Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
МЕСИТОВ Михаил Валентинович
ТКАНЕСПЕЦИФИЧНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ СО СТРЕССОМ ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ГОМОЦИСТЕИНА
14.03.03 - Патологическая физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2012
Работа выполнена в Лаборатории молекулярных механизмов тромбогенеза и тромболизиса Федерального государственного бюджетного учреждения Научноисследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Аслан Амирханович Кубатиев Кандидат медицинских наук, Алексей Александрович Московцев
Официальные оппоненты:
Всеволод Иванович Киселев Доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАМН ГН - РФ Институт медико-биологических проблем РАН Главный научный сотрудник Отдела молекулярно-клеточной медицины Михаил Юрьевич Карганов Доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН Заведующий Лабораторией полисистемных исследований
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский университет дружбы народов
Защита состоится л___ __________ 2012 года в ___ часов на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии РАМН, по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, дом 8.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ НИИОПП РАМН
Автореферат разослан л___ __________ 2012 года
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук Л.Н. Скуратовская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Клеточный стрессовый ответ относится к числу механизмов, лежащих в основе патогенеза широкого спектра заболеваний. Изменения внутренней среды организма при патологических состояниях могут индуцировать стрессовые ответы определенных типов клеток в зависимости от их чувствительности к меняющимся факторам среды.
Клеточный стресс представляет собой универсальную неспецифическую форму системной реакции клетки на любую форму макромолекулярных повреждений, превышающих пороговую величину (Kltz D., 2003; Кубатиев А.А. и др., 2012).
Стрессовая реакция необходима для временного увеличения толерантности к повреждениям макромолекул посредством использования филогенетически консервативных наборов генов и биохимических путей, которые опосредуют макромолекулярную стабилизацию и репарацию в клетке для обеспечения клеточной и организменной целостности в субоптимальных условиях (Kltz D, 2003).
Структурированность эукариотической клетки, наличие отличающихся по составу внутренней среды компартментов с мембранами, выполняющими барьерные функции, и защитными системами, индуцируемыми независимо от цитоплазматических, обусловливают неодинаковую чувствительность к воздействиям и разную степень вовлеченности структурно-функциональных модулей клетки в стрессовый ответ. Факт наличия активных, стабилизирующих структуру и функцию биологического модуля, неспецифических буферных механизмов позволил масштабировать и использовать понятие стресс на субклеточном уровне, то есть рассматривать компартментализованный вариант клеточного стресса.
К числу компартментов эукариотической клетки, способных к инициации специальной формы стрессового ответа, относится эндоплазматический ретикулум (ЭПР) - многофункциональная органелла, одной из важнейших функций которой является конформационное созревание белков - в ЭПР осуществляется фолдинг около 30% белков эукариот (Hetz C., 2012). Нарушения процессов конформационного созревания белков могут стать причиной развития протеотоксического стресса, динамика которого определяется интенсивностью de novo синтеза и обновления клеточных и экстраклеточных белков. Продукты незаконченной трансляции, интермедиаты фолдинга с некорректной конформацией, а также субъединицы, не включенные в олигомерные белковые комплексы, могут экспонировать гидрофобные области (Hart F.U., Hayer-Hartl M., 2009), которые становятся дополнительными, незаконными интерфейсами для межмолекулярного взаимодействия и могут приводить к агрегации белков, формированию токсичных и иммуногенных продуктов.
Накопление конформационно-дефектных белков в люмене ЭПР в связи со множественностью функций и единым объемом этого компартмента может инициировать нарушения работы других систем ЭПР, и тем самым индуцировать состояние, характеризуемое как стресс эндоплазматического ретикулума (Ron D., Walter P., 2007).
Для защиты от протеотоксического стресса и ошибок работы системы конформационного созревания белков в ЭПР эукариот возникли следующие приспособления: 1) рецепция белков c ненативными конформациями в ЭПР; 2) обработка и передача информации в ядро о детектированных белках с дефектными или незрелыми конформациями; 3) адаптационные изменения ЭПР и ассоциированных структур, общим результатом действия которых должно стать снижение концентрации дефектных белков в люмене ЭПР.
Перечисленные функции реализуются посредством нескольких механизмов, действующих зачастую совместно: 1) система сигнальных каскадов ответа на белки с ненативными конформациями (Unfolded Protein Response, UPR); 2) контроль трансляции - аттенюация кеп-зависимой трансляции, опосредуемая киназой PERK; 3) активация транскрипционного фактора ATF6; 4) ответ на избыток белка в люмене ЭПР, или перегрузку ЭПР (endoplasmic reticulum overload response, EROR), опосредуемый активированным транскрипционным фактором NF-kappaB.
Таким образом, в компартменте ЭПР при различных нарушениях может иметь место локализованный протеотоксический стресс. При дефектах или функциональной недостаточности системы контроля качества стресс может быть генерализован во внутри- и внеклеточном пространстве. Невозможности компенсации стресса индуцирует программированную клеточную гибель (Szegezdi E. et al, 2006).
Несмотря на значительный интерес исследователей, динамические аспекты регуляции стресса ЭПР в клетках человека различных типов изучены недостаточно.
Способность клеток различных типов к эффективной реализации во времени адаптивной фазы стресса ЭПР определяет устойчивость клеток к стрессу и их дальнейшую выживаемость. В этой связи, анализ тканеспецифичных особенностей временных профилей экспрессии генов системы UPR, в частности, BiP, XBP1, кинетики сплайсинга XBP1 и соотнесение динамики этих процессов с индукцией проапоптотического гена CHOP, а также анализом клеточной гибели представляются актуальными задачами исследования.
При гипергомоцистеинемии - распространенном патологическом состоянии (Hashimoto T. et al, 2007), ассоциированном с сердечно-сосудистыми, нейродегенеративными заболеваниями, инсулиннезависимым диабетом и рядом других патологий, возросший уровень аминокислоты гомоцистеина в плазме крови может оказывать стресс-индуцирующее действие на клетки. Предполагается, что гомоцистеин может активировать стрессовый ответ эндотелиоцитов и быть причиной развития эндотелиальной дисфункции, при этом формой стрессовой реакции может быть стресс ЭПР и IRE1-зависимый апоптоз (Zhang C. et al, 2001).
ЭПР-стресс как результат нарушений конформационного созревания белков может играть ключевую роль в патогенезе ассоциированных с гипергомоцистеинемией заболеваний и способен рассматриваться как типовой молекулярно-патофизиологический процесс. В связи с этим, исследование ЭПРстрессовых ответов клеток разных типов и различной тканевой принадлежности имеет важнейшее фундаментальное и прикладное значение для патофизиологии и биомедицинской науки в целом. С учетом вовлеченности сосудистой стенки в развитие патологического состояния гипергомоцистеинемии (Kubatiev A. et al, 2005), изучение стресса эндоплазматического ретикулума в эндотелиоцитах и взаимодействующих с ними клетках иммунной системы является актуальной задачей.
Цель исследования. Целью настоящего исследования является сравнительный анализ экспрессионных профилей генов, вовлеченных в стресс эндоплазматического ретикулума, а также выявление неизвестных ранее тканеспецифических особенностей их регуляции под действием гомоцистеина in vitro и в условиях экспериментальной гипергомоцистеинемии in vivo.
Задачи исследования:
1. Провести исследование уровней мРНК генов XBP1, BiP и CHOP, ассоциированных со стрессом ЭПР, в клетках T-лимфоцитарной линии Jurkat и эндотелиоцитарной линии EA.hy926 под действием гомоцистеина in vitro.
2. Изучить динамику внутриклеточных концентраций белков стрессового ответа BiP и CHOP в клетках линий Jurkat и EA.hy926 под действием гомоцистеина.
3. Установить взаимосвязь временных профилей экспрессии генов стрессового ответа и концентраций их белковых продуктов с процессами клеточной гибели и распределением клеток по фазам клеточного цикла.
4. Выявить особенности экспрессии генов стрессового ответа на модели гипергомоцистеинемии in vivo.
