Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
МЕДЖИДОВА МАРЖАНАТ КАПУРОВНА
ТЕЧЕНИЕ ПОСЛЕРОДОВОГО ПЕРИОДА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ОСОБЕННОСТЕЙ МИКРОБИОЦЕНОЗА И ЛОКАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ВЛАГАЛИЩА У БЕРЕМЕННЫХ ПЕРЕД РОДАМИ
14.01.01. - акушерство и гинекология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
МОСКВА, 2012
Работа выполнена в Федеральном бюджетном государственном учреждении Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России Научные руководители:
доктор медицинских наук Тютюнник Виктор Леонидович доктор биологических наук Трофимов Дмитрий Юрьевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор, заведующий родильным отделением ФГБУ Н - АГиП имени академика В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России Баев Олег Радомирович доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой акушерства и гинекологии лечебного факультета Московского государственного медицинского стоматологического университета Манухин Игорь Борисович Ведущая организация - Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова
Защита диссертации состоится л19 июня 2012 года в 13 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д 208.125.01 ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России по адресу: 117997, Россия, Москва, ул.
Академика Опарина, д.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России Автореферат разослан л17 мая 2012 года
Ученый секретарь диссертационного совета, Калинина Елена Анатольевна доктор медицинских наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Многочисленные исследования показали, что ведущая роль в развитии послеродовых инфекционно-воспалительных заболеваний принадлежит восходящей инфекции влагалища, частота которой в популяции варьирует от до 30% (Yokoe D.S. et al., 2001; Кира Е.Ф. и соавт., 2002; Jacobsson B. et al., 2002; Andrews W.W. et al., 2003; Стрижаков А.Н. и соавт., 2003; Баев О.Р. и соавт., 2010; Lee S.M. et al., 2011; Roberts C.L. et al., 2011).
Применяемые сегодня способы оценки состояния микробиоценоза влагалища являются либо недостаточно информативными, либо дорогостоящими и субъективными. Кроме того, не всегда удается идентифицировать этиологически значимые условно-патогенные микроорганизмы, в частности анаэробы (Leitich G. et al., 2003; Bradshaw C.S. et al., 2006; Yoshimura K. et al., 2011). Следует отметить, что только учет количественных соотношений отдельных видов микроорганизмов может характеризовать состояние вагинального микробиоценоза и степень его нарушений (Анкирская А.С. и соавт., 2011; Deutscher M. et al., 2011). Применение некультуральных методов позволяет расширить спектр выявления данных изменений. Этим требованиям в большей степени отвечает анализ биотопа влагалища методом полимеразной цепной реакции в реальном режиме времени (Bradshaw C.S. et al., 2006;
Шипицина Е.И. и соавт., 2009; Yoshimura K. et al., 2011; Плотко Е.Э. и соавт., 2011).
В современной литературе большое количество работ посвящено исследованию роли моноцитарно-макрофагального звена в регуляции иммунного ответа организма беременных (Hedges R.S. et al., 2006; Brown D.M. et al., 2009; Трофимов Д.Ю. и соавт., 2011). Изучение особенностей баланса про- и противовоспалительных цитокинов при физиологическом и осложненном течении беременности, как в периферической крови, так и на местном уровне представляется задачей крайне актуальной (Kutteh W.H. et al., 2001;
Орджоникидзе Н.В., Басиладзе Е.С., 2005; St John E.P. et al., 2007; Witkin S.S.
et al., 2007; Anderson B.L. et al., 2011).
Сравнительный анализ микробиоценоза влагалища беременных перед родами, с применением классических микробиологических методов и полимеразной цепной реакции в реальном времени, изучение соотношения провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в вагинальном отделяемом, позволят выработать меры по прогнозированию и профилактике послеродовых инфекционно-воспалительных осложнений. Вышеизложенные данные отечественной и зарубежной литературы свидетельствуют об актуальности выбранной темы исследования и перспективности дальнейшего внедрения, полученных результатов в клиническую практику.
