Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

  На правах рукописи

Костюнина Надежда Викторовна

Участие глутаматных  и  дофаминовых субстратов мозга в селекции внимания у крыс линий Вистар и SHR

03.03.01 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2012

Работа выполнена в лаборатории механизмов регуляции памяти, Федерального государственного бюджетного учреждения Научно-исследовательский институт физиологии  СО РАМН, г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук

Лоскутова Лилия Владимировна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, акад. РАМН 

Штарк Марк Борисович

 

доктор биологических наук, профессор 

Идова Галина Вениаминовна

 

Ведущее учреждение: Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН

г. Санкт-Петербург

Защита состоится л_28__ марта____ 2012 года в _10___ часов на заседании диссертационного совета Д 001.014.01 при ФГБУ НИИ физиологии Сибирского отделения РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. акад. Тимакова,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ НИИ физиологии СО РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. акад. Тимакова, 4, тел. (383)335 97 54, факс (383)335 98 54

Автореферат разослан л  2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук  Бузуева И.И.

  Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Синдром дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ) является комплексным нейропсихиатрическим расстройством, которое включает поведенческие и когнитивные отклонения, такие как невнимание, импульсивность и гиперактивность. Совокупность всех трех характерна для подгруппы, включающей 76% пациентов (Hawk et al., 2003). Расстройство внимания  диагностируется у 4-12% детей в возрасте от 6 до 12 лет и может сохраняться у взрослых в 30-60% случаев в отсутствие специфической терапии (Wender, 2002; Mich et al., 2004; Resnick, 2005; Faraone et al., 2006). Для лечения в основном используется метилфенидат (риталин) и другие психостимулянты амфетаминового ряда. Хотя 70-90% пациентов реагируют на эти препараты значительным улучшением поведенческих и когнитивных функций (Hood et al.,2005; Arnsten, 2006; Lijffijt et al., 2006; Coghill et al., 2007; Wilens, 2008; Rubia et al., 2011), механизмы коррекции функции внимания в значительной степени не изучены. Кроме того, они могут вызывать нежелательные побочные эффекты инсомнию, анарексию, головную боль, желудочные проблемы, задержку умственного и психического развития, а также синдром отмены и угрозу злоупотребления  (Goldman et al.,1998; Bolanos et al.,2003).

  В настоящее время поддерживается мнение о дисфункции дофаминергической (ДА) системы в патофизиологии СДВГ (Bregh, 2009). Тем не менее, обсуждается вопрос, будут ли изменения ДА системы первичными или следствием  аномальной регуляции глутаматергической системы (Carrey et al., 2007; Lule et al., 2008; Warton et al., 2009) и, что особенно важно, на уровне каких мозговых регионов происходит сбой. Очевидно, что создание целевых препаратов нуждается в уточнении нейромедиаторных и морфофункциональных основ СДВГ, для  исследования которых необходимы адекватные биологические модели. Из списка предлагаемых сегодня - линия крыс SHR признана наилучшей с ее высокой степенью валидности по крайней мере, для смешанного и самого распространенного типа данного расстройства (Russell et al., 2000, 2007; Davids et al.,2003; Sagvolden et al., 2005). Помимо того, что эта линия представлена аналогичными симптомам СДВГ поведенческими характеристиками, имеются биохимические показатели, которые касаются  специфических изменений активности дофаминергической (Russell et al., 2000; Volkow et al., 2001; Oades, 2002;), норадренергической и серотонинергической (Kulikov et al., 1997; Nakamura et al., 2001; Oades et al., 2005) систем. Установлена также повышенная чувствительность крыс SHR к психостимулянтам метилфенидату, кофеину и кокаину (Yang et al., 2006; Dela Pena et al., 2010; Amini et al., 2004; Pires et al., 2010; Thanos et al., 2010). Кроме того, совсем недавно при анализе физиологических и анатомических аспектов гиппокампальных СА3-СА1 синапсов крыс SHR обнаружено снижение долговременной потенциации (Jensen et al., 2009), что может указывать на дисфункцию активности N-метил-D-аспартатных рецепторов, контролирующих этот процесс. Авторы предполагают, что функциональное изменение глутаматергической синаптической трансмиссии может быть одной из причин патологии поведенческих отклонений крыс SHR, однако связь обнаруженного дефекта долговременной потенциации с когнитивными функциями пока не проверялась.

Отдельным нерешенным вопросом в проблеме СДВГ остается определение типа торможения (моторное или когнитивное), дисфункция которого может быть основным препятствием в процессах поддержания внимания и обучения. Несмотря на использование современных диагностических средств - функциональной магнитно-резонансной томографии, исследователи до сих пор не пришли к конценсусу в этом вопросе. И в этом плане интересен анализ состояния внутреннего Павловского торможения, надежным тестом которого является феномен латентного торможения. Сегодня он широко используется для тестирования способности субъекта игнорировать нерелевантную информацию, а в эксперименте представлен задержкой формирования условных рефлексов у здоровых субъектов в результате многократных преэкспозиций условного стимула до обучения (Lubow, 1989). Существует единственное сообщение (Lubow, Josman,1993) о нарушении латентного торможения у подростков с диагнозом СДВГ без последующей разработки полученных данных.

