Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по техническим специальностям  

На правах рукописи

МАШЕНЦЕВА НАТАЛЬЯ ГЕННАДЬЕВНА

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ПРОМЫШЛЕННО-ЦЕННЫХ СВОЙСТВ СТАРТОВЫХ КУЛЬТУР И ИХ ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ В ТЕХНОЛОГИИ МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ

Специальность 05.18.07 Ц Биотехнология пищевых продуктов

(перерабатывающие отрасли АПК)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора технических наук

Москва Ц 2008

Работа выполнена на кафедре Технология мяса и мясных продуктов Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московский государственный университет прикладной биотехнологии (ГОУ ВПО МГУПБ)

Научный консультант: 

 

Доктор технических наук, профессор       В.В. Хорольский

Официальные оппоненты:

Доктор технических наук, профессор                         В.И. Ганина

Доктор биологических наук, профессор                          Ю.Д. Цыганков

Доктор технических наук  Ю.И. Ковалев

Ведущая организация:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита диссертации состоится л___ _________2008 г. в ______часов на заседании Диссертационного совета Д 212.149.01. при ГОУ ВПО Московский государственный университет прикладной биотехнологии по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33, конференц-зал.

       

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПБ.

       

Автореферат разослан л___ ________ 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат технических наук, профессор А.Г. Забашта

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

       Актуальность. В настоящее время производственные процессы, основанные на жизнедеятельности микроорганизмов, приобрели огромное значение. Современная биотехнология прямо или косвенно связана с генной инженерией - созданием новых форм микроорганизмов путем непосредственного изменения их генетической системы для получения высокоэффективных полезных штаммов, что влечет за собой увеличение разнообразия биотехнологической продукции. XXI век объявлен Организацией объединенных наций веком биотехнологии. Достижение превосходства в биотехнологии - одна из важных задач в экономической политике промышленных государств. Возможно, что в XXI веке биотехнология окажет решающее воздействие на решение таких важных проблем, как охрана здоровья, обеспечение человека продовольствием, охрана окружающей природы и энергообеспечение.

Тенденцией сегодняшнего дня является создание функциональных продуктов питания с целью улучшения здоровья потребителя. Чаще всего в этой роли выступают кисломолочные продукты, в состав которых входят живые пробиотические культуры. Эффективность и безопасность этих микроорганизмов для здоровья доказаны за долгие годы их применения ( Сухие колбасы и другие ферментированные мясные продукты также могут быть курьерами для доставки пробиотиков в желудочно-кишечный тракт человека.

Одним из основных аспектов биотехнологии является обеспечение безопасности мясных продуктов, поэтому для гарантии безопасности Институт питания РАМН обязательно рекомендует в технологиях производства мясопродуктов, не подвергающихся тепловой обработке, предусматривать добавление в рецептуру эффективных в отношении санитарно-показательной микрофлоры стартовых культур (Шевелева С.А., 2007).

Микробная биотехнология предлагает новые подходы к переработке нетрадиционных видов сельскохозяйственного сырья, появлению безотходных и усовершенствованию классических технологий мясопродуктов, и созданию широкого спектра полноценных высококачественных продуктов питания.

Фундаментальные основы промышленной биотехнологии микроорганизмов, направленной на получение продуктов питания нового поколения, заложены в трудах Ганиной В.И., Костенко Ю.Г., Липатова Н.Н. (мл), Митасевой Л.Ф., Рогова И.А., Семенихиной В.Ф., Соловьева В.И., Титова Е.И., Токаева Э.С., Хорольского В.В., Bover-Cid S., De Vuyst L., Eerola S., Klaenhammer T.R., Leroy F., Madsen S.M., Niinivaara F., Tanous C., Vandamme E.J. и др.

       В пищевой промышленности до последнего времени использовали штаммы микроорганизмов, выделенные из природы. В других промышленных технологиях применяются оптимизированные штаммы, создание которых является важной частью микробиологического синтеза.

Вопросами совершенствования промышленных микроорганизмов традиционно занимаются микробиологи-селекционеры. Для микроорганизмов, недостаточно изученных с точки зрения генетики, единственным инструментом их улучшения является индуцированный мутагенез и ступенчатый отбор лучших вариантов штаммов-продуцентов. Такой метод чрезвычайно трудоемок, и селекционные работы могут занимать многие годы. Развитие методологии генной инженерии, позволяющей выделять и изменять отдельные гены, значительно расширило возможности перестройки геномов микроорганизмов. Сегодня селекция микроорганизмов-продуцентов проводится с помощью методов генной инженерии. Так, если раньше сначала искали активный штамм микроорганизма и только затем разрабатывали процесс получения продукта, то теперь можно взять приспособленный к условиям производства штамм и ввести в него генную конструкцию, которая обеспечит эффективный синтез необходимого продукта.

Конструирование высокопродуктивных штаммов микроорганизмов с заданными свойствами позволит собрать в одном штамме все полезные свойства и элиминировать вредные.

Цель работы - теоретически обосновать и разработать научные принципы совершенствования свойств стартовых культур, позволяющих управлять биотехнологической переработкой сельскохозяйственного сырья, гарантирующей качество и безопасность мясных продуктов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• провести направленный отбор и идентификацию стартовых культур с применением классических фенотипических методов в сочетании с генетическими методами в соответствии с рекомендациями ФАО/ВОЗ (Аргентина, 2001; Канада, 2002);
• расшифровать механизмы формирования качественных характеристик мясопродуктов за счет внесения стартовых культур, и определить основные критерии отбора промышленно-ценных микроорганизмов;
• определить генетические детерминанты, ответственные за проявление основных технологических свойств у стартовых культур;
• предложить принцип конструирования высокопродуктивных штаммов микроорганизмов с заданными свойствами;
• разработать генетическую систему трансформации, экспрессии и селекции перспективных штаммов, и создать штамм-суперпродуцент необходимого технологически-ценного метаболита;
• создать коллекцию промышленных микроорганизмов, в том числе штаммов-суперпродуцентов с активностями, направленными на обеспечение качества и безопасности мясных продуктов;
• научно и экспериментально обосновать методологию создания бактериальных препаратов (б/п) на основе стартовых культур по совокупности функциональных свойств микроорганизмов, обладающих взаимной совместимостью;
• разработать структуру, пользовательские функции и программную оболочку информационного ресурса стартовых культур;
• провести оценку эффективности влияния стартовых культур на качество и функциональные свойства модельных мясных систем и готовых мясных продуктов;
• разработать и утвердить техническую документацию на бактериальные препараты и новые виды мясопродуктов.

Научная новизна. Теоретически обоснована и предложена схема направленного отбора молочнокислых бактерий, денитрифицирующих стафилококков, дрожжей и мицелиальных грибов. Проведена идентификация молочнокислых бактерий с применением классических фенотипических методов в сочетании с генетическими методами в соответствии с рекомендациями ФАО/ВОЗ. Проведена идентификация дрожжей и мицелиальных грибов по совокупности микро- и макроморфологических свойств. У выделенных штаммов мицелиальных грибов вида Penicillium camembertii были исследованы вторичные метаболиты. Результаты показали, что ни один из штаммов P. camembertii не продуцирует характерные для данного вида микотоксины, а именно циклопиазоновую кислоту (ЦПК) и ругуловазины А и В.

Обоснована возможность использования энтерококков в качестве стартовых культур. Исследования на тестовых питательных средах (тесты на протеолитическое разжижение желатина, ДНКазу и гемолизин) показали отсутствие факторов вирулентности у штаммов Enterococcus faecalis. Поиск генов, отвечающих за признаки патогенности энтерококков: прикрепление бактерий к поверхности эукариотической клетки (agg), синтез токсина, обеспечивающего гемолиз эритроцитов, (gelE), cylA - активация цитолизина и esp - внеклеточный поверхностный протеин, необходимый E. faecalis для колонизации мочевыводящих путей и образования биопленок, показал присутствие генов agg и gelE в геномах исследуемых штаммов E. faecalis, хотя и не проявляющих свою активность фенотипически.

Изучена проблема распространения антибиотикоустойчивости у промышленных микроорганизмов. Определено отношение к антибиотикам различных групп стартовых культур, проведен анализ природы антибиотикоустойчивости с оценкой ее потенциальной опасности в плане горизонтального переноса.

Разработан системный подход направленного отбора и оптимизации свойств бактерий, позволяющий управлять технологическими процессами производства мясных продуктов, и схемы конструирования штаммов с заданными свойствами: Схема получения суперэкспрессии гена Y и Схема получения делеции участка ДНК, кодирующего ген Y.

Изучена генетическая природа бактериальной денитрификации. Проведено сравнение нитритредуктазной активности штаммов S. carnosus и S. xylosus коллекций МГУПБ и ВКПМ. Сконструирован термочувствительный челночный вектор pBTmcs для репликации в грамположительных бактериях. Получен мутантный штамм S. carnosus (thyAЦ) на основе штамма S. carnosus B-8953. Клонирован и использован селективный маркер - ген, кодирующий фермент тимидилат синтетазу. Сконструирована экспрессионная плазмида для грамположительных бактерий, включающая сильный промотор гена, кодирующего фермент глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу. С помощью генетических преобразований путем замены промоторной области гена nirR на сильный промотор гена gap на основе штамма  S. carnosus (thyAЦ) получен штамм-суперпродуцент фермента нитритредуктазы S. carnosus LIA-96 (ВКПМ В-9518). Определена значимость наличия всех белковых продуктов нитритредуктазного оперона штамма S. carnosus для активного восстановления нитрита.

Выявлены причины образования биогенных аминов (БА) в мясных продуктах и их влияние на организм человека. Проведен скрининг штаммов с низкой декарбоксилазной активностью или с полным ее отсутствием. Определены генетические детерминанты - tdc гены декарбоксилаз аминокислот у ряда штаммов L. sakei, образующих биогенные амины выше допустимого уровня. Предложен подход к созданию методами генной инженерии штаммов с выключенной декарбоксилазной активностью делецией участка хромосомы с геном tdc. Выбраны штаммы с аминоксидазной активностью, снижающие содержание биогенных аминов в мясных продуктах.

Систематизирована информация о классификации бактериоцинов, механизмах их действия, влиянии условий культивирования штаммов-продуцентов на синтез бактериоцинов стартовыми культурами и методов их определения. Проведен поиск продуцентов бактериоцинов с применением экспресс-метода с нейтрализацией молочной кислоты. Изучена генетика продуцирования бактериоцинов, и определена локализация генетических детерминантов синтеза бактериоцинов у педиококков. Предложены пути к повышению синтеза бактериоцинов стартовыми культурами.

Объяснен механизм ароматообразования в мясных продуктах за счет использования стартовых культур, и определены критерии отбора ароматобразующих микроорганизмов. Проведен скрининг ароматобразующих штаммов с глутаматдегидрогеназной активностью, и изучено их влияние на образование ароматических соединений. Определены генетические детерминанты - гены gdh, кодирующие фермент глутаматдегидрогеназу. Предложен подход к созданию методами генной инженерии штаммов с суперэкспрессией гена gdh.

У стартовых культур определены супероксиддисмутазная (СОД), каталазная, пероксидазная активности и способность связывать ионы металлов переменной валентности Fe2+ и Cu2+, способствующие инактивации производных форм кислорода. Определены генетические детерминанты фермента супероксиддисмутазы - sodA гены у микроорганизмов различных таксонов. Предложен подход к созданию методами генной инженерии штаммов с суперэкспрессией гена sodA.

Предложены научные и практические основы создания бактериальных препаратов, содержащих стартовые культуры различных таксонов, обладающие взаимной совместимостью.

Практическая значимость и реализация результатов. Создана коллекция стартовых культур для мясной промышленности, содержащая микроорганизмы следующих видов: Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus claussenii, Macrococcus caseolyticus, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus, Debaryomyces vanriji, Debaryomyces polymorphus, Debaryomyces hansenii, Candida famata, Penicillium camembertii.

Предложены пути предотвращения распространения детерминантов антибиотикоустойчивости промышленными микроорганизмами.

Предложен подход к изучению и отбору непатогенных стартовых культур энтерококков.

Разработаны экспресс-методы отбора штаммов с аминоксидазной активностью, ароматобразующих штаммов с глутаматдегидрогеназной и трансаминазной активностью с помощью ТСХ.

Создана программа с базой данных основных функциональных свойств микроорганизмов, входящих в коллекцию МГУПБ, позволяющая проектировать состав бактериальных препаратов комплексной направленности для мясных продуктов.

Проведена паспортизация промышленно-ценных штаммов с помощью ДНК-фингерпринта (геномной дактилоскопии) методом ПЦР с использованием штаммоспецифических праймеров. Проведено депонирование штаммов стартовых культур в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, ряд штаммов поставлен на национальное патентное депонирование.

На основе природных штаммов разработаны бактериальные препараты: Лактомикс, предназначенный для биотрансформации мясного сырья и производства ферментированных мясопродуктов; Аромалакт - для цвето- и ароматообразования ферментированных мясопродуктов и биотрансформированного мясного сырья; Биосейф - для снижения уровня биогенных аминов в ферментированных мясопродуктах и биотрансформированном мясном сырье, ТУ 9229-045-02068640-07; Дебарс плюс - для производства ферментированных мясных изделий, ТУ 9229-046-02068640-07.

На основе штамма S. carnosus LIA-96 разработан бактериальный препарат Биоцвет, предназначенный для производства термически обработанных предварительно ферментированных мясных изделий, ТУ 9229-047-02068640-07 (на стадии согласования с органами Роспотребнадзора по договору № С-77НЛ/06 от 18.12.2006 г.).

Молекулярно-генетическая экспертиза, проведенная ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, установила, что штамм S. carnosus LIA-96 не является генетически модифицированным, так как был получен путем перестройки собственного генетического материала без включения в его состав чужеродной ДНК. Показана фенотипическая и генотипическая стабильность данного штамма. Проведено молекулярно-генетическое исследование, подтверждающее отсутствие в геноме штамма S. carnosus LIA-96 генов, кодирующих белки-токсины.

Проведены клинические исследования штамма S. carnosus LIA-96 in vivo на белых линейных мышах, в результате которых штамм признан безопасным по показателям безвредности, токсичности, токсигенности и вирулентности.

Разработаны рецептуры и технологии новых видов комбинированных и традиционных мясопродуктов: Мясные продукты в форме первого сорта с добавлением биотрансформированного легкого, ТУ 9213-002-51611136-03, Паштеты в оболочке с добавлением биотрансформированной селезенки, ТУ 9213-002-00423769-03, Полуфабрикаты мясные рубленые с бактериальным препаратом Лактомикс, ТУ  9214-350-23476484-08, Колбасы сырокопченые, ТУ 9213-007-224-68-005-08, Колбасы сыровяленые, ТУ 9213-008-224-68-005-08, Продукты из свинины деликатесные, ТУ  9213-007-02068315-08. Промышленная апробация разработанных технологий проводилась в условиях Черкизовского МПЗ, ЗАО Микояновский мясокомбинат, ОАО Царицыно, ООО МПЗ Рублевский, ОАО ИКМА, ООО АНСЕЙ ВМК, Ростовского и Новочеркасского мясокомбинатов, ЗАО Агрофирма Мясо, ООО Гиперглобус.

Результаты работы нашли применение в учебном процессе МГУПБ на кафедре Технология мяса и мясопродуктов, при проведении специализации инженеров-технологов мясной промышленности, при выполнении дипломных и диссертационных работ. Новизна решений защищена патентами, справками о депонировании стартовых культур в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика. Практическая значимость работы подтверждена соответствующими документами.

Апробация работы. В диссертации обобщены результаты исследований, проведенных лично автором, при его непосредственном участии и под его руководством.

       Основные результаты работы были предметом докладов и обсуждений на Международных и Российских научных конференциях, семинарах: Проблемы экологической безопасности Северо-Кавказского региона, Ставрополь, 2000; Пищевой белок и экология, Москва, 2000; Экологические, технологические и экономические аспекты производства продуктов питания, Семипалатинск, 2000; Пища, экология, человек, Москва, 2001; Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования, Москва, 2002; Технологические аспекты комплексной переработки сельскохозяйственного сырья при производстве экологически безопасных пищевых продуктов общего и специального назначения, Углич, 2002; Биотехнология: состояние и перспективы развития, Москва, 2002, 2003, 2005, 2007, 2008; Живые системы и биологическая безопасность населения, Москва, 2002; Современные технологии переработки животноводческого сырья в обеспечении здорового питания: наука, образование и производство, Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы, Москва, 2004; Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем, Калининград, 2005; Живые системы и биологическая безопасность населения, Москва, 2005; Выездной пленум НОГР клинико-патогенические аспекты желудочно-кишечного дисбиоза при заболеваниях органов пищеварения: диагностика, лечение и профилактика, 2005; Биология наука XXI века: 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного центра РАН, Пущино, 2006; Успехи медицинской микологии, 2006; Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней, Москва, 2006; Живые биосистемы 2007, Москва, 2007.

       Результаты работы удостоены дипломами, грамотами и медалями конференций Биотехнология: состояние и перспективы развития, Биотехнология. Вода и пищевые продукты, Биотехнология и медицина, Технологии живых систем, Живые системы и биологическая безопасность населения, биотехнологической выставки-ярмарки РосБиоТех-2007. Исследования выполнялись в рамках научных тематик МГУПБ, их результаты регулярно рассматривались на научно-техническом и ученом советах. По материалам диссертации опубликовано: 101 работа (в т.ч. статей в журналах, рекомендованных ВАК - 17, в других изданиях - 37); монография, патенты, два лабораторных практикума и методические указания для студентов специальностей 270900, 250301, 240901, 240902 и магистров направления 260100.

       Структура и объем работы. Диссертационная работа включает введение, 9 глав, выводы и приложения, изложена на 363 страницах основного текста, содержит 76 таблиц и 133 рисунка. Список литературы состоит из 288 источников.

       На защиту выносятся следующие основные положения:

       - научные принципы совершенствования свойств стартовых культур, основанные на внутренней перестройке генома клеток и создании условий, побуждающих включение генов в жизнедеятельность клетки;

       - системный подход к направленному отбору и идентификации стартовых культур;

       - обоснование необходимости определения устойчивости к антибиотикам промышленных микроорганизмов и выбора штаммов, свободных от мобильных генетических факторов устойчивости;

       - результаты исследований ферментативных активностей микроорганизмов, влияющих на цвето-, ароматообразование, снижение уровня биогенных аминов, замедление окислительной порчи липидов мясного сырья, подавление жизнедеятельности санитарно-показательной микрофлоры за счет синтеза бактериоцинов, и их взаимосвязь с генетическими детерминантами;

       - способ конструирования штамма суперпродуцента фермента нитритредуктазы путем перестройки собственного генетического материала, позволяющего значительно снижать или полностью исключать наличие остаточного нитрита натрия в мясных продуктах;

       - обоснование принципов подбора промышленно-ценных штаммов, обладающих взаимной совместимостью, при использовании компьютерной программы с базой данных функциональных свойств стартовых культур в методологии создания функциональных бактериальных препаратов;

       - биотехнология ферментированных мясных продуктов, в том числе с использованием нетрадиционного сельскохозяйственного сырья;

       - оценка эффективности влияния разработанных бактериальных препаратов на качественные показатели и безопасность мясного сырья и готовых мясных продуктов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

       Во введении кратко изложено состояние проблемы на данный период времени, обоснована актуальность выбранного направления, поставлена цель, определены задачи исследований и сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну, показана практическая значимость и степень апробации работы.

       В первой главе Литературный обзор приводится обзор информации относительно роли микроорганизмов в современной биотехнологии мясных продуктов.

В главе 2 Методика постановки эксперимента и частные методы исследований даны краткие характеристики объектов исследований, представлена схема эксперимента (рис. 1), обоснован комплекс исследуемых показателей и изложены методики их определения.

Объектами исследований служили спонтанно ферментированные мясные продукты, молочнокислые бактерии видов Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus claussenii, денитрифицирующие кокки Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus, Macrococcus caseolyticus, энтерококки Enterococcus faecalis, дрожжи Debaryomyces vanriji, Debaryomyces polymorphus, Debaryomyces hansenii, Candida famata, мицелиальные грибы Penicillium camembertii из коллекции стартовых культур МГУПБ. Штамм-суперпродуцент фермента нитритредуктазы Staphylococcus carnosus LIA-96 (В-9518).

Штамм Micrococcus sp. В-3087, обладающий гистидиндекарбоксилазной активностью, типовые штаммы P. pentosaceus В-7511, P acidilactici В-7509, L. plantarum  В-6758 и D. hansenii Y-1682, тест-культуры патогенных и условно-патогенных штаммов Salmonella typhymurium LT2 (B-3533), Proteus vulgaris ATCC 13315 (B-1667), E. coli K-12  C 600 (B-1010), Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P (В-6646), S. epidermidis B-8933, S. epidermidis В-8940, E. faecalis В-4610, Staphylococcus aureus subsp. aureus 6538Р, Staphylococcus epidermidis 14990, Staphylococcus saprophiticus 15305, Escherichia coli 157, Salmonella typhimurium 5715, Shigella sonnae 5063, Proteus vulgaris 14, Proteus mirabilis 47 были предоставлены ВКПМ ГосНИИгенетики и ГКПМ ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Стартовые культуры, входящие в состав бактериальных препаратов фирм WIBERG/Австрия, Gewrzmller/Германия, Chr.Hansen/Дания, Texel/Франция. Бактериальные препараты Лактомикс, Аромалакт, Биосейф, Биоцвет, Дебарс плюс, модельные мясные системы и вновь разработанные мясные продукты.

В процессе лабораторных исследований и опытно-промышленных выработок были использованы классические микробиологические, физиолого-биохимические, молекулярно-генетические, физико-химические, органолептические методы, их модификация, а также вновь разработанные методы. Генетические методы, используемые в работе (выделение плазмиды из грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, выделение хромосомной ДНК, электропорация, блоттинг по Саузерну, гибридизация по Саузерну, лигирование ДНК, рестрикция ДНК, ПЦР и др.), являются модификацией известных методов (Маниатис Т., 1984).

Определение устойчивости к антибиотикам проводилось диско-диффузионным методом, антагонистической активности - методом перпендикулярных штрихов. Определение глутаматдегидрогеназной, трансаминазной, аминоксидазной активностей и микотоксинов - методом ТСХ. Определение декарбоксилаз аминокислот - с использованием основы бульона Мюллера и методом ВЭЖХ. Определение белка в клеточных экстрактах микроорганизмов - методом Брэдфорд. НАД и НАДФ-зависимые глутаматдегидрогеназные (ГДГ) активности были измерены в свежих клеточных экстрактах, используя тест, основанный на колориметрическом определении L-глутаминовой кислоты в пищевых продуктах (Boehringer Mannheim, Германия). Способность связывать ионы металлов переменной валентности Cu2+ и Fe2+, каталазная, пероксидазная, супероксиддисмутазная активности определялись спектрофотометрически. Определение денитрифицирующей активности - методом Грисса. Определение бактериоцинов осуществлялось экспресс-методом с нейтрализацией молочной кислоты. Бактериологическое исследование проводили согласно ГОСТ 9958.

Определение органических кислот проводилось методом ВЭЖХ на хроматографе Alliance (Separations Module Waters 2695, Photodiode Array detector Waters 2996); колонка ReproSil-Pur C18-AQ, 5 мкм, 2504,0 мм, температура колонки 30 С, инжекция 5 мкл.

Для проведения газохроматографических исследований использовали капиллярный газовый хроматограф фирмы Hewlett Packard (США) HP 5730 с пламенно-ионизационным детектором и кварцевой капиллярной колонкой SPB-1 (50 м 0,32 мм, слой фазы 0,25 мкм).        Аминокислотный анализ проводили с использованием хроматографии на сульфо-полистирольном ионообменнике с элюцией ступенчатым градиентом Na-цитратных буферных растворов на аминокислотном анализаторе Hitachi 835 (Япония).

Клинические испытания in vivo проводились в соответствии с санитарными правилами СП 3.3.2.561-96 Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунологических препаратов в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Молекулярно-генетическая экспертиза проводилась в соответствии с МУ 2.3.2.1830-04 Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили по стандартным программам и общепринятым алгоритмам с использованием регрессионного анализа и оптимизации.

Рис. 1. Схема проведения эксперимента

Глава 3. Направленный отбор и идентификация стартовых культур

Молочнокислые бактерии и денитрифицирующие стафилококки

       В работе было проведено выделение микроорганизмов из высококачественных спонтанно ферментированных мясных изделий, были изучены культуральные, физиолого-биохимические, технологические, пробиотические свойства. Для того чтобы отобрать отечественные конкурентоспособные штаммы, параллельно проводилась работа по изучению технологически-ценных свойств стартовых культур импортных бактериальных препаратов.        

       Идентификацию на уровне штамма (генетическое типирование) проводили методом ПЦР с анализом полиморфизма случайно амплифицированных последовательностей ДНК. Таксономический статус микроорганизма устанавливали на основании фенотипических свойств в сочетании с генетической идентификацией, используя такие методы, как ДНК-ДНК гибридизация, сиквенс 16S рРНК, RAPD-ПЦР и др. При проведении анализа нуклеотидных последовательностей вариабельный участков 16S рРНК продукты амплификации участка 16S рРНК после проведения электрофореза в агарозном геле визуализировали в УФ-свете на приборе УФ-трансиллюминатора УВТ-1 при помощи программы BioTest. Нуклеотидная последовательность амплифицированных участков 16S рРНК была получена в результате секвенирования на автоматическом секвенаторе CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, США). Для подтверждения идентичности штамма тем микроорганизмам, таксономический статус которых уже установлен, были использованы молекулярно-биологические базы данных В результате были отобраны и идентифицированы бактерии, отнесенные к 11 видам, депонированные в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика.

Дрожжи и мицелиальные грибы

Идентификация дрожжей проводилась по совокупности микро- и макроморфологических свойств. В результате было отобрано шесть штаммов дрожжей. По совокупности определенных признаков при использовании определителя дрожжей (Nakase T., 1998) полученные штаммы были идентифицированы как Debaryomyces vanriji Dji, D. hansenii Dhi, D. polymorphus Dps, Candida famata КФ-1, КФ-2, КФ-3. Штаммы находятся на национальном патентном депонировании в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика под номерами Y-3140, Y-3139, Y-3138, Y-3129, Y-3130, Y-3128 соответственно, что подтверждается справками о депонировании.

Идентификацию грибов проводили путем культивирования на различных питательных средах (агар Чапека с дрожжевым экстрактом, сусло-агар, нитратный агар с глицерином) и определения их культуральных и морфологических признаков.

Для того чтобы исключить риск использования в пищевой промышленности микроорганизмов, способных синтезировать микотоксины, у выделенных штаммов мицелиальных грибов вида P. camembertii были исследованы вторичные метаболиты, и проведен среди них поиск микотоксинов: ЦПК и ругуловазинов А и В. Полученные в результате ТСХ данные показали, что ни один из штаммов P. camembertii ПК-1, ПК-2,  ПК-3, ПК-4, ПК-5, ПК-7 не продуцирует характерные для данного вида мицелиальных грибов микотоксины, а именно ЦПК и ругуловазины А и В, о чем свидетельствует приведенная хроматографическая пластина (рис. 2). По итогам проведенной работы были отобраны шесть штаммов мицелиальных грибов, относящихся к виду Penicillium camembertii ПК-1, ПК-2, ПК-3, ПК-4, ПК-5, ПК-7, которые находятся в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика под номерами F-905, F-885, F-906, F-907, F-908, F-884 соответственно, что подтверждается справками о национальном патентном депонировании.

Рис. 2. Определение ругуловазинов А и В, и ЦПК в условиях глубинного культивирования на среде Абе

Обозначения: 1 - ПК-1 (6 сут), 2 - ПК-1 (12 сут); 3 - ПК-2 (6 сут), 4 - ПК-2 (12 сут); 5 - ПК-3 (6 сут),  6 - ПК-3 (12 сут); 7 - С-47 (контроль ругуловазинов А и В); 8 - F-3088 (контроль ЦПК); 9 - ПК-4 (6 сут), 10 - ПК-4 (12 сут); 11 - ПК-5 (6 сут), 12 - ПК-5 (12 сут); 13 - ПК-7 (6 сут), 14 - ПК-7 (12 сут)

Неправильная идентификация микроорганизмов не только не позволит получить продукт с заданными свойствами и характеристиками, но и может нести угрозу безопасности ферментированных продуктов, поэтому для идентификации должен быть использован комплекс всех доступных фенотипических и генотипических методов.

Глава 4. Определение безопасности стартовых культур

Антибиотикоустойчивость промышленных культур и пути предотвращения распространения ее детерминантов

В последнее время, в связи с глобальным распространением явления антибиотикоустойчивости у микробов, влекущего за собой рост неблагоприятных последствий для человека (снижение эффективности лечения различных широко распространенных заболеваний, повышение тяжести инфекций, вызванных антибиотикорезистентными возбудителями, усиление агрессивных свойств возбудителей и т.д.), в мире стало уделяться повышенное внимание такому важному критерию отбора микроорганизмов для промышленных целей как отсутствие антибиотикоустойчивости, связанной с эффективно распространяющимися путем горизонтального переноса генетическими факторами. Такие генетические факторы могут, в частности, передаваться с высокой частотой от лактобактерий к патогенным микроорганизмам и наоборот.

Возможность горизонтального переноса генов устойчивости к антибиотикам повышается при локализации этих генов в составе плазмид и транспозонов. Следует учитывать, что плазмиды широко распространенны среди всех видов молочнокислых бактерий, и ряд плазмид кодирует важные технологические свойства. Наличие плазмид у стартовых культур и пробиотиков может не представлять опасности, если штаммы не содержат трансмиссивных генов устойчивости к антибиотикам.

Устойчивость к антибиотикам штаммов промышленных микроорганизмов сама по себе не является вредным фактором. В некоторых случаях природная устойчивость может быть полезной для стабилизации микрофлоры кишечника при проведении антибиотикотерапии. В то же время, при рекомендации к использованию в пищевой промышленности штаммов молочнокислых микроорганизмов необходимо учитывать опасность переноса генов антибиотикоустойчивости от молочнокислых бактерий к патогенным микроорганизмам.

Проведение анализа проблемы распространения антибиотикоустойчивости позволило определить пути предотвращения распространения детерминантов антибиотикоустойчивости молочнокислыми бактериями. Для этого необходимо:

• обязательно оценивать культуры стандартизованными методами на устойчивость к антибиотикам;
• развивать критерии и методологию контроля промышленных микроорганизмов в сырье и пищевых продуктах при их допуске в производство и находящихся в обороте;
• создать информативную базу минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотиков и пограничных значений МПК природной устойчивости;
• создать базу данных генетических элементов, определяющих антибиотикоустойчивость бактериальной клетки, способных с высокой частотой распространяться горизонтальным путем;
• проводить поиск новых промышленных штаммов, не содержащих генов приобретенной устойчивости к антибиотикам.

Выполнение данных положений имеет большое значение для отбора безопасных стартовых культур и пробиотиков, не несущих трансмиссивных генов антибиотикоустойчивости. У выделенных и идентифицированных микроорганизмов была определена устойчивость к антибиотикам различных групп, включая ингибиторы синтеза клеточной стенки, белка, нуклеиновых кислот и ингибиторы функции цитоплазматических мембран.

       Таблица 1

Определение устойчивости к антибиотикам лактобактерий

АНТИБИОТИКИ	L. sakei 105	L. curvatus 1	L. curvatus 102	L. sakei 104	L. casei 10	L. curvatus 2	L. sakei  35	L. sakei  45
Ингибиторы синтеза клеточной стенки
ПЕНИЦИЛЛИНЫ
Метициллин М 5 мкг	29 S	21 S	21 S	24 S	21 S	36 S	21 S	19 S
Пенициллин  G Р  10 ед	38 S	36 S	40 S	35 S	33 S	40 S	35 S	30 S
ЦЕФАЛОСПОРИНЫ
Цефалоридин Cr 30 мкг	32 S	15 I	19 S	18 S	10 R	29 S	6 R	6 R
Ингибиторы синтеза белка
АМИНОГЛИКОЗИДЫ
Канамицин К  30 мкг	11 R	17 I	18 S	14 I	6 R	24 S	6 R	6 R
Тобрамицин Tb  10 мкг	17 S	18 S	17 S	15 S	6 R	22 S	6 R	6 R
ИНКОЗАМИДЫ
инкомицин L  2 мкг	35 S	38 S	39 S	28 S	20 I	38 S	23 S	32 S
МАКРОЛИДЫ
Олеандомицин Ol 15 мкг	23 S	22 S	24 S	20 S	17 I	28 S	18 S	16 S
Ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот
ХИНОЛОНЫ
Норфлоксацин Nx  10 мкг	18 I	22 S	25 S	16 I	10 R	34 S	6 R	6 R

Обозначения: R - устойчивый, I - умеренно устойчивый, S - чувствительный.

Цифры обозначают диаметры задержки роста штаммов вокруг дисков с антибиотиками, мм.

Как видно из табл. 1, все штаммы оказались чувствительными к пенициллину G, метициллину. Вариабельность была зафиксирована в отношении цефалоридина, норфлоксацина и аминогликозидов. Устойчивость к этим антибиотикам является природной. Умеренная устойчивость в отношении линкомицина (группа линкозамиды) и олеандомицина (группа макролиды) была характерна только для L. casei 10. В данном случае прослеживается перекрестная умеренная устойчивость к линкозамиду и макролиду.

По результатам работы были выбраны микроорганизмы, не способные к распространению генов антибиотикоустойчивости. Это позволит предотвратить опасность переноса генов антибиотикоустойчивости от молочнокислых бактерий к патогенным микроорганизмам.

Определение факторов вирулентности у штаммов вида Enterococcus  faecalis

Штаммы молочнокислых энтерококков в последнее время все чаще предлагается использовать в качестве пробиотиков для улучшения микробного баланса тонкого кишечника. Неоднозначное отношение к энтерококкам связано с тем, что, будучи частью нормальной микрофлоры, они являются и одним из важнейших возбудителей госпитальных инфекций, и отсутствие факторов патогенности - главный и обязательный критерий при оценке возможности использования бактерий рода Enterococcus в пищевой промышленности, а также в качестве пробиотиков. Во многих случаях патогенность не является видовым признаком микроорганизма.

Разработанные на сегодняшний день тесты, в том числе генетические, позволяют выявить степень безопасности энтерококковых штаммов. Исследования проводились со штаммами E. faecalis 31, E. faecalis 55, E. faecalis 59. Для сравнения были взяты штаммы Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P, S. epidermidis В-8940, типовой штамм E. faecalis В-4610, у которого ранее были обнаружены гены патогенности: agg (прикрепление бактерий к поверхности эукариотической клетки), gelE (синтез токсина, обеспечивающего гемолиз эритроцитов) и cylМВA (синтез цитолизина, где cylM - посттрансляционная модификация цитолизина; cylB - транспорт цитолизина; cylA - активация цитолизина). Проведение исследований на тестовых питательных средах (тесты на протеолитическое разжижение желатина, ДНКазу и гемолизин) показали отсутствие факторов вирулентности, поэтому следующим этапом было проведение ПЦР-генотипирования штаммов.

  а)  б)

Рис. 3. Электрофорез фрагментов генов: а Ц agg, б Ц gelE

Обозначения: М1 - маркер GeneRulerтм 100 bp DNA Ladder, Fermentas; М2 - маркер DNA Ladder, Mix,  Fermentas; 1 - E. faecalis 31; 2 - E. faecalis 59; 3 - E. faecalis 55; 4 - E. faecalis B-4610

Результаты показали присутствие генов вирулентности agg и gelE в геномах исследуемых штаммов E. faecalis (рис. 3), что не позволяет их использовать в качестве стартовых культур и пробиотиков. Применение данного подхода к изучению и отбору энтерококков позволит создавать качественные и безопасные отечественные бактериальные препараты.

Обеспечение безопасности ферментированных мясопродуктов амино-негативными стартовыми культурами

Выбор стартовых культур является основой для гарантии качества готового продукта в отношении содержания биогенных аминов. Поэтому, неспособность к образованию БА в течение всего технологического цикла и в процессе хранения должна быть одним из основных критериев для выбора стартовых культур при производстве ферментированных мясопродуктов. Уровень декарбоксилазной активности in vitro у микроорганизмов, вызывающих существенное повышение концентрации БА (свыше 100 мг/кг продукта), составляет 350 мг/л скрининговой среды. Микроорганизмы, образующие в скрининговой среде БА в количестве, меньшем, чем 350 мг/л, считаются амино-негативными (Bover-Cid S., 1999).

Так как основной задачей было определить штаммы с уровнем активности ниже критического, на первом этапе отбирались штаммы, не имеющие вообще декарбоксилазной активности (на тестовой среде), а на втором этапе были определены уровни активности образования БА среди остальных микроорганизмов методом ВЭЖХ.

Были получены следующие результаты: из 48 исследованных штаммов только 3 имеют декарбоксилазную активность по отношению к гистидину, 18 - к тирозину, 29 - к лизину и 36 - к тирозину. Штаммы P. claussenii 9, L. casei 10, L. sakei 19, P. pentosaceus 25, L. sakei 45 не обладают декарбоксилазной активностью в отношении выбранных аминокислот, а штамм P. pentosaceus 106 имеет декарбоксилазную активность по отношению ко всем аминокислотам. На рис. 4 представлены хроматограммы образцов гистамин-негативного штамма P. pentosaceus 106 и тирамин-позитивного микроорганизма L. sakei 105.

 

        а)  б)

Рис. 4. Хроматограммы а) гистамин-негативного штамма Pediococcus pentosaceus 106 и б) тирамин-позитивного штамма Lactobacillus sakei 105

По оси Х указано время анализа, мин; по осу Y - сигнал детектора, AU.

Результаты исследования показали, что уровень образования гистамина был низким для P. pentosaceus 106 - 4,32 мг/л, L. curvatus CDN - 6,61 мг/л, S. xylosus 45 - 5,65 мг/мл. Путресцин продуцировали 77% штаммов, но в незначительном количестве (в пределах 0,117Ц10,65 мг/л). S. xylosus P-1, стартовая культура, входящая в состав коммерческого импортного бактериального препарата, в культуральном бульоне накапливала путресцин в количестве 63,35 мг/л. Независимо от их видовой принадлежности, продуцировали кадаверин (от 0,192 до 11,13 мг/л) 40% штаммов. Три штамма L. sakei 101, 103, 105 были определены как амино-позитивные, так как продуцировали тирамин выше обозначенного уровня 350 мг/л (468,19, 477,75 и 581,18 мг/л, соответственно). В данном случае можно говорить, что высокая активность тирозиндекарбоксилазы характерна для вида L. sakei. Количество тирамина, образуемого остальными штаммами, не превышало 2 мг/л. В результате были отобраны отечественные штаммы, низкая декарбоксилазная активность которых (или полное ее отсутствие) позволит использовать их в мясной промышленности в качестве стартовых культур.

По результатам исследований была создана Коллекция стартовых культур МГУПБ, в которую вошли технологичные штаммы с отсутствием патогенности и токсигенности, а также трансмиссивной антибиотикоустойчивости. Штаммы депонированы в ВКПМ ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов и хранятся в лиофилизированном виде, что подтверждается справками о депонировании, в том числе национальном патентном депонировании. На каждый штамм оформлен паспорт, в котором отражена информация об его точной таксономической идентификации, источнике выделения, характере устойчивости к антибиотикам с оценкой ее потенциальной опасности в плане переноса, перечислены основные фенотипические, генотипические и промышленно-ценные свойства.

ГЛАВА 5. Изучение промышленно-ценных свойств стартовых культур

Определение аминоксидазной активности у стартовых культур

Потенциальная роль микроорганизмов, имеющих аминоксидазную активность, используемых в ферментации продуктов питания, заключается в прекращении образования или снижении аккумулирования БА в продуктах питания. Аминоксидазы участвуют также в обезвреживании аминов, образующихся в кишечнике под влиянием гнилостных бактерий. Поэтому аминоксидазная активность должна рассматриваться как важная характеристика при селекции стартовых культур, а также пробиотиков.

Аминоксидазная активность у исследуемых микроорганизмов определялась по способности снижать содержание БА (гистамина, тирамина, кадаверина, путресцина). На первом этапе методом ТСХ были выбраны штаммы, при инкубировании с которыми количество биогенных аминов в пробах снижалось. Уровни активности ферментов аминоксидаз были определены с помощью ВЭЖХ.

Амины обнаруживались на хроматографической пластинке в виде фиолетовых пятен (например, рис. 5). По разности размеров и интенсивности окраски пятен, соответствующих контрольному образцу и анализируемой пробе, определяли, имело ли место снижение концентрации амина, т.е. проявление аминоксидазной активности.

Рис. 5. Картина тонкослойной хроматографии путресцина

0 - начальная концентрация амина, 1 - P. acidilactici 33, 2 - P. acidilactici 34, 3 - P. pentosaceus 23, 4 - P. acidilactici 27, 5 - P. pentosaceus 106, 6 - P. acidilactici 3, 7 - P. pentosaceus 28, 8 - P. pentosaceus 39, 9 - S. carnosus 108, 10 - P. acidilactici 25, 11 - L. sakei 104, 12 - P. pentosaceus 31, 13 - P. acidilactici 38

По результатам ТСХ для дальнейшего количественного анализа были выбраны следующие штаммы, показавшие наибольшую аминоксидазную активность: L. plantarum 22/2, 32, L. curvatus 102, 2, L. sakei 104, 35; L. casei 10; P. acidilactici 3, 25, 27, 33, 38;  S. carnosus 108. Количественное определение снижения уровня биогенных аминов было проведено методом ВЭЖХ (табл. 2).

Таблица 2

Количественная оценка способности микроорганизмов разрушать биогенные амины

Название микроорганизма	Биогенные амины
	Гистамин	Тирамин	Кадаверин	Путресцин
	Начальное количество БА в образце, мг/л
	737,1131,29	265,6312,16	128,935,33	89,303,45
	Количество БА в образце через 96 ч инкубации, мг/л
Lactobacillus curvatus 2	Ц	3,130,15	0,3320,015	0,8300,04
Lactobacillus curvatus 102	0,7190,035	Ц	Ц	1,660,31
Lactobacillus sakei 35	Ц	Ц	0,1280,001	Ц
Lactobacillus sakei 104	Ц	62,393,23	Ц	Ц
Lactobacillus casei 10	386,2815,34	207,279,35	Ц	0,4800,022
Lactobacillus plantarum 32	60,5580,98	52,4123,31	0,9580,036	Ц
Lactobacillus plantarum  22/2	Ц	Ц	0,1860,008	0,6740,033
Pediococcus acidilactici 3	163,817,18	Ц	0,0930,004	Ц
Pediococcus acidilactici 25	131,766,23	259,949,92	Ц	0,2930,015
Pediococcus acidilactici 27	129,165,44	Ц	0,1210,006	Ц
Pediococcus acidilactici 38	151,817,17	Ц	Ц	Ц
Pediococcus acidilactici 33	184,408,36	270,6213,45	0,3140,013	Ц
Staphylococcus carnosus 108	561,0323,07	Ц	Ц	0,6860,031

Установлено, что активность фермента аминоксидазы зависит скорее от штамма, а не от вида микроорганизма, т.е. является штаммоспецифичным признаком. Проведенный скрининг позволил охарактеризовать микроорганизмы по уровню их аминоксидазной активности и рекомендовать ряд штаммов для использования в мясной промышленности в качестве стартовых культур, повышающих безопасность и качество продуктов.

Стартовые культуры Ц продуценты бактериоцинов

Один из важнейших эффектов стартовых культур - это продление срока годности мясных продуктов. Считается, что молочнокислые микроорганизмы подавляют жизнедеятельность посторонней микрофлоры за счет выделения органических кислот и, следовательно, снижения рН. Это неоспоримый факт, и снижение рН является частью комплексного действия молочнокислых микроорганизмов, что позволяет использовать их в качестве биоконсервантов. Однако проведенные научные исследования доказывают, что ингибирование роста условно-патогенной микрофлоры происходит в ряде случаев именно за счет антибактериальных белковых веществ - бактериоцинов. Это особенно важно при использовании бактериоцинов в чистом виде после предварительного выделения и очистки для тех мясных продуктов, при производстве которых понижение рН нежелательно.

Так как бактериоцины играют большую роль в природных бактериальных сообществах, синтез этих веществ имеет значение для конкуренции внутри популяции и между ними. У бактериоциногенных популяций защитная активность проявляется в ингибировании развития других бактерий, обладающих сходными пищевыми потребностями, поэтому это свойство очень ценно для использования в мясных системах при подавлении жизнедеятельности нежелательной микрофлоры. Полученные результаты показали, что среди проверенных штаммов есть микроорганизмы, как с разным уровнем синтеза бактериоцинов, так и с разным спектром ингибирования санитарно-показательной микрофлоры, и подтверждают данные других авторов, что способность синтезировать бактериоцины не является видовой характеристикой микроорганизмов и относится к штаммоспецифическому признаку (табл. 3).

Таблица 3

Способность молочнокислых микроорганизмов продуцировать бактериоцины

Название микроорганизма	Номер ВКПМ	Киллерная активность микроорганизмов, %
		Salmonella typhymurium LT2	Proteus vulgaris ATCC 13315	Escherichia coli K-12 C 600	Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P
Lactobacillus curvatus 1	В-8889	1	0	0	0
Lactobacillus curvatus 2	В-8906	0	0	27	34
Lactobacillus curvatus 102	В-8900	21	30	34	44
Lactobacillus curvatus 301-1	В-8954	0	0	0	0
Lactobacillus curvatus CDN	В-8948	25	0	0	0
Lactobacillus sakei 35	В-8886	21	7	0	9
Lactobacillus sakei 45	В-8896	0	0	0	27
Lactobacillus sakei 101	B-8939	0	47	39	30
Lactobacillus sakei 103	В-8932	33	35	35	50,1
Lactobacillus sakei 104	В-8936	26	10	30	64,8
Lactobacillus sakei 105	В-8905	62	17	56	13
Lactobacillus sakei 306-1	В-8949	0	0	0	0
Lactobacillus sakei 111-1	В-8952	0	28	0	72
Lactobacillus casei 10	В-8890	0	0	0	15
Lactobacillus plantarum 19	В-8907	0	8	27	35
Lactobacillus plantarum 21	B-8654	0,2	0	20	53
Lactobacillus plantarum 100	В-8899	40	20	34	31
Lactobacillus plantarum 7К	В-2663	0	57	28	30
Lactobacillus plantarum  22/2	В-1615	34	0	0	19
Lactobacillus plantarum 2П	В-1616	0	27	0	57
Lactobacillus plantarum 31	В-1617	48	13	21	17
Lactobacillus plantarum 32	В-1618	0	0	37	49
Pediococcus acidilactici 3	В-8891	62	0	33	29
Pediococcus acidilactici 8	В-8897	72	0	38	51
Pediococcus acidilactici 15	В-8895	24	0	0	0
Pediococcus acidilactici 25	В-8892	0	0	27	44
Pediococcus acidilactici 27	В-8893	61	0	34	67
Pediococcus acidilactici 33	В-8903	24	5	0	0
Pediococcus acidilactici 34	В-8887	0	0	0	0
Pediococcus acidilactici 38	В-8902	58	27	50	22
Pediococcus pentosaceus 23	В-8894	96	2	32	54
Pediococcus pentosaceus 28	В-8888	58	65	39	65
Pediococcus pentosaceus 31	В-8901	8	0	0	3
Pediococcus pentosaceus 39	В-8898	0	52	34	30
Pediococcus pentosaceus 55	В-8955	78	75	72	65
Pediococcus pentosaceus 106	В-8935	51	34	35	30
Pediococcus claussenii 9	В-8908	2	0	0	0
Staphylococcus xylosus 45	В-8945	0	0	0	2
Staphylococcus xylosus P-1	В-8944	21	0	0	20
Staphylococcus xylosus SAL-1	В-8946	8	1	0	0
Staphylococcus xylosus 96-2	В-8947	48	52	0	9
Staphylococcus carnosus 108	В-8953	38	26	0	0
Staphylococcus carnosus 301-2	В-8950	11	45	0	0
Staphylococcus carnosus 111-2	В-8951	11	0	0	0
Macrococcus caseolyticus 38	В-1619	9	0	0	0

Как наиболее перспективные для использования в пищевой промышленности в качестве штаммов биоконсервантов можно выделить следующие микроорганизмы, чья киллерная активность в отношении санитарно-показательной микрофлоры превысила 50%: L. curvatus 1, L. sakei 103, L. sakei 104, L. sakei 105, L. plantarum 2П, L. plantarum 7К, P. pentosaceus 23, P. pentosaceus 28, P. acidilactici 27, P. acidilactici 3, P. acidilactici 8,  P. acidilactici 38, P. pentosaceus 55, P. pentosaceus 106.

Образование ароматических соединений стартовыми культурами

Ароматические соединения, полученные в результате жизнедеятельности микроорганизмов, оказывают значительное влияние на формирование суммарного аромата ферментированных мясных продуктов. Катаболизм аминокислот - это главный процесс для ароматообразования в ферментированных мясных продуктах, аромат которых в значительной степени формируется за счет альдегидов, спиртов и кислот, полученных из ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана), аминокислот с разветвленной цепью (лейцина, изолейцина, валина) и серосодержащих компонентов, полученных из метионина. Реакция трансаминирования является ключевой в формировании ароматических компонентов из аминокислот под действием стартовых культур, в которой -кетокислоты превращаются в различные ароматические соединения, такие как альдегиды, карбоксикислоты и серосодержащие соединения. Для конверсии L-глутамата, содержащегося в мясном сырье в большом количестве, в -кетоглутарат требуется присутствие молочнокислых микроорганизмов с глутаматдегидрогиназной (ГДГ) активностью. Глутаматдегидрогеназа - это фермент, который катализирует обратимое окислительное дезаминирование глутамата в -кетоглутарат и аммоний, используя НАД+, НАД(Ф)+ или оба в качестве кофакторов.

       В табл. 4 представлена относительная активность фермента глутаматдегидрогеназы ГДГ-позитивных штаммов.

Таблица 4

Определение глутаматдегидрогеназной активности

Штамм	Относительная активность ГДГ, ед. ОП492/мкг белка100
Lactobacillus plantarum 7K	68,52
Lactobacillus plantarum 22/2	3,38
Lactobacillus plantarum 2П	1,44
Lactobacillus plantarum 31	0,94
Lactobacillus plantarum 32	0,99
Lactobacillus plantarum 21	7,18
Lactobacillus plantarum 19	4,58
Lactobacillus plantarum 100	1,22
Lactobacillus curvatus 2	14,63
Lactobacillus sakei 104	2,11
Lactobacillus sakei 35	6,18
Pediococcus acidilactici 8	3,81
Pediococcus acidilactici 25	2,93
Pediococcus pentosaceus	7,11
Pediococcus pentosaceus 106	5,23
Staphylococcus carnosus 111-2	68,91

По данным табл. 4 можно видеть, что наибольшей ГДГ активностью обладают штаммы L. plantarum 7K (68,52) и S. carnosus 111-2 (68,91), последний выбран в качестве контроля как ароматобразующий микроорганизм. Полученные результаты подтверждают, что предложенная методика может быть использована для скрининга штаммов, способных образовывать ароматические соединения. Далее, по убыванию ГДГ активности, были выбраны следующие микроорганизмы: L. curvatus 2 (14,63), L. plantarum 21 (7,18), L. sakei 35 (6,18), P. pentosaceus 106 (5,23).

       Изучение связи активности глутаматдегидрогеназы микроорганизмов и превращения аминокислот в ароматические соединении

       Для доказательства того, что штаммы, у которых была определена высокая активность ГДГ, действительно способны образовывать ароматические соединения из аминокислот, они были инкубированы с аминокислотами в присутствии глутаминовой кислоты или -кетоглутарата. Катаболизм аминокислот был изучен у ГДГ-позитивных штаммов методом ТСХ. В качестве отрицательного контроля был взят штамм L. sakei 45, у которого не было обнаружено ГДГ активности (рис. 6, 7).

Данные ТСХ показывают, что штаммы с ГДГ активностью конвертируют аминокислоты как в присутствии -кетоглутарата, так и без него. За счет своей ферментативной активности микроорганизмы превращают глутаминовую кислоту в  -кетоглутарат, который и служит акцептором для аминогрупп. Штамм L. sakei 45, не обладающий ГДГ активностью, не конвертировал аминокислоты в присутствии глутаминовой кислоты. В присутствии -кетоглутарата происходила конверсия 100% лейцина, 75% триптофана, 50% фенилаланина, 60% тирозина. Этот факт подтверждает, что для превращений аминокислот и получения ароматических соединений необходимы микроорганизмы с активным ферментом глутаматдегидрогеназой.

 

Рис. 6. Картина тонкослойной хроматографии катаболизма аминокислот штаммом Staphylococcus carnosus 111-2 в присутствии глутаминовой кислоты

Рис. 7. Картина тонкослойной хроматографии катаболизма аминокислот штаммом Lactobacillus sakei 45 в присутствии глутаминовой кислоты

Обозначения к рис. 6 и 7: к - аминокислота, 150 мг/л, 0 - количество аминокислоты в инкубационной среде до начала инкубации, 24 - количество аминокислоты после 24 ч инкубации с клетками.

       Для ароматобразующего штамма L. plantarum 7К были определены ароматические соединения, которые образовывались в результате катаболизма ароматических аминокислот, аминокислот с разветвленной цепью и метионина. Карбоксильные аминокислоты определяли с помощью ВЭЖХ (рис. 8).

Рис. 8. Хроматограмма органических кислот, полученных в результате катаболизма метионина штаммом Lactobacillus plantarum 7К

При определении органических кислот были получены пики -кетоглутаровой кислоты (т.к. исследуемые образцы были с добавлением -кетоглутарата), молочной, щавелевой, лимонной, фумаровой кислот, а также обнаружены пики неидентифицированных соединений. Микроорганизмы других видов могут конвертировать аминокислоты с образованием разнообразных соединений, в том числе и органических кислот, таких как лимонная, пировиноградная, янтарная, молочная, уксусная, пропионовая, масляная и др. Выбор ароматобразующих штаммов, а также создание определенных консорциумов позволит формировать желаемый вкус и аромат ферментированных мясопродуктов.

Определение способности стартовых культур инактивировать активные формы кислорода и связывать ионы металлов переменной валентности

Для современных прокариотов O2, содержащийся в окружающей среде, в ряде случаев является абсолютно необходимым. В то же время кислород и его производные (супероксид анион радикал кислорода О, пероксид водорода Н2О2, синглетный кислород 1О2, гидроксильный радикал НОХ) являются токсичными для микробных клеток.        Отсутствие или сбой системы равновесия между образованием производных форм кислорода и их дезактивацией антиоксидантами приводит к возникновению окислительного стресса. Изучение вопроса взаимодействия стартовых культур с кислородом и его формами позволит отобрать штаммы, способные выживать в условиях окислительного стресса. Направленное использование стартовых культур, обладающих механизмами инактивации производных кислорода, позволит снизить их количество в мясных продуктах и, тем самым, замедлить окислительную порчу.

Ионы металлов переменной валентности (Fe2+, Cu+, Mo3+ и др.) являются необходимыми кофакторами огромного количества ферментов в живых организмах с одной стороны, но представляют опасность для клеток, с другой стороны, т.к. их присутствие усиливает образование высокореакционных гидроксильного и алкосильного радикалов. Хелатные соединения являются важными компонентами антиоксидантной защиты организмов за счет того, что связывают ионы металлов переменной валентности и, тем самым, препятствуют их вовлечению в реакции разложения перекисей. В связи с этим у стартовых культур была определена способность ингибировать автоокисление L-аскорбиновой кислоты, пероксидазная, каталазная и супероксиддисмутазная активности, а также способность связывать ионы металлов Fe2+ и Сu2+ (табл. 5).

Таблица 5

Способность стартовых культур инактивировать активные формы кислорода и связывать ионы металлов переменной валентности

Микроорганизмы	Ингибирование автоокисления аскорбиновой кислоты/мг белка, %	Количество связанных ионов Fe2+, мкг/мг белка	Количество связанных ионов Сu2+, нмоль/мг белка	Ед. активности СОД/мг белка
L. plantarum  22/2	5,0	85,89	28,94	5,31
L. plantarum 2П	9,4	122,05	40,42	6,81
L. plantarum 31	5,5	81,24	27,17	15,30
L. plantarum 32	12,1	162,47	54,78	5,94
L. plantarum 7К	4,3	94,34	31,13	2,42
L. plantarum 21	12,9	172,75	58,35	5,12
L. plantarum 100	9,5	172,92	Ц	Ц
L. plantarum 19	13,3	117,78	38,64	3,61
L. sakei 45	13,9	208,57	70,57	Ц
L. sakei 105	17,4	291,83	99,31	5,77
L. sakei 104	13,6	292,28	98,33	5,79
L. sakei 35	9,8	219,45	73,28	8,42
L. sakei 101	5,2	88,84	29,37	Ц
L. sakei 103	10,7	119,85	39,75	Ц
L. casei 10	21,5	157,46	53,44	4,68
L. curvatus 301-1	14,0	Ц	Ц	4,51
L. curvatus 1	8,8	195,01	64,93	3,41
L. curvatus 2	14,8	292,08	96,65	Ц
L. curvatus 102	8,43	312,55	104,04	7,63
P. acidilactici 8	16,9	172,66	58,35	СОД АКТИВНОСТЬ НЕ ОБНАРУЖЕНА
P. acidilactici 15	4,4	262,54	Ц
P. acidilactici 25	10,6	154,75	Ц
P. acidilactici 3	5,6	122,28	41,25
P. acidilactici 33	11,7	265,09	89,09
P. acidilactici 34	18,2	244,61	81,92
P. acidilactici 38	1,6	145,72	48,81
P. acidilactici 27	29,0	325,87	109,78
P. pentosaceus 23	16,3	198,65	66,62
P. pentosaceus 28	6,8	139,24	46,38
P. pentosaceus 31	10,6	138,73	46,75
P. pentosaceus 39	15,0	194,67	65,40
P. pentosaceus 55	1,63	97,85	32,72
P. claussenii 9	7,1	101,23	33,86
S. carnosus 108	8,5	125,85	42,49	4,45
S. xylosus 45	1,8	102,52	33,86	6,65
S. carnosus SAL-1	6,0	Ц	Ц	2,76
S. carnosus 96-2	2,5	83,81	28,26	5,05
S. carnosus 111-2	2,0	127,14	43,13	2,16
S. carnosus 301-2	7,4	71,77	23,52	3,73

Обозначения: Ц - показатель не определялся

Качественная оценка каталазной активности всех исследуемых микроорганизмов была проведена при их идентификации. Каталазная активность была обнаружена только у стафилококков. Штаммы мало отличались между собой по каталазной активности, минимальная активность была у S. carnosus SAL-1 - 26 ед/мг, максимальная - у S. xylosus 45 - 36 ед/мг. Каталазная активность составила для S. carnosus 111-2 - 30 ед/мг, S. carnosus 108 - 35 ед/мг, S. carnosus 96-2 - 31,5 ед/мг, S. carnosus 301-2 - 33 ед/мг. Стафилококки также показали пероксидазную активность при тестировании с помощью бензидинового теста.

Анализируя полученные результаты по всем изученным активностям, связанным с защитой от окислительного стресса, нужно отметить, что в большинстве случаев недостаток активности одной ферментативной системы компенсируется наличием другой. Итак, для использования в промышленности штамм-продуцент должен синтезировать нужные метаболиты в необходимом количестве, обуславливающие промышленную ценность (технологичность) стартовых культур.

ГЛАВА 7. Применение денитрифицирующих микроорганизмов в мясной промышленности

Нитрит натрия является мультифункциональной пищевой добавкой - в результате посола мяса он и его производные оказывают влияние на аромат, задерживают окислительную порчу жиров, участвуют в образовании окраски продукта и предотвращении развития микробиологической порчи. Вместе с тем, даже при наличии всех благоприятных условий среды, значительная часть внесенного нитрита натрия, до 40%, остается неиспользованной и обнаруживается в продуктах (Лисицын А.Б., 2005). Остаточный нитрит натрия служит источником образования токсичных нитрозосоединений.

Один из путей снижения остаточного нитрита натрия - введение в фарш денитрифицирующих бактерий, которые, наряду с обычной дыхательной системой, имеют специфическую окислительно-восстановительную систему.

Однако применяемые в настоящее время денитрифицирующие микроорганизмы не обеспечивают синтеза достаточного количество фермента нитритредуктазы, позволяющего значительно снижать или полностью исключать наличие остаточного нитрита в мясных продуктах. В связи с этим было решено повысить уровень синтеза фермента нитритредуктазы с помощью генной инженерии. Для получения продуцента нитритредуктазы использовали штамм S. carnosus 108 (B-8953), который входит в коллекцию стартовых культур МГУПБ.

С генетической точки зрения за проявление нитритредуктазной активности в  S. carnosus отвечают шесть генов: nirC, nirR, sirA, nirB, nirD, sirB, из которых пять последних сгруппированы в оперон (рис. 9) (Neubauer Н., 1999).

Рис. 9. Карта локуса, включающего гены, участвующие в восстановлении нитрита

Ген nirC не активен и является остатком гена-транспортера. В анаэробных условиях транскрипция инициируется с промотора гена nirR, а в аэробных - с промотора гена sirA.

Первоначально была проверена целесообразность замещения промотора нитритредуктазного оперона для увеличения активности штамма. В связи с противоречивыми данными о роли белкового продукта гена nirR было решено проводить замену промоторов генов nirR и sirА. Для усиления транскрипции оперона был выбран хорошо изученный промотор гена ксилозоизомеразы xylA из S. xylosus c геном белка-регулятора xylR или без него. Это связано с возможной токсичностью для клетки сверхэкспрессируемого белка. Быстрый отбор трансформантов осуществлялся за счет использования в качестве селективного маркера гена устойчивости к эритромицину Em из транспозона Tn917. Замена промотора осуществлялась с помощью термочувствительной плазмиды, используя двойной кроссинговер при длине флангов для интеграции 750Ц960 п.н. (рис. 10).

Рис. 10. Схема конструирования плазмиды pBT-thyA-gap-nirR, интегрируемой в хромосому Staphylococcus carnosus

Для того чтобы организм не имел статуса генетически модифицированного, допускается введение только собственного генетического материала. Поэтому в качестве генетического маркера была выбрана мутация по гену тимидилат синтетазы thyA, которая возникает спонтанно в гене thyA. Данный генетический маркер детерминирует отчетливо выраженный фенотипический признак - не способность штамма расти без тимидина, и является допустимым при генетической модификации штаммов, применяемых в пищевом производстве (Sasaki Y., 2004). После изучения нитритредуктазной активности трансформантов, в наиболее лудачной конструкции селективный маркер Em замещен геном тимидилат синтетазы thyA, а промотор гена xylA сильным промотором гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы gap из S. carnosus с помощью созданной плазмиды pBT-thyA-gap-nirR (рис. 11).

Штамм, полученный с помощью вектора pBT-thyA-gap-nirR, был назван S. carnosus LIA-96 (В-9518). Двенадцатичасовое микроаэрофильное культивирование полученного рекомбинантного штамма S. carnosus LIA-96 в L-среде с исходной концентрацией нитрита натрия, равной 25 мг на 100 мл, привело к снижению концентрации нитрита натрия до нулевого уровня, в то время как исходный штамм S. carnosus B-8953 восстановил только 50% нитрита. Таким образом, показано значительное усиление синтеза фермента нитритредуктазы в рекомбинантном штамме.

        а)  б)

Рис. 11. а) Замена промоторной области гена nirR с помощью плазмиды  pBT-thyA-gap-nirR и б) Электрофорез ПЦР продукта с хромосомы S. carnosus, трансформированного pBT-thyA-gap-nirR

Обозначение: 1 - ПЦР фрагмент 3250 п.н., M - маркер молекулярного веса GeneRuler 1 kb

Клинические исследования штамма S. carnosus LIA-96 in vivo проводились на белых линейных мышах массой (121) г. При определении острой и хронической токсичности микроорганизм вводился per os в течение 7 и 30 сут (вводимая дозаа3103 КОЕ/0,5 мл). Гистология внутренних органов (миокарда, тимуса, легких, печени, селезенки, почек, кишечника, желудка, корня языка, головного мозга) проводилась на 1 и 7 сут после прекращения введения штамма. Были исследованы 4 группы животных (по 10 мышей в каждой): 1 - подопытная (вводились живые клетки), 2 - подопытная (инактивированные клетки), 3 - контрольная (физраствор) и 4 - интактная. Проведенные исследования показали, что пероральное введение суточной живой культуры штамма Staphylococcus carnosus LIA-96 не приводит к развитию во внутренних органах и ЦНС мышей изменений, указывающих на наличие токсического действия.

При изучении вирулентности, общей токсичности и токсигенности вводили внутрибрюшинно (106, 107 и 108 КОЕ/0,5 мл) суспензию живых клеток, инактивированных клеток и культуральную среду, освобожденную от клеток центрифугированием, соответственно. Наблюдение за изменением поведения, внешнего вида и веса животных осуществляли в течение 5 сут. Сравнение проводилось с интактными и контрольными животными. В результате проведенных исследований штамм Staphylococcus carnosus  LIA-96 признан безопасным по показателям безвредности, токсичности, токсигенности и вирулентности.

       Молекулярно-генетическая экспертиза установила, что штамм S. carnosus LIA-96 не является генетически модифицированным, так как был получен путем перестройки собственного генетического материала без включения в его состав чужеродной ДНК. Показана фенотипическая и генотипическая стабильность данного штамма. Проведено молекулярно-генетическое исследование, подтверждающее отсутствие в геноме штамма  S. carnosus LIA-96 генов (sea, seb, sec, sed, see, eta, etb, tst), кодирующих белки-токсины.

Глава 8. Перспективы использования микроорганизмов в мясной промышленности: генетическая модификация штаммов-продуцентов в желаемом направлении

       Для создания штаммов с желаемым генотипом наиболее эффективным современным методом на сегодняшний день является способ введения в микробные клетки определенных генов, полученных с использованием технологий рекомбинантных ДНК. Штаммы можно конструировать как в направлении изменения метаболизма, так и в направлении их приспособления к особым требованиям технологического процесса.

       Ниже представлены схемы конструирования штаммов с заданными свойствами: лСхема получения суперэкспрессии гена Y и лСхема получения делеции участка ДНК, кодирующего ген Y.

Для получения суперэкспрессии нужного гена Y между этим геном и участком хромосомы вводится конструкция, состоящая из двух элементов - гена тимидилат синтетазы thyA и сильного промотора, например, гена ксилозоизомеразы xylA. Введение дополнительных элементов в хромосому осуществляется с помощью термочувствительной плазмиды pBT2 (Bruckner R., 1993), несущей конструкцию для интеграции. Конструкцию для интеграции синтезируют с использованием ПЦР и клонируют в плазмиде pBT2 с образованием плазмиды pInt. Далее модифицируемый штамм трансформируют плазмидой pInt и проводят селекцию на среде GS без тимидина с хлорамфениколом, т.е. отбираются штаммы, в которых прошла трансформация. После этого плазмиду удаляют с помощью теплового шока, а штамм проверяют на способность расти на среде GS с тимидином и на чувствительность к хлорамфениколу. Таким образом, мутантный штамм приобретает ген thyA и способность расти на среде GS без тимидина, а ген Y оказывается под контролем сильного регулирующего промотора, например, промотора гена xylA.

Выключение гена проводится подобным образом, за исключением того, что с помощью ПЦР синтезируют и клонируют в pBT2 фрагмент, содержащий левый и правый фланги выключаемого гена, между которыми встроен маркер thyA.

Определение генетических детерминантов декарбоксилаз аминокислот

юбое свойство, проявляемое микроорганизмом, является следствием активности определенного гена или группы генов, входящих в геном этого штамма. Определение генов, ответственных за проявление того или иного технологического свойства, является отдельным этапом в конструировании промышленно-ценных микроорганизмов.

Методом ПЦР у тирамин-позитивных штаммов L. sakei 101, 103, 105 были найдены tdc гены (рис. 12), кодирующие тирозиндекарбоксилазную активность. На картине электрофореза показаны tdc гены штаммов L. sakei 101, 103, 105 при разных температурах отжига праймеров. Размер tdc гена для этих штаммов составляет 1866 п.н. (Национальный центр биотехнологической информации, NCBI, США, В связи с тем, что выбранные универсальные праймеры для всего вида L. sakei не захватывают всю рамку считывания, для L. sakei 101, 103, 105 были получены фрагменты размером 846 п.н. (крайние точки отжига - 1193 и 347 п.н.).

 

Рис. 12. Картина электрофореза тирозиндекарбоксилазных генов tdc у тирамин-позитивных штаммов Lactobacillus sakei 101, 103, 105

Обозначения: М - маркер GeneRulerЩ 1 kb DNA Ladder, 1 - L. sakei 101, 2 - L. sakei 103, 3 - L. sakei 105 при температурах отжига 48, 50 и 52 C

Создание методами генной инженерии штаммов с выключенной декарбоксилазной активностью (см. Схема получения делеции участка ДНК, кодирующего ген Y) позволит получать промышленно-ценные микроорганизмы с оптимальными технологическими параметрами, но не способные продуцировать биогенные амины и, тем самым, безопасные для здоровья потребителя.

Генетика продуцирования бактериоцинов

Синтез бактериоцинов с высокой киллерной активностью и широким спектром ингибирования микроорганизмов порчи был обнаружен у видов P. pentosaceus и  P. acidilactici (Ped+ штаммы). В большинстве случаев локализация генов, кодирующих синтез педиоцинов, является плазмидной. В связи с этим у Ped+ штаммов получены данные по плазмидному профилю, и определены размеры плазмид (рис. 13). У штаммов  P. acidilactici 27 и P. acidilactici 38 было найдено по одной плазмиде размером примерно 11 т.п.н., у штаммов P. pentosaceus 23, 28, 55 плазмид обнаружено не было. По размеру плазмиды, найденные у бактериоцин-синтезирующих штаммов P. acidilactici 27 и 38, являются крупными, и, как показал анализ литературных источников, именно на таких плазмидах локализованы гены, кодирующие синтез бактериоцинов. В случае штаммов  P. pentosaceus 23, 28, 55 можно говорить о хромосомной локализации генов, ответственных за синтез бактериоцинов.

Для подтверждения плазмидной локализации детерминантов синтеза бактериоцинов у штаммов P. acidilactici 27 и 38 была проведена элиминация плазмид с новобиоцином и акридиновым оранжевым. После элиминации плазмид педиококки выращивали на среде с индикаторным штаммом S. epidermidis B-8933 и учитывали наличие или отсутствие зон задержки роста индикаторного штамма вокруг колоний педиококков (Ped+/Ped-). Колонии без зон задержки роста проверяли на отсутствие плазмид (Ped-).

         

Рис. 13. Плазмидный профиль Ped+  Рис. 14. Плазмидный профиль Ped+ и Ped-

M - плазмида pBRG1310 размером 12330 п.н.,   M - маркер GeneRulerЩ 1 kb DNA Ladder;

1 - P. pentosaceus 55; 2 - P. pentosaceus 23;  1 - P. acidilactici 27 (Ped+); 2 - P. acidilactici 38 (Ped+);

3 - P. acidilactici 27; 4 - P. pentosaceus 28;  3 - P. acidilactici 27 (Ped-); 4 - P. acidilactici 38 (Ped-).

5 - P. acidilactici 38;

S - суперскрученная форма плазмиды, L - линейная, C - кольцевая.

На картине электрофореза (рис. 14) видно, что Ped+ штаммы содержат плазмиду размером ~ 11 т.п.н., в то время как Ped- штаммы плазмид не имеют. Таким образом, методом элиминирования плазмид, была установлена плазмидная локализация генов, кодирующих синтез бактериоцинов у штаммов P. acidilactici 27 и P. acidilactici 38.

Сверхпродукцию бактериоцинов, детерминируемых генами плазмиды, предлагается получать повышением копийности этих генов в результате мутации плазмид по функции репликации. В случае хромосомной локализации генов, ответственных за синтез бактериоцинов, имеет смысл помещать эти гены под контроль сильного промотора.

Гены, кодирующие глутаматдегидрогеназу. Повышение активности фермента глутаматдегидрогеназы стартовых культур позволит увеличивать количество ароматических соединений в ферментированных мясных продуктах. В связи с этим у штаммов S. carnosus 111-2 и L. plantarum 7K методом ПЦР были идентифицированы гены gdh, детерминирующие ГДГ активность (рис. 15). Методы генной инженерии, при использовании разработанной Схемы получения суперэкспресии гена Y, позволят направленно улучшить свойства микроорганизмов для получения регулируемой суперэкспресии гена gdh фермента глутаматдегидрогеназы.

       Определение генетических детерминантов супероксиддисмутазы. Для мясной промышленности важно селекционировать стартовые культуры, устойчивые к окислительному стрессу. Поэтому у штамма, представителя каждого вида, был выделен ген, кодирующий фермент СОД (рис. 16). У штаммов L. curvatus 2, L. plantarum 7К, L. sakei 104 и L. casei 10 был найден ген sodA размером 454 п.н., у S. carnosus 108 и S. xylosus 45 размер гена sodA составил 503 п.н. У штаммов, относящихся к видам Pediococcus spp., гена sodA, ответственного за синтез фермента супероксиддисмутазы, обнаружено не было. Изменение активности экспрессии генов sodA, кодирующих фермент СОД, при использовании разработанной Схемы получения суперэкспресии гена Y, позволит не только получать устойчивые к окислительному стрессу штаммы, но и создавать промышленно-ценные микроорганизмы, способные замедлять окислительную порчу мясопродуктов.

Рис. 15. Картина электрофореза глутаматдегидрогеназных генов gdh

Обозначения: L. plantarum 7К - 1347 п.н. (температура отжига праймеров 55 С и 57 С), S. carnosus 111-2 - 1245 п.н. (температура отжига праймеров 49 С и 51 С), М - маркер GeneRulerЩ 1 kb DNA Ladder

Рис. 16. Картина электрофореза супероксиддисмутазных генов

Обозначение: 1 - L. curvatus 2, 2 Ц  L. plantarum 7К, 3 - L. sakei 104, 4 - L. casei 10, 5 - S. carnosus 108, 6 - S. xylosus 45,  M - маркер GeneRulerЩ 1 kb DNA Ladder

Глава 8. Методология создания бактериальных препаратов на основе стартовых культур по совокупности их функциональных свойств

Изучение возможности совместного использования микроорганизмов различных видов в бактериальных препаратах

В основном в промышленности применяют многоштаммовые бактериальные препараты, поэтому задача отбора микроорганизмов состоит не только в выборе оптимальных по функциональным свойствам для конкретного продукта штаммов, но также штаммов, обладающих взаимной совместимостью. В связи с этим была изучена способность к совместному росту и размножению выделенных штаммов молочнокислых микроорганизмов, стафилококков, а также дрожжей и мицелиальных грибов.

На примере штаммов, относящихся к видам L. plantarum, L. casei, S. carnosus, P. acidilactici, P. pentosaceus было показано отсутствие антагонизма между этими микроорганизмами методом перпендикулярных штрихов. На снимках видно, что при одновременном культивировании исследуемых штаммов друг с другом негативного влияния на их морфологию и рост обнаружено не было (рис. 17 (а) и (б)).

   

  а)  б) в)

Рис. 17. Совместный рост штаммов

а) L. plantarum B-2663, L. plantarum B-8899, S. carnosus B-8953, б) P. acidilactici В-8902, P. pentosaceus В-8888 и L. casei В-8890, в) L. plantarum B-2663, L. plantarum В-1618, L. plantarum В-8654.

       На рис. 17 (в) видны зоны антагонизма между микроорганизмами одного вида  L. plantarum. Штаммы по кислотообразованию близки друг к другу, активная кислотность L. plantarum B-2663 составляет 65 Т, L. plantarum В-1618 - 79 Т, L. plantarum В-8654 - 73 Т, поэтому объяснить антагонизм продуцированием молочной кислоты нельзя. В данном случае можно говорить о синтезе бактериоцинов штаммом L. plantarum B-2663, подавляющих рост микроорганизмов гомологичного вида. 

Были изучены взаимоотношения между дрожжами видов D. hansenii, D. vanriji, D. polymorphus и мицелиальными грибами вида P. camembertii, которые также не показали антагонизма.

Применение ДНК-фингерпринта для паспортизации промышленно-ценных микроорганизмов

Для паспортизации промышленных микроорганизмов был проведен ДНК-фингерпринт (геномная дактилоскопия), который используется для идентификации штаммов на таксономическом уровне до штамма. Данный уровень идентификации зависит от выбора штаммоспецифичных праймеров. Идентификация на уровне штамма позволяет точно говорить, что данный штамм, используемый в промышленности, идентичен той культуре, которая была депонирована или же запатентована, разрешена к использованию в пищевой промышленности и будет проявлять нужные в технологическом процессе свойства. ДНК-фингерпринт позволяет обезопасить производство и оградить автора данной культуры от незаконного ее использования.

Создание программы с базой данных функциональных свойств стартовых культур

       Полный целенаправленный отбор микроорганизмов для бактериальных препаратов  при наличии большого числа коллекционных культур возможен лишь при использовании вычислительной техники. Компьютерная техника позволяет быстро, с учетом заданных параметров, произвести выбор штаммов, оптимальных для определенных условий производства. В связи с этим была создана программа с базой данных функциональных свойств стартовых культур. Программа имеет иерархическую структуру и позволяет производить ранжирование, статистическую обработку, расчет и оценку по количественным критериям. Очень важно, что эта программа способна выстраивать штаммы в порядке приоритета.

Система База данных микроорганизмов написана на языке Java и выполняется в среде исполнения JRE версии 5.0 или выше. Для хранения данных используется единый файл micro.db, создаваемый при необходимости в рабочем каталоге системы. Система является переносимой и способна выполняться на всех поддерживаемых JRE ОС. Тестировалась система на ОС Windows XP и Mac OS X 10.4.

       Интерфейс системы построен в виде экранных форм и диалоговых окон, в которых выполняется вся работа по выборке данных и внесению новых данных в базу данных. На главной форме программы расположено главное меню, позволяющее обращаться к другим формам, и область статистики, где выводится количество зарегистрированных в базе данных сущностей. Внутреннее представление данных выполнено в виде реляционных таблиц (рис. 18).

Результаты исследований позволили разработать методологию создания функциональных бактериальных препаратов, представленную на рис. 19.

Рис. 18. Структура реляционной базы данных

Рис. 19. Методология создания функциональных бактериальных препаратов

Глава 9. Оценка эффективности влияния стартовых культур на качественные характеристики модельных мясных систем и готовых мясных продуктов

       При проведении оценки эффективности было уделено внимание получению продуктов не только традиционными методами, но и с привлечением нестандартного мясного сырья, биотрансформированного стартовыми культурами, которое, в силу своих качественных особенностей, не может быть использовано в нативном виде. Было изучено влияние стартовых культур на изменение характеристик мясного сырья, в том числе нестандартного, а также мясных продуктов.

Цветообразование и снижение остаточного нитрита натрия

Оценку эффективности бактериального препарата Биоцвет, в состав которого входит штамм S. carnosus LIA-96, в отношении цветообразования и снижения остаточного нитрита натрия, проводили с использованием модельной фаршевой системы, состоящей из фарша (говядина + свинина, 1 : 2), глюкозы (2%), MgSO4 (0,00035%) и нитрита натрия до конечной концентрации 3, 5 и 7,5 мг на 100 г фарша. В качестве контроля использовали штамм S. carnosus B-8953. В обоих случаях количество КОЕ составило 2109 на 100 г фарша. Образцы выдерживали в анаэростате при 24 С, пробы отбирали через равные промежутки времени. Динамика изменения концентрации нитрита натрия с использованием в качестве стартовой культуры штамма-продуцента S. carnosus LIA-96 и исходного штамма S. carnosus B-8953 при введении нитрита натрия 3, 5 и 7,5 мг на 100 г, показана на рис. 20Ц22, соответственно. Во всех образцах, в которые был внесен штамм S. carnosus B-8953, за 18 ч ферментации не произошло полного восстановления нитрита, а при внесении в образцы штамма S. carnosus LIA-96 нитрит не обнаруживался через 6 ч при его введении 3 мг/100 г фарша; через 10 ч - 5 мг/100 г и через 14 ч - 7,5 мг/100 г. В случае со штаммом S. carnosus B-8953 при повышении концентрации нитрита натрия происходила задержка начала активного восстановления ионов нитрита, в случае применения штамма S. carnosus LIA-96 данного явления не наблюдалось. Это связано с разной регуляцией активности nir-оперона промоторами этих штаммов. Поскольку у штамма S. carnosus LIA-96 сила промотора Pgap выше, происходило более быстрое накопление белкового продукта nir-оперона и последующее активное восстановление токсичного для микробной клетки нитрита. В случае же промотора Pnir у штамма  S. carnosus B-8953 происходила постепенная активизация синтеза белка nir-опероном, а, следовательно, задержка начала активного роста бактерий.

Рис. 20. Утилизация нитрита натрия штаммами S. carnosus LIA-96 и S. carnosus  B-8953 в фаршевой системе при введении нитрита натрия 3 мг на 100 г продукта

Рис. 21. Утилизация нитрита натрия штаммами S. carnosus LIA-96 и S. carnosus B-8953 в фаршевой системе при введении нитрита натрия 5 мг на 100 г продукта

Рис. 22. Утилизация нитрита натрия штаммами S. carnosus LIA-96 и S. carnosus  B-8953 в фаршевой системе при введении нитрита натрия 7,5 мг на 100 г продукта

       Далее было проведено исследование нитритредуктазной активности бактериального препарата Биоцвет при получении готового мясного продукта на примере вареной колбасы. В качестве контроля была взята вареная колбаса Молочная первого сорта (ГОСТ Р 52196) - образец № 1. Опытные образцы (2-й, 3-й и 4-й) были приготовлены следующим образом: после измельчения мяса на волчке к фаршу добавляли NaCl, нитрит натрия в концентрации 3, 5 и 7,5 мг на 100 г сырья, соответственно, и бактериальный препарат Биоцвет в количестве 100 г/100 кг сырья. Мясное сырье размером 2Ц6 мм выдерживали при 12 С в течение 24 ч в вакуумной мешалке. Дальнейший процесс осуществлялся в соответствии с технологической схемой контроля.

       Определение содержания остаточного нитрита натрия показало отсутствие ионов нитрита (точность измерения 0,0001%) в опытных образцах (№ 2, 3, 4) по сравнению с контрольным (№ 1). Эти данные находятся в обратной зависимости с результатами опытов по определению содержания нитрозопигментов: образцы без остаточного нитрита  отличались более высоким содержанием нитрозопигментов по сравнению с контрольным (табл. 6).

Таблица 6

Химические показатели образцов вареных колбас

Наименование показателей	Готовый продукт
	Образец № 1 контроль 0,0075% NaNO2	Образец № 2 Биоцвет + 0,0075% NaNO2	Образец № 3 Биоцвет + 0,005% NaNO2	Образец № 4 Биоцвет+ 0,003% NaNO2
Массовая доля влаги, %, не более	65,800,54	66,100,52	65,700,49	67,700,51
Массовая доля нитрита натрия, %	0,00480,0002	0,0001	0,0001	0,0001
Количество нитрозопигментов, %	68,15±0,47	79,43±0,47	77,38±0,63	68,87±0,66
ТБЧ	0,092±0,001	0,089±0,001	0,093±0,001	0,090±0,001
Кислотное число, мг КОН	0,9216±0,0012	0,9188±0,0014	0,9062±0,0012	0,9138±0,0015
Пероксидное число, %J2	0,0062±0,0003	0,0061±0,0003	0,0062±0,0003	0,0065±0,0004

Изучение пероксидных, тиобарбитуровых и кислотных чисел на 5 сут хранения показало, что характер изменения липидной фракции опытных образцов вареных колбас практически не отличался от контрольного образца. Следует, что использование бактериального препарата Биоцвет в технологии вареных колбас с одновременным снижением уровня вводимого нитрита натрия не ухудшает устойчивость продукта к окислительным процессам, происходящих в готовом продукте в течение 5 сут хранения. Дегустационной комиссией было отмечено, что образцы № 3 и № 4, приготовленные с низким содержанием нитрита натрия, не только не уступали, а даже превосходили по интенсивности окраски на срезе батона контрольный образец (№ 1). Также было отмечено, что аромат и вкус опытных колбасных изделий не отличался от контрольного образца. Санитарно-гигиенические показатели опытных образцов вареных колбас соответствовали требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01. Это свидетельствует о том, что введение бактериального препарата Биоцвет не влияет на сроки хранения готового продукта.

Полученные данные говорят о возможном снижении уровня вводимого нитрита натрия в вареные колбасные изделия с 0,0075% до значения 0,003% при одновременном введении в рецептуру бактериального препарата Биоцвет, в состав которого входит штамм S. carnosus LIA-96. При этом достигается полное восстановление ионов нитрита в готовом мясном продукте без ухудшения его качества. Применение бактериального препарата Биоцвет позволит исключить возможный риск для здоровья человека, связанный с употреблением мясных продуктов, приготовленных с добавлением нитрита натрия. Перспективным является применение данного бактериального препарата в технологиях других мясных изделиях, в рецептуру которых входит нитрит натрия.

Комплексное исследование возможности использования биотрансформированного сырья в качестве белкового композита при производстве мясных продуктов

       Биотрансформация сельскохозяйственного сырья позволяет расширить ресурсные возможности за счет более глубокой и комплексной его переработки, а также вовлечь неиспользованные отходы в качестве источника белка для получения продуктов питания. Схема биотрансформации представлена на рис. 23.

Рис. 23. Схема биотрансформации мясного сырья

Ароматообразование

       Проведено исследование влияния бактериального препарата Аромалакт на ароматообразование биотрансформированных субпродуктов (легкое+селезенка). Образец № 2 - биотрансформация в течение 24 ч, образец № 3 - в течение 48 ч. В контрольный образец № 1 бактериальный препарат не вносили.

       Состав летучих компонентов в образцах был исследован методом газовой хроматографии, в результате которой было получено 73 пика, большинство из которых было идентифицировано. Основные летучие компоненты представлены в табл. 7.

Таблица 7

Основные летучие компоненты в образцах

№ пика	Соединение	Содержание в образце, мкг/мл
		Образец № 1	Образец № 2	Образец № 3
1	Пропаналь	1206	65315	71528
2	2-Метилпропаналь	1206	2379	2127
3	2-Бутанон	563	1385	1858
4	Бутаналь	764	673	582
5	Диацетил	22611	2478	25311
6	2-Метилбутаналь	894	1255	1374
7	Изо-бутанол	322	1336	1917
8	2-Бутеналь	27814	28911	31513
9	Пентаналь	583	1927	2479
13	2-Пентеналь	392	482	562
22	2-Гептеналь	271	893	1435
23	Метиональ	Ц	150,5	170,5
35	-Терпинен	43222	58317	72321
42	Дипропилдисульфид	322	1405	1567
54	Гераниол	39520	41714	43311
60	Терпенилацетат	1518	2079	2408

       Из таблицы видно, что во время биотрансформации происходит увеличение альдегидов, спиртов, сульфидов, эфиров. Первый образец, в отличие от второго и третьего, не содержит малолетучие соединения с индексами удерживания более 1800 (время удерживания больше 25 мин). В этой области могут присутствовать свободные жирные кислоты и их метиловые эфиры.

Доминирующая роль в формировании аромата мясных продуктов принадлежит ферментации жиров, в процессе которого образуются ди- и моноглицериды, летучие жирные кислоты (уксусная, масляная, капроновая и др.) и продукты их распада (альдегиды, кетоны, метилкетоны, эфиры, спирты). Эти соединения формируют ароматический букет, позволяя нивелировать специфический запах субпродуктов. Такое сырье можно рекомендовать к использованию в технологиях вареных, в/к, п/к колбасных изделий, паштетов и мясных полуфабрикатов в качестве белкового композита.

Определение аминокислотного состава биотрансформированного сырья

Были проведены исследования изменения аминокислотного состава вторичного мясного сырья в результате ферментативных активностей стартовых культур, входящих в бактериальный препарат Аромалакт.

Результаты проведенных исследований показали, что стартовые культуры, используемые в процессе биотрансформации, обладают протеиназной и пептидазной активностью. Белок, под действием протеиназ, расщепляется на определенное количество пептидов. Завершают гидролиз белков пептидазы, проявляющие различную специфичность, которые катализируют гидролиз пептидов до свободных аминокислот.

Таким образом, образуется большое количество конечных продуктов, таких как пептиды и свободные аминокислоты, чьи концентрация и состав коррелируют со специфическими вкусовыми признаками. Также известно, что свободные аминокислоты являются предшественниками некоторых летучих соединений, которые являются составными частями аромата.

Результаты аминокислотного анализа представлены в виде диаграммы на рис. 24. Анализ полученных данных показывает, что может быть выделена группа аминокислот (Asp, Thr, Ser, Pro, Leu, Orn, Lys, His), для которых наблюдается изменение их содержания в образцах. Величина этих изменений, по минимальной оценке, находится в диапазоне от 2 до 13 % (в среднем около 7%). Исключение составляет орнитин, содержание которого увеличивается в ходе ферментации в 6,4 раза за 24 ч и в 8,8 раза за 48 ч.

Отмечено снижение содержания глутаминовой кислоты в процессе биотрансформации. Глутаминовая кислота под влиянием фермента глутаматдегидрогеназы стартовых культур переходит в -кетоглутарат, который является акцептором аминогрупп ароматических аминокислот, аминокислот с разветвленной цепью и метионина, в результате чего происходит образование ароматических соединений.

Полученные данные по аминокислотному составу и биологической ценности свидетельствуют о превалировании в исследованных образцах соединительнотканных белков, которые, как хорошо известно, лимитированы по триптофану и ароматическим аминокислотам. Тем не менее, направленное действие штаммов позволяет модифицировать структуру белков в составе композиции из тканей легкого и селезенки в заданном направлении.

В ходе проведения комплексного исследования химического состава, пищевой ценности и органолептических показателей определена возможность использования биотрансформированного сырья в качестве белкового композита в технологии вареных колбас и паштетов. Установлен рациональный уровень замены основного сырья на белковый композит: в технологии вареных колбас - 20%; при производстве мясных паштетов - 25%, где экономия основного сырья составила 7120 руб. и 5290 руб. на 1 т готовой продукции, соответственно.

Рис. 24. Относительное содержание аминокислот в образцах

Снижение уровня биогенных аминов в ферментированных колбасах

       Одну из ключевых ролей в накоплении биогенных аминов играет качество исходного мясного сырья. Однако другие переменные, такие как рН, aw, окислительно-восстановительный потенциал, концентрация NaCl, компоненты, входящие в рецептуру, а также режимы технологического процесса могут значительно влиять на образование биогенных аминов в колбасах. Для предотвращения накопления БА необходимо, чтобы стартовые культуры не продуцировали БА и подавляли рост амино-позитивной микрофлоры. Для определения способности снижать БА в мясных продуктах бактериальным препаратом Биосейф были выработаны 3 партии с/к колбасы Премьера по 100 кг (1 - контроль, без стартовых культур, 2 - с импортным бактериальным препаратом, 3 - с б/п Биосейф). Осадка и копчение с/к колбасы осуществлялось в климокамере по режимам, указанным в табл. 8.

Таблица 8

Режимы осадки и копчения с/к колбасы

Этап	Время созревания, ч	Температура, С	Относительная влажность, %	Продолжительность подачи дыма, ч
1 2 3 4 5	6Ц12 12Ц14 24 12Ц14 24 12Ц14 6 12	24 22Ц24 22 22 20 18 18 16	86 94Ц96 92 90Ц92 88Ц90 84Ц86 84 82	Ц - 0,5 - 3 - 3 (с интервалом в четыре часа)

       Сушку осуществляли в течение первых 4 сут при температуре 16 С, относительной влажности воздуха =(83+1)%, скорости движения воздуха =0,1 м/с, затем в течение 16 сут при температуре 11Ц12 С, относительной влажности воздуха =(72+2)%, скорости движения воздуха =0,05Ц0,1 м/с.

       Бактериальный препарат вносился в количестве 25 г/100 кг сырья. БА (гистамин, тирамин, путресцин, кадаверин) были определены в исходном сырье, а также во время технологического процесса и хранения (16 недель) (диаграммы на рис. 25Ц29).

Рис. 25. Диаграмма изменения содержания в образцах гистамина

Рис. 26. Диаграмма изменения содержания в образцах тирамина

Рис. 27. Диаграмма изменения содержания в образцах путресцина

Рис. 28. Диаграмма изменения содержания в образцах кадаверина

       

       Внесение стартовых культур значительно снижает уровень БА по сравнению с контролем (надо отметить благополучное гигиеническое состояние исходного сырья). Как уже было сказано ранее, отсутствие высокой декарбоксилазной активности у стартовых культур является важным критерием для зарубежных производителей. В нашем случае бактериальный препарат Биосейф был составлен из микроорганизмов, обладающих аминоксидазной активностью, и показал свою высокую эффективность в плане снижения количества БА в мясном продукте, как за счет разрушения БА, так и за счет подавления нежелательной амино-позитивной микрофлоры. Так, количество гистамина и кадаверина было очень низким, а количество тирамина и путресцина не превышало 100 мг/кг, в то время как в контроле уровень тирамина и путресцина был высоким - 450 мг/кг и 835 мг/кг, соответственно.

Предотвращение окислительной порчи б/п Лактомикс

Для исследования влияния бактериального препарата Лактомикс на окислительные процессы, происходящие в мясном продукте при хранении, была разработана технология мясного продукта - купаты Из птицы с использованием мяса птицы механической обвалки, которое отличается по внешнему виду, химическому составу и микробиологическим показателям от мяса ручной обвалки. Оно представляет собой мелкоизмельченную массу и характеризуется повышенным содержание липидов, ПНЖК, гемовых компонентов и железа; высоким значение рН; большой площадью контакта поверхности мясной массы с кислородом воздуха и значительным содержанием воздушных включений. Эти факторы способствуют развитию окисления липидов и изменению цвета мяса птицы механической обвалки. Кроме того, мясо механической обвалки - хорошая питательная среда для роста микроорганизмов.

Были выработаны две партии купат: образец № 1 (контроль), без внесения б/п; образец № 2 (опыт) - был внесен бактериальный препарат Лактомикс. Образцы хранили при температуре 4 С и относительной влажности 80% в течение 4 сут. Интенсивность развития окислительных процессов в фарше была изучена по накоплению первичных и вторичных продуктов окисления в процессе хранения: были определены рН, кислотное, пероксидное, тиобарбитуровое числа (табл. 9).

Таблица 9

Влияния препарата Лактомикс на окислительные процессы в купатах Из птицы

Образцы	Продолжительность хранения, ч
	0	24		48			96
рН
Образец № 1 (контроль)	7,000,35		6,850,34		6,730,33	6,580,31
Образец № 2 (опыт)	7,010,35		6,740,32		6,560,32	5,420,26
Пероксидное число ПЧ, %J
Образец № 1 (контроль)	0,00160,0001		0,01070,0003		0,01390,0005	0,01710,0006
Образец № 2 (опыт)	0,00160,0001		0,00440,0002		0,00760,0003	0,01140,0005
Кислотное число КЧ, мг КОН
Образец № 1 (контроль)	0,0640,003		0,2240,010		0,3740,015	0,1120,003
Образец № 2 (опыт)	0,0640,003		0,1870,009		0,2990,014	0,0940,002
Тиобарбитуровое число, ОП532
Образец № 1 (контроль)	0,1010,005		0,2650,012		0,3710,017	0,6230,027
Образец № 2 (опыт)	0,1010,005		0,1580,006		0,1990,009	0,4450,021

Обозначения: образец № 1 (контроль) - без внесения бактериального препарата; образец № 2 (опыт) - с внесением бактериального препарата

Как видно из табл. 9 рН опытного образца почти на единицу ниже контрольного. Кислотное число на 4 сут хранения в опытном образце, по сравнению с контрольным, снизилось на 20%, а содержание первичных и вторичных продуктов окисления к этому же периоду в опытном образце - на 33% и 28% соответственно ниже, чем в контрольном. Бактериологическое исследование проводили на 4 сут хранения продукта. Результаты микробиологического анализа соответствовали требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01, индекс 1.1.9.3. Дополнительно определили количество молочнокислых микроорганизмов в 1 г продукта, которое составило 108 КОЕ/г.

Результаты проведенных анализов показали, что бактериальный препарат Лактомикс, замедляет развитие окислительных процессов в фарше и снижает содержание продуктов окисления. Кроме того, его применение способствует улучшению органолептических и микробиологических показателей. Таким образом, внесение рекомендуемого бактериального препарата повышает качество и безопасность производимого продукта. По результатам исследований была разработана техническая документация на Полуфабрикаты мясные рубленые с бактериальным препаратом Лактомикс, ТУ 9214- 350-23476484-08.

Таким образом, установлено, что разработанные бактериальные препараты эффективны в выбранном направлении и конкурентоспособны (общая оценочная стоимость импортируемых бактериальных препаратов составляет порядка 50 млн. руб. в год и имеет тенденцию к увеличению). Они являются надежной и безопасной альтернативой специальным искусственным добавкам и консервантам. Бактериальные препараты рекомендуются к использованию, как в новых разработанных технологиях, так и в традиционных технологиях колбас и деликатесной мясной продукции, не требующих изменений, и позволяют получить продукты с заданным комплексом качественных характеристик и гарантированным уровнем безопасности.

Рекомендации к использованию бактериальных препаратов в мясной промышленности и их практическая реализация представлены в табл. 10.

Таблица 10

Рекомендации к использованию бактериальных препаратов в мясной промышленности

Наименование бакпрепарата	Практическая реализация
Экспериментально-промышленный выпуск бактериальных препаратов осуществлялся на производственных мощностях экспериментального участка ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии
Бактериальный препарат Биоцвет ТУ 9229-047-02068640-07	Для цветообразования и снижения остаточного нитрита натрия. При посоле мясного сырья в вакуум-мешалках непрерывного действия при температуре 8Ц12 С. Продолжительность выдержки сырья в посоле зависит от степени его измельчения, от 12 до 24 ч. Нитрит натрия добавляют в количестве 3 г на 100 кг мясного сырья в виде раствора концентрацией не выше 2,5%. Бактериальный препарат добавляют в количестве 100 г/100 кг. Промышленная апробация технологии вареной колбасы с использованием б/п Биоцвет в условиях  ОАО ИКМА.
Бактериальный препарат Дебарс плюс ТУ 9229-046-02068640-07	При биотрансформации мясного сырья, в т.ч. нестандартного, с высоким содержанием соединительной ткани. При производстве ферментированных мясных продуктов, сыровяленых и сырокопченых колбас, ветчинных изделий с поверхностным покрытием дрожжей и благородный плесеней. Промышленная апробация при производстве с/в колбасы Московская в условиях ЗАО Микояновский мясокомбинат. Колбасы сырокопченые, ТУ 9213-007-224-68-005-08, колбасы сыровяленые, ТУ 9213-008-224-68-005-08, апробация в условиях ООО АНСЕЙ ВМК.
Бактериальный препарат Аромалакт ТУ 9229-045-02068640-07	Для ароматообразования мясного сырья и готовых мясных изделий. Апробация технологии паштетов в оболочке в промышленных условиях ЗАО Агрофирма Мясо. Технологическая инструкция по применению б/п при вакуумном упаковывании мясопродуктов на ООО МПЗ Рублевский. Опытно-промышленная выработка продуктов из свинины цельномышечных  в составе рассола для шприцевания (ООО Гиперглобус). Колбасы сырокопченые, ТУ 9213-007-224-68-005-08, колбасы сыровяленые, ТУ 9213-008-224-68-005-08, апробация в условиях ООО АНСЕЙ ВМК. Продукты из свинины деликатесные, ТУ 9213-007-02068315-08.
Бактериальный препарат Лактомикс ТУ 9229-045-02068640-07	Технология полуфабрикатов мясных рубленых с бактериальным препаратом Лактомикс, ТУ 9214-350-23476484-08, позволяющая снизить окислительную порчу липидов; апробация в опытно-промышленных условиях ВНИИПП. Разработаны технологии Мясные продукты в форме 1 сорта с добавлением биотрансформированного легкого, ТУ 9213-002-51611136-03 и Паштеты в оболочке с добавлением биотрансформированной селезенки, ТУ 9213-002-00423769-03. Промышленная апробация разработанных технологий проводилась в условиях Ростовского и Новочеркасского мясокомбинатов. Опытно-промышленная выработка продуктов из свинины цельномышечных в составе рассола для шприцевания в условиях ООО Гиперглобус. Колбасы сырокопченые, ТУ 9213-007-224-68-005-08, колбасы сыровяленые,  ТУ 9213-008-224-68-005-08, апробация в условиях ООО АНСЕЙ ВМК. Продукты из свинины деликатесные, ТУ 9213-007-02068315-08.
Бактериальный препарат Биосейф ТУ 9229-045-02068640-07	Для снижения уровня биогенных аминов в ходе технологического процесса и хранения. Промышленная апробация при производстве с/к колбасы Столичная в условиях ЗАО Микояновский мясокомбинат; с/к колбасы Премьера в условиях ЗАО Партнер-Ф, ОАО Царицыно. Технологическая инструкция по применению б/п при вакуумном упаковывании охлажденного мясного сырья и натуральных п/ф на ООО МПЗ Рублевский. Опытно-промышленная выработка продуктов из свинины цельномышечных в составе рассола для шприцевания в условиях ООО Гиперглобус. Колбасы сырокопченые, ТУ 9213-007-224-68-005-08, колбасы сыровяленые,  ТУ 9213-008-224-68-005-08, апробация в условиях ООО АНСЕЙ ВМК. Продукты из свинины деликатесные, ТУ 9213-007-02068315-08.

ВЫВОДЫ

1. Разработана схема направленного отбора молочнокислых бактерий, денитрифицирующих стафилококков, дрожжей и мицелиальных грибов. Установлено, что ни один из штаммов P. camembertii не продуцирует характерные для данного вида микотоксины: ЦПК и ругуловазины А и В. Создана коллекция стартовых культур, содержащая микроорганизмы видов L. curvatus, L. sakei, L. casei, L. plantarum, P. acidilactici, P. pentosaceus, P. claussenii, M. caseolyticus, S. carnosus, S. xylosus, D. vanriji, D. polymorphus, D. hansenii, C. famata, P. camembertii. Проведено депонирование, в том числе национальное патентное, штаммов стартовых культур во ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов.

2. Проведена оценка возможности использования энтерококков в качестве стартовых культур. Исследования на тестовых питательных средах показали отсутствие факторов вирулентности у штаммов E. faecalis. Поиск генов, отвечающих за признаки патогенности энтерококков, agg, gelE, cylA и esp, показал присутствие генов agg и gelE в геномах исследуемых штаммов E. faecalis, хотя и не проявляющих свою активность фенотипически. Предложен подход к изучению и отбору непатогенных стартовых культур энтерококков.

3. Определено отношение стартовых культур к антибиотикам различных групп, проведен анализ природы антибиотикоустойчивости с оценкой ее потенциальной опасности в плане горизонтального переноса. Предложены пути предотвращения распространения детерминантов антибиотикоустойчивости промышленными микроорганизмами.

4. Расшифрованы механизмы формирования качественных характеристик мясопродуктов за счет внесения стартовых культур, и определены основные критерии промышленно-ценных свойств микроорганизмов. Разработаны экспресс-методы скрининга штаммов с аминоксидазной активностью, ароматобразующих штаммов с глутаматдегидрогеназной и трансаминазной активностью, предложен экспресс-метод отбора бактериоцин-синтезирующих штаммов. Проведен скрининг продуцентов бактериоцинов, ароматобразующих штаммов и штаммов с низкой декарбоксилазной активностью, выбраны штаммы с аминоксидазной активностью, снижающие содержание БА в мясных продуктах. Определены стартовые культуры с каталазной, пероксидазной, супероксиддисмутазной активностями и способные связывать Fe2+ и Cu2+. Разработан системный подход направленного отбора и оптимизации свойств бактерий, позволяющий управлять технологическими процессами производства мясных продуктов.

5. Предложены принцип и схемы конструирования штаммов с заданными свойствами:  Схема получения суперэкспрессии гена Y и Схема получения делеции участка ДНК, кодирующего ген Y. Определены генетические детерминанты, ответственные за проявление основных технологических свойств у стартовых культур: tdc гены у штаммов L. sakei 101, 103, 105, образующие биогенные амины выше допустимого уровня, gdh гены, кодирующие фермент глутаматдегидрогеназу, sodA гены - супероксиддисмутазу, nirR гены - нитритредуктазу у микроорганизмов различных таксонов. Изучена генетика продуцирования бактериоцинов и определена их генетическая локализация у педиококков: у P. acidilactici 27 и 38 - плазмидная, у P. pentosaceus 23, 28, 55 - хромосомная. Предложены пути повышения синтеза бактериоцинов стартовыми культурами.

6. Изучена генетическая природа бактериальной денитрификации. Сконструирован термочувствительный челночный вектор pBTmcs для репликации в грамположительных бактериях. Получен мутантный штамм S. carnosus (thyAЦ) на основе штамма S. carnosus B-8953. Клонирован и использован селективный маркер - ген, кодирующий фермент тимидилат синтетазу. Сконструирована экспрессионная плазмида для грамположительных бактерий, включающая сильный промотор Pgap. С помощью генетических преобразований путем замены промоторной области гена nirR на сильный промотор Pgap на основе штамма S. carnosus (thyAЦ) получен штамм-суперпродуцент фермента нитритредуктазы S. carnosus LIA-96. Молекулярно-генетическая экспертиза установила, что штамм не является генетически модифицированным, так как был получен путем перестройки собственного генетического материала без включения в его состав чужеродной ДНК. Показана фенотипическая и генотипическая стабильность штамма, а также отсутствие в геноме данного штамма генов, кодирующих белки-токсины. Проведены клинические исследования штамма S. carnosus LIA-96 in vivo на белых линейных мышах, показавшие отсутствие изменений у подопытных животных, по сравнению с контрольными и интактными.

7. Научно и экспериментально обоснована методология создания бактериальных препаратов на основе стартовых культур по совокупности функциональных свойств микроорганизмов, обладающих взаимной совместимостью. Проведена паспортизация промышленно-ценных штаммов с помощью геномной дактилоскопии. Создана программа с базой данных основных функциональных свойств микроорганизмов, входящих в коллекцию МГУПБ, позволяющая проектировать состав бактериальных препаратов комплексной направленности. На основе природных штаммов разработаны бактериальные препараты: Лактомикс, Аромалакт, Биосейф, ТУ 9229-045-02068640-07; Дебарс плюс, ТУ 9229-046-02068640-07. На основе штамма S. carnosus LIA-96 разработан бактериальный препарат Биоцвет, ТУ 9229-047-02068640-07.

8. Проведена оценка влияния стартовых культур на качественные характеристики модельных мясных систем и готовых мясных продуктов, подтвердившая их функциональную эффективность. Разработаны рецептуры и технологии новых видов мясопродуктов: Мясные продукты в форме первого сорта с добавлением биотрансформированного легкого, ТУ 9213-002-51611136-03, Паштеты в оболочке с добавлением биотрансформированной селезенки, ТУ 9213-002-00423769-03, Полуфабрикаты мясные рубленые с бактериальным препаратом Лактомикс, ТУ  9214-350-23476484-08, Колбасы сырокопченые, ТУ 9213-007-224-68-005-08, Колбасы сыровяленые, ТУ 9213-008-224-68-005-08, Продукты из свинины деликатесные, ТУ 9213-007-02068315-08. Промышленная апробация разработанных технологий проводилась в условиях Черкизовского МПЗ, ЗАО Микояновский мясокомбинат, ОАО Царицыно, ООО МПЗ Рублевский, ОАО ИКМА, ООО АНСЕЙ ВМК, Ростовского и Новочеркасского мясокомбинатов, ЗАО Агрофирма Мясо, ООО Гиперглобус.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

Монография

1. Машенцева Н.Г. Функциональные стартовые культуры в мясной промышленности / Н.Г. Машенцева, В.В. Хорольский - М.: ДеЛи принт, 2008. - 335 с.

Учебные пособия

1. Хорольский В.В. Ферментация и лиофилизация микроорганизмов для создания безопасных технологий биотрансформации мясного сырья и производства мясопродуктов / В.В. Хорольский, Л.Ф. Митасева, А.Н. Габараев, Н.Г. Машенцева и др. // Лабораторный практикум для студентов специальности 270900 - Технология мяса и мясных продуктов. - М.: МГУПБ, 2003. - 75 с.
2. Хорольский В.В. Изучение функционально-технологических свойств стартовых культур, используемых в мясной промышленности: методические указания / В.В. Хорольский, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, И.А. Лаптев, Е.А. Баранова. - М.: МГУПБ, 2008. - 44 с.
3. Хорольский В.В. Выделение и идентификация бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов для использования в производстве ферментированных мясных продуктов: лабораторный практикум / В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, И.А. Лаптев, А.И. Семенышева - М.: МГУПБ, 2008. - 79 с.

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Титов Е.И. Изменение аминокислотного состава мясного сырья / Е.И. Титов, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, С.В. Костров, И.В. Демидюк // Пищевая промышленность. - 2004. - № 11. - С. 82Ц83.
2. Хорольский В.В. Влияние молочнокислых микроорганизмов на вкусоароматические характеристики паштетов / В.В. Хорольский, Л.Ф. Митасева, Т.А. Мишарина, Н.Г. Машенцева, А.А. Калиновский, В.В. Ведерников // Мясная индустрия. - 2004. - № 3. - С. 29Ц31.
3. Хорольский В.В. Биотехнологические аспекты повышения безопасности мясных продуктов / В.В. Хорольский, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, А.Г. Бучинская // Все о мясе. - 2004. - № 3. - С. 23Ц24.
4. Блинкова Л.П. Биотехнологические условия синтеза бактериоцинов / Л.П. Блинкова, Н.Г. Машенцева, В.В. Хорольский, О.Б. Горобец, Е.С. Дорофеева // Микробиология. - 2006. Ц№ 2. - С.83Ц89.
5. Хорольский В.В. Молочнокислые микроорганизмы в технологии мясных продуктов / В.В. Хорольский, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, А.Г. Бучинская // Мясная индустрия. - 2006. - № 6. - С. 34Ц38.
6. Машенцева Н.Г. Антибиотикоустойчивость промышленных микроорганизмов как современная проблема безопасности / Н.Г. Машенцева, С.А. Шевелева, С.П. Синеокий // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2006. - № 9. - С. 56Ц62.
7. Хорольский В.В. Применение дрожжей и мицелиальных грибов в составе стартовых культур для интенсификации производства мясопродуктов / В.В. Хорольский, А.Н. Габараев, Н.Г. Машенцева, М.А. Лобач, О.В. Семина, Н.Г. Винокурова // Мясная индустрия. - 2006. - № 9. - С. 32Ц34.
8. Машенцева Н.Г. Скрининг аминонегативных стартовых бактериальных культур для их использования в мясной промышленности / Н.Г. Машенцева, В.В. Хорольский, С.П. Синеокий, Ю.А. Рыбаков, Е.Д. Барсуков, С.А. Антонова, А.Г. Бучинская // Биотехнология. - 2006. - № 5. - С 70Ц77.
9. Машенцева Н.Г. Скрининг молочнокислых микроорганизмов-продуцентов бактериоцинов, перспективных для использования в мясной промышленности / Н.Г. Машенцева, В.В. Хорольский, С.П. Синеокий, Е.С. Дорофеева, А.Г. Бучинская, А.А. Каниковская // Биотехнология. - 2006. - № 6. - С. 37Ц43.
10. Хорольский В.В. Исследование аминоксидазной активности молочнокислых микроорганизмов / В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, О.В. Семина, Е.А. Баранова, А.А. Осанова, Е.Д. Барсуков, С.В. Антонова // Мясная индустрия. - 2007. - № 5. - С. 56Ц58.
11. Машенцева Н.Г. Стартовые культуры как альтернатива искусственным антиоксидантам / Н.Г. Машенцева, В.В. Хорольский, Л.Ф. Митасева, А.И. Семенышева, С.В. Абинскова, В.Н. Леонова // Мясная индустрия. - 2007. - № 11. - С. 26Ц28.
12. аптев И.А. Получение высококачественных мясных изделий, не содержащих остаточного нитрита натрия / И.А. Лаптев, Н.Г. Машенцева, В.В. Хорольский, С.П. Синеокий, А.И. Семенышева // Мясная индустрия. - 2007. - № 12. - С. 25Ц28.
13. Машенцева Н.Г. Идентификация стартовых культур, используемых в мясной промышленности / Н.Г. Машенцева // Все о мясе. - 2007. - № 6. - С. 11Ц12.
14. Машенцева Н.Г. Создание функциональных бактериальных препаратов для мясной промышленности / Н.Г. Машенцева // Мясная индустрия. - 2008. - № 1. - С. 26Ц29.
15. Машенцева Н.Г. Функциональные стартовые культуры - новые перспективы в мясной промышленности: обзор / Н.Г. Машенцева // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2008. - № 2. - С. 67Ц71.
16. Машенцева Н.Г. Образование ароматических соединений стартовыми культурами, используемыми в мясной промышленности / Н.Г. Машенцева // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2008. - № 3. - С. 32Ц35.
17. Машенцева Н.Г. Создание бактериальных препаратов для мясной промышленности / Н.Г. Машенцева // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2008. - № 7. - С. 62Ц65.

Статьи в других изданиях

1. Патент № 2216203 Российская Федерация.  Способ получения биологически полноценного белкового композита / В.А. Княжев, В.А. Тутельян, И.А. Рогов, Н.Г. Машенцева и др. - заявл. 07.12.2001; опубл. 20.11.2003. Бюл. № 32. - 7 с.
2. Рогов И.А. Получение белкового композита на основе биотрансформированного коллагенсодержащего мясного сырья и его использование в производстве вареных колбас / И.А. Рогов, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, А.Г. Бучинская // Пища. Экология, Человек: Материалы пятой международно-технической конференции. М.: МГУПБ, 2003. - С. 42Ц43.
3. Хорольский В.В. Современные подходы к идентификации и изучению свойств микроорганизмов мясной промышленности / В.В. Хорольский, А.Н. Габараев, Н.Г. Машенцева, А.А. Калиновский, А.Г. Бучинская // Международная конференция Биотехнологические процессы переработки сельскохозяйственного сырья: Сборник докладов. М.: ВНИИМП, 2002. - С. 45Ц48.

4. Хорольский В.В. Переработка вторичных сырьевых ресурсов с помощью генетически идентифицированных микроорганизмов / В.В. Хорольский, А.Н. Габараев, Н.Г. Машенцева, Д.В. Ким // Современные технологии переработки животноводческого сырья в обеспечении здорового питания: наука, образование и производство: Международная научно-техническая конференция. - Воронеж, 2003. - С. 403Ц404.
5. Вахитова О.С. Селекция штаммов микроорганизмов для их использования в мясной промышленности / О.С. Вахитова, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы II Международной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2003. - С. 58Ц61.
6. Рогов И.А. Применение метода сохранения диагностических свойств для их использования в биотехнологии мясопродуктов / И.А. Рогов, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева и др. // Технологии живых систем: Материалы научно-технической конференции. М.: МГУПБ, 2003. - С. 91Ц95.
7. Хорольский В.В. Разработка технологии пищевых продуктов на основе нестандартного сельскохозяйственного сырья консорциумами микроорганизмов / В.В. Хорольский, Л.Ф. Митасева, А.Н. Габараев, Н.Г. Машенцева, Д.В. Ким // Пища. Экология, Человек: Материалы пятой международно-технической конференции. М.: МГУПБ, 2003. - С. 55Ц56.
8. Хорольский В.В. Идентификация микроорганизмов, используемых в мясной промышленности / В.В. Хорольский, А.Н. Габараев, Н.Г. Машенцева, Д.В. Ким, О.С. Вахитова  // Пища. Экология, Человек: Материалы пятой международно-технической конференции. М.: МГУПБ, 2003. - С. 121Ц122.
9. Хорольский В.В. Современные аспекты переработки вторичного сырья мясной промышленности / В.В. Хорольский, А.Н. Габараев, Н.Г. Машенцева, А.Г. Бучинская // Технологии и техника пищевых производств: Итоги и перспективы развития на рубеже XX и XI веков, С-Петербург, СПГУНиПТ, Сборник 300, 2003. - С. 56Ц60.
10. Хорольский В.В. Перспективы применения штаммов молочнокислых бактерий, продуцирующих бактериоцины, в мясной промышленности / В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, О.С. Вахитова // Технологии, оборудование и компоненты для производства мясных продуктов здорового питания: Научно-практический семинар. - Вологда, 2004. - С. 62Ц64.
11. Хорольский В.В. Оценка декарбоксилазной активности микроорганизмов, образующих биогенные амины в ферментированных мясопродуктах / В.В. Хорольский, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, А.А. Ярмонов // Технологии, оборудование и компоненты для производства мясных продуктов здорового питания: Научно-практический семинар, Вологда, 2004. - С. 64Ц67.
12. Хорольский В.В. Изучение возможности создания высокоэффективного штамма-продуцента фермента нитритредуктазы / В.В. Хорольский, С.П. Синеокий, Н.Г. Машенцева, Т.В. Юзбашев, И.А. Лаптев // Технологии, оборудование и компоненты для производства мясных продуктов здорового питания: Научно-практический семинар, Вологда, 2004. - С. 67Ц69.
13. Хорольский В.В. Обеспечение бактериоцинами безопасного протекания микробиологических процессов в мясных продуктах / В.В. Хорольский, Машенцева Н.Г. Вахитова О.С. // Адаптация к условиям АПК РФ общей методологии отслеживания и интегрированного контроля качества и безопасности мясных продуктов. Часть II: Доклады 7-й Международной научной конференции памяти В.М. Горбатова. - М.: ВНИИМП, 2004. - С. 229Ц232.
14. Хорольский В.В. Биотехнологические аспекты повышения безопасности мясных продуктов / В.В. Хорольский, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева // Адаптация к условиям АПК РФ общей методологии отслеживания и интегрированного контроля качества и безопасности мясных продуктов. Часть II: Доклады 7-й Международной научной конференции памяти В.М. Горбатова. - М.: ВНИИМП, 2004. - С. 232Ц236.
15. Хорольский В.В. Возможность создания высокоэффективного штамма - продуцента фермента нитритредуктазы / В.В. Хорольский, С.П. Синеокий, Н.Г. Машенцева, Т.В. Юзбашев, И.А. Лаптев // Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК. - М.: Пищепромиздат, 2004. - С. 38Ц43.
16. Хорольский В.В. Идентификация молочнокислых микроорганизмов для их использования в мясной промышленности / В.В. Хорольский, С.П. Синеокий, Н.Г. Машенцева, В.В. Самсонов, С.А. Самсонова, О.С. Вахитова // Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК. - М.: Пищепромиздат, 2004. - С. 48Ц54.
17. Хорольский В.В. Влияние ферментативной активности молочнокислых микроорганизмов, используемых для биотрансформации вторичного мясного сырья / В.В. Хорольский, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, А.Г. Бучинская, А.А. Калиновский // Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК. - М.: Пищепромиздат, 2004. - С. 163Ц168.
18. Машенцева Н.Г. Влияние молочнокислых микроорганизмов на структурно-механические свойства низкосортного мясного сырья / Н.Г. Машенцева, В.В. Ведерников, Д.А. Светлаков, М.В. Маркина // Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК. - М.: Пищепромиздат, 2004. - С. 294Ц297.
19. Хорольский В.В. Идентификация дрожжей и грибов, используемых в мясной промышленности / В.В. Хорольский, М.М. Вустин, А.Н. Габараев, Н.Г. Машенцева, О.С. Вахитова  // Качество и безопасность сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов: Научно-практическая конференция. Углич, ВНИИМС, изд. Россельхозакадемия, 2004, Ч. II. - С. 230Ц235.
20. Рогов И.А. Разработка технологий синбиотического лиофилизированного бакпрепарата для производства мясопродуктов / И.А. Рогов, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, Д.В. Ершов // Технологии живых систем: Материалы научно-технической конференции. М.: МГУПБ, 2004. - С. 78Ц82.
21. Бучинская А.Г. Получение новых видов молочнокислых микроорганизмов для использования их в мясной промышленности / А.Г. Бучинская, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы III Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2004. - С. 80Ц84.
22. Дорофеева Е.С. Практическое использование бактериоцинов в мясной промышленности / Е.С. Дорофеева, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы III Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2004. - С. 85Ц89.
23. Ярмонов А.А. Роль стартовых бактериальных культур в формировании биогенных аминов в ферментированных продуктах питания / А.А. Ярмонов, В.В. Хорольский, А.Н. Габараев, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы III Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2004. - С. 96Ц100.
24. Хорольский В.В. Изучение декарбоксилазной активности у стартовых баккультур, используемых в мясной промышленности / В.В. Хорольский, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, А.Г. Бучинская // Научное обеспечение инновационных процессов в мясоперерабатывающей отрасли: 8-я Международная конференция памяти В.М. Горбатова. - Москва, 2005. - 2 т, Т 2. ЦС. 54Ц57.
25. Бучинская А.Г. Использование биотрансформированного вторичного мясного сырья в технологии вареных колбас  / А.Г.  Бучинская, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы V Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2006. - С. 27Ц29.
26. Абинскова С.В. К вопросу использования антиоксидантов микробного происхождения в производстве мясопродуктов / С.В. Абинскова, А.И. Семенышева, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы V Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2006. - С. 44Ц45.
27. Абрамова Е.К. Оценка антибиотикоустойчивости стартовых культур в аспекте современной проблемы безопасности / Е.К. Абрамова, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы V Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2006. - С. 67Ц69.
28. Антоненко О.Ю. Формирование вкуса и аромата ферментированных мясопродуктов стартовыми культурами. / О.Ю. Антоненко, О.О. Бурина, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева //  Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы V Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2006. - С. 105Ц107.
29. Баранова Е.А. Использование стартовых бактериальных культур для понижения уровня биогенных аминов в мясных продуктах / Е.А. Баранова А.А. Осанова, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы V Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2006. - С. 155Ц157
30. аптев И.А. Создание высокопродуктивного штамма фермента нитритредуктазы для улучшения цветообразования мясных продуктов / И.А. Лаптев, В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы V Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2006. - С. 197Ц199.
31. Патент № 2329304 Российская Федерация. Способ определения декарбоксилазной активности / В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, О.В. Семина, Е.А. Баранова, А.А. Осанова - заявл. 10.01.2007; опубл. 20.07.2007. Бюл. № 26. - 9 с.
32. Патент № 2333975 Российская Федерация. Способ конструирования рекомбинантного штамма Staphylococcus carnosus / В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, И.А. Лаптев - заявл. от 20.02.2007; опубл. 20.09.2008. Бюл. № 26. - 11 с.
33. Заявка на патент № 2007146645/13(051136) Российская Федерация. Препарат бактериальный для производства ферментированных мясных изделий / В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, Е.А. Баранова, А.И. Семенышева, А.А. Васильченко - заявл. от 19.12.2007. - 7 с.
34. Хорольский В.В. Использование биотехнологических процессов в современном производстве вареных колбас / В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, А.Г. Бучинская // Мясные технологии. - 2007. - № 11 - С.42Ц48.
35. Хорольский В.В. Влияние стартовых культур на уровень биогенных аминов в мясных продуктах / В.В. Хорольский, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, Е.А. Баранова, А.А Осанова., О.В. Семина // Сборник докладов 10-й Международной конференции памяти В.М. Горбатова. Актуальные проблемы мясной промышленности: инновации, качество, управление. - Москва, 2007. - С. 154Ц157.
36. Машенцева Н.Г. Технологическая инженерия денитрифицирующих стартовых культур, используемых в мясной промышленности / Н.Г. Машенцева, И.А. Лаптев, В.В. Хорольский, С.П. Синеокий // Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях. - М.: Пищепромиздат, 2008. - 267 с. - С. 39Ц45.
37. Титов Е.И. Комплексный подход к разработке отечественных бактериальных препаратов для мясной промышленности / Е.И. Титов, В.В. Хорольский, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, Е.А. Баранова, А.А. Васильченко, А.И. Семенышева // Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях. - М.: Пищепромиздат, 2008. - 267 с. - С. 209Ц215.

Основные тезисы, отражающие суть работы

1. Хорольский В.В. Использование ПЦР-диагностики для определения штаммоспецифической характеристики культур, используемых в мясной промышленности / В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, А.А. Калиновский // Международная научно-практическая конференция Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования: Тезисы докладов. М.: 2002. - С. 22.
2. Хорольский В.В. Идентификация микроорганизмов, используемых в мясной промышленности / В.В. Хорольский, Н.Г. Машенцева, А.А. Калиновский // 1-ый Международный конгресс Биотехнология - состояние и перспективы развития: Тезисы докладов. М.: 2002. - С. 331.
3. Машенцева Н.Г. Использование биотрансформированного сырья в производстве вареных колбас / Н.Г. Машенцева, В.В. Хорольский, Л.Ф. Митасева, А.Г. Бучинская // II Московский международный конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития, 10Ц14 ноября 2003 г. - С. 118.
4. Хорольский В.В. Селекция микроорганизмов для использования в продуктах питания с функциональными свойствами / В.В. Хорольский, С.П. Синеокий, Н.Г. Машенцева, С.А. Самсонова и др. // Международная конференция Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы. Москва 2Ц4 июня 2004. - 242 с. - С. 36.
5. Хорольский В.В. Создание безопасных мясопродуктов с использованием пробиотических культур / В.В  Хорольский., С.П. Синеокий, Н.Г. Машенцева, ЮА. Рыбаков, И.А. Лаптев // Международная конференция Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы. Москва 2Ц4 июня 2004. - 242 с. - С. 200.
6. Дорофеева Е.С. Изучение возможности использования молочнокислых микроорганизмов - продуцентов бактериоцинов в мясной промышленности / Е.С. Дорофеева, Н.Г. Машенцева, В.В. Хорольский, Л.П. Блинкова // 3-ый Международный конгресс Биотехнология - состояние и перспективы развития: Тезисы докладов. М.: 2005. - С. 98.
7. аптев И.А. Создание штамма-суперпродуцента для снижения остаточного нитрита натрия в мясных изделиях / И.А. Лаптев, В.В. Хорольский, С.П. Синеокий, Н.Г. Машенцева // 3-ый Международный конгресс Биотехнология - состояние и перспективы развития: Тезисы докладов. М.: 2005. - С. 123.
8. Баранова Е.А. Изучение молочнокислых микроорганизмов, продуцентов бактериоцинов / Е.А. Баранова, В.В. Хорольский, Л.П. Блинкова, Н.Г. Машенцева, Е.С. Дорофеева // материалы Четвертого Московского международного конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 12Ц16 марта, 2007 г.) М.: ЗАО Экспо-биохим-технологии, РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2007 - часть 2. - С. 154.
9. Синеокий С.П. Пути предотвращения распространения антибиотикоустойчивости промышленными микроорганизмами / С.П. Синеокий, С.А. Шевелева, Б.С. Народицкий, Н.Г. Машенцева // Региональная конференция Международной молочной федерации Кисломолочные продукты - технологии и питание, Москва, 17 мая 2007. - С. 352.

       Автор выражает искреннюю благодарность всем коллегам за помощь в проведении экспериментов и обсуждение результатов работы.

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по техническим специальностям