Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по сельскому хозяйству
На правах рукописи
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ
ТУБЕРКУЛЕЗНОГО АНАТОКСИНА
И ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ КАНАМИЦИНА
06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,
микология с микотоксикологией и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
Курск-2012
Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.
Научный руководитель: | доктор ветеринарных наук, профессор Евглевский Анатолий Алексеевич |
Официальные оппоненты: | доктор ветеринарных наук, профессор Мищенко Владимир Александрович зав. отд. болезней рогатого скота ФГУ Федеральный центр охраны животных, г. Владимир |
кандидат ветеринарных наук, Шевцов Илларион Андреевич руководитель ГБУ Курская городская станция по борьбе с болезнями животных, г. Курск | |
Ведущая организация: | ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН, г. Воронеж |
Защита диссертации состоится л07 июня 2012 в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.220.040.03 при ФГБОУ ВПО Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова по адресу: 305021, г. Курск, ул. К. Маркса, 70 КГСХА
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова
Автореферат разослан л апреля 2012г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Г.Ф. Рыжкова
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Развитие эпизоотического процесса при туберкулезе у животных в определенной степени связано с эпидемическим процессом у человека и наоборот, так как не вакцинированные животные, не обладая достаточным иммунитетом, будут заражаться и создавать резервуар возбудителя (Биргер М.О. 1982; Донченко А.С. 1997; Ридер Г.Л. 2001).
Наличие более 50 видов микобактерий, сложность строения, резкое повышение устойчивости к средствам химико- и антибиотикотерапии представляют серьезную медико-ветеринарную и социальную проблему (Беляков В.Д. 1998; Данилевская Н.В. 2005; Коротяев А.И. 1998).
Использование вакцины БЦЖ, туберкулезного аллергена (туберкулина токсино-аллергена), адьюванта Фрейнда экспериментальных ДНК - вакцин, анатоксинов и антибиотикотерапия не решили проблему эффективности профилактических, диагностических и лечебных мероприятий в борьбе с туберкулезом (Бектемиров Т.А. 2007; Леви Д.Т. 1999).
Актуальными проблемами остаются совершенствование средств и способов аллергодиагностики и специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота, повышения эффективности и снижения токсичности антибиотиков (Никитин А.В. 2009; Сорокин Г.В. 2008; Федоров Ю.Н. 2005).
Вышеизложенное определило выбор темы, цель и задачи исследований.
Цель работы: Целью работы явилось усовершенствование синтетической питательной среды для выращивания свежевыделенных микобактерий туберкулеза бычьего вида для получения нативного туберкулина и токсино-аллергенов, изыскание биологической модели аллергии и повышения эффективности туберкулезного анатоксина и канамицина.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи исследования:
1. Усовершенствование жидкой и плотной синтетической питательной среды для выращивания, выделения микобактерий туберкулеза и получение токсино-аллергенов;
2. Создание способа безопасной биологической модели аллергии туберкулёза, путём сенсибилизации морских свинок и сельскохозяйственных животных убитыми микобактериями туберкулёза, для изучения процесса детоксикации и инактивации токсина аллергена и проявление аллергических реакций;
3. Усовершенствование средств и способа детоксикации и инактивации туберкулезных токсино-аллергенов и модификации канамицина;
4. Изучение протективных, иммуногенных свойств полученного туберкулезного анатоксина, а также лечебной и бактерицидной эффективности модифицированного канамицина.
Научная новизна. Детоксикация, полимеризация и инактивация туберкулезных молекулярных токсино-аллергенов позволило получить анатоксин, обладающий протективными и иммуногенными свойствами. Установлено, что иммунизация кроликов туберкулезным анатоксином вызывает образование в сыворотке крови аллергеннейтрализующие и преципитирующие антитела, которые могут быть использованы в качестве новых диагностических тестов.
Модификация канамицина по способу получения туберкулезного анатоксина повысило бактерицидную активность и лечебную эффективность препарата в отношении канамициноустойчивых микобактерий туберкулеза бычьего вида при утрате токсичности.
Полученные результаты при детоксикации и инактивации туберкулезных токсино-аллергенов, модификация канамицина по принципу получения анатоксинов, выявление в сыворотке крови кроликов иммунизированных туберкулезным анатоксином преципитирующих и аллергеннейтрализующих антител, получение биологической модели аллергии к туберкулину являются приоритетными.
Теоретическая и практическая значимость работы. Иммуногенные протективные свойства туберкулезного анатоксина могут составить основу специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота.