Поскольку латентное торможение является физиологическим механизмом, обеспечивающим избирательность внимания и предпочтительную обработку новых стимулов, то анализ его в биологических моделях СДВГ, и в частности у крыс линии SHR, с одновременной оценкой нейрохимических и морфофункциональных процессов внимания, представляется нам достаточно важной задачей. Отсутствие работ такого плана определило направление настоящего исследования.

Цель и задачи исследования

  Целью настоящей работы было исследование участия глутаматных N-метил-D-аспартатных рецепторов и их взаимодействие с дофаминергической системой мозга в приобретении навыков и формировании латентного торможения у крыс линий SHR и Вистар. Роль в этих процессах вентрального гиппокампа и фронтальной коры.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1) выявить особенности обучения и формирования латентного торможения в условно-рефлекторных задачах разной сложности. Определить степень зависимости когнитивных нарушений от генетически детерминированных поведенческих характеристик крыс SHR;

2) оценить роль глутаматных N-метил-D-аспартатных рецепторов мозга в приобретении условных реакций и формировании латентного торможения  у крыс SHR и Вистар;

3) установить вклад дофаминовых Д1 рецепторов мозга в приобретение условных реакций пассивного и активного избегания, и в формирование латентного торможения у крыс SHR и Вистар;

4) выявить особенности взаимодействия глутаматных и дофаминовых субстратов вентрального гиппокампа и префронтальной коры при формировании навыков на новый и нерелевантный стимулы у крыс SHR и Вистар;

5) исследовать влияние блокады дофаминовых терминалей вентрального гиппокампа крыс Вистар в период пубертатного развития на выработку условных рефлексов и формирование латентного торможения.

Научная новизна

В настоящей работе впервые установлено:

• нарушение латентного торможения у крыс линии SHR, выраженность которого зависит от типа условно-рефлекторной задачи и не связано с поведенческой гиперактивностью этих животных;
• активация N-метил-D-аспартатных рецепторов  вентрального гиппокампа крыс SHR вызывает коррекцию латентного торможения, а вместе с системной активацией дофаминовых Д1 рецепторов значительно облегчает обучение на новую информацию и поддерживает экспрессию латентного торможения;

• функциональная зависимость между глутаматными N-метил-D-аспартатными рецепторами вентрального гиппокампа и дофаминовыми Д1 рецепторами префронтальной коры крыс SHR в приобретении новых навыков и формировании латентного торможения;
• положительное влияние активации глициновых участков N-метил-D-аспартатных рецепторов мозга на обучение и латентное торможение крыс SHR, и аналогичный эффект у взрослых крыс Вистар с блокадой активности дофамина вентрального гиппокампа в период пубертатного развития.

Теоретическая и научноЦпрактическая ценность работы

Теоретическое значение работы заключается в экспериментальных доказательствах нарушения ЛТ у крыс линии SHR, степень которого зависит от типа и сложности используемой условно-рефлектороной задачи. Установлена морфо-функциональная система, дефект которой обусловлен низкой активностью NMDA-рецепторов вентрального гиппокампа и Д1 рецепторов фронтальной коры, что должно быть принято во внимание при выборе адекватных моделей СДВГ.

Сходство нарушений латентного торможения и корректирующей эффективности коагониста NMDA рецепторов у крыс SHR и крыс Вистар  с блокадой активности ДА вентрального гиппокампа в период пубертатного развития, позволяют предложить таких крыс в качестве возможной модели СДВГ для поиска специфических препаратов с определенным местом действия.

Полученные в работе данные, раскрывающие ранее неизвестные механизмы нарушения селективного внимания у крыс SHR, могут быть использованы при чтении лекций по физиологии высшей нервной деятельности и патофизиологии ЦНС в университетах и медицинских ВУЗах. Данные о существенной коррекции обучения и ЛТ у крыс SHR одновременной активацией NMDA-рецепторов вентрального гиппокампа и Д1 рецепторов фронтальной коры вносят вклад в понимание механизмов когнитивных расстройств у детей с СДВГ и могут быть полезны при разработке схем фармакологической коррекции поддержания и переключения  внимания.

Положения, выносимые на защиту

1. У крыс линии SHR (модель СДВГ) способность к торможению незначимой информации зависит от степени сложности предъявляемой задачи и не связана с поведенческой гиперактивностью или низкой тревожностью этих животных.
2. Коррекция латентного торможения у крыс SHR активацией NMDA рецепторов вентрального гиппокампа, и обеспечение поддержания внимания к новой информации при одновременной активации дофаминовых Д1 рецепторов мозга, свидетельствует о взаимодействии двух нейромедиаторных систем в модуляции переключения внимания. Дисбаланс данного взаимодействия может быть причиной когнитивных нарушений у крыс SHR и, возможно, при СДВГ с установленной низкой активностью Д1 рецепторов в медиальной ПФК.
3. Имитация нарушения торможения внимания к незначимой информации у половозрелых крыс Вистар с блокадой дофаминовых терминалей гиппокампа в период пубертатного развития и коррекция нарушения латентного торможения системным введением d-циклосерина предполагает, что основным местом его действия может быть гиппокампальная формация с низкой активностью NMDA рецепторов. Снижение реализации мезогиппокампального дофамина в период созревания мозга может быть одной из причин развития дефицита торможения внимания у крыс SHR.

