктов и сырья животного происхождения антибиотиками использованы в плане мероприятий г. Москвы по снижению уровня загрязнения животноводческой продукции антибиотиками.
Разработана схема подбора различных штаммов микроорганизмов для обнаружения антибиотиков в продуктах животного происхождения. Отделением ветеринарной медицины РАСХН утверждены методические рекомендации Подбор микробиологической тест-системы для обнаружения антибиотиков в продуктах животного происхождения (11.05.05 г.).
Разработан пластинчатый метод определения антибиотиков в биологических субстратах на основании двух отобранных штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341, чувствительных к широкому спектру современных антибиотиков. Отделением ветеринарной медицины РАСХН утверждены методические рекомендации Определение концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения пластинчатым методом с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341 (11.05.05 г.).
Разработаны и апробированы в условиях производственного предприятия ОАО ТАМП методы пробоподготовки продуктов животноводства для определения в них остаточных количеств антибиотиков.
Проведен сравнительный анализ чувствительности методов иммуноферментного анализа, высокоэффективной жидкостной хроматографии и микробиологического метода для определения антибиотиков в мышечной ткани, молоке, яйцах.
Определен нижний предел чувствительности микробиологической системы Дельвотест-R к широкому спектру антибиотиков, применяющихся при производстве молока. Отделением ветеринарной медицины РАСХН утверждены методические рекомендации Чувствительность микробиологической тест-системы ДЕЛЬВОТЕСТ-R к антибиотикам, применяемым в животноводстве и ветеринарии (06.02.08 г.).
Разработаны и научно обоснованы технологические режимы, способствующие уменьшению остаточных количеств антибиотиков в мышечной ткани и молоке. Отделением ветеринарной медицины РАСХН утверждены методические рекомендации по ветеринарно-санитарной оценке продуктов убоя, содержащих остаточные количества антибиотиков (12.10.06 г).
Дана ветеринарно-санитарная оценка продукции животноводства, содержащей антибиотики и практические рекомендации по ее использованию. Отделением ветеринарной медицины РАСХН утверждены методические рекомендации Снижение содержания остаточных количеств антибиотиков в молоке под действием режимов пастеризации, стерилизации и сквашивания (06.02.08 г.).
На основании результатов исследований в ветеринарное законодательство внесены предложения по ветеринарно-санитарной экспертизе сырья и продуктов животного происхождения, содержащих остаточные количества антибиотиков.
УМО по образованию в области технологии сырья и продуктов животного происхождения утвердило 2 учебных пособия: Ксенобиотики лекарственного происхождения в продукции животноводства - М.: МГУПБ, 2006. - 93 с. и Методы лабораторного контроля животноводческой продукции, содержащей антибиотики - М.: МГУПБ, 2006.Ц98 с.
Материалы диссертации используются в цикле лекций МГУПБ по курсу Ветеринарно-санитарная экспертиза, Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии пищевых производств.
Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в рамках распоряжения № 173 от 30.08.2005 г. начальника Объединения города Москвы А.Н. Туника во исполнение п. 17 постановления Правительства города Москвы № 59-ПП Об основных направлениях укрепления продовольственной безопасности города Москвы на дальнейшую перспективу и в рамках научно-исследовательской работы Определение остаточных количеств антибактериальных веществ в продукции животноводства в соответствии с планом НИР МГУПБ, регистрационный номер 7 - 3 - 06. Код темы по ГРНТИ 68.41.05, 62.01.37.
Апробация работы. Результаты научных и экспериментальных исследований доложены на:
- 2-ой Научно-практической конференции Новые фармакологические средства для животноводства и ветеринарии - Краснодар, 2001;
- 4-ой и 5-ой Международных научно-практических конференциях Пища. Экология. Человек - М., 2001, 2003;
- Международной научно-технической конференции Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях - Воронеж, 2002;
- 4-ой и 5-ой Международных научно-практических конференциях Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции - М., 2002, 2004;
- Международной научно-практической конференции Состояние и проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии в животноводстве - Чебоксары, 2004;
- 12-ом Международном ветеринарном конгрессе - М., 2004;
- 8-ом Всероссийском Конгрессе Оптимальное питание - здоровье нации - М., 2005;
- Международной конференции Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды - Саратов, 2005;
- Международной научно-практической конференции Актуальные проблемы ветеринарной медицины - Санкт-Петербург, 2005;
- Международной научно-практической конференции Пищевые технологии Ц2005 - Одесса, 2005;
- Третьем съезде общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова - М., 2005;
- 4 Международной научной конференции Живые системы и биологическая безопасность населения - М., 2005;
- Международном симпозиуме Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителейопасных инфекционных заболеваний - Казань, 2005;
- Всероссийской конференции Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы - М., 2005;
- Симпозиуме Научное обеспечение инновационных процессов в перерабатывающих отраслях АПК - М., 2005;
- Второй Международной научно-практической конференции Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности - Санкт-Петербург, 2006;
- Международной конференции Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы - М., 2006;
- Международной научно-практической конференции Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии - М., 2006;
- Х Конгрессе педиатров России Актуальные проблемы педиатрии - М., 2006;
- Международном симпозиуме Агроэкологическая безопасность в условиях техногенеза - Казань, 2006;
- Международной научно-практической конференции Технология и продукты здорового питания - М., 2006;
- 1-ом Всероссийском съезде диетологов и нутрициологов Диетология: проблемы и горизонты - М., 2006;
- 2 Международной научно-практической конференции Пищевые технологии - 2006 - Одесса, 2006;
- 6 Межународной научно-практической конференции Качество, стандартизация, контроль: теория и практика - Ялта, 2006;
- 8 Международной научно-практической конференции Интеграция в мясную промышленность России современных методов управления качеством и прослеживаемости Ц М., 2006;
- 6 Международной научной конференции студентов и молодых ученых Живые системы и биологичская безопасность населения - М., 2007.
Публикации результатов исследований. По материалам собственных исследований опубликовано 42 печатных работы, в которых отражено основное содержание диссертации. Из них 6 методических рекомендаций утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН. 2 учебных пособия утверждены УМО по образованию в области технологии сырья и продуктов животного происхождения.
Объем работы. Диссертация изложена на 370 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и практических предложений. Содержит 38 таблиц, 14 рисунков. Список литературы включает 286 источников, из них 138 отечественных и 148 зарубежных авторов.
Основные положения, выносимые на защиту:
• Результаты мониторинга по изучению уровня распространения сырья и продуктов животного происхождения, содержащих остаточные количества антибиотиков.
• Результаты определения чувствительности четырнадцати штаммов микроорганизмов к девяти антибиотикам, применяемым в ветеринарии, животноводстве.
• Научно обоснованные аспекты подбора микробных тест-культур для определения антибиотиков в продуктах животного происхождения.
• Теоретическое обоснование и практическая разработка методики определения концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения пластинчатым методом с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341.
• Модификация пробоподготовки мяса, молока, яиц для определения содержания в них антибиотиков, применяемых в ветеринарии и животноводстве.
• Экспериментальные данные по изучению сравнительной оценки чувствительности и специфичности методов ИФА, ВЭЖХ и микробиологического метода, используемых для определения остаточных количеств антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения.
• Научно обоснованные параметры уменьшения содержания остаточных количеств антибиотиков в мышечной ткани и молоке.
• Порядок ветеринарно-санитарной оценки продукции животноводства, содержащей остаточные количества антибиотиков.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы. Работа проводилась в период с 2000 г. по 2007 г. в лаборатории ветеринарно-санитарной экспертизы Московского государственного университета прикладной биотехнологии, в Московской Городской ветеринарной лаборатории, в Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории МСХ РФ, лаборатории санитарии молока и профилактики мастита ГНУ ВНИИВСГЭ, в ФГУ Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве, в ЗАО РОСТЕСТ, на производственном предприятии Леггорн (Республика Молдова), в производственной лаборатории АО ТАМП, в ФГУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Чувашской республике - Чувашия, в РГУ Территориальная отраслевая санитарно-технологическая пищевая лаборатория Чувашской республики, в ООО Продовольственная корпорация (г. Казань).
Мониторинговые исследования по обнаружению остаточных количеств антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения проводили методом отбора образцов на предприятиях, в лабораториях, в торговой сети. Исследованию подвергали мышечную ткань и субпродукты птицы (РФ, Бразилия, Китай, Дания, Канада), крупного рогатого скота (Бразилия, Польша) и свиней (Германия), фарш куриный (Германия, Франция), яйца куриные (РФ), яичный порошок (Бразилия), молоко и молочные продукты (РФ, Литва, Болгария), рыбу морскую (РФ) - всего 2091 образец.
Пробы продукции любезно предоставлены ОАО Таганским мясоперерабатывающим заводом, ООО Герсан (г. Солнечногорск), АО Леггорн (г. Тараклия), СХПК ТОЙСИ (Чувашская Республика), ООО Продовольственная корпорация (г. Казань), Пятигорским мясокомбинатом.
Данные по содержанию остаточных количеств антибиотиков были получены микробиологическим методом диффузии в агар (МУ 3049-84), экспресс-методом определения антибиотиков в пищевых продуктах (МУК 4.2.026-95), методом иммуноферментного анализа и высокоэффективной жидкостной хроматографии (МУК 4.1.1912-04).
Штаммы микроорганизмов были получены во Всероссийском государственном институте качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГНКИ).
Определяли чувствительность четырнадцати тест-культур к бензилпенициллину, тетрациклину, стрептомицину, неомицину, гентамицину, спектиномицину, левомицетину, линкомицину, гризину и бацитрацину. Их содержание в животноводческой продукции регламентируется СанПиН 2.3.2.1078 - 01 и ФАО - ВОЗ.
В опытах использовали бумажные диски, содержащие антибиотики, полученые в ФГУ ВГНКИ. Диски, содержащие гризин, бацитрацин и стрептомицин, были изготовлены самостоятельно из ватмана № 2 на 0,01 н растворе соляной кислоты из расчета 1000 мкг антибиотика в 1 мл (Егоров Н.С., 1964).
При приготовлении питательных сред использовали пептон, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, 40 %-ный коммерческий раствор глюкозы (Реахим, Россия).
Питательные среды считали пригодными, если при культивировании получали четкие зоны ингибиции. Всего было испытано 15 вариантов питательных сред. Оптимальной считали агарозную питательную среду, приготовленную на переваре Хоттингера с содержанием 120 - 140 мг % аминного азота, рН 7,2 Ц7,4 с добавлением 1 % глюкозы в виде 40 % стерильного раствора.
Экстракцию антибиотиков из субстрата проводили с помощью химических веществ и воздействия температуры. Использовали пепсин, панкреатин, серную кислоту, реактив Карреза, ацетон, этилацетат, метанол и другие химические вещества.
Заморозку и оттаивание образцов мышечной ткани проводили в бытовых условиях.
Сравнивали предложенный нами способ пробоподготовки образцов со способами, предложенными в Методических указаниях по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства (№ 3049-84), в Экспресс-методе определения антибиотиков в пищевых продуктах (МУК 4.2.026-95), в методических указаниях по Определению остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа (МУК 41.1912-04).
Апробация методики определения концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения пластинчатым методом с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341 проведена комиссионно на производственном предприятии АО ТАМП.
Для количественного определения левомицетина и тетрациклина в продуктах питания использовали принцип твердофазного конкурентного ИФА на полинстироловых планшетах. Измерения проводили на планшетном фотометре Униплан с использованием фильтра, соответствующего длине волны 450 нм. Расчеты осуществляли в полуавтоматическом режиме по программе Photo Check.
