Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по физике
Национальный исследовательский центр Курчатовский институт На правах рукописи
Новикова Наталья Николаевна
УДК 538.91, 538.97 СТРУКТУРНО-ЧУВСТВИТЕЛЬНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ И БИООРГАНИЧЕСКИХ НАНОСИСТЕМ НА ОСНОВЕ МЕТОДА СТОЯЧИХ РЕНТГЕНОВСКИХ ВОЛН
Специальность 01.04.07 - Физика конденсированного состояния
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук
Москва-2011
Работа выполнена в НИЦ Курчатовский институт.
Научный консультант:
доктор физ.-мат. наук, член-корреспондент РАН Ковальчук М.В.
Официальные оппоненты:
доктор физ.-мат. наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ академик РАН Панченко В.Я.
доктор физ.-мат. наук, профессор Пикин С.А.
доктор физ.-мат. наук, профессор Суворов Э.В.
Ведущая организация:
Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, физический факультет.
Защита состоится л___ _________ 2011 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 520.009.01 при НИЦ Курчатовский институт, по адресу: пл. Академика Курчатова 1, г. Москва.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИЦ Курчатовский институт.
Автореферат разослан л____ ____________ 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д 520.009.кандидат физико-математических наук А.В.Мерзляков
Актуальность темы.
Создание новых методов формирования и изучения свойств высокоорганизованных органических и биоорганических тонкопленочных систем представляет собой одно из важнейших направлений научных разработок в области нанотехнологий. Это объясняется, прежде всего, возможностью модифицировать физические и химических характеристики таких систем в широких пределах, что позволяет получать тонкопленочные покрытия нанометрового диапазона с заранее заданными и самыми разнообразными свойствами. Важнейшей сферой практического применения молекулярных пленок является микроэлектроника. В этом случае главным достоинством молекулярных пленок является возможность создавать тонкие, однородные диэлектрические, проводящие и полупроводниковые слоистые структуры с резкими границами между слоями. Упорядоченные биоорганические пленки приобретают все большее значение для различных биотехнологических применений, к числу которых относится использование белковых пленок в качестве активных элементов биосенсоров, разработка биокатализаторов для биотехнологических процессов, создание синтетических нанобиоструктурных материалов для биомедицинских приложений и т.д.
Особый интерес к исследованию упорядоченных белково-липидных пленок связан с тем, что по своему составу и морфологии эти системы представляют собой адекватную модель биологических мембран. Такие исследования позволяют получать информацию о структурно-функциональном состоянии белково-липидных моделей клеточных мембран на молекулярном уровне и могут быть эффективно использованы для решения широкого круга задач, связанных с биомедицинской диагностикой и биофизическими исследованиями. Новые перспективы для фундаментальных и прикладных исследований в области биологии и медицины открывает изучение белковолипидных пленок на поверхности жидкой субфазы, когда не нарушается нативная конформация белковых молекул, а, следовательно, сохраняются их биологические функции. Это дает принципиальную возможность моделировать различные биофизические и биохимические процессы, протекающие в функционирующих мембранах.
Дальнейшее расширение границ применения органических и биоорганических слоистых наноструктур тесно связано с развитием новых физических методик для характеризации объектов, имеющих наноразмерную организацию. К числу наиболее перспективных современных методов диагностики тонкопленочных систем относятся рентгеновские методики, дающие спектрально-селективную структурную информацию, такие как метод стоячих рентгеновских волн (СРВ). Исследования тонкопленочных биоорганических систем с помощью метода СРВ основаны на одновременной регистрации рентгеновского отражения и выхода вторичного излучения (например, характеристической флуоресценции), возникающего при неупругом рассеянии рентгеновских лучей в условиях полного внешнего отражения.
Главным преимуществом метода СРВ по сравнению с классическими рентгеновскими методиками является возможность напрямую определять местоположение атомов определенного сорта в слоистой системе из анализа угловых зависимостей выхода флуоресценции от этих атомов.
Важным шагом в развитии метода СРВ явилось применение этого метода для исследования белково-липидных слоев на жидкой субфазе, что потребовало решения целого ряда аппаратурно-методических задач, связанных с реализацией рентгенофлуоресцентных измерений при неподвижном положении образца. Несмотря на огромный потенциал метода СРВ, исследования органических слоев на жидкости с помощью рентгенофлуоресцентных измерений носят единичный характер. К началу настоящей работы существовали лишь две публикации американских и французских ученых по изучению процессов сегрегации ионов металлов из водной субфазы на мономолекулярный слой, нанесенный на поверхность водной субфазы.
Целью настоящей работы являлось развитие метода стоячих рентгеновских волн в области полного внешнего отражения для нанодиагностики органических и биоорганических пленок на твердых подложках и на поверхности жидкой субфазы. Работа включала в себя решение следующих задач:
Разработка методики рентгенофлуоресцентных измерений в области полного внешнего отражения для изучения элементного состава и структурной организации молекулярных пленок, сформированных на поверхности жидкой субфазы;
Проведение исследований органических и биоорганических наносистем на жидкости в условиях, когда молекулы находятся в подвижном состоянии и обладают большой свободой движения;
Теоретический анализ особенностей рассеяния рентгеновского излучения в биоорганических наносистемах в условиях полного внешнего отражения;
Создание математических подходов для анализа экспериментальных данных по исследованию методом стоячих рентгеновских волн мономолекулярных слоев на жидкости.
Научная новизна. В ходе работы впервые:
1. Метод СРВ экспериментально реализован для исследования элементного состава и структурной организации мономолекулярных слоев, сформированных на поверхности жидкой субфазы.
Преимущества развиваемого метода связаны с возможностью получать спектрально-селективную структурную информацию о динамичных двумерных системах, формирующихся в результате самопроизвольной организации молекул на межфазной границе жидкость/воздух.
2. Исследованы процессы самоорганизации, протекающие в белковолипидных пленках на поверхности жидкой субфазы, в условиях, когда липидные и белковые молекулы обладают высокой молекулярной подвижностью. Продемонстрированы принципиально новые возможности, которые открывает применение метода СРВ для изучения белково-липидных моделей биологических мембран в условиях максимально приближенных к условиям их функционирования в живой клетке.
3. Получена новая информация о молекулярных механизмах повреждающего действия токсических агентов (тяжелые металлы и мочевина) на белково-липидные модели биомембран, сформированные на поверхности жидкой субфазы и на твердых подложках.
4. Экспериментально и теоретически изучено явление резонансного усиления волнового поля в биоорганических наноструктурах, сформированных на поверхности жидкой субфазы.
5. Теоретически проанализированы особенности волновых полей, формирующихся в слаборассеивающих органических пленках в условиях полного внешнего отражения. Получено аналитическое выражение для интенсивности выхода флуоресценции от мономолекулярного слоя в приближении линейного затухания эвансцентной волны.
6. Экспериментально обнаружено самопроизвольное присоединение ионов металлов из воды высокой степени очистки к белковым макромолекулам в результате конформационных перестроек, вызванных действием различных ксенобиотиков (токсические агенты и лекарственные препараты).
7. Метод СРВ применен для изучения молекулярных механизмов действия лекарственных соединений. Предложен новый подход для исследования эффективности и безопасности действия лекарственных соединений с использованием белково-липидных наноструктур в качестве изолированных моделей клеточных мембран.
Практическая значимость. Результаты работы представляют собой научнометодическую основу для спектрально-селективной структурной диагностики органических и биоорганических наносистем на жидкости и на твердых подложках.
Развито новое направление в применении метода СРВ - изучение элементного состава и молекулярной организации органических и биоорганических пленок, сформированных на поверхности жидкой субфазы. Научный задел по нанодиагностике белковых пленок на жидкости с применением спектрально-селективных рентгеновских измерений позволит существенно расширить возможности биофизических исследований по изучению структуры белковолипидных моделей клеточных мембран, а также выявлению механизмов повреждения клеточных мембран при патологическом воздействии на клетку.
Разработана методика измерения угловой зависимости выхода флуоресценции от молекулярных пленок в условиях полного внешнего отражения, позволяющая избежать искажений сигнала, связанных с изменением положения области засветки рентгеновским пучком на поверхности жидкой субфазы.
На примерах исследований белково-липидных пленок на жидкой субфазе показаны новые возможности метода СРВ для изучения молекулярной организации, а также механизмов функционирования биологических мембран в физиологических условиях и при патологических воздействиях на клетку.
Предложен метод контроля эффективности и безопасности действия лекарственных препаратов, позволяющий получать дифференциальные данные о механизмах действия лекарственного соединения, в отличие от интегральной информации, получаемой на живом организме.
Получена сравнительная оценка действия лекарственных препаратов (ЭДТА, сукцимер и ксидифон), применяемых для лечения острых и хронических интоксикаций тяжелыми металлами.
Разработаны аналитические подходы для математической обработки и интерпретации результатов эксперимента по изучению структуры и композиционного состава органических и биоорганических тонкопленочных наноструктур на жидкости с помощью метода СРВ.
