Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
СОКОЛОВА ТАТЬЯНА ГЕННАДИЕВНА Термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты (03.00.07 - микробиология)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва-2008
Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Научные консультанты:
доктор биологических наук Е.А. Бонч-Осмоловская академик РАН, профессор Г.А. Заварзин
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук А.Н. Ножевникова доктор биологических наук, профессор Ю.А. Троценко доктор биологических наук, профессор Р.Н. Ивановский
Ведущая организация:
Факультет почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова, г. Москва.
Защита диссертации состоится У 6 У октября 2008 г. в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.224.при Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.
Автореферат диссертации разослан У Ф сентября 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.В. Хижняк
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Оксид углерода - СО - широко известен как высоко токсичный газ для человека и животных. СО - один из важных малых газов атмосферы. Он присутствует в атмосфере в концентрации 0.06-0.15 ppm (IPCC). Значение СО определяется тем, что его участие в фотохимических реакциях в тропосфере приводит к усилению парникового эффекта (Crutzen, 1974, Bergamaschi et al., 2000). Предполагается, что атмосфера ранней Земли содержала СО в значительной концентрации (Holland, 1984; Kasting, 1990; Kharecha et al., 2005);
ряд гипотез приписывает СО важную роль в происхождении жизни (Pinto et al., 1980; Chameides and Walker, 1981; Wachtershauser 1997; Miyakawa et al., 2002;
Martin and Russel 2004). Аналогами древних биоценозов считаются современные сообщества гидротерм (Заварзин, 1984; Stetter, 2006). Источниками СО в гидротермах являются вулканические газы, которые могут содержать до нескольких % СО по объему (Соколов, 1971; Symonds et al., 1994). СО также может быть продуктом термического разложения органического вещества (Conrad and Seiler, 1985; Schade et al., 1999; Hellebrand and Schade, 2008) и промежуточным метаболитом микробного синтеза или разложения ацетил-КоА по пути Вуда-Льюнгдаля (Conrad and Thauer, 1983; Diekert et al,1984; Eikmans et al., 1985; Ragsdale, 2004).
Окисление СО микроорганизмами было открыто в начале прошлого века (Bejerinck & van Delden, 1903; Kaserer, 1906). Аэробное окисление СО карбоксидобактериями по реакции: 2СО + О2 = 2СО2 подробно изучено (Ножевникова, 1974; Заварзин, 1977; Meyer et al., 1986; Conrad, 1996; King & Weber, 2007). Среди аэробных карбоксидобактерий известно несколько умеренных термофилов (Lyons et al., 1984; Meyer and Schlegel, 1983; Krueger and Meyer 1984; Gadkari et al., 1990). До начала нашей работы было известно, что некоторые анаэробы - ацетогены, метаногены и сульфатредукторы - могут использовать CO как субстрат для роста с образованием ацетата, метана или сероводорода, соответственно. Среди них было известно лишь несколько термофильных представителей (Savage et al., 1987; Diekert & Thauer, 1978; Daniel et al., 1990; Daniels et al., 1977). Кроме того, был выделен один штамм мезофильной фототрофной несерной пурпурной бактерии Rhodocyclus (Rubrivivax) gelatinosus, способный расти в темноте в анаэробных условиях за счет окисления СО до СО2, сопряженного с восстановлением воды до водорода (Uffen, 1983). В 1990 г. В.А. Светличным в гидротермальных местах обитания Курильских островов были обнаружены анаэробные СО-окисляющие бактерии с новым для термофилов типом метаболизма, использовавшие для роста энергию реакции: СО + Н2О = СО2 + Н2 (G0= - 20 кДж/моль) (Светличный и др., 1990;
СО + Н2О = СОSvetlicnhy et al., 1991). К началу наших исследований ничего не было известно о филогенетическом и физиологическом разнообразии водородобразующих (гидрогеногенных) СО-окисляющих (карбоксидотрофных) прокариот, их распространении в гидротермальных местах обитания и роли в микробных сообществах гидротерм.
Интерес к термофильным гидрогеногенным карбоксидотрофным прокариотам носит и прикладной характер. Гидрогеногенные карбоксидотрофы могут быть использованы для получения высокоочищенного водорода при переработке синтез-газа. Синтез-газ, получаемый в результате паровой конверсии природного газа или газификации угля, является наиболее дешевым сырьем для получения водорода и содержит от 29 до 76 % водорода и от 5,6 до 60 % СО.
Водород - экологически чистое средство аккумулирования, транспортировки и потребления энергии. Переработка синтез-газа с участием микроорганизмов, образующих водород как один из продуктов, может значительно увеличить выход водорода и одновременно избавляет от токсичного компонента - СО. Помимо этого, СО-трофы, как и все термофильные микроорганизмы, являются потенциальными источниками новых термостабильных ферментов.
Цели и задачи исследования. Целью представленного исследования являлось изучение термофильных гидрогеногенных СО-окисляющих прокариот:
их физиологического и филогенетического разнообразия, распространения в различных гидротермальных местах обитания, их роли в микробных сообществах гидротерм.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
(1) характеристика исследуемой группы и определение активностей предполагаемых ключевых ферментов метаболизма СО у термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот;
(2) обнаружение термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот в разнообразных по физико-химическим параметрам и географическому положению наземных и глубоководных гидротермах;
(3) определение скорости и основных продуктов трансформации СО микробными сообществами горячих источников;
(4) определение численности анаэробных карбоксидотрофных прокариот в горячих источниках;
(5) выделение и характеристика микроорганизмов, осуществляющих анаэробную трансформацию СО в горячих источниках;
Научная новизна работы. Впервые с помощью разработанного нами радиоизотопного и хроматографического методов показана высокая активность микробной СО трансформации в горячих местах обитания. Определены основные продукты микробной трансформации СО.
Показано физиологическое и филогенетическое разнообразие термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот, их широкое распространение в разнообразных гидротермальных местах обитания.
Описана новая физиологическая группа анаэробных термофильных прокариот. Узаконены новый класс, новое семейство, 5 новых родов, 8 новых видов. В типе Firmicutes описан новый класс Thermolithobacteria, включающий семейство Thermolithobacteriales и новый род Thermolithobacter, содержащий два вида T. carboxydivorans и T. ferrireducens. Выделены и описаны новые роды Carboxydothermus, Thermincola, Carboxydocella, Thermosinus. Выделены гидрогеногеннные карбоксидотрофные представители рода Dictioglomus и типов Euryarchaeota и Crenarchaeota: Thermococcus AM4 и новый вид УThermophilum carboxydotrophusФ.
Впервые было показано наличие и высокая активность ферментов метаболического пути Вуда-Льюнгдаля: формиатдегидрогеназы, гидрогеназы, СО дегидрогеназы, фолатных соединений в бесклеточном экстракте представителя гидрогеногенных СО-окисляющих прокариот C. hydrogenoformans. Обнаружена высоко термостабильная СО дегидрогеназа.
Практическая значимость работы. Разработан аналитический метод нехроматографического разделения газовой смеси метана и СО, и радиоизотопный метод количественного определения продуктов трансформации СО чистыми культурами карбоксидотрофных термофилов и термофильными микробными сообществами. Создана коллекция новых термофильных микроорганизмов, которая может быть использована для целей биотехнологии.
Экстремально термофильные бактерии и гипертермофильные археи являются потенциальными продуцентами термостабильных ферментов. Умеренно термофильные гидрогеногенные СО-окисляющие прокариоты представляют большой интерес как потенциальные агенты для переработки синтез-газа с целью получения водорода.
Личный вклад соискателя. Цикл работ, составляющих диссертационную работу, был начат автором как работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук под руководством академика РАН профессора Г. А.
Заварзина. В дальнейших исследованиях, составляющих данную диссертационную работу, соискателю принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке экспериментальных подходов и обобщения полученных результатов. Автор принимал личное участие в организации и реализации научных экспедиций в районы гидротермальной активности: Баргузинский и Кроноцкий Национальные Заповедники. В работах, выполненных в соавторстве, вклад соискателя заключался в непосредственном участии во всех этапах исследования, - от постановки задач и проведения конкретных экспериментов до обсуждения полученных результатов и подготовке их к публикации.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях УThermophily today. International meeting on cell constituents, genetics and biotechnological applications of thermophilic microorganismsФ - 1990, УExtremophiles 2000Ф, У15th International Symposium of Environmental BiogeochemistryФ - 2001, УThermophiles 2001Ф, Astrobiology in Russia - 2002, УExtremophiles 2002Ф, УExtremophiles 2004Ф, УThermophiles 2005Ф, УBiodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophilesФ - 2005, The 2nd FEMS congress of European microbiologists - 2006, The 11th International Symposium on Microbial Ecology - 2006, УExtremophiles 2006Ф, УThermophiles 2007Ф, The 18th International Symposium on Environmental Biogeochemistry - 2007 и Всероссийской молодежной школе-конференции Актуальные аспекты современной микробиологии - 2005.
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 49 печатных работах, включая 19 экспериментальных работ, 3 главы в BergyТs Mannual, обзора, 24 тезисов конференций.
Место проведения работы. Работа проводилась с 1991 по 1996 гг. в Лаборатории микробных сообществ и с 1996 по 2008 гг. в Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н.
Виноградского РАН (ИНМИ РАН).
Радиоизотопные исследования проводились в Лаборатории микробиологии и биогеохимии водоемов ИНМИ РАН. Секвенирование последовательностей 16S рДНК чистых и накопительных культур выполнялось в Центре Биоинженерии РАН, в Центре Морской Биотехнологии, Балтимор, США, факультете биологии Университета Портлэнда, США. Электронную микроскопию чистых культур выполняли в ИНМИ РАН и МГУ им. М.В. Ломоносова.
Автор приносит искреннюю благодарность академику РАН Г.А. Заварзину и д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловской за постоянное внимание, помощь и интерес к работе. Автор глубоко благодарен за помощь и поддержку на начальном этапе работы В.А. Светличному и д.б.н. М.А. Пушевой. Автор выражает глубокую признательность Н. А. Черныху, А.В. Лебединскому, Т.В. Слеповой, Н.А.
Кострикиной, Т.П. Туровой, Т.В. Колгановой и А.М. Лысенко (ИНМИ РАН), д.г.м. н. Г.А. Карпову (Институт вулканологии и сейсмологии ДВО РАН), проф.
Фрэнку Робу (Центр Морской Биотехнологии, Балтимор, США) за предоставленные пробы из Йеллоустонского Национального Парка и глубоководные пробы из гидротерм Окинавской впадины. Автор выражает глубокую признательность всем соавторам за сотрудничество, а также сотрудникам и аспирантам лаборатории гипертермофильных микробных сообществ за дружескую поддержку и участие.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 240 страницах машинописного текста и включает 35 рисунков и 15 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы и результаты исследования, заключения, выводов и списка литературы, который содержит 52 русских и 197 английских наименований.
Основные защищаемые положения (1) термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты широко распространены в наземных и глубоководных гидротермальных местах обитания и составляют существенную часть микробных сообществ гидротерм;
(2) ключевыми ферментами процесса анаэробного окисления СО с образованием водорода являются СО дегидрогеназы и гидрогеназы, фиксация углерода происходит с участием СО дегидрогеназы по пути Вуда-Льюнгдаля;
(3) в гидротермальных местах обитания, населенных анаэробными термофильными микробными сообществами, и идет активный процесс трансформации СО, причем основным продуктом является СО2;
(4) термофильные гидрогеногенные СО-окисляющие прокариоты разнообразны по фенотипическим свойствам и не образуют единую филогенетическую группу;
(5) существуют как факультативно, так и облигатно зависящие от СО термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты, в разной степени чувствительные к высоким концентрациям СО.
Объекты и методы исследования Объектами исследования служили микроорганизмы и микробные сообщества, населяющие горячие источники.
