Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по сельскому хозяйству  

ОБЪЯВЛЕНИЕ

Ермолаева  Ольга  Константиновна

Токсикологическая оценка монилиформина, изыскание методов индикации и средств профилактики монилиформинотоксикоза животных

06.02.03

биологические науки

Д-220.012.01

Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности

420075, г. Казань, Научный городок -2, тел. (843)  239.53.20

Email: vnivi@mail.ru

Предполагаемая дата защиты диссертации - 11 декабря  2012 г.

На правах рукописи

Ермолаева ольга константиновна

ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА МОНИЛИФОРМИНА, ИЗЫСКАНИЕ МЕТОДОВ ИНДИКАЦИИ И СРЕДСТВ ПРОФИЛАКТИКИ МОНИЛИФОРМИНОТОКСИКОЗА ЖИВОТНЫХ

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности (ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ, г. Казань).

Научный руководитель:	доктор биологических наук, профессор Тремасов Михаил Яковлевич
Официальные оппоненты:	Великанов Валериан Иванович заведующий кафедрой анатомии, фармакологии с токсикологией Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии доктор биологических наук, профессор Софронов Владимир Георгиевич заведующий кафедрой  зоогигиены Казанской государственной академии ветеринарной медицины, доктор ветеринарных наук, профессор
Ведущее учреждение:	Всероссийский научно-исследовательский  институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ВНИИВСГЭ) г. Москва.

Защита состоится л11 декабря 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при Федеральном центре токсикологической, радиационной и биологической безопасности (420075, г. Казань, Научный городок - 2, ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ (г. Казань).

Автореферат разослан л____ ________ 2012 г. и размещен на официальном сайте ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ www.vnivi.ru и на официальном сайте ВАК РФ www.vak2.ed.gov.ru.

Учёный секретарь диссертационного

совета, кандидат ветеринарных наук В.И. Степанов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.Наиболее часто встречающимися экотоксикантами, загрязняющими продукты питания и корма, являются микотоксины - яды микроскопических плесневых грибов (А.М. Смирнов и др., 1999; А.Ф. Кузнецов, 2001; А.В. Иванов и др., 2006, 2010; М.Я. Тремасов и др., 2009; О.В. Труфанов и др., 2012).

Микотоксины - вторичные, структурно различные метаболиты грибов, которые растут на разнообразных продуктах питания и кормах, потребляемых животными и человеком. Заболевания, возникающие в результате потребления последними контаминированных микотоксинами продуктов и кормов, классифицируются как микотоксикозы (В.А. Тутельян и др., 1985;А.В. Иванов; М.Я.Тремасов; К.Х. Папуниди, 2009; К. Гейнбихнер, 2012).

Исследования отечественных и зарубежных ученых показывают, что животноводство несет серьезные экономические потери от снижения продуктивности и воспроизводства сельскохозяйственных животных, возникающих при микотоксикозах (В.И. Дорожкин, В.Г. Иванов, 2007).

Микроскопические грибы в различных регионах могут отличаться по видовому составу, распространенностью и уровню загрязнения пищевых продуктов и кормов.В зависимости от климатических и географических условий изменяются и токсинообразующие свойства грибов. Высокая влажность воздуха и повышенная температура создают более благоприятные условия для образования токсинов. В связи с этим, выявление зон повышенного экологического риска и прогнозирование потерь является одной из серьезных задач, поставленных перед сельскохозяйственной наукой для повышения сохранности урожая, улучшения пищевой ценности кормов и пищевых продуктов и  их безопасности для населения (О.А. Монастырский, Ю.Д. Коган, 2001; В.А. Антипов и др., 2007; Г.П. Кононенко и др., 2009; В.В. Рухляда и др., 2009; А.В. Иванов и др. 2010, 2012).

Из известных в настоящее время микроскопических грибов, интерес представляют грибы из рода Fusarium, в частности менее изученный в регионах Среднего Поволжья Fusariummoniliforme.

Грибы Fusariummoniliforme (совершенная стадия Gibberellazea) поражает широкий круг зерновых культур, включая пшеницу, кукурузу, ячмень и др. В результате заражения оболочка зерна приобретает розовое окрашивание, а в нем могут накапливаться микотоксины, в частности монилиформин, ведущий к развитию алиментарных токсикозов человека и животных (В.А. Тутельян и др., 1994, 2002; А.Н. Котик 1999).

Несмотря на высокую токсичность и канцерогенность сведений о распространении грибов - продуцентов монилиформина в различных регионах России крайне незначительно, не изучены вопросы токсичности микотоксина, отсутствуют данные по методам его индикации в нашей стране, не разработаны средства профилактики и лечения отравлений животных. Учитываявышеизложенное, проблема изучения монилиформина является актуальной.