Цель исследования Определить особенности микробиоценоза и локального профиля экспрессии генов цитокинов влагалища при доношенной беременности и оценить их влияние на течение родов и послеродового периода.
Задачи исследования 1. Изучить клиническую характеристику, течение беременности, родов, послеродового периода и состояние новорожденных у обследованных женщин.
2. Оценить состояние микробиоценоза влагалища и охарактеризовать видовой состав нормофлоры и дисбиотических состояний перед родами при доношенной беременности.
3. Определить профиль экспрессии генов провоспалительных (IL1B, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL18, TNF, IFNG) и противовоспалительных (IL10, TGFB) цитокинов в отделяемом влагалища у беременных перед родами.
4. Выявить роль нарушений микробиоценоза и локального иммунитета влагалища в развитии осложнений родового акта и послеродового периода.
5. Разработать прогностические критерии послеродовых инфекционновоспалительных осложнений у родильниц на основании современных методов определения микробиоценоза и локального иммунитета влагалища.
Научная новизна На современном уровне, с применением молекулярно-биологических методов проведена оценка микробиоценоза влагалища и охарактеризован видовой состав флоры влагалища в норме и при дисбиотических состояниях перед родами.
Использование современных методов лабораторной диагностики позволило изучить профиль экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов в отделяемом влагалища при доношенной беременности.
Проведено типирование лактофлоры влагалища, показана связь определенных видов лактобактерий с экспрессией про- и противовоспалительных цитокинов, определена роль L. iners в развитии осложнений родового акта и послеродового периода.
Установлена взаимосвязь различных типов микробиоценоза влагалища с состоянием локального иммунитета и течением родового акта и послеродового периода. Определена роль Atopobium vaginae в развитии послеродовых осложнений.
Практическая значимость Исследование микробиоценоза влагалища методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволило своевременно диагностировать дисбиотические состояния и провести адекватную профилактику осложнений родового акта и послеродового периода.
Воспалительные заболевания нижних отделов репродуктивной системы беременных сопровождаются изменением профиля экспрессии мРНК цитокинов (повышаются IL1B, TNF, СD45, IL6, LIF, IL8, IL10, IFNG, снижаются TGFB1, IL12A и IL18), что позволяет использовать данные маркеры для оценки тяжести воспалительного процесса. В качестве объективного метода диагностики воспалительных заболеваний половых органов при беременности предложена модель с использованием значения уровней экспрессии мРНК генов IL1B, IL8, IL10 и IL18.
Определение профиля экспрессии генов цитокинов является важным диагностическим критерием, позволяющим объективно разграничить бессимптомное носительство условно-патогенной микрофлоры от проявлений вагинита.
Выявление грибов рода кандида и уреаплазм более 104 ГЭ/образец в отделяемом влагалища требует лечения только при наличии локальной воспалительной реакции.
Типирование лактобатерий способствует прогнозированию развития воспалительных заболевания половых органов и послеродовых осложнений.
Внедрение в клиническую практику современных методов исследования микробиоценоза и локального иммунитета влагалища у беременных перед родами позволяет своевременно предпринять меры по профилактике послеродовых воспалительных осложнений.
Положения, выносимые на защиту 1. Нарушение качественного и количественного состояния микробиоценоза влагалища является фактором риска осложнений родового акта и послеродового периода. Снижение доли лактобактерий менее 80% от общей бактериальной массы и/или повышение количества Atopobium vaginae выше 102,1 ГЭ/образец необходимо рассматривать как неблагоприятный прогностический признак.
2. Определение профиля экспрессии генов цитокинов является объективным диагностическим методом оценки локальной воспалительной реакции во влагалище и позволяет провести своевременную профилактику осложнений родов и послеродового периода.