Пробы воды, ила и бактериальных обрастаний были отобраны из гидротерм Байкальской рифтовой зоны, расположенных на берегу реки Большая, в долине реки Аллы и из горячего источника Гарги; горячих источников Камчатки, расположенных в кальдере Узон, Долине гейзеров, в районах вулканов Мутновский и Карымский; наземных и мелководных морских горячих источников острова Кунашир (Курильские острова); из источника расположенного в гейзерном бассейне Норрис, Йеллоустонский Национальный парк; из горячего источника острова Рауль (архипелаг Кермодек); глубоководных горячих источников Окинавской впадины и Восточно-Тихоокеанского поднятия.
В наземных источниках температура воды в источниках была от 30 до 97С, рН воды от 4.0 до 9,5. Для комплексных исследований СО трансформации радиоизотопными, хроматографическими, молекулярными и культуральными методами были выбраны несколько источников кальдеры Узон. Характеристики этих источников приведены в таблице 1.
Культивирование накопительных и чистых культур гидрогеногенных СОокисляющих прокариот проводили в анаэробно приготовленной (Hungate, 1966;
Жилина и Заварзин, 1978) жидкой среде в атмосфере, содержащей от 100 до 5 % СО в смеси с азотом. Базовая минеральная среда для культивирования пресноводных нейтрофильных гидрогеногенных карбоксидотрофов имела следующий состав (г/л): NH4Cl - 0.66, MgCl2.6H2O - 0.16, CaCl2.2H2O - 0.1, KCl - 0.33, KH2PO4 - 0.33, NaHCO3 - 0.5. В среду добавляли 1 мл/л раствора витаминов (Wolin et al., 1963), 1 мл/л раствора микроэлементов (Кевбрин, Заварзин, 1992). В среду для культивирования алкалофильных или алкалотолерантных гидрогеногенов добавляли Na2CO3 (0,5 г/л). Среду восстанавливали добавлением Na2S.9H2O (1 г/л). Для культивирования морских организмов использовали базовую среду следующего состава: NaCl (18); KCl (0,7); MgSO4 (3,9); CaCl2 2H2O (0,4); NH4Cl (0,3); Na2HPO4 (0,15); Na2SiO3 (0,03); NaHCO3 (0,5); дрожжевой экстракт (Difco) (0,05); резазурин (0.002). В некоторых случаях в среду вносили дрожжевой экстракт (0.2 г/л), ацетат натрия (0.2 г/л), лактат натрия (0.2 г/л), пируват (0.2 г/л). Способность выделенных штаммов расти на сбраживаемых субстратах проверяли в атмосфере азота. Потенциальные субстраты роста, доноры и акцепторы электронов вносили в конечной концентрации 2 г/л. S0, Fe(III) в виде аморфного оксида или цитрата и 9,10-антрахинондисульфонат натрия (AQDS) вносили до конечных концентраций 10 г/л, 90 мМ, 20 мМ и мМ, соответственно. Среду готовили анаэробно, с кипячением и последующим охлаждением под током чистого N2, с добавлением резазурина и, в качестве Таблица 1. Характеристика горячих источников кальдеры Узон, в которых проводились исследования трансформации 14СО радиоизотопным методом Eh, Источник Т,С рН Описание источника Тип пробы мВ воронка, 15 м в диаметре, с серые Бурлящий 90 6.5 -290 постоянным обрастания со интенсивным дна выходом газа в центре глубокая трещина, 1 м серые в длину, стенки Трещинный 80 6.5 -270 обрастания со покрыты серыми стенок обрастаниями воронка, 1 м в Оранжевый светло-серый 70 6.0 -310 диаметре, с мутной нейтральный осадок водой воронка, 2.5*7 м, сверху покрытая гранулами нативной цианоГрифон серы белого цвета; по 60 6.2 -296 бактериальный Заварзина краям воронки мат активно развиваются циано-бактериальные маты восстановителя, Na2S.9H2O (0.5 г/л). Среду с AQDS, аморфным оксидом или цитратом железа готовили без добавления восстановителя и резазурина. До нужного значения рН доводили с помощью 6Н HCl или 6Н NaOH, после чего под током азота разливали среду по пробиркам и флаконам с герметично закрывающимися крышками. Затем газовую фазу во флаконах полностью или частично замещали СО (100, 45, 15 или 5% СО в газовой фазе). Среды стерилизовали автоклавированием при 1 или 0.5 (при наличие в среде S0) АТИ.
Рост СО-окисляющих прокариот оценивали по убыли СО в газовой фазе и образованию Н2 и СО2, наблюдая рост микроскопически.
Численность карбоксидотрофных анаэробов в осадках определяли методом предельных разведений, инкубируя пробы на минеральной среде со 100% СО в газовой фазе. Общую численность прокариот определяли окрашиванием препаратов 1 мкМ раствором ДНК-специфического флуоресцентного красителя ДАФИ (4, 6-диамидино-2-фенилининдол) в течение 5-7 мин (Huber et al., 1985), с использованием флуоресцентного микроскопа (Axio Imager D1, Германия).
Чистые культуры гидрогеногенных карбоксидотрофов получали методом предельных разведений, с последующим высевом на твердые среды для получения отдельных колоний. Использовали твердые среды двух типов: Уroll tubesФ со средой, содержащей 3% агара в атмосфере 100% СО, или лагаровые столбики со средой с органическими субстратами с 1, 5% агара. Для получения клеточной массы культивирование проводили в герметично закрытых сывороточных бутылях объемом 500 мл, при соотношении жидкой и газовой фазы 1:4, или в 5 л ферментере с перемешиванием, со 100% СО в газовой фазе.
Клетки хранили при Ц18 С под азотом.
Определение газообразных продуктов метаболизма и субстратов.
Определение газообразных продкутов метаболизма (СО2, СН4, Н2) и СО определяли на газово-жидкостном хроматографе GLC-Chrom 5 (Laboratorni Pristrozhe, Чехия) со стеклянной колонкой, заполненной активированным углем АГ-3, газ-носитель - Ar, детектор - катарометр.
Восстановление Fe(III) отслеживали с помощью определения концентрации Fe(II) с дипиридилом (Резников и др., 1970).
Микроскопия. Наблюдение за ростом и подсчет клеток проводили с помощью светового микроскопа Микмед-1 с фазово-контрастным устройством КФ-4 (ЛОМО, Россия). При присутствии в среде Fe его нерастворимые в воде формы растворяли в оксалатном буфере (Гаврилов и др., 2003), разведение учитывали при подсчете. Тонкое строение клеток изучали с помощью стандартных методов фиксации клеток и окраски срезов (Reynolds, 1963), с использованием трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100C (Jeol, Япония).
Бесклеточный экстракт получали разрушением клеток обработкой лизоцимом яичного белка с последующим осмотическим шоком протопластов или в прессе Френча. Разрушение клеток проводили анаэробно. Мембраны осаждали ультрацентрифугированием.
Активности ферментов СО дегидрогеназы, формиат дегидрогеназы и гидрогеназы определяли спектрофотометрическим методом в регистрирующем спектрофотометре Specord UV VIS (Германия) с термостатирующим устройством в анаэробных кюветах. Активность гидрогеназы определяли по востановлению бензилвиологена бесклеточным экстрактом в атмосфере водорода (Пушева и др., 1986). Активность формиатдегидрогеназы определяли по восстановлению метилвиологена бесклеточным экстрактом в атмосфере азота в присутствии мМ формиата натрия (Andresen & Ljungdahl, 1976). Активность СО дегидрогеназы определяли по восстановлению бензилвиологена бесклеточным экстрактом в атмосфере 100% СО (Clark et al., 1982). Восттановление метилвиологена и бензилвиологена регистрировали при длине волны проходящего света 600 нм.
Состав цитохромов определяли по дифференциальным спектрам поглощения восстановленных дитионитом против окисленных H2O2 мембранных препаратов с помощью спектрофотометра Specord UV VIS (Германия).
Флавины, тетрагидрофолаты определяли по спектрам флуоресценции на флуоресцентном спектрофотометре МРФ-2А (Япония).
Выделение ДНК проводили методами Мармура или Бирнбойма-Доли в модификациях (Marmur, 1961; Булыгина и др., 2002), с применением технологии фирмы Promega (США). Определение содержания Г+ - пар оснований в ДНК проводили по кривым плавления (Marmur, Doty, 1962). ДНК-ДНК гибридизацию проводили методом оптической реассоциации (De Lay et al., 1970).
Определение концентрации растворенного в источнике СО проводили с использованием Уhead-spaceФ метода отбора проб воды, по методике равновесной дегазации (Большаков, Егоров, 1987). Концентрацию СО в воздушной фазе определяли на газовом хроматографе Кристалл 5000 (ЗАО Хроматэк, Россия) с пламенно-ионизационным детектором и метанатором.
Определение кинетики трансформации СО микробным сообществом горячего источника.
Под током азота в 60-мл флаконы помещали 2 мл пробы - ила из горячего источника Трещинный. В газовую фазу СО вводили в концентрации 0.2-1мкмоль/л газовой фазы. Инкубировали пробы при температурах, близких к in situ, на водяной бане-шейкере ThermoHaake SWB25 (Германия) со скоростью об/мин. Заранее была подобрана такая скорость перемешивания, при увеличении которой скорость потребления СО уже не повышалась. Остаточное содержание СО в газовой фазе определяли на газовом хроматографе Кристалл 5000 (ЗАО Хроматэк, Россия) с пламенно-ионизационным детектором и метанатором.
Расчет концентрации СО в осадках проводили с использованием табличного значения коэффициента его растворимости при данной температуре и минерализации среды.
Оценка потенциальной активности и определение основных продуктов анаэробной термофильной трансформации СО микробными сообществами горячих источников.
Перед началом исследования трансформации СО термофильными прокариотами была проверена эффективность действия при высоких температурах трех традиционных в радиоизотопных исследованиях способов фиксации: добавления NaOH, глютарового альдегида и автоклавирования.
Оптимальным фиксатором для данных исследований оказался глютаровый альдегид (в конечной концентрации 2.5% от общего объема).
С использованием 14СО были измерены скорости трансформации СО чистой культурой термофильной автотрофной гидрогеногенной карбоксидотрофной бактерии и микробными сообществами горячих источников. Интенсивность трансформации СО чистой культурой определяли модифицированным радиоизотопным методом (Беляев и др., 1975). Вносили 0.1 мл СО общей активностью 0.2 мКи, в конечной концентрации 450 мкмоль/л культуры.
Культуру инкубировали с меченным субстратом в течение 3 часов при 65С, после фиксировали глютаровым альдегидом. Опыты с природными пробами проводили в 18-мл пробирках Хангейта. 2 мл осадка заливали до края водой из источников, герметично закрывали. За счет вытеснения воды вводили 1 мл газовой смеси, содержащей N2 и СО (общая активность 0.0046 мКи, конечная концентрация 116 мкмоль СО/л осадка). Анаэробную трансформацию СО микробными сообществами прослеживали с течением времени. Пробы инкубировали in situ 3, 6, 9, 12 и 24 часа. После образцы фиксировали глютаровым альдегидом.
Интенсивность микробной трансформации СО в природных пробах 14 14 оценивали по образованию СН4, СО2, включению углерода СО в растворенное органическое вещество (РОВ), биомассу клеток и летучие жирные кислоты (ЛЖК). Для отделения газообразных продуктов трансформации СО 14 (14СН4, СО2, С-ЛЖК) от оставшегося субстрата была разработана и успешно апробирована специальная установка. Разделение продуктов состояло из следующих этапов: в реакционной колбе СО2 связывалась добавлением 2 Н NaOH; затем проба нагревалась и С-ЛЖК конденсировались при помощи обратного холодильника, подсоединенного к колбе; оставшаяся смесь СН4 и СО пропускалась через нагретую до 300С колонку с CuO, где происходило окисление 14СО до 14СО2, которая на выходе улавливалась -фенилэтиламином в сцинтилляционной смеси; СН4 поступал в нагретую до 700-800С кварцевую трубку, наполненную силикагелем, пропитанным солями кобальта, где сжигался 14 до СО2. Остальные продукты СО трансформации разделяли и количественно определяли, используя описанные ранее методики (Беляев и др., 1975; Гальченко, 1994). Радиоактивность образовавшихся продуктов определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике Rack-Beta (LKB, Швеция). Примененная нами модификация метода описана в публикации (17).
