Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по сельскому хозяйству
На правах рукописи
Коршунова Людмила Георгиевна
ТРАНСГЕНЕЗ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ У СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ
06.02.07 - разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва 2012 Диссертационная работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте птицеводства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии)
Научный консультант: доктор сельскохозяйственных наук, профессор, академик Россельхозакадемии Фисинин Владимир Иванович
Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор, член-корреспондент Россельхозакадемии Кочиш Иван Иванович доктор биологических наук, профессор Забудский Юрий Иванович доктор биологических наук Станишевская Ольга Игоревна
Ведущая организация: ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева
Защита состоится 12 апреля 2012 г. в 10 ч. на заседании диссертационного совета Д.220.042.03 при ФГБОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.
Автореферат разослан 12 марта 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Шумилина Н.Н.
доктор сельскохозяйственных наук, профессор 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Современная селекция в птицеводстве базируется на отборе лучшего поголовья из высокопродуктивных семей и семейств и требует длительного времени. Одним из нетрадиционных подходов к генетическому улучшению птицы может стать трансгенез - внедрение в их геном инородных генов. Несмотря на методические трудности, работы по созданию трансгенной птицы как актуального направления в отрасли активно ведутся во многих странах, поскольку перспективны с точки зрения экономической выгоды, возможностью достижения эффекта селекции в короткие сроки. Трансгенез расширяет возможности получения животных с измененными признаками, многие из которых могут быть использованы в селекции, при этом отпадает необходимость длительных обратных скрещиваний для удаления из популяции ненужных генов, неизбежно передаваемых при обычной гибридизации. Очевидно, что методами трансгенеза могут быть введены в популяцию совершенно новые фенотипические признаки, кодируемые генами других видов и родов животных.
Дальнейшее развитие селекции и генетики сельскохозяйственной птицы предполагает разработку новых методов и приемов оценки генома, основанных на знаниях механизмов организации и функционирования живых организмов, в частности, механизмов яйцеобразования у кур. Процесс яйцеобразования связан со значительным усилением биосинтетических процессов в печени, где происходит синтез большинства желточных белков. Белки желтка в основном происходят из вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП), синтез которых начинается в печени кур по достижении ими репродуктивного возраста. С наступлением яйценоскости печень курицы приобретает новую вителлогенную функцию без утраты предшествующих. Такая дифференцировка уже специализированной ткани находится под контролем эстрогенов. Синтез вителлогенина и ЛОНП может быть вызван у цыплят введением им эстрадиола. Этот феномен позволяет изучать гормониндуцированную экспрессию молчащих генов, то есть последовательность процессов, приводящих к синтезу определенного белкового продукта, не синтезируемого ранее, а также определенные этапы этих процессов. Реализация генетической ин формации во многом зависит от рибосом, содержание которых определяет интенсивность белкового синтеза.
Активизация биосинтеза в печени связана с дополнительными энергозатратами, что предполагает значительное увеличение энергетической нагрузки на митохондрион печени, обеспечивающий производство необходимого количества макроэргических соединений для анаболических процессов. Наличие в митохондриях собственного генетического материала обуславливает свои особенности во взаимодействии ядерного и митохондриального геномов в процессе развития и специализации органов и тканей.
Новые знания о сопряженности экспрессии вителлогенинового гена с биогенезом рибосом, митохондриальной энергетикой клеток печени и их использование будут способствовать максимальной реализации продуктивного потенциала у кур.
Цель и задачи исследований Основной целью настоящей работы было изучение воздействия интегрированной генной конструкции, с геном гормона роста быка на биологические и продуктивные признаки генетически модифицированных перепелов, а также изучение гормональной экспрессии генов в печени цыплят.
В связи с указанным были поставлены следующие задачи:
- получить трансгенных перепелов с встроенным геном гормона роста быка;
- провести оценку экспрессии трансгена, биологических и продуктивных показателей трансгенных перепелов в ряду поколений:
динамика роста и иммунный статус перепелов, гормональный статус крови, масса перепелиных яиц, их биохимический состав и морфологические показатели, яйценоскость;
- изучить экспрессию генов на модели гормониндуцированного вителлогенеза у цыплят: синтез вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности, биохимические показатели крови и печени, биогенез рибосом после однократного и повторного введения цыплятам 17--эстрадиола и в зависимости от его дозы;
- определить влияние гормональной экспрессии генов, вызванной 17--эстрадиолом, на биогенез и биоэнергетические параметры митохондрий печени цыплят.
Научная новизна работы Впервые проведена оценка экспрессии трансгена, генетический и фенотипический анализ трансгенных по гену гормона роста быка перепелов, полученных методом микроинъекции экзогенной ДНК в зародышевые диски яйцеклеток, и их потомков в ряду поколений.
Впервые на примере трансгенных перепелов по гену гормона роста быка показана возможность существенного улучшения продуктивности птицы методами трансгенеза.
Впервые изучена сопряженность эстрогениндуцированной экспрессии вителлогенинового гена, выраженной в усилении синтетических процессов в печени и увеличении содержания вителлогенина, ЛОНП и триглицеридов в плазме крови с синтезом РНК и биогенезом рибосом в печени цыплят.
Выявлено, что синтез вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности в печени эстрогенизированных цыплят имеют разные динамики, то есть относительно независимую регуляцию экспрессии соответствующих генов.
Обосновано, что необходимым условием для становления вителлогенной функции печени является синтез мРНК в первые часы после введения 17--эстрадиола цыплятам. Биогенез рибосом определяет количественные характеристики ответа печени на гормон. Увеличение числа рибосом в печени после повторного введения эстрадиола цыплятам больше, чем после однократного.
Получены новые данные о том, что различия функционального состояния митохондрий печени кур-несушек и цыплят нивелируются в ходе эстрогениндуцированного вителлогенеза: в митохондриях печени цыплят происходят изменения параметров сопряжения и активного транспорта ионов кальция, которые приближаются к таковым в митохондриях печени кур-несушек.
Практическая ценность работы Перепела опытной группы, потомки трансгенных по гену гормона роста быка, в ряду поколений сохранили превосходство по живой массе на 5Ц15% и массе яиц на 10Ц20% по сравнению с обычными, что свидетельствует о возможном практическом использовании трансгенеза в селекционной работе, направленной на повышение продуктивных показателей птицы в короткие сроки. Производствен ная проверка подтвердила результаты исследований. Разница по массе яиц перепелок трансгенного происхождения и эстонской породы составила 18,7%.
Материалы исследований легли в основу разработанного способа отбора перепелок по массе яиц (Патент РФ № 2402209). Результаты еженедельных взвешиваний яиц перепелок, отличающихся по средним показателям, с 7- до 50- недельного возраста позволили определить целесообразный возраст проведения оценки перепелок по этому признаку (11Ц12 недель). Именно в этом возрасте масса яйца соответствует средним показателям за весь период яйценоскости.
Выявленные у цыплят различия в динамике индукции синтеза вителлогенина и ЛОНП в ответ на введение 17--эстрадиола являются обоснованием возможности раздельной селекции кур по этим признакам.
инейная зависимость содержания фосфопротеидного фосфора и общего кальция в крови эстрогенизированных цыплят позволяет использовать каждый из них для ранней оценки яичной продуктивности кур. Использование в качестве показателя общего кальция из соображений методического характера является предпочтительным.
На основании изученных параметров окислительного фосфорилирования и цитохромоксидазной активности митохондрий печени получено экспериментальное подтверждение оптимальным нормам кормления, режимам выращивания и содержания птицы (Фисинин В.И., Коршунова Л.Г., 1988; Байковская И.П., Коршунова Л.Г., 1989), Методическое руководство для зоотехнических лабораторий (1998).
Основные положения, выносимые на защиту В результате выполненных исследований и производственной проверки разработаны и выносятся на защиту следующие основные положения:
1. Экспрессии трансгена у перепелов, полученных методом микроинъекции генной конструкции с геном гормона роста быка в зародышевые диски яйцеклеток, и их потомков в ряду поколений.
2. Рост, продуктивность, гормональный статус крови, иммунный статус трансгенных по гену гормона роста быка перепелов и их потомков в ряду поколений.
3. Синтез вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности, показатели крови и печени, биогенез рибосом после однократного и повторного введения цыплятам 17--эстрадиола и в зависимости от его дозы.
4. Интеграция гормональной индукции вителлогенной функции печени цыплят с биогенезом, активностью окислительного фосфорилирования и функциональной специализацией митохондрий.
Апробация работы Основные материалы диссертации были представлены на Ученых советах ВНИТИП в ежегодных отчетах 1980Ц2010 г.г.; на Всесоюзном симпозиуме по биохимии митохондрий, Пущино (1981); на Всесоюзном симпозиуме по биохимии с.-х. животных, Витебск (1982); на научноЦметодической комиссии по селекции и генетике птицеводства Отделения животноводства ВАСХНИЛ (1983); на Всесоюзном биохимическом съезде, Киев (1986); на Всесоюзном симпозиуме Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа, Ташкент (1986); на 2 Всесоюзном симпозиуме Научные основы витаминного питания с.-х. животных, Юрмала (1987); на Всесоюзной научно-технической конференции Эффективное использование кормов в птицеводстве, Новосибирск (1990); на Всесоюзной научной конференции Использование физических и биологических факторов в ветеринарии и животноводстве, Витебск (1991); на Украинской конференции с международным участием Актуальные проблемы современного птицеводства, Харьков (1991); на международном симпозиуме Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов с.-х.
животных, С.-Петербург, Пушкин (1994); на ежегодных отчетах в отделении зоотехнии и животноводства РАСХН (1995Ц2005 г.г.); на научных конференциях Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии, Москва (1996, 2000 гг.); на II Международной выставке Инновации-99. Технологии живых систем Всероссийский выставочный центр, Москва (1999), где был присужден Диплом II степени за разработку Получение трансгенной птицы; на конференции Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России. С.Петербург (2008), на XVI конференции Российского отделения Всемирной научной ассоциации по птицеводству Достижения в современном птицеводстве: Исследования и инновации, Сергиев Посад (2009); а также за рубежом на 10 Европейской конференции по птицеводству, Иерусалим, Израиль (1998); на 6 Конференции Балтийских стран по птицеводству, Вильнюс, Литва (1998), на 8 конференции стран Балтии по птицеводству, Турку, Финляндия (2000); на Международном конгрессе по птицеводству, Монреаль, Канада (2000).
Публикация результатов исследований Основные результаты исследований опубликованы в трудах ВНИТИП, материалах Россельхозакадемии, республиканских и международных научных конференций, научных и научно-производственных журналах, информационной экспресс-информации.
Всего по теме диссертационной работы опубликовано 56 статей, в том числе 14 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, методическое руководство для зоотехнических лабораторий Оценка качества кормов, органов, тканей, яиц и мяса птицы, 1998, получен патент РФ(2009 г.) на изобретение.