Использовали тест-системы RIDASCREEN Левомицетин и RIDASCREEN Тетрациклин (ООО Стайлаб R-Biopharm). Образцами для определения левомицетина служили говядина жилованная 1 сорта, свинина жилованная 1 сорта, фарш для докторской колбасы высшего сорта, яйцо столовое 1 категории, полученные в СХПК Тойси Батыревского района Чувашской Республики. Образцами для определения тетрациклина служили пробы молока, отобранные в Тукаевском филиале ООО Продовольственная корпорация Республики Татарстан и пробы молока и говядины, искусственно загрязненные 50 мкг/л тетрациклина.
Содержание остаточных количеств левомицетина и тетрациклина в продуктах животного происхождения определяли также методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (МУК 4.1.1912-04) с последующим количественным определением на жидкостном хроматографе с УФ-детектором, обеспечивающим измерение при длине волны 278 нм для левомицетина и 355 нм для тетрациклина.
Пробы мяса отбирали по ГОСТ 7269-79 Мясо. Методы отбора проб для органолептического исследования.
Всего в экспериментах по определению левомицетина и тетрациклина использовано более 500 образцов животноводческой продукции.
Для определения влияния температурной обработки на разрушение антибиотиков в мышечной ткани исследованы 140 образцов мышечной ткани различных видов животных и птицы. Тушки птицы получены из АО Леггорн г. Тараклия.
Убой опытных животных и птицы проводили в различные сроки после введения препарата. Отбор образцов тканей проводили по ГОСТ 26668-85. Исследование образцов на содержание антибиотиков - по МУ 3049-84 Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства.
Для термической обработки применяли режимы и параметры, утвержденные Правилами ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов. Мясо убойных животных проваривали кусками массой не более 2 кг в течение 3 ч. при достижении температуры внутри куска не менее 80С. Тушки птицы разрубали вдоль позвоночного столба на две половины и проваривали при 100С в течение 1 ч.
После проварки образцы повторно исследовали на содержание остаточных количеств антибиотиков. Исследованию также подвергали бульон, полученный после варки.
При изучении возможности использования антибиотиков в качестве антимикробных средств для продления сроков хранения пищевых продуктов в лимфатические узлы куска говядины вводили цитратно-кислый буфер, снижающий рН мяса и растворы антибиотиков различной концентрации. Использовали хлортетрациклин и нистатин (Стекольников Л.И., 1984). Эти же растворы были использованы для орошения кусков говядины.
С целью разрушения антибиотиков куски говядины промывали под проточной водой и замораживали в морозильной камере в течение 48 часов. Остаточные количества антибиотиков определяли на поверхности куска, на глубине 1 см и на глубине 3 см.
Для определения присутствия антибиотиков в молоке использовали тест-систему Дельвотест-R (Нидерланды). Кроме того, для исследования были использованы образцы молока с искусственным внесением пенициллина, тетрациклина, стрептомицина и левомицетина.
Пробы молока были подвергнуты длительной (63 - 65С в течение 30 мин), кратковременной (75 - 80С в течение 15 - 20 с) и мгновенной пастеризации (80 - 90С без выдержки) каждая в объеме 50 мл. Образцы молока также подвергали кипячению и стерилизации. Кипячение проводили при общепринятых параметрах, используя стерильную посуду. Стерилизацию образцов проводили в условиях Юрьев-Польского молочного завода (Владимирская обл.). Молоко сначала нагревали паром до 75С, потом в инжекторе за несколько секунд - до 140С и в течение последующих 4 с выдерживали под высоким давлением.
Для изучения влияния сквашивания на остаточные количества антибиотиков образцы молока сквашивали ацидофильной закваской, а после появления сгустка и охлаждения подвергали исследованию.
Количественные показатели результатов исследований подвергали вариационно-статистическому анализу с помощью пакета программ Microsoft Excel, Statgraf, Statgraf Plus. Достоверность различий устанавливали по методу Стьюдента-Фишера (Плохинский Ш.А., 1970).
Результаты исследований получены лично автором. Участие соисполнителей отражено в списке опубликованных работ. Всех соисполнителей настоящих исследований автор искренне благодарит.
Особую благодарность автор выражает научному консультанту за неоценимую помощь в выполнении данной работы.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Изучение уровня загрязнения остаточными количествами антибиотиков отечественного и импортного сырья и продуктов животного происхождения
Большинство специалистов связывают попадание антибиотиков в пищевые продукты с широким применением лечебных, лечебно-профилактических и ростостимулирующих средств для сельскохозяйственных животных и птицы, а также с использованием антибиотиков для удлинения сроков хранения продуктов питания.
Во исполнение п. 17 постановления Правительства города Москвы № 59-ПП Об основных направлениях укрепления продовольственной безопасности города Москвы на дальнейшую перспективу с 2002 года по 2005 год нами проводились мониторинговые исследования по обнаружению остаточных количеств антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения отечественного и импортного производства и изучалась степень загрязнения продуктов животного происхождения антибиотиками.
За изучаемый период было обнаружено 114 случаев превышения содержания антибиотиков в продуктах животного происхождения, поступающих на исследования в городские лаборатории: мышечная ткань и субпродукты птицы (РФ, Бразилия, Китай, Дания, Канада), крупного рогатого скота (Бразилия, Польша) и свиней (Германия), фарш куриный (Германия, Франция), яйца куриные (РФ), яичный порошок (Бразилия), молоко и молочные продукты (РФ, Литва, Болгария) (табл.1).
Следует отметить, что остаточные количества антибиотиков в мышечной ткани крупного рогатого скота и свиней обнаруживались только в продукции импортного происхождения (Бразилия, Германия, Польша). Большая часть мышечной ткани и субпродуктов птицы, загрязненная остатками антибиотиков, также была импортного происхождения (Бразилия, Китай, Дания, Канада). Молочная продукция и яйца куриные, в которых обнаруживались антибиотики, были отечественного производства, однако на рынке этот сектор представлен в основном отечественными производителями.
В мышечной ткани и субпродуктах птицы, крупного рогатого скота и свиней чаще всего обнаруживали антибиотики тетрациклинового ряда. Следующим по частоте встречаемости отмечен стрептомицин. В мышечной ткани и субпродуктах редко обнаруживали левомицетин. Пенициллин не обнаружили ни в одном образце.
Гризин и бацитрацин (кормовые антибиотики) были обнаружены в блочной замороженной говядине импортного происхождения (Польша).
Таблица 1
Антибиотики, обнаруживаемые в продуктах животного происхождения в количествах, превышающих требования СанПиН 2.3.2.1078-01
Объект исследования | Страна происхождения | Антибиотик | Количество положитель-ных проб | Место проведения исследований |
Грудки куриная | РФ, Бразилия, Дания, Канада | Тетрациклин Стрептомицин | 33 1 | Горвет- аборатория |
Печень куриная | РФ | Тетрациклин | 14 | Горвет- аборатория |
Фарш куриный | Германия Франция | Тетрациклин Стрептомицин | 3 1 | Горвет- аборатория ЦГСЭН |
Мышечная ткань индейки | Китай | Тетрациклин | 11 | Горвет- аборатория |
Яйца куриные | РФ | Тетрациклин Стрептомицин | 2 2 | Горвет-лаборатория |
Яичный порошок | Бразилия | Тетрациклин Стрептомицин | 3 3 | РОСТЕСТ |
Мышечная ткань крс | Бразилия | Тетрациклин | 1 | ЦГСЭН |
Печень крс | Бразилия | Тетрациклин евомицетин | 3 | ЦГСЭН Горвет-лаборатория |
Мышечная ткань свиней | Германия | Тетрациклин | 2 | Горвет-лаборатория |
Печень свиней | Германия | Тетрациклин | 1 | Горвет-лаборатория |
Мышечная ткань крс б/к замороженная | Польша | Гризин Бацитрацин | 2 1 | ЦГСЭН |
Молоко | РФ | Пенициллин Стрептомицин Тетрациклин | 3 3 1 | РОСТЕСТ |
Сметана | РФ | Стрептомицин Тетрациклин | 2 2 | РОСТЕСТ |
Десерт творожный | РФ | Тетрациклин | 8 | РОСТЕСТ |
Сыр твердый | итва РФ | евомицетин Стрептомицин Тетрациклин | 1 1 2 | РОСТЕСТ |
Брынза | Болгария РФ | Пенициллин Стрептомицин Тетрациклин евомицетин | 2 2 2 2 | РОСТЕСТ |
Всего 114 случаев | ||||
В куриных яйцах и яичном порошке присутствовали тетрациклин и стрептомицин, другие антибиотики не были обнаружены.
В молоке и молочных продуктах встречались остатки пенициллина, тетрациклина, стрептомицина и левомицетина.
Анализ результатов исследования образцов продуктов животноводства показал, что из всех случаев обнаружения антибиотиков наиболее часто в пробах выявляли антибиотики тетрациклинового ряда - в 74,5 % случаев. Стрептомицин присутствовал в 14,9 % образцов мышечной ткани и субпродуктов, молока и молочных продуктов. Левомицетин встречался чаще в молоке и молочных продуктах - всего 5,2 % случаев. Пенициллин обнаруживался только в молочных продуктах в 4,0 % случаев. Гризин и бацитрацин обнаруживались еще реже - в 0,6 и 0,8 % случаев (рис. 1).
Рис. 1. Частота обнаружения остаточных количеств антибиотиков в продуктах животного происхождения
Нами методом случайной выборки проводился отбор проб для собственных исследований.
В продуктах убоя птицы (табл. 2) чаще всего обнаруживали тетрациклин - в 18,5 % в куриных грудках, в 26,3 % в печени, в 60,5 % в желудках, в 33,3 % в фарше. Антибиотик вдвое чаще обнаруживали в фарше и втрое чаще в желудках, по сравнению с мышечной тканью, которая хуже накапливает антибиотики.
Наибольшая частота обнаружения тетрациклина - в мышечной ткани индейки, она составила 72,7 %. Возможно это связано со сложностями при выращивании молодняка индейки и дополнительным введением тетрациклина. Наши данные согласуются с данными Аксенова В.И. и Ковалева В.Ф. (1977).
Таблица 2
Частота обнаружения остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства и растениеводства
| Объект исследования | Антибиотик | Количество исследован- ных проб | Из них положительных | |
кол-во | % | |||
Грудки куриные | Тетрациклин | 76 | 14 | 18,5 |
Печень куриная | Тетрациклин | 76 | 20 | 26,3 |
Желудки куриные | Тетрациклин Гризин | 76 | 46 2 | 60,5 2,6 |
Фарш куриный | Тетрациклин Гризин евомицетин | 12 | 4 - 1 | 33,3 0 8,3 |
Мыш. ткань индейки | Тетрациклин | 11 | 8 | 72,7 |
Яйца куриные | Тетрациклин Стрептомицин евомицетин | 60 | 17 2 1 | 28,3 3,3 1,6 |
Мыш. ткань крс | Тетрациклин | 400 | 32 | 8,0 |
Печень крс | Тетрациклин евомицетин | 400 | 42 3 | 10,5 0,08 |
Почки крс | Тетрациклин евомицетин Бацитрацин | 400 | 51 7 - | 12,6 1,8 0 |
Мыш. ткань свиней | Тетрациклин | 160 | 27 | 16,9 |
Печень свиней | Тетрациклин | 160 | 27 | 16,9 |
Почки свиней | Тетрациклин евомицетин | 160 | 31 6 | 19,4 10,0 |
Молоко | Тетрациклин Стрептомицин Пенициллин | 34 | 6 12 5 | 17,6 35,3 14,7 |
Сметана | Тетрациклин Стрептомицин Пенициллин | 17 | 4 2 2 | 23,5 11,8 11,8 |
Десерт творожный | Тетрациклин | 8 | 8 | 100,0 |
Сыр твердый | Тетрациклин евомицетин Стрептомицин | 12 | 2 3 1 | 16,6 25,0 8,3 |
Рыба морская | Тетрациклин | 13 | 5 | 38,8 |
Смывы с яблок | Низин | 4 | 4 | 100,0 |
Смывы с помидоров | Низин | 12 | 2 | 16,6 |
Всего | 2091 | 377 | 19,0 | |
евомицетин был обнаружен в 8,3 % продуктов убоя птицы, гризин - лишь в 2,6 %. Всего в 251 образце продуктов убоя птицы выявлено 95 случаев превышения допустимого содержания антибиотиков, что составило 37,9 %.