Положения, выносимые на защиту:
Метод нанодиагностики органических и биоорганических пленок на жидкой субфазе с применением рентгенофлуоресцентных измерений в области полного внешнего отражения. Главным преимуществом предложенного метода является возможность получать спектральноселективную структурную информацию о динамичных двумерных системах, формирующихся в результате самопроизвольной организации молекул на межфазной границе жидкость/воздух.
Методика проведения рентгенофлуоресцентных измерений молекулярных пленок на поверхности жидкой субфазы для экспериментальных станций синхротронного излучения, на которых отклонение падающего рентгеновского пучка от горизонтали осуществляется с помощью кристалла-дефлектора.
Теоретические исследования общих закономерностей выхода флуоресценции от слаборассеивающих пленок в угловой области полного внешнего отражения. Метод, позволяющий однозначно определять местоположение атомов в мономолекулярном слое на жидкой субфазе из анализа угловых зависимостей выхода флуоресценции в области полного внешнего отражения.
Исследования процессов формирования органических и биоорганических наносистем на жидкости. В том числе: изучение молекулярной упаковки в органических слоях на жидкости;
исследование процессов самоорганизации в белково-липидных пленках в условиях, когда белковые и липидные молекулы обладают высокой молекулярной подвижностью; исследования нарушений белковолипидных взаимодействий в биоорганических пленках под влиянием различных токсических агентов (тяжелые металлы и мочевина).
Комплексное исследование белково-липидных пленок на твердых подложках, позволившие разработать новый метод изучения молекулярных механизмов действия лекарственных препаратов с использованием белково-липидных наноструктур в качестве изолированных моделей клеточных мембран. Полученные методом СРВ данные об эффективности комплексообразующих лекарственных препаратов, применяемых при острых и хронических интоксикациях тяжелыми металлами.
Обнаружено явление адсорбции ионов металлов на белковых молекулах, подвергнутых действию различных ксенобиотиков. Полученные результаты раскрывают один из возможных механизмов нарушения микроэлементного баланса в организме под действием экотоксикантов, а также при патологических изменениях в организме.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава I носит обзорный характер и посвящена изложению современного состояния исследования в области формирования упорядоченных органических и биоорганических пленок, а также развитию рентгеновских методик для диагностики такого рода объектов.
Нанотехнологии сегодня интенсивно используют процессы молекулярной и супрамолекулярной организации для создания новых структур, обладающих заранее заданными свойствами; развиваются все новые подходы к конструированию материалов, основанные на субмикронной сборке при использовании принципов самоорганизации вещества. Одним из наиболее эффективных методов создания упорядоченных органических наносистем является метод Ленгмюра-Блоджетт (ЛБ), позволяющий контролировать организацию слоистых систем на молекулярном уровне. Основа метода была разработана в 30-х годах 20 века И.Ленгмюром и его сотрудницей К.Блоджетт.
енгмюровские пленки формируются на границе раздела фаз жидкость/воздух из поверхностно активных веществ, обладающих амфифильными свойствами.
Первая попытка нанесения белковых монослоев (на основе пепсина и уреазы) была предпринята еще И.Ленгмюром. Новая волна интереса к белковым пленкам возникла в 80-х годах 20 века, когда были получены функциональные упорядоченные биоорганические пленки толщиной в одну молекулу, и продемонстрирована возможность применения белковых ЛБ пленок в качестве активных элементов биосенсорных устройств. В настоящее время иммобилизованные биологически активные высокомолекулярные соединения на твердых носителях широко применяются для развития новых областей науки и техники таких, как аналитическая биотехнология, биоэлектроника, биосенсорное приборостроение и т.д. Тонкие пленки на основе ферментов используется в биологии, биохимии и медицине с диагностической целью.
С точки зрения фундаментальных исследований изучение адсорбированных ферментов является одним из хорошо известных методов изучения их макромолекулярной организации, а также природы химических взаимодействий, лежащих в основе ферментативной активности. Кроме того, рентгеновские измерения на упорядоченных белковых пленках, сформированных на жидкой субфазе, могут быть хорошей альтернативой для рентгеноструктурного анализа белков, трудно поддающихся трехмерной кристаллизации, при этом появляется возможность in situ исследований процессов формирования белковых комплексов.
Дальнейшее расширение границ применения молекулярных пленок в сфере фундаментальных и прикладных исследований тесно связано с развитием новых физических методик для исследования такого рода объектов, позволяющих контролировать наноархитектуру органических систем на молекулярном уровне. Естественно, что различные поверхностночувствительные рентгеновские методы, такие как рефлектометрия, двумерная поверхностная дифракция и др., получившие дополнительные экспериментальные возможности с использованием источников синхротронного излучения, все более активно используются для исследования молекулярных пленок.
Сравнительно недавно рентгеновские исследования молекулярных пленок получили новый импульс в своем развитии, благодаря созданию рентгеновских спектрометров, оснащенных ленгмюровской ванной. В настоящее время структурная диагностика органических и биоорганических наносистем на жидкости представляет собой важную интенсивно развивающуюся область рентгеновских исследований с применением всего арсенала современных поверхностно чувствительных методик.
В настоящее время рентгеновские исследования молекулярных пленок на жидкости интенсивно развиваются по двум направлениям. Первое связано с использованием двумерной дифракции в скользящей геометрии, когда вектор рассеяния направлен параллельно поверхности пленки.
Рентгенодифракционные измерения в такой геометрии позволяют изучать кристаллическую структуру двумерных молекулярных систем вдоль поверхности и являются наиболее широко применяемым методом исследования органических пленок на поверхности жидкости.
Второе направление рентгеновских исследований на жидкости связано с измерениями в стандартной геометрии, когда вектор рассеяния направлен перпендикулярно к поверхности, что позволяет получать информацию о распределении профиля рассеивающей плотности вдоль нормали к поверхности. Это направление базируется на классических достижениях рентгеновской рефлектометрии и позволяет с атомной точностью локализовать отдельные химические компоненты молекулярной пленки по ее толщине.
Особое место в ряду рентгеновских методик занимает метод стоячих рентгеновских волн (СРВ). Исследования тонкопленочных биоорганических систем с помощью метода СРВ основаны на одновременной регистрации рентгеновского отражения и выхода вторичного излучения (например, характеристической флуоресценции), возникающего при неупругом рассеянии рентгеновских лучей в условиях полного внешнего отражения. Важным преимуществом метода СРВ по сравнению с классическими рентгеновскими методиками является возможность напрямую определять местоположение атомов данного сорта в слоистой системе из анализа угловых зависимостей выхода флуоресценции от этих атомов.
Первые работы по применению метода СРВ появились около 40 лет назад. Основное направление этих исследований было связано с изучением совершенных кристаллов полупроводников. Новый импульс в своем развитии метод СРВ получил около 20 лет назад с появлением высокоинтенсивных источников рентгеновского излучения - синхротронов, что дало возможность применить метод СРВ для исследования слабо рассеивающих тонких приповерхностных слоев, а также границ раздела между кристаллом и тонкой эпитаксиальной пленкой.
Одно из важнейших направлений в использовании метода СРВ связано с изучением структуры и композиционного состава сложноорганизованных тонкопленочных наноматериалов с упорядочением от супрамолекулярного до атомного уровня, таких как биоорганические слоистые наносистемы, органические молекулярные и полимерные пленки, нанесенные на твердые подложки, и т.д. Широкие возможности метода СРВ для исследования ЛБ пленок на твердой подложке были продемонстрированы в целом ряде работ.
Первые исследования границы раздела воздух/вода с помощью рентгеновской флуоресценции в области полного внешнего отражения были посвящены изучению профиля концентрации различных элементов в растворе у границы раздела воздух/вода и сегрегации ионов металла из раствора к границе.
Глава II посвящена развитию математических подходов для анализа экспериментальных данных по изучению тонкопленочных наноструктур с помощью метода стоячих рентгеновских волн.