Амплификацию генов 16S рРНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирование полученных ампликонов проводили согласно описанным ранее методикам (Субботина и др., 2003). При этом использовали следующие бактериальные, архейные и универсальные праймеры: Bact8-27F, Arch338F, Bact907R, Arch1381R, Arch915R, Univ515F, Univ1492R.
Филогенетическое положение изолятов и разделенных ДГГЭ фрагментов природной ДНК определяли путем сравнения последовательностей генов 16S рРНК с последовательностями, представленными в базе данных GenBank, с использованием программ BLAST ( и CLUSTAL W v.1.75 (Thompson et al., 1994). Филогенетические деревья были построены с помощью программ TREECON W (Van de Peer, De Wachter, 1994) и PHYLIP (Felsenstein, 1989).
Результаты 1. Краткая характеристика и основные черты метаболизма термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот Предметом нашего исследования были обитающие в гидротермах термофильные прокариоты, характеризующиеся хемолитотрофным типом метаболизма, основанным на использовании СО в качестве единственного источника энергии с образованием Н2 как единственного восстановленного продукта, в соответствии с уравнением: СО + Н2О = СО2 + Н2. Традиционно, физиологические группы анаэробных прокариот называются в соответствии с образуемым продуктом и/или субстратом (метаногенные, ацетогенные, сульфатредуцирующие прокариоты). Для исследуемой нами группы прокариот было предложено название гидрогеногенные, т.е. образующие водород (Svetlitchnyi et al., 2001). Способность к росту на СО (оксиде углерода, карбоксиде) также является определяющей особенностью представителей этой группы и должна быть отражена в ее наименовании - гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты.
В начале нашей работы из гидротерм Курильских островов были выделены несколько штаммов гидрогеногенных карбоксидотрофных бактерий, отнесенных к новому виду нового рода Carboxydothermus hydrogenoformans (см. разд. 6) - первому представителю карбоксидотрофных гидрогеногенных прокариот. Так как ничего не было известно о метаболизме прокариот исследуемой группы, мы выбрали один из штаммов для определения активностей ключевых ферментов предполагаемого пути метаболизма.
Ферментативные активности были определены в экстракте клеток Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2906, выращенных на СО. Были обнаружены высокие активности СО-дегидрогеназы, формиатдегидрогеназы и гидрогеназы, которые составляли 18,35 мкмоль/мин.мг белка (при 73 С, рН 7,0), 0,11 мкмоль/мин.мг белка (при 74С) и 1,57 мкмоль/мин.мг белка (при 65С) соответственно. Для СО-дегидрогеназы было определено значение КmCO, которое составляло 20 мкМ. Обнаруженная нами СО-дегидрогеназная активность обладала исключительно высокой термостабильностью. Максимальная активность наблюдалась при 109С, при 135С активность была лишь в два раза ниже максимальной. Периоды полуинактивации СО-дегидрогеназной активности составляли 35 минут при инкубации при 110С и 6 минут - при 130С. При инкубации реакционной смеси, содержащей бесклеточный экстракт, при 85С в течение 1 часа СО-дегидрогеназная активность не изменялась. По спектрам флуоресценции в бесклеточном экстракте было обнаружены высокое содержание фолатных производных. Исследование дифференциальных спектров выявило возможное присутствие ферредоксина. Присутствие в клетках Carboxydothermus hydrogenoformans СО дегидрогеназной, формиатдегидрогеназной, гидрогеназной активностей, и высокого содержания фолатных соединений указывало на вероятное функционирование нециклического пути фиксации углерода ВудаЛьюнгдаля. Впоследствии это было подтверждено работами В.А. Светличного, в течение последних 15 лет подробно изучавшего метаболизм Carboxydothermus hydrogenoformans, и исследованиями полного генома этого организма. Был выделен ключевой ферментный комплекс пути Вуда-Льюнгдаля - CОдегидрогеназа/ацетил-КоА синтаза (Svetlitchnyi et al., 2004). В геноме Carboxydothermus hydrogenoformans обнаружены гены, кодирующие все ферменты, задействованные в этом метаболическом пути (Wu et al., 2005). В получении энергии этим организмом участвует ферментный комплекс, включающий СО- дегидрогеназу и гидрогеназу особого типа, относящуюся к так называемым Уenergy converting hydroganasesФ (ECH). Была выделена СОдегидрогеназа, входящая в этот комплекс (Svetlitchnyi et al., 2001). Было обнаружено сходство структуры этого комплекса с СО-окисляющим Н2образующим комплексом способной к гидрогеногенному карбоксидотрофному росту несерной пупурной бактерии Rhodospirillum rubrum (Soboh et al., 2002; Fox et al., 1996). В нашей дальнейшей работе, используя праймеры, созданные нами на основе консенсусной последовательности генов cooS и cooS-1, кодирующих СО дегидрогеназы Rhodospirillum rubrum и Carboxydothermus hydrogenoformans, и консенсусной последовательности генов cooH, кодирующих ECH этих организмов, мы показали присутствие сходных генов и их локализацию в едином кластере у ряда филогенетически удаленных гидрогеногенных карбоксидотрофов:
Сarboxydothermus hydrogenoformans, Thermosinus carboxydivorans, Carboxydocella thermautotrophica, Thermincola carboxydiphila, Desulfotomaculum carboxydovorans и Thermolithobacter carboxydivorans (Lebedinsky et al., 2005). Недавнее исследование генома Thermococcus sp. AM4 показало, что объединение СОдегидрогеназы и гидрогеназы (ECH) в одном генном кластере является специфической особенностью и геномным маркером гидрогеногенных карбоксидотрофов (Lebedinsky et al., 2008).
2. Распространение гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот Таблица 2. Географическое положение и физико-химические характеристики исследованных источников Количество рН в Температура Количество источников, местах в местах Места отбора проб исследованных где отбора отбора проб источников обнаружены проб (С) СО-трофы Баргузинский заповедник 7,6 - 9,5 35 - 70 16 Камчатка: Узон, Долина 3,5 - 9,5 30 - 94 59 Гейзеров, вулканы Мутновский и Карымский Йеллоустонский 7,5 50 1 Национальный парк, гейзерный бассейн Норрис о. Рауль (архипелаг Кермадек) 7,2 80 1 Окинавская впадина нд нд 1 Восточно-Тихоокеанское нд нд 24 поднятие Прокариоты, осуществляющие реакцию анаэробного окисления СО, сопряженного с образованием водорода как единственного восстановленного продукта в соотвествии с уравнением: СО + Н2О СО2 + Н2 (G0= - кДж/моль), были обнаружены в пробах воды, ила и бактериальных обрастаний, отобранных из географически удаленных и разнообразных по физико-химическим параметрам гидротерм (табл. 2). Таким образом, было показано, что термофильные гидрогеногенные СО-окисляющие прокариоты присутствуют в наземных и глубоководных источниках с температурами от 30 до 97С и рН от 4.до 9.5.
3. Трансформация СО термофильными микробными сообществами гидротерм Концентрация растворенного СО была измерена в трех континентальных источниках, расположенных в кальдере Узон, Камчатка (табл.1): Бурлящий, Трещинный и грифон Заварзина. В источнике Бурлящий концентрация растворенного СО составила 33 нМ, в двух других - по 20 нМ.
Кинетику анаэробной трансформации СО изучали на примере микробного сообщества осадков источника Трещинный (80С), расположенного в кальдере Узон, Камчатка (табл. 1). Трансформация СО начиналась без лаг-фазы, или она была непродолжительна (около 1 часа), что свидетельствует о том, что анаэробная СО-окисляющая микрофлора находилась в активном состоянии. Зависимость скорости потребления СО от его концентрации имела двуступенчатый характер (рис. 1). Были найдены следующие кинетические параметры: KS1 = 54 нМ, V1m = 0.45 ммоль СО/л осадка/сут; KS2 = 1 мкМ, V2m = 4.5 ммоль СО/л осадка/сут.
Исходя из реальной концентрации СО в источнике (в данном источнике 20 нМ) и пользуясь полученной зависимостью, можно оценить реальную скорость его трансформации микробным сообществом источника Трещинный, где реальная скорость трансформации СО составила 0.09 ммоль/л осадка/сут.
Таким образом, в окислении СО в исследованном горячем источнике могут участвовать карбоксидотрофные прокариоты с высоким и низким сродством к субстрату. Другим объяснением может быть присутствие нескольких СОдегидрогеназ с разными кинетическими характеристиками в одном организме. И в том, и в другом случае микробное сообщество обладает способностью к адаптации к изменяющимся концентрациям СО в источнике и, следовательно, к наиболее полному использованию этого субстрата.
V2m 4,3,2,1,V1m 0,KS1 KS0 20 40 60 80 100 120 140 1СО, мкмоль/л Рис. 1. Зависимость скорости потребления СО от его текущей (остаточной) концентрации в газовой фазе.
4. Пути трансформации СО микробными сообществами гидротерм.
Процессы трансформации СО термофильными микробными сообществами исследовали в четырех источниках кальдеры Узон (табл. 1) с помощью радиоизотопных методов. СО вносили в концентрации, существенно превышающей полученные значения Кs, что позволяло проследить включение метки во все возможные продукты и оценить потенциальную активность процессов. Была выявлена быстрая трансформация СО микробными сообществами. Более 90% от внесенной метки переходило в продукты трансформации СО за 9 часов инкубации в источнике Заварзина (60С), за 3 часа в источнике Трещинный (80С). В источнике Бурлящий (90С) 80% от внесенной СО трансформировалось в продукты за 12 часов инкубации (рис. 2).
Потенциальная активность анаэробной микробной трансформации СО в источниках с температурами 60, 70, 80 и 90С составила 0.09, 0.10, 0.48 и 0.ммоль/л осадка/сут, соответственно.
Основным продуктом микробной трансформации СО всеми четырьмя исследованными сообществами был СО2 (90-100% от использованного 14СО). Не более 5% от использованного СО трансформировалось в летучие жирные кислоты (ЛЖК); доля метки, обнаруживаемой в ЛЖК, снижалась с повышением температуры в источнике. Оставшийся 14С включался в РОВ и биомассу (рис. 2).
Перехода метки в 14СН4 показано не было.
скорость, ммоль/л осадка/сут СО2 СО С-ОВ 0 3 6 9 12 15 18 21 время инкубации (ч) Рис. 2. Динамика трансформации 14СО в 14СО2 и 14С-органическое вещество (14СОВ) микробными сообществами источника Бурлящий (90С), где 14С-ОВ - это сумма 14С-ЛЖК, 14С-РОВ (растворенное органическое вещество) и 14С-клеточной массы.
Таблица 3. Распределение метки в продуктах трансформации 14СО микробными сообществами за 6 часов инкубации.
Название Темпера- Распределение метки в продуктах трансформации 14СО источника тура в 14 14 14 СО2 С-ЛЖК С- С-РОВ источниклеточная ке (С) масса Грифон 60 95.0% 4.8% 0.1% 0% Заварзина Оранжевый 70 100% 0% 0% 0% Трещинный 80 99.2% 0.8% 0% 0% Бурлящий 90 90.4% 0.8% 0.5% 8.3% Пути трансформации СО микробными сообществами, по-видимому, зависят от температуры, при которой развивается сообщество. В составе продуктов трансформации СО при температурах 60, 70, 80 и 90С исследованными нами радиоактивность (имп*10 /мин) сообществами преобладал СО2; заметная доля ЛЖК среди продуктов трансформации СО наблюдалась при 60С.
Таким образом, присутствующий в составе растворенных газов в гидротермальных источниках СО в анаэробных условиях при температуре от до 90С активно трансформируется микробными сообществами гидротерм.
Основным продуктом трансформации является СО2.
5. Определение численности анаэробных термофильных карбоксидотрофных прокариот Анаэробные карбоксидотрофные прокариоты являются значимым компонентом микробных сообществ в горячих источниках (табл. 4). Доля анаэробных СО-окисляющих прокариот составляет от 0.1 до 10% от общего Таблица 4. Соотношение численности анаэробных термофильных карбоксидотрофных прокариот и органотрофных термофильных прокариот в микробных сообществах горячих источников.
