Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
ГАББАСОВ Зуфар Ахнафович
ТРОМБОЦИТЫ И ЯДРОСОДЕРЖАЩИЕ КЛЕТКИ КРОВИ В РАЗВИТИИ СТЕНОЗИРУЮЩИХ ПОРАЖЕНИЙ АРТЕРИЙ
14.01.21 Гематология и переливание крови
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва-2010
Работа выполнена в лаборатории стволовых клеток человека института экспериментальной кардиологии Федерального Государственного Учреждения Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи.
Научный консультант:
Член-корреспондент РАН, академик РАМН, Смирнов доктор биологических наук, профессор Владимир Николаевич
Официальные оппоненты:
Член-корреспондент РАМН, Савченко доктор медицинских наук, профессор Валерий Григорьевич Академик РАМН, Кубатиев доктор медицинских наук, профессор Аслан Амирханович доктор биологических наук Васильев Андрей Валентинович
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московская медицинская академия имени И. М. Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
Защита диссертации состоится л_______________ 2010 года в ____ часов на заседании Диссертационного совета Д.001.042.02. при Учреждении Российской Академии Медицинских наук Гематологический Научный Центр РАМН по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд д.4а
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГН - РАМН.
Автореферат разослан л_______________ 20___ года
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Е.Е. Зыбунова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из главных причин инвалидизации и смертности населения во многих промышленно-развитых странах. По данным ВОЗ, распространенность сердечно-сосудистых заболеваний существенно растет с возрастом, и среди людей старше 60 лет достигает 72-74% [American Heart Association Statistics Committee, 2009].
Основной причиной сердечно-сосудистых заболеваний является развитие стенозирующих процессов в стенке сосудов, которые, вызывая сужение просвета пораженных артерий, приводят к органным и общим расстройствам кровообращения. Это комплексное хроническое заболевание, которое характеризуется возникновением в стенках артерий очагов повреждений с последующим образованием атеросклеротических бляшек.
Результаты исследований последних лет позволяют заключить, что патогенез атеросклероза тесно связан с защитной реакцией организма, когда попытка локализации зоны поражения приводит к чрезмерному фибропролиферативному клеточному ответу, вызывающего сужение просвета сосуда. Последовательность биологических событий внутри стенки сосуда, которые происходят в процессе такого избыточного УремонтаФ, включает проникновение в субэндотелиальное пространство клеток воспаления, накопление липидов, активацию и дегрануляцию тромбоцитов, миграцию и пролиферацию синтезирующих экстрацеллюлярный матрикс стромальных клеток. По мнению Р.Росс и многих современных авторов, ведущая роль в приводящем к стенозу сосудов фибропролиферативном клеточном ответе принадлежит проникающим из медии в интиму и там пролиферирующим гладкомышечным клеткам и/или макрофагам [Ross R. 1993]. Вместе с тем, появляются все новые данные об участии в атерогенезе стволовых клеток костномозгового происхождения. Эти данные позволяют предположить, что пролиферирующие в интиме клетки, скорее всего, имеют костномозговую природу, а патогенез атеросклероза тесно связан с мобилизацией стволовых клеток из костного мозга в кровоток и их последующей миграцией в области повреждения интимы сосудов [Соболева Э.Л. 1994, Caplice N.M. et al.
2003, Sata M. 2003].
Расшифровка клеточных механизмов формирования атеросклеротических поражений остается нерешенной фундаментальной задачей современной биологии и медицины. Несмотря на значительные успехи в лечении сердечнососудистых заболеваний, они остаются главной причиной смертности в развитых странах. Выявление классических сердечно-сосудистых факторов риска (включая высокое кровяное давление, диабет и курение) играет ведущую роль в предотвращении заболевания. Тем не менее, многие индивидуумы, страдающие ишемической болезнью сердца (сужение просвета снабжающих сердце сосудов), имеют только один, а порой и ни одного из классических факторов риска. Поэтому необходимы новые биомаркеры, способные подтвердить традиционные индикаторы и пролить дополнительный свет на механизмы заболевания. Эти слова, опубликованные американскими учеными Gerszten R.E. и Wang T.J. в журнале Nature в 2008 году, как нельзя лучше подчеркивают актуальность и значимость работ, посвященных изучению механизмов развития стенозирующих процессов в стенке сосудов, а также важность поиска новых маркеров сердечно-сосудистых заболеваний.
Представленная работа посвящена актуальной проблеме современной медицины, а именно, вопросам изучения клеточных механизмов атеросклероза и проблемам выявления новых биомаркеров стенозирующих процессов в сосудах артериального русла человека.
Современное состояние исследований в данной области науки.
Накоплен значительный фактический материал, который касается участия тромбоцитов в развитии сердечно-сосудистых патологий (ишемической болезни сердца, нарушений мозгового кровообращения, патологий периферических сосудов). Trip M.D. с соавт. представили сведения о том, что спонтанная активация тромбоцитов является независимым фактором риска повторных инфарктов миокарда. Показано, что повышенная активность тромбоцитов увеличивает риск повторного инфаркта более чем в пять раз [Trip M.D. et al. 1990]. В многоцентровом исследовании, которое длилось более 6 лет, и в которое было включено более 3000 добровольцев, было показано, что спонтанная агрегация тромбоцитов является независимым фактором риска сердечно-сосудистых осложнений у здоровых людей. Это большое проспективное исследование, впервые проведенное на популяции здоровых индивидуумов, в котором параметры функциональной активности тромбоцитов изучались совместно с традиционными факторами риска, такими как, возраст, пол, уровень глюкозы крови, курение, повышенный уровень артериального давления крови и уровень липопротеидов высокой плотности [Breddin H.K. et al. 1996]. Эти и другие данные последних лет указывают на активное участие тромбоцитов в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний.
В последние годы появляются новые данные об участии в атерогенезе клоногенных клеток-предшественников. Начатые в группе Э.Л.Соболевой в 1986 году исследования позволили обнаружить в интиме атероматозной аорты человека не только терминальные клетки (Т-лимфоциты, моноциты/макрофаги, тучные клетки), но и стволовые колониеобразующие клетки костномозгового происхождения. В клональных тест-системах in vitro клетки, выделенные из интимы пораженных атероматозом сосудов, были способны формировать колонии различных линий дифференцировки. Такие колониеобразующие клетки (КОЕ) гемопоэтической линии формировали клеточные колонии-клоны моноцитов/макрофагов, лимфоцитов, тучных клеток, а КОЕ стромальной линии дифференцировки (КОЕ-ф) - колонии остеобластов, миофибробластов, адипоцитов [Соболева и соавт. 1986, Soboleva E.L. et al. 1994].
Обнаружение стромальных колониеобразующих клеток в интиме атероматозной аорты человека дает основание полагать, что атеросклероз является специфическим, но нежелательным проявлением единых механизмов регенерации тканей. Т.е. накопление костномозговых стволовых клеток и их пролиферацию в интиме можно рассматривать как стандартную реакцию костного мозга на очаги воспаления и/или липоидоза в сосудистой стенке, а фиброз интимы и последующий стеноз сосуда есть следствие изоляции этих очагов стромальными стволовыми клетками костного мозга. Эти выводы подтверждаются исследованиями тканей умерших больных женщин, ранее перенесших пересадку костного мозга мужчин. Было показано, что у этих женщин в интиме атероматозных аорт содержались производные мужских стромальных клеток, в то время как в здоровых сосудах они отсутствовали [Caplice N.M. et. al. 2003].
Мобилизация стромальных стволовых КОЕ-ф из костного мозга в кровоток и их последующая миграция в область повреждения должна сопровождаться увеличением их количества в периферическом кровотоке.
Однако, стромальные КОЕ-ф в периферической крови долгое время обнаружить не удавалось. Считалось, что стромальные стволовые клетки не способны циркулировать в крови, а так называемые региональные или ткань специфичные стволовые клетки полностью обеспечивают потребности отдельных тканей в материале для их восстановления. Впервые обнаружить в периферической крови человека клоногенные стромальные клетки позволило культивирование клеток мононуклеарной фракции, которые были выделены из крови пациентов с ИБС. Клональные тест-системы выявили в крови у пациентов с первичной гиперлипидемией и коронарным атеросклерозом наличие клоногенных клеток, которые in vitro формировали стромальные фибробластоподобные колонии. Клетки в этих колониях были способны синтезировать коллагеновый фибриллярный и/или остеоидный внеклеточный матрикс, а на своей поверхности экспрессировали остеонектин - неколагеновый белок костной ткани [Soboleva E.L. et al. 1994]. Увеличение в крови у пациентов с ИБС количества циркулирующих стволовых клеток-предшественников со стромальным фенотипом (когда содержание таких клеток в крови у здоровых людей и у пациентов с нестенозированными сосудами невелико) могло бы служить прогнозом наличия/развития стенозирующего атеросклеротического поражения. Однако, в настоящее время, отсутствуют как методики количественного анализа, так и единое понимание фенотипического описания таких клеток со стромальным фенотипом [He Q. et al. 2007]. Это делает проблему количественного определения и последующего клинического анализа диагностической значимости определения уровня циркулирующих стромальных клеток-предшественников нерешенной практической задачей.