Для математической обработки экспериментальных результатов был использован метод рекуррентных соотношений. В качестве исходной модели многослойной структуры рассмотрим плоскослоистую среду, которая состоит из М однородных, изотропных слоев с j = 1, 2... M и постоянными значениями толщин слоев lj и диэлектрической проницаемости = 1- 2 - i2. Нулевым j j j слоем является воздух (0 = 1), а M + 1 слой - подложка. Пусть на поверхность многослойной структуры под углом к поверхности падает плоская монохроматическая волна. Ось Z перпендикулярна к поверхности образца и направлена вглубь него. В плоскослоистой среде, свойства которой изменяются только вдоль оси Z, электрическое поле рентгеновской волны в j-ом слое имеет вид:
E (z, x,)= E (z )exp(ikx - it) (2.1) j j j j j где координата z отсчитывается от верхней границы j-слоя. Поле E (z ) есть j j j R сумма полей преломленной и отраженной волн с амплитудами E (0) и E (0), j j соответственно:
R E (z )= E (0)exp(ikz z )+ E (0)exp(ikz z ) (2.2) j j j j j j j j kz - Z-компонента волнового вектора в j-ом слое.
j Используя условия непрерывности тангенциальных компонент электрического и магнитного векторов на границе раздела двух соседних слоев j и j+1 можно получить систему рекуррентных уравнений для комплексных амплитуд преломленной и отраженной волн:
R E (0)= t E (0)+ rj+1, j E (0) (2.3) j+1 j, j+1 j j+R R E (0)= rj, j+1E (0)+ t E (0) (2.4) j j j+1, j j+где:
kz - kz kz - kz j j+1 j +1 j rj, j+1 = exp(- i2kz l ) rj+1, j = (2.5) j j kz + kz kz + kz j j +1 j j + 2kz 2kz j j +t = exp(- ikz l ) t = exp(- ikz l ) (2.6) j, j+1 j j+1, j j j j kz + kz kz + kz j j+1 j j +Решая систему уравнений (2.3 - 2.6), нетрудно получить рекуррентные соотношения для амплитудных коэффициентов отражения и прохождения j-го слоя:
t t Rj+j, j+1 j+1, j Rj = rj, j+1 + (2.7) 1- rj+1, j Rj+1- Rjrj, j+Tj = exp(- i2kz l ) (2.8) j j t j+1, j Алгоритм вычисления коэффициента отражения многослойной структуры состоит в следующем: начиная с RM +1 = 0 последовательно находят все Rj, j = 0, 1, 2... M. Величина R0 определяет интенсивность рентгеновского излучения, отраженного многослойной системой.
Для расчета зависимости коэффициента отражения от угла скольжения Z-компоненту волнового вектора в j-ом слое kz выражают через параметры j этого слоя (j, j) и угол скольжения . Используя закон Снеллиуса после несложных преобразований можно получить:
2 2 kz = n2 2 (2.9) -(kx ) ~ - 2 - i2 j j j j Формулы (2.7), (2.8) и (2.9) определяют схему расчета угловой зависимости коэффициента отражения многослойной системы для проведения численного моделирования и анализа экспериментальных данных. Следует подчеркнуть, что справедливость этих выражений не связана с какими бы то ни было приближениями, другими словами, описанный выше метод позволяет решить задачу рассеяния рентгеновского излучения на многослойных системах в самом общем случае: независимо от рассеивающей способности системы, для любых углов скольжения падающего излучения, в том числе и в области полного внешнего отражения.
Расчет интенсивности выхода вторичных излучений. Исследование многослойных структур методом СРВ основано на регистрации вторичных излучений, возникающих в таких системах при поглощении рентгеновских квантов в условиях полного внешнего отражения и брэговской дифракции. В дипольном приближении фотоэлектрическое поглощение пропорционально локальной интенсивности электрического поля.
В соответствии с этим число квантов вторичного излучения, рожденных на глубине zj в слое толщиной dz с единичной площадью и в единицу времени, j определяется выражением:
d(z,) j = J (z,) (2.10) j j dz j 2 -J = E0 Tk C1{1+ Rj C2 + 2 Rj C1 cos } j j где введены обозначения:
4 4 8 = + Bj z ; C1 = exp- Aj z ; C2 = exp Aj z j j j j j j - фаза амплитудного коэффициента отражения для j-того слоя; Aj, Bj - мнимая и действительная части величины - 2 - i2. Ослабление j j вторичного излучения учитывается с помощью функции влияния P(z), характеризующей вероятность попадания в детектор кванта вторичного излучения, рожденного на глубине zj. Конкретный вид функции влияния зависит от типа регистрируемого вторичного излучения. В случае характеристического флуоресцентного излучения P(z) имеет вид:
z P(z)~ exp- (2.11) L где L - глубина выхода флуоресценции. Интегрируя (2.11) в пределах от 0 до lj с учетом функции влияния, получим выражение, определяющее вклад j-того слоя в общий выход вторичного излучения.
Интенсивность волнового поля в мономолекулярных пленках в условиях ПВО. При исследовании мономолекулярных пленок необходимо учитывать, что, хотя толщина таких пленок мала, а электронная плотность низкая, в области малых углов (при углах меньше критического угла ПВО для подложки c) изменения волнового поля, вызванные присутствием пленки, могут быть существенными. Поэтому даже в простейшем случае, когда мономолекулярную пленку можно представить как один однородный и изотропный слой, форма угловой зависимости выхода флуоресценции от атомов, расположенных в пленке, будет определяться тремя неизвестными параметрами: толщина и электронная плотность пленки (параметры, описывающие изменения интенсивности поля) и расстояние от атомов до границы раздела пленка/подложка. Особый случай представляют пленки, толщина и электронная плотность которых удовлетворяют условию:
2 2 (2.12) 4k0 d <1, k0 = f f где df толщина пленки с показателем преломления nf=1-f-if. Как будет показано ниже, интенсивность поля в таких пленках зависит только от одного параметра - от числа электронов на единицу площади пленки.
Используя выражения (2.7-2.11), можно численно рассчитать интенсивность волнового поля в любой точке произвольной слоистой структуры. В частном случае однородного слоя на полубесконечной подложке выражение для интенсивности волнового поля можно получить в аналитическом виде.
С учетом приближения (2.12) в области малых углов 2 I =, p = k0d . (2.13) f f f f + 2 p 2 - s f s Для простоты изложения приведено выражение при z=df. Сравним формулу (2.13) с выражением для интенсивности волнового поля на поверхности чистой подложки, которое можно получить из условий непрерывности на границе вакуум/подложка: 2 I =. (2.14) s s Теперь легко заметить, что изменение интенсивности волнового поля, вызванное присутствием пленки, определяется вторым слагаемым в знаменателе выражения (2.13), причем зависимость этого слагаемого от толщины и электронной плотности пленки описывается через параметр pf. Если учесть, что толщина и электронная плотность пленки входят в выражение для pf в виде произведения, становится очевидным, что изменение волнового поля целиком определяется поверхностной электронной плотностью пленки. В области больших углов >c для интенсивности поля на границе получим: 4 2 (2.15) I =, = 4k0 d . f f f ( + - 2 ) + ( - ) s f s Согласно условию (2.12) параметр мал по величине, так что с хорошей точностью слагаемое (f -s) в знаменателе выражения (2.15) можно опустить. Это означает, что при больших углах присутствие монослоя на поверхности полубесконечной подложки не приводит к каким либо заметным изменениям волнового поля. Полученные аналитические результаты представляются особенно важными для исследования молекулярных пленок на поверхности жидкости. Действительно, если химический состав молекул известен, т.е. число электронов в одной молекуле задано, то величина поверхностной электронной плотности пленки будет целиком определяться значением площади, занимаемой одной молекулой в пленке Sмол. Особенность исследования ленгмюровских пленок на поверхности жидкости состоит в том, что величину Sмол можно оценить из изотермы сжатия независимо от рентгеновских измерений, что позволяет свести к минимуму число неизвестных параметров при подгонке экспериментальных кривых выхода флуоресценции. Следовательно, анализ экспериментальных данных по измерению выхода флуоресценции от ленгмюровских пленок на поверхности жидкости дает принципиальную возможность однозначно определять местоположение атомов в пленке. Глава III посвящена развитию метода СРВ для исследования упорядоченных наноструктур на жидкости. С точки зрения экспериментальной техники рентгеновские измерения на жидкости представляют собой достаточно сложную задачу. В отличие от измерений на твердых образцах, когда направление падающего пучка сохраняется неизменным, а для изменения угла между падающим пучком и поверхностью образца наклоняют образец, в измерениях на жидкости положение образца (ленгмюровской ванны) должно оставаться горизонтальным. Поэтому для изменения угла приходится отклонять падающий пучок от горизонтальной плоскости. Однако, в такой схеме проведения эксперимента возникает проблема с положением области засветки рентгеновским пучком: при изменении угла падения меняется положение области засветки на поверхности