Разработанный и апробированный способ сенсибилизации морских свинок и сельскохозяйственных животных суспензией из автоклавированных микобактерий туберкулеза позволяет использование в качестве безопасной биологической модели аллергии для изучения аллергической реакции, динамики детоксикации и инактивации туберкулезных токсино-аллергенов при изготовлении туберкулезного анатоксина.
Установленное образование у вакцинированных кроликов туберкулезным анатоксином преципитирующих и аллергеннейтрализующих антител создают возможность использование новых диагностических проб при диагностике туберкулеза у животных.
На защиту выносятся следующие основные положения:
1. Усовершенствование жидкой и плотной с агаром синтетической среды для выращивания и выделения микобактерий туберкулеза.
2. Сравнительная оценка разных методов деструкции микобактерий туберкулеза для получения растворимых токсино-аллергенов.
3. Результаты сенсибилизации морских свинок и температурного воздействия на проявление реакции кожи на токсино-аллергены.
4. Результаты редуцирующего и инактивирующего действия формальдегида на туберкулезные токсино-аллергены и получение анатоксина.
5. Результаты усовершенствования метода получения туберкулезного анатоксина.
6. Повышение эффективности модифицированного канамицина к микобактериям туберкулеза.
7. Результаты определения бактерицидной и лечебной эффективности канамицина, модифицированного детоксикацией и полимеризацией.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы изложены и одобрены на всероссийских научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И. Иванова и Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины.
По теме работы опубликовано восемь научных статей в т.ч. три в журналах рекомендованных ВАК РФ. Получен один патент РФ на изобретение и одно положительное решение о выдачи патента на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах компьютерного текста и включает общую характеристику работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы и практические предложения. Работа иллюстрирована 10 рисунками, 5 фото и 11 таблицами. Список литературы включает в себя 196 источников, в том числе 71 иностранных авторов.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования проводились в условиях лаборатории кафедры эпизоотологии, радиобиологии и фармакологии ФГБОУ ВПО Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, кафедры туберкулеза ГОУ ВПО "Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, ГУ Жуковская районная станция по борьбе с болезнями животных и ГУ Жуковская районная ветлаборатория Комитета ветеринарии при Правительстве Калужской области и животноводческого хозяйства ЗАО За Мир Жуковского района, Калужской области с 2008 года по 2011 год с использованием морских свинок кроликов, белых мышей, поросят и крупного рогатого скота.
Выделение чистой культуры микобактерий туберкулеза проводили после обработки суспензии пораженных органов (легких, селезенки, лимфоузлов) с использованием для подавления посторонней микрофлоры (стафилококков, сальмонелл и кишечной палочки) вначале 4-6% раствором лимонной кислоты и 3% раствором перекиси водорода в соотношении 1:1 к суспензии биоматериала и выдержки в течение 30-60 минут при комнатной температуре, с последующей обработкой раствором содержащим 4-5% янтарной кислоты и 3% перекиси водорода в соотношении с суспензией 1:1 с последующей через 30-60 минут, нейтрализацией полученной суспензии 5-7% раствором аммиака до РН - 6,8 - 7,0.
Выращивание свежевыделенных микобактерий туберкулеза бычьего вида проводили в 2 -х литровых биобутылях с объемом среды равной 1 литру, путем нанесение пленки микроорганизмов, взятых с помощью шпателя или платиновой петли с картофельных клиньев с синтетической средой.
Для более безопасного способа аллергизации морских свинок и крупного рогатого скота использовали суспензию из автоклавированных микобактерий, сорбированных на 3-5 мг/мл гидроокиси алюминия.
Предложенный способ использовали для изучения динамики инактивации, редуцирования утраты аллергенных свойств туберкулезных токсино-аллергенов при получении туберкулезного анатоксина.
Туберкулезный анатоксин использован для изучения на токсичность и иммуногенную, протективную и аллергизирующую активность.
Модификацию канамицина проводили путем детоксикации и полимеризации, по принципу получения анатоксинов: вначале отдельно 0,2% раствором формальдегида при 38-40С в течение 3-5 суток, а затем в сочетании с 0,2 % раствора этония в том режиме.
Исследования проведены по следующей схеме, которая представлены на рис. 1
Рис.1. Схема исследований.