Формирование склеротических бляшек, вызывая утолщение стенки и сужение просвета сосуда, со временем может вызывать дефицит кровоснабжения тканей и развитие клинических симптомов. Одним из эффективных и наиболее распространенных методов лечения стенозирующего поражения сосудов является ангиопластика - расширение стенозированного участка артерии с помощью катетера и установка в зону атероматозного повреждения специального стента. Такая процедура радикально улучшает проходимость сосуда и за счет армирования просвета с помощью стента способна предотвратить его схлопывание (recoil) после завершения эндоваскулярного вмешательства. Эффективность ангиопластики существенно возросла с внедрением в клиническую практику стентов со специальным лекарственным покрытием, уменьшающем развитие рестеноза (повторного сужения просвета сосуда в ранее стентированном сегменте). Подобные стенты обеспечивают локальную доставку лекарства, которое, воздействуя на клеточном уровне на миграцию/пролиферацию клеток, секрецию внеклеточного матрикса и воспаления, способствуют ингибированию утолщения интимы [Costa M.A. and Simon D.I. 2005]. Хотя внедрение в клиническую практику стентов с лекарственным покрытием и снизило частоту возникновения рестенозов, проблема их возникновения все же сохранилась.
Даже при использовании стентов, элюирующих такие вещества как сиролимус, паклитаксель или эверолимус, частота рестеноза внутри стента или по его краям составляет 5-9% и остается одной из важных проблем у пациентов, которые перенесли реваскуляризацию [Rensing B.J. et al. 2001, Morice M-C. et al. 2002, Sousa J.E. et al. 2005].
Стенозирующие поражения сосудов тесно связаны с защитной реакцией организма на воспаление, когда чрезмерный фибропролиферативный клеточный ответ приводит к сужению просвета сосуда. Последовательность биологических событий внутри стенки сосуда, которые происходят в процессе избыточного клеточного ответа, во всех случаях включает проникновение в субэндотелиальное пространство клеток гематогенного происхождения.
Профиль инфильтрации зон повреждения клетками воспаления (лимфоциты, моноциты, макрофаги, нейтрофилы и т.д.) определяет характер и динамику локального воспалительного процесса. Резюмируя вышесказанное, можно заключить, что в развитие стенозирующих процессов в стенках сосудов вовлекаются различные клеточные популяции (стромальные и гемопоэтические клетки-предшественники, тромбоциты, клетки воспаления). При разных способах реваскуляризации возможны существенные различия в механизмах развития стенозов, которые необходимо учитывать при поиске эффективных путей по предотвращению повторного сужения просвета сосуда. Пока не выявлены эти механизмы, невозможно делать какие-либо специфические рекомендации по предупреждению рестенозов. Специфическое воздействие на какие-либо клеточные пулы без учета их действительной роли в развитии приводящего к стенозированию сосуда воспалительного процесса может приводить в лучшем случае к неэффективной, а иногда даже и к вредной реакции.
Цель исследования. Изучение роли клеток крови (циркулирующих клеток-предшественников, тромбоцитов и эффекторных клеток воспаления) в патогенезе стенозирующих поражений сосудов.
Задачи исследования:
1. разработка методических подходов, позволяющих адекватно выявлять и анализировать роль тромбоцитов, циркулирующих клетокпредшественников и эффекторных клеток воспаления в развитии стенозирующих процессов в стенках сосудов;
2. исследование функциональной активности тромбоцитов и взаимодействия тромбоцитов с циркулирующими клеткамипредшественниками у пациентов со стенозирующими поражениями коронарных и периферических артерий;
3. изучение взаимосвязи уровня в крови циркулирующих клетокпредшественников со стромальным фенотипом с развитием стенозирующих поражений коронарных и периферических артерий;
4. оценка участия циркулирующих в крови пациентов со стенозирующими поражениями коронарных артерий клетокпредшественников и эффекторных клеток воспаления в развитии рестеноза пораженных участков артерий после имплантации внутрикоронарных стентов.
Научная новизна и практическая значимость работы. Расшифровка клеточных механизмов формирования атеросклеротических поражений остается нерешенной актуальной фундаментальной задачей биологии и медицины. Исследование роли клеток крови в развитии стенозирующих процессов внутри артерий, как атеросклеротической природы, так и после реваскуляризации тканей, позволит получить новые данные о механизмах развития этих процессов и внести коррективы в раннюю, недоступную другими методами диагностику, тактику предупреждения и лечения стенозирующих поражений сосудов. Современная диагностика атеросклероза включает комплекс как простых, так и сложных, дорогостоящих методов исследования:
анализы крови, нагрузочные тесты, мониторирование ЭКГ, эхокардиографию, ультразвуковую диагностику, сцинтиграфию миокарда, ангиографию сосудов.
Эти методы позволяют выявить клинически манифестирующие и зачастую терминальные изменения сосудов. При этом визуализация крупных атеросклеротических бляшек не отражает полной картины течения заболевания, в первую очередь активности протекающего процесса и прогноза развития патологии на ближайший период.
В настоящем исследовании показано, что повышение в крови содержания остеонектин-положительных клеток-предшественников может служить маркером наличия стенозирующего повреждения стенки сосуда, и дает основание к поиску его очага. Определение в крови уровня циркулирующих клеток-предшественников со стромальным фенотипом позволит дополнить спектр существующих методов высоко информативным анализом, отражающим динамику атеросклеротического репродуктивного воспалительного процесса.
Впервые обнаружено, что у пациентов с ИБС генерализованно повышена агрегационная активность тромбоцитов в ответ на воздействие низких доз целого ряда физиологических индукторов. При этом, тромбоциты, взаимодействуя с клетками-предшественниками способны участвовать в развитии стенозирующих процессов в сосудистой стенке.
Ряд экспериментальных фактов, впервые обнаруженных в настоящем исследовании, заставляет по-новому взглянуть на проблему внутристентового рестеноза. Выяснено, что рестеноз стентов является реакцией на повреждение сосуда, отличной от атероматоза. Рестеноз сопровождается развитием локальных воспалительных реакций в стенке сосуда. В этих реакциях активно участвуют эффекторные клетки воспаления, являющиеся мощными стимуляторами пролиферативной и синтетической активности локальных фибробластов. Нами показано, что при использовании стентов с лекарственным покрытием, в развитие рестенозов активно вовлекаются эозинофильные гранулоциты.
Практическая значимость исследования заключается в том, что ранняя диагностика наличия у пациентов стенозирующих поражений сосудов артериального русла может позволить предупредить или предотвратить развитие многих инвалидизирующих болезней и болезней со смертельным исходом: ИБС, атеросклеротическое поражение сосудов головного мозга, почечных артерий и других. Правильная и своевременная диагностика развития рестенозов позволит найти новые варианты предупреждения и лечения осложнений после реваскуляризации тканей. Внедрение разработанных в ходе выполнения работы научных результатов и диагностических методик возможно практически во всех амбулаторных и госпитальных медицинских учреждениях, а также организациях, занимающихся диспансеризацией больших групп населения.
Связь работы с научными темами и программами. Ряд исследований проводился в рамках тем НИР ФГУ РКНПК Росмедтехнологий №155 Роль циркулирующих стромальных клеток-предшественников и эффекторных клеток воспаления в развитии рестеноза стентов с лекарственным покрытием и №128 Циркулирующие костномозговые стромальные клетки и стенозирующий атеросклероз сосудов артериального русла человека, а также, грантов РФФИ № 05-04-48922-а Клеточно-молекулярные аспекты атерогенеза.
Роль мезенхимальных стволовых клеток костномозгового происхождения и вирусного инфицирования сосудистой стенки в атерогенезе и №08-04-01530-а Клеточно-молекулярные аспекты атеросклероза. Роль циркулирующих костномозговых стромальных стволовых клеток-предшественников в атерогенезе.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликована 33 научные работы (включая 4 патента) в рецензируемых отечественных и зарубежных изданиях. Результаты работы были доложены на 32 международных конгрессах и симпозиумах, в том числе, на следующих научных конференциях: Всероссийская научно-практическая конференция "Перспективы кардиологии в России в ХХI веке" г. Москва, 8 - 10 июня 20года, IV Всероссийская конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии, 4-6 февраля 2009 года;
Российский Национальный Конгресс Кардиологов Повышение качества и доступности кардиологической помощи, 7-9 октября 2008; Всероссийская научно-практическая конференция Прогресс кардиологии и снижение сердечно-сосудистой смертности, 2-4 июня 2008 г.; Москва; XIII Международная научно-практическая конференция Пожилой больной.
Качество жизни, 29сентября-1октября 2008, Москва; NATO Advanced Research Workshop УTranslational knowledge for heart healthФ May 12-16, 2008; 76rd Congress of the European Atherosclerosis Society, Helsinki, 2007; The World Congress of the International Academy of Cardiovascular Sciences, Sapporo, 2006;
XIV International Symposium on Atherosclerosis, Rome 2006; NATO Advanced Research Workshop УStress induced biochanges in the heartФ, February 2-7, Antalya, 2005; 74th Congress of the European Atherosclerosis Society, Seville, 2004; и т.д.
Материалы диссертации доложены на ученом совете ИЭК РКНПК Росмедтехнологий (Москва, 25 июня 2009 года).
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, разделов: Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение результатов, Выводы и Список литературы.
Работа изложена на 173 страницах и включает 22 рисунка и 8 таблиц. Список процитированной литературы содержит 368 источников.
КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Пациенты: В общей сложности обследовано 332 пациента, включая контрольную группу из 54 здоровых добровольцев.