Цель и задачи исследования.Целью наших исследований явилось изучение степени распространения грибов - продуцентов микотоксинамонилиформина, определение параметров его токсичности, усовершенствование и разработка методов индикации, поиск средств профилактики монилиформинотоксикоза.

В этой связи перед нами были поставлены следующие задачи:

• изучить распространение грибов - продуцентовмонилиформина;
• изучить параметры острой токсичности монилиформина для животных;
• оценить изменения клинических, гематологических и биохимических показателей организма животных при интоксикации;
• разработать методы индикации монилиформина в кормах;
• оценить сорбционные свойства сорбентов различных групп в отношении монилиформина;
• изыскать способы профилактики монилиформинотоксикозов животных.

Научная новизна работы.Впервые изучена степень распространения микроскопических грибов потенциальных продуцентов микотоксинамонилиформина в РТ, составлена карта-прогноз вероятных микотоксикозов в регионе.

Определена острая токсичность монилиформина для лабораторных животных, изучены клинические, гематологические и биохимические показатели при монилиформинотоксикозе.

Разработаны методы высокоэффективной жидкостной и тонкослойной хроматографии для индикации монилиформина в кормах. Впервые в лабораторных условиях обоснована и подтверждена профилактическая эффективность использования Микосорба и Фитосорба при отравлении животных монилиформином.

Практическая ценность работы.Составлена карта распространения фузариоза и банк данных монилиформина республики Татарстан. В качестве средств профилактики монилиформинотоксикоза рекомендуется включать в рацион энтеросорбенты Микосорб и Фитосорб в концентрации 2% от сухого вещества в течение 30 суток. Применение отобранных средств снижает тяжесть токсикоза, благоприятно влияет на клинические, гематологические и биохимические показатели и выживаемость животных.

Результаты исследований вошли в Инструкции по применению энтеросорбентов для профилактики монилиформинотоксикоза животных, утв. Главным управлением ветеринарии КМ РТ (2012г.), Методическое пособие по профилактикемонилиформин - микотоксикоза животных, утв. отделением ветеринарной медициныРАСХН(2012 г.).

Апробация материалов диссертации.Основные материалы диссертационной работы доложены и одобрены на научных сессиях ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ по итогам НИР за 2005-2011 гг., международных и межрегиональныхнаучно - практических конференциях и симпозиумах (Казань 2005; 2006; 2007; 2008; 2009; Санкт - Петербург 2007; 2011; Воронеж 2007; Москва 2008; 2012; Краснодар 2011).

Публикации.По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

• загрязнения кормов микроскопическими грибами рода Fusarium в частности монилиформином;
• методы индикации монилиформина в кормах;
• токсичность и опасность монилиформина для животных;
• клинико-гематологические и биохимические показатели при монилиформинотоксикозе;
• оценка сорбционных свойств Микосорб и Фитосорб при монилиформинотоксикозе животных.

Объём и структура работы.Диссертация изложена на 147страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, методов и результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и списка литературы. Работа иллюстрирована 17 рисунками и содержит 24 таблиц. Список литературы включает 227 литературных источников, в том числе 121 зарубежных авторов.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 2005Ц2011 гг. в отделе токсикологии ФГБУ ФЦТРБ-ВНИВИ (г. Казань) в соответствии с тематическим планом НИР по теме: Токсикологическая безопасность (№ гос. регистрации 01200202603).

Исследования проведены на лабораторных (белые мыши, крысы - 190) и сельскохозяйственных (овцы - 12) животных. Перед постановкой опытов животные выдерживались на 2-х недельном карантине, кормление проводили согласно принятым в зоотехнии нормам.

Подопытные и контрольные группы  животных формировали по принципу аналогов. В течение всего опыта животные находились в одинаковых условиях содержания и кормления.

Для экспериментальных исследований использовали кристаллический монилиформин, выпускаемый фирмой Sigma (США). Для проведения опытов использовали спиртовой раствор монилиформинав концентрации 250 мкг/мл.

Микологические исследования проводили путем высева проб кормов на пластинчатый слой среды Чапека в чашках Петри. Посевы культивировали в термостате при 22-260С, согласно методике, описанной Курасовой В.В. и соавт. (1971). Учет роста микромицетов проводили на 7-10 сутки; колонии, по культуральным признакам отнесенные к роду Fusarium, выделили в чистые культуры. Видовую идентификацию проводили в соответствии с Пидопличко Н.М., Билай В.И. (1977). Токсичность грибов определяли на простейших (Parameciumcaudatum) по Спесивцевой Н.А. (1964). Количественное определение содержания монилиформина проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе Spectra 100 на колонке Luna 100 (250 х4,6 мм), подвижная фаза: 18% ацетонитрила в воде с добавками ион-парного реагента (тетрабутиламмоний гидроксид, 50%- ный водный раствор, Sigma, США) и 1,1 М водного раствора KH2PO4. Подтверждение присутствия монилиформина в полученном сухом остатке проводили масс - спектрометрически, в режиме химической ионизации метаном методом прямого ввода пробы и нагревания от 220С до 2500С.