Статистическую обработку данных производили на ПК с помощью программы Excel из пакета прикладных программ MS Office 2003. Результаты представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки. Достоверность различий между показателями установили с помощ ью критерия Крамере -Уэлча (Орлов А.И. 2002) при заданном уровне значимости.
Исследования и результаты подтверждены актами, с участием: научного сотрудника Курского НИИ АПП к.в.н. Евглевского Д.А; зав. кафедрой туберкулеза ГОУ ВПО "Курский государственный медицинский университет, д.м.н, профессора Коломиец В.М.; зав кафедрой эпизоотологии, паразитологии и вирусологии ФГОУ ВПО Курская государственная сельскохозяйственная академия им. проф. И.И. Иванова, д.в.н. профессора Евглевского Ан.А.; врача эпизоотолога ГУ Жуковская районная станция по борьбе с болезнями животных Смирнова И.И.; директора лаборатории ГУ Жуковская районная ветлаборатория Семёновой В.В.; главного ветврача животноводческого хозяйства ЗАО За Мир Колосовой Т.И.
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Усовершенствование жидкой и плотной с агаром синтетической среды для выращивания и выделения микобактерий туберкулеза.
В основу исследований по разработке состава синтетической питательной среды положено изучение энергетической и питательной функции ряда ди-, трикарбоновых кислот цикла Кребса, в частности с разным содержанием лимонной, янтарной, винной, пировиноградной, яблочной (изоянтарной) кислот отдельно, и в сочетании друг с другом, с аспарагином (амидом аспарогиновой кислоты), глицином, цитратом амония, сернокислым цинком и другими химическими компонентами.
Приготовленный раствор синтетической питательной среды разливали в 2-х литровые биобутыли с объемом жидкости равной 1 литру. Автоклавирование проводили при 1,0 атм. в течение 30 минут.
Посев микобактерий туберкулеза проводили с картофельных клиньев с помощью платиновой петли на поверхность жидкой синтетической питательной среды для их выращивания в течение 55-60 дней в термостате при 370,2С.
По результатам изучения роста и накопления бактериальной массы определен следующий оптимальный состав синтетической среды, рисунок 2.
Рис2. Состав жидкой синтетической питательной среды
для выращивания микобактерий туберкулеза в г/л.
С учетом результатов получения максимального накопления микобактерий туберкулеза на предложенной жидкой синтетической среде, была предпринята попытка выяснить питательную ценность плотной минеральной среды - с 2,5 % содержанием агара. Ингредиенты питательной среды растворяли в дистиллированной воде, как при последовательном их растворении, так и после предварительного их смешивания в сухом виде с внесением 2,5% агара. Реакцию среды устанавливали аммиаком до 6,8-7,1 перед стерилизацией.
Визуально наблюдаемый рост микобактерий туберкулеза происходил в среднем через 10-13 дней - для свежевыделенных культур микобактерий, и через 5-7 дней для лабораторных штаммов микобактерий туберкулеза бычьего вида на минеральной агаровой среде. В то же время заметный рост микобактерий туберкулеза при высеве на среду Левенштейна - Йенсена как известно происходит во всех случаях через 17-20 суток.
При посеве микобактерий туберкулеза с глицеринового картофеля или с жидкой питательной среды заметный рост микобактерий туберкулеза на минеральной агаровой среде отмечался на 3-5 сутки. Поверхность агара покрывается сплошным тонким налетом культуры в целом через 5-7 дней инкубирования, которые превращались в крошковатые наложение с образованием бугристого слоя до 0,3 см толщины.
Многократное успешное испытание указанного варианта минеральной агаровой среды по приготовлению и выращиванию микобактерий туберкулеза создает предпосылки для поддержания выделенной культуры и изучения лекарственной устойчивости микобактерий.
В ходе проведения опытов выяснено, что наиболее оптимальным средством позволяющим подавлять постороннюю микрофлору является состав смеси, состоящий из: 4-6% раствора лимонной кислоты с 3% раствором перекиси водорода, с последующем добавлением раствора содержащего 4-5% янтарной кислоты и 3% перекиси водорода с последующей, через 30-60 минут, нейтрализацией полученной суспензии 5-7% раствором аммиака до РН - 6,8 - 7,0. представленной в таблице 1.
Таблица 1. Состав смеси для подавления микрофлоры при выделении чистой культуры МТ.