название Число клеток в 1 мл или ТС анаэробных СО-трофных описание пробы № инкубации* прокариот/анаэробных источника органотрофных прокариот Грифон цианобактериаль-ные 60 105/1Заварзина маты, ил Трещинный темно-серый ил 82 10/1Бурлящий темно-серый ил 90 106/1Оранжевое поле, 1534 керн, нейтральная 90 106/1часть розовато-бежевые 1312 70 105/1гранулы,78С/8.нитевидные обрастания розового 1315 70 104/1цвета в ручье 72С/8.* - инкубировали при рН среды 6.8-7.0.
количества микроорганизмов или от числа органотрофов. Следует особо отметить их высокую численность в высокотемпературных источниках.
6. Выделение и описание чистых культур новых гидрогеногенных карбоксидотрофных термофильных прокариот Из ряда исследованных горячих источников были получены накопительные культуры, использующие СО, и выделены и описаны новые гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты. Характеристика мест отбора проб, из которых они были выделены, приведена в таблице 5.
Анаэробные термофильные карбоксидотрофные гидрогеногенные прокариоты легко выделялись из проб, богатых органическим веществом, таких как цианобактериальные маты, бактериальные обрастания или илы. В пробах с температурами 50-60C, содержащих цианобактериальные маты, гидрогеногенные карбоксидотрофы обнаруживались практически во всех случаях. За редким исключением, все они были впоследствие выделены в чистую культуру на восстановленной сульфидом натрия среде (Eh= - 250 мв) в атмосфере СО.
Большинство выделенных нами организмов оказалось представителями новых таксонов (рис.3, табл. 6). Они не образуют единую филогенетическую группу, среди них есть представители доменов бактерий и архей. Большая часть выделенных нами термофильных карбоксидотрофных бактерий относится к типу УFirmicutesФ. Наиболее многочисленны представители класса Clostridia, относящиеся к порядку Clostridiales к семействам Peptococcaceae, Syntrophomonadaceae, Acidaminococcaceae. Один из выделенных нами организмов оказался представителем глубокой, на уровне класса, ветви в типе УFirmicutesФ и был отнесен к новому классу Thermolithobacteria. Нами было показано, что среди Dictyoglomi также есть гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты. Среди архей нами были обнаружены гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты, относящиеся к Euryarchaeota и Crenarchaeota (табл. 6). Для большинства новых изолятов, принадлежащих к Bacteria, за исключением представителей родов Caldanaerobacter, Thermolithobacter и Dictyoglomus, способность к окислению СО оказалась признаком рода, для представителей архей карбоксидотрофия была штаммовым или видовым признаком.
Таблица 5. Источники выделения термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот.
Название организма географическое описание пробы температура положение места (C)/pH в месте отбора пробы отбора пробы Виды, выделенные из наземных горячих источников Carboxydothermus о. Кунашир, ил из горячего болота 68 /5.hydrogenoformans Курильские острова УCarboxydothermus Долина Гейзеров, нитевидные розовые 72 /8.siderophilusФ Камчатка обрастания в потоке Thermincola река Большая, ил и 51-72 /6.8-9.carboxydiphila Байкальский цианобактериальный заповедник мат Thermincola о. Кунашир, вода, ил, отложения 65 /6.8-7.ferriacetica Курильские острова охры Carboxydocella Долина Гейзеров, ил и 60/8.thermautotrophica Камчатка цианобактериальный мат Carboxydocella подводный источник ил и 60/6.sporoproducens в озере Карымское, цианобактериальный Камчатка мат УCarboxydocella кальдера Узон, керн, глина 55/5.ferrireducensФ Камчатка Thermosinus гейзерный бассейн вода, ил, гравелит 50/7.carboxydivorans Норрис, Йеллоустонский Национальный парк Caldanaerobacter о. Кунашир, вода и осадок 97/6.штамм 2707 Курильские острова Thermolithobacter остров Рауль, вода, осадок 80/7.carboxydivorans архипелаг Кермадек УDictyioglomus кальдера Узон, вода, ил 80/6.carboxydiphilusФ Камчатка УThermophilum кальдера Узон, вода, ил 90/6.carboxydivoransФ Камчатка глубоководные горячие источники Caldanaerobacter Окинавская впадина ил нет данных subterraneus subsp.
pacificus Thermococcus AM4 Восточно- активная нет данных Тихоокеанское гидротермальная поднятие постройка, заселенная Alvinella 10% Carboxydothermus hydrogenoformans Carboxydothermus ferrireducens.
Caldanaerobacter subterraneus strain 27Caldanaerobacter subterraneus ssp. pacificus Caldanaerobacter subterraneus ssp. tengcongensis.
Caldanaerobacter subterraneus ssp. yonsiensis Caldanaerobacter keratinophilusФ У Caldanaerobacter subterraneus ssp. subterraneus Thermoanaerobacter wiegelii Thermoanaerobacter ethanolicus.
Thermoanaerobacter siderophilus Thermoanaerobacter kivui Thermoanaerobacter brockii Thermoanaerobacter mathranii Thermoanaerobacter italicus Ammonifex degensii Dehalococcoides ethenogenes Dictyoglomus thermophilum Thermaerobacter marianensis Moorella thermoacetica Thermolithobacter carboxydivorans Thermolithobacter ferrireducens Thermincola ferriacetica Thermincola carboxydophila Desulfotomaculum nigrificans Sporotomaculum hydroxybenzoicum Desulfotomaculum thermobenzoicum У Carboxydocella ferrireducens" Carboxydocella thermoautotrophica Thermosinus carboxydivorans Dendrosporobacter quercicolus Desulfitobacterium dehalogenans Desulfitobacterium hafniense Anaerobranca horikoshiii Thermosyntrophasyntropha lipolytica Syntrophomonas wolfei Syntrophospora bryantii Desulfovibrio vulgaris ssp. vulgaris Rhodospirillum rubrum Rubrivivax gelatinosus Рис. 3. Филогенетическое положение анаэробных термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных представителей УFirmicutesФ и наиболее изученных гидрогеногенных карбоксидотрофных мезофильных бактерий.
Таблица 6. Термофильные гидрогеногенные СО-окисляющие прокариоты, выделенные из гидротермальных мест обитания Название организма Морфология Г+ - автотроф используе акцепторы оптимальная Минималь Ссылки содер ия/спосо мые востанавли температура ное время жание бность к акцепторы ваемые во С/оптималь удвоения в ДНК броже- время ный рН (часы) мол% нию роста на СО Bacteria; Firmicutes; Clostridia Clostridiales; Peptococcaceae Carboxydothermus короткие слегка 42 факультат + / + Fe(III), AQDS 70-72 / 7.0 2 Svetlichny et al., hydrogenoformans изогнутые ивная AQDS, S0, фумарат 1991 b; Henstra & палочки, SO32-, Stams, 2004* подвижные, S2O32-, Грам + фумарат, нитрат УCarboxydothermus короткие, 41 факультат - / - Fe(III), Fe(III) 70 / 7.0 9.0 Slepova et al. IJSEM siderophilus прямые, ивная AQDS AQDS submitted неподвижные палочки, Грам+ Thermincola прямые палочки, 48 облигатная - / - - - 55 / 8.0 1.3 Sokolova et al., 20carboxydiphila подвижные, Грам+ Thermincola прямые или 48 - / - Fe(III) nd 57-60 / 7.0- 1.5 Zavarzina et al., ferriacetica слегка изогнутые факультат oxide, 7.1 20палочки, ивная AQDS, подвижные, MnO2, спорообразующи S2Oе, Грам+ Clostridiales; Syntrophomonadaceae Carboxydocella короткие, 46 облигатная + / - - - 58 / 7.0 1.1 Sokolova et al., 20thermautotrophica прямые, подвижные палочки, Грам+ Carboxydocella короткие прямые 47 факультат + / + - - 60 / 6.8 1.0 Slepova et al., 20sporoproducens палочки, ивная неподвижные, спорообразующи е, Грам+ УCarboxydocella короткие прямые 48 факультат - / + Fe(III), Fe(III) 60 / 6.8 1.0 Sokolova, personal ferrireducensФ палочки, ивная AQDS communication подвижные, спорообразующи е, Грам+ Clostridiales; Acidaminococcaceae Thermosinus изогнутые 52 факультат - / + Fe(III), Fe(III), 60 / 6.8-7.0 1.5 Sokolova et a., carboxydivorans палочки, ивная SeO32- SeO32 2005a подвижные, S2O32- Грам- Thermoanaerobacteriales; Thermoanaerobacteriaceae Caldanaerobacter тонкие длинные 33 факультат - / + S2O32- - 70 / 6.8-7.1 7.1 Sokolova et al., subterraneus subsp. прямые иногда ивная 2001;
pacificus ветвящиеся Fardeau et al., 20 палочки, неподвижные, Грам+ Caldanaerobacter тонкие, 35 факультат - / + S2O32- - 75 / 7.0 3.2 Subbotina et al., strain 2707 длинные, слегка ивная IJSEM in press изогнутые палочки, спорообразующи е, Грам+ Bacteria; Firmicutes; Thermolithobacteria Thermolithobacterales; Thermolithobacteraceae Thermolithobacter короткие прямые 52 факультат + / + - - 70 / 6.8-7.0 8.3 Sokolova et al., 20carboxydivorans палочки, ивная подвижные, Грам+ Bacteria; Dictyoglomi; Dictyoglomi (class) Dictyoglomales; Dictyoglomaceae Dictyoglomus длинные тонкие нд нд - / нд нд нд 75 / нд нд Slepova, et al., AEM палочки, submitted неподвижные, Грам- Archaea; Euryarchaeota; Thermococci Thermococcales; Thermococcaceae Thermococcus AM4 подвижные 55 факультат - / - S0 S0 85 / *7.0 3.1 Sokolova et al., кокки ивная 2005b Archaea; Crenarchaeota; Thermoprotei Thermoproteales; Thermofilaceae Thermofilum длинные тонкие nd факультат - / нд нд нд 92 / нд нд Slepova et al., AEM палочки ивная submitted * - данные о росте Carboxydothermus hydrogenoformans в атмосфере азота на среде с лактатом с акцепторами электронов, полученные Henstra & Stams, 2004, приведены в таблице для более полной сравнительной характеритики этого вида.
Род Carboxydothermus (Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales;
Peptococcaceae).
(В) 1 мкм Рис. 4. Морфология Carboxydothermus hydrogenoformans (A) и УCarboxydothermus siderophilusФ (В).