Научная новизна исследования. Впервые проанализирована экспрессия генов BiP, CHOP и XBP1, участвующих в формировании стрессового ответа, в клетках линии Т-лимфобластной лейкемии человека Jurkat. Получены временные профили экспрессии генов в линиях клеток Jurkat и EA.hy926, свидетельствующие о клеточноспецифичной динамике стрессового ответа, определяемой морфофункциональными особенностями эндоплазматического ретикулума этих клеток. Впервые показано отсутствие корреляции между изменением уровня мРНК гена CHOP и его белкового продукта в клетках Jurkat и EA.hy926, что может указывать на важность посттранскрипционных механизмов в регуляции экспрессии генов системы сигнальных каскадов UPR, участвующих в принятии решения клеткой о запуске про- или антиапоптотических механизмов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе данные углубляют существующие представления о динамике развития стрессового ответа в линиях клеток, различающихся по морфофункциональным свойствам эндоплазматического ретикулума, но имеющих идентичную организацию системы сигнальных каскадов UPR. Обнаруженные в работе особенности экспрессии проапоптотического гена CHOP могут указывать на существование нового регуляторного механизма при стрессе эндоплазматического ретикулума. Практическая значимость полученных данных состоит в возможности использования белков BiP и CHOP в качестве маркеров для диагностики стресса ЭПР in vivo.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Гомоцистеин способен вызывать стресс ЭПР в клетках различного тканевого происхождения (клетки T-лимфоцитарной линии Jurkat и эндотелиоцитарной линии EA.hy926).
2. Степень чувствительности и устойчивости к стрессу ЭПР под действием гомоцистеина зависит от типа клеток и их тканевого происхождения.
3. Специфичность функционирования системы UPR в клетках Т-лимфоцитарной линии Jurkat и эндотелиоцитарной линии EA.hy926 выражается в различной динамике и уровнях экспрессии генов стрессового ответа.
4. Неполная корреляция между уровнями мРНК и концентрациями белковых продуктов генов стрессового ответа, прежде всего CHOP, указывает на возможность вовлечения дополнительных посттранскрипционных механизмов регуляции в систему сигнальных каскадов UPR.
5. Ключевую роль при стрессе ЭПР играет времязависимая регуляция системы UPR.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на межлабораторной конференции Отдела молекулярной и клеточной патофизиологии ФГБУ НИИОПП РАМН (Россия, Москва, 26 июня 2012), на Циклах усовершенствования врачей и научно-педагогических кадров по молекулярной и клеточной патологии в РМАПО МЗ РФ (Россия, Москва, 2011 - 2012), на VII съезде аллергологов и иммунологов стран СНГ (Россия, Санкт-Петербург, 2009), IV международном конгрессе Stress Responses in Biology and Medicine (Япония, Саппоро, 2009).
Публикации по теме диссертации. По материалам диссертационной работы опубликовано 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов:
введения, обзора литературы, описания материалов, объектов и экспериментальных методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит рисунка и 5 таблиц. Список литературы включает 166 источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клеточные линии. Исследования выполнены на линиях клеток Jurkat (Тклеточный лимфобластоидный лейкоз человека), полученной из Российской коллекции культур клеток позвоночных, и EA.hy926 (гибрид первичной культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека HUVEC и тиогуанин-резистивного клона линии клеток аденокарциномы легкого A549). Клетки EA.hy926 были любезно предоставлены доктором Edgel C. J. (Университет Северной Каролины, США).
Инкубация клеток с D,L-гомоцистеином и дитиотрейтолом. Клетки Jurkat инкубировали в полной питательной среде RPMI-1640 с добавлением 10% ТЭС в присутствии различных концентраций исследуемых препаратов в течение 0 - 24 ч., в атмосфере с 5% содержанием CO2, при 37С. Клетки EA.hy926 инкубировали в полной питательной среде DMEM (4,5г/л глюкозы) с добавлением 10% ТЭС, 50мкг/мл гентамицина, 2ммоль/л глютамина, 1% NEAA и суплемента HAT в присутствии различных концентраций исследуемых препаратов в течение 0 - 24 ч., в атмосфере с 5% содержанием CO2, при 37С. Контролем служили интактные клетки, которые инкубировали в тех же условиях, но в отсутствии препаратов.
Лазерная конфокальная сканирующая микроскопия (ЛКСМ).
Сравнительный анализ морфологии эндоплазматического ретикулума в клетках Jurkat и EA.hy926 проводили методом прижизненно окрашивания карбоцианиновым красителем 3,3-дигексилоксакарбоцианин перхлоратом (DiOC6). Визуализацию препаратов осуществляли с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Nikon C1 (лNikon Corporation, Япония).
Иммуноцитохимия. Оценку содержания и распределения исследуемых белков в клетках проводили методом иммуноцитохимии, с использованием лазерного конфокального сканирующего микроскопа Nikon C1.
Проточно-цитофлуориметрический анализ. Изменения уровней белков BiP и CHOP в клетках Jurkat (плотность 5х105 клеток/мл.) и EA.hy926 (плотность 4х1клеток/мл.), а также в выделенных клетках печени крыс анализировали методом иммунофлуоресценции с использованием проточного цитофлуориметра FACSCalibur (лBecton-Dickinson Biosciences, США). Регистрацию интенсивности флуоресценции клеток проводили по каналу FL1 (FITC). Сбор и анализ данных осуществляли с использованием программного обеспечения CellQuest, версия 6.0 (лBecton-Dickinson Biosciences, США).
Определение апоптотических клеток по окрашиванию ДНК пропидий йодидом. Для определения апоптотических клеток, ядерную ДНК окрашивали фенантридиновым флуорофором пропидий йодидом, используя для этой цели коммерческий набор BD PharmingenЩ PI/RNase Staining Buffer и предложенный производителем протокол. Суспензию клеток, окрашенных PI, анализировали методом проточной цитофлуориметрии с использованием цитометра FACSCalibur. Сбор и анализ данных проводили с использованием программного обеспечения CellQuest, версия 6.0.
Анализ клеточного цикла. Для исследования изменений клеточного цикла ядерную ДНК окрашивали пропидий йодидом, используя для этой цели коммерческий набор BD PharmingenЩ PI/RNase Staining Buffer и предложенный производителем протокол. Суспензию клеток, окрашенных PI, анализировали методом проточной цитофлуориметрии с использованием цитометра FACSCalibur. Анализ файловых данных проводили в программном обеспечении ModFit LT, версия 3.2 (лSoftware House, США).
Выделение суммарной клеточной РНК. Суммарную РНК выделяли из 2х1клеток Jurkat и 1х106 клеток EA.hy926 с использованием набора реагентов RNeasyо Mini Kit (лQiagen GmbH, Германия). Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре NanoDropо ND-1000 (лNanoDrop Technologies Inc., США). Для оценки качества (целостности) выделенной суммарной РНК проводили электрофорез в 1,2% агарозном геле. С целью предотвращения контаминации геномной ДНК, выделенную суммарную РНК из всех использованных в исследовании образцов клеток обрабатывали ДНКазой I (лFermentas, Литва).
Реакция обратной транскрипции. Перед реакцией количество суммарной РНК выравнивали с использованием флуориметра Qubit (лInvitrogen, США). Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием олиготимидиновых праймеров oligo-dT(18) и обратной транскриптазы M-MuLV (без активности РНКазы H) в составе набора RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (лFermentas, Литва) в соответствии с протоколом производителя.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени ПЦР-РВ). Реакцию ( проводили с использованием набора реактивов MaximaTM SYBR Green/ROX qPCR MasterMix (2X) (лFermentas, Литва), включающим интеркалирующий краситель Sybr Green, на амплификаторе CFX96TM Real-Time PCR Detection Systems (лBio-Rad Laboratories, Inc., США) при следующих условиях: начальная денатурация - 95C, 10мин.; циклирование (40 циклов) - денатурация - 95C, 15сек., отжиг - 55C, 30сек., элонгация - 72C, 30сек. Регистрация интенсивности флуоресценции SybrGreen, связанного с двухцепочечной ДНК, и пассивного референсного красителя ROX проходила автоматически в конце стадии элонгации каждого цикла при 72C по каналам FAM/SybrGreen и ROX. Для подтверждения специфичности реакции, после последнего цикла снимали кривую плавления при следующих условиях:
предварительное удерживание - 60C, 30сек; диапазон плавления - от 55C до 95C с шагом 0,5C, 6сек.