При исследовании 60 шт. яиц куриных тетрациклин обнаружили в 17 шт. (28,3 %), стрептомицин - в 2 шт. (3,3 %), левомицетин - в 1 шт. (1,6 %). Итого, в 33,3 % случаев яйца куриные содержали антибиотики, несмотря на то, что куры-несушки не должны получать антибиотики.
Наибольший удельный вес тетрациклина возможно обусловлен тем, что его продолжают давать птице для стимуляции роста, невзирая на запрещающую инструкцию.
Мышечная ткань крупного рогатого скота содержала тетрациклин в 8 % случаев, а свиней - в 16,9 % случаев. В печени крупного рогатого скота и свиней также был обнаружен тетрациклин в 10,5 % и 16,9 % случаев соответственно. Кроме того, в печени крупного рогатого скота был обнаружен левомицетин в небольшом количестве случаев - 0,08 %. В 12,6 % почек крупного рогатого скота и в 19,4 % почек свиней присутствовал тетрациклин, в 1,8 % почек крупного рогатого скота и 10,0 % свиней обнаруживался левомицетин.
Всего было исследовано на содержание антибиотиков 1200 образцов продуктов убоя крупного рогатого скота, из них в 135 случаях были обнаружены тетрациклин и левомицетин, то есть в 11,2 % образцов остаточные количества антибиотиков превышали МДУ.
Для исследования продуктов убоя свиней было отобрано 480 проб, в 91 пробе были обнаружены антибиотики, что составило 19,0 %.
Молоко содержало наиболее широкий спектр выделенных антибиотиков. В 14,7 % случаев МДУ превышало содержание пенициллина, в 17,6 % случаев - тетрациклина, в 35,5 % случаев - стрептомицина. Из 34 образцов в 23 были обнаружены антибиотики, что составило 67,6 %.
В сметане из 17 исследованных образцов в 8 случаях было превышение остаточных количеств антибиотиков (в 47,6 %), из них в 23,5 % случаев выделяли тетрациклин, в 11,8 % - стрептомицин и в 11,8 % - пенициллин.
Десерт творожный содержал тетрациклин в количествах, превышающих МДУ во всех исследованных пробах - в 100 % случаев.
Сыр твердый содержал в 25,0 % случаев левомицетин, в 16,6 % - тетрациклин, в 8,3 % - стрептомицин, то есть в 50 % отобранных образцов отмечено содержание остаточных количеств антибиотиков.
Для более полной картины исследованию на остаточные количества антибиотиков подвергали образцы рыбы морской (РФ), яблок (Польша) и помидоров (Египет). В рыбе был обнаружен тетрациклин в 38,8 % случаев. Смывы с яблок импортного производства (Польша) в 100 % случаев содержали антибиотик низин, смывы с помидоров содержали низин в 16,6 % случаев. Мы связываем загрязнение рыбы, яблок и помидоров с их поверхностной обработкой антибиотиками, применяемой практически повсеместно для продления сроков хранения скоропортящихся продуктов.
Итого, как видно из таблицы 2, исследованию на содержание остаточных количеств антибиотиков подверглись 2091 образец продуктов животного происхождения и продуктов растениеводства, из которых 19,0 % содержали антибиотики в количествах, превышающих нормы, установленные СанПин 2.3.2.1078-01.
Рис. 2 отражает степень загрязнения различных продуктов животноводства и растениеводства антибиотиками, наиболее часто применяемыми в животноводстве, ветеринарии и пищевой промышленности.
Рис. 2. Степень загрязнения продукции сельского хозяйства остаточными количествами антибиотиков
Из 2091 исследуемых проб в 377 (19,0 %) были обнаружены антибиотики: тетрациклин - в 344 случаях (16,4 %), левомицетин - в 21 случае (1,0 %), стрептомицин - в 17 случаях (около 1,0 %), пенициллин - в 7 случаях (0,4 %), низин - в 6 случаях (около 0,4 %), гризин - в 2 случаях (около 0,01 %).
Таким образом, сырье и продукты животного происхождения характеризуются содержанием различных величин остаточных количеств антибиотиков - от невыявления до 100 % положительных проб, кроме того, в продуктах присутствует весь спектр антибиотиков, остаточные количества которых нормируются СанПиН 2.3.2.1078-01.
Установлено, что во всех пробах остаточные количества антибиотиков в десятки раз превышали МДУ, который определен СанПиН 2.3.2.1078-01, тогда как согласно инструкций по применению антибиоиков, не разрешается добавлять антибиотики в корм коровам, племенному скоту, курам-несушкам. Кроме того, инструкциями установлены сроки прекращения введения или дачи с кормами антибиотиков за 3 - 7 суток перед убоем животных. Молоко от коров, которых лечили антибиотиками, не должно поступать в пищу.
Тот факт, что остаточные количества антибиотиков обнаруживаются в сырье и продуктах животного происхождения, может свидетельствовать о нарушении существующих инструкций по их применению, а также возможно, что сроки выдержки животных перед убоем после последней дачи антибиотика недостаточны. Проследить причины попадания антибиотиков в импортную продукцию и вовсе невозможно.
Обнаружение в пробах только перечисленных антибиотиков объясняется тем фактом, что для анализа положительных проб использовали методы дифференциального определения только пенициллина, стрептомицина, левомицетина и тетрациклинов. Для более полного выяснения вида антибиотика необходимо использовать несколько методов, что практически невыполнимо в условиях производственных лабораторий.
С целью снижения трудозатрат на проведение анализов и расширения круга выявляемых антибиотиков целесообразно разработать универсальный метод их обнаружения в продуктах убоя, базирующийся на подборе наиболее чувствительных тест-культур к наибольшему спектру антибиотиков.
Подбор унифицированных культур микроорганизмов для определения антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения
Большинство современных микробиологических методов выявления антибиотиков ориентировано на определение антибиотиков, МДУ которых нормируется СанПиН - пенициллин, тетрациклин, левомицетин, стрептомицин, гризин, бацитрацин. В то время как в современном животноводстве и ветеринарии используется около 50 антибиотиков и их миксов.
Мы изучали чувствительность микроорганизмов к основным антибиотикам, используемым в ветеринарии и животноводстве, с целью подобрать унифицированные тест-культуры к наиболее широкому спектру антибиотиков.
Показателем чувствительности микроорганизма к антибиотику служил размер зоны задержки микробного роста вокруг бумажного диска.
Тестирование чувствительности четырнадцати микроорганизмов по отношению к антибиотикам (содержание активного вещества 0,1 мкг/мл) дало возможность обозначить наиболее чувствительные штаммы.
Грамотрицательный микроорганизм E.coli ATCC 9637 малочувствителен к таким антибиотикам как бензилпенициллин (диаметр зоны 9 мм), тетрациклин (10 мм), стрептомицин (7 мм), линкомицин (9 мм), бацитрацин (7 мм). Известно, что эти антибиотики малоэффективны против грамотрицательной микрофлоры.
Штамм B.subtilis L2 оказался высокочувствительным ко всем изучаемым антибиотикам (диаметр зоны 17 мм и более), за исключением левомицетина (14 мм) и бацитрацина (13 мм), к которым он оказался умеренно чувствительным.
Штамм B.subtilis ATCC 6633 проявил высокую чувствительность к тетрациклину, неомицину, гризину, бацитрацину (диаметр более 19 мм) и умеренную чувствительность к бензилпенициллину, гентамицину, линкомицину, левомицетину (13 - 14 мм).
Аналогична чувствительность к антибиотикам и у штамма B.subtilis 720.
Штамм B.cereus ATCC 11778 высокочувствителен к тетрациклину, левомицетину, гризину (диаметр зоны 22 мм), но к остальным изучаемым антибиотикам штамм проявил умеренную чувствительность.
Штамм B.mycoides 537 оказался умеренно чувствительным ко всем используемым антибиотикам.
B.calidolactis чувствителен к бензилпенициллину и левомицетину (соответственно 21 и 17 мм), к остальным антибиотикам умеренно чувствителен (12 - 15 мм).
Штамм B.pumilus NCTC 8241 ко всем изучаемым антибиотикам оказался устойчиво чувствительным (диаметр зоны 17 - 20 мм).
Оба штамма S.aureus 209-P и ATCC 6538 одинаково высокочувствительны к концентрации изучаемых антибиотиков, содержащейся в бумажных дисках (16 - 20 мм).
Три изучаемых штамма M.luteus - ATCC 9341, ATCC 10240, 8340 незначительно различаются по своей чувствительности к антибиотикам, но самым высокочувствительным является M.luteus ATCC 9341 (19 - 24 мм).
Зоны задержки роста вокруг дисков, пропитанных антибиотиками, у штаммов стрептококков Str.thermophilus и S.faecium относительно одинаковы (14 - 20 мм).
Исходя из полученных результатов, считаем, что для дальнейших исследований должны быть использованы штаммы со стабильной высокой чувствительностью к антибиотическим препаратам.
Штамм B.subtilis L2 является одновременно чувствительным к наличию в среде бензилпенициллина, тетрациклина, неомицина, гентамицина, стрептомицина, линкомицина и гризина, охватывая, таким образом, достаточно широкий спектр антибиотиков.
Для определения наличия в субстрате левомицетина и бацитрацина может быть использован штамм M.luteus ATCC 9341, как наиболее чувствительный. У остальных изучаемых микроорганизмов интервал антибиотикочувствительности уже или же степень чувствительности ниже требуемой.
В результате исследований были установлены пределы чувствительности восьми штаммов микроорганизмов к девяти антибиотическим препаратам, наиболее часто применяемым в ветеринарии и животноводстве. Пределы чувствительности изучаемых микробных культур представлены в таблице 3.
Таблица 3
Нижний предел чувствительности микробных культур к антибиотикам
| Антибиотик | Концентрация антибиотика в питательной среде, ед/мл, мкг/мл | |||||||
B.subtilis L2 | B.micoides 537 | B.pumilus NCTC 8241 | S.aureus 209-P | S.aureus ATCC 6538 | M.luteus ATCC 9341 | Str.termo- philus | Str.faecium | |
Пенициллин (не допускается)* | 0,01 | 1 | 0,5 | 0,001 | 0,001 | 100 | 0,001 | 1 |
Тетрациклин (не допускается) | 0,01 | 5 | 0,1 | 0,1 | 0,5 | 0,1 | 5 | 100 |
Неомицин (0,5 мг/кг) | 0,1 | 0,1 | 0,5 | 0,5 | 1 | 1 | 100 | 5 |
Гентамицин (0,1мг/кг) | 0,01 | 1 | 0,01 | 5 | 5 | 0,5 | 1 | 100 |
Стрептомицин (0,5 мг/кг) | 0,01 | 1 | 0,001 | 0,1 | 0,5 | 1 | 5 | 10 |
евомицетин (не допускается) | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 10 | 10 | 0,001 | 0,001 | 0,01 |
инкомицин (0,1мг/кг) | 0,1 | 5 | 100 | 10 | 100 | 1 | 100 | 100 |
Гризин (не допускается) | 0,1 | 1 | 0,5 | 10 | 10 | 100 | 10 | 100 |
Бацитрацин (не допускается) | 0,5 | 1 | 0,5 | 5 | 10 | 0,01 | 100 | 100 |
* В скобках указаны максимальные уровни остатков антибиотиков, допускаемые в продуктах убоя согласно СанПиН 2.3.2.1078 - 01 и рекомендаций ФАО - ВОЗ.