Клиническое обследование пациентов включало регистрацию ЭКГ покоя, суточное мониторирование ЭКГ и в отдельных случаях АД, ультразвуковое исследование сердца и периферических артерий, радиоизотопные исследования, проведение пробы с физической нагрузкой на тредмиле или велоэргометре. При наличии показаний проводили ангиографическое исследование.
На первом этапе было проведено исследование функциональной активности тромбоцитов у 65 пациентов страдающих гипертонической болезнью 1-2 стадии. Средний возраст пациентов составлял 481.4 лет. По данным клинической картины, течения заболевания, результатам нагрузочных тестов и суточного мониторирования ЭКГ у 42 из 65 обследованных пациентов была выявлена ИБС различной степени тяжести. Контрольную группу составили 18 пациентов без ИБС с нормальными уровнями артериального давления (средний возраст 452 года). Все пациенты прекращали прием любых медикаментов за 7-14 дней до исследования агрегации тромбоцитов.
Для исследования взаимосвязи уровня в крови циркулирующих клетокпредшественников с развитием стенозирующих поражений коронарных и периферических артерий были обследованы 99 пациентов с критическими стенозирующими поражениями коронарных артерий, 28 пациентов с атеросклерозом периферических сосудов и 8 пациентов у которых было документировано отсутствие стенозирующих поражений аорты и её ветвей. Клиническое обследование всех пациентов включало запись ЭКГ в покое и при физической нагрузке на велоэргометре, суточное мониторирование ЭКГ, эхокардиографию, коронароангиографию. Части пациентов по показаниям проводили сцинтиграфию миокарда в покое и после индуцированной велоэргометрией ишемии миокарда. Течение заболевания, данные нагрузочных тестов и суточного мониторирования ЭКГ свидетельствовали о наличии у 99 пациентов коронарной недостаточности разной степени тяжести. Коронароангиография у всех этих пациентов с ИБС выявила критический стенозирующий атеросклероз как минимум двух коронарных артерий или их ветвей. У 8 пациентов отсутствие стенозирующих поражений аорты и её ветвей было документировано ультразвуковыми методами, коронарной ангиографией и радиоизотопной сцинтиграфией миокарда со стресс-тестом. В исследование не включали пациентов с хроническим гепатитом и заболеваниями почек, эндокринными патологиями, и почечной гипертонией. Пациенты с заболеваниями гастроинтерстициального тракта и респираторной системы, которые требовали непрерывной медикаментозной терапии также были исключены из исследования.
На протяжении всего исследования допускался прием больными антиангинальных и гипотензивных препаратов (нитратов, диуретиков, бетаблокаторов, ингибиторов АПФ и т.д.), аспирина и гипогликемических препаратов внутрь. Безопасность проводимой терапии осуществляли с помощью мониторирования активности печеночных ферментов - АСТ и АЛТ, а также КК. Повышение АСТ или АЛТ более чем в 3 раза, и/или КК более чем в 10 раз являлось основанием для прекращения приема препаратов.
Контрольную группу составили 19 здоровых добровольцев в возрасте 2149 лет, у которых ИБС был исключен по данным суточного мониторирования ЭКГ и велоэргометрией, а стенозирующий атеросклероз аорты и её ветвей ультразвуковыми методами.
Для оценки участия циркулирующих в крови клеток-предшественников и эффекторных клеток воспаления в развитии рестеноза артерий после имплантации пациентам со стенозирующими поражениями коронарных артерий стентов исследовали 40 пациентов с ИБС, которым проводили коронарное стентирование металлическими стентами. Кроме того, исследовали 38 пациентов с ИБС, которым проводили коронарное стентирование стентами с лекарственным покрытием.
В двухлетнее проспективное исследование были включены 40 пациентов с ИБС, которым по показаниям были имплантированы металлические стенты (Palmaz-Schatz stent, Johnson@Johnson International Systems). Кроме того, под наблюдением находилось 38 больных ишемической болезнью сердца (ИБС) обоего пола, которым в плановом порядке проводили коронарное стентирование стентами с лекарственным покрытием (Sypher stent, Cordis Corporation), которым в течение первого года от момента проведения эндоваскулярной реваскуляризации миокарда было в постгоспитальном периоде проведено повторное коронароангиографическое обследование.
Контрольную группу составили 17 практически здоровых добровольцев в возрасте 21-35 лет.
Стентирование осуществляли по стандартной методике. Использовались стенты, длина которых составляла 8-33 мм, а диаметр - 2,25-3,5 мм. Все пациенты перед стентированием получали аспирин 100 мг/д и клопидогрель мг/д (как минимум за 5 дней до вмешательства). Всем пациентам во время процедуры вмешательства болюсно вводили гепарин. Решение о назначении ингибиторов гликопротеиновых рецепторов IIb/IIIa принимали индивидуально с учетом противопоказаний к их применению. У всех пациентов на протяжении периода наблюдения проводили терапию аспирином 100 мг/д, клопидогрелем 75 мг/д, у части больных при наличии соответствующих показаний назначались антиангинальные или гипотензивные препараты, дозы которых оставались неизменными. Отсутствие ИБС у добровольцев подтверждено данными ЭКГ и велоэргометрии.
По прошествии 2, 6 и 12 месяцев после коронарного стентирования больные были обследованы повторно. Провели опрос больного, физикальное обследование, проведение общий и биохимический анализ крови, регистрацию ЭКГ в 12 стандартных отведениях, ультразвуковое исследование сердца, пробу с физической нагрузкой на тредмиле. При наличии показаний и получении информированного согласия, пациентам проводили повторное ангиографическое исследование и брали кровь для определения уровня циркулирующих в крови стромальных клеток-предшественников и полиморфноядерных лейкоцитов. Рестенозом считали возникновение стеноза в ранее стентированном сегменте (внутри стента и 5 мм дистальнее или проксимальнее стента), уменьшающего просвет коронарной артерии более 50% по диаметру. Проведено сопоставление уровня полиморфноядерных гранулоцитов крови, а также стромальных клеток-предшественников среди пациентов, у которых выявлено возникновение рестеноза и у больных, у которых рестеноза не было.
В исследование не включили пациентов в возрасте >75 лет, с нестабильной стенокардией, в первые 2 месяца после перенесенного инфаркта миокарда;
ранее перенесшие коронарное шунтирование; с возникновением рестеноза в анамнезе; у которых осуществлялась ангиопластика окклюзий коронарных артерий. Не включали пациентов с фракцией выброса левого желудочка <40%, застойной сердечной недостаточностью; с уровнем креатинина >180 мкмоль/л;
с содержанием эозинофилов крови >700 клеток/мкл, включая случаи вторичной эозинофилии при паразитарной инвазии, аллергической или воспалительной реакции, и злокачественных форм эозинофилии.
Рутинные лабораторные исследования включали общий и биохимический анализ крови, а также, определение в крови уровней общего холестерина, триглицеридов, ХС-ЛПНП, ХС-ЛПВП, Лп (а), высокочувствительного Среактивного белка.
Для изучения спонтанной и индуцированной низкими, пороговыми дозами индукторов агрегации тромбоцитов нами был разработан высокочувствительный метод исследования агрегации, основанный на анализе флуктуаций светопропускания, вызванных случайным изменением числа частиц в оптическом канале [Gabbasov Z.A. et al., 1989]. Относительная дисперсия таких флуктуаций пропорциональна среднему размеру агрегатов, что используется для исследования кинетики агрегации (Рисунок 1А).
Метод не имеет порога чувствительности и позволяет регистрировать образование агрегатов тромбоцитов даже в тех случаях, когда это оказывается невозможным традиционными методами (Рисунок 1Б).
А Б Рисунок 1. Кинетика изменения среднего размера агрегатов (А) и светопропускания суспензии тромбоцитов (Б) после добавления в образец обогащенной тромбоцитами плазмы пороговых доз индукторов агрегации.
Высокая чувствительность делает метод пригодным для исследования спонтанной агрегации и агрегации под действием очень низких, пороговых концентраций индукторов агрегации [Габбасов З.А. и соавт., 1989], а также агрегации субклеточных частиц [Tertov V.V. et al. 1989].
Поверхностные и внутриклеточные маркеры различных популяций клеток крови анализировались методом проточной цитофлуорометрии.
Исследование экспрессии клетками антигенов проводили в течение 2 часов после взятия крови. Для определения в крови количества CD34+ гемопоэтических стволовых клеток методом проточной цитометрии мы руководствовались протоколом ISHAGE (International Society of Hematotherapy and Graft Engineering) в котором для определения количества CD34+ гемопоэтических стволовых клеток рекомендуется использование четырех параметров: прямого и бокового рассеяния света, флуоресценции CD45-FITC и CD34-PE [Sutherland D.R. et. al., 1996]. Использовали меченые фикоэритрином моноклональные антитела к CD34 (CD34-РЕ, Caltag, США) и меченые флуоресцеинизотиоционатом моноклональные антитела к CD45 человека (CD45-FITC, Caltag, США). Стратегия верификации CD34+ стволовых клеток заключалась в логическом последовательном гейтировании накопленных событий (100000 для каждого образца) по их светорассеивающим свойствам и неяркой флуоресценции по CD45-FITC. На диаграммах зависимостей интенсивности бокового рассеяния света от прямого рассеяния, выделяли области (гейты), содержащие лимфоцитоподобные клетки. Далее, среди выделенной популяции клеток, по параметрам флуоресценции CD34-PE и CD45-FITC определяли клетки с невысокой, но положительной интенсивностью флуоресценции по CD45-FITC и положительной флуоресценцией по CD34-PE.