В качестве средств профилактики монилиформинотоксикоза, применялись сорбенты: Микосорб - сорбент микотоксинов, производства компании Оллтек, Ирландия; Фитосорб, разработанный в ФГБУ ФЦТРБ - ВНИВИ и в Казанском Государственном Технологическом Университете; Хитозан, фирмы Эвалар, Россия; Сорбитокс, производства компании Biotal, Великобритания.

В основу эксперимента по определению адсорбционной способности сорбентов invitro была положена методика, описанная Крюковым В.С. с соавт. (1992).

Острую оральную токсичность изучали на белых мышах и крысах, живой массой тела 18-20 г и 180-200 г, соответственно.

Расчёт токсических доз проводили по методу Кербера (1931).

В ходе экспериментов изучалось клиническое состояние животных, потребление корма и воды, изменение массы тела, регистрировали продолжительность жизни, патологоанатомическую картину. После проведения необходимых процедур, определяемых целью и задачами эксперимента, брали кровь для исследований.

Количество эритроцитов, лейкоцитов, содержание гемоглобина в периферической крови определяли по общепринятым методикам, глюкозу - ортотолуидиновым методом, общий белок - рефрактометрически  (Б.И. Антонов и др., 2004; И.П. Кондрахин, 2004). Активность холинэстеразы - по методу Хестрина в модификации Панюкова П.Н. (1966). Другие биохимические показатели сыворотки крови определяли на анализаторе EXPRESSPLUS.

При выполнении отдельных этапов работы принимали участие с.н.с., к.м.н. Губеева Е.Г. и зав. лаб. физико-химического анализа Шангараев Н.Г., за что им выражаем признательность.

Обработку цифрового материала проводили методом вариационной статистики с применением критерия достоверности по Стъюденту на персональном компьютере с использованием программ Excel.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1Микофлора кормов в районах Республики Татарстан

Изучена степень контаминации кормов микроскопическими грибами в 2005 - 2011 годах, поступивших из различных регионов Среднего Поволжья, с изучением токсических свойств выделенных микромицетов на простейших (Parameciumcaudatum). Наибольший интерес представляли микромицетырода Fusarium, особенно продуценты монилиформина, которые являются малоизученными.Однако известны их высокотоксичные метаболиты, вызывающие у живых организмов кардиотоксикозы различной степени тяжести и серьезные повреждения сердечной мышцы, вследствие нарушения проницаемости сарколеммальной мембраны.

Максимальный процент загрязнения кормовгрибами рода Fusarium было выявлено в Тукаевском и Нижнекамском районах (60-70%): F. moniliforme, F. avenaceum, F. sporotrichiella, F. graminearum иF. culmorum - 37% из них обладали токсичностью.

В Альметьевском районе наибольшее загрязнение грибами отмечено в пшенице (58%), ржи (46%) и ячмене (41%). Из них токсическими свойствами обладали 41,7% исследованных штаммов, среди которых были выделены грибы F. sporotrichiella, F. graminearum, F. moniliforme, F. culmorum иF. oxysporum.

В кормах, поступивших изЧистопольского и Алексеевского районов(зоны умеренного техногенного воздействия) зарегистрировано меньшее содержание грибов рода Fusarium (30-40%). Определение видовой принадлежности фузариев из зерна позволило отнести их к следующим видам: F. moniliforme, F. avenaceum, F. graminearum, F. culmorum и F. sporotrichiella.Также относительно небольшую распространенность фузарийнаблюдали в Высокогорском и Кукморском районе на долю Fusarium приходилось от 15 до 46%.

Из 5 представителей рода Fusarium, 4 вида обладали токсическими свойствами (F. sporotrichiella, F. graminearum, F. culmorum, F. oxysporum), их количество составило 27,8%.

Из зерновых Верхнеуслонского района был выделенмикромицетF. moniliforme (кукуруза, комбикорм от 8 до 30%, овес, ячмень - 1-4%), продуцирующий микотоксинмонилиформин.

Микологические исследования в Тюлячинском районе показали наличие в зернофураже грибов рода Fusarium, Aspergillus иPenicillium. Наибольший процент токсигенных штаммов грибов - более 40% из числа выделенных приходилось на долю F. sporotrichiella, далее - около 30% - A. flavus, около 20% - Penicillium.