Определение концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341
На основании данных, полученных при изучении чувствительности различных штаммов микроорганизмов к нарастающим концентрациям основных антибиотических препаратов, была разработана методика, позволяющая определять в продуктах животного происхождения наличие антибиотических препаратов.
Сущность метода заключалась в том, что адсорбирующие бумажные диски, смоченные изучаемым субстратом и растворами антибиотика различной концентрации размещаются на поверхности агаризированной питательной среды, содержащей тест-культуру к изучаемому антибиотику.
Рост тест-культуры при термостатировании приводит к помутнению агара.
Отсутствие помутнения вокруг диска с изучаемым образцом (зона отсутствия роста, зона задержки роста) свидетельствует о наличии в изучаемом субстрате антибиотического вещества.
Размер зоны отсутствия роста сравнивается с размером зоны отсутствия роста вокруг дисков, содержащих различные концентрации антибиотика.
Для обнаружения в субстрате бензилпенициллина, тетрациклина, неомицина, гентамицина, стрептомицина, линкомицина, гризина был использован штамм B.subtilis L2.
M.luteus ATCC 9341 был использован для обнаружения левомицетина, бацитрацина.
Для построения стандартных кривых и расчета концентрации антибиотиков была составлена таблица роста штаммов B.subtilis L2 и M.luteus ATCC 9341 вокруг бумажных дисков, содержащих различные концентрации антибиотиков (табл. 4).
Таблица 4
Рост штаммов B.subtilis L2 и M.luteus ATCC 9341 вокруг бумажных дисков, пропитанных различными концентрациями антибиотиков
| Антибиотик | Диаметр зоны задержки роста штаммов, мм | |||
0,001мкг/мл | 0,01мкг/мл | 0,1мкг/мл | 1,0мкг/мл | |
B.subtilis L2 | ||||
Бензилпенициллин | 7,2 ± 1,0 | 10,3 ± 0,8 | 17,5 ± 0,6 | 24,3 ± 0,7 |
Тетрациклин | 9,3 ± 1,0 | 17,2 ± 0,5 | 23,5 ± 0,4 | 23,5 ± 0,4 |
Неомицин | 7,5 ± 0,5 | 18,3 ± 1,0 | 20,0 ± 0,6 | 22,2 ± 0,9 |
Гентамицин | 7,3 ± 0,5 | 14,3 ± 0,3 | 18,5 ± 0,9 | 21,4 ± 0,3 |
Гризин | 10,2 ± 0,5 | 14,3 ± 0,6 | 20,3 ± 0,2 | 22,5 ± 0,6 |
M.luteus ATCC 9341 | ||||
евомицетин | 10,5 ± 0,6 | 18,6 ± 0,5 | 21,1 ± 0,2 | 26,2 ± 0,2 |
Бацитрацин | 10,1 ± 0,3 | 17,5 ± 0,2 | 21,3 ± 0,5 | 27,2 ± 0,5 |
На основании результатов исследований диаметра зоны задержки роста построены стандартные кривые для определения концентрации бензилпенициллина, тетрациклина, неомицина, гентамицина, левомицетина, гризина, бацитрацина с помощью наиболее чувствительных штаммов B.subtilis L2 и M.luteus ATCC 9341 (рис. 3, 4).
Результаты тсследований по определению концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341 апробированы в условиях производственной лаборатории Таганского мясокомбината и представлены в методических рекомендациях, утвержденных Отделением ветеринарной медицины РАСХН (11.05.2005).
Выбор способа пробоподготовки образцов мышечной ткани
Для выбора оптимального, наименее трудоемкого и наиболее быстрого способа извлечения антибиотиков было изучено влияние различных химических веществ на мышечную ткань. Для этого один и тот же образец мышечной ткани, полученный от опытных животных, которым вводили известный антибиотик, подвергали воздействию различных химических веществ и температуры и проводили сравнение их действия. Степень извлечения антибиотиков определяли по диаметру зоны задержки роста тест-культур вокруг бумажных дисков, пропитанных элюатами.
Рис. 3. Стандартные кривые роста штамма B.subtilis L2 в присутствии различных концентраций антибиотиков
Рис. 4. Стандартные кривые роста штамма M.luteus АТСС 9341 в присутствии различных концентраций антибиотиков
Сначала сравнивали действие буферного раствора и дистиллированной воды, а также выдержки проб в термостате при 37 С и интенсивного встряхивания в шуттель-аппарате.
Установлено, что степень диффузии антибиотика в агар не изменялась при добавлении дистиллированной воды, которой заменили буферный раствор. Также не установлено значительной разницы в степени извлечения антибиотиков из проб мышечной ткани, если заменить термостатирование образцов в течение 90 мин. при температуре 37 С на интенсивное встряхивание в течение 10 мин. в шуттель-аппарате.
С целью депротеинизации к мышечной ткани добавляли пепсин, подвергали пробы заморозке и оттаиванию. На извлечение антибиотиков большее влияние оказывает добавление 2%-ного раствора пепсина по сравнению с заморозкой проб при -8С. Возможно при заморозке какая-то часть антибиотиков разрушается, что приводит к уменьшению диаметра зоны задержки роста тест-культур.
С целью увеличения экстракции антибиотиков к образцам мышечной ткани добавляли серную кислоту, реактив Карреза, ацетон и метанол.
Установлено, что добавление 10%-ного раствора серной кислоты привело к уменьшению степени диффузии всех антибиотиков в агар. По сравнению с образцами, которые не подвергались воздействию кислоты, диаметр зоны задержки роста тест-культур уменьшился для тетрациклина приблизительно на 5%, для левомицетина - на 6%, неомицина - на 6%. По-видимому, экстракция антибиотиков из мышечной ткани протекает лучше в щелочной и нейтральной среде, чем в кислой.
Добавление к образцам реактива Карреза привело к незначительному увеличению диффузии антибиотика в агар и увеличению диаметра зоны задержки роста тест-культур. Диаметр увеличился при добавлении реактива Карреза в целом на 5%.
Наиболее существенно на экстракцию антибиотиков из мышечной ткани повлияло добавление к гомогенизату ацетона в соотношении 1:1. При его внесении перед центрифугированием диаметр зоны задержки роста тест-культур увеличился: для тетрациклина с 23,5 ± 0,5 мм до 27,5±0,2 мм (≈17%), для левомицетина - с 23,5 ± 0,3 мм до 26,9±0,5 мм (≈15%), для неомицина - с 20,0 ± 0,0 мм до 22,3±0,0 мм (11,5%).
Добавление метанола в соотношении 1:1 практически не изменило степень диффузии антибиотиков.
Таким образом, опытами установлено, что предварительная обработка образцов мышечной ткани оказывает влияние на степень извлечения антибиотиков. Наибольшее влияние наблюдается при добавлении к образцам ацетона в соотношении 1:1, наименьшее - при добавлении 10 %-ного раствора серной кислоты и при заморозке образцов в течение 12 ч. при температуре -8С.
Термостатирование образцов при 37С в течение 90 мин., добавление 2%-ного раствора пепсина, реактива Карреза и метанола практически не влияло на степень извлечения антибиотиков из мышечной ткани и диаметр зоны задержки роста тест-культур.
Влияние предварительной обработки образцов на степень извлечения тетрациклина, левомицетина, неомицина показано на рис. 5.
Рис. 5. Влияние реактивов на степень извлечения антибиотиков из образцов мышечной ткани
Исходя из полученных результатов, нами предложен метод пробоподготовки образцов мышечной ткани, который заключается в следующем: пробу без предварительного нагревания необходимо гомогенизировать в ступке и добавить дистиллированной воды в соотношении 1:2. Перемешать в шуттель-аппарате в течение 10 мин. Для более полного экстрагирования добавить к пробе ацетон в соотношении 1:1 и подвергнуть повторному встряхиванию в шуттель-аппарате в течение 10 мин. Затем пробу необходимо подвергнуть центрифугированию при 3000 об./мин. в течение 10 мин. Надосадочную жидкость слить, осадок отжать. Полученная проба готова к исследованию.
При сравнении пробоподготовок мяса, яиц, молока, предложенных в Методических указаниях по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства (№ 3049-84), в Экспресс-методе определения антибиотиков в пищевых продуктах (МУК 4.2.026-95), в Определении остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа (МУК 41.1912-04) и пробоподготовок, разработанных нами, установлено, что предложенные нами способы не только не снижают, а и несколько увеличивают степень извлечения антибиотиков, а также позволяют экономить реактивы и время за счет исключения термостатирования (90 мин.) и заморозки (1 сут.).
Определение остаточных количеств антибиотиков методом иммуноферментного анализа, высокоэффективной жидкостной хроматографии и микробиологическим методом в сравнительном аспекте
Разработка новых и модификация существующих методов анализа антибиотиков, пригодных для массовых исследований, позволит более полно изучить содержание антибиотиков в пищевых продуктах, сопоставить данные, полученные в разных лабораториях, должным образом оценить проблему и принять необходимые меры, обеспечивающие сохранность здоровья населения.
Подготовка проб мяса, яиц проводилась двумя способами: по методике МУК 4.1.1912-04 и по методике, разработанной нами. Пробоподготовка согласно методике МУК 4.1.1912-04 длилась около двух часов и требовала большего количества реактивов, чем пробоподготовка, разработанная нами. Кроме того, самостоятельно разработанная пробоподготовка не уступала по эффективности пробоподготовке по МУК 4.1.1912-04.
Результаты, полученные нами с помощью метода иммуноферментного анализа с использованием различных способов обработки образцов, практически не различались, что позволило предположить, что для постановки ИФА возможно применение пробоподготовки, разработанной нами. Концентрация левомицетина в образцах, подготовленных по методике, разработанной самостоятельно, составляла в говядине 0,063 мг/кг, в свинине - 0,065 мг/кг, фарше - 0,062 мг/кг, яйцах - 0,051 мг/кг. Концентрация левомицетина в образцах, обработанных по МУК 4.1.1912-04 соответственно: 0,064; 0,068; 0,062; 0,05 мг/кг.
Аналогичные результаты были получены при исследовании методом ИФА проб молока и говядины, искусственно загрязненных 50 мкг/л тетрациклина. В качестве тест-системы использовали набор реагентов RIDESCREEN Тетрациклин. Концентрация тетрациклина в образцах, подготовленных по МУК 4.1.1912-04, составила в говядине 0,044 мг/кг, в молоке - 0,043 мг/кг, а при пробоподготовке, разработанной самостоятельно соответственно: 0,041 мг/кг и 0,046 мг/кг.
Большее значение содержания тетрациклина в молоке, полученное при использовании пробоподготовки, разработанной самостоятельно, объясняется применением в процессе обработки образца ацетона, который разрушает белковую оболочку жировых шариков молока.
В мясе более высокий результат получен при пробоподготовке, описанной в МУК 4.1.1912-04. Однако следует учитывать, что эта пробоподготовка более трудоемкая, дорогостоящая и длительная, тогда как разница в полученных результатах незначительная.
В образцах молока и мяса, искусственно загрязненных 50 мкг/л тетрациклина, степень извлечения была очень высокая и составила соответственно для молока 91 ± 1 %, для мяса - 85 ± 3 % при использовании обеих пробоподготовок.
Экспериментальные данные, полученные при использовании метода иммуноферментного анализа мяса и молока, подтвердили его высокую чувствительность и специфичность.