Рисунок 2. FACS-анализ ON-положительных клеток в периферической крови больного ИБС. А - выделение гейта лимфоцитоподобных клеток на диаграмме зависимости бокового рассеяния от прямого. Б - связывание FITC-меченых изотипических иммуноглобулинов с клетками лимфоцитарного гейта. В - связывание FITC-меченых антител к остеонектину с клетками лимфоцитарного гейта.
Такая процедура исключала из анализа нелизированные эритроциты, агрегаты тромбоцитов, дебриз и неспецифически окрашенные антителами к СD34 зрелые клетки.
Нами была разработана методика определения в крови количества циркулирующих клеток-предшественников со стромальным фенотипом. Для этого среди популяции лимфоцитоподобных клеток крови выделяли клетки, несущие на своей поверхности остенектин - неколлагеновый белок костной ткани, наличие которого на поверхности клеток является маркером остеогеной дифференцировки (Рисунок 2) [Габбасов и соавт., 2005].
Взаимодействие ядерных клеток крови с тромбоцитами изучали с помощью 3-х цветной проточной цитофлуориметрии с использованием комбинации антител: ON-FITC/CD41-PE/CD45-TC [Gabbasov Z.A. et al, 2007].
Для этого использовались меченые флуоресцеинизотиоционатом поликлональные кроличьи антитела к остеонектину человека (ИМТЕК, Россия), меченые фикоэритрином моноклональные антитела к CD41 (CD41-РЕ, Caltag, США) и меченые CY5-PE моноклональные антитела к CD45 человека (CD45TC, Beсton Dickinson, США). В контроле использовали соответствующие изотипические антитела (кроличьи Ig(G+A+M)-FITC, ИМТЕК, Россия, мышиные IgG1-PE и мышиные IgG1-TC, Beсton Dickinson, США).
огика гейтирования включала следующие последовательные шаги: на диаграмме зависимости бокового рассеяния света от прямого по параметрам светорассеяния выделяли гейт лимфоцитов (Гейт R2, Рисунок 3А). Далее, на другой диаграмме среди клеток этого лимфоцитарного гейта выделяли клетки, которые одновременно экспрессировали антигены CD41 и CD45 (Гейт R3, Рисунок 3Б). Среди CD41+/CD45+ клеток на графике зависимости бокового рассеяния света от интенсивности флуоресценции ON-FITC определяли количество ON-положительных клеток (Рисунок 3В).
Рисунок 3. FACS-анализ взаимодействия тромбоцитов с ON-положительными клетками периферической крови больного ИБС. А - выделение гейта лимфоцитоподобных клеток на диаграмме зависимости бокового рассеяния от прямого. Б - связывание антител к CD41 с CD45-положительными клетками лимфоцитарного гейта. В - связывание FITC-меченых антител к остеонектину с CD41+/CD45-положительными клетками лимфоцитарного гейта.
Для каждого образца крови проводили контроль связывания изотипических иммуноглобулинов с CD41+/CD45-положительными клетками лимфоцитарного гейта.
Для определения уровня эозинофилов в периферической крови мы использовали разработанную нами двухплатформенную методику выявления и определения количества эозинофилов, в которой общее количество лейкоцитов крови определяли с помощью гематологического анализатора, а клеточный состав фракций CD45-положительных лейкоцитов определяли методами проточной цитофлуориметрии [Gabbasov Z.A. et al, 2009]. Для этого выполняли следующее:
1. С помощью автоматического гематологического анализатора Cell-Dyn 3500В определяли общее количество лейкоцитов в исследуемой пробе крови.
2. В той же пробе крови с помощью проточного цитофлуориметра FACS Calibur по параметрам светорассеяния клеток, связыванию клеток с CD45 и активной автофлуоресценции определяли процентное содержание CD45положительных эозинофилов с высоким уровнем автофлуоресценции по флуоресцентному каналу FL-1.
3. По данным этих двух измерений вычисляли концентрацию эозинофильных гранулоцитов в крови в 1/мкл.
Количество нейтрофильных и базофильных гранулоцитов в крови определяли по стандартным методикам.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Агрегация тромбоцитов при ИБС. У больных с артериальной гипертонией при ИБС агрегационная активность тромбоцитов оказывается генерализованно повышенной. Это выражалось в усилении у пациентов с ИБС и гипертонической болезнью (ГБ) спонтанной агрегации и агрегации тромбоцитов в ответ на малые дозы нескольких (АДФ, U46619, ФАТ, серотонин) индукторов агрегации в сравнении с группой пациентов с гипертонической болезнью без ИБС. У пациентов с ГБ без признаков ишемии миокарда в сравнении со здоровыми добровольцами была слегка, но достоверно повышена только спонтанная агрегация и агрегация в ответ на низкие дозы АДФ (Рисунок 4).
Достоверные различия в активности тромбоцитов наблюдались только при спонтанной агрегации и при активации тромбоцитов низкими дозами индукторов. При воздействии на тромбоциты высоких дозах индукторов агрегации аналогичных различий между группами пациентов мы не обнаружили. Например, при воздействии на тромбоциты 5 мкМ АДФ или 0.мкМ U46619 размер агрегатов составлял 12.11.9 против 11.31.1 отн.ед.
(p>0.1) и 12.51.7 против 11.40.8 отн.ед. (p>0.1) в группе пациентов с ГБ и ИБС против группы пациентов только с ГБ. При этом, обе группы пациентов не различались по возрасту, длительности заболевания гипертонией, уровнями диастолического и систолического артериального давления, массе миокарда левого желудочка и обследованным биохимическим показателям крови, включая уровни холестерина и триглицеридов крови.
Рисунок 4. Спонтанная агрегация тромбоцитов и агрегация в ответ на воздействие малых доз индукторов в контрольной группе здоровых добровольцев (n=18), пациентов с гипертонической болезнью при отсутствии (n=23) и наличии (n=43) у них ишемической болезни сердца. 1 - спонтанная агрегация, 2 - 0.5 мкМ АДФ, 3 - 0.1 мкМ U46619, 4 - 10 нМ ФАТ, 5 мкМ серотонина. * - p<0.05 в сравнении с контрольной группой. # - p<0.05 в сравнении с группой пациентов с ГБ без ИБС.
Линейный регрессионный анализ не выявил достоверных корреляционных взаимосвязей между параметрами агрегации и уровнем систолического давления, длительностью заболевания, уровнем холестерина крови. Была обнаружена слабая корреляционная связь между уровнем диастолического давления, возрастом пациентов и агрегацией тромбоцитов.
Кроме того, была выявлена слабая, но достоверная положительная корреляционная связь уровня спонтанной агрегации и агрегации тромбоцитов в ответ на воздействие малых доз АДФ, ФАТ и серотонина с массой миокарда левого желудочка. Наиболее сильная связь ММЛЖ обнаруживается с агрегацией тромбоцитов в ответ на 0.1 мкМ U46619 (Таблица 1).
Таблица 1. Корреляция между массой миокарда левого желудочка у пациентов с ГБ и параметрами агрегации тромбоцитов после воздействия различных активаторов.
Параметры n r p ММЛЖ - спонтанная агрегация 65 0.39 <0.0ММЛЖ - АДФ (0.5 мкМ) 65 0.26 <0.ММЛЖ - АДФ (5 мкМ) 65 0.10 >0.ММЛЖ - ФАТ (10 нМ) 65 0.30 <0.ММЛЖ - серотонин (5 мкМ) 65 0.34 <0.ММЛЖ - U46619 (0.5 мкМ) 41 0.17 >0.ММЛЖ - U46619 (0.1 мкМ) 41 0.66 <0.0Степень агрегации тромбоцитов в ответ на 0.1 мкМ U46619 различалась двух группах пациентов, которые различались массой миокарда ЛЖ. Агрегация тромбоцитов в ответ на U46619 у пациентов с выраженной гипертрофией миокарда ЛЖ (ММЛЖ>200g) была значительно повышена в сравнении агрегацией у пациентов без выраженной гипертрофии МЛЖ (ММЛЖ<200g) и здоровых добровольцев (5.60.6 отн.ед., 3.10.4 отн.ед. и 2.20.2 отн.ед.
соответственно, p<0.05). Многофакторный анализ, в который были включены уровни артериального давления, возраст, уровни холестерина крови, индекс массы тела, масса миокарда левого желудочка показал, что степень агрегации тромбоцитов в ответ 0.1 мкМ U46619 независимо и достоверно коррелирует с массой миокарда левого желудочка у пациентов с ГБ.
ИБС и циркулирующие клетки-предшественники. Были обследованы 99 пациентов с ишемической болезнью сердца и 28 пациентов со стенозирующими поражениями периферических артерий. Контрольная группа состояла из 8 пациентов с непораженными сосудами артериального русла.
Характеристика исследуемой популяции пациентов приведена в таблице 2.
Таблица 2. Характеристика пациентов со стенозирующими поражениями коронарных артерий, пациентов со стенозирующими поражениями периферических артерий и пациентов с нестенозированными артериями.