3. Наличие грибов рода кандида и уреаплазм в количестве более 1ГЭ/образец имеет клиническое значение только при наличии локальной воспалительной реакции. Типирование лактобактерий является важным в диагностике воспалительных заболеваний половых органов и в прогнозе осложнений родов и послеродового периода. Повышение Lactobacillus iners является неблагоприятным прогностическим критерием.
4. Дисбиотические состояния влагалища сопровождаются локальной воспалительной реакцией в 10 раз чаще, чем при нормоценозе. При сочетании дисбиотических состояний влагалища с локальной воспалительной реакцией риск осложненного течения родов и послеродового периода увеличивается в 2 раза.
Внедрение результатов исследования в практику Практические рекомендации, основанные на результатах исследования, используются в работе акушерского обсервационного отделения Федерального государственного бюджетного учреждения Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Апробация работы Материалы диссертации представлены на 4ом и 6ом международных конгрессах по репродуктивной медицине (Москва, 2010, 2012), XIIом Всероссийском научном форуме Мать и дитя (Москва, 2011).
Обсуждение диссертации состоялось на заседании межклинической научной конференции 27 марта 2012 года и апробационной комиссии при Ученом Совете Д 208.125.01 ФГБУ Н - АГиП имени академика В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России 02 апреля 2012 года.
ичный вклад автора Автором самостоятельно проведен набор и анализ клинического материала, обследование, лечение и родоразрешение пациенток, статистическая обработка и научное обоснование полученных результатов.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01. - лакушерство и гинекология. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 4 и 5 паспорта акушерства и гинекологии.
Публикации результатов исследования По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе работы в журналах, рекомендуемых ВАК Минобразования и науки РФ.
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 155 страницах компьютерного текста. Работа состоит из введения, 5 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, общая клиническая характеристика обследованных беременных, результаты исследования и их обсуждение), выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложения (алгоритма). Работа иллюстрирована 35 таблицами и 17 рисунками. Библиографический указатель включает 210 работ цитируемых авторов, из них 92 на русском и 118 на иностранных языках.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы исследования Для решения поставленных задач проведено клинико-лабораторное обследование 157 женщин в сроках от 37 до 41 недель беременности без родовой деятельности с целым плодным пузырем.
Критериями исключения из исследования явились наличие у пациенток тяжелой экстрагенитальной и акушерской патологии, истмико-цервикальной недостаточности, преждевременного излития околоплодных вод, а также инфекций, передаваемых половым путем и лечение вагинальной инфекции в течение 3-4-х недель до данного исследования.
Изучены данные соматического, инфекционного и репродуктивного анамнеза, проанализированы течение данной беременности, родов, послеродового периода.
Специальные методы исследования:
Микроскопический метод Микроскопии вагинальных мазков, окрашенных по Граму. Метод использовали для оценки состояния вагинального микроценоза. Учитывали:
характер вагинального эпителия, наличие ключевых клеток, количество лейкоцитов, общую микробную обсемененность, морфологический состав микрофлоры, наличие дрожжеподобных грибов.
Исследование биоценоза влагалища, оценка локального иммунитета.
Исследование микрофлоры влагалища методом ПЦР в реальном режиме времени методом Фемофлор Взятие биологического материала (соскоб с задней стенки влагалища) осуществляли в пробирки с физиологическим раствором. Осаждение клеток и бактериальных агентов проводили путем центрифугирования при 130об/мин в течение 10 минут. Полученные клетки ресуспендировали в 100 мкл физиологического раствора. Для выделения ДНК использовали наборы Проба ГС производства ООО (НПО ДНК-Технология, Россия). Объем образцов после выделения составил 100 мкл.
Проводилась количественная оценка биоценоза влагалища (Фемофлор, ДНК-Технология, Россия). Так же было проведено обследование женщин методом ПЦР на наличие абсолютных патогенов:
Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis и герпесвирусов (ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ).
Амплификацию осуществляли в режиме реального времени согласно инструкции производителя. Обработка результатов осуществлялась автоматически с помощью программного обеспечения к приборам.