Использование методики пробоподготовки, разработанной самостоятельно, показало ее эффективность при определении концентрации антибиотиков методом иммуноферментного анализа и позволило более полно извлечь тетрациклин из молока по сравнению с пробоподготовкой, рекомендуемой МУК 4.1.191-04.
С целью сравнения эффективности и достоверности методов ИФА и ВЭЖХ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии определялись антибиотики в тех же образцах животноводческой продукции, в которых они определялись методом ИФА.
При пробоподготовке образцов по методике, предложенной в МУК 4.1.1912-04, были получены более высокие результаты по определению содержания левомицетина и тетрациклина в сравнении с методикой пробоподготовки, разработанной самостоятельно. Это позволяет сделать вывод о том, что методика пробоподготовки, разработанная нами, менее эффективна при определении антибиотиков методом ВЭЖХ. По-видимому, исключение из пробоподготовки некоторых этапов экстрагирования и обезжиривания привело к тому, что содержание антибиотиков в образцах, которые готовились к исследованию по методике пробоподготовки, разработанной самостоятельно, оказалось ниже в среднем на 25 - 30 %, чем в идентичных образцах, подготовленных согласно МУК 4.1.1912-04.
Общее количество времени, ушедшее на исследование одного образца методом ВЭЖХ от начала опыта и до получения результата, составило около 9 ч. Определение содержания антибиотиков в образцах животноводческой продукции методом ВЭЖХ сопряжено с длительной пробоподготовкой и использованием большого количества дорогостоящих реактивов. Кроме того, исследования реализуются на дорогостоящем оборудовании, которое нуждается в постоянном квалифицированном обслуживании.
Микробиологический метод определения антибиотиков позволил обнаруживать остаточные количества левомицетина и тетрациклина с точностью до 0,01 мг/кг. Подготовка проб длилась приблизительно 2 ч. Результат исследования был получен через 12 ч.
Значения, полученные при использовании пробоподготовки, разработанной нами, практически не отличались от значений, полученных при обработке образцов с применением пробоподготовки по МУК 3049-84.
Результаты сравнительного тестирования чувствительности методов ИФА, ВЭЖХ (МУК 4.1.1912-04) и микробиологического метода (МУК 3049-84) по определению левомицетина и тетрациклина в одних и тех же образцах мяса, фарша, яиц и молока представлены в таблице 5.
Таблица 5
Содержание левомицетина и тетрациклина в образцах продукции
| Образец | АБ | Концентрация антибиотика, мг/кг | |||||||
ИФА | ВЭЖХ | Микробиология | М±m | ||||||
1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | ||
Говядина | 0,064 | 0,063 | 0,071 | 0,051 | 0,070 | 0,08 | 0,067±0,003 | 0,065±0,01 | |
Свинина | 0,068 | 0,065 | 0,065 | 0,050 | 0,060 | 0,050 | 0,061±0,004 | 0,055±0,007 | |
Фарш | 0,062 | 0,062 | 0,067 | 0,052 | 0,050 | 0,050 | 0,059±0,006 | 0,054±0,005 | |
Яйцо | 0,050 | 0,051 | 0,055 | 0,045 | 0,050 | 0,040 | 0,051±0,002 | 0,045±0,003 | |
Молоко № 1 | Т | 0,150 | 0,170 | 0,255 | 0,150 | 0,220 | 0,200 | 0,208±0,036 | 0,175±0,02 |
Молоко № 2 | Т | 0,043 | 0,046 | 0,047 | 0,040 | 0,040 | 0,040 | 0,043±0,002 | 0,042±0,003 |
Говядина искусствен. загрязненная | Т | 0,044 | 0,041 | 0,045 | 0,041 | 0,040 | 0,050 | 0,043±0,002 | 0,042±0,003 |
1 - подготовка образцов к исследованию по МУК 4.1.1912-04 и 3049-84
2 - подготовка образцов к исследованию по методике, разработанной самостоятельно
- левомицетин, Т - тетрациклин
Результаты, полученные параллельно с использованием одних и тех же образцов, вполне сопоставимы и различаются незначительно, что свидетельствует о сходной эффективности использованных методов.
Статистическая обработка данных позволила определить, что отличия в концентрации антибиотиков, полученной с помощью различных методов, не превышают 10%-ный уровень. То есть, повторяемость результатов при использовании разных методов очень высокая.
Если сравнить данные, полученные с использованием разных способов пробоподготовки образцов, то можно отметить следующее: использование пробоподготовки, разработанной нами, эффективно для определения концентрации антибиотиков методом ИФА и микробиологическим методом. При этом полученные данные концентрации не ниже, а в некоторых случаях выше, чем данные, полученные при использовании пробоподготовки, рекомендуемой МУК 4.1.1912-04 и 3049-84. Например, при определении содержания остаточных количеств тетрациклина в образцах молока № 1 и № 2, тетрациклина и левомицетина в говядине.
Тогда как данные, полученные с помощью метода ВЭЖХ при использовании пробоподготовки, разработанной нами, оказались во всех случаях ниже, чем данные, полученные с использованием пробоподготовки, рекомендованной МУК 4.1.1912-04. Сказалось отсутствие обезжиривания и экстракции.
Следует отметить, что на сегодняшний момент методом ИФА и ВЭЖХ возможно определять только остаточные количества левомицетина и тетрациклина, тогда как на практике применяется около 50 антибиотиков и их миксов.
Преодолеть эти недостатки позволяет микробиологический метод, для которого нами усовершенствована схема пробоподготовки, занимающая 1,5 - 2 часа, и с помощью которого можно определять остаточные количества любых антибиотиков, в том числе современных, методом подбора тест-культур.
Для сравнения чувствительности методов ИФА, ВЭЖХ и микробиологического метода изучению на содержание остаточных количеств антибиотиков подвергались образцы молока, искусственно загрязненные различным количеством левомицетина и тетрациклина (от 0,00001 мг/кг до 1,0 мг/кг). Для исследования брали по 10 проб молока, в которые вносили одинаковое количество антибиотика и определяли его содержание тремя методами (табл. 6).
Таблица 6
Частота обнаружения остаточных количеств левомицетина и тетрациклина различными методами в искусственно загрязненных образцах молока
Пробы молока | Количество положительных проб | ||||||
Количество внесенного антибиотика, мг/л | Количество исследуемых образцов | ВЭЖХ | ИФА | Микробиологический метод | |||
Т | Т | Т | |||||
0,000001 | 10 | - | - | - | - | - | - |
0,00001 | 10 | - | - | 10 | 10 | - | - |
0,0001 | 10 | - | - | 10 | 10 | - | - |
0,001 | 10 | 4 | 5 | 10 | 10 | 1 | 3 |
0,01 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
0,1 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
1,0 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
Л - левомицетин, Т - Тетрациклин
Исследования показали, что предел чувствительности для метода ВЭЖХ и микробиологического метода составляет 0,01 мг/кг, а для метода ИФА - 0,00001 мг/кг антибиотика, что совпадает с данными большинства литературных источников.
С помощью метода ВЭЖХ только в 4-х образцах из 10-ти (40 %) был обнаружен левомицетин и в 5-ти образцах из 10-ти (50 %) тетрациклин в концентрации 0,001 мг/кг. С помощью микробиологического метода левомицетин в концентрации 0,001 мг/кг был обнаружен в 1-ом образце из 10-ти (10 %), а тетрациклин в 3-х образцах из 10-ти (30 %). Более низкие концентрации левомицетина и тетрациклина с помощью этих методов не обнаруживались.
Следовательно, ВЭЖХ и микробиологический метод определения остаточных количеств антибиотиков могут быть использованы для определения левомицетина и тетрациклина в концентрации 0,01 мг/кг и выше.Содержание левомицетина и тетрациклина в концентрации 0,00001 мг/кг и выше может быть определено с помощью метода ИФА.
Таким образом, метод ВЭЖХ и микробиологический метод позволяют определять остаточные количества этих антибиотиков на уровне, обусловленном требованиями СанПиН 2.3.2.1078-01 (<0,01 мг/кг). Более чувствительный метод ИФА может использоваться для изучения образцов с пограничным содержанием антибиотиков во избежание получения ложно отрицательных результатов.
Микробиологический метод определения антибиотиков, как наиболее доступный, может использоваться для скрининговых целей, а положительные результаты, полученные с его помощью, должны служить основанием для дальнейших исследований продуктов животноводства методом ИФА или ВЭЖХ.
Рекомендации по ветеринарно-санитарной экспертизе продуктов убоя, содержащих антибиотики
Правила ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов (1988 г.) не содержат рекомендаций по ветсанэкспертизе продуктов убоя, содержащих остаточные количества антибиотиков. Даны лишь следующие указания: В случае вынужденного убоя животных, подвергшихся отравлению ядовитыми веществами химического происхождения, решение о возможности использования в пищу мяса от таких животных принимается в каждом отдельном случае, с учетом степени и клинических признаков отравления животных, токсичности и остаточного количества яда, вызвавшего отравление (п. 9.1.).
В таких случаях бактериологические и физико-химические исследования не способны решить вопрос о дальнейшей реализации продуктов убоя. Необходимо определять остаточные количества антибиотиков (их МДУ нормируются СанПиН 2.3.2.1078-01), а также принимать решение об использовании продуктов убоя, полученных от таких животных.
Нами исследованы 140 образцов мышечной ткани различных видов животных и птицы по следующей схеме:
Введение антибиотиков опытным животным, птице согласно наставлениям по применению препаратов
↓
Убой опытных животных, птицы в различные сроки после введения препарата,
отбор образцов по ГОСТ 26668-85
↓
Исследование образцов на содержание антибиотиков по МУ 3049-84
↓
Термическая обработка образцов
↓
Повторное исследование образцов на содержание антибиотиков
Образцы тканей отбирали согласно методам отбора проб для микробиологических анализов - ГОСТ 26668-85.
В результате термической обработки в мышечной ткани животных и птицы значительно сокращается содержание антибиотиков. В основном из мышечных волокон лекарственный препарат вместе с мышечным соком переходит в бульон, часть препарата разрушается под действием высоких температур.
После варки в мышечной ткани животных и птицы остается приблизительно десятая часть исходного количества антибиотиков. В бульон переходит около 70 % антибиотиков. Следовательно, можно предположить, что около 20 % антибиотиков разрушается в результате проварки, либо переходит в метаболиты, которые микробиологическим методом не определяются (табл. 7).
Таблица 7
Содержание антибиотиков в мышечной ткани животных и птицы до и после проварки
Вид животного | Антибиотик | Содержание в сырой мышечной ткани (100%) (М±m) | Содержание в мышечной ткани после варки (М±m) | Содержание в бульоне (М±m) | Разрушено (М±m) | ||
мг/кг | мг/кг | % | мг/кг | % | % | ||
Крупный рогатый скот | Тетрациклин n=8 | 0,4±0,12 | 0,04±0,01 | 9,2±3,1 | 0,28±0,05 | 70,0±2,9 | 20,8±4,0 |
евомицетин, n=6 | 0,3±0,05 | 0,03±0,01 | 11,3±2,9 | 0,21±0,03 | 67,5±3,0 | 21,2±3,9 | |
Свиньи | Тетрациклин n=10 | 0,98±0,05 | 0,01±0,001 | 8,9±2,6 | 0,72±0,07 | 71,3±4,0 | 19,8±3,3 |
евомицетин, n=6 | 0,65±0,04 | 0,08±0,005 | 12,0±3,0 | 0,45±0,04 | 70,0±1,1 | 18,0±5,8 | |
Птица | Тетрациклин, n=30 | 0,5±0,01 | 0,045±0,008 | 9,0±2,6 | 0,36±0,04 | 71,2±2,9 | 19,8±4,1 |
евомицетин, n=30 | 0,5±0,02 | 0,055±0,01 | 11,7±1,9 | 0,34±0,03 | 69,0±1,5 | 19,3±2,0 | |
Гризин, n=30 | 0,25±0,05 | 0,01±0,0 | 5,9±1,6 | 0,17±0,03 | 76,0±3,4 | 18,1±2,8 | |
Бацитрацин, n=20 | 0,2±0,04 | 0,015±0,0 | 7,3±3,0 | 0,15±0,03 | 78,2±2,2 | 14,5±2,1 | |
Таким образом, если в продуктах убоя обнаружено десятикратное превышение предельно допустимого количества перечисленных антибиотиков, для дальнейшей реализации туш может быть рекомендована промышленная переработка в виде проварки кусков мышечной ткани массой не более 2 кг в течение 3 ч. при достижении температуры внутри куска не менее 80С. Тушки птицы необходимо проваривать при 100С в течение 1 ч.