В каждую экспериментальную постановку включали контрольные реакции:
отрицательный контроль без матрицы (кДНК); отрицательный контроль с неспецифической матрицей - суммарной РНК; положительный контроль, содержащий кДНК гена GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), синтезированную в реакции обратной транскрипции совместно с экспериментальными образцами, но на основе синтетической мРНК гена GAPDH, приложенной производителем к набору (Ребриков Д.В. и др., 2009).
В нашей работе расчет уровня матричной РНК (мРНК) генов XBP1, BiP и CHOP проводили с использованием алгоритма 2-Ct, в основу которого положены относительные изменения пороговых циклов (Ct) исследуемого гена и гена домашнего хозяйства, в опытных и контрольных образцах (Livak K.J., Schmittgen T.D., 2001; Wong M.L., Medrano J.F., 2005). Для увеличения точности получаемых результатов, при их нормировании с использованием гена домашнего хозяйства, предварительно было оценено изменение экспрессии сразу нескольких таких генов (Vandesompele J. et al, 2002), наиболее известных по литературным данным. Более стабильный уровень мРНК продемонстрировали гены GAPDH и HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1). В дальнейших расчетах мы использовали значения уровня мРНК только гена GAPDH. Обработанные данные представляли в виде среднего значения, выраженного в относительных единицах, +/- стандартное отклонение по выборке.
Животные. Работа проводилась на 25 самцах беспородных белых крыс массой 100 - 145 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к пище и воде. Массу тела крыс определяли перед началом эксперимента и далее перед каждой новой серией инъекций.
Моделирование токсического действия гомоцистеина in vivo. Раствор гомоцистеина для инъекций готовили на стерильном физиологическом растворе. Все крысы были распределены на пять экспериментальных групп по пять животных в каждой. Первой группе крыс гомоцистеин вводили внутрибрюшинно, второй - подкожно, из расчета 0,6 мкмоль гомоцистеина на 1 г. массы тела, один раз в день (Streck E.L. et al, 2002; Streck E.L. et al, 2003). Животным контрольных групп вводили соответствующий объем физиологического раствора. Пятая группа животных была интактной. Длительность введения гомоцистеина определялась кинетикой развития ответа на стресс, ранее уточненной в ходе предварительно проведенных экспериментов, в которых было установлено, что пик острого ответа приходился на - 5 день. Через 1 час после последней инъекции крысы были декапитированы гильотиной согласно требованиям международных правил работы с животными, взята кровь и органы. Сыворотку анализировали на количественное содержание гомоцистеина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Иванов А.В.
и др., 2011). Печень взвешивали и часть использовали для получения взвеси клеток.
Получение клеточной взвеси из ткани печени. Навески печени помещали в ростовую среду RPMI-1640 с 5% ТЭС и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе. Профильтрованную суспензию клеток подвергали гипотоническому шоку для удаления мертвых клеток и эритроцитов. Далее клетки окрашивали моноклональными антителами для последующего проточно-цитофлуориметрического анализа.
Статистическая обработка данных. Статистическую обработку результатов производили с помощью программного обеспечения Statistica, версия 6.0 (StatSoft Inc, США), а также Microsoft Excel. Использовались однофакторный дисперсионный анализ и критерий Крускала-Уоллиса. Различия считались достоверными при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Морфофункциональные особенности эндоплазматического ретикулума в клеточных линиях EA.hy926 и Jurkat Клетки линий EA.hy926 и Jurkat представляют собой функционально и морфологически разные клеточные типы: первые имеют эндотелиальное происхождение и являются адгезивной культурой, вторые - Т-лимфоцитарное с суспензионным типом роста. Нами был проведен сравнительный анализ степени развития ЭПР в этих двух клеточных типах. На рисунке 1 представлены полученные нами методом ЛКСМ микрофотографии прижизненно меченых клеток флуоресцентным зондом DIOC6. Данный зонд связывается с мембранами внутриклеточных ретикулярных сетей и, в использованной концентрации, позволяет визуализировать ЭПР. С учетом неспецифичности мечения зондом, предпочтительным местом визуализации ЭПР является периферия клеток.
На микрофотографиях видно, что клетки EA.hy926 и Jurkat обладают различным ядерно-цитоплазматическим отношением и разной степенью развития эндоплазматического ретикулума: площадь, занимаемая ЭПР в клетках EA.hy926 в несколько раз превышает таковую в клетках Jurkat. Известно, что эндотелиоциты синтезируют и секретируют большое количество белковых продуктов, в том числе фактор Виллебранда, запасаемый в тельцах Вейбеля-Палада, причем синтез и внутриклеточное депонирование фактора меняются при стрессе ЭПР (Игнашкова Т.И.
и др., 2012). Различия в площади и объеме ЭПР этих двух клеточных типов ассоциированы с разной степенью интенсивности синтеза белка. Эти различия определяются функциональными особенностями данных клеток и, по-видимому, могут обусловливать неодинаковую чувствительность к действию факторов, индуцирующих стресс ЭПР. Большее количество молекулярных сенсоров системы UPR и высокая концентрация белка в люмене ЭПР активно секретирующих клеток, достигающая 100мг/мл (Stevens F.J., Argon Y., 1999; Wu J., Kaufman R.J., 2006), могут, (Stevens F.J., Argon Y., 1999; Kaufman по нашему предположению, привести к отличиям в динамике стрессового ответа: в предположению, прив динамике стрессового частности, к различной длительности фаз интеграции сигналов, разным длительности сигналов, разным амплитуде и положению на временной шкале генов стрессового ответа.
шкале максимумов экспрессии генов стрессового А Б В Г Рис. 1. Различная степень развития ЭПР в клетках двух линий, меченных зондом развития меченных зондом DIOC6: А - клетки линии EA.hy926; Б и В - клетки линии Jurkat; Г - фрагмент ЭПР клеток линии и В фрагмент ЭПР EA.hy926.
2. Изменения экспрессии генов линий человека EA.hy9генов системы UPR в клетках линий человека и Jurkat, под воздействием дитиотрейтола воздействием D,L-гомоцистеина и дитиотрейтол Одним из предполагаемых механизмов патологического действия предполагаемых патологического действия гомоцистеина на клетку является стресс эндоплазматического ретикулума (Austin R.C. et al, 2004;
стресс эндоплазматического Austin Roybal C.N. et al, 2004), в ответ ся система сигнальных ответ на который в клетке активируется система путей UPR (Ron D., Walter P., 2007; Merksamer P.I., Papa F.R., 2010). В ряде работ P, 20показано, что действие гомоцистеина может приводить к аресту клеточного цикла, гомоцистеина аресту стрессу ЭПР и апоптозу эндотелиальных клеток, следствием чего может быть целый эндотелиальных чего ряд патологий, связанных с повреждением стенки сосуда (Outinen P.A. et al, 1999;
связанных с повреждением Outinen Zhang C. et al, 2001).
Известны иммунорегуляторные эффекты гомоцистеина при сердечноиммунорегуляторные гомоцистеина сосудистых заболеваниях: индукция секреции хемокинов и цитокинов моноцитами и индукция цитокинов T-лимфоцитами, а также непосредственное стимулирование пролиферации Bтакже непосредственное стимулирование лимфоцитов и секреции IgG. Под воздействием гомоцистеина эндотелиоциты IgG гомоцистеина продуцируют молекулы адгезии и хемокины, что приводит к увеличению адгезии лейкоцитов на эндотелии (Dai J., Wang X., 2007; Todd et al, 2008). Таким образом, гомоцистеин может влиять как на функционирование отдельных типов клеток, так и на их взаимодействие.
Для сравнительного исследования процесса развития стресса ЭПР в эндотелиоцитарной (EA.hy926) и Т-лимфоцитарной (Jurkat) клеточных линиях человека при воздействии D,L-гомоцистеина и положительного индуктора стресса - дитиотрейтола (Outinen P.A. et al, 1999), была проанализирована экспрессия геновучастников системы UPR - BiP (immunoglobulin heavy chain-binding protein), XBP1 (Xbox binding protein 1) и CHOP (C/EBP-homologous protein), на уровне мРНК. Клетки EA.hy926 и Jurkat инкубировали в течение различных временных интервалов с D,Lгомоцистеином и дитиотрейтолом (ДТТ), с концентрацией в ростовой среде 2,5мМ.