жидкости, при этом область засветки очень быстро смещается за пределы ванны. Поэтому в рентгеновских измерениях на жидкости приходится изменять положение ванны по высоте: зная геометрические параметры станции можно рассчитать, на сколько следует поднять или опустить ванну, чтобы при изменении угла положение области засветки на поверхности жидкой субфазы оставалось неизменным. Однако специфика измерений методом стоячих рентгеновских волн состоит в том, что в этих экспериментах регистрируют очень слабые флуоресцентные сигналы, которые приходится подолгу копить. При этом уровень жидкости в ленгмюровской ванне неконтролируемым образом изменяется из-за испарения с поверхности водной субфазы. Поэтому при длительных измерениях коррекцию положения ленгмюровской ванны по высоте следует вести в режиме непрерывного мониторинга. В настоящих исследованиях была применена специальная методика измерения угловой зависимости интенсивности выхода флуоресценции, позволяющая избежать искажений интенсивности флуоресцентного сигнала, возникающих в процессе проведения исследований методом стоячих рентгеновских волн из-за изменения положения центра области засветки рентгеновским пучком на поверхности жидкой субфазы. Все рентгеновские измерения органических и биоорганических наноструктур на жидкости, представленные в настоящей работе, были выполнены на экспериментальной станции ID10B в Европейском Центре Синхротронного Излучения (Гренобль, Франция). В качестве первого шага модельными объектами исследования были выбраны поверхностно-активные органические соединения, образующие стабильные упорядоченные лэнгмюровские слои на поверхности жидкости: металлозамещенные фталоцианины (Рс), полиорганосилоксаны и фосфолипиды. Фталоцианины. Раствор смеси Cu(Pc)/Fe(Pc) в хлороформе с концентрацией 0,45 мг/мл наносили на поверхность водной субфазы. Измерения выхода флуоресцентного излучения проводили при постоянном поверхностном давлении монослоя 22 мН/м. Фталоцианин олова Sn(Pc) растворяли в смеси метанола и хлороформа, концентрация 0,6 мг/мл. Измерения выхода флуоресценции проводили при 22 мН/м. Циклолинейные полиорганосилоксаны. Полимер наносился из 0,45 мг/мл раствора хлороформа. Эксперимент проводили при давлении 8,4 мН/м. Фосфолипид. 1,2 дипальмитоил-sn-глицерофосфат-3-фосфатидилхолин (DPPC) растворяли в смеси метанола и хлороформа, концетрация 0,45 мг/мл. Измерения выхода флуоресценции проводили при 22 мН/м. Угловые зависимости выхода флуоресценции от монослоев фталоцианинов Cu(Pc)/Fe(Pc) и Sn(Pc), а также от монослоя полиорганосилоксана и монослоя фосфолипидов приведены на рис. 1. Математическая обработка результатов эксперимента по исследованию монослоев фталоцианинов и фосфолипида проводилась в рамках двухслойной модели. Величина площади на молекулу определялась по изотерме сжатия: Sмол=902 для Sn(Pc), Sмол=702 для смеси Cu(Pc)/Fe(Pc), Sмол=452 для DPPC. 1,(1) (2) 1, 1,2,1,2,1,1, 1,1,1,1,0,0,0,0,0,0 0,0,0 0,0,5 1,0 1,5 2, 0,5 1,0 1,5 2,, мрад , мрад а) б) Рис.1. Угловые зависимости выхода флуоресценции от монослоев на поверхности выхода: а) кривая 1 - угловые зависимости Cu К и Fe К от Cu(Pc)/Fe(Pc) монослоя; кривая 2 - угловая зависимость Sn К флуоресценции от Sn(Pc) монослоя; кривая 3 - угловая зависимость Si К от монослоя полиорганосилоксана. б) угловая зависимость выхода флуоресценции Р К от монослоя DPPC. Нижние кривые - рентгеновское отражение. Сплошные линии - расчет. Энергия первичного пучка 12,5 кэВ. Вставка - модели молекул фталоцианина (1) и фосфолипида (2). Согласно приведенному в главе II рассмотрению, подгонка угловых зависимостей выхода флуоресценции осуществляется по одному варьируемому параметру D - расстояние между ионами, излучающими флуоресценцию, и поверхностью воды. Наилучшее совпадение теоретических и экспериментальных кривых было получено для следующих значений параметра D: 7 для Sn(Pc) и 7 для смеси Cu(Pc)/Fe(Pc). выход флуоресценции, отн.ед. выход флуоресценции, отн.ед. интенсивность отражения интенсивность отражения Величина диаметра макроцикла молекулы фталоцианина, полученная по результатам компьютерного моделирования составляет 13 . Ион металла расположен в центре макроцикла, поэтому определенное из экспериментальных исследований расстояние между ионами металлов и поверхностью воды (D=), позволяет предположить, что макроциклы молекул фталоцианина расположены перпендикулярно к поверхности воды. На рис. 1б представлены угловые зависимости выхода флуоресценции от фосфора, расчетная кривая соответствует тому, что ионы фосфора находятся на расстоянии D~4 от границы раздела воздух/вода. Угловые зависимости выхода флуоресценции от кремния для монослоя полиорганосилоксана представлены на рис. 1а (кривая 3). Наилучшее согласие теории и эксперимента в рамках однослойной модели получено для D~4 , что соответствует полимерным кольцам, лежащим плашмя на поверхности воды. В главе IV представлены результаты исследований повреждения молекулярной организации органических и биоорганических наносистем в результате инкорпорирования ионов металлов из водной субфазы. Экспериментальные измерения были проведены на источнике синхротронного излучения BESSY (Германия), станция KMC-2. Пленки на основе фосфолипидов. Для исследований на твердой подложке был выбран 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо-О-этаноламин (DPPE). Образец №1. Раствор фосфолипида концентрации 0,3 мг/мл в смешанном растворителе хлороформ/метанол наносили на субфазу (тридистиллированная вода). Монослой поджимали до поверхностного давления 40 мН/м и переносили на гидрофобную кремниевую подложку методом вертикального лифта (Ленгмюра-Блоджетт). Образец №2. Для приготовления образца монослой фосфолипида формировали на субфазе, содержащей ионы свинца: раствор ацетата свинца 1х10-4 М. Остальные условия нанесения были такие же, как и в первом случае. На рис. 2 приведены характеристические спектры флуоресцентного излучения от образца №2, записанные при углах падения меньше критического угла ПВО для кремния. На спектрах хорошо видны интенсивные пики от ионов свинца, которые были связаны молекулами фосфолипида из водной субфазы. Кроме того, на спектре хорошо различим пик от ионов фосфора, которые входят в состав головок фосфолипидных молекул. 1, 1 Si K Pb M 0,Ar K P K 0,0,0,0,1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,Е(кэВ) Рис. 2. Характеристические спектры флуоресцентного излучения от фосфолипидного бислоя. Угловая зависимость выхода Pb L флуоресценции представлена на рис. 3. Кривая выхода от ионов фосфора не показана из-за плохой статистики. 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3, 3,3,2,2,1,1,0,0,8 0,0,0,0,0,0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3, (мрад) Рис. 3. Экспериментальная угловая зависимость выхода флуоресценции от ионов свинца, присутствующих в фосфолипидном бислое. выход флуоресценции (cps) выход Pb L флуоресценции (отн. ед.) интенсивность отражения Как видно, кривая выхода Pb L флуоресценции повторяет форму угловой зависимости отражения рентгеновских лучей и описывается соотношением 1+R, где R интенсивность отраженного рентгеновского пучка. Такая форма угловой зависимости характерна для ситуации, когда атомы-источники флуоресцентного излучения образуют островковую структуру в пленке. Одной из возможной причин такого рода угловой зависимости выхода вторичного излучения может быть то, что ионы свинца в бислое DPPE образуют отдельные частицы, которые могут формироваться под фосфолипидным монослоем на поверхности водной субфазы благодаря гидротации ионов свинца в воде и формированию гидроксо-мостиковых структур. Следует отметить, что угловая зависимость выхода флуоресценции от ионов фосфора имеет совершенно другой характер, это хорошо видно из сравнения интенсивности пиков P K и Pb M на спектрах, представленных на рис. 2. Хорошо видно, что с увеличением угла интенсивность выхода флуоресценции от фосфора заметно растет от нулевого значения при 1 ~ мрад до некоторого максимального значения при 3 ~ 2 мрад, тогда как интенсивность пика от свинца на этих спектрах практически не меняется. При больших углах падения по мере увеличения глубины проникновения рентгеновского излучения в кремниевую подложку резко возрастает интенсивность пика Si K так что пик от ионов фосфора становится неразличим. Пленки на основе жидкокристаллических соединений. Были исследованы ЛБ пленки на основе жидкокристаллического (ЖК) комплекса европия с основанием Шиффа: трис [1-(4-додецилоксифенил)-3-(4тетрадецилоксифенил) пропан-1,3-дионо) монофенантролин] европий. Образец №1. Ленгмюровский монослой поджали до поверхностного давления 25 мН/м. Так как монослой был не стабилен, выжидали 1 час. Затем сделали 7 погружений подложки методом горизонтального лифта. Образец №2. Ленгмюровский монослой поджали до поверхностного давления 25 мН/м. Сразу же после формирования монослоя сделано погружений подложки методом горизонтального лифта. Образец №3. Ленгмюровский монослой поджали до поверхностного давления 25 мН/м. Сразу же после формирования монослоя сделано погружений подложки методом горизонтального лифта. Для исследования термостабильности ЛБ пленок на основе комплекса Eu(III) образцы были подвергнуты отжигу при t=85С (температура фазового перехода ЖК составляет 90С). На характеристических спектрах флуоресцентного излучения от всех образцов помимо европия (который входит в состав молекулы ЖК) были обнаружены пики от целого набора ионов металлов: Fe, Zn, Cu, Ca (рис. 4). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 образец №Si 1,0 Ar Zn K Fe K 0,Eu L12 Fe K Ca Zn K 0,образец №Si Fe K Eu LAr Ca образец №Fe K Si Eu L12 Eu LZn K Fe K Ar Ca Zn K 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Е (кэВ) Рис. 4. Спектры характеристического флуоресцентного излучения от образцов пленок на основе ЖК комплекса европия. Угловые зависимости интегральной интенсивности пиков от этих ионов как функция угла скольжения представлены на рис. 5. Cu K Ni K Cu K интенсивность (имп.) Ni K Cu K 0 1 2 3 4 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3, Eu а) б) Fe Cu Ca Eu Zn Cu Fe 1, 1,0,0, 0,0,0 1 2 3 4 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3, (мрад) (мрад) 012Eu 5, Eu в) г) Cu 2,0,5,0 Eu Fe Zn 2,Fe 3,0,1,5, Eu Ca 0,2,Zn 3,0,1,0,0,0,012012 (мрад) (мрад) Рис. 5. Угловые зависимости выхода флуоресценции и интенсивности рентгеновского отражения (нижняя кривая) от образца №1 (а), №2 (б) и №3 (в). Сравнение угловых зависимостей выхода флуоресценции от образца №3 до и после отжига (г). интенсивность (пр.ед) интенсивность (пр.ед) отражение отражение интенсивность (пр.ед) интенсивность (пр.ед.) отражение При подгонке угловых зависимостей выхода флуоресценции от Eu и Cu для образца № 1 наилучшее согласие теории и эксперимента было получено для общего числа монослоев равного 11, что не соответствует числу погружений, которое для этого образца составляло 7. Такое расхождение может быть связано с тем, что в процессе приготовления этого образца ленгмюровский слой инкубировали в течение 1 часа на водной субфазе, при этом заметно сокращалась площадь слоя. Вероятно, пленка комплекса Eu(III) на поверхности жидкости представляла собой не мономолекулярный слой, а систему доменов с различным количеством монослоев, так что средняя толщина перенесенной на подложку пленки оказалась больше, чем число погружений. Угловая зависимость выхода флуоресценции от ионов Ca (рис. 5а) повторяет форму кривой рентгеновского отражения, и описываются выражением 1+R. Сравнение данных для ионов Fe и Zn, полученных на разных образцах, показывает, что форма кривых выхода флуоресценции от этих ионов зависит от способа нанесения пленки. Так для образца №1 (ленгмюровский слой выдерживали в течения 1 часа перед перенесением на твердую подложку) форма кривых выхода от Fe и Zn повторяет кривую отражения. Тогда как на образцах № 2 и 3 (ленгмюровский слой переносили на твердую подложку сразу же после формирования) эти кривые имеют некоторый промежуточный вид. Результаты по исследованию термостабильности ЛБ пленок на основе комплекса Eu(III) приведены на рис. 5г. Как видно из рисунка, при отжиге образца № 3 заметно изменились все кривые: угловые зависимости выхода флуоресценции от Fe и Zn до отжига имели промежуточную форму, после отжига эти кривые стали более походить на кривую отражения. Изменения кривой выхода от Eu носили такой же характер. При обсуждении полученных результатов следует, прежде всего, принять во внимание, что в состав молекул исследуемого ЖК соединения входят в качестве лигандов -дикетонат и фенантролин, которые являются сильными хелатирующими агентами для большинства металлов. В процессе формирования ленгмюровского слоя на водной субфазе молекулы фенантролина могли выйти из координационной сферы европия и сформировать более устойчивые комплексы с ионами железа и цинка из субфазы. Комплексы железа и цинка с фенантролином могли агрегировать и образовывать отдельную от -дикетоната фазу. В результате этих изменений в ленгмюровском слое возникают отдельные островки соединений железа и цинка в структурно упорядоченном слое комплекса Eu(III). Принимая во внимание приведенные выше рассуждения, форму кривых выхода флуоресценции от железа и цинка, полученных для образца №1, можно объяснить следующим образом: в процессе инкубирования слоя комплекса Eu(III) на водной субфазе (в течение часа), произошло фазовое разделение слоя. Так что большая часть ионов железа и цинка в слое присутствует в виде отдельных островков. При приготовлении образца №2 пленку переносили на твердую подложку сразу после формирования слоя на водной субфазе. В этом случае, фазовое разделение слоя еще не завершилось, поэтому распределение ионов железа и цинка в пленке носит промежуточный характер. Что касается кривых выхода флуоресценции от ионов меди (которые по форме совпадают с кривыми выхода от ионов европия), то по литературным данным константа устойчивости комплекса меди с Шиффовыми основаниями значительно выше, чем для других металлов. Это позволяет предположить возможность частичного замещения в исследуемом комплексе Eu(III) атомов европия на атомы меди. В главе V представлены результаты исследований молекулярных механизмов действия лекарственных препаратов с применением метода стоячих рентгеновских волн, развиты новые подходы для исследования эффективности и безопасности действия лекарственных соединений с использованием белково-липидных наноструктур в качестве изолированных моделей клеточных мембран. Общая схема нанесения белковых пленок. Монослой фосфолипида формировали на поверхности водной субфазы и переносили на гидрофобные кремниевые подложки методом Ленгмюра-Блоджетт. Подложку с монослоем фосфолипида помещали в кювету, находящуюся на дне ленгмюровской ванны. Затем кювету с подложкой вынимали из ванны. Адсорбционную иммобилизацию белковых молекул на ЛБ слое фосфолипида проводили из рабочего раствора в течение суток при комнатной температуре. После адсорбции белка образец, не вынимая из кюветы, промывали дистиллированной водой. Затем кювету помещали на дно ленгмюровской ванны, заполненной дистиллированной водой. На поверхности субфазы вновь формировали монослой фосфолипида. После чего подложку с иммобилизованным белковым слоем вынимали через вновь сформированный монослой. Таким образом, пленка состояла из 3 слоев: I слой - монослой фосфолипида, II слой - белковые молекулы, III слой - монослой фосфолипида (рис. 6). монослой липидов белковые молекулы монослой липидов Si подложка Рис. 6. Схема белково-липидной пленки. Белковые пленки на основе Са АТФазы. Иммобилизацию белка проводили на монослой фосфолипида DPPE. Образец №1. При солюбилизации Са-АТФазы в раствор добавили ацетат свинца, концентрация свинца в растворе составляла 3х10-4 М. Смесь инкубировали в течение 1 часа. Иммобилизацию белка проводили по общей схеме, описанной выше. Образец №2. При солюбилизации Са-АТФазы в раствор добавили ацетат свинца, концентрация свинца в растворе составляла 3х10-4 М. Смесь инкубировали в течение 1 часа. Иммобилизацию белка проводили так же, как и в случае контрольного образца. Однако после инкубирования в течение суток в рабочем белковом растворе образец, не вынимая из кюветы, промыли сначала дистиллированной водой, а затем выдерживали три часа в растворе лекарственного препарата ксидифон (концентрация 0,07 М). Снова промыли водой и поместили кювету с образцом на дно ленгмюровской ванны, заполненной дистиллированной водой. На поверхности субфазы вновь формировали монослой DPPE. После чего подложку с иммобилизованным белковым слоем вынимали через вновь сформированный монослой DPPE Интегральная интенсивность Pb L флуоресценции как функция угла падения для этих образцов показана на рис. 7. 4,3,3,2,2,1,1,0,0,1,0,0,0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,(мрад) Рис.7. Угловые зависимости выхода Pb L флуоресценции от белковолипидных пленок. Кривая 1 - экспериментальные данные для образца №1, сплошная линия - расчет для толщины слоя свинца 1 нм, пунктирная линия - расчет для толщины слоя свинца 3 нм. Кривая 2 - экспериментальные данные для образца №2, сплошная линия - расчет для толщины слоя свинца 13 нм, пунктирная линия - расчет для толщины слоя свинца 15 нм Нижние кривые - экспериментальная и расчетная угловые зависимости рентгеновского отражения. Энергия падающего пучка 13,5 кэВ. выход флуоресценции, отн.