Пациенты со Пациенты со Пациенты с стенозами стенозами нестенозирован p коронарных периферических ными артериями артерий (n=99) артерий (n=28) (n=8) Возраст, лет 58 (50, 65) 50 (40,57) 55 (42, 58) 0.Пол (м/ж) 85/14 18/10 6/2 0.Холестерин, 5.1 (4.4, 5.9) 5.4 (4.9, 6.3) 5.6 (5.2, 6.2) 0.ммоль/л Триглицериды, 1.58 (1.16, 2.50) 1.84 (1.13, 2.11) 1.61 (0.82, 4.00) 0.ммоль/л ЛПНП, ммоль/л 3.05 (2.23, 4.38) 3.39 (2.84, 4.31) 2.98 (2.61, 3.35) 0.ЛПВП, ммоль/л 1.23 (1.01, 1.45) 1.24 (1.01, 1.63) 1.31 (1.16, 1.72) 0.Мочевая к-та, 392 (331, 447) 363 (303, 421) 307 (283, 397) 0.мкмоль/л Гипертония 47/99 19/28 5/8 0.Диабет 13/99 2/28 1/8 0.Коронарная ангиография выявила у всех 99 пациентов с ИБС критическое поражение как минимум двух коронарных артерий. Методом ультразвукового дуплексного сканирования гемодинамически значимый (более 50%) стеноз брахиоцефальных артерий и/или артерий нижних конечностей был выявлен у 28 пациентов. В контрольной группе из 8 пациентов клиническое обследование не выявило стенозирующих поражений коронарных или периферических артерий.
Количество стволовых гемопоэтических клеток-предшественников в периферической крови относительно невелико и обычно составляет 0.01-0.1% от общего числа ядерных клеток. В нашем исследовании количество CD34+ гемопоэтических клеток-предшественников у пациентов с ИБС составляло 0.0400.006% и достоверно не отличалось от их количества у здоровых добровольцев (0.0310.004%,
0.1).Мы исследовали различия в уровне ON-положительных клеток в крови пациентов и здоровых добровольцев среди различных субпопуляций CD45положительных клеток (лимфоциты, моноциты, гранулоциты). Обнаружено, что в сравнении с контрольной группой у больных ИБС содержание ON+ клеток достоверно повышено в популяции лимфоцитоподобных клеток.
Наиболее значимые различия между группами пациентов со стенозирующими поражениями артерий и с нестенозированными артериями были обнаружены в пуле CD41+/CD45+ клеток. У больных ИБС процент таких ON+/CD41+ клеток составлял 0.86о/о (0.62, 1.26) и был значительно выше, чем у здоровых добровольцев (0.26% (0.36, 0.17), p<0.0001) и пациентов с нестенозированными артериями (0.23% (0.29, 0.21), p<0.0001, Рисунок 5).
Количество CD41+/CD45+ клеток отражает наличие в образцах крови лимфоцитарно-тромбоцитарных конгломератов. Количество таких CD41+/CD45+ лимфоцитов, способных связывать тромбоциты, в крови больных ИБС [3800 (2350, 5800)] достоверно не отличалось от их количества в контрольной группе у пациентов с нестенозированными артериями [4315 (3570, 5200), p=0.78] и здоровых добровольцев [3650 (2500, 5500), p=0.61]. В крови добровольцев и пациентов с нестенозированными артериями содержался очень малый процент лимфоцитоподобных ON-положительных клеток. Количество этих ON+ клеток у пациентов с нестенозированными артериями [0.25% (0.20, 0.30)] достоверно не отличалось от их количества у здоровых добровольцев [0.27% (0.17, 0.36), p=0.94].
Рисунок 5. Количество ON-положительных лимфоцитоподобных клеток с CDпозитивностью у практически здоровых добровольцев, пациентов с нестенозированными артериями и больных ИБС. 1 - добровольцы (n=19), 2 - пациенты с нестенозированными артериями (n=8), 3 - больные ИБС (n=99).
p1,2 = 0.94, p1,3 <0.0001, p2,3 < 0.0001, MannЦWhitney U test.
Неспецифическое связывание клеток с изотипическими иммуноглобулинами было на уровне 2-4 клеток на 100,000, что соответствовало 0.08 (0.06, 0.11) процентам от количества лимфоцитарно-тромбоцитарных конгломератов. В 5 случаях из 19 у здоровых добровольцев процент ON+ клеток был сравним с уровнем связывания клеток с изотипическими иммуноглобулинами. В этих случаях мы не могли уверенно констатировать факт наличия ON-положительных клеток в крови у добровольцев.
Методом ультразвукового дуплексного сканирования гемодинамически значимый (более 50%) стеноз брахиоцефальных артерий и/или артерий нижних конечностей был выявлен у 43 пациентов (43%) из группы с ИБС (пациентов). В группе пациентов со стенозирующими поражениями периферических артерий коронарная ангиография ни у одного из обследованных пациентов не выявила наличия стенозирующих поражений коронарных артерий.
Рисунок 6. Количество ON-положительных лимфоцитоподобных клеток с CD41 позитивностью у индивидуумов с нестенозированными артериями, пациентов с ИБС и пациентов с атеросклерозом периферических артерий. 1 - пациенты с нестенозированными артериями (n=23), 2 - пациенты со стенозирующими поражениями коронарных артерий (n=99), 3 - пациенты со стенозирующими поражениями периферических артерий (n=28).
p1,2 <0.0001, p1,3 < 0.0001, p2,3 = 0.14, MannЦWhitney U тест.
Содержание ON+/CD41+ клеток в группе пациентов с атеросклерозом периферических артерий составляло 0.68% (0.53, 0.90) и было достоверно выше, чем у индивидуумов с нестенозированными артериями 0.25% (0.20, 0.30) (p<0.0001). Одновременно это значение существенно не отличалось от уровня таких клеток у пациентов с ИБС (p=0.15, Рисунок 6).
Уровень лимфоцитоподобных ON+/CD41+ клеток в крови у пациентов с ИБС, но без ГБ и сахарного диабета составлял 0.87% (0.68, 1.20) и не отличался от уровня таких клеток у пациентов ИБС с ГБ без диабета и у пациентов с ИБС, ГБ и диабетом, у которых он был 0.91% (0.60, 1.24) и 0.87% (0.59, 1.09) соответственно (p = 0.91, Рисунок 7).
Рисунок 7. Количество ON-положительных лимфоцитоподобных клеток с CDпозитивностью у пациентов с ИБС без ГБ и диабета, у пациентов с ИБС и ГБ без диабета и у пациентов с ИБС с ГБ и диабетом. 1 - пациенты с ИБС без ГБ и диабета (n = 52); 2 - пациенты с ИБС и ГБ без диабета (n = 34); 3 - пациенты с ИБС с ГБ и диабетом (n = 13). p = 0.91, KruskalЦWallis тест.
Диагностическая значимость определения в крови уровня ON+ клеток. Анализ взаимосвязи уровня циркулирующих в крови ON+ клеток с наличием у пациентов стенозирующих поражений сосудов показал, что прогностическая ценность определения в крови количества остеонектинположительных клеток с СD41-позитивностью значительно выше прогностической ценности определения общего количества остеонектинположительных клеток (94% против 71%, n=150). Факты наличия взаимосвязи наличия у пациентов стенозирующих поражений с уровнем циркулирующих ON+/CD41+ клеток, а также обнаруженное при ИБС генерализованное повышение агрегационной активности тромбоцитов позволяют утверждать, что тромбоциты активно участвуют в развитии стенозирующих процессов в стенке сосудов.
Таблица 4. Уровни значимости различий в количестве ON+/CD41+ клеток и некоторых факторов риска у пациентов с наличием атеросклеротических поражений коронарных и периферических артерий, пациентов без стенозирующих поражений сосудов и здоровых добровольцев (n=150).
Показатель p Уровень ON+/CD41+ клеток <0.00Возраст <0.00Индекс массы тела <0.00СРБ 0.00ТГ 0.00Лп (а) 0.00Холестерин 0.0ХС-ЛПНП >0.ХС-ЛПВП >0.Многофакторный анализ, в который кроме уровня в крови лимфоцитоподобных ON+/CD41+ клеток были включены основные факторы риска атеросклероза, показал, что уровень в крови таких остеонектинположительных клеток является независимым и одним из наиболее значимых факторов, способным предсказать наличие у пациента стенозирующих атеросклеротических поражений сосудов артериального русла (Таблица 4).
Рестеноз после внутрикоронарной установки металлических стентов.
В двухлетнее проспективное исследование были включены 40 пациентов с ИБС, которым по показаниям были имплантированы металлические стенты.
Целью исследования была оценка прогностической ценности определения таких параметров как, спонтанная и индуцированная агрегация тромбоцитов, уровень в крови фактора вон Виллебранда, активность ингибитора активатора плазминогена, активность тканевого активатора плазминогена, уровень антигена урокиназного активатора плазминогена, количество рецепторов урокиназного активатора плазминогена, уровень С-реактивного белка в плазме крови у пациентов со стабильной стенокардией после успешной процедуры внутрикоронарного стентирования (Palmaz-Schatz stent, Johnson@Johnson International Systems). Контрольное клиническое обследование проводилось через 12 месяцев после стентирования (с запланированным сроком наблюдения до 2 лет). Кумулятивная частота событий (возобновление клинических симптомов и/или возникновение инфаркта миокарда) была 22% (9 пациентов).