№ п/п | Состав ингибирующей смеси для подавления роста микроорганизмов | Время обработки до нейтрализации аммиаком | Исходный показатель рН среды | Виды микроорганизмов и их рост | |||
S. aureus | Сальмонеллы | Кишечная палочка | МТ | ||||
1. | 2% раствор лимонной кислоты с 2% раствором перекиси водорода | 30-60 | 6,8-7,0 | + | + | + | - |
2. | 3% раствор лимонной кислоты с 3% раствором перекиси водорода | 30-60 | 6,8-7,0 | + | - | - | + |
3. | 4-6% раствор лимонной кислоты с 3% раствором перекиси водорода, а затем через 30-60 минут 4-5% раствор янтарной кислоты с 3% раствором перекиси водорода | 30-60 минут | 6,8-7,0 | - | - | - | + |
Сравнительная оценка разных методов деструкции микобактерий туберкулеза для получения растворимых токсино-аллергенов.
С целью изыскания рациональных методов получения максимального количества туберкулопротеинов из бактериальной массы микобактерий туберкулеза проводили автоклавирование микроорганизмов при 1,0 и 1,5 атмосферах в течении от 30 минут до 3-х часов. Ввиду того, что при проведении химико- термического гидролиза бакмассы при давлении 1,5 атмосферы и выше происходило образование темно-коричневого гидролизата, в связи с этим в дальнейших исследованиях автоклавирование проводили при 1,0 атмосфере.
По полученным в ходе опытов данным, выяснено, что с увеличением экспозиции автоклавирования от 30 минут до 3-х часов обеспечивало выделение в жидкую часть питательной среды туберкулопротеинов от 0,700,04 до 1,340,04 мг/мл. При этом аллергенная активность туберкулезных токсино-аллергенов, установленная при введении сенсибилизированным морским свинкам, в разведений 1:100, 1:500 и 1:1000 основных растворов токсино-аллергенов и ППД-туберкулина производственной серии Курской биофабрики препарата увеличилась с 520003000 ТЕ до 950005000 ТЕ в одном мл.
Результаты сенсибилизации морских свинок и температурного воздействия на проявление реакции кожи на токсино-аллергены.
При изучении аллергенных и протективных свойств разрабатываемого биопрепарата необходимо было использовать биологические модели по изучению аллергии в эксперименте. Однако имеющиеся в настоящее время модели для сенсибилизации (аллергизации) морских свинок рассчитаны на использование живых вирулентных микобактерий или вакцины БЦЖ, что требует соблюдения определенных мер безопасности и соответствующих затрат, а на введение суспензии автоклавированных микобактерий туберкулеза в минеральном масле и ланолине у морских свинок происходило образование стерильных гнойных абсцессов. В то же время при использовании в качестве депонента гидроокиси алюминия отдельно с убитыми микобактериями туберкулёза без минерального масла для вакцин, образование абсцессов не происходило. Поэтому для сенсибилизации морских свинок использовали суспензию из автоклавированных микобактерий туберкулёза с гидроокисью алюминия без минерального масла.
Окончательный состав суспензии микобактерий для сенсибилизации морских свинок включает: 5 г сухих автоклавированных микобактерий туберкулеза, 90 мл физраствора и 10 мл гидроокиси алюминия (300 - 500мг) из расчета 3-5мг/мл гидроокиси алюминия.
Предложенная биологическая модель аллергии при туберкулезе была использована для изучения влияния термического фактора (охлаждение и перегревание животных) на реактивность сенсибилизированных морских свинок к туберкулину и определения редуцирующего действия формальдегида на туберкулёзный токсиноаллерген для получения туберкулёзного анатоксина. Первоначально изучено влияние температурного воздействия на реактивность кожи сенсибилизированных морских свинок путем внутрикожного введения туберкулина Результаты опытов предоставлены в таблице 2.
Таблица 2. Диаметры гиперемии кожи у сенсибилизированных морских свинок на туберкулин подвергнутых температурному воздействию.
№ групп животных | Количество животных | Температурное воздействие | Реакция кожи в мм через: | |
24 часа | После 10 дней | |||
1. | 8 голов | Контроль 20-25С | 14,22 | 13,22 |
2. | 12 голов | 5С В течение 24 часа | 6,50,5 | 13,52 |
3. | 12 голов | 40-42С 3-х кратно по 1 часу в день | 6,70,5 | 13,52 |
Из данных, представленных в таблице 2 следует, что у аллергизиро-ванных морских свинок, после их переохлаждения или перегревания возникает анергия, сопровождаемая утратой реакции на туберкулин. Утраченная чувствительность кожи к туберкулину восстанавливается через 10 дней после перевода животных в нормальные температурные условия. Полученные результаты учитывались как противопоказания на введение туберкулина при изучении аллергии и редуцирующего действия формальдегида на аллергенные свойства туберкулезного анатоксина.