ед. интенсивность отражения Количественные оценки толщин распределения ионов свинца были получены из подгонки экспериментальных угловых зависимостей выхода флуоресценции к расчетным кривым. Наилучшее совпадение теоретических кривых с экспериментальными данными было получено для следующих значений толщин распределения ионов свинца: 13 нм для образца №1 и 1 нм для образца №2. Согласно полученным данным, в образце №1 ионы свинца распределены по всей толщине белкового слоя, тогда как после инкубации пленки в растворе ксидифона, ионы свинца сохранились в тонком слое у нижней границы пленки. Белковые пленки на основе щелочной фосфатазы (ЩФ). При растворении ЩФ в раствор добавили раствор ацетата свинца, концентрация свинца в растворе составляла 3х10-4 М/л. Смесь инкубировали в течение 5 часов. Иммобилизацию белка на смешанный монослой DPPС и холестерина проводили по общей схеме, описанной выше. Однако после инкубирования в течение 10 часов в рабочем белковом растворе, образец, не вынимая из кюветы, промыли сначала дистиллированной водой, а затем выдерживали 2 часа в растворе комплексообразующего соединения. После чего подложку с иммобилизованным белковым слоем вынимали через вновь сформированный монослой DPPС и холестерина. Образец №3. В кювету с подложкой добавили 2% раствор ксидифона. Образец №4. В кювету с подложкой добавили 0,04 % раствор ЭДТА. Образец №5. В кювету с подложкой добавили 0,02 % раствор сукцимера. На спектрах от всех образцов интенсивность пика Pb L оказалась очень низкой, для сравнения на рис. 8 представлен также спектр от пленки, обработанной свинцом, но не промытой раствором комплексона. Хорошо видно, что в результате применения каждого из трех исследованных комплексообразующих препаратов наблюдается значительное уменьшение количества ионов свинца в белково-липидных пленках. Тем не менее, согласно полученным данным, после обработки комплексообразующим соединением в каждой из пленок сохранилось некоторое количество ионов свинца. 91Pb L 8образец №образец №76154Pb M 3Ar K 2Pb Ll Pb L 1Fe K Cu K 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Е(кэВ) Е (кэВ) 1 1образец №образец №Si K Ar K 11Pb L Cu K Pb L Cu K Zn K Fe K 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Е(кэВ) Е (кэВ) Рис. 8. Спектры характеристического флуоресцентного излучения от образцов пленок на основе щелочной фосфатазы. Таким образом, представленные в настоящей главе исследования белково-липидных пленок позволили напрямую определить положение ионов свинца в пленках до и после применения комплексообразующих лекарственных препаратов. Продемонстрированы возможности метода стоячих рентгеновских волн для изучения белково-липидных мембранных моделей на твердых подложках. Установлено, что в случае изолированной белково-липидной пленки применение исследованных комплексообразующих лекарственных препаратов (ЭДТА, сукцимера и ксидифона) дает возможность максимально, но не полностью удалить из молекул ферментов (Са АТФаза и щелочная фосфатаза) ионы свинца, связанных в процессе преинкубации белка в растворе уксуснокислого свинца. Показана высокая эффективность отечественнго бифосфонового комплексообразующего соединения - ксидифона, не интенсивность (имп.) интенсивность (имп.) интенсивность (имп.) интенсивность (имп.) уступающая по элиминирующим свойствам патентованным комплексонам (ЭДТА и сукцимер). Глава VI. Исследования, представленные в главе VI, посвящены изучению процессов формирования белково-липидных пленок на поверхности жидкой субфазы. Пленки на основе щелочной фосфатазы. Раствор фосфолипида (DPPC) в хлороформе наносили на субфазу (TRIS рН=8,3). Монослой DPPC поджимали до поверхностного давления 12 мН/м, затем слой разжимали и вводили под монослой 200 мкл белково-липидной смеси (ЩФ и фосфатидилинозитол). Слой выдерживали 30 мин. и опять поджимали до 12 мН/м. Снова разжимали, добавляли 300 мкл белково-липидной смеси. Еще раз выдерживали слой в течение 30 мин. и поджимали до 30 мН/м. Угловые зависимости интегральной интенсивности выхода флуоресценции от белково-липидной пленки на основе щелочной фосфатазы представлены на рис. 9. Ni а) 4 Молекулы липида DPPC 2 P+ Ni ионы Слой A (30A) 0 P+ Ni ионы Слой B (200A) Мицелы б) Zn Zn+ Ni ионы Слой C (250A) Zn Zn Молекулы белка P+ Ni ионы Слой D (800A) в) P Молекулы липидов Водная субфаза 1,0 1 0,0,0,5 1,0 1,5 2, (мрад) Рис. 9. Угловые зависимости выхода флуоресценции от белково-липидной пленки на основе смеси щелочной фосфатазы и фосфолипида фосфатидилинозитол. Точки - экспериментальные данные, сплошные линии - интенсивность (пр.ед) отражение расчет. Нижняя кривая - экспериментальная угловая зависимость рентгеновского отражения. Модель белково-липидной пленки на основе смеси щелочной фосфатазы и фосфолипида фосфатидилинозитол. Наилучшее совпадение теоретических кривых с экспериментальными данными было получено в рамках модели, состоящей из 4 слоев (рис. 9). На основе полученных результатов можно предположить, что после нанесения смеси диспергированного в водной среде фосфолипида фосфатидилинозитол и водного раствора белка ЩФ под ленгмюровский слой фосфолипида DPPC произошло самопроизвольное расслоение этой термодинамически неустойчивой дисперсионной системы. При этом молекулы фосфатидилинозитола могли образовать агрегатные структуры типа мицелл или визикул (слой B на рис. 9) под слоем DPPC, а молекулы ЩФ самоорганизовались в отдельный слой (слой С), не содержащий фосфолипидных молекул. Часть молекул фосфолипида присутствует под слоем белка (слой D). Следует отметить, что модуляции на кривых выхода флуоресценции связаны с явлением резонансного усиления волнового поля, возникающего в слоистых системах при рассеянии рентгеновского излучения в условиях ПВО. Резонансное усиление возникает в пленке, если электронная плотность пленки меньше чем электронная плотность подложки f слой A (P+Ni) Z (A) слой B (P+Ni) 2400 слой C (Zn+Ni) 6слой D (P+Ni ) 81012водная субфаза 0 2 4 6 8 10 12 интенсивность волнового поля Рис. 10. Расчетные зависимости интенсивности волнового поля от глубины в белково-липидной пленке, рассчитанные при фиксированных углах падения: (кривая 1), 2 (кривая 2) и 3 (кривая 3), отмеченных на рис. 9. Пленки на основе глюкозооксидазы (ГО). Для формирования смешанных белково-липидных пленок был использован метод адсорбции белка на ленгмюровский монослой поверхностно активного вещества: водный раствор ГО (концентрации 8 мг/л) наливали в Ленгмюровскую ванну, а затем на поверхности этой субфазы наносили монослой бегеновой кислоты. Слой поджимали до поверхностного давления 20 мН/м. Пленки на основе ГО, обработанной растворами солей свинца и хрома. В рабочий раствор ГО добавляли растворы ацетата свинца (II) (измерение №1) и хлорида хрома (III) (измерение №2). Концентрация Pb (II) в рабочем растворе белка составляла 3х10-5 М, а концентрация Cr (III) - 3,86х10-6. Формирование смешанной белково-липидной пленки проводили по общей схеме, описанной выше. С точки зрения измерений методом СРВ, ионы металлов, связанные белковыми молекулами, являлись своего рода метками, что дало возможность, определить местоположение белковых молекул в белково-липидной пленке из анализа угловых зависимостей выхода флуоресценции от ионов металлов. Кривые выхода флуоресценции от свинца и хрома, показаны на рис. 11: обе кривые имеют классическую форму, которая наблюдается, в том случае, когда атомы-источники флуоресцентного излучения расположены в тонком слое вблизи отражающей поверхности. 4,0 Pb ионы Молекулы белка Слой A 3,Водная субфаза 3,2,Молекулы бегеновой Pb 2,0 кислоты Слой A 1,Cr ионы Молекулы белка Слой B 1,Cr 0,Водная субфаза 0,0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1, (мрад) Рис. 11. Угловые зависимости выхода флуоресценции от белково-липидных пленок на основе глюкозооксидазы, обработанной растворами солей свинца и хрома (модель белковой молекулы показана на вставке). Точки - экспериментальные данные, сплошные линии - расчет. Математическая обработка экспериментальных угловых зависимостей выхода флуоресценции позволила определить толщину d и плотность слоев, в которых распределены ионы металлов для каждой из исследованных белковолипидных пленок. Согласно полученным данным в пленке, сформированной на основе ГО, обработаной раствором свинца, ионы свинца присутствуют в слое, расположенном у границы раздела пленка/воздух, толщина и плотность этого интенсивность (пр.