Основные факторы риска (возраст, наличие гипертонии, гиперлипидемии, курение и избыточный вес) достоверно не отличались у групп пациентов с наличием (группа Ус рестенозомФ) и без сердечно-сосудистых событий (группа Убез рестенозаФ.
Все анализируемые параметры определялись у пациентов перед процедурой реваскуляризации.
Рисунок 8. Предпроцедурная спонтанная агрегация и агрегация тромбоцитов в ответ на малые (0.5 мкМ) и большие (5 мкМ) дозы АДФ в контрольной группе здоровых добровольцев и в группах пациентов со стабильной стенокардией с сердечно-сосудистыми событиями (группа Рестеноз) и без сердечнососудистых событий (группа Без рестеноза) в течении 12 месяцев после успешной реваскуляризации.
Мы не обнаружили каких-либо различий в АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов у пациентов с ИБС с рестенозом и без него (Рисунок 8).
Предпроцедурный уровень спонтанной агрегации тромбоцитов у пациентов с ИБС был значительно выше, чем у здоровых добровольцев. Однако значительных различий в уровне спонтанной агрегации тромбоцитов у пациентов с сердечно-сосудистыми событиями и без них обнаружено не было.
Аналогичные результаты были получены при анализе уровня vWF. Уровень vWF у пациентов был значительно повышен в сравнении с контрольной группой. Однако, значительных различий в уровне vWF у пациентов с сердечно-сосудистыми событиями и без них также выявлено не было. В группе пациентов с сердечно-сосудистыми событиями в сравнении с группой без событий в плазме крови был значительно и достоверно повышен уровень Среактивного белка (17.85.1 против 5.51.4, p<0.05).
Тот факт, что степень спонтанной агрегации тромбоцитов и уровень vWF сохраняются одинаково высокими и не различается в группах с рестенозом и без него, позволяет заключить, что взаимодействие имплантированных стентов с циркулирующими активированными тромбоцитами (в том числе через посредство или через дополнительное участие фактора vWF), не способно значительно воздействовать на процессы развития сердечно-сосудистых событий у пациентов со стабильной стенокардией. Полученные результаты указывают на возможную роль воспалительных процессов в развитии сердечнососудистых событий после имплантации пациентам металлических стентов.
Увеличенное содержание предпроцедурных уровней СРБ в группе пациентов с сердечно-сосудистыми событиями может не только указывать на возможную прогностическую ценность этого показателя, но и подчеркивает роль системного воспаления в развитии неблагоприятных исходов после реваскуляризации.
Внутристентовый рестеноз после установки стентов с лекарственным пкрытием. Из 55 больных, вошедших в исследование, 38 пациентам были имплантированы 59 стентов покрытых рапамицином (в среднем 1,6 стента у больного). По результатам повторного ангиографического обследования, проведенного через 6-12 месяцев после коронарного стентирования, больные были разбиты на 2 группы. В 1 группу вошли 23 пациента, у которых не было выявлено рестеноза. Во 2 группу вошли 15 пациентов, у которых отмечено возникновение рестеноза, по крайней мере, 1 стента. Рестенозом считали возникновение стеноза в ранее стентированном сегменте (внутри стента и 5 мм дистальнее или проксимальнее стента), уменьшающего просвет коронарной артерии более 50% по диаметру. Клиническая характеристика больных, вошедших в исследование, представлена в таблице 6.
Таблица 6. Клиническая характеристика больных.
Пациенты без Пациенты с Показатель p рестеноза (n=23) рестенозом (n=15) Возраст (лет) 61 (56, 68) 57 (48, 64) 0.Мужчины/женщины 19 (83%)/4 (17%) 14 (93%)/1 (7%) 0.ИМ в анамнезе 12 (52%) 9 (60%) 0.Артериальная гипертония 21 (91%) 12 (80%) 0.Гиперлипидемия 23 (100%) 15 (100%) 1.Курение 10 (43%) 8 (53%) 0.Сахарный диабет 9 (39%) 1 (7%) 0.1 МКА 7 (30%) 4 (27%) 1.2 МКА 10 (44%) 7 (47%) 1.3 МКА 6 (26%) 4 (27%) 1.Примечание. МКА - магистральная коронарная артерия; n - количество пациентов.
Пациенты в группах не отличались по возрасту, полу, соотношению курящих и некурящих, а также наличию гиперлипидемии (ГЛП). Равное количество пациентов имели постинфарктный кардиосклероз, артериальную гипертонию и сахарный диабет (СД). Одинаково часто встречалось поражение 1-3 магистральных коронарных артерий (МКА).
Ангиографическая характеристика представлена в таблице 7. У больных обеих групп одинаково часто осуществляли стентирование передней нисходящей артерии (ПНА), огибающей артерии (ОА) и правой коронарной артерии (ПКА), протяженных (20 мм) стенозов, артерий малого (2,75) диаметра, бифуркационных стенозов, а также одновременное стентирование > МКА. В обеих группах больных одинаково часто встречался тип С поражения коронарных артерий.
Таблица 7. Ангиографическая характеристика больных.
Пациенты без Пациенты с Показатель p рестеноза (n=36) рестенозом (n=23) ПНА 15 (42%) 9 (39%) 1.ОА 9 (25%) 4 (17%) 0.ПКА 12 (33%) 10 (44%) 0.Протяженность стеноза 4 (11%) 3 (13%) 1.мм Диаметр артерии 2,75 мм 9 (25%) 8 (35%) 0.Бифуркационный стеноз 7 (19%) 5 (21%) 1.Тип С 12 (33%) 9 (39%) 0.Имплантация >1 стента 11 (31%) 8 (35%) 0.Примечание. ПНА - передняя нисходящая артерия; ОА - огибающая артерия; ПКА - правая коронарная артерия; n - количество стентов.
Уровень остеонектин-положительных лимфоцитоподобных клеток в крови у пациентов с ИБС был достоверно выше, чем у здоровых добровольцев и составлял 2.5 (1.8, 3.9) против 1.5 (1.0, 1.9) клеток в мкл (p=0.004). В группах больных ИБС с рестенозом и без него уровень этих клеток был 2.4 (1.7, 3.2) и 2.5 (1.9, 4.1) клеток в мкл соответственно. Количество остеонектинположительных клеток в обоих случаях было выше, чем у здоровых добровольцев (p<0.01), без значимых различий между группами (p=0.59). У больных обеих групп не выявлено различий и в количестве нейтрофильных и базофильных гранулоцитов крови. Количество эозинофильных гранулоцитов в крови пациентов с рестенозом статистически значимо выше, чем в крови у пациентов без рестеноза и составило соответственно 262 (222, 285) против 1(89, 158) клеток в мкл (p<0.001). Сравнение количества полиморфноядерных гранулоцитов у пациентов и у здоровых добровольцев показало, что количество эозинофилов у пациентов с рестенозом и без рестеноза статистически значимо выше, чем у добровольцев. Медианы распределений составили 262 (222, 285) и 139 (89, 158) клеток в мкл соответственно против 56 (31, 86) у здоровых добровольцев, p<0.001 (Рис. 9).
Рис. 9. Уровни эозинофильных гранулоцитов крови здоровых добровольцев, больных не имевших рестеноза, а также пациентов у которых было выявлено возникновение рестеноза после установки стентов с лекарственным покрытием. 1 - здоровые добровольцы (n=17); 2 - пациенты без рестеноза (n=23); 3 - пациенты с рестенозом стентов (n=15). Kruskal-Wallis ANOVA by Ranks, p < 0.001.
Анализ распределений числа пациентов и здоровых по количеству эозинофилов в крови показал, что у практически здоровых добровольцев распределение имеет одномодальный характер близкий к нормальному распределению (p=0.35, Рис. 10А). У больных с ИБС после стентирования выявлено бимодальное распределение пациентов по содержанию в крови эозинофилов (p=0.02, Рис. 10Б). Это указывает на то, что этих пациентов можно разделить на две относительно самостоятельные группы. Медиана этого бимодального распределения составила 172 клетки в мкл. Количество эозинофилов в крови у здоровых добровольцев варьировало в пределах 12 - 1 клетки в мкл и не превысило медиану распределения у пациентов с ИБС (1клетки в мкл).
А Б Рис. 10. Гистограммы частот распределения количества эозинофилов в периферической крови здоровых добровольцев (А) и в крови пациентов после интракоронарного стентирования (Б).
По уровню эозинофилов периферической крови пациенты, подвергшиеся коронарному стентированию, были разделены на две группы - больные с уровнем эозинофилов в крови ниже медианы распределения (<172 в мкл, n=19) и пациенты с уровнем эозинофилов в крови выше медианы (>172 в мкл, n=19).
Между этими группами не выявлено достоверных различий в возрасте, поле, наличии ГЛП, гипертонии, СД и в основных ангиографических характеристиках стенозов. В то же время, в группе с более низким уровнем эозинофилов крови (ниже уровня медианы распределения) рестенозы выявлены только у 1 (5% случаев) пациента, в то время как во второй группе у пациентов (74% случаев) (p<0.001).
Анализ частоты рестенозов у пациентов, разделенных по четырем квартилям в зависимости от количества эозинофилов, выявил статистически значимое различие в частоте рестенозов в этих четырех группах пациентов.
Если в первой квартили рестенозы у пациентов не наблюдались вовсе, то во второй и третьей квартилях с увеличением количества эозинофилов крови частота возникновения рестенозов последовательно повышалась от 10% до 70%, достигнув в четвертой квартили величины в 78 % (p<0.001, Рис. 11).