Апробация результатов 

Результаты работы  были доложены на 6-м Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008); конференции молодых ученых НИИ Физиологии СО РАМН (Новосибирск, 2009); 21-м съезде физиологического общества (Калуга, 2010); Всероссийской конференции с международным участием Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе адаптации к условиям среды (Санкт-Петербург, 2010).

Публикации.  По теме диссертации опубликовано 7 научных работ в рецензируемых журналах: 1 из них - в зарубежном журнале.

Структура и объем работы.  Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение, выводы, список литературы из 234 источников. Работа содержит 18 рисунков и 2 таблицы.

  Материалы и методы

Экспериментальные животные.  В работе использованы  крысы-самцы 2-х  линий - SHR и Вистар половозрелого (2.5-3.5 мес) и ювенильного (28-46 дн) возраста, полученных из вивария Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск). В опытах использовано 687 крыс (n= 7-14) в группах.  Опыты проводились с соблюдением принципов гуманности в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755) и одобренных комитетом по биомедицинской этике НИИ физиологии СО РАМН.

Поведенческие тесты:  приподнятый крестообразный лабиринт и темно/светлую камеру использовали для идентификации поведенческих особенностей крыс линии SHR (гиперактивности и эмоциональности), выращенных в местном виварии (результаты представлены в диссертации).

Выработка условных рефлексов  проводилась в двух ситуациях - новизны условного стимула и после угашения новизны преэкспозицией (ПЭ) условного стимула до бучения  для получения эффекта латентного торможения (ЛТ).

Условная реакция пассивного избегания (УРПИ) является примером однократного контекстуального обучения (Jarvik, Koop, 1967) в установке, состоящей из двух отделений: освещённого (безопасного) и тёмного (опасного). В день обучения, переход крысы в опасный отсек наказывали электрокожным раздражением (0,75 мА, 2 сек). Через 24 часа регистрировали сохранение УРПИ. Время наблюдения - 180 с. Для получения  ЛТ перед обучением вводилась стадия преэкспозиции условного стимула - 20 неподкрепляемых предъявлений экспериментальной камеры в течении 5 дней по схеме (Лоскутова, 1985). Наличие ЛТ определяли при сравнении с группой крыс без преэкспозиции.

Условная реакция активного избегания (УРАИ) вырабатывалась в автоматической челночной камере с программным обеспечением (ИФТ-04). Наблюдение за поведением осуществлялось с помощью монитора, на экране которого отражались все переходы крыс, общее время сессии, подача условного (свет) и безусловного (ток) стимулов. Временной интервал между сочетаниями стимулов колебался от 22 до 30 с. Обучение проводилось в одной сессии, которая состояла из 100 предъявлений пары стимулов свет + ток. Все параметры фиксировались автоматически и обрабатывались соответствующей программой. Регистрировались показатели:  ЛП перехода при избавлении от тока (escape reaction);. число сочетаний свет+ток до начала закрепления условной реакции избегания наказания (avoidance reaction) с критерием закрепления 7 правильных ответов подряд; число межстимульных переходов, отражающих моторную активность. Для получения эффекта ЛТ за сутки до обучения УРАИ проводилась стадия преэкспозиции условного светового стимула (100 ПЭ) без подачи безусловного стимула.

Фармакологический анализ проводили с применением селективных глутаматергических и дофаминергических (ДА) рецепторных препаратов, вводимых либо системно за 30-50 мин, либо в гиппокамп за 5-7 мин до обучения. Для разрушения ДА терминалей вентрального гиппокампа применяли нейротоксин 6-Hydroxydopamine (6-OHDA). Внутриструктурные инъекции  производились с помощью микроинжектора (Stoelting Co, USA) и вживленных проводниковых канюль (Helmflon, Германия).  Координаты для вентрального гиппокампа: Bregma: -4.7; H= 6.5; L= 5.0 (Paxinos, Watson, 1998).

Статистика. Данные обрабатывали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA, Statistica 6.0). Влияние каждого фактора оценивали по критерию Фишера, а достоверность различий между групповыми средними определяли с помощью тестов LSD и Newman-Keul. Независимыми факторами являлись: линия крыс, наличие преэкспозиции и препараты. Результаты представлены в виде средних арифметических значений со средней стандартной ошибкой (MSEM).