ед.) слоя составили d=120 А, =0,7*ГО (где ГО - плотность монослоя ГО при плотной упаковке молекул белка). Для пленки на основе ГО, обработанной раствором хрома, наилучшее совпадение теоретических кривых с экспериментальными данными было получено в рамках двухслойной модели. Параметры первого (верхнего) слоя имеют значения: d=27 А, =1,33*БК (где БК - плотность монослоя бегеновой кислоты при плотной упаковке молекул жирной кислоты), параметры второго (нижнего) слоя: d=100 А и =ГО, причем в этой пленке ионы хрома присутствуют только в нижнем слое. Пленки на основе ГО, подвергнутой обработке мочевиной. Обработку ГО мочевиной проводили по следующей схеме: в раствор белка добавляли мочевину, концентрация мочевины в рабочем растворе составляла 90 мМ, смесь инкубировали при комнатной температуре в течение различного периода времени 12 (измерение №3) и 24 часов (измерение №4). Рентгенофлуоресцентные измерения позволили выявить существенные изменения композиционного состава биоорганических пленок в результате обработки белка раствором мочевины. По сравнению с чистой ГО на спектрах появились интенсивные пики от Ca, Zn и Pb. Следует подчеркнуть, что для приготовления всех рабочих белковых растворов, а также буферных растворов субфазы была использована вода высокой степени очистки (сопротивление >Mом/см), полученная на установке Millipore Corp. 2 4 6 8 10 12 2 4 6 8 10 12 Ar K Ar K Zn K 0,Ca K Pb L Pb L Ni K Zn K 0, 0,1E-2 4 6 8 10 12 14 2 4 6 8 10 12 Е (кэВ) Е, кэВ Рис. 13. Характеристические спектры флуоресцентного излучения от белковой пленки на основе фермента ГО: а) чистая ГО; б) ГО обработанная мочевиной: кривая 1 - длительность обработки 12 ч, кривая 2 Ц24 ч. интенсивность (имп) интенсивность (имп/сек) Обнаруженное в представленных исследованиях накопление ионов металлов в пленке ГО, обработанной мочевиной, возможно, связано с тем, что в результате действия мочевины произошло изменение пространственного расположения отдельных пептидных фрагментов на поверхности белковой макромолекулы. Это могло привести к увеличению доступности аминокислотных остатков с функциональными группами, которые обладают высокой способностью координировать ионы металлов. Угловые зависимости выхода флуоресценции от наиболее интенсивных пиков примесей (Zn K для измерения №3) для пленок на основе ГО, обработанной раствором мочевины, представлены на рис.14. 4, расчет 3, Cr Zn 3,2,2,1,1,0,0,0,2 0,4 0,6 0,8 1, (мрад) Рис. 14. Угловые зависимости выхода флуоресценции от белково-липидных пленок на основе фермента ГО, обработанной растворами мочевины в течение 12 часов. Для сравнения приведена угловая зависимость выхода флуоресценции от белково-липидных пленок на основе ГО, обработанной раствором хрома. Точки - экспериментальные данные, сплошные линии - расчет. Форма кривой выхода флуоресценции от пленки на основе ГО, подвергнутой обработке мочевиной в течение 12 часов, совпадает с кривой, полученной на пленке ГО, обработанной хромом. В том случае, когда обработку ГО раствором мочевины проводили в течение 24 часов (измерение №4), ход экспериментальной кривой выхода флуоресценции от белкового слоя имел интенсивность (пр.ед.) более сложный характер. На первом этапе измерений форма этой кривой совпадает с кривой выхода от хрома, полученной в измерении №2. Затем ход угловой зависимости меняется и эта кривая совпадает с кривой выхода от свинца, полученной в измерении №1. Проведенные в настоящих исследованиях рентгенофлуоресцентные измерения смешанных белково-липидных пленок на основе фермента глюкозооксидаза показали, что в результате обработки белка раствором мочевины происходит самопроизвольное присоединение ионов металлов из воды высокой степени очистки. Обнаруженные в представленных исследованиях факты повышения связывающей способности белковых молекул в присутствии токсических доз мочевины раскрывают один из возможных механизмов эндогенно обусловленного микроэлементоза при заболеваниях почек. Анализ угловых зависимостей выхода флуоресценции от ионов металлов, связанных молекулами ГО, позволил определить характер изменений молекулярной организации в белково-липидных пленках при токсическом воздействии тяжелых металлов (свинец, хром) и мочевины. Согласно полученным результатам после обработки свинцом молекулы ГО встраиваются в монослой бегеновой кислоты, образуя рыхлый слой непосредственно на границе раздела воздух/пленка (плотность слоя <ГО, а толщина слоя больше, чем толщина белкового монослоя). Для пленки с хромом слой белка расположен, под монослоем бегеновой кислоты, причем плотность слоя оказалась больше, а толщина меньше, чем в пленке со свинцом. Эти различия в молекулярной организации белково-липидных пленок могут быть связаны с конформационными перестройками белковой глобулы, вызванными обработкой растворами повреждающих агентов. Так, под действием свинца могло произойти частичное разрушение нативной конформации белковой глобулы, при этом число гидрофобных участков на поверхности молекулы увеличилось, и молекулы ГО начали встраиваться в гидрофобную область липидного слоя, образуя слой непосредственно у границы раздела пленка/воздух. При обработке ГО раствором хрома концентрация хрома в растворе была меньше, и изменения конформации белковых молекул, по-видимому, оказались не столь существенными. Так что в этом случае заметного изменения способности ГО сорбировать на монослой липидов не произошло, и белковые молекулы концентрировались под монослоем бегеновой кислоты, не встраиваясь в сам монослой. Обработка ГО мочевиной также привела к разрыву водородных связей на поверхности белковой глобулы. Так как концентрация мочевины была невысокой, нарушения конформации оказались не столь глубокими, и белок адсорбировался у нижней границы монослоя бегеновой кислоты. Однако, при увеличении длительности обработки мочевиной, процесс деструкции пошел более интенсивно, и в измерениях №4 было обнаружено, что белок сначала адсорбировался под монослоем, а затем начал всплывать к поверхности. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 1) Разработаны численные и аналитические подходы для математической обработки и интерпретации результатов эксперимента по изучению структуры и композиционного состава органических и биоорганических наносистем с помощью метода СРВ в области полного внешнего отражения. Получено аналитическое выражение для интенсивности выхода флуоресценции от мономолекулярного слоя в приближении линейного затухания эвансцентной волны. Показано, что анализ экспериментальных данных по измерению выхода флуоресценции от ленгмюровских пленок на поверхности жидкости дает принципиальную возможность однозначно определять местоположение атомов в пленке. 2) Экспериментально продемонстрированы возможности метода СРВ в области полного внешнего отражения для определения местоположения ионов внутри органического монослоя, сформированного на поверхности жидкости. Получены спектры характеристического флуоресцентного излучения от лэнгмюровских монослоев фталоцианинов, полиорганосилаксанов и фосфолипида. Анализ угловых зависимостей выхода флуоресценции от монослоев позволил определить тип упаковки органических молекул в слое. Показано, что в условиях экспериментов для монослоев фталоцианинов определенное в них местоположение ионов металлов (Fe, Cu, Sn) соответствует положению макроциклов молекулы перпендикулярно поверхности жидкости. Для полиорганосилаксанов полученная величина расстояния ионов Si до границ раздела пленка/жидкость соответствует полимерным кольцам, лежащим плашмя на поверхности жидкости. 3) Разработана методика измерения угловой зависимости выхода флуоресценции в области полного внешнего отражения, позволяющая избежать искажений сигнала, связанных с изменением положения области засветки рентгеновским пучком на поверхности жидкой субфазы при отклонении падающего пучка от горизонтальной плоскости. 4) Проведены экспериментальные исследования по изучению изменений структурной организации ЛБ пленок на твердых подложках, вызванных адсорбцией ионов металлов, присутствующих в водной субфазе. Обнаружены существенные повреждения молекулярной организации фосфолипидной пленки, сформированной на водной субфазе, содержащей ионы свинца. С помощью метода СРВ получена информация о характере распределения ионов свинца, инкорпорированных в фосфолипидный слой из водной субфазы. Установлено, что ионы свинца в ЛБ пленке образуют отдельные частицы. 5) Исследовано влияние следовых количеств ионов металлов, присутствующих в водной субфазе, на молекулярную организацию ленгмюровского слоя жидкокристаллического соединения. Изучались многослойные органические наносистемы на основе металлоорганического комплекса европия Eu(III), нанесенные на кремниевые подложки. Обнаружено, что, несмотря на низкий уровень концентрации ионов металлов в водной субфазе (ниже чем 10-7 М), присоединение ионов металлов (Fe, Zn, Cu, Ca) привело к значительным перестройкам молекулярной организации ленгмюровского слоя жидкокристалличсекого соединения. Анализ угловых зависимостей выхода флуоресценции от ионов примесных металлов позволил сделать заключение, что в процессе инкубирования слоя комплекса Eu(III) на водной субфазе, произошло фазовое разделение слоя. Так что большая часть ионов железа и цинка в слое присутствует в виде отдельных островков. Ионы меди располагаются в Шиффовых основаниях молекул жидкокристаллического соединения благодаря частичному замещению в исследуемом комплексе Eu(III) атомов европия на атомы меди. 6) Получена сравнительная оценка эффективности действия лекарственных препаратов, применяемых для ускорения выведения тяжелых металлов при острой и хронической интоксикации. В качестве модельных систем использовали белково-липидные пленки на основе металлоферментов Са АТФазы и щелочной фосфатазы на твердых подложках. Методом СРВ в области полного внешнего отражения определен композиционный состав, а также местоположение ионов свинца внутри белковых пленок до и после применения лекарственных препаратов. Показано, что по эффективности элиминации ионов свинца на изолированных белково-липидных мембранных моделях отечественный лекарственный препарат ксидифон, не уступает импортным аналогам - препаратам ЭДТА и сукцимер. 