0,25 СО рост 0,0,0,Н0,0,00 010 20 время, часы Рис. 5. Рост Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901Т при 75С на 100 % СО в газовой фазе, потребление СО и образование НРод Carboxydothermus (табл. 6) был первым валидно описанным таксоном, включающим представителей термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных бактерий. В настоящее время род содержит три вида:
клетки х10 мл --СО, Н ммоль мл описанные нами Carboxydothermus hydrogenoformans и УC. siderophilusФ, а также C. ferrireducens, который первоначально был описан как новый вид нового рода железовосстанавливающих бактерий, Thermoterrabacterium ferrireducens (Slobodkin et al., 1997), и впоследствии реклассифицирован нами как новый вид рода Carboxydothermus. К виду C. hydrogenoformans были отнесены 4 штамма, выделенных из горячих источников острова Кунашир. УC. siderophilusФ представлен единственным штаммом, выделенным из горячего источника в Долине Гейзеров. Все виды рода Carboxydothermus представлены палочковидными клетками, имеющими клеточную стенку грамположительного типа строения (рис. 4). Все представители рода Carboxydothermus - строгие анаэробы, экстремальные термофилы, нейтрофилы (табл.6), все они факультативные карбоксидотрофы, способные к росту как на СО, так и на других субстратах. Все представители рода Carboxydothermus растут на 100% СО в газовой фазе. C. hydrogenoformans и УC. siderophilusФ - гидрогеногены - литотрофно растут на СО, образуя СО2 и Н2 как единственный восстановленный продукт (рис. 5). C. hydrogenoformans способен к хемолитоавтотрофному росту на СО, УC. siderophilusФ нуждается в дрожжевом экстракте (0.2 г/л). При этом рост УC. siderophilusФ как на СО, так и на других субстратах облигатно зависит от присутствия в среде Fe(III) или AQDS. В присутствии гидроморфного оксида трехвалентного железа C. ferrireducens растет на СО. В процессе его роста происходит окисление СО до СО2 и восстановление гидроморфного оксида Fe(III) c образованием магнетита, но без образования водорода. Было показано, что C.
ferrireducens может расти на СО восстанавливая фумарат до сукцината или AQDS до AQDSH2, но не образуя при этом водорода (Henstra et al., 2004). C.
hydrogenoformans также может расти восстанавливая гидроморфный оксид Fe(III) водородом. C. hydrogenoformans растет в отсутствие СО в атмосфере азота, сбраживая пируват с образованием ацетата, Н2 и СО2, или окисляя формиат, лактат, глицерин или водород и восстанавливая AQDS, или на лактате, восстанавливая сульфит, тиосульфат, серу, нитрат или фумарат (Henstra et al., 2004). УC. siderophilusФ в отсутствие СО в атмосфере азота растет хемоорганотрофно на глюкозе, ксилозе, лактате или дрожжевом экстракте (в присутствии трехвалентного железа или AQDS). Представители разных видов рода Carboxydothermus выделены из географически удаленных источников, расположенных на Камчатке, острове Кунашир и в Йеллоустонском Национальном парке, что свидетельствует о широком распространении представителей этого рода в вулканических местах обитания. В то же время в базе данных GenBank отсутствуют клоны природной 16S рДНК близкородственные 16S рДНК Carboxydothermus, что может объясняться низкой численностью этих микроорганизмов в микробных сообществах горячих мест обитания или плохим выделением ДНК представителей этого рода применяемыми методами.
Род Thermincola (Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Peptococcaceae) Описанный нами род Thermincola (табл.6) включает два вида Thermincola carboxydiphila и T. ferriacetica. Оба вида представлены клетками палочковидной формы с клеточной стенкой грамположительного типа (рис. 6). T. ferriacetica образует споры. Представители рода Thermincola строгие анаэробы, умеренные термофилы. Оба вида представлены единичными штаммами. Thermincola carboxydiphila 2204Т был выделен из слабо щелочного горячего источника Байкальской рифтовой зоны, T. ferriacetica Z-001Т был выделен Д. Г. Заварзиной из отложений охры в горячем источнике острова Кунашир. T. carboxydiphila 2204Т - алкалотолерантный, T. ferriacetica Z-001Т - нейтрофил. Представители рода Thermincola способны к хемолитотрофному росту на СО с образованием СОи Н2, растут на 100% СО в газовой фазе. Не растут на сбраживаемых субстратах.
T. carboxydiphila - облигатный карбоксидотроф, растет на СО хемолитогетеротофно, нуждается в ацетате (0.2 г/л) или дрожжевом экстракте (0.г/л). T. ferriacetica помимо хемолитотрофного роста на СО, способна к росту за счет восстановления трехвалентного железа водородом, ацетатом, петоном, дрожжевым экстрактом, гликогеном, гликолятом, пируватом. Представители рода Thermincola широко распространены, их места обитания не ограничиваются горячими источниками. Штамм, принадлежащий к роду Thermincola был также выделен из горячего источника Исландии (Н.К.Биркланд, личное сообщение), А А В Рис 6. Морфология Thermincola carboxydiphila 2204Т. (А) Ультратонкий срез. (В)Негативное контрастирование. Шкала 0.мкм..
Гены 16S рРНК с высоким сходством с генами16S рРНК рода Thermincola были детектированны в нефтеносных пластах (Liew & Jong, GenBank accession no.
EF095439), в сточных водах очистных сооружений (А.И. Слободкин, неопубликованные данные), в накопительных культурах из шахты с проявлениями геотермальной активности, Япония (Kaksonen et al., 2006), в морских осадках (Mathis et al., 2007).
Род Carboxydocella. (Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales, Syntrophomonadaceae) С Рис. 7. Морфология (A) Carboxydocella thermautotrphica 41T, (В) УC. ferrireducensФ 019, (С) C.
sporoproducens KarT. Негативное контрастирование. Шкала 1 мкм.
Описанный нами род Carboxydocella (табл. 6, рис. 3) представлен тремя видами: Carboxydocella thermautotrophica, C. sporoproducens,УC. ferrireducensФ.
Виды Carboxydocella представлены палочковидными клетками разной длины.
Клетки C. sporoproducens образуют споры (рис. 7). Представители рода Carboxydocella строгие анаэробы, умеренные термофилы, нейтрофилы. Все представители рода Carboxydocella выделены из горячих источников Камчатки:
C. thermautotrophica из источника в Долине Гейзеров, C. sporoproducens - из оз.
Карымское, УC. ferrireducensФ- из кальдеры Узон. Все виды Carboxydocella хемолитотрофно растут на 100% СО в газовой фазе, образуя СО2 и водород. C.
thermautotrophica и C. sporoproducens растут на СО автотрофно. УC.
ferrireducensФнуждается в дополнительном источнике углерода, которым может быть ацетат (0.2 г/л), лактат ( 0.2 г/л) или дрожжевой экстракт (0.2 г/л). УC.
ferrireducensФ растет на СО также и в присутствии трехвалентного железа в виде гидроморфного оксида, образуя СО2 и Н2. Во время роста происходит восстановление трехвалентного железа до двухвалентного, которое не нарушает заметно соотношение окисленного СО и образованного Н2. C. thermautotrophica - облигатный карбоксидотроф. C. sporoproducens органотрофно растет в атмосфере азота, сбраживая дрожжевой экстракт, сахарозу или пируват. УC. ferrireducensФ органотрофно растет на глюкозе, пирувате, глицерине, мальтозе, лактозе. Кроме восстановления трехвалентного железа во время роста на СО, УC. ferrireducensФ способен восстанавливать тиосульфат водородом в присутствии дрожжевого экстракта. Еще три принадлежащих к роду Carboxydocella штамма были выделены из умеренно горячих источников кальдеры Узон, значения рН в которых были близки к нейтральным. Один из этих штаммов был выделен из источника Заварзина, в котором мы показали активный процесс трансформации присутствующего гидротермальном растворе СО в СО2. Еще один штамм был выделен из источника в районе вулкана Мутновский (75С/6.5). Все выделенные штаммы 0,25 Рис.8. Рост СО Carboxydocella 0,thermautotrophica на 0,100 % СО при 60С рост рост 0,0,Н0,00 010 20 время, часы представлены палочками размером 0.5х3 мкм. Два штамма способны образовывать споры. Все эти штаммы росли хемолитоавтотрофно на 100% СО в газовой фазе, образуя равные количества Н2 и СО2, или хемоорганогетеротрофно на дрожжевом экстракте и глюкозе. Таким образом, показано широкое log ( клетки мл ) --СО, Н ммоль мл распространение представителей рода Carboxydocella в различных гидротермальных системах Камчатки.
Род Thermosinus (Bacteria; Firmicutes; Clostridiales; Acidaminococcaceae) Единственный известный к настоящему времени представитель рода Thermosinus - T. carboxydivorans (табл. 6) был выделен на среде, содержащей гидроморфный оксид трехвалентного железа, в атмосфере 100% оксида углерода.
Клетки T. carboxydivorans - изогнутые подвижные палочки с латеральным жгутикованием (рис.9). Клеточная стенка грамотрицательного типа строения. Как и другие водородобразующие карбоксидотрофные бактерии T.
carboxydivorans получает энергию для роста в результате анаэробного окисления СО в Рис. 9. Морфология Thermosinus реакции с водой, продуктами которой carboxydivorans. Негативное являются эквимолярные количества СО2 и контрастирование. Шкала, мкм. Н2; другие продукты не образуются. T.
carboxydivorans растет в атмосфере СО как на восстановленной среде (Eh=-250 mV), так и на среде, приготовленной анаэробно, но не содержащей восстановливающий агент (Eh=+50 mV), как в присутствии, так и в отсутствие соединений трехвалентного железа. Во время роста на СО T. carboxydivorans способен восстанавливать трехвалентное железо в двухвалентное; при этом происходит образование водорода и СО2 в количествах, близких к тем, что образуются этим организмом при росте на СО в отсутствие железа (рис. 10). При окислении 0,22 ммоль СО образуется 11,2 мкмоль Fe(II), что явно недостаточно для того, чтобы существенно повлиять на количество другого восстановленного продукта - водорода. T. carboxydivorans не способен к автотрофному росту на оксиде углерода, но нуждается в дрожжевом экстракте (0,1 г/л) как дополнительном источнике углерода. Повышение концентрации дрожжевого экстракта в среде до 1,0 г/л ведет к увеличению урожая клеток до 5х109 клеток/мл. Кроме роста за счет анаэробного окисления оксида углерода T.
carboxydivorans способен к росту за счет сбраживания ряда сахаров, а именно глюкозы, лактозы, арабинозы, мальтозы, фруктозы, ксилозы и сахарозы, и пирувата. T. carboxydivorans не растет на целлобиозе, галактозе, пептоне, дрожжевом экстракте, лактате, ацетате, 0,25 8,СО рост 0,2 8,0,15 7,Н0,1 7,0,05 6,0 6,(А) 0 102030Время, часы 0,25 Fe(II) 0,CO Н0,рост 0,0,0 10 20 30 (B) Время, часы Рис. 10. Рост Thermosinus carboxydivorans NorT при 60С в атмосфере 100% СО(А) в отсутствие и (B) в присутствии 20 мМ цитрата Fe (III).
формиате, этаноле, метаноле или на цитрате натрия. В процессе сбраживания глюкозы образуются ацетат, водород и СО2. В атмосфере азота на среде не содержащей восстановителя (Eh=+50 mV) он растет на глюкозе, лактозе или сахарозе только в пристствии акцепторов электронов - трехвалентного железа или тиосульфата - восстанавливая их до двухвалентного железа или Н2S соответственно. Во время роста на СО в присутствии Na2SeO4 (2мМ) восстанавливает четырехвалентный селен до элементного.
--2, log (клетки мл ) CO, H ммоль мл --СО, Н ммоль мл log(клетки мл ); Fe(II) мМ Карбоксидотрофные гидрогеногенные представители рода Caldanaerobacter (Thermoanaerobacteriales; Thermoanaerobacteriaceae) Рис. 11.
Морфология Caldanaerobacter subterraneus subsp.
pacificus JM; (А), (В) негативное контрастирование (С) ультратонкий срез. Шкала 0.мкм.
Caldanaerobacter subterraneus subsp. pacificus (табл. 6, рис.3) был первым гидрогеногенным СО-окисляющим термофилом, выделенным из глубоководных мест обитания. Штамм JM был выделен нами из глубоководного горячего источника Окинавского прогиба, описан и валидно опубликован как представитель нового вида нового рода Carboxydobrachium pacificum. Позднее он был реклассифицирован как подвид нового рода нового вида Caldanaerobacter subterraneus - С. subterraneus subsp. pacificus (Fardeau et al., 2004). К тому же виду Caldanaerobacter subterraneus нами был отнесен еще один гидрогеногенный СО- окисляющий организм - штамм 2707 Цвыделенный из наземного пресноводного источника острова Кунашир. Эти штаммы представлены очень длинными тонкими палочковидными клетками. Клетки С. subterraneus subsp. pacificus JM иногда ветвятся (рис.11), клетки штамма 2707 образуют споры. Строгие анаэробы, экстремальные термофилы, нейтрофилы. От других представителей вида Caldanaerobacter subterraneus наши изоляты отличаются способностью к хемолитотрофному росту на СО, сопровождающемуся образованием равных количества Н2 и СО2. Также оба штамма растут органотрофно на ряде сбраживаемых субстратов, образуя как основные продукты брожения Н2, СО2 и ацетат. Оба штамма восстанавливают тиосульфат до Н2S во время роста на сбраживаемых субстратах. Штамм 2707 восстанавливает гидроморфный оксид трехвалентного железа во время роста на пептоне.