Бульон после варки должен быть утилизирован, так как содержит около 70 % первоначального содержание антибиотика.
Для изучения возможности использования сырья, содержащего остаточные количества антибиотиков, при изготовлении вареных колбас в условиях АО ТАМП был изготовлен опытный образец колбасы Закусочной согласно технологической инструкции по производству изделий колбасных вареных (ГОСТ Р 52196-2003).
Говядину получили от животного, которому при жизни был введен препарат Тиакат-и. Препарат разработан ВИЭВ и изготовлен на основе окситетрациклина. Препарат вводили животному в виде внутримышечной инъекции из расчета 0,5 мл на 10 кг живого веса.
В 1 г говядины, полученной после убоя, содержался 1 мкг окситетрациклина, что в 100 раз превышает требования СанПиН 2.3.2.1078-01.
В сыром фарше содержание окситетрациклина составило 0,73 мкг/г. Уменьшение количества объясняется разбавлением мышечной ткани шпиком, крахмалом и другими инградиентами, добавляемыми по рецептуре. В готовом продукте содержание окситетрациклина после варки составило 0,65 мкг/г.
Учитывая то, что в сыром фарше содержание окситетрациклина составляло 0,73 мкг/г, снижение его в готовом изделии оказалось незначительным.
Для выяснения влияния термической обработки на содержание остаточных количеств антибиотиков в фарше, из которого изготовлены колбасные изделия, нами были приготовлены несколько образцов продукта в искусственной оболочке диаметром от 32 до 120 мм.
Для изготовления образцов использовали говядину жилованную, которую предварительно инъецировали растворами следующих антибиотиков: левомицетина, бензилпенициллина, стрептомицина, тетрациклина.
Образцы продуктов были подвержены всем технологическим операциям, которые используются для изготовления колбас вареных. В таблице 8 отражено содержание антибиотиков в опытных образцах и говядине, которая использовалась для их изготовления.
Таблица 8
Влияние технологических параметров (варки) на содержание антибиотиков в готовом изделии (n=6)
Объект исследования | Содержание антибиотиков, мкг/г, (М±m) | |||
евомицетин | Бензил-пенициллин | Стрептомицин | Тетрациклин | |
В сыром фарше | 1,00±0,02 | 0,65±0,01 | 0,70±0,05 | 1,50±0,01 |
В готовом изделии | 0,92±0,07 | 0,58±0,02 | 0,64±0,08 | 1,32±0,04 |
В % к начальному содержанию | 93 % | 89 % | 90 % | 89 % |
Полученные данные позволяют предположить, что варка колбасных изделий с использованием горячего пара в термических камерах не приводит к значительному разрушению антибиотиков и не может быть рекомендована для использования мышечного сырья с содержанием антибиотиков в концентрациях, превышающих предельно допустимые. В отличие от проварки мышечного сырья кусками в ваннах или автоклавах, при изготовлении вареных колбас не образуется бульон, в который могла бы уходить большая часть антибиотика.
Использование антибиотиков для продления сроков хранения пищевых продуктов.
За последние десятилетия во многих странах мира внимание привлечено к антибиотикам как к веществам, задерживающим в процессе хранения порчу многих пищевых продуктов: мяса, рыбы, птицы, овощей и др. Применяемые в небольших концентрациях, они способны предохранить продукты от порчи в течение более или менее длительного времени.
Мы ввели в лимфатические узлы куска говядины цитратно-кислый буфер, снижающий рН мяса и растворы антибиотиков различной концентрации. Использовали хлортетрациклин и нистатин в концентрации 10 мг/л, 50 мг/л и 100 мг/л раствора, а также раствор, содержащий 100 мг/л хлортетрациклина и 200 мг/л нистатина. Эти же растворы были использованы для орошения кусков говядины. Растворы вводили сразу после убоя. Через 24 часа определяли КМАФАнМ в говядине. Контролем служил необработанный растворами антибиотиков кусок говядины от той же туши.
Использование цитратно-кислого буфера позволило снизить рН в куске мяса до 5,5, что привело к уменьшению КМАФАнМ с 5050 ± 24 микробных клеток/г в контроле до 3548 ± 52 микробных клеток/г при введении буфера в лимфатические узлы и до 3800 ± 61 микробных клеток/г при орошении куска.
Наибольшее понижение наблюдалось при введении в лимфоузлы раствора, содержащего 100 мг/л хлортетрациклина и 200 мг/л нистатина - до 340 ± 19 микроорганизмов в грамме мяса при введении в лимфоузлы и до 1190 ± 16 микроорганизмов в грамме мяса при орошении по сравнению с контролем. Такой же порядок микроорганизмов в мясе обнаруживался при применении растворов хлортетрациклина с концентрацией активного вещества 10 мг/л, 50 мг/л и 100 мг/л. Это позволило сделать вывод о том, что для предотвращения порчи возможно использование более низких концентрации хлортетрациклина, чем мы встречали в исследованиях других авторов.
При использовании растворов нистатина заметного снижения количества микрофлоры не наблюдалось. Эффект был ниже, чем при использовании цитратно-кислого буфера. По-видимому, это связано с тем, что нистатин эффективен в основном против дрожжей и плесеней.
В опытах доказана эффективность применения растворов хлортетрациклина с концентрацией активного антибиотика 10, 50, 100 мг/л и смеси растворов хлортетрациклина 100 мг/л и нистатина 200 мг/л в соотношении 1:1 для предохранения охлажденной говядины от порчи. Однако вопрос о безопасности применения антибиотиков остается открытым.
Поэтому в каждом куске говядины охлажденной мы определяли содержание остаточных количеств антибиотиков (табл. 9).
Таблица 9
Остаточные количества антибиотиков в говядине охлажденной
Концентрация раствора вводимого антибиотика | Остаточные количества антибиотиков, мг/кг, | |
Введение в лимфоузлы | Орошение куска | |
Хлортетрациклин, 10 мг/л | 0,76 ± 0,003 | 0,58 ± 0,01 |
Хлортетрациклин, 50 мг/л | 4,45 ± 0,05 | 4,21 ± 0,02 |
Хлортетрациклин, 100 мг/л | 8,94 ± 0,01 | 7,62 ± 0,09 |
Нистатин, 10 мг/л | 0,64 ± 0,017 | 0,57 ± 0,024 |
Нистатин, 50 мг/л | 4,12 ± 0,06 | 4,00 ± 0,003 |
Нистатин, 100 мг/л | 6,90 ± 0,03 | 5,77 ± 0,015 |
Х + Н, 100 мг/л + 200 мг/л | 24,03 ± 0,21 | 20,12 ± 0,05 |
При обработке говядины орошением количество антибиотика несколько ниже, чем при введении в лимфатические узлы. Возможно, это связано с тем, что при орошении обрабатывается только поверхность куска, и за 24 часа антибиотик не успевает проникнуть в глубокие слои мышечной ткани, а также частично испаряется с поверхности. Однако в обоих случаях остаточные количества хлортетрациклина и нистатина значительно превышают требования СанПиН 2.3.2.1078-01. Это говорит о том, что охлажденная говядина, подвергшаяся обработке растворами антибиотиков с целью предохранения от порчи, не может быть реализована потребителю без ограничений в охлажденном виде.
Даже при применении растворов с низкой концентрацией активного антибиотика (10 мг/л) в охлажденной говядине обнаруживается 0,76 ± 0,003 мг/кг (при введении в лимфоузлы) и 0,58 ± 0,01 мг/кг (при орошении) хлортетрациклина и 0,64 ± 0,017 мг/кг (при введении в лимфоузлы) и 0,57 ± 0,024 мг/кг (при орошении) нистатина, что недопустимо для мяса, поступающего в реализацию.
При применении более высоких концентраций растворов антибиотиков (50, 100, 200 мг/л), рекомендуемых в литературе, остаточные количества превышают допустимые показатели в сотни и тысячи раз.
Мы считаем, что для получения бактериостатического эффекта достаточно использовать раствор хлортетрациклина с концентрацией активного антибиотика не более 10 мг/л. Дальнейшие исследования проводились с применением этого раствора.
Чтобы снизить количество хлортетрациклина в мясе, было решено охлажденные куски говядины промыть под проточной водой и заморозить. Замораживали куски в морозильной камере в течение 48 часов. Остаточные количества антибиотиков определяли на поверхности куска, на глубине 1 см и на глубине 3 см.
Промывание проточной водой привело к лучшим результатам по остаточному количеству хлортетрациклина, в том случае, когда куски говядины для предохранения от порчи орошались раствором антибиотика, а не обрабатывались введением раствора в лимфатические узлы (рис. 6).
Рис. 6. Динамика разрушения хлортетрациклина в говядине после промывки и замораживания
Для кусков, которые обрабатывались введением хлортетрациклина в лимфатические узлы, практически не имела значение глубина отбора проб, а при орошении остаточные количества на поверхности составляли 0,51 ± 0,07 мг/кг хлортетрациклина, тогда как на глубине 3 см - 0,14 ± 0,023 мг/кг, что втрое меньше.
Замораживание кусков привело к небольшому снижению остаточного количества хлортетрациклина. В результате наименьшие показатели остаточного количества антибиотика получены на глубине 3 см после заморозки в кусках, обработанных орошением, - 0,09 ± 0,007 мг/кг хлортетрациклина и на глубине 1 см после заморозки кусков, которым вводили раствор антибиотика в лимфатические узлы - 0,33 ± 0,014 мг/кг хлортетрациклина. Однако в обоих случаях концентрация хлортетрациклина в мясе превышала требования СанПиН 2.3.2.1078-01.
Следовательно, для предотвращения порчи говядины возможно использование хлортетрациклина с концентрацией активного антибиотика 10 мг/кг. Лучший бактериостатический эффект получен при введении антибиотика в лимфатические узлы, однако при таком способе введения даже после промывки и заморозки остаточные количества антибиотика втрое выше, чем при использовании орошения.
Мясо, обработанное орошением раствором хлортетрациклина, не может быть использовано в охлажденном виде для реализации из-за превышения в нем МДУ антибиотика. Промывка и заморозка снижают количество антибиотика в мясе, но оно остается выше нормативов.
Рекомендации по ветеринарно-санитарной экспертизе молока, содержащего антибиотики
При анализе молока и молочных продуктов наиболее широкое распространение за рубежом получил тест-микроб Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C-953, который чувствителен не только к пенициллину, но и к ряду других антибиотиков, а также отличается быстротой роста при повышенных температурах. Эта тест-система под названием Дельвотест-R в последние годы является самой распространенной при проведении анализа молока на содержание антибиотиков. Онако в наставлении по применению указана чувствительность только к пенициллину, в то время как на практике применяется около 20 антибиотиков.
Для расширения возможностей Дельвотест- R мы использовали метод подбора чувствительности культуры Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C-953 к различным антибиотикам.