Научные исследования выполнены в соответствии с планом (1980Ц2010 гг.) Всесоюзного научно-исследовательского и технологического института птицеводства ныне ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии по темам: Разработать методы прогнозирования яйценоскости кур с помощью введения в раннем возрасте экзогенных гормонов, № гос. рег. 81090364; Разработка переносов генов в геном птиц № гос. рег. 01980008817, Разработать новые и усовершенствовать существующие методы получения трансгенной птицы с заданными признаками, № гос. рег. 01200120268; Разработать методы получения генетически модифицированной птицы с ценными хозяйственными признаками, № гос. рег. 01200602327.
Объем и структура работы Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение; обзор литературы; материал и методика исследований; результаты исследований и их обсуждение; выводы; список литературы;
приложения. Материал изложен на 305 страницах машинописного текста, иллюстрирован 44 таблицами и 26 рисунками. Список литературы включает 644 библиографических источника, в том числе 2отечественных и 439 иностранных авторов. Приложение включает дополнительные таблицы и рисунки, иллюстрирующие результаты исследований; Патент РФ на изобретение №2402209 Способ отбора перепелок по массе яиц, 2009; Акт производственной проверки, 2009; Удостоверение на рационализаторское предложение, 1981; Методическое руководство, 1998.
ичный вклад соискателя Автору принадлежит постановка темы диссертации, ее разработка и решение. Экспериментальная часть работы и обработка полученных результатов выполнена непосредственно при личном авторском участии диссертанта, а также совместно с соисполнителями, что нашло отражение в списке публикаций по теме исследований.
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования выполнены по трем разделам (рис. 1): 1 - получение и фенотип трансгенных перепелов по гену гормона роста быка;
2 - эстрогениндуцированный вителлогенез и биогенез рибосом печени цыплят; 3 - роль митохондрий в вителлогенезе печени.
Исследования раздела 1 по получению и изучению биологических и продуктивных качеств перепелов, трансгенных по гену гормона роста быка, проведены в 1994Ц2010 годах на перепелах эстонской породы в условиях вивария ГУП Загорское ЭПХ ВНИТИП Россельхозакадемии (Московская обл.) Птицу содержали в индивидуальных клетках при свободном доступе к воде и корму. Технологические параметры содержания и питательность комбикормов соответствовали принятым нормам.
Трансгенную птицу получали методом микроинъекции экзогенной ДНК в зародышевые диски яйцеклеток. Инъецированная генная конструкция pMTbGH(2att) была предоставлена Институтом молекулярной биологии РАН (г. Москва).
Для идентификации трансгенных перепелов использовали блотгибридизационный анализ ДНК и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза.
Анализ экспрессии трансгенов был выполнен на уровне белка:
исследование плазмы крови на бычий соматотропин иммуноферментным методом.
В исследованиях было две группы перепелов - опытная и контрольная. В опытную группу входили потомки (33 поколения) трансгенных особей, контрольную - эстонские перепела 33 генераций.
Направления исследований Трансгенез Гормональная экспрессия генов Получение перепелов, Фенотип трансгенных Эстрогениндуцированный Роль митохондрий в трансгенных по гену перепелов вителлогенез и биогенез вителлогенезе печени гормона роста быка рибосом печени цыплят Метод получения транс- Биологические и про- Влияние однократного и по- Окислительное фосфогенной птицы. Идентифи- дуктивные качества вторного введения 17--эстра- рилирование, транскация трансгенных пере- трансгенных перепе- диола на массу, состав, со- порт кальция, метабопелов методом полиме- лов: масса суточного держание рибосом и функ- лическая активность и разной цепной реакции и молодняка, динамика циональную активность пече- биогенез митохондрий блот-гибридизационным роста, гормональный ни цыплят. Влияние дозы печени кур и цыплят анализом ДНК. Оценка статус крови, иммун- 17--эстрадиола на вителло- после введения 17-экспрессии трансгена им- ный статус, яичная генез и биогенез рибосом. эстрадиола. Действие муноферментным мето- продуктивность; мор- Действие -аманитина, акти- клофибрата на вителлодом по содержанию бычь- фологические показа- номицина Д, 5-бромдезокси- генез и биоэнергетику его соматотропина в крови тели и биохимический уридина и тиоацетамида на митохондрий.
трансгенных перепелов. состав перепелиных вителлогенез и биогенез рияиц. босом.
Выводы и практические предложения Рисунок 1. Общая схема исследований Поголовье в поколениях колебалось от 45 до 110. Отвод потомства в опытной и контрольной группах проводили естественным спариванием определенных особей. Каждая особь из опытной группы имела шифр в компьютерной базе данных, позволяющий проследить ее родословную, начиная от первичных трансгенных особей.
Учитываемые показатели: живая масса в суточном возрасте и еженедельно, в течение 20 недель, индивидуальная яйценоскость и масса яиц в течение 10 мес. продуктивного периода, биохимические показатели яиц (Фисинин В.И., Тишенков А.Н., 1998), содержание жирных кислот в липидах желтка (Архипов А.В., Топорова Л.В, 1976), морфологические показатели яиц (Дядичкина Л.Ф., Позднякова Н.С., 2001). В плазме крови определяли содержание инсулина, тетрайодтиронина (тироксин или Т4), трийодтиронина (Т3) радиоиммунологическим анализом (Радченков В.П., Аверин В.С., Бутров Е.В., 1985). Иммунный статус перепелов оценивали по нарастанию титров антител в крови и желтках яиц в ответ на введение антигена.
Антитела определяли в реакции задержки гемагглютинации (РЗГА) (Методические указания, 1997).
Исследования раздела 2 по изучению эстрогениндуцированного вителлогенеза и биогенеза рибосом печени проводили на цыплятах породы белый леггорн в возрасте 75Ц90 дней и на взрослой птице в возрасте 240Ц280 дней. Выполнено три исследования на поголовье 333 цыплят, 15 кур и 15 петухов.
В первом исследовании изучали экспрессию вителлогенинового гена по показателям крови и динамике ответа печени цыплят на однократное введение 17--эстрадиола и при разных дозах гормона.
Использовали дозы: 10, 30, 50 и 70 мг/кг. Подробная динамика была исследована для дозы 30 мг/кг. Цыплят декапитировали через 4, 12, 18, часов, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9 суток после введения гормона.
Во втором исследовании изучали показатели крови и динамику ответа печени цыплят на однократное и повторное введение эстрадиола. Были сформированы две опытные группы цыплят. Цыплятам одной группы ввели 17--эстрадиол в дозе 20 мг/кг. Через 16 суток эстрадиол в той же дозе ввели цыплятам обеих групп и декапитировали их через 3, 6, 9, 12 часов и 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 суток.
В третьем исследовании изучали влияние -аманитина, актиномицина Д, бромдезоксиуридина и тиоацетамида на эстрогениндуцированный вителлогенез у цыплят. Цыплятам вводили 17--эстрадиол в дозе 30 мг/кг; -аманитин, актиномицин Д, бромдезоксиуриндин и тиоацетамид в дозах 20 мкг/кг, 50 мкг/кг, 20 мг/кг и 50 мг/кг соответственно. Цыплят декапитировали на 2, 4 и 6 сутки после введения эстрадиола. За 2 часа до убоя цыплятам внутрибрюшинно вводили H-уридин в количестве 70 МБк.
17--Эстрадиол (Сигма, США) растворяли в пропиленгликоле в разных концентрациях и вводили внутримышечно из расчета 1 мл/кг живой массы. Актиномицин Д и -аманитин (Серва, ФРГ), а также 5-бромдезксиуридин и тиоацетамид (BDH, Англия) использовали в виде раствора в 0,85% хлористом натрии и вводили внутрибрюшинно по 1 мл/кг живой массы.
Учитываемые показатели в 1, 2, 3 исследованиях:
- в плазме крови цыплят определяли содержание общего белка (Chromy V.Ficher J., 177), триглицеридов (Tixier M., Clande J., 1974), неорганического и фосфопротеидного фосфора (Грибанов Г.А., Сергеев С.А., Алексеенко А.С., 1976), общего кальция (Sarkar B.C.R., Chauhan U.P.S., 1967). Фракционный состав белков плазмы крови определяли электрофоретически. Количественную обработку электрофореграмм проводили денситометрированием;
- печень оценивали по массе, содержанию общего белка, РНК, ДНК (Труболюбова М. Г., 1977), радиоактивности РНК. РНК-азную активность определяли по скорости расщепления очищенного препарата дрожжевой РНК. Рибосомы выделяли преципитацией 0,2 М MgCI2, количество рибосом определяли по поглощению их растворов в додецилсульфате натрия при 260 нм (Palmitel R., 1974).
По разделу 3: Роль митохондрий в вителлогенезе печени выполнено 2 исследования на птице породы белый леггорн: цыплятах в возрасте 75Ц90 дней, курах и петухах в возрасте 240Ц280 дней. Использованное поголовье составило 330 цыплят, 30 кур и 15 петухов.
В первом исследовании изучали окислительное фосфорилирование, активный транспорт ионов кальция, метаболическую активность и биогенез митохондрий печени кур и цыплят. Для этого из цыплят были сформированы одна контрольная две опытных группы.
Индукцию вителлогенной функции печени у цыплят опытных групп вызывали однократным подкожным введением раствора 17-эстрадиола на пропиленгликоле в дозе 30 мг/кг живой массы. Второй опытной группе одновременно с 17--эстрадиолом внутрибрюшинно вводили спиртовой раствор актиномицина Д в дозе 100 мкг/кг живой массы. Контрольной группе цыплят вводили пропиленгликоль. Убой цыплят контрольной и опытных групп осуществляли декапитацией (по 5 гол.) через 4, 12, 24, 36, 48, 72 и 96 ч после инъекций.
Во втором исследовании изучали действие клофибрата (nэтилхлорофеноксиизобутират) на вителлогенез и биоэнергетику митохондрий с целью определения связи между основными биоэнергетическими функциями митохондрий и активностью индуцированного 17--эстрадиолом липогенеза в печени цыплят. Были сформированы две группы цыплят: контрольная и опытная Цыплят опытной группы в течение семи суток принудительно кормили клофибратом в форме желатиновых капсул, по одной капсуле в сутки. Одна капсула содержала 250 мг препарата. Затем цыплятам вводили 17-эстрадиол в дозе 30 мг/кг живой массы. Убой цыплят осуществляли декапитацией (по 5 гол.): через семь суток кормления клофибратом, через 1 и 2 суток после прекращения скармливания клофибрата, через 1 и 2 суток после инъекции 17--эстрадиола.
Учитываемые показатели 1 и 2 исследований:
- в плазме крови цыплят определяли содержание общего белка (Chromy V.Ficher J., 1977), триглицеридов (Tixier M., Clande J., 1974), неорганического и фосфопротеидного фосфора (Грибанов Г.А., Сергеев С.А., Алексеенко А.С., 1976), общего кальция (Sarkar B.C.R., Chauhan U.P.S., 1967).