Содержание мРНК анализировали методом ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SybrGreen.
2.1. Изменение уровня сплайсинговой формы гена XBP1 в клетках линий человека EA.hy926 и Jurkat, под воздействием D,L-гомоцистеина и дитиотрейтола. Транскрипционный фактор XBP1 (XBP2, или TREB5) является одним из ключевых регуляторов экспрессии генов шаперонов ЭПР, компонентов ЭПРассоциированной системы деградации белков, а также генов участников системы UPR (Lee A.-H. et al, 2003; Merksamer P.I., Papa F.R., 2010; Li X. et al, 2011). При стрессе ЭПР происходит активация трансмембранной киназы/эндорибонуклеазы IRE1, которая специфически распознает 5Т и 3Т сайты сплайсинга мРНК XBP1 и вырезает 26и нуклеотидный интрон. Это приводит к сдвигу рамки считывания и трансляции активного транскрипционного фактора (Yoshida et al, 2001; Lee K. et al, 2002). Поэтому мы использовали набор праймеров (Hirota M. et al, 2006) для определения относительного количества как общего пула мРНК XBP1 (мРНК XBP1(общ)), так и исключительно ее сплайсинговой формы (мРНК XBP1(спл)). Образование и накопление сплайсинговой формы мРНК гена XBP1 является характерным маркером активации сигнального пути IRE1-XBP1 системы UPR (Ron D. et al, 2007).
В нашей работе впервые показаны изменения экспрессии гена XBP1 на уровне его мРНК - мРНК XBP1(общ) и мРНК XBP1(спл), в ответ на действие гомоцистеина на линии клеток Jurkat и EA.hy926 (Рис. 2). Согласно нашим данным, содержание мРНК XBP1(спл) в клетках Jurkat росло пропорционально увеличению интенсивности стресс-индуцирующего воздействия (суммарного показателя - тип индуктора + время воздействия): при действии гомоцистеина уровень мРНК XBP1(спл) в клетках Jurkat демонстрировал более ранний подъем (в 4,5 раза выше) и большую стабильность, чем в клетках EA.hy926. В последних уровень мРНК XBP1(спл) менялся в большем диапазоне значений. Гомоцистеин вызывал значительный подъем только после 8 часов инкубации, тогда как действие ДТТ приводило к существенному росту уже после часов (в 1,3 раза выше, чем в Jurkat) с последующим спадом в 3,3 раза после 8 часов инкубации. Необходимо отметить, что в клетках EA.hy926 количество мРНК XBP1(спл) практически совпадало после 8 часов инкубации как с гомоцистеином, так и с ДТТ (5,31 и 5,90, соответственно).
Количество мРНК XBP1(общ) отражает общий уровень транскрипции гена XBP1. Полученные данные указывают на то, что действие гомоцистеина вызывает увеличение экспрессии мРНК гена XBP1 и продукции его сплайсинговой формы в обеих клеточных линиях. Однако динамический характер индукции этого гена и образования мРНК XBP1(спл) различны для клеток EA.hy926 и Jurkat. Отличия становятся более значительными при действии положительного индуктора стресса ЭПР дитиотрейтола, который приводит к многократному усилению ответа и сокращению его во времени. В клетках эндотелиоцитарной линии EA.hy926 заметна следующая тенденция: чем сильнее индуктор, тем более ранней и интенсивной становится зависимая от активности IRE1 продукция мРНК XBP1(спл). Клетки лимфоцитарной линии Jurkat демонстрировали более ранний подъем и более низкий уровень мРНК XBP1(спл), постепенно повышающийся с увеличением времени инкубации, тогда как в клетках EA.hy926 происходило резкое падение мРНК XBP1(спл) после 8 часов инкубации. Это обстоятельство указывает на снижение активности сигнального пути IRE1-XBP1 в клетках EA.hy926 после 8 часов инкубации.
А Б XBP1 (общ) (Jurkat) XBP1 (спл) (Jurkat) 4.00 25.3.20.3.2.15.2.10.1.1.5.0.0.00 0.4 8 4 Гц Гц 1.07 1.30 4.03 4.ДТТ ДТТ 2.96 3.32 15.14 16.Время, ч Время, ч В Г XBP1 (общ) (EA,hy926) XBP1 (спл) (EA.hy926) 4.50 25.4.20.3.3.15.2.2.10.1.1.5.0.0.00 0.4 8 4 Гц Гц 0.93 2.00 0.90 5.ДТТ ДТТ 3.89 3.05 19.65 5.Время, ч Время, ч Рис. 2. Изменения уровней мРНК гена XBP1 при действии D,L-гомоцистеина (Гц) (2,5мМ) и дитиотрейтола (ДТТ) (2,5мМ) на клетки Jurkat и EA.hy926: А - общий пул мРНК XBP1 в клетках Jurkat; Б - сплайсинговая форма мРНК XBP1 в клетках Jurkat; В - общий пул мРНК XBP1 в клетках EA.hy926; Г - сплайсинговая форма мРНК XBP1 в клетках EA.hy926.
Изменение уровня мРНК, отн.ед.
Изменение уровня мРНК, отн.ед.
Изменение уровня мРНК, отн.ед.
Изменение уровня мРНК, отн.ед.
2.2. Изменение уровня мРНК гена BiP в клетках линий человека EA.hy926 и Jurkat, под воздействием D,L-гомоцистеина и дитиотрейтола. BiP (HSPA5, или GRP78), белок теплового шока и регулятор системы UPR, в норме связан с люменальными доменами ключевых сенсоров стресса ЭПР (PERK, ATF6 и IRE1) и способен к диссоциации при стрессе ЭПР в результате взаимодействия с белками, имеющими ненативные конформации. Это приводит к активации PERK, ATF6 и IRE1, и последующему запуску UPR (Wu J., Kaufman R.J. et al, 2006).
Результаты количественной оценки изменения содержания мРНК гена BiP в клетках EA.hy926 и Jurkat под действием гомоцистеина и ДТТ представлены на рисунке 3. Динамика изменений уровня мРНК гена BiP в обеих клеточных линиях имела общую, за некоторым исключением, тенденцию к повышению с увеличением времени инкубации и силы индуктора. Более ранний подъем и стабильный уровень мРНК BiP в ответ на действие гомоцистеина были характерны для клеток Jurkat, в отличие от клеток EA.hy926, демонстрировавших позднее, но сильное увеличение количества мРНК BiP (после 8 часов в 4,7 раза выше, чем в Jurkat). По сравнению с эффектом гомоцистеина, при действии ДТТ были обнаружены более высокие уровни мРНК BiP в обеих линиях клеток, но с некоторыми отличиями в динамике. Клетки Jurkat демонстрировали некоторое снижение уровня мРНК BiP после 8 часов инкубации с ДТТ, тогда как для клеток EA.hy926 был отмечен его постоянный рост.
Таким образом, под действием гомоцистеина происходит увеличение экспрессии мРНК гена BiP в обеих клеточных линиях, что указывает на развитие стресса ЭПР и активацию системы UPR (Takayanagi S. et al, 2012). В работе Outinen P.A. et al (1998), выполненной на эндотелиальных клетках, было показано, что индукция мРНК BiP является характерной для действия гомоцистеина. Причем другие тиол-содержащие аминокислоты, тепловой шок или перекись водорода не приводили к значительному подъему уровня мРНК BiP. Также гомоцистеин не вызывает увеличения экспрессии шаперонов ядерно-цитоплазматической или митохондриальной локализации, что указывает на его специфичность в индукции стресса ЭПР (Kokame K. et al, 2000).