Род Thermolithobacter (Bacteria; Firmicutes; Thermolithobacteria;
Thermolithobacterales; Thermolithobacteraceae) (табл. 6).
Гидрогеногенный карбоксидотрофный штамм R1 был выделен из пресного гидротермального источника острова Рауль, архипелага Кермадек. Источник был расположен на берегу озера вулканического происхождения. На основании фенотипического сходства с Carboxydothermus hydrogenoformans он был отнесен к новому вида того же рода УCarboxydothermus restrictusФ. Впоследствии выяснилось, что последовательность 16S рРНК гена штамма R1T имеет 99% сходства с тремя штаммами JW/KA -1, JW/KA-2T и JW/JH-Fiji-хемолитоавтотрофных железоредуцирующих бактерий, выделенными Ю.
Вигелем шестью годами позже из горячих источников Йеллоустонского Национального парка и острова Фиджи. Уровень ДНК-ДНК гибридизации между штаммами R1T и JW/KA-2T составил 35 %. На основании физиологических характеристик, уровня ДНК-ДНК Цгибридизации и анализа последовательности генов 16S рРНК гидрогеногенный штамм R1T и три железоредуцирующих штамма были отнесены к двум новым видам нового рода Thermolithobacter принадлежащего типу Firmicutes. Анализ последовательности генов 16S рРНК показал, что род Thermolithobacter представляет глубокую ветвь на уровне класса в типе Firmicutes. На этом основании было предложено отнести новый род Thermolithobacter к новому классу Thermolithobacteria, входящему в филогенетический тип Firmicutes. Штамм R1T был описан как типовой штамм нового вида Thermolithobacter carboxydivorans.
Новый класс Thermolithobacteria включает семейство Thermolithobacteraceae и род Thermolithobacter. В него входят два вида:
Thermolitobacter carboxydivorans - гидрогеногенный СО-троф и Thermolithobacter ferrireducens - литоавтотрофный водород-использующий железоредуктор.
Описание Thermolithobacteria>
Класс Thermolithobacteria принадлежит к Firmicutes. Представители Thermolithobacteria образуют отдельную линию внутри Firmicutes; облигатно или предпочтительно растут хемолитотрофно. Описание класса такое же как рода.
Типовой порядок Thermolithobacteriales.
Описание Thermolithobacteriales ord. nov.
Описание такое же как рода. Типовое семейство Thermolithobacteraceae.
Описание Thermolithobacteraceae fam.nov.
Описание такое же как рода. Типовой род Thermolithobacter.
Описание Thermolithobacter gen. nov.
Клетки - короткие палочки. Грам-положительный тип клеточной стенки.
Бактерия. Облигатный анаэроб. Термофил. Нейтрофил. Хемолитотроф. Г+ - содержание в ДНК 52-53 1 мол %. Типовой вид Thermolithobacter ferrireducens.
В род входят два вида: T. ferrireducens и T. carboxydivorans.
Рис. 12. Безкорневое филогенетическое дерево, показывающее положение видов Thermolithobacter ferrireducens JW/KA-2T и T.
carboxydivorans R1T.
Клетки Thermolithobacter carboxydivorans - короткие подвижные палочки с перитрихальным жгутикованием, клеточная стенка грамположительного типа.
Строгий анаэроб, экстремальный термофил, нейтрофил. Хемолитоавтотрофно растет на СО, образуя водород, как единственный восстановленный продукт. Рост и окисление СО ингибируются пенициллином, эритромицином, хлорамфениколом, но не стрептомицином, рифампицином или тетрациклином (100 мг/мл). Не восстанавливает сульфат, тиосульфат, фумарат или АХДС во время роста на СО. Не восстанавливает сульфат, тиосульфат или элементную серу при росте с дрожжевым экстрактом, пируватом, ацетатом, цитратом, сукцинатом, лактатом или смесью Н2/СО2. Не растет на СО в присутствии нитрата или трехвалентного железа в виде цитрата или гидроморфного оксида.
Штаммы T. ferrireducens росли за счет восстановления гидроморфного оксида трехвалентного железа водородом и были неспособны к росту на СО.
Гидрогеногенный карбоксидотрофный представитель рода Dictyoglomus УDictyoglomus carboxydivoransФ sp. nov. (Bacteria; Dictioglomi; Dictioglomi;
Dictioglomales; Dictioglomaceae) (табл. 6) Штамм 1512 был выделен из источника Трещинный (Восточное термальное поле, кальдера Узон) (табл. 1), в котором нами был обнаружен активный процесс трансформации присутствующего в Рис. 13.
МорфологияСDictyoglomus carboxydivoransТ 1512.
Негативное контрастирование.
Шкала, 1 мкм гидротермальном растворе СО. Новый изолят хемолитотрофно растет на СО при содержании 5% СО в газовой фазе, образуя Н2 и СО2. Способен расти при 15% СО в газовой фазе, при 45% уже не растет. Не растет на смеси Н2:СО2 (4:1).
Органотрофно растет на пирувате. Нуждается в дрожжевом экстракте (0.2 г/л).
Время генерации при росте с 5% СО в оптимальных условиях составляет часов. Таким образом, культивирование в атмосфере с низким содержанием СО позволило выделить гидрогеногенный карбоксидотрофный микроорганизм, относящийся к новому для карбоксидотрофов филогенетическому типу Dictyoglomi. По анализу последовательности гена 16S рРНК новый изолят отнесен к роду Dictyoglomus, к новому виду СD. carboxydivoransТ 1512.
Гидрогеногенный представитель рода Thremococcus (Archaea; Euryarchaeota;
Thermococci;Thermococcales; Thermococcaceae).
Рис. 14. Морфология Thermococcus AM4. Негативное контрастирование. Шкала, 1 мкм.
Рис. 15. Филогенетическое положение Thermococcus AMШтамм АМ4 был выделен из одной из накопительных культур, полученных из проб глубоководных гидротермальных построек, отобранных в районе Восточно-Тихоокеанского поднятия 13N. Он был первым гидрогеногенным карбоксидотрофным представителем гипертермофильных архей. Штамм АМрастет на 100% СО, образуя Н2 и СО2. В присутствии элементной серы штамм АМрос на дрожжевом или соевом экстрактах, или на пептоне в атмосфере азота.
Анализ последовательности гена 16SрРНК показал, что он имеет высокое сходство с видами T. gammatolerans (98,9%), T. peptonophilus (98,8%) и T. stetteri (98,7%).
Мы проверили способность к росту на СО (100% в газовой фазе) у других представителей Thermococcales: Pyrococcus furiosus, Thermococcus peptonophilus, T. profundus, T. chitonophagus, T. stetteri, T. gorgonarius, T. litoralis и T. pacificus.
Было показано, что ни один из них не способен к анаэробному окислению СО. В то же время все остальные гипертермофильные СО-окисляющие накопительные культуры, полученные из проб глубоководных гидротермальных построек Восточно-Тихоокеанского Поднятия, были представлены кокками, возможно, относящимися к Thermococcales. К настоящему моменту с нашим участием прочитан полный геном Thermococcus AM4 и выявлен генный кластер, содержащий гены, кодирующие основные ферменты, участвующие в метаболизме СО: СО-дегидрогеназу и гидрогеназу.
Гидрогеногенный представитель рода Thermofilum. (Archaea; Crenarchaeota;
Thermoprotei; Thermoproteales; Thermofilaceae) УThermofilum carboxydotrophusФ sp. nov. был выделен из горячего источника в районе вулкана Мутновский. Хемолитотрофно рос на СО при 45% СО в газовой фазе, образуя равные количества Н2 и СО2. Облигатно зависел от присутствия дрожжевого экстракта и цистеина (0.2 г/л). Время генерации в данных условиях при температуре инкубации 92С - 30 часов. Не рос при 15% СО в газовой фазе, при 100% СО рост значительно замедлялся. Органотрофно рос на дрожжевом экстракте. Не рос на смеси Н2:СО2 (4:1), лактате или пептоне. Максимальное сходство по последовательности гена 16S рРНК - с Thermofilum pendens Hrk-5T (97.8%) (рис. 17) (Zillig et al., 1983).
Рис. 16. СThermofilum carboxydotrophusТ 1505 (ТЭМ, негативное контрастирование). Шкала, 1 мкм.
По филогенетическим и фенотипическим отличиям новый изолят отнесен к новому виду СT. carboxydotrophusТ 1505Т.
Таким образом, был выделен еще один представитель гидрогеногенных карбоксидотрофных архей, обладающий наиболее высоким температурным оптимумом роста среди СО-трофных прокариот - 92С. Новый изолят оказался представителем другого филогенетического типа архей - Crenarchaeota, и лишь третьим видом рода Thermofilum (Zillig et al., 1983; Burggraf et al., 1997).
Также оказалось, что последовательность гена 16S рРНК выделенного изолята имела 100% сходства с последовательностями ДНК-клонов, полученных из различных проб горячих источников Йеллоустонского Национального Парка (США) (Barns et al., 1994; Reysenbach et al., 2000; Korf et al., неопубликованные данные). Это позволяет предположить, что представители нового вида СT.
carboxydotrophusТ широко распространены в наземных гидротермах, в том числе в горячих источниках Йеллоустонского Национального Парка.
Thermococcus gammatolerans Thermococcus sp. AMThermococcus_celer Methanobacterium_formicicum Methanopyrus kandleri Thermoplasma acidophilum Euryarchaeota Archaeoglobus fulgidus Methanosarcina barkeri Halobacteriumsalinarum Methanomicrobiummobile Methanococcus vannielii Sulfolobus acidocaldarius Desulfurococcus mobilis Thermoproteus tenax Crenarchaeota Thermofilum pendens СThermofilum carboxydotrophusТ Escherichia coli Рис. 17. Филогенетическое положение СThermofilum carboxydotrophusТ 1505.
Обсуждение результатов.
В результате проделанной работы нами было показано, что анаэробные гидрогеногенные карбоксидотрофы широко распространены в гидротермальных местах обитания и составляют существенную часть микробных сообществ гидротерм. Мы показали, что в наземных гидротермах идет активный процесс трансформации присутствующего там СО, причем в исследованных нами случаях основным продуктом этого процесса был СО2. Мы выделили из различных гидротермальных мест обитания ряд термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот, осуществляющих анаэробное окисление СО в реакции с водой, сопряженное с образованием СО2 и водорода. Мы впервые показали, что в клетках одного из представителей этой группы, Сarboxydothermus hydrogenoformans, содержатся высоко активные компоненты пути ВудаЛьюнгдаля. Более глубокое и всестроннее исследование энзимологии гидрогеногенной карбоксидотрофии было осуществлено В.А. Светличным на примере того же организма (Svetlitchny et al., 2001; 2003; 2004; Dobbek et al., 2001). Наша работа была в большей степени посвящена изучению биоразнообразия гидрогеногенных карбоксидотрофов. Эти организмы оказались филогенетически разнообразными, включающими как бактерий типов Firmicutes и Dictioglomi, так и архей типов Euryarchaeota и Crenarchaeota. Среди них были как облигатные карбоксидотрофы, так и микроорганизмы, способные к росту на других субстратах. Наши исследования значительно расширили представления о фенотипическом и филогенетическом разнообразии термофильных микроорганизмов, способных осуществлять анаэробное окисление СО. В дополнение к известным к началу наших работ нескольким анаэробным термофилам, способным окислять СО в процессе роста: трем ацетогенам - Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica и Thermoanaerobacter kivuii (Savage et al., 1987; Diekert & Thauer, 1978; Daniel et al., 1990), и одному метаногену - Methanothermobacter thermoautotrophicus (Daniels et al., 1977), мы показали способность к росту за счет анаэробного окисления СО у 15 новых видов темофильных и гипертермофильных прокариот. 14 из них относятся к группе гидрогеногенных карбоксидотрофов, использующих для роста энергию реакции СО + Н2О СО2 + Н2 G0= - 20 кДж/моль. Один из видов, относящийся к роду Carboxydothermus, окисляет СО в процессе восстановления трехвалентного железа в виде гидроморфного оксида, и не образует водород. Выделенные нами из гидротермальных мест обитания анаэробные термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты не образуют единую филогенетическую группу.