Результаты редуцирующего и инактивирующего действия формальдегида на туберкулезные токсино-аллергены.
Детоксикацию туберкулезных токсино-аллергенов проводили при концентрации раствора формальдегида от 0,4% до 1% при температуре 421 С в течение 10-20 дней с ежедневным перемешиванием. Результаты редуцирующего действия формальдегида на инактивацию и детоксикацию туберкулезных токсино-аллергенов представлены в таблице 3.
Таблица 3 Динамика редуцирующего действия формальдегида на туберкулезные токсиноаллергены.
№ п/п | Аллергенная активность токсиноаллергена и рН раствора | Исходная концентрация фор-мальдегида | Повторное внесение формальдегида через 10 дней | Продолжи- тельность детоксикации при 42С | Остаточная аллергенная активность токсино-аллергенов | % потери активности |
1. | 100000 ТЕ/мл 2 мг/мл рН = 7,0 0,2 | 0,4% | - | 10 дней | 25000500 ТЕ/мл | 75% |
2. | 100000 ТЕ/мл 2 мг/мл рН = 7,0 0,2 | 0,3% | 0,3% | 20 дней | 5000500 ТЕ/мл | 95% |
3. | 100000 ТЕ/мл 2 мг/мл рН = 7,0 0,2 | 0,4% | 0,4% | 20 дней | 2500200 ТЕ/мл | 96% |
4. | 100000 ТЕ/мл 2 мг/мл рН = 7,0 0,2 | 0,5% | 0,5% | 20 дней | 1500200 ТЕ/мл | 98% |
Результаты исследований указывают на способность формальдегида инактивировать аллергенные свойства молекулярного туберкулезного токсино-аллергена и одновременно вызывать детоксикацию его токсических свойств.
В последующем для инактивации и детоксикации туберкулезного токсино-аллергена было испытано сочетании формальдегида с раствором этония.
Сочетанное применение 0,4% раствора формальдегида с 0,2% раствором этония ускоряло детоксикацию и инактивацию туберкулезного токсино-аллергена. Предложенный способ детоксикации и полимеризации туберкулёзного токсино-аллергенов был положен за основу получения туберкулёзного анатоксина. Основные технологические этапы предоставлены на рисунке 3
Рис. 3. Технология получения туберкулезного анатоксина
Предполагаемая оптимизированная технология изготовления туберкулезного анатоксина легко осуществима и основана на общем принципе детоксикации токсичных и инактивации аллергенных свойств туберкулезных токсинов и аллергенов и приобретением иммунопротективных свойств препарата. Приготовленные три серии (образца) туберкулезного анатоксина (8 литров) были подвергнуты изучению на сенсибилизирующие свойства у морских свинок и у коров, на протективную и иммуногенную активность. Исследования проведены в ГУ Жуковскоя ветеринарная лаборатория Калужской области и животноводческого хозяйства ЗАО За Мир Жуковского района, Калужской области.
Результаты усовершенствования метода получения туберкулезного анатоксина
Изучение сенсибилизирующих свойств туберкулезного анатоксина.
Чувствительность кожи у морских свинок определяли путем внутрикожного введения 0,1 мл туберкулина ППД Курской биофабрики в разведении 1:100 (50ТЕ) и коровам по 0,2мл.(10000ТЕ) Учет реакции у морских свинок проводили через 24 часа по диаметру гиперемии кожи, а у коров через 72 часа по утолщению кожной складки. Полученные результаты указывают, что подкожное введение анатоксина, вызывает чувствительность кожи к туберкулину на протяжении 3х-4х месяцев, а затем угасает Результаты опытов предоставлены на рис. 4 и рис. 5.
Рис. 4. Динамика чувствительности кожи у морским свинкам
Рис. 5. Динамика чувствительности кожи у коров
Изучение иммуногенной активности туберкулезного анатоксина
При изучении иммуногенной активности туберкулезного анатоксина использовали иммунную сыворотку. Для ее получения были взяты кролики массой 2,5-3,0 кг, которым 6-ти кратно подкожно в 2-3 точки вводили туберкулезный анатоксин в объеме 2,0 мл с интервалом 5-6 дней. На 10-е сутки после окончания иммунизации получали сыворотку, которую консервировали мертиолятом в разведении 1:10000. Полученную сыворотку изучали на наличие аллергеннейтрализующих и преципитирующих антител.