Формирование лабораторного заключения по результатам исследования методом Фемофлор было основано на критериях разработаных Е.С. Ворошилиной и соавт. (2011).
Исследование профиля мРНК цитокинов методом ОТ-ПЦР Для изучения состояния местного иммунитета определяли содержание провоспалительных цитокинов (ILB, TNF, IL6, IL8, IL18, IL12A/p35, IL10, IFNG, TGFB, LIF, а также общий лейкоцитарный антиген CD45) на локальном уровне. Во избежание деградации РНК взятие материала (вагинальные соскобы) осуществляли в пробирки с раствором гуанидинтиоционата (лизирующий раствор наборы Проба НК ООО (НПО ДНК-Технология, Россия). Осаждение РНК проводили изопропанолом в присутствии соосадителя, с последующими отмывками промывочными растворами. Объем образцов после выделения составил 50 мкл. Реакцию обратной транскрипции ставили в объеме 40 мкл (в реакцию брали 33 мкл образца). В качестве праймеров для обратной транскрипции использовали специфические олигонуклеотиды. Реакцию проводили при температуре 40С в течение 30 мин, с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95С в течение 5 минут. Для увеличения объемов образцов после ОТ кДНК разводили в 5 раз в ТЕ-буфере. Амплификацию осуществляли согласно инструкции производителя. Реакцию ставили в двух повторах для каждой точки. Нормировка проводилась по пяти референсным генам HPRT1, TBP, B2M, GUSB, ABL. Использован метод сравнения индикаторных циклов (метод Cq).
Ультразвуковой скрининг осуществлялся на протяжении всей беременности, проводились допплерометрическое исследование кровотока в системе мать-плацента-плод во II-III триместрах, кардиомониторный контроль за состоянием плода в III триместре.
Изучение здоровья новорожденных. Осмотр детей осуществлялся совместно с неонатологом сразу после рождения, определялось их состояние по шкале Апгар. В дальнейшем изучалась динамика массы новорожденных.
Статистические методы исследования При разработке критериев диагностики вагинита был проведен дискриминантный анализ с использованием пакета программ Statistica 8.0. и построена математическая модель, позволяющая вычислить значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ) для каждого клинического образца. С использованием полученной КЛДФ была построена классификационная математическая модель. Для расчёта оптимального значения величины порога отсечения (точки cut off) использовали метода, получивший название ROC-анализ (Receiver Operator Characteristic - операционная характеристика приёмника). Основой данного анализа является построение так называемой ROC-кривой, которая наиболее часто используется для представления результатов бинарной классификации в машинном обучении. ROC-кривая показывает зависимость количества верно классифицированных положительных примеров от количества неверно классифицированных отрицательных примеров. Для установления точки cut off проводился пересмотр значений классификационной функции от максимального до минимального значения. Для каждого значения проводилось разделение групп с определением чувствительности и специфичности. Критерием выбора порога отсечения выбрано требование максимальной суммарной чувствительности и специфичности модели.
Результаты исследования и их обсуждение В данной работе представлены результаты анализа особенностей течения и исходов беременности у 157 женщин. Наиболее распространенной экстрагенитальной патологией были заболевания мочевыделительной системы, отмеченные у 60 (38,2%) женщин. У 124 (78,9%) пациенток менархе было своевременным, в возрасте от 12 до 14 лет. Длительность менструального цикла у большинства женщин колебалась от 25 до 35 дней. Самым распространенным и часто выявляемым состоянием была эктопия шейки матки - 42,1% пациенток. Эндометриоз и/или аденомиоз - 15,3%, хронический сальпингоофорит отмечен у 14,1% женщин, миома матки - 8,9%, бесплодие 5,1%.