Результаты исследования и их обсуждение

1. Особенности обучения и формирования латентного торможения у  крыс Вистар и SHR

  Трудности в приобретении условных рефлексов для крыс линии SHR однозначны в любых парадигмах (Ueno et al., 2002; Hernandez et al., 2003; Prediger et al., 2005; Лоскутова и др., 2006; Clements et al., 2007). Что касается дефицита внимания, то анализ его механизмов с использованием специализированного теста, такого как латентное торможение, явно не достаточен при наличии единственной работы (Calzavare et al., 2009), в которой обнаружено нарушение латентного торможения у крыс SHR, формируемого в не избегаемой ситуации условной эмоциональной реакции страха. Проблема с определением дефицита торможения (моторного или когнитивного) у крыс линии SHR предполагает необходимость методологии, способной обеспечить их раздельный анализ. В нашей работе впервые применялся сравнительный анализ формирования ЛТ в двух задачах разной сложности и с диаметрально противоположными требованиями к процессам активации-торможения в приобретении условных рефлексов активного и пассивного избегания, с многократным и однократным подкреплением соответственно.

В  условной реакции активного избегания (УРАИ)

  Результаты выработки УРАИ у крыс Вистар и SHR с преэкспозицией (100ПЭ) и без нее (0ПЭ) представлены на рис. 1 тремя важными показателями: количеством сочетаний стимулов до закрепления навыка (а), числом межстимульных переходов (б) и динамикой ЛП перехода в 5-ти первых блоках тренировочной сессии (в). Количество животных в группе составляло 9-11.

  Значительное влияние преэкспозиции на выработку УРАИ (рис. 1а) выявлено только у крыс Вистар (p=0.004 по сравнению с группой 0ПЭ) - эффект ЛТ. Внутрилинейные сравнения у крыс SHR (0ПЭ vs 100ПЭ)  достоверных отличий не имели, что указывает на нарушение латентного торможения. Межлинейные различия по количеству межстимульных переходов (рис. 1б), отражающих двигательную активность животных, отсутствовали. При этом их среднее значение у крыс SHR ниже, чем у Вистар. То есть, характерная для этих крыс гиперактивность не выявлена при обучении в челночной камере. Post hoc сравнения обнаружили достоверные различия ЛП перехода на ток (escape reaction) у крыс Вистар (0ПЭ vs 100ПЭ) для блоков 1, 2, 3 и 5. То есть, время реакции на болевой стимул значительно увеличилось после ПЭ, что способствовало развитию ЛТ. У крыс SHR межгрупповые (0ПЭ vs 100ПЭ) и внутригрупповые (сравнение блоков 1 vs 5) различия не найдены, что указывает на отсутствие влияния ПЭ на процесс избавления от наказания, и предполагает дисгабитуацию крыс SHR, как на стадии ПЭ, так и на стадии обусловливания.

В  условной реакции пассивного избегания (УРПИ)

  На рис. 2. представлены результаты тестирования УРПИ через 1 сутки после однократного обучения на новый (0ПЭ) и нерелевантный (20ПЭ) стимулы.

Рис. 2.  Показатели ЛП перехода в опасный отсек установки при тестировании УРПИ у преэкспозированных и не преэкспозированных крыс. * p<0.01 между группами Вистар (0ПЭ vs 20ПЭ); # p<0.01 при сравнении групп SHR и Вистар без ПЭ. 

  Post hoc анализ выявил достоверное снижение времени перехода у крыс Вистар (20ПЭ) в наказуемый отсек камеры (p=0.001) по сравнению с собственной контрольной группой (0ПЭ), что указывает на эффект ЛТ. У крыс SHR (20ПЭ) при аналогичном сравнении с собственным контролем (0ПЭ) различия отсутствовали (F1.41= 3.25, p=0.067), хотя и граничили со статистической значимостью. Это может указывать на тенденцию к формированию ЛТ или возможность его развития в простой поведенческой задаче.  Последний факт позволил проведение анализа контекстуальной зависимости ЛТ, в котором впервые было обнаружено ее отсутствие у крыс SHR по сравнению с контрольными Вистар (результаты представлены в диссертации).

Таким образом, у крыс SHR обнаружено нарушение латентного торможения, которое зависело от типа и сложности предъявляемой условно-рефлекторной задачи: тотальное нарушение регистрировалось в УРАИ, и только его ослабление в УРПИ. Показано (Zielinski et al., 1997), что у нормальных крыс сочетание свет+ток, завершенное реакцией избавления, вызывает состояние безопасности и снижение частоты межстимульных реакций, которое возрастает непосредственно перед следующим сочетанием. То есть, речь идет о так называемом запаздывательном торможении И.П. Павлова, когда ранние фазы условного стимула, отдаленные от безусловного стимула, подвергаются процессам экспериментального угашения, в то время как поздние фазы сохраняют свое возбуждающее действие и количество межстимульных переходов возрастает. У крыс SHR запаздывательное торможение не наблюдалось, а количество межтрайловых переходов не отличался значимо от таковых крыс Вистар. То есть, выявленные у SHR нарушения, скорее связаны с когнитивной составляющей - дефицитом габитуации или внутреннего торможения, чем с поведенческими характеристиками такими, как импульсивность или гиперактивность. Отдельный интерес представляет отсутствие контекст-зависимости ЛТ, также впервые регистрируемое нами у крыс SHR. У нормальных субъектов смена контекста во время формирования ЛТ приводит к его нарушению (Westbrook et al., 2000; Gray et al., 2001; Gershman et al., 2010). Однако этого не происходит при каких-либо дефицитах внимания, особенно связанных с нейродегенеративными изменениями в гиппокампальных регионах (Hemsley, 2005). Так как внимание к контексту контролируется NMDA рецепторами вентрального гиппокампа (Gewirtz et al., 2000; Kaczorowski, Disterhoft, 2010; Quintero et al., 2011), то наша дальнейшая работа была связана с анализом их участия в поддержании и торможении внимания.