Результаты инактивирующего действия иммунной сыворотки на аллергенные свойства туберкулина, подтверждаются тем, что специфическая иммунная кроличья сыворотка, полученная после иммунизации туберкулезным анатоксином (цельная и в разведении 1:5 и 1:10) после выдерживания в смеси с туберкулином в термостате при 42-43С в течение 6-12 ч вызывает снижение аллергенной активности нативного туберкулина на сенсибилизированных морских свинках соответственно на 60%, 40% и 20%. Результаты опыта представлены в таблице №4.
Из полученных данных следует, что туберкулезный анатоксин после 6 кратного подкожного введения кроликам в объеме 2,0 мл вызывает образование в организме аллергеннейтрализующей и преципитирующие антитела.
Таблица 4. Результаты инактивирующего действия иммунной сыворотки на аллергенную активность туберкулина (токсино-аллергена)
№ п/п | Разведение иммунной сыворотки | Кол-во морских свинок, голов | Исходная аллергенная активность туберкулина, ТЕ/мл | Аллергенная активность после воздействия иммунной сыворотки на туберкулин, ТЕ/мл | Снижение аллергенной активности туберкулина, в % |
1. | цельная | 6 | 50000 | 20000 | 60% |
2. | 1:5 | 6 | 50000 | 30000 | 40% |
3. | 1:10 | 6 | 50000 | 40000 | 20 % |
4. | контроль | 4 | без иммунной сыворотки | 50000 | снижения аллерг. активности не установлено |
Изучение протективной активности туберкулезного анатоксина
Протективные свойства туберкулезного анатоксина определяли с использованием морских свинок и кроликов. В работе использовано 14 морских свинок и 12 кроликов после 3-х кратной вакцинации туберкулезным анатоксином в объеме 2-3 мл с интервалом 10 суток с последующим, через 30 суток заражением 1мг микобактериями туберкулеза во внутреннюю часть тазовой конечности. Наблюдение за животными проводили в течении 90 суток. Полученные результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5 Результаты протективной активности туберкулезного анатоксина
№ п/п | Виды и количество животных | Количество животных пало после заражения через(дней | Убито через 90 дней после заражения | ||
30 | 60 | 90 | |||
1. | 14 морских свинок, вакцинированных ТА | 1 | 2 | 3 | 8 |
2. | 12 кроликов, вакцинированных ТА | 1 | 2 | 2 | 7 |
3. | Контроль 4 морских свинки не вакцинированные ТА | 3 | 1 | - | - |
4. | Контроль 4 кролика не вакцинированные ТА | 3 | 1 | - | - |
Повышение бактерицидной и лечебной эффективности модифицированного канамицина к микобактериям туберкулеза
Для снижения токсичности и повышения эффективности производственного канамицина, устойчивости его к ферментативному воздействию микроорганизмов, использовали полимеризацию и детоксикацию с помощью двух детоксикаторов - вначале 0,2 раствором формальдегида при 40,02,0С в течение 3-5 суток, а затем в таком же режиме используя 0,2% раствор этония для полноты детоксикации и повышения терапевтических свойств препаратов.
Исследованиея на безвредность проводили с использованием 10 белых мышей, 8 морских свинок ,которым ежедневно подкожно, вводили модифицированный канамицин. в дозах: белым мышам по 0,5 мл (50 мг) в течение 5 суток, морским свинкам по 1,0 мл (100 мг) в течение 10 суток. По истечении 15 суток после последнего введения канамицина все животные оставались живыми и без гнойно-некротических изменений на месте введения препаратов.
Определение бактерицидной и бактериостатической эффективности модифицированного канамицина проводили на плотной и жидкой синтетической питательной среде, в которую добавляли 5,0; 10,0; 20,0; 30,0 и 40,0 мкг/мл производственного и модифицированного канамицина.
При этом установлено отсутствие роста лекарственно-устойчивых микобактерий туберкулёза бычьего вида при концентрации 10-15 мкг/мл модифицированного канамицина как на плотной так и на жидких питательных средах.
В то же время рост лекарственноустойчивых микобактерий на плотной и жидкой питательных средах происходил при концентрациях производственного канамицина 40-45 мкг/мл.
Полученные результаты подтверждают, что по эффективности в отношении лекарственноустойчивых микобактерий туберкулёза бычьего вида модифицированный канамицин превышает производственный в 2,5-3,0 раза.