Результаты определения нижнего уровня чувствительности Дельвотест- R к различной концентрации антибиотиков отражены в таблице 10.
Таблица 10
Нижний предел чувствительности Дельвотест- R к антибиотикам
Антибиотик | Нижний уровень чувствительности, мг/л |
евомицетин | 0,5 |
Пенициллин | 0,002 |
Тетрациклин | 0,01 |
инкомицин | 0,04 |
Эритромицин | 0,01 |
Олеандомицин | 0,6 |
Полимиксин | 0,1 |
Рифамицин | 0,08 |
Неомицин | 0,007 |
Гентамицин | 0,005 |
Стрептомицин | 0,04 |
Считаем, что результаты, полученные с помощью тест-системы Дельвотест- R, должны подтверждаться дополнительными методами, для того, чтобы учесть низкие концентрации таких антибиотиков, как линкомицин, эритромицин, рифамицин, стрептомицин, олеандомицин, полимиксин, левомицетин.
Для изучения влияния температурных режимов на уменьшение содержания антибиотиков в молоке использовали пробы молока, отобранные с помощью Дельвотест-R (молоко с естественным фоном загрязнения антибиотиками) и образцы молока с искусственным внесением пенициллина, тетрациклина, стрептомицина и левомицетина.
Все пробы молока были подвергнуты длительной, кратковременной и мгновенной пастеризации каждая в объеме 50 мл. После охлаждения в каждой пробе определяли остаточное количество антибиотика и сравнивали с первоначальным содержимым в сыром молоке. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 11.
Таблица 11
Влияние режимов пастеризации на разрушение антибиотиков в молоке
| Пробы молока | Исходное содержание антибиотиков,мг/л | Остаточное содержание антибиотиков в молоке | |||||
Длительная пастеризация | Кратковременная пастеризация | Мгновенная пастеризация | |||||
мг/л (М±m) | % | мг/л (М±m) | % | мг/л (М±m) | % | ||
Естественный фон, n=15 | 0,009±0,0002 | 0,007±0,001 | 77,7 | 0,009±0,01 | 100 | 0,009±0,001 | 100 |
Пенициллин, n=10 | 0,1±0,003 | 0,08±0,005 | 80 | 0,08±0,002 | 80 | 0,09±0,003 | 90 |
Тетрациклин, n=10 | 0,5±0,002 | 0,37±0,01 | 74 | 0,42±0,02 | 84 | 0,40±0,01 | 80 |
Стрептомицин, n=10 | 0,05±0,002 | 0,039±0,00 | 78 | 0,041±0,005 | 82 | 0,040±0,01 | 80 |
евомицетин, n=10 | 1,0±0,005 | 0,86±0,005 | 86 | 0,90±0,01 | 90 | 0,90±0,002 | 90 |
Как видно из таблицы 11, пастеризация оказывает незначительное разрушительное действие на содержание антибиотиков в молоке. После пастеризации в молоке содержание антибиотиков составляло 74 - 100 % от исходного показателя. Максимально был подвержен разрушению тетрациклин при использовании режима длительной пастеризации.
Представленные результаты свидетельствуют о том, что с помощью пастеризации можно незначительно снизить количество антибиотиков в молоке на 10 - 20 %, используя различные режимы пастеризации.
Из-за частичного свертывания белков и образования солей на поверхности чанов образуется осадок - молочный камень (пригар). Возможно, его образование и способствует уменьшению остаточных количеств антибиотиков в молоке, которые частично денатурируют и образуют белково-солевые комплексы, оседающие на стенках.
Кипячению и стерилизации подвергали образцы молока сырого, в которые искусственно вносили антибиотик. Результаты статистической обработки данных представлены в таблице 12.
Таблица 12
Влияние кипячения и стерилизации молока на разрушение антибиотиков
| Образец молока | Исходное содержание антибиотика, мг/л (М±m) | Содержание антибиотиков после обработки | |||
Кипячение | Стерилизация | ||||
мг/л (М±m) | % | мг/л (М±m) | % | ||
Естественный фон, n = 15 | 0,009 ± 0,0002 | 0,0086±0,01 | 95 | 0,0085±0,004 | 95 |
Пенициллин, n = 10 | 0,1 ± 0,003 | 0,090±0,001 | 90 | 0,100 ±0,05 | 100 |
Тетрациклин, n = 10 | 0,5 ± 0,002 | 0,465±0,02 | 93 | 0,500 ±0,002 | 100 |
Стрептомицин, n = 10 | 0,05 ± 0,002 | 0,045±0,003 | 90 | 0,046±0,005 | 92 |
евомицетин, n = 10 | 1,0 ± 0,005 | 0,910±0,04 | 90 | 0,945±0,03 | 95 |
При рассмотрении результатов анализов, очевидно, что кипячение и стерилизация практически не влияют на количество антибиотиков в молоке. После кипячения в молоке остается от 90 до 95 % исходного количества антибиотиков, то есть разрушается от 5 до 10 % их количества. Стерилизация разрушает антибиотики еще незначительней - в образце, содержащем стрептомицин, разрушено - 8 % от исходного количества антибиотика, в образце, содержащем левомицетин - 5 %, а тетрациклин и пенициллин не разрушались вовсе. После стерилизации в молоке оставалось от 92 до 100% исходного количества антибиотиков. Такие данные позволяют сделать выводы о непригодности параметров кипячения и стерилизации для разрушения антибиотиков в молоке.
Рис.7. Влияние различной технологической обработки молока на содержание в нем остаточных количеств антибиотиков
При сквашивании молока в конечном продукте незначительно уменьшается количество изучаемых антибиотиков. Среднее значение остатка антибиотиков составило 90,4 %. То есть при сквашивании разрушается около 10 % изначального содержания антибиотиков. Таким образом, увеличение кислотности молока от 16 - 18Т (кислотность сырого молока) до 100Т (такова кислотность полученной ацидофильной простокваши) позволяет снизить количество антибиотика в среднем на 10 %.
На рис. 7 отмечено диаграммами влияние различных параметров технологической обработки образцов молока на разрушение в них антибиотиков.
Анализируя данные диаграммы, можно отметить, что наибольшее разрушение антибиотиков в образцах происходило при длительной пастеризации. Возможно это связано с наиболее длительным влиянием на антибиотики высокой температуры, которая приводит к коагуляции белков и оседанию их вместе с антибиотиком на стенках емкостей.
В наименьшей степени антибиотики разрушались под действием стерилизации. В молоке оставалось от 92 до 100 % антибиотиков от исходного количества.
Кратковременная и мгновенная пастеризация приводили к разрушению приблизительно 12 % количества антибиотиков, что оказалось эффективнее, чем кипячение и сквашивание, после которых в образцах молока оставалось от 90 до 100 % от исходного количества антибиотиков.
ВЫВОДЫ
1. Сырье и продукты животного происхождения импортного и отечественного производства, отобранные на предприятиях, в лабораториях и на рынках г. Москвы, содержат остаточные количества антибиотиков.
Наиболее часто в образцах обнаруживались антибиотики тетрациклинового ряда - в 74,5 % проб, стрептомицин присутствовал в 14,9 % исследуемых проб. Левомицетин встречался чаще в молоке и молочных продуктах - всего 5,2 % случаев. Пенициллин обнаруживали только в молочных продуктах в 4,0 % случаев. Гризин и бацитрацин были обнаружены в продуктах убоя крупного рогатого скота - в 0,6 и 0,8 % случаев соответственно.
2. Штаммы B.subtilis L2, B.mycoides 537, B.pumilus NCTC8241, S.aureus 209-P, S.aureus ATCC 6538, M.luteus ATCC 9341, Str.thermophilus, Str.faecium могут служить тест-культурами для определения остаточных количеств антибиотиков: бензилпенициллина, тетрациклина, неомицина, гентамицина, спектиномицина, левомицетина, линкомицина, гризина и бацитрацина в различных субстратах.
3. Наиболее широким спектром чувствительности обладают штаммы B.subtilis L2 (является одновременно чувствительным к наличию в среде бензилпенициллина, тетрациклина, неомицина, гентамицина, спектиномицина, линкомицина и гризина) и M.luteus ATCC 9341 (чувствителен к наличию в субстрате левомицетина и бацитрацина). У остальных изучаемых микроорганизмов интервал антибиотикочувствительности уже или же степень чувствительности ниже требуемой.
3. Установлено, что оптимальной средой для культивирования штаммов B.subtilis L2 и M.luteus ATCC 9341 является перевар Хоттингера с содержанием 120 Ц140 мг% аминного азота с добавлением 1% глюкозы, рН среды 7,2 - 7,4. Плотность инокулюма для получения сплошного газона должна составлять 1 млрд. бактериальных клеток в 1мл культуральной жидкости. Величина инокулюма - 1 мл на одну чашку Петри. Температура культивирования - 35 Ц37С в течение 18 часов.
4. Максимальное извлечение тетрациклина и левомицетина из образцов мышечной ткани достигается при гомогенизации пробы, экстракции антибиотика ацетоном в соотношении 1:1 с дальнейшим центрифугированием пробы при 3000 об./мин.
5. Модифицированная методика с использованием штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341 позволяет пластинчатым методом определять в продуктах животного происхождения наличие широкого спектра антибиотиков.
6. Методы ВЭЖХ, ИФА и микробиологический метод позволяют определять остаточные количества антибиотиков на уровне, обусловленном требованиями СанПиН 2.3.2.1078-01 (< 0,01 мг/кг). Более чувствительный метод ИФА (0,00001 мг/кг) может использоваться для изучения образцов с пограничным содержанием антибиотиков во избежание получения ложноотрицательных результатов.
7. При обнаружении десятикратного превышения предельно допустимого количества антибиотиков для дальнейшей реализации туш рекомендуется проварка мышечной ткани при общепринятых технологических параметрах (куски массой не более 2 кг в течение 3 ч, для птицы - 1 ч). Бульон после варки должен быть утилизирован, так как содержит около 70 % первоначального содержание антибиотика.
8. Изготовление вареных колбас не приводит к значительному разрушению антибиотиков и не может быть рекомендовано для использования мышечного сырья с содержанием антибиотиков вколичествах, превышающих предельно допустимые.
9. Для продления сроков хранения говядины возможно использование раствора хлортетрациклина с концентрацией активного антибиотика не более 10 мг/л. Мясо, обработанное орошением раствором хлортетрациклина, не может быть использовано в охлажденном виде для реализации из-за превышения в нем МДУ антибиотика. После использования необходима промывка, снижающая количество хлортетрациклина в три - четыре раза и проварка при общепринятых технологических режимах.
Замораживание не влияет на снижение остаточного количества хлортетрациклина в мышечной ткани.
10. Микробиологическая тест-система Дельвотест-R чувствительна к присутствию в молоке пенициллина, тетрациклина, эритромицина, неомицина, гентамицина. Другие антибиотики изменяют цвет системы при концентрации активного антибиотика выше МДУ.
Результаты, полученные с помощью Дельвотест-R, должны подтверждаться дополнительными методами, для того, чтобы учесть низкие концентрации таких антибиотиков, как линкомицин, эритромицин, рифамицин, стрептомицин, олеандомицин, полимиксин, левомицетин.
11. Пастеризация оказывает незначительное разрушительное действие на содержание антибиотиков в молоке. После длительной пастеризации в молоке содержание антибиотиков составляет 74 - 100 % от исходного показателя. Максимально подвержен разрушению тетрациклин при использовании режима длительной пастеризации.
После кратковременной и мгновенной пастеризации в молоке остается соответственно 87,2 % и 88,0 % антибиотиков от исходного количества.
12. Кипячение и стерилизация незначительно влияют на содержание остаточных количеств антибиотиков в молоке. После кипячения в молоке остается от 90 до 95% исходного количества антибиотиков. После стерилизации в молоке остается от 92 до 100% исходного количества антибиотиков. Сквашивание снижает исходное количество антибиотиков в молоке в среднем на 10%.