7) Продемонстрирована принципиальная возможность применения современных структурно-чувствительных рентгеновских методик для развития новых методов контроля эффективности действия лекарственных препаратов в условиях in vitro (вне организма), позволяющих получать дифференциальные данные о действии лекарственного соединения. 8) Проведена серия исследований по изучению упорядоченных биоорганических наноструктур на поверхности жидкой субфазы с помощью метода СРВ. Исследовались белково-липидные пленки на основе фосфолипида фосфатидилинозитол и металлофермента щелочная фосфатаза. Установлено, что в пленках, сформированных на поверхности жидкости, происходит самопроизвольное присоединение ионов металлов из сверхчистой воды. Анализ полученных экспериментальных данных позволил локализовать положение следовых количеств ионов металлов, инкорпорированных из водной субфазы в белково-липидную пленку. Показано, что белковые молекулы самоорганизовались в отдельный слой, не содержащий фосфолипидных молекул. Обнаружено, что в сформированной слоистой структуре происходит резонансное усиление интенсивности волнового поля, приводящее к соответствующему усилению интенсивности выхода флуоресценции от атомов белково-липидной пленки. 9) Метод СРВ был применен для изучения влияния различных повреждающих агентов (тяжелых металлов и мочевины) на формирование упорядоченных белково-липидных пленок на основе фермента глюкозооксидаза, нанесенных на поверхность водной. Исследования были посвящены выявлению возможных молекулярных механизмов повреждения структурной организации клеточных мембран под действием экотоксикантов, а также при патологических изменениях в организме. Установлено, что в результате воздействия ионов тяжелых металлов и мочевины существенно изменяется тип взаимодействия липидного слоя с белковыми молекулами. 10) Рентгенофлуоресцентные измерения в области полного внешнего отражения позволили определить композиционный состав белково-липидных пленок на основе фермента глюкозооксидаза. Показано, что в результате обработки белка глюкозооксидаза раствором мочевины происходит самопроизвольное присоединение ионов металлов из воды высокой степени очистки. Обнаруженные факты повышения связывающей способности белковых молекул в присутствии токсических доз мочевины раскрывают один из возможных механизмов эндогенно обусловленного микроэлементоза при заболеваниях почек. По материалам диссертации опубликовано 29 статей в российских и зарубежных журналах, а также 30 тезисов докладов, получено 2 патента на изобретение. Основное содержание работы изложено в следующих публикациях 1. Zheludeva S. I., Kovalchuk M. V., Novikova N. N., Sosphenov A. N., Petty M. C., Howarth V. A., Cernik R. I., Collins S. P. Ion permeation through Langmuir-Blodgett layers investigated by total external reflection and fluorescence study. // Materials Science & Engineering. 1995. V.3. P.211-214. 2. Zheludeva S.I., Kovalchuk M.VNovikova., N.N., Sosphenov A.N., Salaschenko N.N., Shamov E.A., Prokhorov K.A., Burattini E., Cappuccio G. X-ray Standing Waves in X-ray Specular Reflection and Fluorescence Study of Nano-Films. // J.Appl.Cryst. 1997. V. 30. P. 833-838. 3. Желудева С.И., Новикова Н.Н., Терещенко Е.Ю., Салащенко Н.Н. Возможности характеризации многослойных структур в области полного внешнего отражения рентгеновских лучей при регистрации флуоресцентного излучения. // Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 1997. N11, C.17-22. 4. Zheludeva S.I., Kovalchuk M.V., Novikova N.N. Total reflection X-Ray fluorescence study of organic nanostructures. // Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy. 2001. V.56. P.2019-2026. 5. Лепихин В.В., Лидер В.В., Желудева С.И., Новикова Н.Н., Вологин В.И., Шишков В.А., Шилин Ю.Н. Блок формирования и управления пучком рентгеновского излучения для исследования молекулярных слоев на поверхности жидкости на источнике синхротронногоизлучения. // Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 2002. N12. C.21-24. 6. Желудева С.И., Новикова Н.Н., Коновалов О.В., Ковальчук М.В., Степина Н.Д., Юрьева Э.А., Мягков И.В., Годовский Ю.К., Макарова Н.Н., Рубцов А.М., Лопина О.Д., Ерко А.И., Толстихина А.Л., Гайнутдинов Р.В., Лидер В.В., Терещенко Е.Ю., Янусова Л.Г. Возможности рентгеновской флуоресценции в области полного внешнего отражения для исследования ленгмюровских монослоев на поверхности жидкости и твердой подложке. // Кристаллография. 2003. Т.48. N6. С. 30-42. 7. Novikova N.N., Zheludeva S.I., Konovalov O.V., Kovalchuk M.V., Stepina N.D., Myagkov I.V., Godovsky Yu.K., Makarova N.N., Tereschenko E.Yu., Yanusova L.G. Total reflection X-ray fluorescence study of Langmuir monolayers on water surface. // J. Appl. Cryst. 2003. V.36. P.727-731. 8. Zheludeva S.I., Novikova N.N., Konovalov O.V., Kovalchuk M.V., Stepina N.D., Tereschenko E.Yu. Langmuir monolayers on water surface investigated by X-ray total reflection fluorescence. // Materials Science and Engineering. 2003. V.23. P.567-570. 9. Новикова Н.Н., Юрьева Э.А., Желудева С.И., Ковальчук М.В., Степина Н.Д., Коновалов О.В., Толстихина А.Л., Гайнутдинов Р.В., Урусова Д.В., Матковская Т.А., Рубцов А.М., Лопина О.Д., Ерко А.И. Исследование белково-липидных мембранных моделей с помощью рентгенофлуоресцент-ных методик. // Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 2005. N8. C.67-73. 10. Novikova N.N., Yur'eva E.A., Zheludeva S.I., Kovalchuk M.V., Stepina N.D., Tolstikhina A.L., Gainutdinov R.V., Urusova D.V., Matkovskaya T.A., Rubtsov A.M., Lopina O.D., Erko A.I., Konovalov O.V. X-ray fluorescence methods for investigations lipid/protein membrane models. // J.Synchrotron Rad. 2005. V.12. P. 511-516. 11. Новикова Н.Н., Желудева С.И., Степина Н.Д., Толстихина А.Л., Гайнутдинов Р.В., Ерко А.И., Хаазе В., Галяметдинов Ю.Г. Структурная локализация следовых количеств примесных ионов в пленках ЛенгмюраБлоджетт с помощью метода стоячих рентгеновских волн. // Кристаллография. 2006. T.51. C.1110-1116. 12. Novikova N.N., Zheludeva S,I., Stepina N.D., Tolstikhina A.L., Gaynutdinov R.V., Haase W., Erko A.I., Knyasev A.A., Galyametdinov Yu.G. Arrangement of trace metal contaminations in thin films of liquid crystals studied by X-ray standing wave technique. // Spectrochimica Acta Part B. 2006. V.61. P. 12291235. 13. Zheludeva S., Novikova N., Stepina N., Yurieva E., Konovalov O. Molecular organization in protein-lipid film on the water surface studied by x-ray standing wave measurements under total external reflection. // Spectrochimica Acta B. 2008. V.63. P. 1339-1414. Novikova N.N., Zheludeva S.I., Stepina N.D., Tolstikhina A.L., Gaynutdinov R.V., Haase W., Erko A.I., Knyazev A.A., Galyametdinov Yu.G. X-ray standing wave studies of metal ions incorporation in Langmuir-Blodgett films. // Appl Phys A. 2009. V.94. P. 461-466. 15. Желудева С.И., Новикова Н.Н., Ковальчук М.В., Степина Н.Д., Коновалов О.В., Юрьева Э.А. Рентгенофлуоресцентные измерения для исследования элементного состава и молекулярной организации белковных пленок на поверхности жидкой субфазы. // Кристаллография. 2009. T. 54. N6. C. 968-976. 16. Novikova N.N., Zheludeva S.I., Kovalchuk M.V., Stepina N.D., Erko A.I., YurТeva E.A. Investigation of molecular mechanisms of action of chelating drugs on protein-lipid model membranes by x-ray fluorescence. // Crystallography Reports. 2009. V.54. N 7. P. 1208-1213. 17. Novikova N.N. Zheludeva S.I., Kovalchuk M.V., Stepina N.D., Konovalov O.V. X-ray standing waves studies of trace metal contaminations in lipid/protein molecular films on liquid subphase // The 13-th conference on total reflection x-ray fluorescence analysis and related methods (TXRF 2009). Sweden. 2009. Book of Abstracts. P. 83. 18. Гайнутдинов Р.В., Толстихина А.Л., Степина Н.Д., Новикова Н.Н., Юрьева Э.А., Хрипунов А.К. АСМ-исследование адсорбции белковых молекул на перенесенном ленгмюровском монослое. // Кристаллография. 2010. T. 55. №3. C. 520-525.