2. Участие N-метил-D-аспартатных рецепторов в формировании латентного торможения у крыс Вистар и SHR

Имеется достаточно доказательств, что антагонисты NMDA-рецепторов ухудшают обучение и память у грызунов в большом ранге поведенческих задач (обзор Riedel et al., 2003). Блокада NMDA-рецепторов снижает способность переключаться с одной поведенческой реакции на другую (Svensson 2000; Jentsch, Taylor 2001) и вызывает поведенческие нарушения такие, как импульсивность (Tonkiss et al., 1988) и гиперактивность (Bardgett et al., 2003). Интересно, что изменения, вызываемые блокадой NMDA-рецепторов у нормальных крыс, имеют сходство с генетическими характеристиками крыс линии SHR (низкая способность к обучению, гиперактивность, импульсивность). Литературные данные по влиянию блокады этих рецепторов на развитие ЛТ у нормальных животных немногочисленны и не имеют однозначных результатов. С одной стороны, ЛТ крыс Вистар оставалось интактным при его формировании в эмоциональной реакции страха на фоне фенциклидина (Weiner, Feldon, 1992), а с другой ЛТ у мышей нарушалось введением дизоцилпина (МК-801) перед стадией ПЭ (Lewis, Gould, 2004). Что касается вопроса о вовлечении глутаматных рецепторов в когнитивные дефициты крыс SHR, то пока он  остается открытым. Поэтому в план наших исследований входила сравнительная оценка особенностей вовлечения NMDA-рецепторов в развитие ЛТ у крыс Вистар и SHR.

На рис. 3 показано влияние блокады NMDA-рецепторов на обучение УРПИ и формирование ЛТ у крыс Вистар. В качестве антагониста использовали МК-801 в дозе (0.2 мг/кг), нарушающей ассоциативное обучение (Bardgett et al., 2003; Davis, Gold, 2005).

  Рис. 3.  Показателт ЛП перехода в опасный отсек камеры при тестировании

УРПИ,  выработанной у крыс Вистар c преэкспозицией и без нее  с системной блокадой NMDA-рецепторов. * p<0.01 между группами  0ПЭ+Veh и 20ПЭ+Veh.

Полученный результат напоминает нарушения, выявленные у крыс SHR (рис. 2). Такое же резкое ухудшение приобретения навыка при обучении на новый стимул (F1. 34 =58.80, p<0.001 между группами  0ПЭ), и наличие  ЛТ, хотя и менее значимого, чем в контроле.

  Такое же сходство нарушений было получено у крыс Вистар и в УРАИ. Антагонист NMDA-рецепторов мемантин дозозависимо нарушал не только формирование латентного торможения, но и значительно снижал количество межтрайловых переходов (результаты в диссертации).

3. Корректирующий эффект глицина при экспериментальных и генетически обусловленных нарушениях обучения и латентного торможения

Уникальной характеристикой NMDA рецептора является то, что кроме участка для связывания глутамата он имеет дополнительный глицин модулирующий участок, с которым могут связываться глицин и d-серин, экзогенное подведение которых может стимулировать NMDA рецептор (Coyle et al, 2003). Установлено, что локальные концентрации глицина в переднем мозге регулируются высокоафинным глициновым переносчиком первого типа GlyT1 (Atkinson et al., 2001), блокада которого может вызвать усиление NMDA активности. И действительно, у мышей с нокаутом гена GlyT1 препульсовое торможение (сенсо-моторный аналог ЛТ) оставалось интактным при введении МК-801 в дозе 0.2 мг/кг (Singer et al., 2011), то есть, хроническая активация глицина предотвратила нарушение препульсового торможения блокадой NMDA рецепторов. Также, производные, усиливающие активность глициновых участков, включая глицин, d-серин и порционный коагонист d-циклосерин (d-cicloserine, DCS) способны реверсировать поведенческие нарушения, вызванные NMDA антагонистами у человека и грызунов (Javitt et al., 1999; Koystal et al., 2003).

Эксперименнт 1. Для анализа модулирующего влияния глицина при нарушениях процессов внимания были использованы крысы Вистар с блокадой NMDA рецепторов, и DCS (15 мг/кг), который вводили через 20 мин после МК-801. Доза выбрана на основании результатов поведенческих исследований (Gaisler-Salomone et al., 2007).