13. Контроль за остаточными количествами антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения должен проводиться повсеместно и регулярно с целью исключения поступления к потребителю продукции, не соответствующей требованиям стандартов качества и безопасности по содержанию лекарственных препаратов.
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Результаты работы могут быть использованы при определении качественных и количественных показателей содержания антибиотиков в продукции животноводства, а также могут быть полезны при решении вопросов о дальнейшей реализации сырья животного происхождения, содержащего остаточные количества антибиотиков.
Отделением ветеринарной медицины РАСХН утверждены методические рекомендации для специалистов научно-исследовательских учреждений и лабораторий, занимающихся вопросами ветеринарно-санитарного контроля мяса и мясопродуктов:
Подбор микробиологической тест-системы для обнаружения антибиотиков в продуктах животного происхождения (11.05.2005г.);
Определение концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения пластинчатым методом с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341 (11.05.2005г.);
Методические рекомендации по ветеринарно-санитарной оценке продуктов убоя, содержащих остаточные количества антибиотиков (26.10.06);
Методические рекомендации по определению антибиотиков в продуктах животноводства методом высоковольтного электрофореза (26.10.06).
Чувствительность микробиологической тест-системы ДЕЛЬВОТЕСТ-R к антибиотикам, применяемым в животноводстве и ветеринарии (06.02.08).
Снижение содержания остаточных количеств антибиотиков в молоке под действием режимов пастеризации, стерилизации и сквашивания (06.02.08).
Изданы учебные пособия для студентов ветеринарных и технологических факультетов высших учебных заведений, курсов повышения квалификации и практических специалистов по ветсанэкспертизе:
Методы лабораторного контроля животноводческой продукции, содержащей антибиотики - М.: МГУПБ, 2005. - 80 с.;
Ксенобиотики лекарственного происхождения в продукции животноводства - М.: МГУПБ, 2005. - 80с.
Материалы экспериментальных и клинических исследований используются в учебном процессе при подготовке ветеринарных, ветеринарно-санитарных врачей, технологов, биотехнологов, слушателей курсов повышения квалификации по курсам ветсанэкспертиза, производственный ветеринарный контроль, ветсанэкспертиза с основами технологии производства продуктов животного происхождения.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Кальницкая О.И. Оптимальные среды и режимы культивирования микроорганизмов // Научный вестник ЛГАВМ. - Львов. - 2000. - С. 112-114.
- Кальницкая О.И. О качестве и безопасности пищевых продуктов // Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции: Материалы 4-ой международной научно-практической конференции. - М., 2002. - С. 54-55.
- Кальницкая О.И. Ветеринарно-санитарные требования к качеству продуктов убоя животных // Практик. - 2003. - № 6.
- Кальницкая О.И. Определение потенциально опасных химических соединений в продуктах убоя животных и птицы // Пища. Экология. Человек: Материалы 5-ой международной научно-технической конференции. - М. - 2003. - С. 244-245.
- Кальницкая О.И. Проблемные аспекты использования антибиотиков в ветеринарии и животноводстве // Состояние и проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии в животноводстве: Материалы международной научно-практической конференции. - Чебоксары. - 2004. - С. 4-8.
- Кальницкая О.И. Экспериментальное определение чувствительности споровых тест-культур к наиболее распространенным антибиотикам // Состояние и проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии в животноводстве: Материалы международной научно-практической конференции. - Чебоксары. - 2004. - С. 8-11.
- Кальницкая О.И. Антибактериальные препараты и их определение в животноводческой продукции // Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции: Материалы 5-ой международной научно-практической конференции. - М. - 2004. - С. 163-165.
- Кальницкая О.И. Нитрофураны как ксенобиотики лекарственного происхождения // Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции: Материалы 5-ой международной научно-практической конференции. - М. - 2004. - С. 165-166.
- Кальницкая О.И. Подбор микробиологической тест-системы для обнаружения антибиотиков в продуктах животного происхождения: методические рекомендации (Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 11.05.05). - М.: МГУПБ, 2005. - 18 с.
- Кальницкая О.И. Определение концентрации антибиотиков в продуктах животного происхождения пластинчатым методом с помощью штаммов Bacillus subtilis L2 и Micrococcus luteus ATCC 9341: методические рекомендации (Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 11.05.05). - М.: МГУПБ, 2005. - 6 с.
- Кальницкая О.И. Влияние остаточных количеств антибиотиков на результаты ветсанэкспертизы продуктов животноводства // Оптимальное питание - здоровье нации: 8 Всероссийский Конгресс. - М., ГУ НИИ питания РАМН. - 2005. - С. 110.
- Кальницкая О.И. Использование антибиотиков в ветеринарии и животноводстве // Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы: Материалы международной конференции. - М., ФГУ ВГНКИ, 2005. - С. 51 - 53.
- Кальницкая О.И. Новые направления использования антибиотиков в пищевой промышленности // Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы: Материалы международной конференции. - М., ФГУ ВГНКИ, 2005. - С. 53 - 54.
- Кальницкая О.И. Определение остаточных количеств антибиотиков в мышечной ткани птицы // Мясная индустрия. - 2005. - № 12. - С. 35-37.
- Кальницкая О.И. Проблема применения антибиотиков // Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды: Материалы международной конференции. - Саратов, ИБФРМ РАН. - 2005. - С. 132-133.
- Кальницкая О.И. О необходимости ветеринарного контроля за остаточными количествами антибиотиков в продукции животноводства / Кальницкая О.И., Кунаков А.А., Серегин И.Г. // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: Материалы научно-практической конференции. - Санкт-Петербург. - 2005. - С. 89-90.
- Кальницкая О.И. Антибиотики в мясных продуктах питания / Кальницкая О.И., Мулюкова А.П. // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: Материалы научно-практической конференции. - Санкт-Петербург. - 2005. - С. 88-89.
- Кальницкая О.И. Экологические аспекты производства пищевых продуктов // Пищевые технологии-2005: Материалы международной научно-практической конференции. - Одесса, ОНАПТ. - 2005. - С. 130-131.
- Кальницкая О.И. К вопросу о безопасности питания // Материалы 3 съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. - М. - 2005. - С. 151.
- Кальницкая О.И. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, применяемым в ветеринарии и животноводстве // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии: сборник научных трудов. - М. - 2006. - Т. 118. - С. 149-155.
- Кальницкая О.И. Ксенобиотики лекарственного происхождения в продукции животноводства: учебное пособие. - М.: МГУПБ, 2006. - 93 с.
- Кальницкая О.И. Методы лабораторного контроля животноводческой продукции, содержащей антибиотики: Учебное пособие. - М.: МГУПБ, 2006. - 99 с.
- Кальницкая О.И. Нормативные акты в области обеспечения безопасности сырья / Кальницкая О.И., Баранов М.А. // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы 4 международной научной конференции. М., МГУПБ. - 2005. - С. 199-201.
- Кальницкая О.И. Лекарственные средства как возможные контаминанты продукции животноводства // Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний: Материалы международного симпозиума. - Казань, ФГУ ФЦТРБ-ВНИВИ. - 2005. - С. 165-169.
- Кальницкая О.И. Методы определения антибиотиков в продуктах животноводства // Научное обеспечение инновационных процессов в перерабатывающей отрасли: сборник трудов, посвященный 75-летию ВНИИМП им. В.М. Горбатова. - М. - 2005. - С. 19-21.
- Кальницкая О.И. Современные методы определения антибиотиков // Ветеринария. - 2006. - №6. - С. 54-56.
- Кальницкая О.И. Гигиенические аспекты проблемы использования лекарственных препаратов в животноводстве // Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии: Материалы международной научно-практической конференции. - М., ВИЭВ. - 2006. - С. 608-609.
- Кальницкая О.И. Нормативная база по организации питания детей // Актуальные проблемы педиатрии: Х Конгресс педиатров России. - М. - 2006. - С. 239.
- Кальницкая О.И. Влияние канцерогенных веществ на качество сельскохозяйственной продукции и здоровье человека / Кальницкая О.И., Ильина А.Г. // Агроэкологическая безопасность в условиях техногенеза: Материалы международного симпозиума. - Казань - 2006.- С. 41-47.
- Кальницкая О.И. Ветеринарный контроль за остаточными количествами антибиотиков в животноводческой продукции / Кальницкая О.И., Мулюкова А.Н. // Эффективное животноводство. Изд-во ЭФПИТ.
- Кальницкая О.И. Контроль безопасности пищевых продуктов с помощью современных методов исследования / Кальницая О.И., Иванова Г.В. // Технология и продукты здорового питания: Материалы международной научно-практической конференции. - М., МГУПП. - 2006. -С. 28-31.
- Кальницкая О.И. Уровень обнаружения антибиотиков в продуктах убоя, полученных из отечественного и импортного сырья / Туник А.Н., Уша Б.В., Кальницкая О.И. // Ветеринария. - 2007. - № 4. - С. 48-53.
- Кальницкая О.И. Особенности регионального мониторинга продуктов питания, содержащих антибиотики / Кальницкая О.И., Розанова И.И., Кипин Е.Н. // Диетология: проблемы и горизонты: 1-й Всероссийский съезд диетологов и нутрициологов. - М. - 2006. - С. 44-45.
- Кальницкая О.И. Законодательное обеспечение работ в РФ по недопущению в пищу продовольственного сырья, содержащего ксенобиотики / Кальницкая О.И., Петрова Е.И. // Качество, стандартизация, контроль: теория и практика: Материалы 6-ой международной научно-практической конференции. - Ялта. - 2006. - С. 57-60.
- Кальницкая О.И. Влияние антибиотиков, обнаруженных в продуктах животноводства, на здоровье человека / Кальницкая О.И., Петрова Е.И. // Качество, стандартизация, контроль: теория и практика: Материалы 6-ой международной научно-практической конференции. - Ялта. - 2006. - С. 60-63.
- Кальницкая О.И. Оценка степени риска при применении антибиотиков в пищевой промышленности / Кальницкая О.И., Кунаков А.А., Серегин И.Г. // Интеграция в мясную промышленность России современных методов управления качеством и прослеживаемости: Материалы 8-ой международной научно-практической конференции. - М., ВНИИМП. - 2006. - С. 67-68.
- Кальницкая О.И. Влияние остаточных количеств антибиотиков на безопасность продуктов животноводства / Чубарова Е.А., Кальницкая О.И. // Материалы 6-ой международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М., МГУПБ. - 2007. - С. 233-234.
- Кальницкая О.И. Влияние способов пробоподготовки на степень извлечения антибиотиков из биологических субстратов // Ветеринария, № 1, 2008, с. 58-60.
- Кальницкая О.И. Методические рекомендации по ветеринарно-санитарной оценке продуктов убоя, содержащих остаточные количества антибиотиков (Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.10.06) / Кальницкая О.И., Уша Б.В. // Ветеринарный консультант. - 2007. - № 3 (142). - С. 11-14.
- Кальницкая О.И. Методические рекомендации по определению антибиотиков в продуктах животноводства методом высоковольтного электрофореза (Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.10.06) / Кальницкая О.И., Петрова Е.И. // Ветеринарный консультант. - 2007. - № 6 (145). - С. 7-10.
- Кальницкая О.И. Методические рекомендации Чувствительность микробиологической тест-системы ДЕЛЬВОТЕСТ-R к антибиотикам, применяемым в животноводстве и ветеринарии (Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 06.02.08).
- Кальницкая О.И. Методические рекомендации Снижение содержания остаточных количеств антибиотиков в молоке под действием режимов пастеризации, стерилизации и сквашивания (Утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 06.02.08).
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по разное