Вагинальный кандидоз перенесли 24,8% женщин, бактериальный вагиноз - 5,1%, микоплазменную инфекцию - 14,1%. Среди обследованных женщин было 45,9% первобеременных первородящих, 32,5% повторнобеременных повторнородящих и 21,6% повторнобеременных первородящих. Частота искусственного аборта составила 32,0%, самопроизвольных выкидышей - 18,8%, неразвивающейся беременности Ц17,6%. Анамнез женщин был отягощен преждевременными родами - у 3,9%, гипотрофией новорожденных - у 5,8%, внутриутробной инфекцией плода - у 3,9%.
Таким образом, обследованные женщины по исходной клинической характеристике, экстрагенитальной и генитальной патологии могут быть отнесены к группе низкого риска по развитию инфекционно-воспалительных осложнений, что позволило объективно оценить влияние именно изменений микробиоценоза влагалища и локальной воспалительной реакции на течение родов и послеродового периода.
Анализ течения настоящей беременности показал, что из осложнений преобладала угроза прерывания в I (40,7%) и во II (27,4%) триместрах, угроза преждевременных родов составила 10,2%. Достаточно часто встречались:
анемия - 34,4%, ранний токсикоз - 25,4% и преэклампсия - 24,2%. По данным методов функциональных диагностики чаще встречались: многоводие - у 18,4% пациенток, маловодие - у 16,6%, умеренные нарушения реактивности сердечно-сосудистой системы плода - у 9,5%, нарушение кровотоков I Б степени - у 7,0%. ОРВИ с повышением температуры тела наблюдалась у 31,8% женщин. В период настоящей беременности у пациенток чаще встречались вагинальный кандидоз - у 19,1%, неспецифический вагинит - у 8,3%, бактериальный вагиноз - у 3,2%, микоплазменная инфекция у 3,2% женщин.
Обследование всех 157 беременных в 34-36 недель показало, что микробный пейзаж влагалища был в норме.
Среди обследованных пациенток роды через естественные родовые пути произошли у 56,1% женщин, путем операции кесарева сечение родоразрешено 43,9% пациенток. Все роды в исследуемой группе женщин были своевременными. Средняя продолжительность родов составила 7,82,6 часов. Объем кровопотери после родов через естественные пути в среднем составил 250,7100,9 мл.
Из осложнений преобладало преждевременное излитие околоплодных вод - 19,1%. Длительность безводного промежутка в среднем составила 8,2+2,1 часа. В большинстве (54,0%) случаев показания к абдоминальному родоразрешению были сочетанными как со стороны матери, так и плода, в 21,0% они были только со стороны плода, и в 25,0% - со стороны матери.
Средний объем кровопотери во время операции кесарева сечения составил 539,13+77,7 мл.
Осложнения послеродового периода в исследуемой нами группе были выявлены в 12,7%; из них в 9,5% - отмечалась субинволюция матки, в 1,9% - эндометрит, в 1,3% - раневая инфекция.
В нашем исследовании не выявилась зависимость частоты возникновения и клинического течения послеродовых осложнений от способа родоразрешения, что наглядно представлено на рисунке 1.
Рис. 1. Осложнения послеродового периода в зависимости от метода родоразрешения Исход родов для плода и течение раннего неонатального периода были проанализированы у 157 новорожденных. Все дети были доношенными.
Масса новорожденных колебалась от 2750 до 4440 г и составила в среднем 3552,4244,1 г. Основная часть детей (142 - 92,3%) родились без признаков асфиксии, а 12 (7,7%) новорожденных в асфиксии легкой степени. Внутриутробное инфицирование плода и реализация инфекции отмечены у 6 (3,8%) детей. Остальные дети (151 - 96,2%) на момент рождения и выписки из роддома были практически здоровы.