112Квартили Рис. 11. Частота возникновения рестенозов в различных группах пациентов в зависимости от количества эозинофилов периферической крови (n=38).
1 - первая квартиль (количество эозинофилов < 101 в мкл, n=9);
2 - вторая квартиль (101 в мкл < количество эозинофилов < 172 в мкл, n=10);
3 - третья квартиль (172 в мкл < количеством эозинофилов < 258 в мкл, n=10);
4 - четвертая квартиль (количество эозинофилов > 258 в мкл, n=9).
Kruskal-Wallis ANOVA by Ranks, p < 0.0Развитие стенозирующего поражения сосуда при рестенозе стентов тесно связано с защитной реакцией организма на воспаление, когда попытка локализации зоны воспаления приводит к чрезмерному, приводящему к сужению просвета сосуда, фибропролиферативному клеточному ответу.
Последовательность биологических событий внутри стенки сосуда, которые происходят в процессе избыточного клеточного ответа, во всех случаях включает проникновение в субэндотелиальное пространство клеток гематогенного происхождения. Обнаружено, что при баллонной ангиопластике ведущую роль в развитии местной воспалительной реакции играют нейтрофилы [Welt FG, et al, 2000]. После установки в зону повреждения металлических стентов к развитию локального воспалительного процесса подключаются клетки моноцитарно/макрофогального ряда, которые в этом случае начинают играть доминирующую роль в развитии локального Частота рестенозов (%) воспалительного процесса [Horvath C, et al, 2002]. Наши исследования показали, что при использовании стентов с лекарственным покрытием в процесс развития рестеноза оказывается вовлеченной ещё одна популяция эффекторных клеток, а именно, пул эозинофильных гранулоцитов. Эти данные говорят о том, что, несмотря на схожие по своей природе общие механизмы клеточных ответов разные методы реваскуляризации сопровождаются вовлечением в процессы заживления различных популяций клеток воспаления.
Наше предположение о том, что после разных эндоваскулярных процедур в заживлении стенки сосуда могут участвовать разные популяции эффекторных клеток воспаления можно проиллюстрировать следующей схемой (Рисунок 12).
Баллонная дилатация Нейтрофилы Установка металлического Моноциты/макрофаги стента Установка стента с лекарственным покрытием Эозинофилы Рисунок 12. Участие эффекторных клеток воспаления в развитии локальных воспалительных реакций после различных эндоваскулярных процедур. При баллонной ангиопластике ведущую роль в развитии местной воспалительной реакции играют нейтрофилы (Welt FG, et al, 2000). После установки в зону повреждения металлических стентов к развитию воспалительного процесса подключаются клетки моноцитарно/макрофогального ряда, которые начинают играть доминирующую роль в развитии рестеноза стентов (Kawamoto R et al, 2006, Horvath C, et al, 2002). При использовании стентов с лекарственным покрытием в процесс возникновения рестеноза активно вовлекаются эозинофилы (Gabbasov Z.A. et al. 2009).
Мы полагаем, что при поиске эффективных путей по предотвращению повторного сужения просвета сосуда необходимо учитывать наличие существенных различий в клеточных механизмах развития локальных воспалительных реакций после разных методов реваскуляризации (в первую очередь различий после установки в зону повреждения сосуда металлического стента или стента с лекарственным покрытием). Специфическое воздействие на какие-либо клеточные пулы без учета их действительной роли в развитии воспалительного процесса может приводить к неэффективной, а в некоторых случаях даже и к вредной реакции.
Эозинофильные гранулоциты являются популяцией эффекторных иммунокомпетентных клеток, которые циркулируют в крови несколько часов, а затем мигрируют в ткани. Это клетки, в которых сочетаются, как важные для организма защитные функции, так и повреждающие эффекты по отношению к эндотелию сосудов и эндокарду. Эозинофилы обладают рядом уникальных свойств, которые могут обусловливать их важную роль в инициации и развитии хронического рестеноза и тромбоза после установки стентов с лекарственными покрытиями. Потенциальная способность эозинофилов инициировать клеточную иммунную реакцию (в первую очередь их способность действовать в качестве профессиональных антигенпрезентирующих клеток) открывает возможности использования их функциональных свойств и характеристик в качестве диагностического инструментария и/или мишени при поиске методов терапевтического подавления развития локальных воспалительных реакций.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Предложены оригинальные методы анализа различных популяций клеток крови, которые включают иммунофлуоресцентный метод фенотипирования клеток-предшественников со стромальным фенотипом, метод анализа взаимодействия циркулирующих клеток-предшественников с тромбоцитами, высокочувствительный метод анализа агрегационной активности тромбоцитов и высокоточный двухплатформенный метод определения в крови уровня эозинофильных гранулоцитов. В ходе проведенных исследований благодаря использованию разработанных методик было показано, что повышение в крови содержания остеонектин-положительных клеток-предшественников может служить маркером наличия стенозирующего поражения сосудистой стенки, и дает основание к поиску его очага. Обнаружено, что пороговая агрегационная активность тромбоцитов генерализованно повышена у пациентов с ИБС.
Показано, что появление в кровотоке комплексов тромбоцитов с клетками предшественниками является независимым и одним из наиболее значимых признаков наличия стенозирующих поражений артерий. Выяснено, что рестеноз стентов является реакцией на повреждение стенки сосуда, отличной от атероматоза. Показано, что при использовании стентов с лекарственным покрытием в развитии рестенозов активно вовлекаются эозинофилы, которые являющиеся стимуляторами пролиферативной и синтетической активности локальных фибробластов.
ВЫВОДЫ 1. Применение новых, уникальных методов определения в крови уровня циркулирующих лимфоцитоподобных остеонектин-положительных клеток, методики оценки взаимодействия циркулирующих клеток со стромальным фенотипом с тромбоцитами, высокочувствительного метода анализа агрегации тромбоцитов, оригинального двухплатформенного метода определения в крови уровня эозинофильных гранулоцитов позволило получить принципиально новые данные об участии клеток крови в патогенезе стенозирующих поражений сосудов артериального русла человека.
2. Обнаружено, что у пациентов с ишемической болезнью сердца уровень остеонектин-положительных клеток значительно выше, чем у здоровых добровольцев и пациентов с нестенозированными артериями. Уровень повышения не зависит от локализации атерсклеротических поражений (коронарные или периферические артерии) и наличия у пациентов сахарного диабета и/или гипертонической болезни.
3. Показано, что уровень в крови стенектин-положительных клеток может служить маркером наличия стенозирующих повреждений сосудистой стенки.
4. Обнаружено, что у пациентов с ишемической болезнью сердца генерализованно повышена функциональная активность тромбоцитов, что выражается в усилении спонтанной агрегации и агрегации в ответ на малые дозы ряда индукторов (0.5 мкМ АДФ, 0.1 мкМ U46619, 10 нМ ФАТ и 5 мкМ серотонина).
5. Уровень повышения агрегационной активности тромбоцитов в большей степени зависит от наличия ишемической болезни сердца, чем от наличия артериальной гипертонии, сахарного диабета или параметров липидов крови.
6. Многофакторный анализ показал, что уровень в крови остеонектинположительных клеток с СD41-позитивностью является независимым и одним из наиболее значимых факторов, способным предсказать наличие у пациента стенозирующих атеросклеротических поражений сосудов артериального русла.
7. При выявлении у пациентов стенозирующих поражений сосудов артериального русла прогностическая ценность определения в крови количества остеонектин-положительных клеток с СD41-позитивностью (способных связывать тромбоциты) составляет 94% и значительно превышает прогностическую ценность определения общего количества остеонектин-положительных клеток (71%, n=150).
8. Уровень циркулирующих в крови у пациентов остеонектинположительных клеток после установки им стентов с лекарственным покрытием повышен в сравнении с уровнем у здоровых добровольцев, однако не отличается у пациентов с рестенозом и без рестеноза установленных стентов.
9. При использовании стентов с лекарственным покрытием в развитие рестенозов активно вовлекаются эозинофилы. Показано, что в группе пациентов с более низким уровнем эозинофилов крови (ниже уровня медианы распределения) рестенозы выявляются только в 5% случаев, в то время как в группе с повышенным уровнем эозинофилов крови у 74% пациентов (p<0.001).
СПИСОК СТАТЕЙ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Gabbasov ZA, Kozlov SG, Ljakishev AA, Saburova OS, Smirnov VA, Smirnov VN. Polymorphonuclear blood leukocytes and restenosis after intracoronary implantation of drug eluting stents // Canadian Journal of Physiology and Pharmacology.- 2009.- Vol. 87(2).- P. 130-136.
2. Габбасов З.А., Козлов С.Г. Клеточные аспекты стенозирования артерий и рестеноза стентов (передовая) // Клиническая Геронтология.- 2009.- т.
15(3).- С. 3-9.
3. Агапов А.А., Габбасов З.А., Балахонова Т.В., Руденко Б.А., Сабурова О.С.
Циркулирующие остеогенные стволовые клетки-предшественники при стенозирующем атеросклерозе аорты и её ветвей // Кремлевская медицина. Клинический вестник. - 2009. - №2. - С. 119-123.
4. Габбасов З.А., Козлов С.Г., Сабурова О.С., Титов В.Н., Лякишев А.А.