В домене Bacteria они представлены в шести различных ветвях типов Firmicutes и Dictioglomi. В домене Archaea гидрогенногенные карбоксидотрофы представлены в типах Euryarchaeota и Crenarchaeota. Все описанные нами новые гидрогеногенные СО-окисляющие прокариоты обитают в природных термальных местах обитания - горячих источниках различного типа. Другими исследователями из ила анаэробного биореактора был выделен еще один термофильный факультативный гидрогеногенный карбоксидотроф - сульфатредуцирующая бактерия Desulfotomaculum carboxydivorans (Parshina et al., 2005). Также было показано, что представитель гипертермофильных архей Archaeoglobus fulgidus может расти на СО, образуя ацетат или, в присутствии сульфатов, сероводород (Henstra et al., 2007). Также расширился круг мезофильных гидрогеногенных СО-трофов: в дополнение к известному ранее штамму Rhodocyclus gelatinosus были описаны еще три мезофильных бактерии с этим типом метаболизма: Rhodospirillum rubrum (Kerby et al., 1995), Citrobacter sp.
(Jung et al., 2002) и Sulfurospirillum carboxydovorans (Jensen & Finster, 2005). Было также установлено, что Methanosarcina acetivorans может расти на СО образуя в качестве основных продуктов ацетат и формиат (Rother & Metcalf, 2004). Таким образом, выявлено значительно более широкое распространение сособности к СО-трофии среди анаэробов, чем это представлялось ранее.
Выделенные нами гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты представлены умеренными, экстремальными и гипертермофильными организмами. Экстремальные термофилы относятся к бактериальным родам Carboxydothermus, Caldanaerobacter, Thermolithobacter, Dictioglomus.
Гипертермофилы относятся к археям родов Thermococcus и Thermofillum.
Большинство гидрогеногенных карбокисдотрофных прокариот нейтрофилы; нами был выделен только один алкалитолерантный представитель этой группы - Thermincola carboxydiphila. Ацидофильных представителей исследуемой группы пока не обнаружено.
Большинство гидрогеногенных карбоксидотрофных покариот, известных к настоящему времени, устойчивы к высоким концентрациям СО и хорошо растут при 100% СО в газовой фазе. Только два выделенных нами организма УDictyoglomus carboxydivoransФ и УThermofilum carboxydotrophusФ- чувствительны к высоким концентрациям СО, оптимально развиваясь при 5 или 45 % СО в газовой фазе. Однако даже и эти относительно низкие концентрации СО, значительно превышают полученные нами значения содержания СО в гидротермах и полученные нами значения KS для потребления СО микробным сообществом, обитающим в осадках гидротермального источника. Таким образом, возникает вопрос о роли выделенных нами микроорганизмов как агентов трансформации СО в природных горячих местах обитания. Исследования Carboxydothermus hydrogenoformans, проведенные голландскими учеными показали, что этот организм способен к потребления чрезвычайно низких концентраций СО - до 2 ppm (Henstra et al., 2004). Однако полученные нами значения KS указывают на вероятное существование термофильной микрофлоры с еще более высоким сродством к СО. Похожая ситуация наблюдается в аэробной системе, где осуществление процесса окисления СО в природных местах обитания приписывается так называемым карбоксидоворам - микроорганизмам с высоким сродством к СО, использующим его в процессе миксотрофного роста (King & Weber, 2007).
Большинство описанных нами микроорганизмов способно к росту на других субстратах, помимо СО, но два вида облигатно зависят от СО - это Carboxydocella thermautotrophica и Thermincola carboxydophila.
Многие описанные нами гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты способны расти за счет восстановления различных акцепторов электронов. Было показано, что способность к анаэробному окислению СО и диссимиляционному восстановлению трехвалентного железа является общим признаком ряда таксонов термофильных организмов. Эти свойства могут встречаться у разных видов одного рода - как в случае Thermincola carboxydiphila и Thermincola ferriacetica - или сочетаться в одном организме - Thermosinus caroxydivorans, УCarboxydocella ferrireducensФ. Особый интерес представляют представители рода Carboxydothermus, где мы наблюдаем оба случая сочетания этих свойств.
Среди способных к окислению СО анаэробных термофильных прокариот виды, относящиеся к гидрогеногенным карбоксидотрофам, наиболее многочисленны. Термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты как правило легко выделяются из гидротермальных мест обитания, их численность достигает 10 % от числа органотрофных организмов в микробных сообществах гидротерм. Это позволяет предположить, что СО окисляющие гидрогеногены играют в них важную роль. Гидротермальные системы характеризуются поступлением энергии в виде восстановленных химических соединений, содержащихся в вулканических эксгаляциях. СО, наряду с водородом и сероводородом, может служить источником энергии для развития хемолитотрофных прокариот, населяющих гидротермы. Автотрофные представители этой группы, такие как Carboxydothermus hydrogenoformans, Thermolithobacter carboxydivorans, представители рода Carboxydocella могут быть первичными продуцентами. Как автотрофные так и хемолитогетеротрофные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты окисляют СО с образованием другого энергоемкого соединения - водорода, который является субстратом для многих членов микробных сообществ гидротерм. Кроме того, карбоксидотрофные прокариоты удаляют из системы СО, токсичный для многих, как аэробных, так и анаэробных микроорганизмов.
ВЫВОДЫ 1. Термофильные водородобразующие карбоксидотрофные прокариоты широко распространены в географически удаленных наземных и глубоководных гидротермальных местах обитания с рН от 5.5 до 10.0 и температурами от 50 до 94С и составляют существенную часть микробных сообществ гидротерм.
Установлено, что численность СО-окисляющих водородобразующих термофильных прокариот в горячих источниках кальдеры Узон и Долины Гейзеров составляет до 10% от численности органотрофных организмов.
2. В клетках Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2906 были обнаружены ферментативные активности характерные для нециклического пути фиксации углерода Вуда-Льюндаля: формиатдегидрогеназная, гидрогеназная, СОдегидрогеназная, спектрофотометрически показано наличие фолатных соединений и ферредоксина. Показана высокая активность и термостабильность и низкое сродство к СО выявленной в бесклеточном экстракте СО дегидрогеназной активности.
3. Установлено, что в горячих источниках кальдеры Узон при температуре 6090С и нейтральных значениях рН, идет активное окисление СО до СО2.
4. Группа термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот филогенетически разнообразна. В нее входят бактерии типов Firmicutes и Dictyoglomi и археи типов Euryarchaeota и Crenarchaeota. В типе Firmicutes описан новый класс Thermolithobacteria, включающий семейство Thermolithobacteriaceae и род Thermolithobacter. 10 представителей типа Firmicutes отнесены к 5 новым родам класса Clostridia: Carboxydothermus, Thermincola, Carboxydocella, Thermosinus и Caldanaeobacter. Выделены и описаны новые гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты: Carboxydothermus hydrogenoformans, СCarboxydothermus siderophilusТ, Thermincola carboxydiphila, Carboxydocella thermautotrophica, Carboxydocella sporoproducens, УCarboxydocella ferrireducensФ, Thermosinus carboxydivorans, Caldanaerobacter subterraneus subsp. pacificus, Thermolithobacter carboxydivorans, СDictyoglomus carboxydivoransТ,СThermofilum carboxydotrophusТ, Thermococcus sp. AM4. Показана способность к росту на СО у железоредуцирующих бактерий: Thermincola ferriacetica - с образованием водорода и Carboxydothermus ferrireducens - без образования водорода или ацетата.
5. Группа термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот метаболически разнообразна, она включает как облигатных СО-окисляющих литотрофов, так и микроорганизмы, способные к росту на других субстратах.
6. Анаэробное окисление СО, сопряженное с образованием водорода, может сопровождаться восстановлением ряда акцепторов электронов, таких как трехвалентное железо, в форме гидроморфного оксида или цитрата, или четырехвалентный селен, в форме селенита.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Светличный В.А., Соколова Т.Г., Герхардт М., Заварзин Г.А. (1990) Новая группа анаэробных термофильных карбоксидобактерий выделяющих водород.
Докл. АН СССР, 314: 742-72. Svetlichny V.A., Sokolova T.G., Kostrikina N.A., Zavarzin G.A. (1991) Anaerobic extremely thermophilic carboxydotrophic bacteria in hydrotherms of Kunashir Island.
Microbial Ecology, 21: 1-3. Svetlichny, V. A., Sokolova T. G., Gerhardt M., Ringpfeil M., Kostrikina N. A. & Zavarzin G. A. (1991). Carboxydothermus hydrogenoformans gen.nov., sp.nov., a CO-utilizing thermophilic anaerobic bacterium from hydrothermal environments of Kunashir Island. System Appl Microbiol 14, 254-260.
4. Светличный В.А., Соколова, Т.Г., Кострикина, Н.А., Лысенко А.М. (1994) Carboxydothrmus restrictus sp.nov. - новая термофильная анаэробная карбоксидотрофная бактерия. Микробиология, 63, 523-55. Пушева М.А., Соколова, Т.Г. (1995). Распределение активностей СОдегидрогеназы при СО-зависимом и пируват-зависимом росте анаэробной термофильной карбоксидотрофной бактерии Carboxydothermus hydrogenoformans.
Микробиология, 64, 581-586.
6. Бонч-Осмоловская Е.А., Мирошниченко М.Л., Слободкин А.И., Соколова Т.Г., Карпов Г.А., Кострикина Н.А., Заварзина Д.Г., Прокофьева М.И., Русанов И.И., Пименов Н.В. (1999) Биоразнообразие анаэробных литотрофных прокариот в наземных гидротермах Камчатки.
Микробиология, 68:398-47. Sokolova T.G., Gonzales J.M., Kostrikina N.A., Chernyh N.A., Tourova T.P., Bonch-Osmolovskaya E.A., Robb F.T. (2001) Carboxydobrachium pacificum gen.
nov., sp.nov., a new anaerobic thermophilic carboxydotrophic acterium from Okinawa Trough. Int J System Bacteriol, 51: 141-18. Sokolova T.G., Kostrikina N.A., Chernyh N.A., Tourova T.P., Kolganova T.V., Bonch-Osmolovskaya E.A. (2002) Carboxydocella thermoautotrophica gen. nov., sp.
nov., a novelanaerobic CO-utilizing thermophile from a Kamchatkan hot spring. Int J System Evol Microbiol, 52:1961-199. Субботина И.В., Черных Н.А., Соколова Т.Г., Кубланов И.В., БончОсмоловская Е.А., Лебединский А.В. (2003) Олигонуклеотидные зонды для детекции представителей рода Thermoanaerobacter. Микробиология, 72: 377-310. Sokolova, T. G., Gonzalez, J. M., Kostrikina, N. A., Chernyh, N. A., Slepova, T.
V., Bonch-Osmolovskaya E.A. & Robb, F.T. (2004a). Thermosinus carboxydivorans gen. nov., sp. nov., a new anaerobic thermophilic, carbon-monoxide-oxidizing, hydrogenogenic bacterium from a hot pool of Yellowstone National Park. Int J Syst Evol Microbiol 54: 2353-2311. Sokolova, T. G., Jeanthon, C., Kostrikina, N. A., Chernyh, N. A., Lebedinsky, A. V., Stackebrandt, E. & Bonch-Osmolovskaya, E. A. (2004b). The first evidence of anaerobic CO oxidation coupled with H2 production by a hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-sea hydrothermal vent. Extremophiles, 8: 317-3212. Sokolova T. G., Kostrikina N. A., Chernyh N. A., Kolganova T.V., Tourova T.P., Bonch-Osmolovskaya E.A. (2005). Thermincola carboxydiphila gen.nov., sp.nov., a new anaerobic carboxydotrophic hydrogenogenic bacterium from a hot spring of Lake Baikal area. Int J Syst Evol Microbiol, 55: 2069-2013. Slepova T.V., Sokolova T.G., Lysenko A.M., Tourova T.P., Kolganova T.V., Kamzolkina O.V.,. Karpov G.A., Bonch-Osmolovskaya E.A. (2006) Carboxydocella sporoproducens sp. nov., a novel anaerobic CO-utilizing/H2-producing thermophile bacterium from Kamchatka hot spring. Int J Syst Evol Microbiol, 56: 797-80014. Slobodkin A.I., Sokolova T.G., Lysenko A.M., Wiegel J. (2006) Reclassification of Thermoterrabacterium ferrireducens as Carboxydothermus ferrireducens comb. nov., and emended description of the genus Carboxydothermus. Int J Syst Evol Microbiol, 56:2349-2315. Zavarzina D.G., Sokolova T.G., Tourova T.P.,Chernyh N.A., Kostrikina N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A. (2007). Thermincola ferriacetica sp. nov., a new anaerobic, thermophilic, facultatively chemolithoautotrophic bacterium capable of dissimilatory Fe(III) reduction. Extremophiles, 11(1):1-16. Sokolova T., Hanel J., Oneynwoke R.U., Reysenbach A.-L., Banta A., Geyer R., Gonzalez J., Whitman W.B., Wiegel J. (2007) Novel chemolithotrophic, thermophilic, anaerobic bacteria Thermolithobacter ferrireducens gen. nov., sp. nov. and Thermolithobacter carboxydivorans sp. nov. Extremophiles, 11(1): 145-117. Слепова Т.В., Русанов И.И., Соколова Т.Г., Бонч-Осмоловская, Пименов Н.В.