- из печени методом дифференциального центрифугирования выделяли митохондриальную фракцию, в которой определяли содержание ДНК, РНК, белка (Труболюбова М. Г., 1977), свободных аминокислот. Скорость дыхания в митохондриях определяли полярографическим методом (Кондрашова М.Н., Евдодиенко Ю.В., Кудзина Л.Ю., 1973). Цитохромоксидазную активность оценивали по максимальной скорости дыхания митохондрий в присутствии насыщающих концентраций аскорбата натрия с тетраметилпарафенилендиамидом и цитохромом С. Активность транспорта ионов кальция в митохондриях определяли по потреблению кислорода в присутствии сукцината после добавления CaCl2 (50Ц100 мкМ/мг белка митохондрий) (Кудзина Л.Ю., 1970).
Результаты обработаны статистическими методами (Гмурман В.В., 1972) с использованием программы Microsoft Excel. На диаграммах и таблицах указаны ошибки выборочного среднего.
Достоверность различий показателей опытной и контрольной групп в таблицах отмечены следующим образом: * - p<0,05; ** - p<0,01;
*** - p<0,001.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Получение и фенотип трансгенных перепелов по гену гормона роста быка Перепела, трансгенные по гену гормона роста быка, были получены хирургическим методом микроинъекции экзогенной ДНК перепелиных яйцеклеток, как овулировавших, так и находившихся на поздних стадиях созревания (крупные фолликулы). Для инъекции использовали генную конструкцию pMTbGH(2att), содержащую природный ген гормона роста быка (bGH gene), находящийся под контролем металлотионинового промотора (MT prom) (рис. 2). Последний активируется ионами цинка и других тяжелых металлов, содержащихся в организме птицы. Активный промотор заставляет экспрессироваться ген бычьего гормона роста. У трансгенных по этой конструкции перепелов происходит синтез указанного гормона.
PstI SacI PstI PstI EcoRI PstI EcoRI 5' 3' 103 1619 460 210 60 1150 1150 786 103 162att MT prom. bGH gene 3'-poly(A) att HindIII NdeI pUCРисунок 2. Физическая карта плазмиды pMTbGH(2att) (указаны сайты рестрикции эндонуклеазами), использованной в качестве генной конструкции при получении генетически модифицированных перепелов Было прооперировано 93 перепелки, у которых инъецировано 280 яйцеклеток, как овулировавших, так и находившихся в крупных фолликулах. От них получено 122 перепеленка.
Методами блот-гибридизационного анализа и ПЦР было исследовано 180 проб ДНК, выделенных из эмбрионов, органов и тканей экспериментальных перепелов. Нуклеотидные последовательности гена гормона роста быка были обнаружены в ДНК 10 эмбрионов и 14 особей перепелов. Распределение трансгена в тканях опытных перепелов проиллюстрировано на рис. 3.
Трансгенные перепела были исследованы на содержание в крови бычьего соматотропина. В некоторых образцах крови он был обнаружен в количестве 1,0Ц3,0 нг/мл. Таким образом, экспрессия трансгена в крови полученных трансгенных перепелов составила от 1,0 до 3,0 нг/мл бычьего соматотропина, тогда как в крови перепелов контрольной группы искомый белок отсутствовал. Трансгенность перепелов проявилась в ряду поколений.
1 2 3 4 5 6 7 8 п.н.
23194654323205Рисунок 3. Блот-гибридизационный анализ ДНК из различных тканей перепелов: 1 - птица 116, грудная мышца; 2 - птица 116, печень; 3 - птица 116, ножная мышца; 4 - птица 22, миокард; 5 - птица 22, грудная мышца;
6 - птица 107, грудная мышца; 7 - птица 107, миокард; 8 - кровь контрольного перепела плюс плазмида в количестве 1Ц2 копии на гаплоидный геном В процессе выращивания экспериментально полученных перепелов и отвода от них потомства было замечено, что некоторые самки сносили крупные яйца (14,0Ц21,0 г), а из яиц с обычной массой вылуплялись перепелята с живой массой на 15Ц25% выше обычной.
Вскрытие показало, что яйца не были двухжелтковыми и были покрыты нормально пигментированной прочной скорлупой. Была установлена связь признака крупнояичности с трансгенностью особей, а также наследование этого признака (рис. 4).
Это послужило основанием для размножения экспериментальных особей и изучения фенотипа полученной птицы. Трансгенные особи были использованы с целью получения потомства для формирования и дальнейшего исследования опытной группы перепелов.
В настоящее время получено и изучено 33 поколения экспериментальных перепелов.
F0:
самец самка, F1:
крупные яйца 103 104 1самка, самец, самка, самец, F2:
крупные СТГб крупные СТГб яйца 1,2 нг/мл яйца 2,6 нг/мл Рисунок 4. Пример фенотипического проявления трансгенности в потомстве перепелов У трансгенных перепелов живая масса на 5-15% была выше, чем в контроле. У их потомков сохранялось превосходство по живой массе (рис. 5), причем у самок различия оказались более существенны. В суточном и 1-недельном возрасте опытные птицы были крупнее контрольных соответственно на 21 и 13%. Средняя масса суточных перепелят в опытной группе составляла 9,1, в контрольной - 7,4 г. В 7- и 20-недельном возрасте статистически достоверные различия наблюдались только у самок - соответственно 8,0 и 6,0% (p<0,001).
Масса суточного молодняка птицы в значительной степени обусловлена массой инкубационных яиц. В наших опытах с увеличением массы яиц пропорционально увеличивалась масса трансгенных суточных перепелят (r = +0,810). При этом все перепелята были подвижными, активно реагировали на звук, имели мягкий подобранный живот, чистую клоаку. Пух мягкий, ровный, блестящий, правильно пигментированный (коричневого цвета с двумя светлыми полосками на спинке). Ноги и клюв крепкие, глаза блестящие. Взрослые особи внешне не отличались от контрольных перепелов.
2Опыт, самки 2Опыт, самцы Контроль, самки 150 Контроль, самцы 11 сут. 1 нед. 7 нед. 20 нед.
Возраст Рисунок 5. Живая масса перепелов опытной и контрольной групп, в среднем по 15 поколениям Живая масса трансгенных перепелов варьировала от поколения к поколению, однако, линия тренда для этого показателя в 20недельном возрасте свидетельствовала об отсутствии тенденции к снижению (наклон незначительный, R2 = 0,019) (рис. 6).
Гормональный статус трансгенных перепелов по изученным показателям не претерпел существенных изменений по сравнению с контрольными. Среднее значение уровня инсулина у самок опытной группы составило 15,8 и у самцов Ц16,4 против 10,7 и 16,5 мкЕд/мл соответственно у контрольной группы. Индивидуальные значения этого показателя варьировали у опытной группы от 6,7 до 30,9 и у контрольной - от 7,8 до 18,1 мкЕд/мл.
В значениях показателей содержания тиреоидных гормонов в крови перепелов опытной и контрольной групп наблюдался большой разброс. Так, минимальные концентрации тироксина составляли 1 - 2 нМ, максимальные: 10Ц12 нМ. Средние значения составили у опытных самок 4,2 и у самцов 6,1 нМ, тогда как у контрольных соответственно 4,7 и 5,7 нМ. Концентрация трийодтиронина у опытных самок была 0,7 и у самцов 1,6 нМ, у контрольных соответствен Живая масса, г но 0,8 и 1,6 нМ. Значительные колебания концентрации трийодтиронина были более характерны для самок - от 0,2 до 2,1 нМ, в то время как у самцов - от 1,2 до 2,1 нМ.
2y = 0,1933x + 207,R2 = 0,021118 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Поколения Рисунок 6. Живая масса самок перепелов в возрасте 20 нед, трансгенных по гену бычьего соматотропина, в разных поколениях.
Показатель отношения концентрации инсулина к трийодтиронину, по которому можно судить о сдвиге метаболизма в организме, был выше у самок, чем у самцов, а также у самок опытной группы по сравнению с контрольной, что подтверждает более высокий уровень анаболизма у подопытных самок, выраженный в повышенном синтезе компонентов яйца.
Полученные данные по нарастанию титров антител в крови и желтке яиц в ответ на введение антигена свидетельствуют о повышении иммунного статуса у перепелов опытной группы, выраженным в ускоренной выработке антител к вводимому антигену. Через четыре недели титры антител у опытных перепелов были выше (p<0,001), чем в контроле (табл. 1). Достоверные различия были получены и для экстрактов желтков яиц контрольной и опытной групп, снесенных через 4 недели после вакцинации (p<0,001).
Живая масса, г 1. Показатели поствакцинального иммунитета перепелов Через 2 нед Через 4 нед Показатель титр log2 титр logКонтрольная группа Сыворотка крови 1:4Ц1:16 3,20,28 1:8Ц1:32 4,00,Экстракт яичного желтка - - 1:4Ц1:8 2,90,Напряженность иммуни80% 100% тета, % Опытная группа Сыворотка крови 1:8Ц1:32 3,80,23 1:32Ц1:128 6,00,23* Экстракт яичного желтка - - 1:8Ц1:64 4,90,23* Напряженность иммуни100% 100% тета, % У трансгенных перепелов и их потомков масса яиц была на 10 - 20% выше, чем в контроле (p<0,001). На пике продуктивности масса яиц у опытных перепелов в среднем по 33 поколениям составила 13,0 г. Разброс показателя по отдельным особям был от 11,3 до 15,0 г.
Яйценоскость перепелок в опытной группе в поколениях колебалась от 200 до 235 яиц, в контроле - от 193 до 227 яиц за 10 месяцев продуктивного периода. Средняя яйцемасса за этот период в опытной группе составила 2749,4 г, что на 11% больше, чем в контрольной группе (p<0,001). Средняя число яиц и их масса по поколениям представлены на диаграмме (рис. 7).
В опытной и контрольной группе увеличение массы яйца до 14,0 г было обусловлено пропорциональным увеличением массы его составных частей - скорлупы, белка, желтка. При этом доля желтка составила 29Ц33%, белка - 58Ц61%, скорлупы - 9Ц10%. Начиная с массы яиц выше 14 г в опытной группе, соотношение составных частей изменилось. Доля желтка возросла до 39,6%, белка - снизилась до 52,3% и скорлупы - до 8,1%. Индекс формы яиц массой от 8,0 до 14,0 г в контрольной и опытной группах варьировал в пределах 75,4 - 83,6%. При дальнейшем увеличении массы яиц в опытной группе происходило снижение индекса формы до 67,5%, то есть форма становилась более вытянутой.