Полученные нами данные свидетельствуют об отличиях в динамике экспрессии мРНК гена BiP в клетках Jurkat и EA.hy926. Так, клетки Jurkat демонстрировали постепенно повышающийся, с увеличением временем инкубации, уровень мРНК гена BiP, тогда как в клетках EA.hy926 его подъем был более существенным, но только после 8 часов инкубации с гомоцистеином. Рост количества мРНК гена BiP в клетках EA.hy926, при увеличении времени инкубации с ДТТ, многократно превосходил таковой в клетках Jurkat. В последних, кроме того, отмечались тенденции к понижению после 8 часов инкубации с ДТТ. В исследованиях Kokame K. et al (1998) и Kokame K. et al (2000), при действии на эндотелиоциты более высоких концентраций гомоцистеина (10мМ), было продемонстрировано значительное увеличение количества мРНК гена BiP уже после 4 часов инкубации. Причем Kokame K. et al (2000) показали, что после достижения максимума на 4 часах, уровень мРНК BiP сохранялся и после 8 часов инкубации. Полученные нами данные по экспрессии мРНК BiP в клетках EA.hy926 согласуются с результатами Hossain G.S. et al (2003). Данные по изменению экспрессии мРНК гена BiP в Т-лимфоцитах под воздействием D,Lгомоцистеина и дитиотрейтола в литературе отсутствуют.
А Б BiP (Jurkat) BiP (EA.hy926) 7.00 35.6.00 30.5.00 25.4.00 20.3.00 15.2.00 10.1.00 5.0.00 0.4 8 4 Гц Гц 1.72 2.13 0.86 10.ДТТ ДТТ 4.19 3.73 11.13 30.Время, ч Время, ч Рис. 3. Изменения уровня мРНК гена BiP при действии D,L-гомоцистеина (Гц) (2,5мМ) и дитиотрейтола (ДТТ) (2,5мМ) на клетки Jurkat и EA.hy926: А - мРНК BiP в клетках Jurkat; Б - мРНК BiP в клетках EA.hy926.
2.3. Изменение уровня мРНК гена CHOP в клетках линий человека EA.hy9и Jurkat, под воздействием D,L-гомоцистеина и дитиотрейтола. CHOP (DDIT3, или GADD153) - ядерный транскрипционный фактор, являющийся ингибитором ряда других транскрипционных факторов. Он играет важную роль в регуляции программированной клеточной гибели (апоптоза) и регенерации (Ohoka N. et al, 2005;
Ohoka N. et al, 2007). Результаты количественной оценки изменения содержания мРНК гена CHOP в клетках EA.hy926 и Jurkat под действием гомоцистеина и ДТТ представлены на Рисунке 4. Показано, что в клетках Jurkat под действием гомоцистеина рост уровня мРНК CHOP наблюдался уже после 4 часов инкубации, превышая таковой в клетках EA.hy926 в 4,0 раза. Эндотелиоциты демонстрировали увеличение количества мРНК CHOP только после 8 часов инкубации, которое превосходило в 1,2 раза количество в Jurkat. ДТТ, являясь более сильным индуктором стресса ЭПР, чем гомоцистеин, вызывал более значительное увеличение количества мРНК CHOP в клетках Jurkat (в среднем, в 7 раз), с сохранением прежней динамики. В клетках EA.hy926 при действии ДТТ было обнаружено существенное увеличение уровня мРНК CHOP уже после 4 часов инкубации (в 6,5 раза выше, чем в Jurkat, и в 136,9 раз выше по отношению к контролю) с последующим падением в 2,9 раза после 8 часов инкубации.
Таким образом, нами показано, что под действием гомоцистеина происходит увеличение уровня мРНК гена CHOP в клеточных линиях Jurkat и EA.hy926.
Учитывая, что транскрипционный фактор CHOP является проапоптотическим (Szegezdi et al, 2006), а его экспрессия зависит от активации трех основных сигнальных путей системы UPR (PERK-, ATF6- и IRE1-опосредованного) (Oyadomari S., Mori M., 2004), следовательно, гомоцистеин активирует систему UPR и вызывает проапоптотический ответ в клетках обеих линий. По сравнению с гомоцистеином, действие дитиотрейтола приводило к более значительному увеличению количества мРНК гена CHOP в клетках Jurkat и EA.hy926. Наивысший уровень был отмечен в эндотелиоцитах после 4 часов инкубации (в 136,9 раз выше, чем в контроле), а после Изменение уровня мРНК, отн.ед.
Изменение уровня мРНК, отн.ед.
часов наблюдался резкий трехкратный спад. Клетки Jurkat характеризовались изначально более низким, но постепенно нарастающим уровнем мРНК гена CHOP.
Полученные данные по экспрессии мРНК гена CHOP в эндотелиоцитах согласуются с Jia F. et al, (2011). Данные по изменению экспрессии мРНК гена CHOP в Тлимфоцитах под воздействием D,L-гомоцистеина и дитиотрейтола в литературе отсутствуют.
А CHOP (Jukat) Б CHOP (EA.hy926) 35.00 180.160.30.140.25.120.20.100.80.15.60.10.40.5.20.0.00 0.4 8 4 Гц Гц 3.35 3.43 0.83 4.ДТТ ДТТ 20.92 26.31 136.87 47.Время, ч Время, ч Рис. 4. Изменение уровня мРНК гена CHOP при действии D,L-гомоцистеина (Гц) (2,5мМ) и ДТТ (2,5мМ) на клетки Jurkat и EA.hy926: А - мРНК CHOP в клетках Jurkat; Б - мРНК CHOP в клетках EA.hy926.
Полученные данные по изменению экспрессии мРНК генов XBP1, BiP и CHOP в клетках эндотелиоцитарной (EA.hy926) и лимфоцитарной (Jurkat) линий человека свидетельствуют об активации системы UPR в ответ на стресс-индуцирующее действие D,L-гомоцистеина и дитиотрейтола. Таким образом, гомоцистеин в концентрации 2,5мМ вызывает стресс эндоплазматического ретикулума в клетках EA.hy926 и Jurkat. Динамика и характер стрессового ответа в клетках данных линий различны. Так, в отличие от клеток Jurkat, клетки EA.hy926 демонстрировали более интенсивный ответ на действие гомоцистеина и дитиотрейтола в абсолютном значении, что указывает на большую реактивность клеток данной линии к стрессу ЭПР, но, вместе с тем, и большую инерционность. Падение экспрессии мРНК гена CHOP и образования сплайсинговой формы мРНК гена XBP1 после 8 часов инкубации с дитиотрейтолом - положительным индуктором стресса, может свидетельствовать об активации компенсаторных механизмов и о возможном начале восстановительной фазы стресса.
3. Динамика внутриклеточной концентрации белковых продуктов генов стрессового ответа в клетках линий человека EA.hy926 и Jurkat, под воздействием D,L-гомоцистеина и дитиотрейтола.
Важным показателем развития стресса ЭПР является изменение уровней белковых продуктов генов - участников стрессового ответа. Для некоторых эндотелиоцитарных клеточных линий уже продемонстрирован дозо- и времязависимый эффект гомоцистеина на примере изменения экспрессии белков BiP и Изменение уровня мРНК, отн.ед.
Изменение уровня мРНК, отн.ед.
CHOP. Следует отметить, что с увеличением обоих этих параметров отмечалось повышение уровней белков BiP и CHOP (Hossain G.S. et al, 2003; Kyriakakis E. et al, 2010). Сведения об экспрессии белков BiP и CHOP в Т-лимфоцитатарных клеточных линиях в использованных в работе условиях индукции стресса в литературе отсутствуют.
Для сравнительного исследования динамики внутриклеточной концентрации белковых продуктов генов стрессового ответа, было проанализировано изменение уровня белка BiP, шаперона ЭПР, а также белка CHOP, транскрипционного фактора, ассоциированного с апоптозом, в клетках эндотелиоцитарной (EA.hy926) и лимфоцитарной (Jurkat) линий человека, под воздействием D,L-гомоцистеина и классического индуктора стресса ЭПР - дитиотрейтола (Outinen P.A. et al, 1999;
Cusinato F. et al, 2006). Клетки EA.hy926 и Jurkat инкубировали в течение 6 и 18 часов с D,L-гомоцистеином (Гц) и дитиотрейтолом (ДТТ), с различными концентрациями в ростовой среде (2,5 и 5,0мМ). Уровни белковых продукта целевых генов измеряли методом иммунофлуоресцентного анализа с использованием проточной цитофлуориметрии.