Представленные на анализ образцы сена, зернового концентрата, сенажа кукурузного из Менделеевского района проявляли токсические свойства, в данных кормах был обнаруженмикотоксин - монилиформин (15;20;150 мкг/кг, соответственно).

Микотоксинмонилиформин обнаружен в кормах свинокомплекса ООО Серп и молот Высокогорского района: сенаже из многолетних трав - 60 мкг/кг, монокорме для родильного отделения - 150 мкг/кг и в шроте подсолнечном - 100 мкг/кг.

Подробно степень загрязнения кормов грибами рода Fusarium изучали и на птицефабрике Пестречинская (Ак-Барс Пестрецы). Из выделенных грибов данного рода - 28% относились к виду F. moniliforme, из них 23% были токсичными, а в 20% корма был обнаружен монилиформин в количестве 80 мкг/кг.

В Тукаевском районе содержание монилиформина было выявлено в 30% кормов, из которых выделяли гриб F.moniliforme. Микотоксинмонилиформин выявлен от 9 до 12% в образцах, где выделялся гриб F. avenaceum. В хозяйствах, где обнаружены токсичные изоляты грибов F. moniliforme и микотоксинмонилиформин, наблюдалась высокая заболеваемость и высокий отход молодняка животного.

3.2 Усовершенствование методов индикации монилиформина в кормах

Диагностика монилиформинотоксикоза требует разработки и усовершенствование методов индикации монилиформина в кормах. Нами предложен и усовершенствован метод определения монилиформина методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Метод ТСХ основан на экстракции токсина водным раствором ацетонитрила, очистке экстракта от неполярных липидов и других органических примесей гексаном.

В качестве экстрагентов использовали: ацетон, ацетонитрил, водные растворы хлористого калия, хлористого натрия, этилацетат и метанол. Для эффективного извлечения токсина наиболее приемлемым оказался водный раствор ацетонитрила в объемном соотношении (955) и метанол, степень экстракции при их использовании достигала 60-70%.

В качестве подвижной фазы для выполнения ТСХ также было проведено сравнение смесей толуола, бензола, хлороформа и этилацетата с ацетоном и метанолом, хлороформа с ацетоном, метанолом, этанолом, изопропанолом, 1- бутанол с уксусной кислотой и водой в различных соотношениях. Для оптимизации условий подготовки пластинок к измерениям по завершении хроматографической стадии их опрыскивали растворами 2,4-ДНФ в 6 Н серной кислоте с концентрациями 1-20% до полного смачивания слоя и выдерживали в термостате в условиях постоянного контактного нагрева при 100-1200С и экспозиции от 5 до 10 минут.

В подвижной стадии 1- бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5), толуол - этилацетат - муравьиная кислота (6:3:1, 50:40:10, 60:30:10), а также в смесях толуола, бензола, хлороформа, этилацетата с ацетоном и метанолом, толуола, гексана с ацетоном (7:3), хлороформа с ацетоном, метанолом, этанолом или изопропанолом, бензолом наблюдался нежелательный эффект размывания вещества в слое силикагеля. Компактные и предельно сжатые по вертикали зоны были получены в смесях хлороформа с этанолом и метанолом в соотношениях 3:2. Наилучший эффект достигался при обработке пластинок 1% раствором реагента - 2,4-динитрофенилгидразина в серной кислоте и 5 минутной экспозиции, стандарт поднимался и проявлялся в виде коричневого пятна при Rf 0,3. Обнаружение на пластинке пятен, соответствующих по хроматографической подвижности и цвету флюоресценции пятнам стандарта монилиформина, свидетельствует о возможности присутствия их в кормах.

Определение содержания монилиформинав водном элюате с патрона проводили методом ВЭЖХ на приборе Spectra 100.

При рабочей чувствительности детектора 0,05 линейный диапазон детектирования составил от 5 до 70 нг. Время выхода монилиформина - 7,8 мин, предел обнаружения методом ВЭЖХ составил 0,5 мг/кг субстрата. Изученные изолятыFusariummoniliforme и Fusariumavenaceum, выделенные из различных зерновых культур (рожь, пшеница, кукуруза) образовывали монилиформин в количествах от 1,3 до 17,3 мг/кг.

3.3 Изучение острой токсичности монилиформина на лабораторных животных

Установлено, что среднесмертельная доза монилиформина для мышей и крыс составляли 19,5 мг/кг и 39,7 мг/кг, соответственно. По классификации химических веществ монилиформин можно отнести к 2 классу опасности - вещества высокотоксичные.