Рис. 4. Показатели УРАИ и ЛТ крыс Вистар, обученных при разных фармакологических воздействиях: vehicle, МК-801 (0.2 мг/кг), МК-801 (0,2 мг/кг) + DCS (15 мг/кг).  * p <0.001 по сравнению с группами 0ПЭ+Veh и 0ПЭ+DCS.

Post hoc сравнения выявили четко выраженный эффект ЛТ у крыс Вистар с растворителем (0ПЭ vs 100ПЭ; p<0.001). Введение МК-801 значительно нарушило приобретение УРАИ (F1.52 =13.60; p<0.001 по сравнению с  группой  0ПЭ+Veh) и незначительно ослабило ЛТ (p=0.075 при сравнении с группой 100ПЭ+Veh). Указанные нарушения были нивелированы введением МК-801 в сочетании с D-циклосерином облегчение приобретения УРАИ у крыс без ПЭ (p=0.010 по сравнению с 0ПЭ+МК), а усиление ЛТ граничило со статистической значимостью (p=0.058 по сравнению с группой 100ПЭ+МК). В результате, между группами с ПЭ и без нее были найдены высоко достоверные различия (F1.52 =14.24; p<0.001), что свидетельствует о полном восстановлении как обучения на новизну, так и ЛТ.

Эксперименнт 2.  Такая же доза d-циклосерина использовалась при выработке УРАИ у крыс  SHR.

  Рис. 5. Корректирующий эффект системного введения D-циклосерина  на показатели реакций избавления от тока (а) и УРАИ (б) у крыс SHR с ПЭ и без нее.

  * p<0.01 между блоками 1 и 5 в группе 0ПЭ+DCS; # p<0.01 между 5-ми блоками групп 0ПЭ+DCS и 100ПЭ+DCS. 

Post hoc сравнения обнаружили достоверные межгрупповые различия ЛП перехода на ток (а), вызванные активацией NMDA рецепторов (0ПЭ+DCS vs 100ПЭ+DCS) для блоков 1 (p<0.0001), 3 (p=0.02) и 5 (p=0.04). В группе (0ПЭ+DCS) появились достоверные различия уже между 1 и 2 блоками (p=0.01) с продолжением снижения до последнего блока. Такая динамика характерна для наивных крыс Вистар (см. рис. 1в и др.). Корректирующий эффект препарата имеется и в группе преэкспозированных крыс (100ПЭ+DCS), несмотря на то, что динамика изменения времени реакции неустойчива по сравнению с группой 0ПЭ+DCS, и даже парадоксальна относительно резкого снижения времени перехода в блоке 1 и такого же увеличения - в блоке 5. Однако коррекция первой фазы обучения УРАИ положительно повлияла на вторую - выработку УРАИ и ЛТ (б). Полученный результат указывает на коррекцию препаратом обучения без ПЭ (p=0.05 по сравнению с 0ПЭ+Veh) и вместе с тем подчеркивает реализацию ЛТ (0ПЭ+DCS vs 100ПЭ+DCS).

Таким образом, сравнительный анализ влияния D-циклосерина на процессы внимания крыс Вистар с блокадой NMDA рецепторов и крыс SHR с возможным, генетически обусловленным снижением их активности, выявил положительное действие препарата, обеспечившего необходимый баланс между поддержанием и торможением внимания в обеих причинно-следственных ситуациях. Кроме того, сходство эффектов D-циклосерина в обеих моделях когнитивных нарушений предполагает, что у крыс SHR имеется дефект глутаматергической системы, возможно связанный с недостаточной активностью NMDA-рецепторного субстрата в вентральном гиппокампе. Такая предпосылка может быть поддержана нашими данными об отсутствии у крыс SHR чувствительности ЛТ к изменению контекста, контролируемого NMDA-рецепторами вентрального гиппокампа (Bast et al., 2001), а также данными литературы (Jensen et al., 2009) о редукции долговременной формы синаптической пластичности в ВГ крыс этой линии.

4.  Взаимодействие NMDA и Д1 рецепторов в обучении и латентном торможении крыс SHR

  Многие поведенческие функции, включая внимание и память, связаны с гиппокампом и ДА-ергической трансмиссией в mPFC. Это предполагает функциональное взаимодействие между этими образованиями. Анатомическим субстратом для такого взаимодействия является тесная внутренняя связь вентрального гиппокампа и ДА иннервация mPFC (Thierry et al., 2000). Показано, что стимуляция ВГ введением NMDA вызывает активацию трансмиссии ДА в mPFC (Peleg-Raibstein et al., 2005;), а задачи, требующие ассоциации между контекстом и аверсивным стимулом зависят от кортико-гиппокампального взаимодействия (Burwell et al., 2004).

Эксперимент выполнялся на крысах SHR с вживленными канюлями в вентральный гиппокамп. Микроинъекция N-метил-D-аспартатной к-ты (0.5 мкг/1 мкл) производилась билатерально за 7 мин до обучения крыс УРПИ.