При количественном анализе биоценоза влагалища перед родами выявлено, что данный биотоп характеризуется высокой бактериальной обсемененностью и широким видовым разнообразием. Основным компонентом биоценоза являлись лактобактерии их количество колебалось от 10 5,2 до 8,ГЭ/образец. Среди всех исследованных групп микроорганизмов можно выделить минорные группы, доля которых ни у одной пациентки не превысила 10%. К ним относятся стафилококки (максимальная доля 1,4%), мобилункус (4,7%), пептострепоткокки (3,3%), а также генитальные микоплазмы - Mycoplasma hominis (0,9%) и Ureaplasma urealyticum (9,2%). Ряд микроорганизмов у некоторых пациенток были основным компонентом микробиоценоза. Так доля энтеробактерий и гарднерелл превышала 68%, а максимальная доля атопобиума достигала 59,1%. У большинства женщин основу микробиоценоза составляли лактобактерии и медиана доли остальных микроорганизмов не превышала 0,02%, а 75 процентиль - 0,38%.
В нашем исследовании нормоценоз был выявлен у 141 (89,8%) пациентки. При этом абсолютный нормоценоз у 84 (53,5%) обследованных женщин, а относительный нормоценоз у 57 (36,3%). У 40,4% женщин на фоне сохранной нормофлоры обнаруживались различные ассоцианты, чаще всего наблюдалось увеличение количества Ureaplasma urealyticum (77,7%) и Candida spp. (35,1%). Частота встречаемости Ureaplasma urealyticum и грибов рода кандида не зависела от количества лактобактерий, что соотносится с данными литературы (Zhou H. et al., 2006; Прилепская В.Н., 2010).
У пациенток, в микробиоценозе которых встречался атопобиум, чаще (p=0,057) развивались послеродовые осложнения (19,6%) по сравнению с 9,9% при отсутствии этого микроорганизма.
Доля анаэробных микроорганизмов при дисбиозе составила 52,(34,89-76,85)%, что было статистически значимо выше по сравнению с долей анаэробов при нормоценозе 0,13 (0,02-0,88)%. При этом доля аэробов у женщин с дисбиозом составила 0,02 (0,00-1,31)% у женщин с нормоценозом 0,(0,00-0,04)%, которое не было статистически значимым.
Данные об осложнениях течения родов и послеродового периода у женщин с различным типом биоценоза представлены в таблице 1.
Таблица Осложнения родов и послеродового периода Осложнения родов и Абсолютный Относительный Дисбиотические Всего послеродового пе- нормоценоз нормоценоз состояния влага- (n=157) риода (n=84) (n=57) лища (n=16) Кол Кол % Кол % Кол % Преждевременное 14 16,6 11 19,3 5 31,3 30 19,излитие околоплодных вод Травмы мягких тка- 4 4,7* 3 5,3* 4 25,0* 11 7,ней родовых путей Субинволюция мат- 7 8,3* 5 8,7* 4 25,0* 15 9,ки Раневая инфекция 0 - 1 1,8 1 6,3 2 1,Послеродовой эндо- 0 - 1 1,8* 2 12,5* 3 1,метрит * - достоверные различия между группами (р<0,05) Как видно из данных, представленных в таблице 1, наиболее часто встречающимся осложнением родового акта явилось преждевременное излитие околоплодных вод, которое отмечалось у 16,6% беременных с абсолютным нормоценозом влагалища, у 19,3% - с относительным нормоценозом влагалища и у 31,3% - с дисбиотическими нарушениями микрофлоры влагалища разной степени тяжести, что соответствует данным литературы (DiGiulio D.B. et al., 2008; Han Y.W., 2009).
Травмы мягких тканей родовых путей были у 25,0% родильниц с дисбиотическими нарушениями микрофлоры влагалища и имели статистически значимые различия (р<0,05) с пациентками с относительным нормоценозом 3 (5,3%) и абсолютным нормоценозом 4 (4,7%).
Особого внимания заслуживает факт достоверно высокой частоты (р<0,05) осложнений послеродового периода у женщин с дисбиотическими нарушениями микрофлоры влагалища, которая составила 43,8% случаев.
Причем в 12,5% случаев из них был диагностирован послеродовой эндометрит, в 25,0% - субинволюция матки, в 6,3% - раневая инфекция.