Рисунок 7. Число (1, 2) и масса (3, 4) яиц в среднем по 19Ц33 поколениям, 1, 3 - трансгенная, 2, 4 - интактная птица Большая часть сухих веществ желтка перепелиных яиц приходится на долю липидов. В желтке яиц опытной группы их содержалось от 26,1 до 29,3%, контрольной - 27,8Ц29,2%.
Содержание протеинов составило от 15,1 до 17,0% для всех проанализированных желтков, независимо от их массы и принадлежности к группе. Не установлено в обеих группах закономерных различий и по содержанию воды в желтках яиц разной массы.
Белок перепелиных яиц содержал 85,0Ц87,9% воды. На долю протеинов приходилось от 8,9 до 10,9%. Закономерные различия между группами также отсутствовали.
Содержание каротиноидов в желтке яиц опытной группы было от 9,2 до 16,6 мкг/г, в контрольной - от 12,2 до 20,7 мкг/г. Отмечена тенденция повышения содержания каротиноидов с увеличением массы яйца. Содержание витамина А в желтке яиц опытной группы менялось от 12,8 до 16,8 мкг/г, в контрольной - от 14,2 до 19,7 мкг/г.
Содержание витамина Е в желтке яиц опытной группы варьировало в пределах 56,7Ц80,5 мкг/г, в контрольной - от 75,4 до 90,5 мкг/г. Витамина В2 в желтке яиц опытной группы содержалось 3,68Ц4,мкг/г, контрольной - 3,82Ц4,42 мкг/г и не зависело от массы яиц. Витамин В2 в белке яиц опытной группы находилось в пределах 1,68 - 1,91 мкг/г, контрольной - 1,95Ц2,16 мкг/г. Аминокислотный состав яичного белка трансгенных перепелок не отличался от такового у контрольных особей.
В желтках яиц у контрольных перепелок на долю насыщенных жирных кислот приходилось 41,35, мононенасыщенных - 41,06, полиненасыщенных - 17,59%. Сумма насыщенных и полиненасыщенных жирных кислот в липидах желтка у птиц в опытной группе была несколько больше и составляла соответственно 42,08 и 19,41%, сумма мононенасыщенных жирных кислот была меньше, чем в контрольной - 38,51%. Выявленные различия обусловлены в основном увеличением содержания стеариновой и линолевой кислот на 1,8% и уменьшением количества олеиновой кислоты на 2,3% в яйцах у перепелок из опытной группы. При этом массовая доля олеиновой кислоты изменялась от 31,40 до 37,00%, линолевой - от 19,90 до 17,30%. В опытной группе содержание стеариновой кислоты в яйцах у несушек 3- и 6-месячного возраста было соответственно 17,03 и 16,76%, линолевой кислоты - 18,08 и 19,33%. Доля олеиновой кислоты в яйцах несушек из опытной группы оказалась 38,55 и 33,59% соответственно. Следовательно, при изменении массы яйца и в опытной, и контрольной группах перепелок наблюдались колебания в содержании отдельных жирных кислот в липидах желтка. Главным образом это относилось к жирным кислотам с 18 атомами углерода:
стеариновой, олеиновой, линолевой и линоленовой.
Таким образом, в наших исследованиях экспериментально показано, что у полученных трансгенных по гену гормона роста быка перепелов произошло усиление биосинтетических процессов в организме без изменений в биологических закономерностях, определяющих процессы роста и развития птицы, формирования яйца. Полученные данные свидетельствуют о возможном практическом использовании методов трансгенеза в селекционной работе на повышение продуктивных показателей птицы.
3.2. Эстрогениндуцированный вителлогенез и биогенез рибосом печени цыплят Одним из факторов регуляции активности генов являются стероидные гормоны. Известно, что стероидные гормоны избирательно накапливаются в определенных тканях организма. Действие стероидных гормонов на метаболизм клеток заключается в экспрессии определенных генов и общем усилении биосинтетических процессов.
Введение 17--эстрадиола цыплятам увеличивало содержание белкового и неорганического фосфора, триглицеридов, общего белка и кальция крови. На вторые сутки после эстрогенизации концентрация белка достоверно отличалась от контрольного значения (p<0,05) и составила 53,9 мг/мл, а в контроле - 44,5мг/мл. Максимальную концентрацию белка зафиксировали на пятые-шестые сутки, когда она на 74Ц68% превышала контрольный уровень. Электрофорез белков плазмы показал, что введение 17--эстрадиола привело к появлению двух крупных белков, характерных для крови кур-несушек (рис. 8). Определение молекулярной массы (м.м.) и окрашивание на фосфор выявило только одну фракцию с м.м. 205 килодальтон (кД), представленную мономером вителлогенина. Это означает, что весь фосфопротеидный фосфор плазмы крови эстрогенизированных цыплят связан с вителлогенином. Другой индуцируемый эстрадиолом крупный белок с м.м. 405 кД представляет собой апопротеин липопротеида очень низкой плотности I (ЛОНП I). Кроме вителлогенина и ЛОНП I под влиянием 17--эстрадиола заметно увеличилась фракция с м.м. 11,5 кД - ЛОНП II.
Рисунок 8. Электрофореграмма белков плазмы крови цыплят в разное время после введения им 17--эстрадиола: 1, 2, 3, 4 - стандарты м.м., 5, 6 - контроль, 7, 8 - 1 сутки, 9,10Ц2 суток, 11,12Ц5 суток, 13,14Ц6 суток, 15, 16 - 9 суток, 17, 18 - 10 суток, 19, 20 - белки плазмы крови курицы-несушки Количественная обработка электрофореграмм показала, что содержание белка в плазме крови цыплят после эстрогенизации увеличилось на 70%, из которых в среднем по 20% приходилось на долю ЛОНП I и вителлогенина, 10% - ЛОНП II. То есть увеличение содержания белка на 3/4 обусловлено появлением в крови главных протеинов - предшественников яичного желтка. Оставшаяся доля (1/4) - результат возрастания концентрации белков - обычных компонентов плазмы крови цыплят.
Содержание фосфопротеидов в контроле было на грани чувствительности использованного метода в течение всего периода исследования. В крови опытных цыплят при всех исследованных дозах гормона в регистрируемых количествах фосфопротеиды появлялись через 3Ц4 ч; на 2-е сутки их количество было значительным, а на 5Ц6-е - максимальным и составило 158Ц296 мкг/мл при дозе гормона 30 мг/кг.
Затем содержание их быстро снижалось. Повторное введение цыплятам 17--эстрадиола через 16 суток после первого, когда действие предыдущей дозы гормона уже закончилось, вызывало более сильную стимуляцию синтеза вителлогенина. Скорость его накопления в крови была значительно больше. Уже через 9 ч различия становились достоверными (p<0,01). Содержание фосфопротеидов на максимуме ответа в обоих случаях на пятые сутки в 1,72 раза превышало этот показатель при первичном ответе.
Таким образом, индукция экзогенным 17--эстрадиолом вителлогенеза в печени цыплят полностью обратима.
Воздействие разных доз 17--эстрадиола на содержание фосфопротеидов в плазме показало, что максимальная скорость их накопления зафиксирована при дозах 30 и 50 мг/кг.
Введение эстрадиола в дозе 10 мг/кг вызывало низкую скорость накопления фосфопротеидов, максимум их содержания отмечен на четвертые сутки, а на шестые количество их было равным показателю аналогично содержанию на девятые сутки при дозе 30 мг/кг. На шестые сутки снизилась масса печени до уровня контроля, увеличилось содержание ДНК (р<0,05).
Доза эстрадиола 70 мг/кг вызвала большую индукцию синтеза фосфопротеидов, по сравнению с 10 мг/кг, и накопление их в крови продолжало непрерывно расти вплоть до шестых суток. Но больше всего фосфопротеидов наблюдалось на шестые сутки при дозе эстрадиола 30 мг/кг.
Масса печени цыплят, как и содержание общего белка в плазме крови, интенсивнее увеличивалась при дозах гормона 50 и 70 мг/кг, причем масса печени для этих доз на шестые сутки больше, чем на четвертые, а для 10 и 30 мг/кг - меньше.
Таким образом, скорость становления вителлогенной функции в печени цыплят возрастает с увеличением дозы вводимого эстрадиола, но до определенных пределов.
Динамика содержания общего кальция, неорганического фосфора, триглицеридов, общего белка в крови цыплят после их эстрогенизации была аналогична динамике содержания фосфопротеидов.
Для выяснения степени связи между исследуемыми показателями были рассчитаны коэффициенты корреляции. Биохимические показатели хорошо коррелировали между собой. Наименее тесная корреляционная связь отмечена между общим белком и другими показателями (0,76Ц0,80). Следует отметить высокий коэффициент корреляции между белковосвязанным фосфором и общим кальцием (0,99), что говорит о функциональной связи между ними. Для этих показателей было построено методом наименьших квадратов линейное уравнение регрессии:
Са = 2,0155P+76,4500;
r = 0,9894, где: Са, Р - концентрация, соответственно, кальция и белкового фосфора, мкг/мл.
Коэффициент 76,45 практически совпадал с концентрацией общего кальция в плазме крови контрольных цыплят (73,9). Следовательно, прибавка общего кальция в плазме крови цыплят после введения им эстрадиола обусловлена долей его, связанной с фосфопротеидами, следовательно, с вителлогенином. Если сделать перерасчет с учетом атомных масс кальция и фосфора, то на один атом белкового фосфора приходится 1,56 атомов кальция за вычетом исходного уровня кальция в плазме крови, то есть когда содержание белкового фосфора практически равно нулю. Отсюда следует, что 2 атома фосфора вителлогенина, то есть две фосфатные группы, связывают в среднем три атома кальция.
инейную зависимость между содержанием фосфопротеидного фосфора и общего кальция в крови цыплят после введения эстрадиола можно использовать при прогнозировании яичной продуктивности кур. Нет необходимости использовать в качестве показателей фосфопротеидный фосфор и общий кальций одновременно, достаточно одного из них. Определение общего кальция методически проще. Определив его, с помощью несложных вычислений легко получить концентрацию белковосвязанного фосфора в плазме крови цыплят после введения 17--эстрадиола.
Введение эстрадиола цыплятам приводило к заметному увеличению массы печени на 2-е сут после однократного и повторного введения 17--эстрадиола (p<0,001) - по группам соответственно, 36,1 и 38,2 г против 28,1 и 28,5 г в контроле, достигая максимума на 4-е сутки (37,6 и 41,1 г) и возвращаясь к контрольному уровню (28,7 и 29,2 г) на 8-е сутки.