Результаты определения лечебной эффективности канамицина, модифицированного детоксикацией и полимеризацией
ечебные свойства модифицированного канамицина изучали с использованием 18 морских свинок по истечении 30 дней после заражения микобактериями туберкулеза бычьего вида в дозе 1,0 мг (40 миллионов микроорганизмов). В качестве контроля использовали производственный канамицин для лечения 8 морских свинок, подвергнутых также заражению 1мг микобактерий туберкулеза. В целом лечение морских свинок, производственным и модифицированным канамицином проводили в течение 30 суток путем ежедневного подкожного введения по 100-120 мг препарата на одно животное. Наблюдение за животными проводили в течение 90 суток. Полученные результаты представлены в таблице 6.
Таблица 6. Результаты лечебной эффективности модифицированного детоксикацией и полимеризацией канамицина
№ п/п | Количество морских свинок | Наименование антибиотика | Количество животных пало после заражения через (суток) | Количество убитых морских свинок после 90 суток лечения | ||
30 | 60 | 90 | ||||
1. | 8 | Производственный канамицин | 1 | 7 | - | - |
2. | 18 | Модифицированный канамицин | - | 3 | 6 | 9 |
Из данных, представленных в таблице 6, следует, что при ежедневном введении в течение 30 суток морским свинкам производственного канамицина в дозе 100-120мг все опытные 8 голов погибли в течение 60 суток после заражения с обширными гнойно-кавернозными очагами в легких, печени, селезенке.
В тоже время однократное ежедневное введение модифицированного канамицина морским свинкам в дозе 100-120мг обеспечило выживаемость животных свыше 60 суток (30%-3 голов) и свыше 90 суток (9 голов -50%).
4. ВЫВОДЫ
1. Обработка суспензий из 5-20 граммов органов и тканей, обсемененных 10 тысячами сальмонелл, кишечной палочки и стафилококков и 1 мг микобактериями туберкулеза бычьего вида вначале 4-6% раствора лимонной кислоты с 3% раствором перекиси водорода, с последующем добавлением раствора содержащего 4-5% янтарной кислоты и 3% перекиси водорода с последующей, через 30-60 минут, нейтрализацией полученной суспензии 5-7% раствором аммиака до РН - 6,8 - 7,0 подавляет рост сальмонелл, стафилококков и кишечной палочки при сохранении роста микобактерий туберкулеза на среде Левенштейна-Йенсена.
2. Выращивание лабораторных и свежевыделенных микобактерий туберкулеза бычьего вида в 2-х литровых биобутылях с объемом синтетической питательной среды равной 1 литру в течение 55-60 суток обеспечивает стабильное накопление бактериальной массы до 120-130 граммов и содержание 0,72-0,76 мг/мл эндогенных растворимых токсино-аллергенов (нативного туберкулина), протеинов, липидов, полисахаридов, нуклеиновых кислот с аллергенной активностью 520003000ТЕ/мл.
3. Усовершенствованный метод получения туберкулезного анатоксина включает увеличение времени автоклавирования культуральной жидкости до 3-х часов при давление 1 атмосфера, декантация надосадочной жидкости, детоксикацию и инактивацию растворимых токсино- аллергенов вначале 0,4% раствором формальдегида при 42-45С в течение 3- 5 суток, а затем 0,2% раствором этония в том же режиме для полноты детоксикации с последующей сорбцией на 3-5 мг/мл гидроокиси алюминия.
4. Шестикратная иммунизация кроликов туберкулезным анатоксином в объеме 2-3 мл с интервалом 5-6 суток вызывает образование в сыворотке крови преципитирующие антитела в разведении 1:5 -1:10 в отношении нативного туберкулина и аллергеннейтрализующие антитела в титре 1:1 - 1:2, обеспечивающих нейтрализацию 70-80% аллергенной активности нативного и ППД - туберкулина, содержащих 500005000ТЕ/мл.
5.Двукратное подкожное введение туберкулезного анатоксина морским свинкам и кроликам в объеме 2-3 мл с интервалом 10 суток обеспечивает устойчивость животных к заболеванию туберкулезом в течение 3-х месяцев после подкожного введения суспензии с 1 мг микобактерий туберкулеза бычьего вида вместо общепринятых 0,01 - 0,001 мг.