На рис. 6. показаны эффекты либо изолированной микроинъекции NMDA в гиппокамп, либо в сочетании с системным введением агониста Д1 рецепторов SKF-38393 (1мг/кг), который вводили за 30 мин до выработки УРПИ и формирования ЛТ. Число животных в подгруппах (8-9).

Рис. 6.  Средние значения ЛП перехода в опасный отсек установки через 1 сут. после обучения крыс SHR с ПЭ и без нее.

*p=0.012 сравнение с группой 0ПЭ+NMDA; **p=0.000 с группой 0ПЭ+NMDA+SKF; #p=0.001 и p=0.03 с группами 0ПЭ+Veh и 0ПЭ+NMDA  соответственно (по результатам post hoc сравнений).

Результат введения в ВГ NMDA незначительное увеличение среднего значения ЛП перехода в подгруппе 0ПЭ+NMDA (77.1 26.0), которое, однако, привело к выделению эффекта ЛТ. Тенденция к усилению обучения на новый стимул может быть результатом увеличения свободного ДА в mPFC при стимуляции нейронной активности ВГ в используемой дозе (Peleg-Raibstein et al., 2005). Предполагая, что она недостаточна для увеличения активности ДА в mPFC крыс SHR, мы использовали одновременную активацию Д1 рецепторов целого мозга. Полученный результат обращает на себя внимание значительным усилением обучения только на новый стимул и отсутствием влияния на уровень ЛТ. В связи с этим, в отдельном эксперименте (результаты в диссертации) анализировалась эффективность SKF38393 в коррекции обучения УРПИ и формирования ЛТ крыс SHR и Вистар. Влияние препарата на обучение или формирование ЛТ крыс Вистар отсутствовало, в то время как у SHR обнаружено значительное усиление обучения на новый стимул. Если у крыс SHR активность Д1 рецепторов снижена в префронтальной коре (Oades et al., 2005), то при системном введении SKF 38393 эта область может быть основным субстратом его действия в коррекции поддержания внимания к новой информации. Таким образом, устранение нарушений селективного внимания у крыс SHR активацией NMDA рецепторов вентрального гиппокампа и одновременной системной активацией Д1 рецепторов мозга может предполагать интеграцию данных субстратов в обеспечении нормальных когнитивных процессов. Следовательно, у крыс SHR дисбаланс взаимодействия двух субстратов является важной причиной дезорганизации обоих аспектов функции внимания - его поддержания на новую информацию и одновременного торможения на нерелевантную. 

5. Фармакологическая модель нарушения латентного торможения у крыс Вистар при дефиците мезо-гиппокампального дофамина

Электрофизиологические доказательства предполагают, что мезенцефалические ДА нейроны могут выполнять регулирующую роль в гиппокампальной возбудимости (Gasbarri et al., 1997), однако функциональная значимость мезогиппокампального ДА-ергического звена в процессах внимания пока не исследована. Низкая реализация ДА в мезолимбических проекционных регионах у детей с СДВГ является дефектом постнатального развития. Отсутствие работ, сочетающих анализ участия дофамина гиппокампа в ЛТ с фактором возраста, определили задачу нашего эксперимента, которая заключалась в выяснении влияния блокады ДА нервных окончаний ВГ на формирование ЛТ крыс Вистар пубертатного и половозрелого возраста.

  В работе использованы крысы Вистар в возрасте 28-30 дней к началу операции. Билатеральная микроинъекция нейротоксина 6ЦOHDA (4 мкг/1 мкл растворителя) выполнялась за месяц до выработки УРАИ. На рис. 7 показаны результаты обучения и формирования ЛТ у взрослых крыс.

Рис. 7.  Показатели УРАИ оперированных взрослых крыс Вистар, обученных при разных фармакологических воздействиях: vehicle, 6-OHDA, SKF-38393 (1мг/кг) и DCS (15 мг/кг).  *p=0.038 между группами  0ПЭ+DCS и 100ПЭ+DCS (по результатам post hoc сравнений).

Во-первых, из представленных данных следует, что у крыс с блокадой ДА активности в ВГ нарушено только ЛТ, без изменения обучения на новизну. Во-вторых, системная активация NMDA рецепторов D-циклосерином значительно усилила ЛТ оперированных крыс, не влияя на выработку УРАИ. Может ли это указывать на селективную роль ДА терминалей ВГ  обеспечении торможения внимания модуляцией активности NMDA рецепторов? В какой-то мере, ответом на вопрос может служить результат биохимического анализа (Молодцова, Лоскутова, 1995), по которому обусловливание преэкспозированного, но не нового стимула, сопровождается усилением метаболизма дофамина в гиппокампе интактных крыс Вистар. Учитывая обнаруженную эффективность D-циклосерина в коррекции приобретения УРАИ и ЛТ у крыс SHR (рис. 5), можно думать, что она обусловлена способностью препарата усиливать синаптическую пластичность (Yaka et al., 2007). Ее снижение обнаружено в ВГ крыс SHR (Jensen et al., 2009), и может присутствавать у крыс Вистар с блокадой ДА терминалей.