В изменении содержания ДНК в тканях печени отмечалась некоторая периодичность (табл. 2). Так, на 1-е и 3-и сутки после однократного введения гормона происходило понижение количества ДНК, перемежаемое повышением этого показателя, что может быть обусловлено частичной синхронизацией клеток печени по митотическому циклу. Наименьшее содержание ДНК после однократного и повторного введения гормона наблюдали на 3Ц4-е сутки, когда отмечались максимумы по массе печени и содержанию рибосом. Следовательно, развитие белоксинтезирующего аппарата клеток печени достигало максимума на 3Ц4-е сутки, что вызывало некоторую гипертрофию гепатоцитов и снижение содержания ДНК. В последующем содержание ДНК постепенно повышалось и на 9-е сутки достоверно отличалось от регистрируемого на 3Ц4-е сутки (p<0,05). Количество рибосом при этом уменьшалось (p<0,01) и на 9-е сутки возвращалось к контрольному значению (рис. 9). Увеличение содержания ДНК и уменьшение содержания рибосом вызваны распадом гипертрофированного под влиянием 17--эстрадиола белоксинтезирующего аппарата клеток печени. Это подтверждается изменением рибонуклеазной активности в тканях печени. На пятые сутки после введения гормона она на 40% превышала контрольные значения (p<0,001Ц0,05), а на 2 - 4-е сутки в период нарастания содержания рибосом в печени становилась ниже контроля на 29Ц16%.
Содержание РНК в тканях печени цыплят возрастало как после однократного, так и после повторного введения 17--эстрадиола при наибольшем значении на 5-е сутки. Наблюдаемое уменьшение содер 2. Масса печени цыплят, содержание в ней РНК, ДНК и рибонуклеазная активность после однократного (О) и повторного (П) введения 17--эстрадиола Рибонуклеаза Масса печени, г/кг РНК, мг/г ДНК, мг/г А260/минг Время после печени введения О П О П О П О Контроль 28,12,7 28,52,2 6,810,37 7,080,37 2,110,24 2,170,10 1,330,3 ч 24,60,7 31,62,0 6,770,40 7,040,16 2,400,18 2,640,08 1,790,6 ч 29,52,4 35,41,4 7,480,29 6,820,40 2,410,09 2,540,15 - 9 ч 29,92,6 33,10,8 7,850,23 7,780,37 2,320,04 2,450,12 - 12 ч 31,52,1 33,41,2 7,480,06 6,570,16 2,450,13 2,160,09 1,240,1 сут 32,81,6 33,81,1 6,770,23 6,830,16 1,940,04 1,980,13 1,320,2 сут 36,11,3 38,22,1 8,510,13 8,390,29 2,190,02 1,790,11 0,950,3 сут 39,01,5 38,51,5 8,680,18 8,440,20 1,930,07 2,070,07 1,240,4 сут 37,61,1 41,11,1 8,410,21 8,500,05 2,040,07 1,760,07 1,120,5 сут 32,51,2 33,51,5 9,210,28 9,210,24 2,340,14 2,170,06 1,880,6 сут 37,01,4 32,74,2 8,870,24 8,840,47 2,170,10 2,360,11 2,050,7 сут 38,21,4 36,51,6 8,410,43 8,550,23 2,130,15 2,120,04 1,730,8 сут 28,71,8 29,21,9 7,850,25 9,150,33 2,370,08 2,800,19 1,730,9 сут 30,51,9 34,95,3 8,450,47 8,600,16 3,200,09 2,570,17 1,720,жания РНК и рибосом в печени через четыре часа после однократного введения гормона сопровождалось увеличением рибонуклеазной активности на 35% (p<0,05).
Изменение количества ДНК зависело от схемы применения эстрогена. Так, на 2-е и 4-е сутки содержание ДНК было достоверно ниже при повторном введении эстрадиола, что свидетельствует о более высокой степени гипертрофии гепатоцитов. На 9-е сутки после однократного введения эстрадиола этот показатель возрастал и превышал контрольное значение (р<0,01). При повторном введении эстрадиола на последних стадиях ответа повышение ДНК наблюдали на 8Ц9-е сутки (табл. 2).
Количество общего белка в печени после однократной и повторной эстрогенизации не различалось. В динамике содержания рибосом в печени после однократного и повторного введения цыплятам 17--эстрадиола имелись некоторые различия: снижение в первые часы после введения гормона, характерное для однократной эстрогенизации (p<0,05), после повторной - не наблюдали. На 12-й ч после повторного введения эстрогена, а также на 3-е и 6-е сутки содержание рибосом было достоверно выше, чем после однократного.
В остальные сроки статистически достоверных различий не обнаружили. Наличие разбросов, обусловленных индивидуальной чувствительностью цыплят к 17--эстрадиолу, затрудняло непосредственное сравнение изменений показателя. Поэтому для оценки динамики содержания рибосом методом наименьших квадратов были построены уравнения регрессии A = a + bt + ct2 + dt3, где А - содержание рибосом в тканях печени, А260/г; t - время после введения гормона, сутки (рис. 9). При сравнении полученных кривых видно, что содержание рибосом в печени цыплят после повторной эстрогенизации в целом выше (p<0,05). Следовательно, после повторной эстрогенизации интенсивность синтеза белка в печени выше, чем после однократной, что и требует большего числа рибосом.
Таким образом, биогенез рибосом в печени у цыплят представляет собой один из главных факторов, количественно определяющих ответ на введение 17--эстрадиола. Изменения в печени после однократного и повторного введения 17--эстрадиола носили обратимый характер.
С целью выяснения роли отдельных классов РНК в становлении вителлогенной функции печени нами использовались: -аманитин - высокоспецифичный ингибитор РНК полимеразы II, ответственной за синтез мРНК; актиномицин Д - антибиотик в малых дозах преимущественно ингибирующий синтез РНК; тиоацетамид (ТАА) - стимулирующий синтез некоторых классов РНК (табл. 3).
2211110 1 2 3 4 5 6 7 8 9 сутки Рисунок 9. Содержание рибосом в печени у цыплят при однократном (1) и повторном (2) введении 17--эстрадиола Действие -аманитина зависело от времени его введения. Будучи введенным одновременно с эстрадиолом, -аманитин полностью подавлял ответ на эстрогенизацию, увеличения содержания фосфопротеидов и триглицеридов не происходило, содержание общего белка в плазме крови снижалось на 37% по сравнению с уровнем контроля. Если -аманитин вводили через 1 сутки после эстрадиола, то на вторые сутки после введения гормона наблюдалось значительное (на 83%) подавление синтеза вителлогенина и в гораздо меньшей степени (на 18%) синтеза триглицеридов, что связано с различной динамикой их биосинтеза и чувствительностью к изменениям в метаболизме РНК. -Аманитин, блокируя синтез мРНК, препятствует синтезу вителлогенина из-за отсутствия матриц для синтеза. При этом ферменты для синтеза триглицеридов не теряют способности работать в присутствии -аманитина, поэтому синтез триглицеридов уменьшается в меньшей степени.
26 A/г 3. Влияние ингибиторов на показатели крови и печени цыплят через двое суток после введения 17--эстрадиола Плазма крови Печень Время Введенное введения Фосфор Триглице- Рибо- РНК-азная вещество ингиби- белкориды, сомы, активность, торов вый мг/мл% А260/г А260/мин.г мкг/мл% Контроль 0,90,2 5,61,7 1425 17,82,Эстрадиол 55,45,8 57,93,2 1748 12,90,6* Эстрадиол Одно1,10,1 7,60,2 1454 - +-аманитин временно Эстрадиол Через 10,11,0 48,50,2 1432 - +-аманитин 24 час.
Эстрадиол Одно38,93,7 40,22,8 1566 - +актиномицин Д временно Эстрадиол Через 16,30,5 26,86,2 1598 - +актиномицин Д 24 час.
Эстрадиол Через 17,81,1 38,03,5 1534 16,72,+тиоацетамид 24 час Контроль Через 1,40,1 10,80,5 1274 28,91,4* 24 час +тиоацетамид -Аманитин, введенный как одновременно с гормоном так и через 24 часа после него, подавлял вызываемое эстрадиолом увеличение рибосом в гепатоцитах.
Актиномицин Д, введенный одновременно с гормоном, не полностью подавлял ответ печени на эстрогенизацию, но примерно на 30% снижал содержание как вителлогенина, так и триглицеридов в крови цыплят. Равномерное снижение синтеза вителлогенина и триглицеридов, мы связываем с дефицитом рибосом, увеличению содержания которых препятствовал актиномицин Д.
Введение ТАА одновременно с 17--эстрадиолом подавляло вызываемое 17--эстрадиолом увеличение содержания РНК и рибосом в печени, при этом содержание фосфопротеидов в плазме крови составило 25%, триглицеридов 35% от значений, наблюдаемых через одни сутки после введении цыплятам только 17--эстрадиола.
Введение ТАА цыплятам контрольной группы на 62% увеличивало рибонуклеазную активность и на 29% включение Н-уридина в РНК печени. У цыплят опытной группы ТАА препятствовал снижению рибонуклеазной активности, вызванному введением 17--эстрадиола. Полученные данные показывают, что ингибирующее действие тиоацетамида на эстрогениндуцированный вителлогенез происходит за счет увеличения рибонуклеазной активности в печени цыплят.
3.3. Роль митохондрий в вителлогенезе печени Становление вителлогенной функции печени при половом созревании кур и при введении эстрогенов цыплятам сопряжено с началом синтеза компонентов яичного желтка. С каждым желтком при снесении яйца из организма курицы выделяется около шести граммов липидов и трех граммов протеина, что обуславливает увеличение энерготрат и предполагает интеграцию вителлогенеза с биогенезом и функциональной активностью митохондрий.
В наших опытах эстрогенизация цыплят повлияла на функциональную активность митохондрий печени (табл. 4).
4. Влияние 17--эстрадиола на цитохромоксидазную активность митохондрий и на содержание мтДНК и мтРНК в печени Время после введения 17--эстрадиола, час Показатель контроль 4Ц12 24Ц48 72итохромоксидазная активность, 25315 20114 1659** 43729*** нмоль О2/минмг белка мтДНК, мкг/мг белка 0,690,03 0,810,03 0,620,03 1,470,07** митохондрий мтРНК, мкг/мг белка 5,20,4 6,40,3 9,50,5** 14,31,0*** митохондрий Коэффициент РНК/ДНК 7,5 7,9 15,3 9,в митохондриях Содержание ДНК в митохондриях (мтДНК) печени через 4Ц12 ч после введения 17--эстрадиола возросло на 17%. Еще более высокие значения зафиксировали через 72Ц96 ч: увеличение было 2,1кратным (p<0,001). Содержание РНК в митохондриях (мтРНК) в опытной группе оказалось больше, чем в контрольной. Наибольший рост показателя (в 1,8Ц2,8 раза) происходил в период с 24 до 96 ч после введения эстрадиола. Величина отношения мтРНК/мтДНК возросла, достигая через 24Ц48 ч максимального значения, после чего несколько снизилась, оставаясь, тем не менее, выше, чем в контроле.