Как было показано (Jacobberger J.W., 2001), примененный метод количественной оценки содержания внутриклеточных белков дает результаты, хорошо согласующиеся с данными иммуноблоттинга для сравнительно широкого диапазона концентраций белков, однако, в области низких концентраций возможны нелинейные отклонения, что затрудняет прямую оценку уровня экспрессируемых белков. Метод проточной цитофлуориметрии, в отличие от иммуноблоттинга, позволяет оценивать экспрессию исследуемых белков в отдельных клетках и дает представление о распределении клеток по содержанию исследуемого белка.
3.1. Изменение внутриклеточного содержания белкового продукта гена BiP в клетках линий человека EA.hy926 и Jurkat, под воздействием D,L-гомоцистеина и дитиотрейтола. Результаты количественной оценки изменения содержания белка BiP в клетках EA.hy926 и Jurkat под действием гомоцистеина и ДТТ представлены на Рисунке 5 (А и В). Было установлено, что гомоцистеин, в обеих линиях клеток, вызывает меньшие изменения уровня белка BiP, по сравнению с ДТТ. При этом наибольшее увеличение уровня белка BiP демонстрировали клетки EA.hy926 (средняя интенсивность флуоресценции клеток была больше в 1,8 раз) после 18 часов инкубации с гомоцистеином в концентрации 5,0мМ, тогда как в клетках Jurkat не было зарегистрировано статистически достоверных изменений уровня флуоресценции клеток. Более существенные изменения уровня флуоресценции клеток и, соответственно, уровня белка BiP были обнаружены после воздействия ДТТ. В клетках Jurkat на протяжении всей временной шкалы наблюдалось некоторое понижение уровня белка BiP при концентрации ДТТ 2,5мМ, тогда как при концентрации 5,0мМ происходило постепенное повышение средней интенсивности флуоресценции (до 1,5 раз, после 18 часов инкубации). Обратная картина наблюдалась в клетках EAhy926, где, при концентрации ДТТ 2,5мМ, со временем инкубации, происходило существенное увеличение уровня белка BiP (интенсивность флуоресценции после 18 часов в 7,5 раз выше). Однако при увеличении концентрации ДТТ до 5,0мМ, после 6 часов инкубации отмечался более низкий уровень (до 2,4 раз), который незначительно понижался после 18 часов (до 2,3 раз).
Известно, что увеличение экспрессии белка BiP указывает на развитие стресса ЭПР и активацию системы UPR (Wu J., Kaufman R.J. et al, 2006; Takayanagi S. et al, 2012). В нашей работе показано, что с увеличением концентрации гомоцистеина и времени инкубации происходит увеличение внутриклеточного содержания белка BiP в клетках EA.hy926, что согласуется с результатами, полученными Hossain G.S. et al (2003), тогда как статистически достоверных изменений содержания этого белка в клетках линии Jurkat обнаружено не было. Действие дитиотрейтола, в среднем, приводило к большему увеличению количества белка BiP в клетках EA.hy926, чем в клетках Jurkat. Необходимо отметить, что для высокой концентрации ДТТ (5мМ) наблюдалось снижение уровня BiP при длительном воздействии. Это может быть связано с внутриклеточным перераспределением белка, обусловленным, вероятно, процессами протеасомной деградации и аутофагии, что было отмечено нами также с применением иммуноцитохимических исследований с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (рис. 6, Г). Однако для интерпретации и подтверждения данного наблюдения требуется проведение дополнительных исследований.
3.2. Изменение внутриклеточного содержания белкового продукта гена CHOP в клетках линий человека EA.hy926 и Jurkat, под воздействием D,Lгомоцистеина и дитиотрейтола. Поскольку продолжительный или тяжелый стресс ЭПР может привести к запуску программированной гибели клетки - апоптозу (Szegezdi E. et al, 2006), было исследовано изменение внутриклеточной концентрации проапоптотического транскрипционного фактора CHOP (Li J. et al, 2006; Oyadomari S.
and Mori M., 2004) при действии гомоцистеина и дитиотрейтола на клетки EA.hy926 и Jurkat. Результаты количественной оценки изменения содержания белка CHOP в клетках EA.hy926 и Jurkat под действием гомоцистеина и ДТТ представлены на Рисунке 5 (Б и Г). Показано, что гомоцистеин, в обеих линиях клеток, вызывает меньшие изменения уровня белка CHOP, по сравнению с ДТТ. При этом наибольшее увеличение уровня белка CHOP демонстрировали клетки EA.hy926 (средняя интенсивность флуоресценции клеток была больше в 1,27 раз) после 18 часов инкубации с гомоцистеином в концентрации 5,0мМ. Изменения количества белка CHOP в клетках Jurkat при действии гомоцистеина были незначительны. С увеличением времени инкубации с ДТТ наблюдался рост уровня белка CHOP в клетках EA.hy926 и Jurkat. Наибольшее увеличение количества белка CHOP было обнаружено в клетках Jurkat при действии ДТТ в концентрации 5,0мМ (средняя интенсивность флуоресценции клеток больше в 1,92 раза).
Таким образом, с увеличением времени инкубации гомоцистеин приводил к росту уровня белка CHOP в клетках обеих линий. Действие ДТТ приводило к более значительному увеличению количества белка CHOP, однако, клетки EA.hy9демонстрировали более высокий его уровень после 18 часов инкубации с гомоцистеином (2,5мМ), чем с ДТТ в той же концентрации. В целом, большее увеличение количества белка CHOP при действии гомоцистеина обнаружено в клетках EA.hy926.
А Б BiP (Jurkat) CHOP (Jurkat) 1.80 2.1.2.1.1.1.1.0.1.0.0.0.0.0.00 0.6/2,5 18/2,5 6/5,0 18/5,0 6/2,5 18/2,5 6/5,0 18/5,Гц Гц 1.00 0.96 1.04 1.06 1.01 1.11 0.97 0.ДТТ ДТТ 0.92 0.75 1.09 1.46 1.75 1.79 1.21 1.Время, ч/Концентрация, мМ Время, ч/Концентрация, мМ В Г BiP (EA.hy926) CHOP (EA.hy926) 9.00 1.8.1.7.1.6.0.5.4.0.3.0.2.0.1.0.00 0.6/2,5 18/2,5 6/5,0 18/5,0 6/2,5 18/2,5 6/5,0 18/5,Гц Гц 1.07 1.01 1.24 1.80 1.09 1.27 1.00 1.ДТТ ДТТ 4.04 7.54 2.38 2.28 1.14 1.22 1.00 1.Время, ч/Концентрация, мМ Время, ч/Концентрация, мМ Рис. 5. Изменение содержания белковых продуктов генов BiP и CHOP в клетках Jurkat и EA.hy9после инкубации в течение 6 и 18 часов с D,L-гомоцистеином (Гц) и дитиотрейтолом (ДТТ) в разных концентрациях: А - изменение уровня белка BiP в клетках Jurkat; Б - изменение уровня белка CHOP в клетках Jurkat; В - изменение уровня белка BiP в клетках EA.hy926; Г - изменение уровня белка CHOP в клетках EA.hy926.
Опираясь на представленные в работе данные об изменении уровней белков CHOP и BiP в клетках линий EA.hy926 и Jurkat под действием гомоцистеина можно заключить, что гомоцистеин является слабым индуктором стресса ЭПР для клеток Jurkat. Клетки EA.hy926 более чувствительны к действию гомоцистеина. Стоит также отметить, что положительный индуктор стресса ЭПР - дитиотрейтол, вызывал большее увеличение уровня белка CHOP в клетках Jurkat, по сравнению с EA.hy926.
Полученные нами данные согласуются с результатами Jia F. et al (2011), демонстрирующими время- и дозозависимый эффект гомоцистеина на эндотелиальных клетках. Jia F. et al (2011) показывают, что с увеличением этих двух параметров происходит увеличение экспрессии генов CHOP и BiP на уровне мРНК и белков. Данные аналогичных исследований, проведенных на клеточной линии Jurkat, в литературе отсутствуют.
(FL1) (FL1) Изменение интенсивности флуоресценции Изменение интенсивности флуоресценции (FL1) (FL1) Изменение интенсивности флуоресценции Изменение интенсивности флуоресценции 4. Иммуноцитохимическое исследование экспрессии ЭПР-резидентных белков в клетках линий человека EA.hy926 и Jurkat, под воздействием D,L-гомоцистеина и дитиотрейтола.