При рассмотрении клинической картины монилиформинотоксикоза можно выделить следующие наиболее часто встречающие симптомы: отсутствие аппетита, отказ от корма, одышка, цианоз, мышечная слабость и нарушение координации движения.

При патологическом вскрытии павших животных отмечали недостаточное кровоснабжение миокарда, деструктивные изменения в печени, почках, надпочечниках, слизистых оболочках желудка и кишечника.

Длительная интоксикация монилиформином приводит в первую очередь к выраженному периваскулярному и перицеллюлярному отеку головного мозга, сосуды которого резко расширены и заполнены эритромассами, нейроны увеличены, деформированные, в поле зрения определяются скопления нейронов с базофильной гомогенной цитоплазмой не содержащих ядра;отмечаются сателлитоз, нейронофагия, некроз и очаги фиброза в миокарде.

3.4 Влияние монилиформина на морфологические и биохимические показатели крови крыс

Количество эритроцитов, гемоглобина у крыс при остром воздействии монилиформинана 1 и 3 сут снижается на 4,4%, 6,7% (p>0,05) и 7,3%, 10%, соответственно. На 7 и 10 сут содержание показателей постепенно увеличивалось.

Содержание лейкоцитов на 1 и 3 сутувеличивалось на 14,7% и 17,3% (p<0,05), соответственно, оставаясь повышенным на 7 и 10 сут на 9,5% и 6,9%, соответственно.

Содержание общего белка в крови у крыс при отравлении монилиформином снижалось в динамике наблюдения на 13,2%; 17,7%; 13,4% и 4% (р<0,05), соответственно. Количество альбуминов, α-глобулинов, в белковых фракциях было недостоверно выше фоновых значений.

Содержание гамма-глобулинов в процессе интоксикации уменьшалось  - на 4,8%; 7,9%; 3,5% и 4,8%; SH групп возрастало - на 5,1%; 4,5%; 3,9% и 1,13%, соответственно. Количество глюкозы и пировиноградной кислоты у крыс возрастало - на 18,1%; 15,9%; 9% и 4,5% и 6,4%; 9,6%; 6,3% и 1,2%, соответственно. Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) также возрастала - на 1; 3; 7 и 10 сут - на 14,5%; 16,3%; 14,5%  и 5,4% (p<0,05), соответственно.

Из представленных данных видно, что однократное введение монилиформина в максимально переносимой дозе вызывает достоверные изменения морфологических и биохимических показателей крови.

3.5 Изучение адсорбционных свойств энтеросорбентовinvitro в отношении монилиформина

Результаты эксперимента связывания монилиформина исследуемой группой энтеросорбентовпредставлены на рисунках 1 и 2.

Рис. 1 Адсорбционная способность Микосорба в отношении монилиформинаinvitro.

Рис. 2 Адсорбционная способность Фитосорба в отношении монилиформинаinvitro.

Установлено, что максимальные сорбционные свойства при комнатной температуре и рН=7 проявили сорбенты Микосорб (40,2%), Фитосорб (45,8%); наименьшую сорбционную способность к монилиформину показал Хитозан (9,9%).

При температуре желудочно - кишечного тракта (370С) у исследуемых сорбентов происходило увеличение адсорбционной способности к связыванию токсина. Так, Микосорб адсорбировал 60,2% монилиформина, Фитосорб - 58,9%, Хитозан- 16,7%, что объясняется раскрыванием адсорбционных свойств сорбентов при повышении температуры.

Таким образом, исследования invitro показали, чтоэнтеросорбенты Микосорб и Фитосорб способны адсорбировать монилиформин и позволяет рекомендовать их применение в качестве средства профилактики.

3.6Испытание энтеросорбентов для профилактики монилиформино-токсикоза на белых крысах

Результаты ранее проведенных исследований сорбционных свойств invitro, позволили предположить эффективность Фитосорба и Микосорба при монилиформинотоксикозе. Для подтверждения этого были проведены опыты по изучению влияния рациона, содержащегосорбенты, на течения токсикоза у белых крыс.

Для проведения экспериментов было сформировано 4 группы крыс по 24 в каждой. Животные 1-й группы получала монилиформин в дозе 1/5 ЛД50 в виде 5% водно-спиртового раствора; 2-й - (опытная), получали наряду с токсином исследуемый Фитосорб в дозе 2% от сухого вещества корма; 3-й Цполучали наряду с токсином сорбент Микосорб в дозе 2% от сухого вещества корма; 4-й - служили биологическим контролем и получали обычный рацион и 5% водноЦспиртовой раствор в объеме, что и опытные группы, но без содержания токсина.

3.6.1Клинико-гематологические показатели белых крыс при монилиформинотоксикозе на фоне применения энтеросорбентов

У крыс, которым задавали микотоксин, наблюдали клинические признаки отравления в виде угнетения, снижения аппетита, а также регистрировали снижение массы тела к 30 сутна 28,1%.