Цитохромоксидазная активность через 4Ц48 ч была несколько ниже, через 72Ц96 ч - в 1,7 раза выше контрольного значения. Введение цыплятам актиномицина Д одновременно с 17--эстрадиолом предотвращало как падение, так и повышение активности цитохромоксидазы. Это предполагает ее зависимость от синтеза de novo рибосомных РНК в ядрах гепатоцитов.
Измерение скоростей дыхания митохондрий показало, что в течение 24 ч после введения 17--эстрадиол не оказывал какого-либо заметного влияния на окисление сукцината в присутствии АДФ, в ее отсутствие и не изменял скорость переноса электронов в разобщенной дыхательной цепи (табл. 5).
5. Влияние 17--эстрадиола на транспорт кальция и скорость потребления кислорода митохондриями печени цыплят (нмольО2/минмг белка) при окислении сукцината Время после введения 17--эстрадиола, час Показатель контроль 4Ц24 36Ц48 72ЦКоэффициент Са/О 4,00,1 4,50,2 5,30,2** 7,70,2*** В присутствии АДФ (V3) 28,51,0 30,01,5 19,51,0** 25,51,В отсутствие АДФ (V4о) 8,51,0 7,30,7 5,50,2* 15,01,5*** В присутствии ДНФ (Vднф) 25,01,0 23,02,5 16,01,2** 28,51,Через 36Ц48 ч после введения 17--эстрадиола в митохондриях наблюдалось заметное снижение скорости контролируемого (V4о) и активного дыхания (V3), а также в разобщенном состоянии дыхательной цепи (Vднф). Аналогичные результаты были получены при окислении других субстратов. Скорость потребления кислорода митохондриями печени эстрогенизированных цыплят при окислении глутамата+малата уменьшилась на 37Ц39%, -кетоглутарата - на 50 - 52%. После 72Ц96 ч у цыплят происходило увеличение скоростей дыхания как в присутствии акцепторов фосфата (V3), так и после использования всего добавленного АДФ (V4о).
Характер окислительного фосфорилирования и активного транспорта в митохондриях печени у кур-несушек и эстрогенизированных цыплят был аналогичен (табл. 6). У кур-несушек АДФ практически необратимо стимулировал дыхание, отмечалось низкое значение коэффициента АДФ/О. Снижение показателей энергетического сопряжения дыхания и фосфорилирования наблюдали при использовании среды инкубации, содержащей ионы магния, повышение - в их отсутствие. При этом величина отношения АДФ/О возросла с 0,50 до 1,50; а скорость дыхания после использования всего добавленного АДФ уменьшилась до 9,0 и практически равнялась таковой у цыплят и взрослых петухов. У кур добавление аденозинмонофосфата не влияло на скорость дыхания в отсутствие Mg2+, но стимулировало его в присутствии этого иона. Исключение ионов магния из среды инкубации практически не влияло на дыхание митохондрий печени у цыплят и взрослых петухов.
6. Окислительное фосфорилирование и коэффициент Са/О митохондрий печени цыплят и взрослой птицы Цыплята эстрогенизированные курыПоказатель петухи (контроль) цыплята (72 ч) несушки Скорость потребления кислорода в присутствии АДФ, нмольО2/минмг белка +Mg 28,52,0 30,01,5 25,01,0 30,02,ЦMg 28,02,0 29,01,5 26,02,0 28,02,Скорость потребления кислорода после исчерпания добавленного АДФ, нмольО2/минмг белка +Mg 8,51,5 15,01,5*** 22,31,7 7,51,ЦMg 7,01,0 7,00,5 9,01,2 7,01,Коэффициент АДФ/О +Mg 1,850,10 1,200,01* 0,500,20 1,850,ЦMg 1,850,09 1,900,02 1,500,10 1,850,Коэффициент Са/О 4,00,1 6,60,2** 11,03,0 4,00,Для митохондрий печени цыплят опытной группы также было характерно низкое сопряжение дыхания и фосфорилирования в присутствии ионов магния и повышение степени сопряженности в их отсутствие. Полученные результаты позволили заключить, что в митохондриях эстрогенизированных цыплят также как у кур происходит включение аденилаткиназной реакции, которая активируется ионами магния и служит связующим звеном между окислительным фосфорилированием и процессами биосинтеза. При этом низкие показатели сопряжения дыхания и фосфорилирования у кур-несушек и эстрогенизированных цыплят обусловлены отвлечением промежуточных макроэргических соединений на специфические биосинтезы.
Одной из эндергонических реакций митохондрий, конкурирующей за промежуточные богатые энергией соединения с синтезом АТФ, является транспорт ионов кальция. В нашем опыте коэффициент Са/О для митохондрий печени у кур-несушек был в 2,8 раза выше, чем у цыплят и петухов. Это предполагает, что поглощение ионов кальция митохондриями у кур-несушек происходит с меньшей затратой кислорода, чем у цыплят и петухов. Под влиянием 17-эстрадиола (через 72Ц96 ч) у цыплят коэффициент Са/О возрастал в 1,9 раз приближаясь к таковому у кур-несушек (табл. 6).
Под влиянием 17--эстрадиола в митохондриях печени цыплят происходило снижение пула свободных аминокислот. Если в контрольной группе сумма свободных аминокислот составила 0,3мкмоль/мг белка, то через 36 ч она составила 0,269, а через 72 ч 32,6% от контрольной величины (p<0,001). Концентрация аргинина и лизина в контроле была 5,6 и 6,0 нМ/мг белка, соответственно, затем она увеличивалась и через 36Ц48 ч была в 2Ц2,5 раза больше, чем в контроле (p<0,001).
Полученные результаты позволили заключить, что при активации вителлогенной функции после введения 17--эстрадиола, в печени цыплят наблюдалось два пика стимуляции биогенеза митохондрий.
Первый по времени совпадал с синтезом ядерной ДНК (до 24 ч после введения эстрадиола), когда характеристики процесса окислительного фосфорилирования не отличались от таковых в контроле. Более интенсивный второй пик регистрировался через 72Ц96 ч после инъекции, и в этот период активность окислительного фосфорилирования в митохондриях печени эстрогенизированных цыплят была аналогична таковой у кур-несушек.
Действие клофибрата на митохондрии печени цыплят проявилось в двукратном увеличении скорости дыхания в третьем и четвер том состояниях по Чансу, в случае использования сукцината в качестве субстрата. Если субстратами служили глутамат+малат, то скорость дыхания митохондрий, лишь немного превышала контроль.
Под влиянием клофибрата на 67% возрастала цитохромоксидазная активность митохондрий. Клофибрат снижал вызванное 17-эстрадиолом увеличение концентрации триглицеридов и не влиял на базовый уровень триглицеридов в плазме крови цыплят (табл.7).
7. Влияние клофибрата и 17--эстрадиола на цитохромоксидазную активность, скорость потребления кислорода (нмоль О2/мин х мг белка) митохондриями печени и содержание триглицеридов в крови цыплят V3 Триглицериды V3 (глютамат ЦитохроГруппа плазмы крови, (сукцинат) моксидаза + малат) мг/мл% Контроль 32,41,2 22,81,5 19120 3,30,7 сут. кормления 57,02,1*** 27,82,0 31931** 3,50,клофибратом 1 сут. после 59,12,5*** 26,41,7 28725** 3,40,клофибрата 2 сут. после 62,53,0*** 25,81,9 30427** 3,30,1,клофибрата 7 сут. Клофибрат + эстрадиол 38,02,0 29,91,8 24420 8,61,(1 сут.) 7сут. клофибрат + 40,62,5 24,81,9 26623 26,41,3*** эстрадиол (2 сут.) Эстрадиол 30,01,9 20,21,7 14315 12,22,0*** (1 сут.) Эстрадиол 19,51,0** 11,50,8*** 11510** 36,77,9*** (2 сут.) Таким образом, снижение триглицеридемии под влиянием клофибрата происходит на фоне стимуляции дыхательной и цитохромоксидазной активностей митохондрий, что определяет важную роль митохондрий в регуляции липогенеза. Функциональные изменения в печени цыплят, вызванные введением эстрадиола, и становление ее вителлогенной функции интегрированы с биогенезом, активностью окислительного фосфорилирования и функциональной специализацией митохондрий.
ВЫВОДЫ На основании проведенных исследований по оценке трансгенных перепелов и изучению гормональной экспрессии генов у кур можно сделать следующие выводы:
1. Методом микроинъекции генной конструкции с геном гормона роста быка в зародышевые диски яйцеклеток перепелок эстонской породы была получена трансгенная птица.
2. Пересадка гена гормона роста быка перепелам эстонской породы повысила их живую массу на 5Ц15% и массу яиц на 10Ц20%.
Высокие показатели наследовались в ряду поколений (p<0,001).
3. Яйценоскость перепелок в опытной группе колебалась по поколениям от 200 до 235 яиц за 50 недель их жизни, в контроле - от 193 до 227. Средняя яйцемасса за этот период в опытной группе составила 2749,4 г, что на 11% больше, чем в контрольной группе (p<0,001).
4. У потомков трансгенных перепелов установлено повышение иммунного статуса, выраженного в ускоренной выработке антител к вводимому антигену. Через четыре недели разность титров была высоко достоверна (p<0,001). В сыворотке крови опытной группы logсоставил 6,00,23, в контрольной - 4,00,24; в желтке яиц опытной группы - 4,90,23, в контрольной - 2,90,09.
5. Введение 17--эстрадиола цыплятам в возрасте 2,5Ц3 месяцев вызывало экспрессию генов, приводящую к становлению вителлогенной функции печени, при этом происходило увеличение ее массы в 1,3Ц2,2 раза и содержания рибосом в ней на 25Ц47%. Количество белка в плазме крови увеличивалось на 70 %, из которых в среднем по 20 % приходилось на долю вителлогенина и ЛОНП I, 10 % - ЛОНП II, являющихся предшественниками яичного желтка; оставшиеся - составляли обычные белки плазмы крови цыплят. Изменения по всем изученным показателям носили обратимый характер и были статистически достоверны (p<0,001Ц0,05).
6. Индукция 17--эстрадиолом синтеза ЛОНП I и вителлогенина имела разную динамику. ЛОНП I появлялся в крови на 12 часов раньше, а исчезал позже вителлогенина, который появлялся через часа, а исчезал через 9 суток; на 5 сутки - их содержание было одинаковым. Синтез ЛОНП II эффективнее, чем синтез вителлогенина;
при перерасчете их содержания в крови на молекулярную массу ЛОНП II было в 9 раз больше, чем молекул вителлогенина.
7. Скорость становления вителлогенной функции в печени цыплят зависела от дозы и кратности введения эстрадиола. Синтез фосфопротеидов увеличивался с повышением дозы 17--эстрадиола с 10 до 30 мг/кг живой массы. Дозы 50 и 70 мг/кг действовали угнетающе.
8. Максимум ответа на введение 17--эстрадиола приходился на пятые сутки. Количество фосфопротеидов в плазме крови цыплят при повторном введении 17--эстрадиола на максимуме ответа в 1,раза превышало этот показатель при первичном ответе.
9. Введение 17--эстрадиола цыплятам приводило к изменению рибонуклеазной активности в печени; через 3Ц4 часа она кратковременно повышалась на 35%, на 2Ц4-е сутки была ниже контроля (71 - 84%), на 5Ц9-е сутки после введения гормона она на 29Ц54% превышала значение в контрольной группе (p<0,001Ц0,05).
10. Действие -аманитина на гормональный вителлогенез у цыплят зависело от времени его введения. Введение -аманитина одновременно с 17--эстрадиолом полностью подавляло увеличение содержания фосфопротеидов и триглицеридов и на 37% - содержание общего белка в плазме крови по сравнению с контролем. Если аманитин вводился на одни сутки позже 17-- эстрадиола, то на вторые сутки после введения гормона происходило подавление синтеза вителлогенина на 83%, синтеза триглицеридов - на 18% (p<0,001).
11. Введение тиоацетамида цыплятам на 62% увеличивало рибонуклеазную активность. Введение тиоацетамида одновременно с 17-эстрадиолом подавляло вызываемое 17--эстрадиолом увеличение содержания РНК и рибосом в печени, при этом содержание фосфопротеидов в плазме крови составило 25%, триглицеридов 35% от значений, наблюдаемых через одни сутки после введении цыплятам только 17--эстрадиола (p<0,01Ц0,05).
12. При активации вителлогенной функции после введения 17-эстрадиола в печени цыплят наблюдались два пика стимуляции биогенеза митохондрий. Первый по времени совпадал с синтезом ядерной ДНК (12Ц24 ч после введения эстрадиола), в это время показатели окислительного фосфорилирования не отличались от таковых в контроле. Более интенсивный второй пик регистрировался через 72 - 96 ч после инъекции. Это сопровождалось увеличением содержания мтРНК в 2,8 раза и увеличением цитохромоксидазной активности в 1,7 раза по сравнению с контролем (p<0,001Ц0,01). Введение цыплятам 17--эстрадиола одновременно с актиномицином Д препятствовало повышению активности цитохромоксидазы, что предполагает ее зависимость от синтеза de novo рибосомных РНК в ядрах гепатоцитов.
13. Введение 17--эстрадиола цыплятам привело к снижению скорости дыхания митохондрий через 36Ц48 ч.: скорость окисления сукцината падала на 32Ц35%, глутамата+малата - на 37Ц39%, кетоглутарата - на 50Ц52%. Под влиянием 17--эстрадиола через 72 - 96 ч. в митохондриях цыплят возрастал коэффициент Са/О в 1,9 раз, приближаясь к таковому у кур-несушек (p<0,001Ц0,01).
14. Митохондрии печени эстрогенизированных цыплят и курнесушек имеют более низкое сопряжение дыхания с фосфорилированием, чем в контроле. Величина отношения АДФ/О в митохондриях у цыплят контрольной группы составила 1,85; у опытных цыплят - 1,20 (p<0,05); у кур-несушек - 0,50 (p<0,001).
15. Митохондрии печени цыплят, которым в течение семи суток давали per os клофибрат, повысили на 67% цитохромоксидазную активность и на 20Ц76% скорость дыхания; последующее введение 17-эстрадиола снизило этот эффект, не снимая полностью. Клофибрат снизил вызванное 17--эстрадиолом увеличение количества триглицеридов в плазме крови на 28Ц30%, не влияя на их содержание в контроле (p<0,001Ц0,01).
СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Данные исследования апробированы в производственных условиях ФГУП Загорское ЭПХ ВНИТИП Россельхозакадемии (Акт производственной проверки от 20 марта 2009 г.). В производственной проверке подтвердились результаты исследований о высокой массе яиц трансгенных перепелов: масса яиц группы перепелок нового варианта была на 18,7% выше массы яиц перепелов базового варианта в возрасте 11Ц12 недель.
2. Результаты по цитохромоксидазной и фосфорилирующей активности митохондрий печени были использованы при уточнении норм витаминов в рационах кур (Фисинин В.И., Коршунова Л.Г., 1988; Байковская И.П., Коршунова Л.Г., 1989), а также в Методическом руководстве для зоотехнических лабораторий Оценка качества кормов, органов, тканей, яиц и мяса птицы, под общей редакцией академика РАСХН В.И. Фисинина и доктора биологических наук, профессора А.Н. Тишенкова, 1998 год, 116 с.
РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 1. Результаты о высокой массе яиц трансгенных по гену бычьего соматотропина перепелов, подтвержденные данными производственной проверки, свидетельствуют о возможном практическом использовании методов трансгенеза в селекционной работе и, в том числе, как эффективный прием на повышение массы яиц.
2. Предложен способ отбора перепелок по массе яиц, позволяющий дать объективную характеристику поголовья по этому показателю и провести целенаправленный отбор перепелок-дочерей с повышенной массой яиц для комплектования промышленных и племенных стад без длительной оценки птицы. На данный способ оценки получен Патент РФ на изобретение №2402209 Способ отбора перепелок по массе яиц (2009).
3. Разные динамики индукции синтеза вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности в печени цыплят, свидетельствующие об относительно независимой экспрессии соответствующих генов, являются обоснованием возможности раздельной селекции кур по этим признакам.
4. Установлена линейная зависимость содержания фосфопротеидного фосфора и общего кальция в крови эстрогенизированных цыплят, что позволяет использование каждого из них для прогнозирования яичной продуктивности кур. Из соображений методического характера показатель общего кальция является предпочтительным.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в рецензируемых журналах ВАК РФ:
1. Коршунова Л.Г., Карапетян Р.В. Трансгеника и ее перспективы в птицеводстве // Птицеводство. - 2000. - № 4. - С. 23Ц25.
2. Коршунова Л.Г., Карапетян Р.В. Генетически модифицированные растения в кормах для птицы // Птицеводство. - 2007. - № 12. - С. 14Ц15.
3. Коршунова Л.Г., Карапетян Р.В. Гормональный и иммунный статус трансгенных перепелов // Ветеринария. - 2009. - № 5. - С.
15Ц16.
4. Коршунова Л.Г. Качество яиц перепелов эстонской породы // Птица и птицепродукты. - 2009. - № 3. - С. 50Ц51.
5. Коршунова Л.Г. Качество яиц трансгенных перепелов // Птицеводство. - 2009. - № 4. - С. 35Ц36.
6. Коршунова Л.Г. О роли митохондрий в становлении вителлогенной функции печени у кур // Сельскохозяйственная биология. - 2009. - № 4. - С. 46Ц50.
7. Коршунова Л.Г. Способ генетического улучшения продуктивных признаков птицы // Вестник РАСХН. - 2009. - № 3. - С. 72 - 73.
8. Коршунова Л.Г. Биологические и продуктивные качества перепелов, трансгенных по гену бычьего соматотропина // Сельскохозяйственная биология. - 2011. - № 2. - С. 46Ц50.
9. Коршунова Л.Г., Карапетян Р.В. Биохимический подход к прогнозированию яичной продуктивности кур // Доклады Россельхозакадемии. - 2011. - № 6. - С. 43Ц44.
10. Коршунова Л.Г., Карапетян Р.В. Влияние дозы 17-бетаэстрадиола на вителлогенез печени цыплят // Вестник РАСХН. - 2011. - № 6. - С. 64Ц66.
11. Коршунова Л.Г., Карапетян Р.В. Синтез вителлогенина в печени эстрогенизированных цыплят // Вестник РАСХН. - 2011. - № 4.
- С. 67Ц69.
12. Коршунова Л.Г. Фенотипическая характеристика серых перепелов эстонской породы // Птица и птицепродукты. - 2011. - № 3.
- С. 43Ц47.
13. Фисинин В.И., Околелова Т.М., Коршунова Л.Г. Гормональный статус мясных кур при различном уровне лимитирующих витаминов в рационе // Доклады ВАСХНИЛ. - 1990. - № 8. - С. 51Ц54.
14. Цитохромоксидазная и фосфорилирующая активность печени ремонтных курочек в зависимости от их возраста и дозы витаминов в рационе / В.И. Фисинин, Т.М. Околелова, Л.Г. Коршунова, Р.В. Карапетян // Сельскохозяйственная биология. - 1988. - № 3.
- С. 43Ц45.
Патентные материалы 15. Способ отбора перепелок по массе яиц: пат. 2402209 RU / В.И. Фисинин, Л.Г. Коршунова, Р.В. Карапетян и др № 2009118061/13; заявл. 12.05.2009; опубл. 27.10.2010, Бюл. № 30.
Публикации в материалах конференций и других научных и научно-практических изданиях:
16. Биоэнергетика митохондрий печени ремонтных молодок в зависимости от уровня жиро- и водорастворимых витаминов в рационе / В.И. Фисинин, Т.М. Околелова, Л.Г. Коршунова и др. // Научные основы витаминного питания с.-х. животных: тезисы докладов 2-го Всесоюзного симпозиума. - Юрмала, 1987. - С. 217Ц218.
17. Влияние дозы эстрадиола на динамику синтеза вителлогенина в печени цыплят / Л.Г. Коршунова, Р.В. Карапетян, И.В. Журавлев, В.И. Фисинин // Всесоюзный биохимический съезд. Тезисы. - Киев, 1986. - Т. 3. - С. 263Ц264.
18. Газоэнергетический обмен и пищеварение у бройлеров при ограниченном кормлении / А.Н. Тишенков, Л.Г. Коршунова, Н.А. Зубарева и др. // Интенсификация птицеводства. Сборник научных трудов ВНИТИП. - Загорск: ВНИТИП, 1987. - С. 139Ц151.
19. Гормональный статус ремонтных молодок при различном уровне лимитирующих витаминов в рационе / В.И. Фисинин, Т.М.
Околелова, Р.В. Карапетян, Л.Г. Коршунова // Научные основы витаминного питания с.-х. животных. Тез. докладов 2-го Всесоюзного симпозиума. - Юрмала, 1987. - С. 215Ц216.
20. Жирнокислотный состав липидов желтка яиц трансгенных перепелов / Л.Г. Коршунова, М.М. Демченко, А.Н. Шевяков, Р.В Карапетян // Сборник научных трудов ВНИТИП. - Сергиев Посад:
ВНИТИП, 2008. - Т. 83. - С. 84Ц93.
21. Инъекции гена бета-галактозидазы в яйцеклетки кур / Р.В.
Карапетян, Л.Г. Коршунова, Л.Е. Андреева и др. // Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: тезисы докладов. - Москва, 1996. - С. 35Ц35.
22. Использование полярографического метода для определения трихотецина / Е.Б. Кругляк, С.Г. Билуши, П.М. Зайцев, Л.Г. Коршунова // Антибиотики. - 1977. - Т. 22. - № 12. - С. 1088Ц1093.
23. Карапетян Р.В., Коршунова Л.Г. Содержание рибосом в печени цыплят и индукция синтеза вителлогенина 17-бета-эстрадиолом // Передовой науч.-произв. опыт в птицеводстве: Экспресс-информ. / ВНИИТЭИСХ, Всесоюз. н.-и. и технол. ин-т птицеводства. - 1980. - № 5. - С. 15Ц20.
24. Карапетян Р.В., Коршунова Л.Г., Журавлев И.В. Эстрогенстимулированный вителлогенез в печени неполовозрелых цыплят // Тез. докл. Всесоюзного симпозиума по биохимии с.-х. животных. - Витебск, 1982. - С. 72Ц73.
25. Карапетян Р.В., Коршунова Л.Г., Журавлев И.В. Биогенез рибосом и синтез вителлогенина в печени цыплят после однократного и повторного введения эстрадиола // Новое в селекции, кормлении и профилактике заболеваний с.-х. птицы. Сб. науч. трудов ВНИТИП. - Загорск: ВНИТИП, 1983. - Т. 56. - С. 40Ц47.
26. Карапетян Р.В., Коршунова Л.Г., Журавлев И.В. Эстрогениндуцированный вителлогенез, метаболизм РНК в печени цыплят и действие альфа-аманитина, актиномицина Д и тиоацетамида // Физиолого-биохимические основы повышения продуктивности с.-х.
птицы. Сб. науч. трудов. - Боровск: ВНИИФБиП, 1985. - Т. XXXI. - С. 126Ц133.
27. Карапетян Р.В., Коршунова Л.Г., Фисинин В.И. Использование сперматозоидов в качестве вектора переноса чужеродной ДНК в яйцеклетки сельскохозяйственной птицы // Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России: материалы конференции. - С.-Петербург, 2008. - С. 55Ц56.
28. Карапетян Р.В., Коршунова Л.Г. Яичная продуктивность потомков перепелов, трансгенных по гену бычьего соматотропина // Достижения в современном птицеводстве. Исследования и инновации: материалы XVI конференции Российского отделения Всемирной научной ассоциации по птицеводству. - Сергиев Посад, 2009. - С. 34Ц35.
29. Коршунова Л.Г. Влияние 17-в эстрадиола на энергетическую функцию митохондрий печени цыплят // Передовой науч.-произв.
опыт в птицеводстве: Экспресс-информ. / ВНИИТЭИСХ, Всесоюз.
н.-и. и технол. ин-т птицеводства. - 1978. - № 7. - С. 28Ц30.
30. Коршунова Л.Г. Роль магния в регуляции фосфорилирования митохондрий печени кур // Передовой науч.-произв. опыт в птицеводстве: Экспресс-информ. / ВНИИТЭИСХ, Всесоюз. н.-и. и технол.
ин-т птицеводства. - 1978. - № 9. - С. 34Ц36.
31. Коршунова Л.Г. Влияние 17-в эстрадиола на содержание свободных аминокислот в митохондриях печени цыплят // Тезисы докладов 22 конференции молодых ученых и аспирантов по птицеводству. - Загорск, 1979. - С. 17Ц19.
32. Коршунова Л.Г., Журавлев И.В. Действие клофибрата на липогенез у цыплят // Передовой науч.-произв. опыт в птицеводстве:
Экспресс-информ. / ВНИИТЭИСХ, Всесоюз. н.-и. и технол. ин-т птицеводства. - 1980. - № 2. - С. 34Ц37.
33. Коршунова Л.Г. Роль митохондрий печени кур в синтезе основных компонентов яичного желтка: Автореф. дисс.... канд. биол.
наук. - Боровск, 1980. - 19 с.
34. Коршунова Л.Г., Журавлев И.В. Окислительное фосфорилирование митохондрий печени цыплят и кур // Митохондрии. Механизмы сопряжения и регуляции. Тез. докл. 11 Всесоюзного симпозиума. - Пущино, 1981. - С. 65Ц66.
35. Коршунова Л.Г., Тишенков А.Н., Зубарева Н.А. Биоэнергетика митохондрий печени кур в зависимости от факторов кормления // Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа. Тез. докл. Всесоюзного симпозиума. - Ташкент, 1986. - С. 83.
36. Коршунова Л.Г., Тишенков А.Н., Зубарева Н.А. Гормональный статус крови и обмен веществ у бройлеров при различной длительности светового периода // Передовой науч.-произв. опыт в птицеводстве: Экспресс-информ. / ВНИИТЭИСХ, Всесоюз. н.-и. и технол. ин-т птицеводства. - 1988. - № 5. - С. 33Ц39.
37. Коршунова Л.Г., Балаев А., Зубарева Н.А. Выращивание бройлеров в условиях пониженного воздухообмена // Передовой науч.-произв. опыт в птицеводстве: Экспресс-информ. / ВНИИТЭИСХ, Всесоюз. н.-и. и технол. ин-т птицеводства. - 1991.
- № 3. - С. 10Ц14.
38. Коршунова Л.Г., Зубарева Н.А., Карапетян Р.В. Энергетический обмен и гормональный статус крови мясных цыплят в зависимости от факторов кормления // Использование физических и биологических факторов в ветеринарии и животноводстве. Тез. докл. Всесоюзной науч. конференции. - Витебск, 1991.
39. Коршунова Л.Г., Зубарева Н.А., Карапетян Р.В. Энергетический обмен и гормональный статус крови у бройлеров в зависимости от плотности посадки // Проблемы современного птицеводства. - Харьков, 1991. - С. 102Ц103.
40. Коршунова Л.Г., Карапетян Р.В. Использование полимеразной цепной реакции для идентификации интегрированного в геном перепела гена гормона роста быка // Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов с.-х. животных: материалы международн. симпозиума. - С.-Петербург, Пушкин, 1994. - С.
18Ц19.
41. Коршунова Л.Г., Карапетян Р.В., Фисинин В.И. Трансформация генома птиц микроинъекцией ДНК в яйцеклетки на разных стадиях созревания // 6-ая Конференция Балтийских стран по птицеводству. - Вильнюс, Литва, 1998. - С. 52Ц55.
42. Коршунова Л.Г., Карапетян Р.В. Исследование экспрессии гена в-галактозидазы в трансгенных эмбрионах кур // Сборник научных трудов ВНИТИП. - Сергиев Посад: ВНИТИП, 2000. - Т. 75. - С.
101Ц104.
43. Коршунова Л.Г., Карапетян Р.В. Трансгенная птица // Науч.произв. опыт в птицеводстве: Экспресс-информ. / Всерос. н.-и. и технол. ин-т птицеводства. - 2000. - № 1. - С. 46Ц48.
44. Нормирование жирорастворимых витаминов для мясных кур-несушек / И.П. Байковская, Т.Л. Пименова, Л.Г. Коршунова и др.
// Вопросы повышения эффективности кормления сельскохозяйственной птицы. Сборник научных трудов ВНИТИП. - Загорск:
ВНИТИП, 1989. - С. 57Ц62.
45. Обмен веществ и пищеварение у бройлеров в зависимости от световых режимов / А.Н. Тишенков, Л.Г. Коршунова, Н.А. Зубарева, В.Н. Доброхотов // Вопросы повышения эффективности кормления сельскохозяйственной птицы. Сборник научных трудов ВНИТИП. - Загорск: ВНИТИП, 1989. - С. 123Ц129.
46. Обмен веществ и пищеварение у бройлеров на низкопротеиновых рационах с добавлением синтетических аминокислот / А.Н.
Тишенков, Л.Г. Коршунова, Н.А. Зубарева, В.Н. Доброхотов // Эффективное использование кормов в птицеводстве. Тезисы докладов Всесоюзной научно-технической конференции. - Новосибирск, 1990. - С. 16.
47. Оценка качества кормов, органов, тканей, яиц и мяса птицы.
Методическое руководство для зоотехнических лабораторий / В.И. Фисинин, А.Н. Тишенков, И.А. Егоров, и др. / под редакцией А.Н. Тишенкова и В.И. Фисинина - Сергиев Пcript')[0]; ss.parentNode.insertBefore(s, ss);})(); Р.В. Карапетян, Л.Г.
Коршунова, К.Р. Коршунов и др. // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Тез. докладов II Межд. науч. конф. - Москва, 2000. - С. 140Ц141.
49. Получение кур, трансгенных по гену в-интерферона / Л.Г.
Коршунова, В.А. Серикова, О.Ф. Зиадинова, Р.В. Карапетян // Сборник научных трудов ВНИТИП. - Сергиев Посад: ВНИТИП, 2000. - Т. 75. - С. 96Ц100.
50. Состояние обмена веществ и пищеварение у бройлеров в зависимости от содержания растворимых форм протеина в рационе / А.Н. Тишенков, Л.Г. Коршунова, Н.А. Зубарева, В.Н. Доброхотов // Селекция и воспроизводство сельскохозяйственной птицы. Сборник научных трудов ВНИТИП. - Загорск: ВНИТИП, 1990. - С. 157Ц167.
51. Сравнительная оценка яичной продуктивности потомков трансгенных и серых перепелов эстонской породы / Л.Г. Коршунова, Р.В. Карапетян, К.Р. Коршунов и др. // Сборник научных трудов ВНИТИП. - Сергиев Посад: ВНИТИП, 2001. - Т. 76. - С. 78Ц85.
52. Трансгенные технологии улучшения продуктивных качеств сельскохозяйственной птицы / Л.Г. Коршунова, Р.В. Карапетян, З.А.
Петрина, О.Ф. Зиадинова // Сборник научных трудов ВНИТИП. - Сергиев Посад: ВНИТИП, 2010. - Т. 85. - С. 18Ц24.
53. Фисинин В.И., Карапетян Р.В., Коршунова Л.Г. Использование спермиев в качестве вектора переноса чужеродной ДНК в яйцеклетки кур // Достижения в современном птицеводстве. Исследования и инновации: материалы XVI конференции Российского отделения Всемирной научной ассоциации по птицеводству. - Сергиев Посад, 2009. - С. 67Ц68.
54. Karapetyan R.V., Korshunova L.G., Fisinin V.I. Production of transgenic chicken by DNA microinjection in ovum // The poultry industry towards the 21st century: 10th European Poultry Conference. - Jerusalem, Israel, 1998. - V. 1. - P. 227Ц229.
55. Phenotypic features of transgenic quail carrying the bovine growth hormone gene / R.V. Karapetyan, L.G. Korshunova, K.R. Korshunov, V.I. Fisinin // XXI World's poultry congress. - XXI World's poultry congress, 2000. - P. 45.
56. Fisinin V.I., Karapetyan R.V., Korshunova L.G. Obtaining of transgenic chicken by DNA microinjection in ovum // Eight Baltic Poultry Conference. - Turku, Finland, 2000. - P. 80.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по сельскому хозяйству