Для визуализации изменений в ЭПР нами было проведено иммуноцитохимическое исследование экспрессии ЭПР-резидентных белков в клетках EA.hy926 и Jurkat с использованием моноклональных антител, специфичных к сигналу локализации в ЭПР - KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu). Наиболее представленными белками ЭПР с такими сигналами являются шапероны BiP, GRP94 и белки семейства протеиндисульфоизомераз (PDI). Повышение экспрессии этих белков ассоциировано со стрессом ЭПР и индукцией адаптивного каскада - UPR. Проведенное нами исследование методом ЛКСМ с 3D-реконструкцией (Рис. 6) показало, что гомоцистеин и дитиотрейтол в концентрации 2,5мМ вызывают увеличение экспрессии шаперонов ЭПР в клетках двух линий, при концентрации 5мМ в клетках EA.hy9наблюдались признаки перераспределения шаперонов в везикулы.
А Б В Г Д Е Рис. 6. Экспрессия ЭПР-резидентных белков с сигналом локализации KDEL в клетках EA.hy926 и Jurkat, инкубированных с D,L-гомоцистеином и дитиотрейтолом в течение 18 часов: А - контроль, клетки EA.hy926, 18 часов без воздействия; Б - клетки EA.hy926, гомоцистеин, 2,5мМ; В - клетки EA.hy926, дитиотрейтол, 2,5мМ; Г - клетки EA.hy926, гомоцистеин, 5,0мМ; Д - контроль, клетки Jurkat, 18 часов без воздействия; Е - клетки Jurkat, дитиотрейтол, 2,5мМ.
Распределение шаперона BiP в клетках EA.hy926 после 18 часов инкубации с гомоцистеином при концентрации 2,5мМ было равномерным, соответствующим локализации флуоресцентного зонда DIOC6 при прижизненном мечении сети ЭПР (Рис. 6, Б). Увеличение концентрации гомоцистеина до 5,0мМ, вызывало перераспределение белка, приводящее к образованию скоплений, заметных в цитоплазме клетки (Рис. 6, Г).
В работе Outinen P.A. et al (1999) было показано, что после 18-и часового воздействия гомоцистеина (5мМ) на эндетелиоциты, происходило перераспределение шаперона BiP из перинуклеарного пространства, по всей цитоплазме, а также изменение интенсивности иммуноцитохимического окрашивания, однако, наши данные, помимо этого, демонстрируют перераспределение шаперонов в везикулы.
6. Оценка клеточной гибели и распределения клеток по фазам клеточного цикла при действии индукторов стресса.
А Б 25.Г В 20.15.10.5.0.Концентрация, 0.00 2.50 5.мМ EAhy926_DTT 2.50 7.02 9.EAhy926_Hcy 2.50 2.78 4.Jurkat_DTT 2.61 16.64 20.Jurkat_Hcy 2.50 3.79 7.Рис. 7. ДНК-цитометрический анализ гибели клеток Jurkat и EA.hy926 после 24 часов инкубации с D,L-гомоцистеином и дитиотрейтолом. А, Б и В - однопараметрические гистограммы распределения клеток по фазам клеточного цикла, канал FL2-A: А - контроль, 24 часа без воздействия; Б - ДТТ, 2,5мМ; В - D,L-гомоцистеин, 2,5мМ. Г - доля клеток в фазе цикла sub-G1.
Как видно из приведенных однопараметрических гистограмм (интервал sub-G1, Рис. 7, А - Г) и графика, отражающего долю апоптотических клеток (Рис. 7, Г), действие индуктора ДТТ приводит к росту апоптоза в обеих линиях клеток, процент клеток sub-G1 при действии ДТТ 2,5мМ в 2,37 раза выше у линии Jurkat. Гомоцистеин % subG1 клеток по каналу FL2A оказывает заметно меньшее действие на клетки, процент апоптотических клеток незначительно превышает контроль.
70.А Б 80.70.60.60.50.50.40.40.30.30.20.20.10.10.0.0.0.00 1.00 2.00 3.0.00 1.00 2.00 3.Концентрация, мМ Концентрация, мМ DTT_Jurkat_G1 DTT_Jurkat_G2 DTT_Jurkat_S DTT_EAhy_G1 DTT_EAhy_G2 DTT_Eahy_S Hcy_Eahy_G1 Hcy_EAhy_G2 Hcy_EAhy_S Hcy_Jurkat_G1 Hcy_Jurkat_G2 Hcy_Jurkat_S Рис. 8. Распределения клеток Jurkat (А) и EA.hy926 (Б) по фазам клеточного цикла после 24 часов инкубации с D,L-гомоцистеином и дитиотрейтолом.
Таким образом, действие ДТТ в клетках Jurkat и EA.hy926 приводит к индукции стресса ЭПР и принятию решения об индукции апоптоза частью клеточной популяции. Клетки EA.hy926 имеют меньшую тенденцию к индукции апоптоза, что может свидетельствовать об их большей устойчивости к стрессу ЭПР.
Для распределения клеток по фазам цикла для двух клеточных линий свойственны разнонаправленные тенденции. Для концентрации 2,5мМ ДТТ и гомоцистеина характерно увеличение процента клеток в стадии G1 для всех линий, более выраженное у гомоцистеина. Действие и ДТТ, и гомоцистеина на два клеточных типа сопровождается снижением количества клеток в фазе S.
6. Изменения экспрессии белковых маркеров стресса ЭПР при действии избытка гомоцистеина in vivo.
Одним из способов моделирования гипергомоцистеинемии у лабораторных животных являются диеты с пониженным содержанием фолиевой кислоты, витамина B12 и (или) избытком метионина (Кубатиев А.А., 2006; Fukada S. et al., 2006; Blaise S.A. et al, 2007;). Данные модели представляют интерес в исследовании патогенеза гипергомоцистеинемии, однако, не лишены ряда недостатков. В частности, ряд авторов полагает, что наблюдаемые эффекты индуцируемой гипергомоцистеинемии имеют комплексный характер, обусловленный не только повышенным уровнем гомоцистеина, но и низким уровнем фолиевой кислоты или повышенным уровнем метионина (Perna A.F. et al, 1996; Hansrani M., Stansby G., 2008). Дефицит фолиевой кислоты и избыток метионина могут оказывать непосредственное неблагоприятное действие на функционирование сосудов независимо от повышенного уровня гомоцистеина (Doshi S.N. et al, 2002; Troen A.M. et al, 2003).
% клеток в фазе цикла % клеток в фазе цикла Для изучения токсического действия гомоцистеина нами была применена модифицированная модель химической индукции стресса гомоцистеином (Scherer E.B.S. et al, 2011). Гомоцистеин вводили животным подкожно и внутрибрюшинно, в дозе 0,6 мкмоль на 1 г. массы тела. Был проведен проточно-цитофлуориметрический анализ экспрессии маркеров стресса ЭПР в клетках печени крыс.
Результаты изменения концентрации гомоцистеина в крови у крыс представлены в Таблице 1.
Таблица 1. Средние значения концентрации гомоцистеина в плазме крови крыс в экспериментальных группах Группа Тип введения Концентрация Гомоцистеина, мкмоль/л Интактные - 1,80,Физиологический раствор подкожный 2,60,внутрибрюшинный 2,40,D,L-Гомоцистеин подкожный 27,70,(доза 0,6 мкмоль/г массы тела) внутрибрюшинный 278,16, Результаты количественной оценки изменения содержания белков BiP и CHOP в клетках печени крысы при токсическом действии гомоцистеина представлены на рисунке 9. При подкожном введении гомоцистеина уровень экспрессии белка BiP в клетках печени был незначительно выше контрольного, тогда как при внутрибрюшинном введении экспрессия BiP увеличивалась более чем в четыре раза (средняя интенсивность флуоресценции клеток была в 4,62 раза выше). Так же было установлено, что внутрибрюшинное введение гомоцистеина приводило к заметному подъему уровня белка CHOP (средняя интенсивность флуоресценции клеток была в 2,87 раз выше), при подкожном введении статистически достоверных изменений уровня флуоресценции клеток, меченых антителами к CHOP, зарегистрировано не было.