6. Канамицин полученный путем детоксикации и полимеризации 0,2% раствором формальдегида при 40-42С в течение 3-5 суток, а затем 0,2 раствором этония в том же режиме повышает в 1,5 раза бактерицидную эффектив-ность в отношении канамицино-устойчивым микобактериям туберкулеза бычь-его вида, а ежедневное подкожное введение морским свинкам 100000 ЕД (0,1 г) препарата в течение 30 суток защищает животных от заболевания, после заражения 1мг микобактерий туберкулеза бычьего вида вместо общепринятых 0,01 - 0,001 мг.
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Целесообразно использовать туберкулезный анатоксин для специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота.
2. Способ создания биологической модели аллергии к туберкулину создает возможность изучать проявления аллергических реакций у животных и определения процесса детоксикации и инактивации туберкулезных токсино-аллергенов при изготовлении туберкулезного анатоксина.
3. Способ подавления роста посторонней микрофлоры в суспензии органов и тканей вначале 4-6% раствора лимонной кислоты с 3% раствором перекиси водорода, с последующем добавлением раствора содержащего 4-5% янтарной кислоты и 3% перекиси водорода с последующей, через 30-60 минут, нейтрализацией полученной суспензии 5-7% раствором аммиака до РН - 6,8 - 7,0 рекомендуем как щадящий метод выделения чистой культуры микобактерий туберкулеза.
Полученные результаты создают перспективу применения:
- туберкулезного анатоксина, полученный усовершенствованным методом, для профилактики заболевания туберкулезом морских свинок, кроликов и крупного рогатого скота;
- усовершенствованного канамицина для повышения эффективности лечения больных туберкулезом животных.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ
- работы, опубликованные в рекомендованных ВАК РФ изданиях
- Евглевский А.А Состояние и перспективы создания туберкулёзных биопрепаратов / Евглевский А.А., Коваленко А.М., Евглевский Д.А., Смирнов И.И. // Теоретические и прикладные проблемы ветеринарной медицины. 2009. - С. 47-49.
- Смирнов И.И. Десенсибилизирующие свойства и аллергизирующая активность туберкулёзного анатоксина / Смирнов И.И., Коваленко А.М., Евглевский Д.А. // Теоретические и прикладные проблемы ветеринарной медицины. -2009. - С. 49-50.
- Смирнов И.И. Протективная активность туберкулёзного анатоксина. / Смирнов И.И., Евглевский Д.А. // Теоретические и прикладные проблемы ветеринарной медицины. -2009. - С.57-58.
- Смирнов И.И. Иммуногенные свойства туберкулёзного анатоксина. / Смирнов И.И., Евглевский Д.А. // Теоретические и прикладные проблемы ветеринарной медицины.- 2009. - С.61.
- *Евглевский А.А. Совершенствование средств специфической профилактики лейкоза крупного рогатого скота / Евглевский А.А.,Кузьмин В.А., Евглевский Д.А.,Смирнов И.И. // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2010. №4. - С.100-102.
- Евглевский А.А. Изучение иммуногенной активности туберкулёзного анатоксина. / Евглевский А.А., Стебловская С.Ю., Евглевский Д.А., Смирнов И.И. и др. // Актуальные проблемы ветеринарной медицины.- 2010.- № 141.- С.19-27.
- *Евглевский А.А. Повышение эффективности канамицина к микобактеориям туберкулёза. / Евглевский А.А., Евглевский Д.А,Смирнов И.И. // Вестник Курской ГСХА.- 2011.- № .1-С. 63.
- *Евглевский Д.А. Универсальная синтетическая среда для выращивания патогенных и пробиотических микроаргонизмов при получении биопрепаратов. / Евглевский Д.А., Евглевский А.А.,Смирнов И.И.-//- Вестник Курской ГСХА.- 2011.- №4. - С.64-66.
- Патент Российской Федерации на изобретение № 2439142. Сентетическая питательная среда для выращивания микроорганизмов / Евглевский Д.А., Евглевский А.А., Тимкова Е.А.,Смирнов И.И. (Ru) КГСХА.
- Положительное решение о выдачи патента на изобретение. 19 января 2012 года. Способ выделения чистой культуры микобактерий туберкулеза / Евглевский А.А.Евглевский Д.А., Коломиец В.М., Коваленко А.М., Смирнов И.И. (Ru) КГСХА.
Формат 60х84 1/16. Бумага для множительных аппаратов.
Печать на копировальном аппарате КГСХА.
Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 107.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по сельскому хозяйству