У опытных животных, получавших сорбенты в количестве 2% от сухого вещества,отставание в росте к концу эксперимента составило 9,5% и 0,9%, соответственно.

Монилиформин оказывает негативное воздействие на гематологические параметры крови, указывая на серьезные деструктивные изменения  во всех внутренних органах. К 30 сут у крыс,получивших токсичный корм, происходило снижение количества эритроцитов - на 28,5%, лейкоцитов - на 32,6% и содержания гемоглобина - на 19,4% (р<0,01).

Введение в рацион сорбентов снижало токсическое действие монилиформина. К 30 сут в группе животных, получавших Фитосорб в количестве 2% от сухого вещества,регистрировали снижение содержания  эритроцитов - на 19,5%, лейкоцитов - на 9,7% (p<0,05), достоверного снижения гемоглобина не наблюдали. При введении в рацион сорбента Микосорб наблюдали снижение вышеназванных параметров кровина 9,5% и 7,13%, соответственно.

Значение СОЭ было выше относительно данных биологического контроля в тех же группах на 157% (р<0,001); 36,6% (р<0,001) и 21,2% (p<0,01), соответственно.

3.6.2Биохимические показатели крови белых крыс при монилиформинотоксикозе на фоне применения энтеросорбентов

О негативном действии монилиформина на сердечно-сосудистую систему, гепатоциты свидетельствуют результаты  исследований белкового и ферментативного профиля крови подопытных животных. В сыворотке крыс, получавших монилиформин, на 30 сут эксперимента наблюдали достоверное снижение содержания общего белка на 26,8%, содержание альбуминов - на 30,5%, -глобулинов - на 31,5%, увеличение -глобулинов и -глобулинов - на 43,3% и 69,2%, соответственно. Содержание глюкозы уменьшалось на 54,7% (р<0,001).

Введение в рацион животным энтеросорбентов предотвращало белковый дисбаланс. Так в сыворотке крови крыс,профилактируемыхвведением Фитосорба и Микосорба в количестве 2% от сухого вещества, к концу эксперимента происходило снижение общего белка на 11,6% (p<0,01) и 7,3%, содержание альбуминов - на 17,6% и 5,9%, -глобулинов - на 15,5% (p<0,01) и 15,2%; увеличение -глобулинов и -глобулинов - на 12,2% и 6,6% (p<0,05), 45,3% (p<0,001) и 27,2% (p<0,01),соответственно.

Повышение уровня глюкозы в сыворотке крови  в профилактируемых группах отмечалось на 30 сут на 10% и 11,4%, соответственно.

У крыс, подвергшихся воздействию монилиформина, к 30 сут исследования зарегистрировали повышение активности ферментов  аланинаминотрансферазына 73,6% (р<0,001), аспартатаминотрансферазы - на 82,3%, щелочной фосфатазы - на 50,6% (р<0,001), что свидетельствует о недостаточном кровоснабжении миокарда. В профилактируемых группах повышение активности данных ферментов было менее выражено, причем изменения носили достоверный характер.

3.7 Профилактическая эффективность энтеросорбентов при монилиформинотоксикозе овец

Для проведения  исследований было сформировано 3 групп овец по 3 головы в каждой: 1-я группа животных получала с кормом монилиформин (1/5 ЛД50); 2-я - монилиформин (1/5 ЛД50) и Фитосорб в количестве 2%  от сухого вещества; 3-я -монилиформин (1/5 ЛД50) и сорбент Микосорб в дозе 2% от сухого вещества.

3.7.1КлиникоЦгематологические показатели овец при введении монилиформина на фоне применения энтеросорбентов

Внешне клиническая картина интоксикации, более выраженная во второй половине опыта, выглядела следующим образом: животные были угнетены, поедаемость корма была несколько снижена, наблюдалось понижение тактильной и болевой чувствительности, снижение внимания у животного, ослабление нервно-мышечного тонуса, угасание условных рефлексов, поседение шерстного покрова, особенно на голове.

У овец 1-й группы регистрировали закономерное снижение гематологических параметров. Так, на 30 сут отмечали уменьшение количества эритроцитов и лейкоцитов на 13,5% и 22,9% (p<0,01), соответственно. Содержание гемоглобина снизилось на 12,9% (p<0,01).

На 30 сут эксперимента, у профилактированныхживотных наблюдали менее выраженное уменьшение исследуемых показателей. Так, количество эритроцитов снижалось на 6,1% и 3,7%, количество лейкоцитов - на 11,8% и 7,3%, содержание гемоглобина - на 5,02% и 7,5%, соответственно.