А Б BiP CHOP 5.00 3.4.3.4.2.3.3.2.2.1.2.1.1.1.0.0.0.00 0.П/К В/Б П/К В/Б D,L-Гомоцистеин (0,6мкмоль/г) D,L-Гомоцистеин (0,6мкмоль/г) Рис. 9. Изменение содержания белков BiP и CHOP в клетках печени крыс: А - изменение экспрессии белка BiP; Б - изменение экспрессии белка CHOP. П/К - подкожное введение, В/Б - внутрибрюшинное введение.
(FL1) (FL1) Изменение интенсивности флуоресценции Изменение интенсивности флуоресценции Таким образом, внутрибрюшинное введение гомоцистеина (0,6 мкмоль/г массы тела животного) приводило к значительному увеличению экспрессии белков BiP и CHOP по сравнению с подкожным введением. Это свидетельствует о развитии стресса ЭПР в клетках печени крыс при действии высоких концентраций гомоцистеина.
В нашей работе проявлением токсического эффекта гомоцистеина in vivo явилась индукция стресса ЭПР в клетках печени крыс. Использованная нами модель индуцируемого гомоцистеином стресса может быть применена для дальнейших исследований механизмов вызванной прямым действием гомоцистеина альтерации тканей.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В работе охарактеризованы особенности экспрессии генов стрессового ответа при действии повышенных концентраций гомоцистеина, характерных для тяжелых форм гомоцистеинемии и гомоцистинурии.
Впервые показаны различия в функционировании системы сигнальных каскадов, индуцируемых при стрессе эндоплазматического ретикулума (UPR, ответ на белки с ненативными конформациями) в клетках эндотелиоцитарного и лимфоцитарного типов. Эти отличия заключаются не только в уровнях индуцируемых мРНК при стрессе ЭПР, что может быть обусловлено разным количеством молекул, выполняющих функцию рецепции белков с дефектами конформаций в ЭПР, и, соответственно, разной концентрацией активирующих транскрипционных факторов.
Обнаруженные изменения на уровне белковых продуктов свидетельствуют также о наличии дополнительных, клеточно-специфичных механизмов регуляции ЭПРстрессового ответа. В работе впервые показаны различия в эффективности адаптации к стрессу ЭПР.
Новизна работы заключается в анализе не только величины, но и длительности сигналов в регуляции стресса ЭПР. В частности, различная продолжительность активации IRE-1-опосредованного сигнального каскада и отличия временных профилей экспрессии проапоптотического гена CHOP могут свидетельствовать о разной длительности фазы принятия решения об индукции апоптоза и обуславливать различия в устойчивости клеток двух типов к ЭПР-стрессу. На основе проведенного анализа сформулировано предположение о времязависимой регуляции в системе UPR. Для уточнения механизмов, лежащих в основе подобной времязависимой регуляции, требуется проведение дополнительных исследований - в частности, анализ стабильности мРНК.
Исследования, проведенные на самцах крыс, показали, что внутрибрюшинное введение гомоцистеина приводило к значительному увеличению экспрессии белков BiP и CHOP по сравнению с подкожным введением. Это свидетельствует о развитии стресса ЭПР в клетках печени крыс при действии избытка гомоцистеина.
Полученные результаты уточняют картину молекулярных и субклеточных процессов при стрессе ЭПР. Установленные особенности экспрессии стрессреспонсивных генов, регуляции стресса ЭПР и апоптоза при действии избытка гомоцистеина могут быть использованы для выработки подходов к лечению гипергомоцистеинемии.
ВЫВОДЫ 1. Гомоцистеин в исследованном диапазоне концентраций приводит к развитию стресса ЭПР и активации системы сигнальных путей UPR в клетках EA.hy9и Jurkat; гомоцистеин является более слабым индуктором стресса ЭПР по сравнению с дитиотрейтолом.
2. Продолжительность активации IRE1-опосредованного сигнального пути различна в клетках двух типов. Снижение уровня мРНК сплайсинговой формы XBP1 в клетках EA.hy926 является признаком более ранней аттенюации ЭПР-ядерного сигнала.
3. Различия в экспрессии гена BiP в клетках двух линий свидетельствуют о неодинаковой интенсивности и времени развития пикового стрессового ответа в клетках EA.hy926 и Jurkat.
4. Для клеток линии EA.hy926 характерно падение уровня мРНК проапоптотического гена CHOP после кратковременной фазы роста и более низкий процент клеточной гибели при исследованной продолжительности стресс-индуцирующего воздействия. В клетках Jurkat уровень мРНК гена CHOP имел более стабильный характер и поддерживался на сравнительно высоком уровне, рост концентрации белка CHOP в клетках Jurkat был более выражен.
5. Наблюдавшееся несоответствие между уровнями мРНК и концентрацией белковых продуктов ряда генов стрессового ответа (в частности, CHOP) свидетельствует о вовлечении дополнительных посттранскрипционных механизмов регуляции экспрессии генов системы UPR.
6. Высокие концентрации гомоцистеина способны индуцировать стресс ЭПР в клетках печени крыс.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. М.В. Меситов, Т.И. Игнашкова, М.Е. Мещерский, А.С. Акопов, А.А.
Соколовская, А.А. Московцев, А.А. Кубатиев. Индукция стресса эндоплазматического ретикулума в условиях окислительно-восстановительного дисбаланса в клетках T-лимфобластной лейкемии человека // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2012. - №3. - С. 88-94.
2. Т.И. Игнашкова, М.В. Меситов, А.С. Рыбаков, А.А. Московцев, А.А.
Соколовская, А.А. Кубатиев. Депонирование фактора Виллебранда в эндотелиальных клетках человека HUVEC в условиях стресса эндоплазматического ретикулума, индуцированного избытком гомоцистеина in vitro // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2012. - №3. - С. 82-87.
3. М.В. Меситов, М.Е. Мещерский, Т.И. Игнашкова, А.А. Московцев, А.А.
Соколовская, А.А. Кубатиев. Влияние гомоцистеина на фолдинг белков // Материалы VII съезда аллергологов и иммунологов СНГ. Санкт-Петербург, 25 - 28 апреля 2009 // Аллергология и иммунология. - 2009. - Т. 10. - №2. - С. 180.
4. Alisa A. Sokolovskaya, Michael V. Mesitov, Tatiana I. Ignashkova, Michael E.
Meshersky, Aleksey A. Moscovtsev, Aslan A. Kubatiev. Homocysteine induced Unfolded Protein Response in human cell lines // Book of Abstracts The 4th International Congress on Stress Responses in Biology and Medicine, Sapporo, Japan, 6 - 9 October, 2009. - P-052.
Mesitov Mikhail Valentinovich Tissue-specific expression patterns of genes associated with the homocysteine induced endoplasmic reticulum stress Hyperhomocysteinemia is a common pathological condition associated with cardiovascular, neurodegenerative diseases, insulin-dependent diabetes and a number of other disorders. One of the proposed mechanisms of homocysteine action is an endoplasmic reticulum stress, in response to which the cell activates system of the signaling pathways, commonly termed: the unfolded protein response, UPR. The aim of our work was to reveal the dynamics of gene expression response to endoplasmic reticulum stress in the different human cell lines.
We first who has shown the functional differences of UPR in endothelial cells and lymphocytes. These differences were in the mRNA levels induced by ER stress, as well as changes in the level of protein products, which suggest the presence of additional, cellspecific regulatory mechanisms of the ER-stress response. We have analyzed the expression of genes BiP, CHOP, and XBP1, involved in the the stress response in the Jurkat cells (human T-lymphoblastic leukemia). Higher amplitude and shorter duration in the change of CHOP mRNA levels, were in EA.hy926 cells compared to Jurkat cells. We hypnotized that it was associated with less cell death of EA.hy926. Thus, regulation of the stress response depends on both the amplitude and the duration of the mRNA expression impulses. We first who has shown the differences in adaptation and resistance to ER-stress between two cell types. Addition we demonstrated the lack of correlation between the CHOP mRNA level and its protein product. This fact may indicate the involvement posttranscriptional regulating mechanisms of this gene expression.
Taken together these results clarify the picture of the molecular and subcellular processes of ER-stress. Crucial features of stress responsive genes expression, as well as regulation of ER-stress and apoptosis by the action of an excess of homocysteine can be used to develop effective therapeutic approaches for the treatment of hyperhomocysteinemia.