Стромальные клетки-предшественники и лейкоциты крови после имплантации стентов с лекарственным покрытием // Кардиология.- 2010.
- №1. - принята в печать.
5. Габбасов З.А., Козлов С.Г., Смирнов В.А., Титов В.Н. Эозинофильные гранулоциты при рестенозе стентов с лекарственным покрытием // Клиническая лабораторная диагностика.- 2009.- принята в печать.
6. Gabbasov Z.A., Agapov A.A., Saburova O.S., Komlev A.E., Soboleva E.L., Akchurin R.S. et al. Circulating stromal osteonectin-positive progenitor cells and stenotic coronary atherosclerosis // Canadian Journal of Physiology and Pharmacology.- 2007.- Vol. 85(3-4).- P. 295-300.
7. Габбасов З.А., Сабурова О.С., Агапов А.А., Соболева Э.Л. Стволовые клетки костного мозга и их участие в атерогенезе сосудов человека // Клиническая Геронтология..- 2007.- т. 13(4).- С. 55-60.
8. Габбасов З.А., Агапов А.А., Сабурова О.С., Руденко Б.А., Балахонова Т.В., Ильина Л.Н., Соболева Э.Л., Акчурин Р.С., Смирнов В.Н.
Циркулирующие стромальные остеонектин-положительные клеткипредшественники и стенозирующий атеросклероз коронарных артерий // Кардиологический Вестник.- 2006.- Том I(XIII), № 1.- С. 10-13.
9. Soboleva, E. L., Gabbasov, Z. A., Agapov, A. A., Akchurin, R. S., Saburova, O. S., Romanov, Y. A., et al. Circulating bone marrow stem/progenitor cells in vascular atherogenesis and in the noninvasive diagnosis of coronary stenosis // Experimental and Clinical Cardiology.- 2005.- Vol. 10(3).- P. 184-188.
10. Габбасов З.А., Соболева Э.Л. Стволовые клетки костного мозга и их участие в атерогенезе человека (передовая) // Клиническая Геронтология.- 2005.- т. 11(10).- С. 3-7.
11. Габбасов З.А., Агапов А.А., Сабурова О.С., Обедзинский Э.А., Соболева Э.Л. Определение циркулирующих стромальных стволовых клеток с остеогенной потенцией в крови пациентов с ИБС методом лазерной поточной цитометрии // Бюл. эксперим. биологии и медицины.- 2005.- т.
139(2).- С. 237-239.
12. Соболева Э.Л., Габбасов З.А. Стволовые клетки костного мозга и атеросклероз // Природа.- 2005.- №10.- С. 36-39.
13. Габбасов З.А., Соболева Э.Л. Стромальные стволовые клетки взрослого организма - резерв восстановительной медицины // Клиническая Геронтология.- 2003.- т. 9(5).- С. 20-24.
14. Рязанов А.С., Габбасов З.А., Юренев А.П. Состояние агрегации тромбоцитов у больных с гипертрофической кардиомиопатией.
Терапевтический архив, 2000, том 72, № 8, с. 36-38.
15. Pязанов А.С., Габбасов З.А., Юpенев А.П. Агpегация тpомбоцитов у больных с pазличными фоpмами гипеpтpофии левого желудочка и ее динамика пpи длительном наблюдении и лечении Терапевтический архив, 2000, том 72, № 11, с. 50-54.
16. Габбасов З.А., Гаврилов И.Ю., Позин Е.Я., Попов Е.Г. Исследование спонтанной и индуцированной малыми дозами индукторов агрегации тромбоцитов // Клиническая лабораторная диагностика.- 1997.- т. 5.- С.
21-22.
17. Авдонин П.В., Габбасов З.А., Нестеров А.В., Позин Е.Я., Попов Е.Г.
Количественное определенние активности фактора Виллебранда в плазме крови // Клиническая лабораторная диагностика.- 1997.- т. 5.- С. 54-55.
18. Gabbasov Z., Nakonecnikov S., Chazova I., Popov E., Belenkov Yu. Platelet aggregation in patients with primary pulmonary hypertension:
effect of long-term therapy with a calcium antagonist isradipine // Platelets. - 1996. - V. 7(2). - P. 80-81.
19. Tertov, V. V., Sobenin, I. A., Gabbasov, Z. A., Popov, E. G., Yaroslavov, A.
A., Jauhiainen, M., et al. Three types of naturally occurring modified lipoproteins induce intracellular lipid accumulation in human aortic intimal cells - the role of lipoprotein aggregation // European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry.- 1992.- V. 30(4).- P. 171-178.
20. Gabbasov, Z. A., Yu Gavrilov, I., & Popov, E. G. Optical density fluctuations for determination of platelet concentration in stirred suspension // Platelets.- 1992.- V. 3(5).- P. 281-282.
21. Tertov, V. V., Orekhov, A. N., Sobenin, I. A., Gabbasov, Z. A., Popov, E. G., Yaroslavov, A. A., et al. Three types of naturally occurring modified lipoproteins induce intracellular lipid accumulation due to lipoprotein aggregation // Circulation Research.- 1992.- Vol. 71(1).- P. 218-228.
22. Tertov, V. V., Sobenin, I. A., Gabbasov, Z. A., Popov, E. G., Jaakkola, O., Solakivi, T., et al. Multiple-modified desialylated low density lipoproteins that cause intracellular lipid accumulation: Isolation, fractionation and characterization // Laboratory Investigation.- 1992.- Vol. 67(5).- P. 665-675.
23. Yurenev A.P., DeQuattro V., Dubov P.B., Ostroumov E.N., Niculin I.A., Konyaeva E.V., Balyakina E.V., Atakhanov Sh.E., Kosenko A.I., Popov E.G., Gabbasov Z.A., Gulyaev V.P. Silent myocardial ishemia in patients with essential hypertension // Am. J. Hypert.- 1992.- Vol. 5(6) part 2.- P. 169S174S.
24. Габбасов З.А., Попов Е.Г., Гаврилов И.Ю., Позин Е.Я., Маркосян Р.А.
Новый высокочувствительный метод анализа агрегации тромбоцитов // Лабораторное дело.- 1989.- N10.- С. 15-18.
25. Габбасов З.А., Попов Е.Г., Гаврилов И.Ю., Позин Е.Я., Маркосян Р.А.
Новый методический подход к исследованию агрегации тромбоцитов in vitro // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1989. - N10. - P. 437-439.
26. Tertov, V. V., Sobenin, I. A., Gabbasov, Z. A., Popov, E. G., & Orekhov, A. N. Lipoprotein aggregation as an essential condition of intracellular lipid accumulation caused by modified low density lipoproteins // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 1989.- Vol.
163(1).- P. 489-494.
27. Gabbasov, Z. A., Popov, E. G., Gavrilov Yu., I., & Pozin Ya., E. Platelet aggregation: The use of optical density fluctuations to study microaggregate formation in platelet suspension // Thrombosis Research.- 1989.- Vol. 54(3).- P. 215-223.
28. Block, H., Gabbasov, Z. A., Pozin, E. Y., Popov, E. G., & Mest, H. Inhibition of cytosolic Ca++ mobilization in human platelets by the antianginal drug trapidil and its derivative AR 12463 // Biomedica Biochimica Acta.- 1988.- Vol. 47(12).- P. 1093-1097.
29. Gabbasov Z, Parfyonova Y, Popov E, Gavrilov I, Anuchin V, Dubov P, Djakonova Y. Association of platelet function in hypertensive patients with left ventricular hypertrophy, transient myocardial ischemia, and coronary artery disease // Platelets.- 1998.- Vol. 9(3-4).- P. 191-195.
30. Маркосян Р.А., Габбасов З.А., Попов Е.Г., Гаврилов И.Ю. Способ определения степени агрегации тромбоцитов и устройство для его осуществления. Патент №1272873.
31. Габбасов З.А., Попов Е.Г., Гаврилов И.Ю., Позин Е.Я. и Прошкин С.Д.
Устройство для определения степени агрегации тромбоцитов. Патент №1561683.
32. Габбасов З.А. Устройство для счета клеток крови или других клеток или частиц. Патент №2282853.
33. Markosyan, R. A., Gabbasov, Z. A., Popov, E. G., Gavrilov Yu., I., Pozin, E.
I., Proshkin S.D. Method for analysis of blood platelet aggregation and apparatus therefore. US Patent #5,071,247.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ИБС - ишемическая болезнь сердца ИМ - инфаркт миокарда АГ - артериальная гипертония УЗДГ - ультразвуковая диагностика КАГ - коронароангиография ЛЖ - левый желудочек ММЛЖ - масса миокарда левого желудочка ГЛП - гиперлипидемия ЛПНП - липопротеиды низкой плотности ЛПВП - липопротеиды высокой плотности ГМК - гладкомышечные клетки КОЕ - колониеобразующие единицы КОЕ-Ф - колониеобразующие единицы для фибробластов МФПК - мононуклеарная фракция периферической крови ON - остеонектин ТРФ- - трансформирующий фактор роста-бета (TGF-) FITC - флуоресцеинизотиоционат PE - фикоэритрин TC - Tri-Color (CY5-фикоэритрин) Ig - иммуноглобулин АДФ - аденозиндифосфат ФАТ - фактор активирующий тромбоциты U46619 - стабильный аналог циклических эндоперекисей (PGG2 и PGH2).