(2007) Радиоизотопное измерение интенсивности трансформации СО анаэробными термофильными прокариотами. Микробиология, 76 (5): 594-618. Slepova T.V., Sokolova T.G., Kolganova T.V., Tourova T.P. and BonchOsmolovskaya E.A. Carboxydothermus siderophilus sp. nov., a novel thermophilic hydrogenogenic carboxydotrophic dissimilatory Fe(III)-reducing bacterium from Kamchatka hot spring. Int J Syst Evol Microbiol, in press 19. Kozina I., Hodges M., Lee K., Wagner I., Wiegel J., Slobodkin A., Tourova T., Bonch-Osmolovskaya E., Sokolova T. Isolation of Caldanaerobacter strains from terrestrial hot springs and description of Caldanaerobacter uzonensis sp.nov. Int J Syst Evol Microbiol, submitted.
Обзоры 1. Слободкин А.И., Заварзина Д.Г., Соколова Т.Г., Бонч-Осмоловская Е.А.
(1999) Диссимиляционное восстановление неорганических акцепторов электронов термофильными анаэробными прокариотами. Микробиология, 68:600-62. Bonch-Osmolovskaya E.A., Miroshnichenko M.L., Sokolova T.G., Slobodkin A.I.
(2004) Thermophilic microbial communities: new physiological groups, new habitats.
In: Proceedings of Winogradsky Institute of Microbiology. Collected articles on the Institute 70th Anniversary. P.29-3. Robb FT, Gonzalez JM, Sokolova T, Chernyh N, Lebedinski A, Eisen JA, Wu, M, Tallon LJ, Jones K. (2005) Primary energy metabolism in geothermal environments:
The role of carbon monoxide. First Biannual Workshop on Geothermal Biology and Geochemistry in Yellowstone National Park. Ed. W. Inskeep 4. Sokolova TG (2008) The genus Carboxydocella Sokolova, Kostrikina, Chernyh, Tourova, Kolganova,and Bonch-Osmolovskaya 2002, 1965 VP. Second edition of Bergey's manual of systematic bacteriology, vol. 5. Sokolova TG (2008) The genus Thermosinus Sokolova, Gonzlez, Kostrikina, Chernyh, Slepova, Bonch-Osmolovskaya, and Robb 2004, 2357VP. Second edition of Bergey's manual of systematic bacteriology, vol. 6. Sokolova TG & Zavarzina DG (2008) The genus Thermincola Sokolova, Kostrikina, Chernyh, Kolganova, Tourova, Bonch-Osmolovskaya 2005, 2072.VP. Second edition of Bergey's manual of systematic bacteriology, vol. Тезисы конференций.
1. Svetlichny V.A., Sokolova T.G., Gerhardt M., Zavarzin G.A. (1990) New COutilizing H2-forming anaerobic extremely thermophilic bacterium - Carboxydothermus hydrogenoformans. In: Thermophily today. International meeting on cell constituents, genetics and biotechnological applications of thermophilic microorganisms. Viterbo, Italy, May 7-9, 1990, p.2. Gerhardt M., Ringpfeil M., Svetlichny V.A., Sokolova T.G., Zavarzin G.A., Neumann A.,Genyi K. Bath- and Fed-Bath-Fermentation des strict anaerobic thermophilic bacterium - Carboxydothermus hydrogenus. Iahustagung der Biotechnologen (Dichema), January 30 - February 1, 1991, Berlin, p.3. Bonch-Osmolovskaya E.A., Miroshnichenko M.L., Sokolova T.G., Slobodkin A.I.
Lithotrophic thermophilic anaerobes from Kamchatka thermal areas. ThermophilesТ98.
International Conference, Brest, France, 1998. Absracts. B-02.
4. Sokolova T.G., Kostrikina N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Gonzales J.M., Robb F.T. Isolation of new anaerobic thermophilic marine carbon monoxide utilizing bacterium from the hot vent of Okinawa trough. ThermophilesТ98. International Conference, Brest, France, 1998. Absracts. B-P31.
Miroshnichenko M.L., Bonch-Osmolovskaya E.A., Chernyh N.A., SlobodkinA.I., 5. Sokolova T.G., Kostrikina N.A., Chernyh N.A., Slobodkin A.I., BonchOsmolovskaya E.A., Gonzales J.M., Robb F.T. Isolation of new anaerobic thermophilic carbon monoxide oxidizing Fe(III) reducing bacterium from a hot spring of Yellowstone National Park. Abstracts of 3rd International Congress on Extremophiles.
3-7 Sept. 2000, Hamburg, Germany, p.6. Sokolova T.G., Kostrikina N.A., Chernyh N.A., Slobodkin A.I., BonchOsmolovskaya E.A., Gonzales J.M., Robb F.T. Isolation of new anaerobic thermophilic carbon monoxide oxidizing Fe(III) reducing bacterium from a hot spring of Yellowstone National Park. Abstracts of 3rd International Congress on Extremophiles.
3-7 Sept. 2000, Hamburg, Germany, p.7. Sokolova T.G., Gonzales J.M., Kostrikina N.A., Chernuh N.A., Tourova T.P., Robb F.T., Bonch-Osmolovskaya E.A. (2001). Anaerobic CO oxidation and Hproduction by thermophilic bacteria from terrestrial and deep-sea hot vents. In:
Proceedings of the 15th International Symposium of Environmental Biogeochemistry, Wroclaw, Poland, September 11-15, 2001, p. 28. Sokolova T.G., Kostrikina N.A., Janthon C., Nercessian O.G., BonchOsmolovskaya E.A. Anaerobic extremely thermophilic carbon monoxide oxidizing hydrogen-producing archaeon from deep-sea hot vent at East Pacific Rise. In:
Thermophiles 2001 International Conference, New Delhi, India, December 3-7, 2001, p. 3.
9. Sokolova T.G., Gonzlez J., Kostrikina N.A., Chernyh N.A.,Tourova T.P., BonchOsmolovskaya E.A., Robb F.Anaerobic CO-oxidizing, H2-producing prokaryotes from volcanic habitats. Workshop Astrobiology in Russia March 25-29, 2002, St.Petersburg, Russia 10. Bonch-Osmolovskaya E.A., Miroshnichenko M.L., Sokolova T.G., Zavarzina D.G., Slobodkin A.I. Novel anaerobic thermophilic prokaryotes from terrestrial and deep-sea volcanic habitats. In: Thermophiles 2001 International Conference, New Delhi, India, December 3-7, 2001, p. 3.
11. Sokolova T.G., Gonzales J., Kostrikina N.A., Chernyh N.A., Tourova T.P., BonchOsmolovskaya E.A., Robb F.T. Thermophilic anaerobic CO-oxidizing, H2-producing prokaryotes. In: The 4th International Congress on Extremophiles. Naples, September 22-26, 2002, p. 417.
12. Lebedinsky, A., Subbotina, I., Chernyh, N., Sokolova T., Robb, F., BonchOsmolovskaya, E. (2004). Is the metabolism of diverse hydrogenogenic carboxydotrophs determined by specific-type carbon monoxide dehydrogenases and hydrogenases? In: The 5th International Congress on Extremophiles. Cambridge, Maryland, September 19-23, 2004, p.54.
13. Sokolova, T. (2004). Metabolic and phylogenetic diversity of thermophilic hydrogenogenic CO-oxidizing prokaryotes. In: The 5th International Congress on Extremophiles. Cambridge, Maryland, September 19-23, 2004, p.106.
14. Slepova, T., Subbotina, I., Chernyh, N., Tourova, N., Kostrikina, N., Sokolova T.
(2004). Carboxydocella sporoforma sp.nov., a novel anaerobic thermophilic, COutilizing hydrogenogenic bacterium from a Kamchatka hot spring. In: The 5th International Congress on Extremophiles. Cambridge, Maryland, September 19-23, 2004, p.112.
15. Sokolova T.G. (2005) Thermophilic hydrogenogenic CO-oxidizing prokaryotes.
In: Thermophiles Т05. From evolution to revolution. September 18 - 22. p.56-5716.
Slepova T.V., Sokolova T.G., Kolganova T.V. (2006) Anaerobic thermophilic COutilizing hydrogenogenic microorganisms from terrestrial hot springs of Geyzer valley and Uzon Caldera, Kamchatka, Russia. In: Thermophiles Т05. From evolution to revolution. September 18 - 22. p.12417. Sokolova T.G. (2006) Thermophilic hydrogenogenic CO-oxidizing prokaryotes from hot volcanic environments. In: 2nd FEMS congress of European microbiologists. Spain, Madrid, July 4-18. Слепова Т.В., Колганова Т.В. и Соколова Т.Г. Распространение анаэробных термофильных СО-окисляющих/Н2-образующих микроорганизмов в наземных горячих источниках Долины Гейзеров и Кальдеры Узон, Камчатка, Россия.
Молодежная школа-конференция "Актуальные аспекты современной микробиологии", Ноябрь 2005, Москва, Россия.
19. Slepova T.V., Sokolova T.G., Kolganova T.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A.
Anaerobic thermophilic CO-utilizing hydrogenogenic microorganisms from terrestrial hot springs of Geyser Valley and Uzon Caldera, Kamchatka, Russia. International workshop УBiodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophilesФ, August 2005, Petropavlovsk-Kamchatky, Russia.
20. Slepova T., Sokolova T. and Kolganova T. Anaerobic thermophilic COutilizing hydrogenogenic microorganisms from terrestrial hot springs of Geyser valley and Uzon caldera, Kamchatka, Russia. International conference УThermophilesФ, September 2005, Cold Coast, Australia. Abstract P45.
21. Lebedinsky A., Subbotina I., Slepova T., Chernyh N. and Sokolova T. Occurrence of coo-type gene clusters in phylogenetically diverse thermophilic CO-oxidizing H2producing prokaryotes. International conference УThermophilesФ, September 2005, Cold Coast, Australia. Abstract P46.
22. Slepova T.V., Sokolova T.G., Kolganova T.V., Pimenov N.V., Rusanov I.I. and Bonch-Osmolovskaya E.A. Hydrogenogenic CO-oxidizing prokaryotes in microbial communities of Kamchatka hot environments. 11th International Symposium on Microbial Ecology, August 2006, Vienna, Austria. Abstract 374.
23. Slepova T.V., Sokolova T.G., Kolganova T.V., Tourova T.P., Kostrikina N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A. A novel thermophilic hydrogenogenic CO-oxidizing Fe(III)-reducing bacterium. International conference УExtremophilesФ, September 2006, Brest, France. Abstract P032.
24. Slepova T., Sokolova T., Rusanov I., Pimenov N., Lebedinsky A., Kolganova T., Kostrikina N., Bonch-Osmolovskaya E. CO transformation by anaerobic microbial communities of Kamchatka hot springs. International conference УThermophilesФ, September 2007, Bergen, Norway. Abstract L9.