Полученные данные свидетельствуют о токсическом действии монилиформина и о выраженной защитнойэффективности сорбентов при отравлении токсином.

3.7.2Изучение биохимических показателей крови овец при введении монилиформина на фоне применения сорбентов

Введение в рацион энтеросорбентов способствовало нормализации белкового обмена при монилиформинотоксикозе.

Так, содержание общего белка в сыворотке крови овец при введении в рацион сорбента Фитосорб уменьшилось на 7,4%, сорбента Микосорб - на 5,5%, а внепрофилактируемой группе - на 14,3%.

Гипогликемия была менее выражена в профилактируемых группах. Так, происходило снижение количества глюкозы в крови овец на 30 сут во 2-й группе на 10%; в 3-й - 6,6% соответственно, при снижении его на 14,2% в непрофилактируемой группе.

В сыворотке крови овец, подвергшихся воздействию монилиформина, активность аланинаминотрансферазы на 10, 20 и 30 сутисследования повысилась на 10,4%; 29,6% и 33,3% (p<0,001), а активность аспартатаминотрансферазы на 12%; 34,1% и 44%, соответственно.

Активность холинэстеразы у животных  1-й группы, которые получали монилиформин, снижалась на всём протяжении опыта: на 10, 20 и 30 сут - 0,5%; 10,3% и 33,3% (p<0,001), соответственно.

Уменьшение активности холинэстеразы на 10, 20 и 30 сут опыта во 2-й  группе составило 8%; 11% и 21%, в 3-й - 10%; 16% и 26% (p<0,01), соответственно.

Во всех группах у животных регистрировали увеличение активности щелочной фосфатазы. Наибольшее увеличение наблюдали в непрофилактированных группах. Так, в 1-й группе увеличение на 30сутсоставило 12% (p<0,05).

У овец в профилактированных группах снижение активности щелочной фосфатазы на 30 сут опыта было следующим: во 2-й группе - 6,9%, в 3-й - 5,7% (p>0,05), соответственно.

Таким образом, проведенные нами исследования показали, что токсигенный потенциал микромицетов в республике Татарстан высок. Монилиформин оказывает токсическое влияние на клинические, гематологические и биохимические показатели. Сорбенты ЦМикосорб и Фитосорб при включении в рацион оказывают профилактическое действие при монилиформинотоксикозе, способствуя коррекции гематологических, биохимических показателей и предотвращая гибель животных.

4. ВЫВОДЫ

1. Видовой состав микроскопических грибов рода Fusarium в кормах по районам Республики Татарстан состоит из многокомпонентной популяции фузариев, поражающих зерно. Выделяются 4 наиболее часто встречающихся вида:F. moniliforme, F. avenaceum, F. sporotrichiella и F. graminearum. В 30% образцах кормов, из которых изолирован гриб F. moniliforme выявлен микотоксинмонилиформин и 9-12% - в образцах, где выделялся гриб F. avenaceum.
2. Разработаны методы высокоэффективной жидкостной и тонкослойной хроматографии для индикации монилиформина в кормах с чувствительностью 2-20мкг/кг.
3. Среднесмертельная доза монилиформина для крыс составляет 39,7 мг/кг; для мышей - 19,5 мг/кг массы тела. Согласно ГОСТу 12.1.007-76, микотоксин относится к 2 классу опасности - вещества высокотоксичные.

4.Длительная интоксикация крыс монилиформином приводит к выраженному периваскулярному и перицеллюлярному отеку головного мозга, гиалиновому перерождению, некрозам и образованию очагов фиброза в миокарде, деструктивным изменениям в печени, почках, слизистых оболочках желудка и кишечника.

5.Острая и подостраяинтоксикация монилиформином сопровождается изменениями клинических, гематологических и некоторых биохимических показателей крови. При острой интоксикации у крысв начальной стадии достоверно возрастает в крови количество лейкоцитов, СОЭ, пировиноградной кислоты, глюкозы и альбуминов, с последующим (на 10 сут) уменьшением показателей. Многократное воздействие монилиформина вызывает у животных снижение количества лейкоцитов, эритроцитов и гемоглобина. Монилиформинотоксикоз сопровождается снижением общего белка на 31,2%, глюкозы - на 54,7%; повышением содержания аланинаминотрансферазы на 73,6%, аспартатаминотрансферазы - на 82,3%, щелочной фосфатазы - на 50,6%.

6.ЭнтеросорбентыФитосорб и Микосорб обладают сорбционными свойствами в отношении микотоксина, активность сорбентов составляет 58,9% - 60,2% (р<0,001), соответственно.