  Представляется, что дисфункция в системе гиппокампально-фронтального взаимодействия может быть важной причиной нарушений ЛТ и обучения крыс SHR. При этом NMDA рецепторная активность вентрального гиппокампа в большей степени обеспечивает тормозный аспект внимания, в то время как оптимальная активность Д1 рецепторов медиальной префронтальной коры необходима для поддержания внимания к новым стимулам. Такой же механизм патогенеза возможен у людей с СДВГ, в гиппокампе которых недавно обнаружены (Plessen et al., 2006) нейродегенеративные изменения

Выводы

1. Нарушение ЛТ у крыс SHR имеет разную выраженность, зависящую от применяемой поведенческой задачи. Тотальное нарушение в УРАИ сопроваждалось дисгабитуацией к повторно предъявляемому условному стимулу и отсутствием гиперактивности. В УРПИ вырабатывалось более слабое ЛТ, чем у крыс Вистар, и с нарушенной чувствительностью к смене контекста.
2. Системное введение  агониста Д1 дофаминовых рецепторов SKF-38393 (1мг/кг) значительно облегчало обучение на новый стимул у крыс SHR, но не способствало формированию ЛТ. У крыс Вистар введение  препарата в той же дозе не влияло на обучение или ЛТ.
3. Микроинъекция в вентральный гиппокамп крыс SHR агониста NMDA рецепторов вызывает экспрессию латентного торможения и не влияет на обучение. Одновременное системное введение SKF-38393 (1мг/кг)  обеспечивает полную коррекцию обоих процессов - обучение на новый стимул и латентное торможение на преэкспозированный. Аналогичный корректирующий эффект регистрируется при системном введении  ко-агониста NMDA рецепторов  D-циклосерина.
4. У крыс Вистар корректирующий эффект D-циклосерина регистрируется только в условиях нарушений обучения и латентного торможения, вызванных системным введением блокатора NMDA рецепторов  дизоцилпина.
5. Избирательная блокада ДА терминалей в вентральном гиппокампе крыс Вистар в период пубертатной реорганизации мозговых систем препятствует формированию ЛТ, но не обучению, в обеих поведенческих задачах. ЛТ восстанавливалось системной инъекцией D-циклосерина, но не SKF-38393.
6. Полученные в работе данные дают основание предполагать интеграцию глутаматных NMDA рецепторов вентрального гиппокампа и Д1 рецепторов префронтальной коры в процессах внимания. Складывается впечатление, что вентральный гиппокамп в большей степени контролирует его тормозный аспект, а префронтальная кора - возбуждающий. Дисбаланс взаимодействия двух систем может вызывать дефициты процессов внимания, представленных у крыс SHR  или вызванных у крыс Вистар блокадой дофаминовых терминалей вентрального гиппокампа в период пубертатного развития.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Костюнина Н.В., Редькина А.В. Участие N-метил-D-аспартатных рецепторов в торможении внимания к незначимой информации у крыс. // Бюл. СО РАМН. - 2009. - № 2 (136). - С. 55 Ц58.

2.  Лоскутова Л.В., Костюнина Н.В., Дубровина Н.И.  Участие дофаминовых рецепторов разного типа в формировании латентного торможения условной реакции пассивного избегания у крыс. // Журн. высш. нерв. деят. - 2009. - № 2 (59). - С. 195 - 201.

3.  Лоскутова Л.В., Костюнина Н.В. Влияние мемантина на латентное торможение условной реакции активного избегания у крыс Вистар. // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2009. Ц№ 6 (147). - С. 626 - 630.

4 Loskutova L.V., Kostjunina N.V., Dubrovina N.I. Involvement of different types of dopamine receptors in the formation of latent inhibition of a conditioned passive avoidance reaction in rats.// Neurosci. Behav. Phisiol. - 2010. ЦVol.40. - № 5. - P. 483 - 487.

5.  Лоскутова Л.В., Костюнина Н.В., Редькина А.В. Нарушение латентного торможения у взрослых крыс после блокады дофаминовых терминалей вентрального гиппокампа в период пубертатного развития. // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2010. - № 5 (96). - С. 455 - 462.

6. Лоскутова Л.В., Костюнина Н.В. Нарушение латентного торможения у крыс линии НИСАГ со стрессчувствительной артериальной гипертензией. // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2010. Ц№ 10 (96). - С. 966 - 971.

7. Костюнина Н.В., Лоскутова Л.В. Особенности формирования латентного торможения у крыс SHR в условно-рефлекторных задачах разной сложности. // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2012. - № 153. - C. 4 - 8.

СПИСОК  СОКРАЩЕНИЙ

ВГ	вентральный гиппокамп
ДА	дофамин
П	атентный период
Т	атентное торможение
ПЭ	преэкспозиция
СДВГ	синдром дефицита внимания и гиперактивности
УРАИ	условная реакция активного избегания
УРПИ	условная реакция пассивного избегания
DCS	D-Cycloserine
NMDA	N-methyl-D-aspartate acid
6-OHDA	6-гидроксидофамин
mPFC	медиальная префронтальная кора

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии