Geum.ru
Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по сельскому хозяйству  

На правах рукописи

Киль Владимир Ильич

Теоретическое обоснование и практическое   использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредитеей и оценке трансгенных растений на биобезопасность

Специальность: 06.01.07- защита растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Краснодар,  2010

Работа выполнена в государственном научном учреждении - Всероссийском научно-исследовательском институте биологической  защиты  растений Россельхозакадемии (ВНИИБЗР) в 2001-2010 гг.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

Волчков Юрий Андреевич

доктор биологических наук,

Мироненко Нина Васильевна

доктор биологических наук,

Антонова Татьяна Сергеевна

Ведущая организация:  ГНУ Краснодарский  научно-исследовательский институт им. П.П. Лукьяненко

Защита состоится 27  октября  2010 г.  в 9.00 часов  на заседании  диссертационного совета ДМ  220.038.06 при  ФГОУ ВПО Кубанский государственный аграрный  университет по адресу:  350044,  г.Краснодар,  ул. Калинина, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО Кубанский государственный  аграрный университет, с авторефератом - на сайте ВАК: referat_vak@obrnadzor.gov.ru

Автореферат разослан и размещен на сайте л июля  2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, 

профессор Горьковенко В.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Для успешного осуществления программ защиты сельскохозяйственных растений от вредных членистоногих необходимо изучение  биологии и генетики популяций как вредных, так и полезных насекомых. Это включает в себя знание генетической структуры популяций, миграционных процессов (динамики), акклиматизации, поведенческих реакций, условий размножения, отношения полов и трофических связей.

Значительный  прогресс  в этом отношении был достигнут в 50-60-е годы прошлого столетия, благодаря использованию классических генетических принципов и подходов.  Изучение  популяционных процессов насекомых исследователи проводили, главным образом, с помощью видимых и хорошо различимых фенотипических маркеров (морфологических и фенетических) таких, как цвет глаз, полосы и пятна, волоски или шипы на теле особи. Это приблизило ученых  к  пониманию закономерностей распространения насекомых, их поведенческих реакций, включая половые отношения, и наследования отдельных генов, контролирующих те или иные признаки [Behura, 2006].

Использование молекулярно-генетических подходов, начиная с белковых маркеров в 1970-х годах, главным образом изоферментов и позже ДНК-маркеров, во многом способствовало более глубокому пониманию исследуемых закономерностей в популяциях насекомых. Большинство ДНК-маркеров,  используемых сегодня - это продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР). ДНК-маркеры  позволяют анализировать и объяснять популяционные процессы  там, где этого не могут сделать никакие другие методы исследований.  Использование ДНК-маркеров необходимо для анализа структуры популяций как полезных насекомых - паразитов и хищников, так и вредителей. Кроме того, они могут использоваться для целей таксономии и филогении [Roehrdanz, Flanders, 1993; Mitchell et al., 2006]. С их помощью можно разделить таксоны насекомых, т.е. биотипы, подвиды, близкородственные виды, а также виды-двойники, т.е.  виды, которые трудно различить морфологически или каким-то другим способом [Mitchell et al., 2005, Mitchell, Samways, 2005; Silva-Brandao et al., 2008].

Несмотря на столь широкие возможности ДНК-маркеров, в нашей стране  в генетических исследованиях популяций вредителей преобладает использование морфологических и фенетических маркеров. На их основе исследователи продолжают изучать динамику, поведенческие  реакции  и  строят прогнозы  о  развитии резистентности насекомых к инсектицидам, главным образом для сельскохозяйственно значимых вредителей [Фасулати, Вилкова, 2000; Сухорученко, 2001, 2005; Король, Новосельская, 2001; Беньковская и др, 2004; Ростовцева, 2005].

Несмотря на то, что фенетические маркеры просты для использования и часто проявляются на протяжении всего жизненного цикла организма, они  имеют ряд существенных недостатков. Основными ограничениями их использования является то, что хорошо различимые фены относительно редки и встречаются далеко не у всех видов насекомых. Проблема идентификации вида по морфологическим признакам в отдельных случаях значительно затрудняется из-за существования видов-двойников. Кроме того, модификационная изменчивость фенетических маркеров, как правило,  весьма значительна,  что  затрудняет  оценку  и  прогноз  динамики популяционных процессов.  Более того, идентификация  таких  маркеров  должна базироваться на знании их генетического контроля и того, как  гены, контролирующие этот признак, наследуются в потомстве.

Использование для этих целей современных методов молекулярно-генетического анализа, в частности ПЦР-метода и полученных на его основе ДНК-маркеров,  может  во  многом  способствовать  решению  этих  проблем.  Важно отметить, что использование ДНК-маркеров не умаляет применения фенетических и других морфологических критериев в практике защиты растений от вредителей, но лишь дополняет их и расширяет возможности для популяционных исследований видов насекомых, не имеющих четких фенетических признаков, позволяет повысить точность мониторинга и прогноза. Кроме того, с использованием ДНК-маркеров появляется возможность проследить динамику отдельных генетических элементов,  отдельных хромосомных локусов, генов и аллелей генов в популяциях, оценить гетерозиготность, гетерогенность и сходство популяций непосредственно на генетическом уровне и другие параметры, которые  невозможно оценить с помощью морфологических критериев.

Таким образом, сегодня исследователям недостает точных методов анализа и прогноза в популяциях вредных и полезных насекомых для целей мониторинга и защиты. Существует также недостаток знаний о молекулярно-генетической структуре популяций насекомых и закономерностях ее изменчивости под влиянием стрессовых факторов внешней среды. В этой связи данные  исследования, несомненно, актуальны и представляют интерес для практики  защиты растений от вредных насекомых.

В то же время многие эксперты по сельскому хозяйству считают, что проблема нехватки продовольствия не может быть решена без применения ДНК-технологий и в частности генной инженерии. Генетическая инженерия по сути продолжает направление традиционной селекции по улучшению  генотипов полезных растений, но  достигает  той  же  цели  более эффективным и быстрым  путем. На сегодняшний день генетическая инженерия уже располагает большим  арсеналом знаний и методов для эффективного переноса полезных генов из одних организмов в другие [Романов, 2000]. На этой основе уже созданы многие сорта трансгенных или генетически-модифицированных растений (ГМР)  и некоторые виды ГМ-насекомых, которые  нашли применение в мировой практике  защиты сельскохозяйственных растений от вредителей. Однако их использование в нашей стране  и  в  частности ГМ-растений сдерживается недостаточным изучением вопросов их экологической безопасности.

В этой связи данные исследования также актуальны и могут найти свое отражение в практике защиты растений на этапе предрегистрационных  испытаний и пострегистрационного мониторинга ГМР и продукции на их основе.

Цель и задачи исследований. Основной целью исследований являлось теоретическое обоснование применения молекулярно-генетических методов в практике защиты сельскохозяйственных растений от вредных насекомых и оценке трансгенных Bt-защищенных растений на экологическую безопасность и на этой основе разработка новых методов мониторинга популяций вредителей и трансгенов.

Для достижения цели исследований были поставлены следующие задачи:

  1. Разработать новые системы описания феноформ рисунка и окраски имаго колорадского жука и клопа вредная черепашка.
  2. Изучить ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие популяций колорадского жука, клопа вредная черепашка, картофельной минирующей моли, хлопковой совки и яблонной плодожорки по RAPD-, ISSR- и SSR-маркерам.
  3. Изучить влияние инсектицидов, географического положения и условий года на фенетическую, молекулярно-генетическую структуру и генетическое разнообразие популяций насекомых-вредителей.
  4. Выявить фенетические и ДНК-маркеры резистентности вредителей к инсектицидам и Bt-картофелю и на этой основе разработать новые методы мониторинга резистентности вредных насекомых.
  5. Усовершенствовать методы детекции и количественной оценки  трансгенов в биоматериале.
  6. Оценить риск вертикального переноса генов для ГМ-картофеля и кукурузы.
  7. Оценить пролонгированное влияние трансгенного (Bt) картофеля,  устойчивого к колорадскому жуку, на нецелевые виды насекомых, а именно на молекулярно-генетическую структуру и генетическое разнообразие популяции картофельной минирующей моли, а также на жизнеспособность насекомых.

Научная новизна.

  • Разработаны новые системы описания рисунка и окраски имаго колорадского жука и клопа вредная черепашка.
  • Выявлены закономерности изменчивости  фенетической структуры популяций насекомых под влиянием инсектицидов и других стрессовых факторов внешней среды. Показано, что чувствительность различных фенетических групп насекомых к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций, как считалось ранее, но в первую очередь определяется  соотношением внутрипопуляционных групп насекомых, имеющих неспецифическую устойчивость к различным стрессам.
  • Выявлена высокая модификационная изменчивость фенетической структуры популяций клопа вредная черепашка, что ограничивает возможность использования фенетических маркеров при мониторинге резистентности этого  вредителя к инсектицидам.
  • По данным молекулярно-генетических исследований показано генетическое сходство клопа вредная черепашка с другими представителями семейства Pentatomidae, что, по-видимому, указывает на принадлежность этого вида клопов  скорее  к семейству Pentatomidae, чем к Scutelleridae.
  • Предложен новый подход к отбору резистентных к инсектицидам насекомых для поиска ДНК-маркеров резистентности у моновольтинных видов насекомых. Новизна предлагаемого подхода заключается в том, что он не требует проведения многоступенчатого, в ряду нескольких поколений, процесса  селекции и отбора особей, резистентных к инсектициду. Выявлены ДНК-маркеры  резистентности клопа вредная черепашка к инсектициду Би-58 Новый.
  • Разработана математическая модель, позволяющая проводить прогноз развития резистентности популяций колорадского жука к трансгенному (Bt) картофелю по феноформам рисунка переднеспинки имаго. 
  • Разработан метод полуколичественной оценки содержания генетически  модифицированных источников в зерне сои и соевой муке.
  • Разработан новый подход к оценке пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых и метод оценки влияния Bt-картофеля на  картофельную моль в ряду нескольких генераций насекомых.

Практическая значимость результатов исследований.

  1. Разработаны системы описания феноформ рисунка и окраски имаго насекомых, которые рекомендуется использовать для целей фенетического анализа популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка.
  2. Разработана методика оценки ДНК-полиморфизма популяций насекомых с помощью ПЦР (RAPD- и ISSR-PCR), которую предлагается использовать для молекулярно-генетического анализа популяций членистоногих.
  3. Предложен подход к поиску резистентных к инсектицидам генотипов в популяциях  моновольтинных видов насекомых, основанный на отборе резистентных генотипов в природной популяции вредителя, постоянно взаимодействующей с инсектицидом.
  4. Разработаны новые методы детекции и полуколичественной оценки трансгенной вставки  в биоматериале, которые предлагается использовать в целях быстрого и эффективного мониторинга ГМ-растений на полях и  получаемых на их основе продуктов и кормов.
  5. Разработан новый метод мониторинга резистентности колорадского  жука к трансгенному (Bt) картофелю по феноформам рисунка переднеспинки имаго.
  6. Предложен подход к оценке пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых и разработана методика оценки влияния Bt-картофеля на картофельную минирующую моль, которую рекомендуется использовать на этапе предрегистрационных испытаний Bt-картофеля.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Новые системы описания феноформ рисунка и окраски колорадского жука и клопа вредная черепашка, которые позволяют более эффективно проводить анализ популяционных процессов этих видов насекомых, нежели традиционные. Фенетическая структура популяций насекомых определяется не столько пестицидным фактором, сколько соотношением генотипов с неспецифической устойчивостью к стрессам.
  2. Методика оценки резистентности популяций колорадского жука к Bt-картофелю по феноформам рисунка переднеспинки, с использованием предлагаемой нами формулы расчета. Использование для этих целей фенетических маркеров необходимо рассматривать только в качестве предварительной, грубой оценки.
  3. Новый подход для поиска и идентификации резистентных к инсектицидам генотипов в популяциях моновольтинных видов насекомых, основанный на  обработке инсектицидом выборки насекомых из природной резистентной популяции. ДНК-маркеры резистентности к инсектициду Би-58 Новый в популяции клопа вредная черепашка для целей создания новых методов мониторинга и прогноза развития резистентности.
  4. Новый подход для оценки пролонгированного влияния трансгенных растений на  нецелевых насекомых биоценоза и методика оценки влияния трансгенного (Bt) картофеля на картофельную минирующую моль, на основе использования сравнительной оценки генетического разнообразия и изменчивости молекулярно-генетической структуры  внутрипопуляционных групп особей по ДНК-маркерам.
  5. Метод полуколичественной оценки на основе ПЦР по целевому гену  устойчивости к гербициду раундап (СP4 EPSPS) для  целей  мониторинга  генетически модифицированных источников в зерне и зернопродуктах сои.

Апробация работы. Исследования проводились в 2001-2010 гг. в Всероссийском научно-исследовательском институте биологической защиты растений Россельхозакадемии (ВНИИБЗР) по программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований РАСХН по научному обеспечению развития  агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2006-2010 гг. Разработать агротехнологии интегрированной защиты растений, использования биобезопасных, экологичных и экономически эффективных химических и биологических средств защиты растений нового  поколения, сортов сельскохозяйственных культур, устойчивых к вредным организмам, и на их основе региональных систем управления процессами фитосанитарного оздоровления агроценозов по этапу Разработать системы технологий фитосанитарного оздоровления и стабилизации агроценозов на основе оптимизации их по экономической эффективности, биологической и экологической безопасности.

Основные результаты исследований ежегодно докладывались на ученых советах ВНИИБЗР, а также научно-практических конференциях: Международной конференции "Трансгенные растения - новое направление в биологической защите растений" (ВНИИБЗР, Краснодар, 2002); третьей региональной научно-практической конференции молодых учёных "Научное обеспечение агропромышленного комплекса" (КубГАУ, Краснодар, 2001); Международной конференции Генетически модифицированные источники пищи: оценка безопасности, законодательно-нормативная база, маркетинг, (Москва. 2003); Всероссийской научно-технической конференции "Биотехнология 2003" (Сочи, 2003); VII Всероссийском конгрессе Здоровое питание населения России (Москва, 2003); 2-м Московском международном конгрессе: "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва,2003); 5-ой региональной научно-практич. конф. молодых ученых Научное обеспечение агропромышленного комплекса (Краснодар, КубГАУ, 2003); Международной конференции Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем (Краснодар, ВНИИБЗР, 2004); III съезде ВОГиС, Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития (Москва, 2004); Отчетной научной конференции грантодержателей РФФИ (Сочи, 2004); IV Семинаре-совещании Средства защиты растений, регуляторы роста, агрохимикаты и их применение при возделывании сельскохозяйственных культур (Анапа, 2005); Отчетной научной конференции грантодержателей РФФИ (Сочи, 2005); международной конференции Актуальные  вопросы экологии и природопользования (Ставрополь, 2005); Втором Всероссийском Съезде по защите растений (Санкт-Петербург, 2005);  3-ей международной конференции из серии Наука и бизнес Международное  сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность (2006,Пущино); Международной научно-практической конференции Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем (Краснодар.2006); отчетной конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края ЮГ-РОССИИ, Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края (пос. Агой туапсинского р-на-2006, 2007, 2008); Международной научно-практической конференции Агротехнический метод защиты растений от вредных организмов (Краснодар, 2007); 2-й Всероссийской научно-практической конференции Ставропольского отделения Русского энтомологического общества РАН Проблемы энтомологии Северо-Кавказского  региона (Ставрополь, 2007);  13 съезде Русского энтомологического общества (Краснодар.2007);  международной конференции Информационные системы диагностики, мониторинга и прогноза важнейших сорных растений, вредителей и болезней сельскохозяйственных культур (Санкт-ПетербургЦПушкин, 2008); международной конференции Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем (Краснодар, 2008); II Международной научно-практической интернет-конференции Актуальные вопросы энтомологии (Ставрополь, 2009); Х сессии Генеральной Ассамблеи ВПРС МОББ и Международной научно-практической конференции Биологические основы  регулирования вредных организмов в агроценозах (Киев, 2009).

Работа поддержана субвенциями Миннауки: "Оценка биологической эффективности генно-инженерно-модифицированных растений (ГИМР) и разработка методов оценки их биоценотической безопасности", а также РФФИ и  администрацией Краснодарского края: гранты №№ 03-04-96772, 06-04-96737, 06-04-96644, 09-04-96514, 09-04-96556 и грантом МНТ - №3768.

Публикации. Основные положения диссертации изложены в 70 научных трудах, в том числе монографии и 9 статьях - в изданиях, рекомендуемых  ВАК для публикации основных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 348 страницах  машинописного текста, состоит из введения, шести глав, выводов, рекомендаций, списка литературы и четырех приложений; содержит  48 таблиц и 60  рисунков. Список  литературы содержит 404 источника, из них 66 на русском языке.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность всем соавторам проведенных исследований: сотрудникам сектора биотехнологии, к.б.н. А.П. Савве и сотрудникам лаборатории гербологии; Ж.А.Ширинян, к.б.н. М.В.Пушне и другим сотрудникам лаборатории массового разведения и применения энтомоакарифагов; к.б.н. И.С. Агасьевой и сотрудникам лаборатории поддержания гос. коллекции энтомоакарифагов; д.б.н. О.Д. Ниязову, д.б.н. В.Г.Коваленкову, а также зам. директора ВНИИБЗР к.б.н. В.Я.Исмаилову и  директору ВНИИБЗР академику РАСХН, профессору В.Д.Надыкте за помощь и поддержку в проведении данных исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1.  Молекулярная биология и генная инженерия в практике защиты

растений от вредных насекомых

В главе рассматривается практическое применение технологии молекулярных маркеров для целей защиты растений от вредителей. Показано применение ДНК-маркеров для идентификации видов, изучения генетики  популяций полезных и вредных видов насекомых, а также мониторинга резистентности вредителей к инсектицидам.

Приводится описание техники трансформации членистоногих для  создания  трансгенных и паратрансгенных насекомых и их использование в программах биологической защиты растений.

Описывается современное состояние исследований по выращиванию генетически модифицированных (трансгенных) растений. Рассматриваются выгоды и преимущества их возделывания, а также вопросы экологической безопасности генетически модифицированных растений, устойчивых к вредным насекомым.

Глава 2.  Материалы и методы

Объект исследования. Объектом исследований явились выборки из популяций различных видов насекомых, представителей четырех отрядов: полужесткокрылые Hemiptera (клопы Nezara viridula, Graphosoma lineatum, Dolicorys  baccarum, Eysarcoris incospicnus, Piesodorus lituratus, Palomena prasina, Pyrrhocoris apterus, Coreus marginatus, Eurygaster integriceps, Perillus bioculatus, Podisus maculiventris); жесткокрылые  Coleoptera  (колорадский жук  Leptinotarsa decemlineata); двукрылые Diptera (муха Ceroxys hortulana); чешуекрылые  Lepidoptera (яблонная плодожорка, Cydia pomonella; картофельная минирующая моль  Phthorimaea operculella; хлопковая совка  Helicoverpa armigera), а также растения картофеля (Bt-защищённые сорта картофеля Супериор Ньюлиф (Монсанто, США), Луговской-плюс (Центр Биоинженерия РАН), кукурузы (Раундап-устойчивая кукуруза NK 603 RR (Монсанто, США) и сои (Раундап-устойчивая соя сорт Stine 2254 RR (Монсанто, США).

Молекулярно-генетический анализ.

Основным методом молекулярно-генетических исследований являлась  полимеразная цепная реакция (ПЦР). Выделение ДНК из насекомых, семян, проростков и  листьев растений, амплификацию ДНК (RAPD-, ISSR-PCR) и электрофорез в  агарозном геле проводили по протоколам описанным нами ранее [Киль, 2009]. ПЦР проводили на амплификаторе Терцик (ДНК-технология, Россия) и термоциклере iCycler (BioRad, США). Во избежание ошибки опыта RAPD- и ISSR-анализ проводили одновременно в одной ПЦР с одним стандартным набором реактивов  (Диалат ЛТД, Москва). Сравнение выборок проводили по воспроизводимым и четко детектируемым ДНК-фрагментам.

SCAR-PCR анализ проводили в 25 мкл реакционной смеси на термоциклере Терцик по одной из следующих программ:

- режимы амплификации для 35S-промотора, NOS-терминатора, гена  актина сои: 3 минуты 30 секунд при 94С - предварительная денатурация, следующих 40 циклов: 20 секунд денатурация при 94С, 40 секунд отжиг праймеров при - 54С, 60 секунд синтез при 72С; последний цикл синтеза 3 минуты при 72С.

- режимы амплификации для генов CP4 EPSPS, лектина сои, зеин-19: 3 минуты при 94С - предварительная денатурация, следующих 50 циклов: 45 секунд денатурация при 94С, 45 секунд отжиг праймеров при - 60С, 25 секунд синтез при 72С; последний цикл синтеза 10 минут при 72С.

- режимы амплификации для гена Cry3A: 10 минут при 94С - предварительная денатурация, следующих 40 циклов: 30 секунд денатурация при 94С, 30 секунд отжиг праймеров при - 60С, 30 секунд синтез при 72С; последний цикл синтеза 7 минут при 72С.

Электрофорез продуктов амплификации (SCAR-PCR) осуществляли в 2% агарозном геле (для детекции ГМ-сои и кукурузы) и в 3% агарозном геле (для идентификации Bt-картофеля) при напряженности электрического поля 5В/см. 

Визуализацию ампликонов после предварительного окрашивания бромистым этидием проводили в ультрафиолете на трансиллюминаторе ECX-20.M (Vilber Lourmat).

Микросателлитный (SSR-PCR) анализ ДНК популяций насекомых яблонной плодожорки и хлопковой совки проводили в 12,5 мкл реакционной смеси, содержащей 10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM KCl, 3,0 mM MgCl2, 50 M каждого dNTP, 0,4M каждого из праймеров, 0,5 U TaqДНК полимеразы и 10-50 ng ДНК. SSR-PCR проводили на термоциклере iCycler (BioRad) с предварительной денатурацией (940С  2 мин) в режиме: денатурация - 940С 30с, отжиг праймера - 580С 40с (для Сp2.39; Сp2.157; HaSSR1; HaSSR3) и 610С 40с (для Сp1.63), элонгация - 720С  40с (35 циклов), конечный синтез - 720С 3 мин.

Продукты SSR-PCR разделяли в 8% полиакриламидном геле (ПААГ) длиной 20 см, толщиной 1 мм при напряжении 300-400 вольт  в течение 4-5 часов.

Статистический анализ данных.

Молекулярно-генетическую структуру описывали по частотам встречаемости в популяциях ДНК-маркеров и проводили сравнительную оценку по критерию хи-квадрат и коэффициенту генетического разнообразия Шеннона. Генетическое разнообразие оценивали по Шеннону с использованием формулы:  H= - (pi ln pi), где pi  - частота i-го аллеля в выборке [Chalmers, 1992], а также другим методом - по Nei и Shennon, из пакета компьютерных программ  POPGENE version 1.31 (Francis C.Yeh). Уровень ДНК-полиморфизма оценивали как отношение числа полиморфных ДНК-фрагментов к общему числу ДНК-маркеров. 

Сравнение средних по выборке проводили по критерию Стьюдента,  канонический дискриминантный анализ - с использованием общепринятых методов и пакетов прикладных программ (Statistica 6.0 и SPSS 11.0). Кластерный анализ ПЦР-спектров ДНК проводили методом  UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with arithmetical  Averages), определение генетических расстояний между генотипами - по Nei и Li [Nei, Li, 1979] из пакета компьютерных программ  Treecon [Van de Peer, De Wachter, 1994].

Глава 3.  Фенетические маркеры в изучении генетической структуры

популяций вредных и полезных насекомых

Рассматривая популяцию с генетической точки зрения, Н.В. Тимофеев-Ресовский и другие исследователи пришли к выводу о необходимости выделения фенетики как отдельного направления в популяционно-генетических исследованиях. Несомненно, использование фенетических маркеров, по сравнению с молекулярными,  в популяционных исследованиях обладает рядом преимуществ и, прежде всего, простотой и доступностью для исследователя, но в тоже время имеет ряд существенных ограничений, о которых мы будем говорить ниже.

    1. Изменчивость фенетической структуры популяций колорадского жука под действием инсектицидов

Целью данного этапа исследований явилось выявление закономерностей изменчивости фенетической структуры популяций колорадского жука в условиях взаимодействия с Bt-картофелем и химическими инсектицидами и разработка на этой основе метода прогноза развития резистентности к Bt-картофелю по фенетическим маркерам. В этой связи ставилась задача разработать  новую  систему описания феноформ рисунка переднеспинки колорадского жука.

В настоящее время оценку фенетической структуры популяций колорадского жука Leptinotarsa decemlineata проводят, главным образом, по рисунку  переднеспинки взрослых особей в соответствии с  методикой, разработанной Фасулати (1986). Однако, по нашим данным, данный подход не учитывает всего многообразия феноформ в популяции и в частности слияние феноформ A  внизу  между собой и с фенокомплексами P и M. Поэтому мы предложили использовать дополнительно к девяти феноформам (по Фасулати) еще фенокомплексы группы А, описанные Кохманюк (1982) и новые феноформы, описанные нами впервые: VР; HР; VHР; HY (рисунок 1).

Такой комплексный подход, включающий в себя 17 фенокомплексов,  оказался оправданным при анализе ряда популяций колорадского жука Краснодарского края, где наиболее часто встречался именно описанный нами фенокомплекс НР (в среднем примерно 30%) (таблица 1).

Оценка выживаемости под действием стрессового фактора наиболее часто встречаемых фенетических групп насекомых выявила тот факт, что они не  являются наиболее устойчивыми к воздействию Bt-картофеля и инсектицидов (лептоцид и дурсбан).  Выживаемость особей  колорадского  жука  в условиях 

       

Тип №1  Тип №2  Тип №3

 

Тип №4  Тип №5  Тип №6

Тип №7  Тип №8  Тип №9

Рисунок 1 - Основные типы (феноформы) рисунка центральной части  переднеспинки имаго колорадского жука (феноформы 1-9 - по Фасулати, 1986; V, H, VH, Y - по Кохманюк, 1982; VР; HР; VHР; HY - по Киль и др., 2004)

Таблица 1 - Средняя частота встречаемости феноформ в популяциях колорадского жука Краснодарского края, % (2001-2003 гг.)

Феноформа

Популяция

краснодарская

темрюкская

староминская

1

4,7

4,3

5,0

2

3,7

1,2

1,7

3

14,0

10,1

10,3

4

1,0

2,0

1,8

5

2,6

2,0

2,2

6

13,6

13,7

13,2

7

1,2

3,0

2,4

8

0,8

2,4

2,1

9

10,7

13,9

12,0

V

2,2

3,4

1,5

Y

4,0

5,0

3,7

VP

1,7

0,2

3,2

HP

27,6*

27,5*

32,1

HY

5,5

2,7

3,5

H

4,6

6,5

2,7

VHP

1,4

2,0

2,6

VH

0,1

0,1

0,2

*-достоверно отличается от других феноформ ( tфакт.   t 0,5 )

пестицидного пресса не коррелировала с исходной частотой их встречаемости в популяциях. Так, например, редко встречаемые насекомые краснодарской  популяции фенокомплекса VP являлись наиболее толерантными к инсектицидам (в среднем выживаемость =58,3%), а часто встречаемые феноформы 3 и НР характеризовались невысокой  выживаемостью в условиях стресса (в среднем =12,9; 16,4%  соответственно). Это указывало на то, что фенетическая  структура  популяций  колорадского жука определяется не только пестицидным, но и другими стрессовыми факторами окружающей среды. По всей видимости, чувствительность различных феноформ к  инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций колорадского жука.

В то же время обращала на себя внимание относительная стабильность  отклика (примерно одинаковая выживаемость) жуков часто встречаемых феноформ на разные стрессовые воздействия. Несмотря на невысокие показатели  устойчивости к инсектицидам, эти фенетические группы насекомых практически одинаково реагировали на различные по своему механизму действия стрессовые факторы. Это наблюдение, в свою очередь, позволило нам сделать следующий вывод о механизмах становления структуры популяций колорадского жука: фенетическая структура популяции колорадского жука определяется наличием и соотношением внутрипопуляционных групп особей, имеющих  неспецифическую устойчивость к различным стрессам. Этот вывод подтверждался данными статистической обработки. Результаты анализа показывали, что фенокомплексы 3, 6, 9, НР характеризовались наименьшей дисперсией (), которая на порядок, а в отдельных случаях и на два порядка, была ниже, чем у других феноформ. При этом данная закономерность прослеживалась для всех трех исследованных популяций и в течение двух лет испытаний.  Вероятно, данные фенетические группы особей характеризуются неспецифической устойчивостью к различным стрессовым факторам внешней среды (засуха, холод, зной и др.), что в  конечном итоге и обусловливает их наибольшую представленность в популяциях (специфическая устойчивость к инсектицидам этих феноформ в большинстве случаев ниже среднего).

Становится понятным роль редких феноформ в структуре популяций колорадского жука. Скорее всего, именно эти фенетические группы насекомых являются своего рода резервом генов резистентности, отвечающих за специфическую устойчивость, например, к воздействию пестицидов. Благодаря селективному давлению неблагоприятного фактора эти особи могут выдержать значительный пестицидный пресс и получить дальнейшие преимущества по сравнению с другими особями, что позволяет популяции в целом выжить. В дальнейшем эти, первоначально редкие феноформы  насекомых, ставшие впоследствии доминирующими в популяции, могут дать потомство, в котором произойдет расщепление по данному признаку, приводящее в конечном итоге к реверсии популяции к исходной структуре.

Несомненно, интересным представлялась возможность проверить универсальность выявленных закономерностей формирования фенетической структуры популяций на других видах насекомых.

    1. Фенетическая структура популяций клопа вредная черепашка

В нашей стране популяционные исследования клопа вредная черепашка Eurygaster integriceps  традиционно проводятся на основе феноформ рисунка  щитка взрослых особей и в частности в Институте Защиты Растений (Санкт-Петербург) [Фасулати, 2005]. Некоторые исследователи отмечают адаптивный характер феноформ клопов под действием инсектицидов [Фасулати, 2005; Махоткин, Махоткина, 2006]. В то же время существующая система описания фенетической структуры популяций  базируется только на пяти фенокомплексах, что с нашей точки зрения явно недостаточно и требовало усовершенствования. При этом важно было определить, носят ли выявленные выше закономерности формирования фенетической структуры популяций универсальный характер, то есть какую роль в адаптивности популяции играют редкие и часто встречаемые феноформы у других видов насекомых, а именно клопа вредная черепашка.

В рамках указанной проблемы на данном этапе исследований ставилась задача разработать новую систему описания фенооблика популяций клопа вредная черепашка, изучить влияние условий года, географического положения и химических инсектицидов на фенетическую структуру популяций.

Новая система описания фенетической структуры популяций клопа вредная черепашка

Нами была разработана новая система описания фенооблика популяций клопа вредная черепашка, которая так же, как и система Фасулати (2005), базировалась на сочетании признаков рисунка и окраски частей тела насекомого. Предложенная нами система описания включала в себя 15 фенокомплексов  щитка и 10 морфотипов брюшка (таблицы 2 и 3).

Для апробации новой системы описания феноформ мы проанализировали фенетическую структуру двух выборок краснодарской популяции клопа вредная черепашка. Данные по частотам встречаемости различных феноформ в популяции клопа вредная черепашка приведены в таблице 4.

Можно заметить, что практически все фенотипические классы предлагаемой системы описания были представлены в обеих выборках, кроме фенокомплексов щитка №1 и №3. Однако это не исключало их присутствие при описании других популяций, что в действительности нами и было обнаружено в дальнейшем при фенетическом анализе ставропольской популяции [Киль и др., 2007].

В целом фенооблик  обеих выборок, ВНИИБЗР и Елизаветинской (по  щитку и брюшку) был одинаков, о чем свидетельствовал и статистический  анализ данных распределений (χ2 факт. = 0, 9 и 1,9, что меньше χ2 05). Это позволяло заключить,  что данные выборки принадлежали, вероятно, к одной популяции, а предлагаемая нами система описания феноформ  вполне пригодна для  оценки  изменчивости  фенетической структуры популяции клопа вредная черепашка и изучения популяционных процессов этого вида насекомых.

Таблица 2- Классификация феноформ щитка клопа вредная черепашка

№

фенокомплекса

Признак

Окраска щитка

Контрастность рисунка

1

Желтый

Контрастный

2

Желтый

Слабый

3

Желтый

без рисунка

4

Коричневый

Контрастный

5

Коричневый

Слабый

6

Коричневый

без рисунка

7

Бурый

Контрастный

8

Бурый

Слабый

9

Бурый

без рисунка

10

темный, серо-коричневый

Контрастный

11

темный, серо-коричневый

Слабый

12

темный, серо-коричневый

без рисунка

13

темно-бурый

Слабый

14

темно-бурый

без рисунка

15

Черный

без рисунка

Таблица 3 - Классификация феноформ брюшка клопа вредная черепашка

№

фенокомплекса

Признак

Окраска брюшка

Наличие рисунка

1

Оранжевое

Рисунок присутствует

2

Оранжевое

Без рисунка

3

Бурое

Рисунок присутствует

4

Бурое

Без рисунка

5

Желтое

Рисунок присутствует

6

Желтое

Без рисунка

7

темно-серое

Рисунок присутствует

8

темно-серое

Без рисунка

9

Коричневое

Рисунок присутствует

10

Коричневое

Без рисунка

Таблица 4 - Частота встречаемости феноформ в краснодарской  популяции клопа вредная черепашка, % * (2006 г.)

Фено-

комплекс

Выборка из популяции

ВНИБЗР

Елизаветинская

ВНИБЗР

самки

ВНИБЗР самцы

Елизаветинская самки

Елизаветинская

самцы

Щиток

1

0

0

0

0

0

0

2

1,0

0,5

0

2,0

0,5

0,5

3

0

0

0

0

0

0

4

23,0

20,1

16,1

30,1

14,2

28,4

5

9,7

9,2

6,5

13,1

6,4

12,2

6

7,5

9,2

7,7

7,2

8,7

9,6

7

2,6

2,3

0

5,2

0,5

4,6

8

7,8

8,7

5,2

10,5

5,5

12,2

9

5,5

5,8

4,5

6,5

6,0

5,6

10

13,0

14,0

11,0

15,0

15,1

12,7

11

13,6

13,5

24,5

2,6

20,6

5,6

12

10,7

10,4

18,1

3,3

15,6

4,6

13

1,3

1,9

1,9

0,7

1,8

2,0

14

2,0

1,4

1,3

2,6

1,4

1,5

15

2,3

2,2

3,2

1,3

3,7

0,5

χ2

0,9

46,2**

29,7**

Брюшко

1

2,9

3,1

1,9

3,9

2,8

3,6

2

2,6

1,7

0,6

4,6

0

3,6

3

20,8

17,1

12,3

29,4

9,2

25,9

4

24,7

22,9

14,8

34,6

15,6

31,0

5

17,5

17,1

33,5

1,3

28,9

4,1

6

1,9

2,7

1,9

2,0

3,7

1,5

7

1,0

0,7

1,9

0

1,4

0

8

3,6

2,7

0

7,2

0

5,6

9

19,2

25,5

29,7

8,5

35,3

14,7

10

5,8

6,5

3,2

8,5

3,2

10,2

χ2

1,9

71,8**

55,4**

* -  % от общего количества всех особей в выборке, для самцов и самок - от общего количества самцов и самок соответственно;

** - различия достоверны (χ2 факт.≥ χ2 05 )

Изменчивость фенетической структуры популяций клопа вредная  черепашка под влиянием различных факторов внешней среды:

А. Географическое положение

С использованием разработанной нами системы описания феноформ  окраски и рисунка имаго клопа вредная черепашка был проведен сравнительный анализ фенооблика краснодарской и ставропольской популяций насекомых. При описании феноформ щитка выявились статистически значимые отличия в фенетической структуре популяций. Между самцами и самками наблюдали  статистически значимые отличия. При этом наиболее значимые отличия между полами наблюдали по феноформам брюшка у обеих популяций (χ2 факт.≥ χ2 05). Одновременно с этим желтое брюшко с узором (фенокомплекс № 5) встречалось почти исключительно у самок. Кроме того,  самки с феноформами брюшка № 5 и 9 встречались наиболее часто (свыше 60 % от всех самок).

Полученные данные указывали на сцепленность генов окраски и рисунка имаго клопов с полом. Вполне вероятно, что желтый цвет брюшка у самок клопа вредная черепашка играет важную роль при спаривании, привлекая особей противоположного пола. Так ранее установлено, что желтый цвет является привлекающим фактором для многих видов насекомых, в том числе и клопов.  Данный факт известен энтомологам давно и в настоящее время используется при изготовлении цветоловушек для защиты садовых насаждений [Васильева, 2006].

Таким образом, фенетическая структура популяций клопа вредная черепашка подвержена изменчивости в зависимости от географического положения популяции. Отмечены статистически значимые отличия в фенооблике краснодарской и ставропольской популяций, а также сцепление генов рисунка и окраски  клопов с полом. Это указывало на то, что исследуемые группы особей относятся к разным популяциям насекомых (этот вывод подтверждался также данными  молекулярно-генетических исследований, глава 4 диссертации), а изучение  популяционных процессов по фенетическим маркерам необходимо проводить с учетом половых различий.

Б. Инсектициды

Далее проводили оценку изменчивости фенетической структуры популяции клопа вредная черепашка под действием инсектицидов разного спектра действия,  Би-58 Новый и суми-альфа. Влияние инсектицидов приводило к  значительным  изменениям в фенетической структуре популяции. При этом характер изменчивости фенетической структуры зависел от природы инсектицида.

Оценка выживаемости под действием инсектицидов наиболее часто встречаемых фенетических групп насекомых выявила также тот факт, что они не являются наиболее устойчивыми к воздействию стрессового фактора. Выживаемость  клопов вредной черепашки в условиях пестицидного пресса не коррелировала с частотой их встречаемости в популяции. Таким образом, чувствительность насекомых различных феноформ к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяции  клопа вредная черепашка, как указывали некоторые авторы [Фасулати, 2005;  Беньковская и др., 2004; Рославцева, 2005], так как насекомые редких феноформ, как правило, имеют  более высокую толерантность к инсектицидам. Это согласуется с нашими исследованиями на колорадском жуке [Киль, Головатенко, 2006]. 

Кроме того, обращала на себя внимание относительная стабильность отклика (примерно одинаковая выживаемость) клопов часто встречаемых феноформ на разные стрессовые воздействия. Несмотря на невысокие показатели  устойчивости к  инсектицидам, часто встречаемые фенетические группы насекомых практически одинаково реагировали на различные по механизму действия  стрессовые факторы, что  наглядно демонстрировали  результаты статистического анализа: наиболее часто встречаемые в популяции феноформы характеризовались наименьшей дисперсией (),  которая на порядок, а в отдельных случаях и на два порядка, была ниже, чем у других феноформ.

Таким образом, полученные данные подтверждают сделанный нами ранее (на колорадском жуке) вывод о механизмах становления структуры популяций насекомых и универсальность данных механизмов адаптивности популяций насекомых к стрессовым факторам внешней среды: фенетическая структура популяции определяется наличием и соотношением внутрипопуляционных групп особей, имеющих неспецифическую устойчивость к различным стрессам.

В то же время для достоверности оценки резистентности популяции по феноформам необходимо, помимо наличия сцепления генов резистентности с  генами  рисунка и окраски, соблюдение следующего важного условия: паратипическая составляющая признака должна быть, по сравнению с генотипической компонентой, относительно невысокой. Этой части исследований посвящен следующий раздел. 

В. Условия года

Несомненный интерес представляло изучение влияния условий года на фенетическую структуру популяции клопа вредная черепашка. Основной целью данного этапа исследований было определить величину паратипической компоненты признака  рисунка и окраски клопов. Результаты оценки фенооблика  популяции клопа вредная черепашка в зависимости от условий года приведены в таблице 5.

Необходимо отметить, что погодные условия были типичными для г. Краснодара только в 2006 году, что подтверждалось данными 2005-2006 гг. Ц  фенетическая структура популяции в эти годы в целом не менялась. Наоборот,  погодные условия 2007  года (жаркие и засушливые весна и лето), когда температура уже в мае достигала 400С и выше и держалась на протяжении четырех-пяти месяцев при практическом отсутствии осадков, привели к существенным изменениям в фенетической структуре популяции клопа вредная черепашка 2007-2008 гг.  Экстремальные погодные условия 2007 года привели краснодарскую популяцию клопа вредная черепашка к значительной элиминации, так что это вызвало депрессию численности клопов в 2008 году, и нам с трудом удалось собрать материал для фенетического анализа. Это драматично отразилось и на фенетической структуре популяции 2008 года, что подтверждали данные статистической обработки (таблица 5).

Таблица 5 - Частота встречаемости феноформ краснодарской популяции клопа

вредная черепашка в разные годы исследований (молодые особи)*, %

Фенокомп-

екс

Самки

Самцы

2006

2007

2008

2006

2007

2008

Щиток

1

0

1,1

0

0

0

5,0

2

0,2

4,1

2,4

1,3

1,8

1,4

3

0

4,0

0

0

2,4

0

4

15,2

24,7

25,0

29,3

21,1

36,6

5

6,5

17,7

33,9

12,7

15,1

21,7

6

8,2

10,8

10,5

8,4

13,6

5,0

7

0,3

4,5

12,1

4,9

7,3

14,9

8

5,4

3,9

6,5

11,3

6,7

4,0

9

5,3

2,2

0,8

6,1

2,8

0,5

10

13,1

10,0

4,8

13,8

13,1

2,0

11

22,5

8,4

3,2

4,1

10,8

3,0

12

16,8

1,8

0

3,9

0,5

0

13

1,8

3,9

0,8

1,3

3,2

4,0

14

1,4

2,4

0

2,1

0,9

1,4

15

3,5

0,5

0

0,9

0,7

0,5

χ2

43,9**

78,2**

15,1

36,8**

Брюшко

1

2,4

0,5

0

3,7

0,9

0

2

0,3

0

0

4,1

0,8

0

3

10,8

5,2

0

27,7

14,4

2,3

4

15,2

10,5

0

32,8

20,0

2,3

5

31,2

19,7

81,5

2,7

9,9

19,8

6

2,8

4,2

4,0

1,8

5,3

12,9

7

1,7

0,2

0

0

0,2

0,5

8

0

0,5

0

6,4

1,0

0

9

32,5

44,8

9,7

11,6

29,2

24,3

10

3,2

14,4

4,8

9,3

18,3

37,6

χ2

18,0**

65,7**

31,7**

106,0**

*- общее число особей в 2006 г. - 723;  2007 г. - 871; 2008 г. - 326; 

** - есть статистически значимые различия между двумя распределениями, по отношению к 2006 г.  (χ2 факт ≥  χ2 таб.)

Сравнительный анализ влияния различных факторов внешней среды на  фенетическую структуру популяции клопа вредная черепашка приведен в таблице 6.

Таблица 6 - Влияние различных факторов на фенетическую структуру популяции клопа  вредная черепашка (значения χ2 )

Фактор

Самки

Самцы

Щиток

Брюшко

Щиток

Брюшко

Географическое положение

50,4*

15,1*

31,5*

24,6*

Условия года

43,9*

18,0*

15,1

31,7*

Инсектицид Би58 Новый

36,3*

36,3*

31,9*

13,7

Инсектицид

суми-альфа

30,5*

30,5*

16,2

51,0*

* - χ2 факт ≥  χ2 05

Можно заметить, что влияние условий года в некоторых случаях  было даже  более значительным, чем влияние инсектицидов. Понятно, что сила влияния фактора будет меняться в зависимости от меняющихся условий внешней  среды, природы  инсектицида и кратности обработок.

Таким образом, можно заключить, что паратипическая компонента признака рисунок и окраска щитка и брюшка клопа вредная черепашка весьма значительна, что ставит под вопрос возможность использования фенетических маркеров при мониторинге резистентности популяций этого вредителя к инсектицидам. По-видимому, морфологический анализ популяций клопа вредная  черепашка и  построенная на нем система мониторинга резистентности  к инсектицидам не может являться абсолютно достоверной ввиду наличия значительной модификационной изменчивости фенетических маркеров в меняющихся  условиях внешней среды. Поэтому прогноз резистентности по феноформам рисунка  имаго или другим морфологическим критериям можно рассматривать только лишь в качестве предварительной, грубой оценки, как мы уже отмечали ранее на колорадском жуке [Киль, Головатенко, 2006], и при необходимости можно дополнить проведением молекулярно-генетического анализа с использованием в частности RAPD-маркеров.

    1. Генетический контроль феноформ окраски щитка и  переднеспинки клопа периллюса

Северо-Американский  хищный  клоп периллюс  Perillus  bioculatus  -  специализированный  энтомофаг  колорадского  жука,  являлся  объектом пристального  внимания  ученых  на  протяжении  многих  десятилетий ХХ века.  Попытки его  акклиматизации  во многих странах не  дали  положительных результатов. В  мае  2008  года  при  обследовании  зарослей  амброзии  полыннолистной  (на  территории  ВНИИБЗР),  оставленной  на  поле  люцерны  в  качестве  резервата  амброзиевого  листоеда Zygograma  suturalis,  были  обнаружены  многочисленные  личинки  периллюса  (от 10 до 20 экз/м2 ),  активно  питающиеся  гербифагом.  Это  предопределило  большой интерес  к  хищнику,  так  как  вид,  очевидно,  самостоятельно  акклиматизировался  и  распространился в агроэкосистемах юга России.

В краснодарской популяции клопа P. bioculatus нами были выделены три четко различающихся по окраске щитка и переднеспинки между собой феноформы: красно-черная, желто-черная и бело-черная. В 2009 г. популяция периллюса  была представлена  самой  многочисленной  красно-черной  феноформой - до  70%  популяции,  бело-черной  и  оранжево-черной  - до 15%  каждая. Данный фенетический полиморфизм может явиться хорошим инструментом в дальнейших популяционных исследованиях этого вида насекомых. Однако использование феноформ для этих целей должно базироваться на знании генетики этого признака, его наследуемости и изменчивости.

Целью данного этапа исследований являлось изучение молекулярно-генетического полиморфизма популяции клопа периллюса по признаку локраска щитка насекомого. В этой связи ставилась задача провести ПЦР анализ трех исследуемых внутрипопуляционных групп особей.

В общей сложности было испытано 25 RAPD- и 15 ISSR-праймеров.  Наиболее четкие отличия между исследуемыми группами насекомых наблюдали только по RAPD-праймеру ОРЕ07, что подтверждалось данными кластерного анализа. Наблюдали практически полное разделение RAPD-фенотипов на три кластера, соответственно признаку окраски щитка. Это указывало на наличие сцепления отдельных ДНК-маркеров с генами, контролирующими окраску щитка насекомого. В частности RAPD-локус размером 750 пар нуклеотидов (п.н.)  наблюдался исключительно у белых особей, тогда как локусы 370 и 390 п.н. - только у клопов с красным щитком.

Таким образом, результаты проведенных исследований указывали на наличие генетического контроля данного признака, что, в свою очередь, делает возможным использование феноформ окраски в дальнейших популяционных исследованиях P. bioculatus.

Глава 4. Молекулярно-генетический анализ популяций вредных  насекомых по ДНК-маркерам

Тестирование генетического разнообразия в популяциях  по ДНК-маркерам позволяет проводить мониторинг их состояния вне зависимости от средовых эффектов и видовых особенностей насекомых. Современные методы молекулярно-генетического анализа позволяют оценить уровень ДНК-полиморфизма популяций, внутрипопуляционное генетическое разнообразие, установить степень генетического сходства между видами, популяциями и  отдельными  индивидуумами  непосредственно на генетическом уровне, в отдельных случаях оценить гетерозиготность  популяции, изучить генетическую изменчивость по отдельным локусам и аллелям генов. 

В данной главе диссертации приводятся результаты анализа ДНК-полиморфизма и молекулярно-генетической структуры различных популяций некоторых наиболее сельскохозяйственно значимых вредных видов насекомых:  колорадского жука, клопа вредная черепашка, картофельной минирующей моли, хлопковой совки и яблонной плодожорки. При этом проводили ПЦР анализ как природных, так и лабораторных  популяций, а также насекомых из энтомологических коллекций, с использованием различных типов ДНК-маркеров (RAPD-, ISSR- и SSR-PCR). Так с использованием метода RAPD-PCR нами был исследован ДНК-полиморфизм различных популяций клопа вредная черепашка и других представителей отряда полужесткокрылых (Hemiptera).

    1. ДНК-полиморфизм различных видов клопов (Hemiptera)

Всего было проанализировано 127 особей из различных таксонов.  В целом по всем  изученным видам насекомых с помощью праймера ОРА06 было выявлено от 16 до 35 RAPD-маркеров; с помощью праймера GT09 - от 12 до 27. Среднее число ампликонов на особь по праймерам ОРА06 и GT09 колебалось в зависимости от вида в пределах 5,6 ÷ 11,7; и 4,2 ÷ 13,5 соответственно. Средний уровень полиморфизма составил 92,4 % (ОРА06) и 86,2 % (GT09). Размеры продуктов  амплификации варьировали от 100 до 2300 (ОРА06) и  от 170 до 2700 пар нуклеотидов (GT09).

По наиболее часто встречаемым и воспроизводимым ДНК фрагментам для обоих праймеров вместе (по 58 RAPD-маркерам) был проведен кластерный анализ (метод UPGMA) и канонический дискриминантный анализ (КДА). Все особи четко распределились в отдельные кластеры в соответствии с их видовой принадлежностью. При этом в самостоятельный кластер выделились особи клопов Pyrrhocoris apterus и  Coreus marginatus, принадлежащих к семействам, отличнным от  клопов-щитников (Pentatomidae).  КДА подтвердил результаты кластерного анализа и позволил выявить генетическое сходство клопов вредной черепашки с клопами щитниками более отчетливо (рисунок 2).

Рисунок  2 - Дискриминация девяти видов клопов в пространстве первой и второй дискриминантных функций

Генетические расстояния шести исследуемых видов клопов-щитников до центроида составляли 9,4 ÷12,7 (у клопа вредная черепашка - 12,0), тогда как представители других семейств отстояли от центроида щитников на расстоянии 13,9 (Coreus marginatus, Coreidae) и 17,6  (Pyrrhocoris apterus,  Pyrrhocoridae).

Таким образом, на основании проведенных исследований нам представляется необходимость в более детальном изучении таксономической принадлежности клопа вредная черепашка Eurygaster integriceps Put. и других представителей семейства Scutelleridae.  Этот вид, по всей вероятности, скорее можно отнести к семейству  Pentatomidae, о чем ранее высказывались и другие исследователи [Бей-Биенко и др., 1955].

    1. ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие различных  видов чешуекрылых (Lepidoptera)

В данном разделе диссертации приводятся данные по молекулярно-генетической структуре различных видов чешуекрылых: картофельной минирующей моли, хлопковой совки и яблонной плодожорки.

SSR-анализ различных географических популяций яблонной плодожорки

Проведение молекулярно-генетического анализа популяций яблонной плодожорки  C. pomonella  с использованием кодоминантных маркеров, таких как микросателлиты (SSR, simple sequence repeat), стало возможным благодаря исследованиям последних лет [Zhou et al, 2005; Franck et al, 2005]. Так сконструированные французскими учеными для яблонной плодожорки SSR-праймеры [Franck et al, 2005] позволили проанализировать молекулярно-генетическую структуру популяций C. pomonella  по микросателлитным локусам во Франции [Franck et al, 2007] и Чили [Fuentes-Contreras et al, 2008].

Целью данного этапа работы явилось изучение ДНК-полиморфизма и  генетического разнообразия различных географических популяций яблонной плодожорки из России и Украины по трем микросателлитным локусам Ср1.63; Ср2.39 и Ср2.157 [Franck et al, 2005].

Объектом исследований явились выборки из популяций различных  географических популяций яблонной плодожорки из Украины (две выборки: гг.Киев и Мелитополь) и России (четыре выборки: гг. Краснодар (Учхоз Кубань), Ейск (Колледж  Ейский), Ставрополь (НПК Незлобнинский) и Санкт-Петербург). В ПЦР использовали три пары микросателлитных праймеров Ср1.63 (мотив повтора (GA)19), Ср2.39 (мотив повтора (ТС)4АС(ТС)11) и Ср2.157 (мотив повтора (GA)10).

Всего было исследовано 120 насекомых (по 20 особей из каждой выборки). Наиболее высокое соотношение нулевых аллелей (более 50%) было отмечено для локуса Ср2.157, поэтому он был исключен из дальнейшего анализа.

Результаты ПЦР анализа ДНК яблонной плодожорки по двум микросателлитным локусам приведены на рисунке 3.

Можно заметить, что основная часть ДНК-фрагментов для локуса Ср2.39, по сравнению с Ср1.63, смещена несколько в более высокомолекулярную часть спектра. Размеры детектируемых ДНК-фрагментов варьировали от 100 до 370 пар нуклеотидов (п.н.) для Ср1.63 и от 100 до 480 п.н. - для Ср2.39. По всем 

Рисунок 3 - SSR-фенотипы яблонной плодожорки. Электрофореграмма ампликонов  C. pomonella в 8% ПААГ (ПЦР анализ по двум микросателлитным локусам Ср1.63 и Ср2.39).М-маркеры молекулярных масс, пар нуклеотидов (п.н.).

популяциям в целом оба локуса были высоко полиморфны (уровень полиморфизма 100%). Среднее количество аллелей на локус по всем популяциям составило 2,3 и 3,2 для Ср1.63 и Ср2.39, соответственно. Доля гетерозигот в среднем для обоих локусов была равна 0,57 (таблица 7).

ПЦР анализ насекомых из Украины и России выявил значительные отличия в молекулярно-генетической структуре исследуемых популяций C.pomonella. Среди выборок из разных стран наиболее гетерогенны были выборки из Мелитополя, Киева и Краснодара. Наиболее высокий генетический  полиморфизм и генетическое разнообразие наблюдали в выборке из Мелитополя (Украина). Эта популяция характеризовалась наибольшим числом аллелей на особь (Аr = 3,2 - для локуса Ср1.63  и  Аr = 7,3 для - Ср2.39), наибольшей долей

гетерозигот, отсутствием нулевых гомозигот и наиболее высоким генетическим разнообразием (по двум локусам h=0,18 и I=0,29). В свою очередь, наименьшим генетическим разнообразием характеризовались выборки из Ейска и Ставрополя (h=0,04 и 0,03; I=0,08 и 0,07 по двум локусам, соответственно). Эти же  выборки характеризовались наименьшим количеством  выявляемых аллелей в среднем на локус и на одну особь.Полученные нами данные по генетическому полиморфизму популяций C.pomonella из России и Украины в целом сопоставимы с полученными ранее для  популяций Франции, Италии, Армении и Чили (Franck et al., 2007). В работе французских исследователей наблюдали также  относительно

Таблица  7 - ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие в различных выборках из географических популяций C.pomonella  по двум микросателлитным локусам

окус

Показатель

Выборка

По всем популяциям

Краснодар

Ейск

Ставрополь

С.Петербург

Киев

Мелитополь

Ср.1.63

Sr

110-320

110-310

110-160

100-260

100-370

100-350

100-370

A

20

11

7

15

30

24

43

Ar

2,9

1,7

1,0

1,8

3,0

3,2

2,3

N

0,10

0

0,20

0,15

0,10

0

0,09

Ht

0,80

0,45

0,10

0,60

0,65

0,80

0,57

h

0,130,14

0,070,1

0,060,07

0,10,1

0,110,07

0,140,12*

0,110,07

I

0,210,21

0,130,17

0,110,14

0,190,16

0,210,13

0,240,18*

0,210,11

Ср.2.39

Sr

100-460

190-240

200-250

100-460

100-480

100-480

100-480

A

29

7

16

16

24

25

45

Ar

4,1

0,9

1,1

1,3

4,3

7,3

3,2

N

0,05

0,40

0,70

0,25

0,05

0

0,24

Ht

0,75

0,20

0,20

0,45

0,80

1,00

0,57

h

0,120,10*

0,020,05

0,020,03

0,050,08

0,110,12*

0,200,15*

0,100,07

I

0,220,17*

0,050,10

0,040,07

0,100,14*

0,190,19*

0,310,23*

0,190,10

По всем локусам

h

0,120,12*

0,040,08

0,030,08

0,070,09*

0,110,10*

0,180,14*

0,100,07

I

0,220,18*

0,080,14

0,070,11

0,130,15*

0,200,17*

0,290,21*

0,200,11

Sr - размеры ДНК-фрагментов, п.н. (пар нуклеотидов)

A - число аллелей

Ar - обогащенность аллелями (allelic richness) - средняя частота аллелей на особь

N - доля нулевых гомозигот

Ht - доля гетерозигот

h - генетическое разнообразие по Nei ( стандартное отклонение)

I - индекс Шеннона ( стандартное отклонение)

*-достоверно отличается от ставропольской выборки (tфакт t05)

более высокое число аллелей и лобогащенность аллелями для локуса Ср2.39 по сравнению с Ср1.63  для всех исследуемых популяций (в 1,5-2 раза у популяций из европейских стран). Кроме того, анализ данных по всем исследуемым 27  выборкам так же, как и в нашей работе,  выявил значительную (более 20%) долю нулевых аллелей по локусу Ср2.157.Снижение генетического полиморфизма и гетерогенности популяций C.pomonella из России (выборки из Ейска, Ставрополя и Санкт-Петербурга), вероятно, было связано с большей пестицидной нагрузкой на фруктовые сады. Так в частности нам известно, что популяции из Киева и Мелитополя, практически не подвергались  инсектицидным обработкам. За последние годы в этих садах проводили от 1 до 5 обработок, тогда как, например, в Ейском районе (фруктовый сад хозяйства Колледж  Ейский) и в Ставрополе (НПК Незлобнинский) количество обработок против вредителей ежегодно достигало 10-12. В то же время полученные данные можно рассматривать лишь как предварительные и требующие более детальной проверки на  генетически  однородном биоматериале (выборки из одной популяции, но с разными показателями резистентности к инсектицидам).

На основании полученных данных по частотам встречаемости аллелей  нами проведена оценка генетического сходства исследуемых популяций. Генетическая идентичность и генетические расстояния между исследуемыми географическими выборками из популяций яблонной плодожорки приведены в таблице 8.

Таблица 8 - Генетическая идентичность и генетические расстояния

[по Nei (1978)  Genetics 89:583-590]

Выборка

Киев

Мелитополь

Ставрополь

С.Петер-бург

Краснодар

Ейск

Киев

*****

0.9874

0.9965

0.9971

0.9941

0.9966

Мелитополь

0.0126

******

0.9829

0.9857

0.9892

0.9815

Ставрополь

0.0035

0.0173

******

0.9987

0.9951

1.0000

С.Петер-

бург

0.0029

0.0144

0.0013

******

0.9943

0.9991

Краснодар

0.0059

0.0109

0.0049

0.0057

******

0.9949

Ейск

0.0034

0.0186

0.0000

0.0009

0.0052

******

генетическая идентичность (над диагональю) и генетические расстояния (под диагональю)

Можно заметить, что наиболее близки в генетическом отношении оказались выборки из Ейска и Ставрополя (генетическая идентичность по Nei = 1,0), что, вероятно, указывает на принадлежность этих выборок к одной  популяции. Это также  наглядно демонстрируют данные кластерного анализа (рисунок 4), где обе эти выборки входили в один кластер.

Наиболее близкой к ним с генетических позиций, несмотря на географическую удаленность, была выборка C.pomonella из Санкт-Петербурга, а наиболее удаленной от них в генетическом отношении была выборка насекомых из Мелитополя.

Таким образом, описана молекулярно-генетическая структура ряда  популяций яблонной плодожорки из России и Украины по микросателлитным локусам. Обнаружены значительные отличия в молекулярно-генетической структуре между популяциями как по числу аллелей на локус, степени гетерозиготности, так и по внутрипопуляционному генетическому разнообразию. Данные различия, вероятно, связаны не только с географическим  положением, но и с пестицидным прессом, которому подвергались популяции насекомых. Определены

 

 

 

       

Рисунок 4 - Дендрограмма по Nei's (1978).

Генетические расстояния: метод UPGMA

коэффициенты генетического сходства и генетические расстояния между исследуемыми выборками насекомых. Снижение гетерогенности отдельных популяций, по-нашему мнению, может быть связано с большим количеством пестицидных обработок в этих садах.

Глава 5.  ДНК-маркеры резистентности популяций вредителей

к инсектицидам

Исследование насекомых-вредителей молекулярно-генетическими  методами позволяет изучать механизмы изменчивости структуры популяций под влиянием стрессовых факторов внешней среды, в том числе инсектицидов, а также приблизить нас к пониманию механизмов развития резистентности к инсектицидам  непосредственно на генетическом уровне. В данной  главе диссертации представлены результаты оценки влияния инсектицидов и  условий года на молекулярно-генетическую структуру и генетическое разнообразие популяции яблонной плодожорки и клопа вредная черепашка.

Проблема поиска ДНК-маркеров резистентности к инсектицидам по сути связана с проблемой идентификации генотипов (в нашем случае резистентных насекомых) по фенотипу (RAPD-фенотипу).  Попытки идентификации резистентных к инсектицидам генотипов методом RAPD-PCR были предприняты для разных видов насекомых [Cидоренко и др., 2000; Баринов и др., 2005; Guerrero et al, 1997]. 

Для молекулярно-генетического анализа исследуемой популяции насекомых прежде всего необходимо иметь две группы особей, близких в генетическом отношении, но различающихся по признаку резистентность к инсектициду. При этом выбор исходного материала для поиска молекулярных (ДНК) маркеров резистентности к  инсектицидам базируется на отборе резистентных генотипов  в ходе лабораторной  селекции в ряду нескольких поколений поливольтинных видов насекомых при постоянном воздействии селектирующего фактора (инсектицида).

В то же время для моновольтинных видов, дающих в природе только одно поколение в год или в несколько лет,  использование такого подхода не представляется возможным, поскольку получение резистентных генотипов в лаборатории предполагает  посемейный отбор в ряду как минимум 10-20  поколений, что, в свою очередь,  требует многолетней работы. При этом исходные особи насекомых должны быть чувствительными к инсектициду. Кроме того, при доминантном характере наследования признака гетерозиготные самки (самцы) при скрещивании будут снова давать расщепление по данному признаку.

В этой связи нами был использован новый подход к отбору  резистентных к  инсектицидам генотипов. Он не требует проведения многоступенчатого, в  ряду нескольких генераций, процесса селекции и постоянного посемейного  отбора особей, резистентных к инсектициду. Предлагаемый нами подход заключается в том, что выборку из природной популяции обрабатывают определенной концентрацией инсектицида и наблюдают динамику смертности насекомых, отбирая при этом особей погибших первыми (чувствительные) и погибших последними, или оставшихся в живых, в зависимости от используемой концентрации инсектицида  (устойчивые). При этом количество отобранных особей должно быть не более 10% от объема выборки. Кроме того, исследуемая популяция насекомых должна находиться в постоянном взаимодействии с инсектицидами и иметь высокий показатель (уровень)  резистентности, что  априори предполагает наличие резистентных генотипов в исследуемой выборке. Данный подход позволил нам отобрать резистентные к инсектицидам генотипы из природной популяции  моновольтинного вида - клопа вредная черепашка  E. integriceps.

С использованием имеющегося у нас набора RAPD-праймеров нами было получено 280 ДНК-маркеров, но только по восьми из них найдены отличия между двумя группами насекомых, а наиболее характерные - по двум ДНК-фрагментам (рисунок 5).

Так устойчивые к инсектициду особи характеризовались более высокой частотой встречаемости ДНК-маркера OPA18/520, а также наличием маркеров OPA07/410 и OPA06/470 при отсутствии таковых у чувствительных  особей. В свою очередь для чувствительных особей было характерно 100%-ное присутствие маркера OPA06/430 при практическом отсутствии его у  устойчивых особей и более высокая частота встречаемости маркеров OPA18/400, OPA07/470, OPA07/450. Наиболее характерные различия между двумя выборками наблюдали по праймеру OPA06  (RAPD-маркеры 470 и 430 п. н.). 

Можно было заключить, что устойчивость/чувствительность к инсектициду Би-58 определялась в данном случае присутствием двух главных RAPD-локусов, по которым отличались конкретные генотипы. Присутствие одного из маркеров, как правило, сопровождается отсутствием другого, что, вероятно, указывает на существование определенной взаимосвязи между маркируемыми локусами. Более того, вполне вероятно, что исследуемый признак контролируется большим числом генов и маркируется соответственно большим числом ДНК-

Рисунок 5 - RAPD-фенотипы клопов вредной черепашки, различающихся чувствительностью к инсектициду Би-58 (праймер ОРА06). Дорожки: 1-8 - чувствительные особи; 9-17Цустойчивые особи. М - Маркеры молекулярных масс λPst1) 

фрагментов. В целом влияние инсектицида Би-58 Новый на молекулярно-генетическую структуру и гетерогенность краснодарской популяции клопа вредная черепашка было весьма существенным. Оценка по наиболее значимым RAPD-маркерам между двумя исследуемыми выборками насекомых (чувствительные/устойчивые)показала, что коэффициент генетического сходства между ними был незначителен и составил 0,61 (по Nei, 1978). Важно отметить также, что наблюдаемое генетическое разнообразие клопов в резистентной выборке было (так же, как и для резистентной популяции яблонной плодожорки) достоверно меньше, чем у чувствительных особей (таблица 9). Это вполне объяснимо, так как действие инсектицида ведет к элиминации чувствительных особей, а, следовательно, и к снижению гетерогенности популяции в целом, выявляемой в частности по отдельным ДНК-локусам.

Таким образом, влияние инсектицида Би-58 Новый  на клопов вредной  черепашки сопровождается изменениями в молекулярно-генетической структуре и снижением генетического разнообразия популяции. Поиск ДНК-маркеров  резистентности к инсектицидам у моновольтинных видов природных популяций вредителей, постоянно взаимодействующих с инсектицидами, рекомендуется проводить с использованием предлагаемого нами подхода. RAPD-метод позволяет оценить различия по чувствительности к инсектицидам у клопа вредная  черепашка и выявить резистентные к инсектицидам  генотипы.

В то же время из-за низкой воспроизводимости RAPD-маркеров к их  использованию для целей мониторинга резистентности необходимо подходить с осторожностью. Чтобы избежать ошибки опыта эксперименты необходимо ставить в нескольких аналитических повторностях, а сравнительный анализ ДНК проводить с одним набором  реактивов, на одном амплификаторе, в одной ПЦР. Кроме того, для большей репрезентативности необходимо последующее

Таблица 9 - Генетическое разнообразие и частота  встречаемости  отдельных  RAPD-локусов в выборках клопов вредной черепашки,  различающихся  чувствительностью к инсектициду Би-58

RAPD-локус

Чувствительные

Устойчивые

ОРА18/520

0.25

0,50

OPA18/450

0,50

0,06

OPA07/470

0,25

0,10

OPA07/450

0,21

0,06

OPA07/430

0,29

0

OPA07/410

0

0,34

OPA06/470

0

1,0

OPA06/430

1,0

0,03

Генетическое разнообразие по Nei (h )

0,25 0,21

0,17 0,19*

Индекс Шеннона (I )

0,37 0,31

0,28 0,26

*- tфакт.t05 - достоверно отличаются от чувствительных

преобразование RAPD- в SCAR-маркеры (sequences-characterized amplified region). В этой связи

полученные данные носят лишь предварительный характер, в то же время это не снижает значимости самого подхода. В конечном итоге результаты подобных экспериментов могут дать в руки исследователю дополнительный инструмент контроля за развитием резистентности насекомых к инсектицидам и помогут лучше понять механизмы формирования этого процесса.

Глава 6.  Изучение экологической безопасности трансгенных растений с использованием фенетических и ДНК-маркеров

Создание трансгенных или генетически модифицированных растений (ГМР) в конце прошлого века и активное их использование в мировом сельскохозяйственном производстве ставит вопрос об их экологической безопасности. Это равным образом относится и к Bt-защищенным растениям, с признаком устойчивости к вредным насекомым и в частности к Bt-картофелю, устойчивому к  колорадскому жуку.

    1. Мониторинг резистентности колорадского жука к  Bt-картофелю

Во многих работах подтверждена взаимосвязь адаптивности популяций колорадского жука к инсектицидам с рисунком центральной части переднеспинки имаго [Кохманюк, 1982; Фасулати, 1986; Король, Новосельская, 2001]. Вот почему нам казалось естественным исследовать возможность оценки  резистентности популяций колорадского жука к Bt-картофелю (растение-инсектицид) по  фенетическим маркерам, что может являться основой для более простого метода мониторинга популяций этого вредителя.

В задачу данного этапа исследований входило изучение изменчивости  фенетической структуры популяций колорадского жука под действием Bt-картофеля и на этой основе  поиск фенетических маркеров резистентности. Для изучения взаимосвязи чувствительности популяций колорадского жука к Bt-картофелю и их фенетической структуры мы оценивали частоту встречаемости феноформ под влиянием трансгенного картофеля и чувствительность к Bt-токсину у ряда популяций Краснодарского края.

По полученным данным нами проведена формализация исследуемой зависимости, на основании которой можно оценить продолжительность жизни личинок колорадского жука (IV возраста) от частоты встречаемости феноформы V: 

5, если Х 6,5;

  Y=  5 + 1,4 (Х-6,5), если Х 6,5,

где Y - продолжительность жизни личинок  колорадского жука IV возраста (сут);  Х - частота встречаемости феноформы V (%).

Предложенная математическая  модель достаточно адекватно описывает исследуемые закономерности в данной группе популяций. Возможно для других популяций колорадского жука предложенная модель может быть модифицирована. В то же время это не снижает значимости самого подхода, но только конкретизирует необходимость проведения аналогичных мероприятий для тех популяций и в тех зонах возделывания, где планируется возделывать Bt-сорта.

Таким образом, мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному картофелю можно проводить по феноформам рисунка переднеспинки имаго, используя в качестве индикатора BtЦчувствительности фенокомплекс V и прогноз развития резистентности по разработанной формуле расчета.

В то же время мы понимаем, что морфологический анализ и построенная на нем система мониторинга не может являться абсолютно достоверной, тем  более в виду наличия значительной модификационной изменчивости фенетических маркеров в меняющихся условиях внешней среды. Вот почему мониторинг по ДНК-маркерам, как нам кажется, будет более достоверным, хотя, несомненно, и более дорогостоящей процедурой. В то же время, данный подход также может иметь право на жизнь. Вероятно, совместное использование всех доступных методов позволит проводить эффективный мониторинг резистентности популяций колорадского жука к Bt-картофелю по морфо-генетическим критериям.

6.2 Влияние Bt-картофеля на молекулярно-генетическую структуру популяций и жизнеспособность нецелевых видов насекомых

Одним из экологических рисков является возможное негативное влияние ГМР на нецелевую биоту, что может негативно отразиться на биоразнообразии видов и в том числе нецелевых насекомых биоценоза. В настоящее время исследователей и общественность волнует главным образом вопрос не острой токсичности ГМР, но пролонгированного действия Bt-растений на нецелевые виды биоты [Соколов и др., 2005]. Действительно, долговременное влияние Bt-токсинов (в ряду нескольких генераций насекомых) может сказаться на внутрипопуляционной структуре и генетическом разнообразии популяций организмов, населяющих биоценоз Bt-картофеля и питающихся листьями, клубнями или пыльцой трансгенного растения. Это, в свою очередь, может отразиться на адаптивности популяций и в конечном итоге на виде в целом.

Кроме того, влияние Bt-токсинов может привести не к элиминации, а наоборот,  к увеличению жизнеспособности насекомых, относящихся к нецелевой группе. Применительно к вредителям данное явление крайне нежелательно, так как неизбежно скажется на росте их численности и соответственно на урожае картофеля. Эти аспекты биобезопасности ГМР до настоящего времени оставались  вне поля зрения ученых и требовали своего рассмотрения.

Целью данного этапа исследований являлось изучить влияние Bt-токсинов на некоторые нецелевые виды насекомых, населяющих биоценоз трансгенного картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, в ряду первых нескольких генераций. В этой связи ставилась задача провести сравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры и генетического разнообразия в частности популяции картофельной минирующей моли при питании исходным и трансгенным (Bt) картофелем. Кроме молекулярно-генетических исследований ставилась задача провести оценку исследуемых двух групп насекомых по некоторым показателям их роста и развития, при этом в анализ планировали включать каждые пять-семь поколений насекомых. Важно отметить, что картофельная минирующая моль Phthorimaea operculell, как нецелевой вид для Bt-картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, является удобным объектом для такого рода исследований, так как способна размножаться на искусственных  питательных средах и в лабораторных условиях может дать до 13 генераций насекомых в год.

Проведенный анализ исходной популяции картофельной моли и первых двадцати пяти ее  генераций на среде с Bt-токсином показал, что молекулярно-генетическая структура и генетическое разнообразие популяции в условиях питания  Bt-картофелем остаются неизменными. Статистически значимых отличий по показателям роста и развития также отмечено не было [Киль и др. 2008, 2009,2010].  В этом разделе автореферата представлены результаты анализа  двадцатой и двадцать пятой генерации насекомых, содержащихся на среде с токсином Сry3A.

Опыт проводили в лабораторных условиях. Выборки из популяции насекомых, содержащихся на искусственной питательной среде с листьями исходного и Bt-картофеля, анализировали по RAPD- и ISSR-маркерам и некоторым показателям роста и развития. Молекулярно-генетическую структуру описывали по частотам встречаемости в популяциях ДНК-маркеров и проводили сравнительную оценку по критерию хи-квадрат и коэффициенту генетического разнообразия Шеннона (Н) [Chalmers et al, 1992]. После проведения предварительного скрининга 20 RAPD- и 10 ISSR-праймеров для целей исследования были отобраны наиболее информативные четыре:  RAPD-праймеры ОРА07, ОРА20, ОРВ01 и  ISSR-праймер UBC810.

Оценка внутрипопуляционного генетического разнообразия по Шеннону не выявила существенных различий между исследуемыми выборками насекомых, питающихся традиционным и трансгенным (Bt) картофелем. Cравнительный  анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры внутрипопуляционных групп насекомых также показал отсутствие статистически значимых различий в исследуемых выборках (таблица 10).

Таблица 10 - Изменчивость молекулярно-генетической структуры и генетического разнообразия в популяции P. operculella  при питании исходным и трансгенным картофелем (двадцатая генерация насекомых)

Праймер

Индекс Шеннона (Н)

Критерий хи-квадрат (χ2 )

Исходный картофель

Bt-картофель

UBC810

1,87

1,94

1,1

OPA07

3,0

2,66

2,5

OPA20

4,25

4,31

4,9

OPB01

4,25

4,24

5,4

χ2факт χ205 - различия не достоверны

Результаты анализа насекомых картофельной минирующей моли, содержащихся при разных условиях питания по некоторым показателям роста и развития насекомых приведены в таблице 11.

Можно заметить, что различия между двумя исследуемыми выборками  были несущественны: фактические значения критерия Стьюдента по всем показателям были меньше табличного.

Таким образом, сравнительный анализ частот встречаемости ДНК-маркеров показал, что молекулярно-генетическая структура и генетическое разнообразие популяции картофельной моли в условиях питания  Bt-картофелем (сорт Луговской плюс) остаются неизменными. Статистически значимых отличий по показателям  роста и развития также отмечено не было. Для оценки пролонгированного действия трансгенного Bt-картофеля на нецелевых насекомых можно использовать в качестве модельного объекта картофельную минирующую моль по предлагаемой нами методике. Оценку пролонгированного влияния ГМР на нецелевых насекомых на этапе предрегистрационных испытаний рекомендуется проводить с использованием предлагаемого нами подхода, в основе которого  лежит содержание поливольтинных видов насекомых на искусственной питательной среде, содержащей Bt-токсины (опыт) и исходный сорт (контроль), и сравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры, генетического разнообразия и показателей роста и развития исследуемых двух групп насекомых.

Таблица  11 - Средние значения показателей роста и развития картофельной минирующей моли в условиях питания Bt-картофелем (двадцать пятая генерация)

Сорт картофеля

Количество яиц, отложенных одной самкой, шт

(n=20)

Отрождение гусениц (фертильность яиц), %

(n=20)

Окуклилось гусениц, %

(n=20)

Масса куколок, мг

(n=27)

Количество вылетевших бабочек, %

(n=20)

Продолжительность развития от яйца до имаго,  сут

(n=20)

Bt-картофель (Луговской плюс)

63,5±1,1

76,9±1,0

56±0,7

6,5±0,6

46,0±0,7

30,0±0,2

Исходный картофель

(Луговской)

64,0±1,3

77,2±1,1

54,7±0,8

7,4±0,9

46,3±1,0

29,8±0,2

Критерий Стьюдента

0,29

0,21

1,31

0,75

0,26

0,96

χ2факт χ205 - различия не достоверны
    1. Оценка риска вертикального переноса генов от ГМ-культур к их  диким сородичам и традиционно возделываемым сортам

Одним из аспектов экологической безопасности ГМ-культур является оценка риска вертикального переноса генов от ГМ-растений к культурным сортам и диким сородичам. Под вертикальным переносом генов понимают передачу генетического материала в поколениях половым путем. Потенциальная опасность здесь заключается в том, что новые привнесенные признаки устойчивости дадут дополнительные преимущества диким видам растений, и будут способствовать их быстрому распространению. В результате это приведет к появлению так называемых суперсорняков и увеличению засоренности полей, что может создать экологическую проблему.

Вопросы риска вертикального переноса генов от ГМ-картофеля и ГМ-кукурузы к их диким сородичам и другим возделываемым сортам также исследованы нами с применением метода ПЦР. При этом анализ генетической вставки проводили с использованием SCAR-праймеров, направленных на регуляторные области генома, 35S-промотор (детектируемый фрагмент размером 195 п.н.), Nos-терминатор (180 п.н.) и целевые гены, в частности ген Cry3A Bt-картофеля (117 п.н.).

Результаты экспериментов по вертикальному переносу генов от Bt-картофеля выявили отсутствие переноса генетической конструкции к диким  видам и культурным сортам картофеля. Необходимо отметить, что, несмотря на то, что картофель является самоопылителем, перекрестное опыление может  составлять у него от 0 до 20 % [Plaisted, 1980]. Если учесть, что в качестве посадочного материала в нашей стране служат клубни картофеля, а не семена, можно заключить, что риск вертикального переноса генов от трансгенного картофеля минимален. К тому же дикие родственники картофеля на территории Российской Федерации не произрастают, а если бы и произрастали, гибридные семена не образовывались бы, что подтверждалось результатами наших опытов.

На закрытых сертифицированных участках опытных полей ВНИИБЗР был проведен также многолетний опыт по изучению возможности вертикальной передачи генов от раундап-устойчивой кукурузы к традиционно возделываемым сортам. В задачу исследований входило изучение возможности переноса пыльцы, дистанция рассеивания пыльцы, определение зоны безопасности и пространственной изоляции при выращивании трансгенной кукурузы.

ПЦР анализ выявил наличие трансгенной вставки у образцов, взятых по различным направлениям переносимой ветром пыльцы (рисунок 6). Перенос генов от ГМ-кукурузы к традиционно возделываемым сортам наблюдали главным образом на дистанции 5-10 м, однако в отдельных случаях - до 200 м (юго-западное направление).

Рисунок  6 - ПЦР-анализ семян кукурузы на наличие трансгенной вставки.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что риск вертикального переноса генов от ГМ-кукурузы к культурным сортам существует. Степень перекрестного опыления между трансгенной кукурузой и культурными сортами, находящимися поблизости, будет зависеть от ряда факторов, таких как расстояние между ними, локальных барьеров на пути движения пыльцы, местного климата и топографии. Вследствие этого поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, а также необходимо создание барьеров на пути движения пыльцы. В России дикие сородичи кукурузы не встречаются, поэтому, риск  интрогрессии трансгенов от ГМ-кукурузы к ее диким видам в Российской Федерации отсутствует [Крутенко, 2006].

Вопросы ПЦР-детекции и идентификации трансгенов при мониторинге вертикального переноса генов от ГМ-культур тесно связаны с методами контроля за ГМ-семенами, зерном, растениями и продукцией на их основе. При этом встает вопрос не только детекции и идентификации трансгенов, но и их количественной оценки в образцах.

Полуколичественная оценка ГМИ в семенах сои

Существующие сегодня методы количественной оценки генетически модифицированных источников (ГМИ)  в пище, зерне и кормах основаны главным  образом на применении техники Real Time RCR.  Такая техника исследований требует использования флуоресцентной метки и дорогостоящего оборудования. Вот почему нами была предпринята попытка количественной оценки ГМИ с  использованием стандартного метода ПЦР, на основе подбора оптимальных условий для высокоспецифичной амплификации ДНК [Киль, Крутенко, 2003].

Объектом исследования являлась раундап-устойчивая соя, сорт Stine 2254 RR (Монсанто, США). 

На рисунке 7 представлена электрофореграмма продуктов амплификации образцов ДНК сои, выделенных из навесок соевой муки с  массовым содержанием ГМ-компонента 10,0 %; 5,0 %; 3,0 %; 1,0 %; 0,5 %; 0,01 %.

Рисунок  7 - Полуколичественная оценка содержания ГМ-компонента (RR-сои) в соевой муке по целевому гену EPSPS (праймеры RR01 и RR04, размер фрагмента 356 п.н.). М-маркеры молекулярных масс (М100 bp).

Можно заметить хорошо различимое изменение интенсивности полос при  соответствующем изменении концентрации ГМИ в зерне, что позволяет проводить полуколичественную оценку ГМИ в образцах на основе простой  визуальной оценки. Эти данные, в свою очередь, позволяют построить калибровочный график зависимости от концентрации ГМИ в образце и интенсивности ДНК-фрагмента, используя соответствующие статистические методы и программы, и на этой основе количественно оценить содержание ГМИ в исследуемом образце.

Таким образом, подобрана оптимальная система полуколичественной оценки ГМИ в семенах сои (в диапазоне концентраций 0,1-10 %), что позволяет проводить быстрый и эффективный мониторинг ГМ-сои как в агроценозах, так и в сельскохозяйственной продукции на ее основе.

Выводы

В результате проведенных исследований можно сделать следующие  основные выводы:

  1. Созданы новые более информативные системы описания фенетической структуры популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка.
  2. Чувствительность различных фенетических групп насекомых к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций колорадского жука. Фенетическая структура популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка в первую очередь определяется  соотношением внутрипопуляционных групп насекомых, имеющих различную неспецифическую устойчивость к различным стрессам, что указывает также на универсальный характер  выявленных закономерностей.
  3. Выявлена сцепленность генов окраски и рисунка имаго клопов вредной  черепашки  с полом. Изучение популяционных процессов клопа вредная черепашка по фенетическим маркерам необходимо проводить с учетом половых различий.
  4. Выявлена высокая модификационная изменчивость фенетической структуры  популяции клопа вредная черепашка, что ставит под вопрос использование фенетических маркеров при мониторинге резистентности клопов к инсектицидам.
  5. Предложен новый подход к отбору резистентных к инсектицидам насекомых для поиска ДНК-маркеров резистентности у моновольтинных видов насекомых. Новизна предлагаемого подхода заключается в том, что он не требует проведения многоступенчатого, в ряду нескольких поколений, процесса селекции и отбора особей, резистентных к инсектициду. Выявлены ДНК-маркеры резистентности к инсектицидам Би-58 Новый: RAPD-маркеры ОРА06/470 и 430 п. н.
  6. Показано генетическое сходство клопов-черепашек с  другими представителям семейства щитников (Pentatomidae), что, по-видимому, указывает на принадлежность этого вида клопов  скорее  к семейству Pentatomidae, чем к Scutelleridae.
  7. Мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному картофелю можно проводить по феноформам рисунка переднеспинки имаго, используя в  качестве индикатора BtЦчувствительности фенокомплекс V и прогноз развития резистентности - по разработанной формуле расчета.
  8. Молекулярно-генетический анализ и оценка показателей роста и развития картофельной минирующей моли свидетельствует об отсутствии  позитивного / негативного влияния Bt-картофеля (сорт Луговской плюс) на генетическое разнообразие, структуру популяции, жизнеспособность и репродуктивные функции этого нецелевого вида насекомых как минимум в первых двадцати пяти  поколениях.
  9. Риск вертикального переноса генов от Bt-картофеля к его диким сородичам и культурным сортам минимален, тогда как риск вертикального переноса генов от ГМ-кукурузы к культурным сортам существует. Поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, при этом необходимо создание барьеров на пути движения пыльцы.
  10. Разработан метод полуколичественной оценки содержания ГМИ, основанный на амплификации участка целевого гена CP4 EPSPS с использованием пары праймеров: RR01 и RR04, фланкирующих участок целевого гена размером 356 п.н., который позволяет проводить не только ПЦР-детекцию и идентификацию трансгенов в зерне и зернопродуктах сои, но и определять их количественное содержание.

Практические рекомендации

  1. Для целей фенетического анализа популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка предлагается использовать новые системы описания феноформ рисунка и окраски имаго насекомых.
  2. Для молекулярно-генетического анализа популяций насекомых предлагается использовать разработанную нами методику: Методика оценки ДНК-полиморфизма популяций насекомых с помощью ПЦР (RAPD- и ISSR-PCR).
  3. Поиск резистентных к инсектицидам генотипов в популяциях моновольтинных видов насекомых рекомендуется проводить с использованием предлагаемого нами подхода, основанного на обработке инсектицидом выборки из природной резистентной популяции.
  4. В целях быстрого и эффективного мониторинга ГМ-растений на полях и  получаемых на их основе продуктов и кормов использовать предлагаемые нами методы детекции и полуколичественной оценки трансгенной вставки в биоматериале.
  5. Поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, а также необходимо создание барьеров на пути движения пыльцы. Изоляции полей с трансгенным картофелем не требуется.
  6. Мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному (Bt) картофелю проводить с использованием предлагаемого нами метода: Метод оценки чувствительности популяций колорадского жука к трансгенному (Bt) картофелю по феноформам рисунка переднеспинки имаго.
  1. На этапе предрегистрационных испытаний оценку пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых проводить с использованием предлагаемого нами подхода и в частности оценку Bt-картофеля - по предлагаемой нами методике: Методика оценки пролонгированного действия трансгенного (Bt) картофеля на нецелевых насекомых, основанной на использовании сравнительной оценки генетического разнообразия и изменчивости молекулярно-генетической структуры внутрипопуляционных групп особей по ДНК-маркерам.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Монография

  1. Киль, В.И. ДНК технологии в защите сельскохозяйственных растений от вредных насекомых [Текст] / В.И. Киль, Россельхозакадемия, ВНИИ биологической защиты растений.- Краснодар: ООО Просвещение-Юг, 2009.- 160 с.: ил.; - Библиогр.: с.128-159.-300 экз. - ISBN- 978-5-9900297-4-3.

Статьи в изданиях, рекомендуемых  ВАК для публикации основных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук

  1. Киль, В.И. Генетически модифицированный картофель, устойчивый к колорадскому жуку [Текст] / Киль В.И., Надыкта В.Д.  // Агро ХХI.- 2002. - № 1. - С.12-15.
  2. Киль, В.И. Оценка риска вертикального переноса генов у Bt-картофеля и других трансгенных культур [Текст] /  Киль В.И. // Агрохимия.-2003.-№ 4.- С.81-89.
  3. Киль, В.И. Управление развитием резистентности колорадского жука к Bt-защищенному картофелю [Текст] / Киль В.И. // Агро XX1.- 2003/2004.- №7-12.- С.22-24.
  4. Киль, В.И.. Выгоды и преимущества возделывания трансгенных растений [Текст] / Киль В.И., Исмаилов В.Я., Надыкта В.Д // Достижения науки и техники АПК.-2003.-№.10.-С.26-30.
  5. Киль, В.И. Резистентность вредителей к трансгенному картофелю и другим Bt-защищенным культурам [Текст] /  Киль В.И., Головатенко Н.А., Крутенко Д.В.// Агрохимия.-2004.-№7.-С.77-91.
  6. Киль, В.И. Мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному  картофелю по фенетическим маркерам [Текст] /  Киль В.И., Головатенко Н.А.  //  Агрохимия.-2006.-№2.-С.58-64.
  7. Киль, В.И. О полиморфизме RAPD-маркеров у различных таксонов полужесткокрылых (Hemiptera) [Текст] / В.И. Киль, В.В. Гронин, Д.В. Крутенко, В.Я.  Исмаилов // Сельскохозяйственная биология.- 2008.-№1.-С.70-76.
  8. Киль, В.И. Идентификация резистентных к инсектицидам генотипов в популяции клопа вредная черепашка по фенам рисунка и RAPD-маркерам [Текст] / В.И. Киль, В.Я. Исмаилов // Агрохимия.- 2009.-№1.-С.38-49.
  9. Киль, В.И. Изучение пролонгированного действия трансгенного (Bt) картофеля на нецелевых насекомых [Текст] / В.И. Киль, Е.Н.Беседина, М.В.Пушня, В.Я.Исмаилов // Труды Кубанского государственного аграрного университета.-2010.-Выпуск 1(22).-С.96-100.

Статьи в реферируемых журналах

  1. Киль, В.И. Морфологические маркеры чувствительности популяций колорадского жука к трансгенному картофелю [Текст] / Киль В.И., Головатенко Н.А.  // Наука Кубани.-2004.-№ 3, ч.1.-С.116-119.
  2. Киль, В.И. Генетичесие маркеры чувствительности популяций колорадского жука к трансгенному картофелю  [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В. //  Наука Кубани.-2005.-№4-С.126-130.
  3. Киль В.И. Молекулярно-генетическая структура популяции картофельной минирующей моли Phthorimaea operculella Z. (Lepidoptera:Gelechiidae) [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В.  //  Наука Кубани-2007-№4.-С.25-29.
  4. Киль, В.И. Использование метода RAPD-PCR для выявления резистентных к инсектициду Би-58 генотипов клопов вредной черепашки [Текст] / В.И. Киль, М.В. Пушня, Ж.А. Ширинян // Наука Кубани.-Приложение.-2008.-С.87-92.
  5. Киль, В.И. RAPD-анализ популяции хлопковой совки Helicoverpa armigera Hbn. (Lepidoptera:Noctuidae)  [Текст] / В.И. Киль, Ж.А. Ширинян // Наука Кубани.- Приложение.- 2008.-С.176-179.
  6. Киль, В.И. Влияние трансгенного картофеля на молекулярно-генетическую структуру популяции и  жизнеспособность картофельной минирующей моли в ряду генераций [Текст] /  Киль В.И., Беседина Е.Н., Пушня М.В., Исмаилов В.Я // Наука Кубани.-2009.-№3.- С.69-73.
  7. Киль В.И. ДНК полиморфизм клопов вредной черепашки Eurygaster integriceps Put (Hemiptera: Scutelleridae) по межмикросателлитным локусам [Текст] / Киль В.И // Наука Кубани.-2009.-№4.-С.42-45.

Статьи в аналитических сборниках

  1. Киль, В.И. Методические подходы к определению наличия трансгенов в пищевых продуктах и кормах [Текст] / Киль В.И. // Материалы международной научно-практической конференции: Трансгенные растения - новое направление в биологической защите растений (ВНИИБЗР, Краснодар, 19-22 июня 2002 г).- Краснодар.-2003.-С.193-208.
  2. Киль, В.И.  Мониторинг генно-инженерно-модифицированных растений: ПЦР-детекция RR - сои [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В. // Тез. докл. на Всероссийскую научно-техническую конференцию "Биотехнология 2003".-Сочи.-2003.-С.87-89.
  3. Киль, В.И. Сравнительный анализ методов ПЦР-детекции семян RR-сои и полуколичественная оценка их содержания в зерне и кормах [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В. // Тезисы VII Всероссийского конгресса Здоровое питание населения России.-Москва 12-14 ноября 2003.-С.235-236.
  4. Киль, В.И. Идентификация и полуколичественная оценка содержания семян RR-сои в зерне [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В. // Тезисы 2-го Московского международного Конгресса: "Биотехнология: состояние и перспективы развития".-Москва,10-14 ноября 2003.-С.199-200.
  5. Киль, В.И. Молекулярно-генетический анализ популяции колорадского жука по признакам пола и окраски яиц [Текст] / Киль  В.И., Игнатов А.Н., Калисниченко С.М., Головатенко Н.А., Крутенко Д.В., Дорохов Д.Б.  // Тезисы 2-го Московского международного Конгресса: "Биотехнология: состояние и перспективы развития".-Москва,10-14 ноября 2003.-С.200-201.
  6. Головатенко, Н.А. Оценка базовой чувствительности различных географических популяций колорадского жука к трансгенному картофелю [Текст] /  Головатенко Н.А., Киль В.И. // Тез. Докл. 5-й региональной научно-практич. конф. Молодых ученых Научное обеспечение агропромышленного комплекса, Краснодар, КГАУ, 2003.- С.82-83.
  7. Киль, В.И. Новый подход к описанию рисунка переднеспинки имаго колорадского жука  на примере некоторых его  популяций в краснодарском крае [Текст] / Киль В.И.,. Головатенко Н.А, Есипенко Л.П. // Материалы докладов конф., посв. 100-летию со дня рожд. Е.М.Степанова (Краснодар, 8-9 окт, 2002).- Краснодар-2004.-С.126-133.
  8. Головатенко, Н.А. Изменчивость фенетической структуры популяций колорадского жука под влиянием Bt-картофеля и инсектицидов на основе комплексного описания рисунка переднеспинки имаго жуков [Текст] / Головатенко Н.А., Киль В.И., Есипенко Л. П. // Материалы докладов конф., посв. 100-летию со дня рожд. Е.М.Степанова. (Краснодар, 8-9 окт, 2002).- Краснодар.-2004.-С.133-147.
  9. Надыкта, В.Д. Биологическая эффективность и биоценотическая безопасность генно-инженерно-модифицированных сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции, устойчивых к колорадскому жуку [Текст] / Надыкта В.Д., Исмаилов В.Я., Ширинян Ж.А., Пушня М.В., Крутенко Д.В., Киль В.И. // Тез. Докл. на III съезд ВОГиС, Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития,  Москва, 6-12 июня 2004.- С. 477.
  10. Исмаилов, В.Я. Методы мониторинга резистентности колорадского жука к Bt-картофелю [Текст] / Исмаилов В.Я., Ширинян Ж.А., Пушня М.В., Головатенко Н.А., Киль В.И. // Тез. Докл. на III съезд ВОГиС, Генетика в XXI веке: современное  состояние и перспективы развития, Москва, 6-12 июня 2004.- С.500.
  11. Зотов, И.С. Оценка генетических различий между популяциями колорадского жука мультивариантным ПЦР анализом [Текст] / Зотов В.С., Игнатов А.Н., Маллабаева Д.Ш., Киль В.И., Дорохов Д.Б. // Тез. Докл. на III съезд ВОГиС, Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития, Москва, 6-12 июня 2004,  С.48.
  12. Киль, В.И. К вопросу о механизмах формирования  структуры популяций колорадского жука в связи с резистентностью к инсектицидам [Текст] / Киль В.И., Головатенко Н.А. // Материалы докладов международной конференции Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем (Краснодар, 29 сент.-1 окт.2004).- Краснодар.-2004.-Вып.2.- С.201-209.
  13. Киль, В.И. RAPD-анализ ДНК имаго колорадского жука Leptinotarsa decemlineata (Say) различных географических популяций [Текст] / Киль В.И., Головатенко Н.А., Крутенко Д.В., Гронин В.В. // Материалы докладов международной конференции Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем (Краснодар, 29 сент.-1 окт.2004).- Краснодар.-2004.-Вып.2.- С.209-222.
  14. Киль, В.И. Возможность оценки продолжительности жизни личинок колорадского жука, питающихся Bt-картофелем, по фенам рисунка переднеспинки имаго [Текст] / Киль В.И., Головатенко Н.А.// Материалы докладов международной конференции Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем, (Краснодар, 29 сент.-1 окт.2004).- Краснодар.-2004.-Вып.2.- С.222-229.
  15. Крутенко,  Д.В. Методы ПЦР-детекции трансгенных растений [Текст] / Крутенко Д. В., Киль В. И. // Материалы докладов международной конференции Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем (Краснодар, 29 сент.-1 окт.2004).- Краснодар.-2004.-Вып.2.- С.303-313.
  16. Надыкта, В.Д. Генетически улучшенные культуры - новое средство биологической защиты растений [Текст] /  Надыкта В.Д., Исмаилов В.Я., Киль В.И. // Тез. докл. участников IV Семинара-Совещания Средства защиты растений,  регуляторы роста, агрохимикаты и их применение при возделывании сельскохозяйственных культур.-5-9 сентября 2005.-Анапа.-2005.-С.118-121.
  17. Киль, В.И. Изучение закономерностей изменчивости фенетической структуры популяций колорадского жука под влиянием  инсектицидов и генетически модифицированного картофеля [Текст] / Киль В.И., Головатенко Н.А. // Сборник материалов международной конференции Актуальные вопросы экологии и природопользования (Ставрополь.-16-19 ноября, 2005).-Ставрополь. Агрус.-2005.-Т.1.-С.140-151.
  18. Киль, В.И. Генетический полиморфизм популяций колорадского жука, различающихся чувствительностью к трансгенному картофелю [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В. // Материалы Второго Всероссийского съезда по защите растений Фитосанитарное оздоровление экосистем, Симпозиум Резистентность вредных организмов к пестицидам.- Санкт-Петербург.- 5-10 декабря, 2005.-С.33-34.
  19. Киль, В.И. Изучение генетического полиморфизма популяций колорадского жука с целью управления их резистентностью к инсектицидам и трансгенному картофелю [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Головатенко Н. А., Крутенко Д. В. // Тез.  докл. на  Заключительную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края р2003юг (п. Агой, Туапсинского р-на, 28 ноября - 1 декабря 2005).- Краснодар. - 2005.-С.101-103.
  20. Киль, В.И. Полиморфизм ДНК различных видов клопов по RAPD-маркерам [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Крутенко Д.В., Исмаилов В.Я. // Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность.-Материалы 3-ей международной конференции из серии Наука и бизнес.-19-21 июня 2006.-Пущино.-2006.-С.114-117.
  21. Киль, В.И. ПЦР анализ ДНК некоторых видов клопов из энтомологической коллекции [Текст] /  Киль В.И., Крутенко Д.В. // Материалы международной научно-практической конференции Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем (Краснодар, 20-22 сентября, 2006).- Краснодар.-2006.- Вып.4.-С.435-436.
  22. Киль, В.И. Изучение молекулярно-генетического полиморфизма различных видов клопов методом RAPD-PCR [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Крутенко Д.В.,  Исмаилов В.Я. // Материалы международной научно-практической конференции Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем (Краснодар, 20-22 сентября, 2006).- Краснодар.-2006.- Вып.4.-С.437-441.
  23. Киль, В.И. Полиморфизм ДНК популяции картофельной минирующей моли Phthorimaea operculella Z. (Lepidoptera:Gelechiidae) по RAPD-маркерам [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В. // Материалы международной научно-практической конференции Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем (Краснодар, 20-22 сентября, 2006).- Краснодар.-2006.- Вып.4.-С.442-446.
  24. Киль, В.И.. Полиморфизм ДНК популяции клопов-вредной черепашки Eurygaster integriceps  Put. по RAPD-маркерам [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Головатенко Н.А. // Материалы международной научно-практической конференции Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем (Краснодар, 20-22 сентября, 2006).- Краснодар.-2006.- Вып.4.- С.447-451. 
  25. Киль, В.И.. Изучение влияния трансгенного картофеля на генетическую структуру популяций и жизнеспособность нецелевых видов насекомых. [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В., Пушня М.В., Ширинян Ж.А. // Тезисы  докладов на отчетную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края ЮГ-РОССИИ, Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края Ц2006.-  С. 175-177.
  26. Киль, В.И. Изучение особенностей формирования морфо-генетической структуры популяций клопа - вредная черепашка под воздействием пестицидов и других стрессовых факторов внешней среды [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В. // Тезисы  докладов на отчетную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края ЮГ-РОССИИ, Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края Ц2006.-С. 138-139.
  27. Гронин, В.В. Новая система описания фенов в популяциях клопов-вредной черепашки [Текст] / Гронин В.В. Крутенко Д.В., Киль В.И. // Материалы VIII Региональной научно-практической конференции молодых ученых (Краснодар, 7-8 декабря, 2006).- Краснодар. Ц2006.- С.108-110.
  28. Киль, В.И. Методика популяционных исследований насекомых вредителей сельскохозяйственных культур с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) [Текст] / Киль В.И.  // Высокопроизводительные и высокоточные технологии и методы диагностики и фитосанитарного мониторинга.- Россельхозакадемия, М.- 2007.- С. 8-15.
  29. Киль, В.И..  Мониторинг резистентности популяции клопа вредная черепашка к инсектициду Би-58 по RAPD-маркерам [Текст] /  Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В. // Материалы 4 Международной научно-практической конференции Агротехнический метод защиты растений от вредных организмов (Краснодар, 13-17 июня, 2007).- Краснодар.-2007.-С.396-398.
  30. Киль, В.И. Новая система описания фенов рисунка и окраски имаго клопов вредной черепашки [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Крутенко Д.В. // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества. Вып. 3: материалы 2-й Всероссийской научно-практической конференции.- Ставрополь: АГРУС, 2007.-С.28-34.
  31. Киль, В.И.  Фенетическая структура Краснодарской и Ставропольской популяций клопов вредной черепашки. [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Крутенко Д.В.  // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества. Вып. 3:  материалы 2-й Всероссийской научно-практической конференции.- Ставрополь: АГРУС, 2007.-С.34-40.
  32. Киль, В.И. Молекулярно-генетическая структура Краснодарской и Ставропольской популяций клопов вредной черепашки [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Крутенко Д.В.  // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества. Вып. 3: материалы 2-й Всероссийской научно-практической конференции.- Ставрополь: АГРУС, 2007.-С.40-46.
  33. Киль, В.И. Влияние инсектицида Би58-новый на фенетическую и молекулярно-генетическую структуру популяции клопа вредная черепашка. [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Крутенко Д.В.  // Тезисы  докладов ХIII съезда Русского энтомологического общества Достижения энтомологии на службе агропромыщленного комплекса, лесного хозяйства и медицины, Краснодар, 9-15 сентября 2007 г.- Краснодар.-2007.-С.92-93.
  34. Киль, В.И. Полиморфизм ДНК популяции хлопковой совки Helicoverpa armigera Hbn. (Lepidoptera:Noctuidae) по RAPD-маркерам [Текст] /  Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В., Ширинян Ж.А. // Тезисы  докладов ХIII съезда Русского энтомологического общества Проблемы и перспективы общей энтомологии, Краснодар, 9-15 сентября 2007 г.- Краснодар.-2007.-С.144-145.
  35. Киль, В.И. Изменчивость морфо-генетической структуры популяций клопов вредной черепашки под воздействием пестицидов и других стрессовых факторов внешней среды  [Текст] / В.И. Киль, Д.В. Крутенко, В.В. Гронин, М.В. Пушня // Тезисы  докладов на отчетную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края ЮГ-РОССИИ, Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края (п. Агой, Туапсинского района,  24-28 октября, 2007).-2007.-С.144-146.
  36. Киль, В.И. Влияние трансгенного картофеля на молекулярно-генетическую структуру популяций, рост и развитие нецелевых видов насекомых [Текст] /  В.И. Киль, Д.В. Крутенко, В.В. Гронин, Е.Н. Беседина, М.В. Пушня, Ж.А Ширинян // Тезисы  докладов на отчетную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края ЮГ-РОССИИ, Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края (п. Агой, Туапсинского района,  24-28 октября, 2007).-2007.-С.190-192.
  37. Киль, В.И. Полиморфизм ДНК популяции клопа вредная черепашка Eurygaster integriceps Put (Hemiptera: Scutelleridae) по RAPD- и ISSR-маркерам [Текст] / В.И. Киль // - Тезисы докладов международной конференции Информационные системы диагностики, мониторинга и прогноза важнейших сорных растений, вредителей и болезней сельскохозяйственных культур (Санкт-Петербург ЦПушкин,  12-16 мая 2008).- Санкт-Петербург ЦПушкин.-2008.-С.44-46.
  38. Киль, В.И. RAPD- и ISSR-анализ популяций картофедьной минирующей моли и хлопковой совки при питании обычным и трансгенным (Bt) картофелем [Текст] / В.И. Киль, Е.Н. Беседина // Тезисы докладов международной конференции Информационные системы диагностики, мониторинга и прогноза важнейших сорных растений, вредителей и болезней сельскохозяйственных культур (Санкт-Петербург - Пушкин,  12-16 мая, 2008).- Санкт-Петербург - Пушкин.-2008.- С.46-49.
  39. Киль, В.И. ДНК полиморфизм популяций хлопковой совки и картофельной минирующей моли по ISSR-маркерам [Текст] / В.И. Киль, Е.Н. Беседина // Материалы международной научно-практической конференции Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем (Краснодар, 23-25 сентября, 2008).- Краснодар.- 2008.- Вып.5.-С.415-420.
  40. Киль, В.И. Изменчивость молекулярно-генетической структуры нецелевых видов насекомых в условиях питания трансгенным картофелем, устойчивым к колорадскому жуку: анализ первых генераций [Текст] / В.И. Киль, Е.Н. Беседина, М.В. Пушня, Ж.А. Ширинян, В.Я. Исмаилов // Материалы международной научно-практической конференции Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем (Краснодар, 23-25 сентября, 2008).- Краснодар.- 2008.- Вып.5.-С.421-425.
  41. Киль, В.И. Использование метода RAPD-PCR для отбора резистентных к Би-58 Новый генотипов в популяциях моновольтинных видов насекомых на примере клопа вредная черепашка [Текст] / В.И. Киль //  Материалы международной научно-практической конференции Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем (Краснодар, 23-25 сентября, 2008).- Краснодар.- 2008.- Вып.5.-С.400-409.
  42. Киль, В.И. RAPD- и ISSR-анализ клопов вредной черепашки, различающихся чувствительностью к инсектициду суми-альфа [Текст] / В.И. Киль //  Материалы международной научно-практической конференции Биологическая защита растений Ц  основа стабилизации агроэкосистем (Краснодар, 23-25 сентября, 2008).- Краснодар.- 2008.- Вып.5.-С.409-415.
  43. Киль, В.И. Биобезопасность трансгенного картофеля: оценка влияния Bt-токсинов на нецелевые виды насекомых в ряду поколений [Текст] /  В.И. Киль, Е.Н. Беседина, М.В. Пушня, Ж.А Ширинян // Тезисы  докладов на отчетную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края ЮГ, Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края (п. Агой, Туапсинского района,  23-27 ноября, 2008).-2008.-С.55-56.
  44. Киль, В.И. Молекулярно-генетический и фенетический анализ популяций клопа  вредная черепашка, различающихся чувствительностью к инсектицидам [Текст] /  В.И. Киль // Тезисы  докладов на отчетную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края ЮГ, Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края (п. Агой, Туапсинского района,  23-27 ноября, 2008).-2008.-С.53-54.
  45. Киль, В.И. ПЦР анализ хищных клопов Perillus bioculatus F., различающихся окраской  щитка, по RAPD- и ISSR-маркерам [Текст] / В.И. Киль, Е.Н. Беседина, О.О. Федичева, В.Я. Исмаилов  // Информационный бюллетень Восточно-Палеарктической региональной секции Международной организации по биологической борьбе с вредными животными и растениями № 39 : материалы Х сессии Генеральной Ассамблеи ВПРС МОББ и Международной научно-практической конференции Биологические основы  регулирования вредных организмов в агроценозах (г.Киев, 18-22 мая 2009 г.).- Киев.-2009.- С.128-130.
  46. Киль, В.И. Закономерности формирования фенетической структуры популяции клопа вредная черепашка [Текст] / В.И. Киль // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества: материалы II Международной научно-практической интернет-конференции Актуальные вопросы энтомологии (г.Ставрополь, 1 марта 2009 г.).- Вып.5 / Ставропольский государственный аграрный университет.- Ставрополь : АГРУС, 2009.-С.17-22.
  47. Киль, В.И. к вопросу о мониторинге резистентности популяций клопа вредная черепашка к инсектицидам по фенам рисунка и окраски имаго [Текст] / В.И. Киль // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества: материалы II Международной научно-практической интернет-конференции Актуальные вопросы энтомологии (г.Ставрополь, 1 марта 2009 г.).- Вып.5 / Ставропольский государственный аграрный университет.- Ставрополь : АГРУС, 2009.-С.220-223.
  48. Киль, В.И. ДНК полиморфизм различных популяций яблонной плодожорки  Cydia pomonella (L.) (Lepidoptera: Torticidae) [Текст] / В.И. Киль, Е.Н. Беседина, О.О. Федичева // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества: материалы II Международной научно-практической интернет-конференции Актуальные вопросы энтомологии (г.Ставрополь, 1 марта 2009 г.).- Вып.5 / Ставропольский государственный аграрный университет.- Ставрополь : АГРУС, 2009.-С.154-157.
  49. Киль, В.И. Молекулярно-генетический анализ хищных клопов Perillus bioculatus F. (Hemiptera: Рentatomidae), различающихся по фенам окраски щитка [Текст] / В.И. Киль, Е.Н. Беседина, О.О. Федичева, В.Я. Исмаилов // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества: материалы II Международной научно-практической интернет-конференции Актуальные вопросы энтомологии (г.Ставрополь, 1 марта 2009 г.).- Вып.5 / Ставропольский государственный аграрный университет.- Ставрополь : АГРУС, 2009.-С.158-162.
  50. Киль, В.И. Молекулярно-генетический анализ популяций яблонной плодожорки Cydia pomonella L. по RAPD- и ISSR-маркерам [Текст] / В.И. Киль, Е.Н. Беседина, О.О. Федичева  // Информационный бюллетень Восточно-Палеарктической региональной секции Международной организации по биологической борьбе с вредными животными и растениями № 40 : материалы докладов международного симпозиума Защита растений - достижения и перспективы (г.Кишинев, 19-22 октября 2009 г.). Кишинев. -2009.- С.92-94.
  51. Киль, В.И. ПЦР анализ  популяций яблонной плодожорки Cydia Pomonella  [Текст] /  В.И. Киль, Е.Н. Беседина, О.О.Федичева // Тезисы  докладов на отчетную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края ЮГ, Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края (г. Анапа,  26-30 октября, 2009). -2009.- С.37-38.
  52. Исмаилов, В.Я. Биологические особенности и морфогенетическая структура популяции хищного клопа Perillus bioculatus F. (Hemiptera: Рentatomidae) [Текст] / В.Я.Исмаилов, В.И. Киль, И.С.Агасьева, Е.В.Федоренко, О.О.Федичева,  Д.В.Степанов, Е.Н. Беседина  // Тезисы  докладов на отчетную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края ЮГ, Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края (г.Анапа,  26-30 октября, 2009).-2009.-С.34-35.
  53. Киль, В.И. Методика оценки ДНК полиморфизма популяций насекомых с помощью ПЦР (RAPD- и ISSR-PCR) [Текст] / В.И. Киль // Методические рекомендации.  ООО Просвещение-Юг. Краснодар. 2009. 16 с.
  Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по сельскому хозяйству