Включение в рацион белых крыс и овец в течение 30 сут этих энтеросорбентов из расчета 2% к сухому веществу корма, оказывает профилактическое действие при монилиформинотоксикозе с нормализацией клинико-гематологических и биохимических показателей.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Составлена карта - распространения грибов рода Fusarium и содержаниямикотоксинамонилиформина в кормах, заготавливаемых на территории Республики Татарстан.
2. В качестве средств профилактики монилиформинотоксикоза у животных рекомендуется в рацион включать энтеросорбентыМикосорб и Фитосорб в концентрации 2% от сухого вещества.
3. Результаты исследований использованы при составленииИнструкции по применению энтеросорбентов для профилактики монилиформинотоксикоза животных, утв. Главным управлением ветеринарии КМРТ (2012г.) и Методических пособий по профилактикемонилиформин - микотоксикоза животных, утв. отделением ветеринарной медициныРАСХН (2012 г.).

6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ермолаева О.К. МОН: распространение и токсичность // Матер.междунар. симпозиума Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклеидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний, 28-30 ноября 2005г. - Казань, 2005. - С. 106-109.
2. Ермолаева О.К. Изучение видового состава микроскопических грибов рода Fusarium в РТ // Ученые записки Казанской Государственной академии ветеринарной медицины. - Казань, 2006. - Т. 186. - С.126-130.*
3. Самсонов А.И.,Семенов Э.И., Ермолаева О.К.Сорбент для профилактики микотоксикозов животных // Матер.междунар. науч. конф. Токсикозы животных и актуальные проблемы болезней молодняка,25-27 октября 2006 г. - Казань, 2006. - С. 172-174.
4. Ермолаева О.К. Изучение распространения грибов рода Fusarium // Матер.междунар.  науч. конф. Токсикозы животных и актуальные проблемы болезней молодняка, 25-27 октября 2006 г. - Казань, 2006. - С. 86-88.
5. Ермолаева О.К. Об опасности монилиформина для животных // Матер.междунар. конгресса Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты, 15-16 мая 2007 г. - Санкт - Петербург, 2007. - С. 40.
6. Ермолаева О.К.Микотоксин МОН: опасность, диагностика, профилактика // Ветеринарный врач. Казань, 2007. - № 2. - С. 21-22.*
7. Ермолаева О.К. Индикация монилиформина методом ТСХ // Матер.науч. - практ. конф. молодых ученых и специалистов Актуальные проблемы ветеринарии, 29 июня 2007 г. - Казань, 2007. - С. 41-42.
8. Тремасов М.Я., Матросова Л.Я., Сергейчев А.И., Закирова Г.Ш., Папуниди К.Х., Ермолаева О.К.Пробиотик при микотоксикозах животных // Матер.первого съезда ветеринарных фармакологов России. - Воронеж, 2007. - С. 600-604.
9. Ермолаева О.К., Иванов А.В., Тремасов М.Я.Микотоксинмонилиформин// Сборник докладов координационного ветеринарного совета Вопросы улучшения ветеринарного благополучия свиноводческих предприятий. М.: 2008г. - С. 39-42.
10. Матросова, Л.Е., Ермолаева О.К., Иванов А.А. Мониторинг микроскопических грибов в сельскохозяйственной продукции РТ // Ветеринарный врач. Казань, 2009. - № 3. - С. 52-53.*
11. Ермолаева О.К., Матросова Л.Е. Сорбционная активность сорбентов в отношении монилиформина // Матер.второго съезда ветеринарных фармакологов и токсикологии России Современные проблемы ветеринарной фармакологии и токсикологии, 09 июня 2009 г. - Казань, 2009. - С. 543-544.
12. Матросова, Л.Е., Ермолаева О.К., Тарасова Е.Ю., Иванов А.А. Изучение микроскопических грибов в РТ  // Матер.второго съезда ветеринарных фармакологов и токсикологии России Современные проблемы ветеринарной фармакологии и токсикологии, 09 июня 2009 г. - Казань, 2009. - С. 457-459.
13. Ермолаева О.К. Применение энтеросорбентов при монилиформинотоксикозе // Матер.международ.науч. - практ. конф. Актуальные проблемы современной ветеринарии, 6-7 июля 2011 г. - Краснодар, 2011. - С. 323-326.
14. Ермолаева О.К. Патоморфологические изменения крыс при воздействии монилиформина // Матер.третьего съезда фармакологов и токсикологов России Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации, 08-10 июня 2011 г. - Санкт - Петербург, 2011. - С. 168-170.
15. Ермолаева О.К.Усовершенствование метода индикации монилиформина // Современная микология в России. - Москва, 2012. - Т. 3.-С. 424-425.

*- статьи, рекомендуемые ВАК РФ

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по сельскому хозяйству