Рис. 2. Частота встречаемости осложнений послеродового периода среди женщин с различными типами биоценоза влагалища.
Для определения состояния локального иммунитета влагалища у беременных перед родами был проведен анализ экспрессии генов цитокинов и общего лейкоцитарного антигена (CD45). В результате было выявлено, что при наличии локальной воспалительной реакции (группа 2) повышены уровни экспрессии мРНК генов IL1B - в 9,1, TNF - в 2,7, СD45 - в 6,7, IL6 - в 13,1, LIF - в 5,9, IL8 - в 6,1, IL10 - в 5,2, IFNG - в 13,5 раз, а уровень экспрессии мРНК генов TGFB1 - в 1,8, IL12A - в 1,7 и IL18 - в 3,7 раза снижены по сравнению с группой женщин с абсолютным нормоценозом (референс - группа).
40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 Значение КЛДФРеференс-группа Вагинит Доля женщин Рис 3. Гистограмма распределения беременных по значению КЛДФ в группах Профиль экспрессии генов цитокинов в вагинальных мазках женщин с обильными выделениями без признаков воспаления не отличался от пациенток с абсолютным нормоценозом влагалища (таблица 2).
Таблица Сравнительный анализ профиля экспрессии мРНК генов цитокинов в вагинальных мазках в исследуемых группах беременных Ген Группа 1 (Нормоценоз) Группа Абсолютный Относительный Вагиниты (n=24) Референс- Обильные Ureaplasma spp. Кандидо группа выделения более 104 носитель- (n=42) (n=8) ГЭ/образец ство (n=16) (n=11) IL1B 9,1 1,04 1,35 0,(6,8-12,8) (0,47-1,79) (0,57-3,18) (0,30-2,07) (0,55-1,33) p=5,0 x 10-TNF 2,1 0,69 1,31 0,(1,9-4,1) (0,62-1,90) (0,38-1,76) (0,62-3,38) (0,66-1,10) p=4,4 x 10-CD45 6,1 0,86 0,70 0,(3,5-9,9) (0,38-1,72) (0,57-3,02) (0,28-1,59) (0,53-1,64) p=1,3 x 10-IL6 13,1 1,60 0,85 0,(5-73,6) (0-3,72) (0,17-2,92) (0,00-9,67) (0,55-1,21) p=2,8 x 10-LIF 0,23 5,1 1,27 0,(0,14-0,53) (3,5-48,8) (0,33-1,96) (0,71-2,78) (0,34-2,57) p=2,5 x 10-3 p=7,3 x 10-IL8 6,1 0,74 1,20 0,(2,9-11,8) (0,45-1,85) (0,28-1,47) (0,24-2,51) (0,42-0,72) p=2,8 x 10-IL10 2,82 5,1 0,93 2,(1,99-3,97) (4,1-9,5) (0,34-2,36) (0,69-2,40) (0,93-5,58) p=5,5 x 10-3 p=1,3 x 10-TGFB1 0,1 2,55 1,31 0,(0,31-1,0) (0,68-2,23) (1,29-2,93) (0,69-1.85) (0,59-0,98) p=1,3 x 10-IL12A 0,1 1,18 0,93 0,(0,28-0,98) (1,71-2,33) (0,99-1,55) (0,62-1,41) (0,55-1,10) p=5,4 x 10-IL18 0,1 1,31 0,69 0,(0,15-0,45) (0,64-1,40) (1,17-1,49) (0,39-1,38) (0,53-1,02) p=3,2 x 10-IFNG 1 0,00 3,33 4,59 13,(0-4,13) (0,00-0,00) (0,00-9,97) (4,00-5,62) (0-28,3) p=6,4 x 10-3 p=3,8 x 10-2 p=6,5 x 10-Бессимптомное носительство Candida spp. сопровождалось достоверным повышением IL10 и IFNG в 2,8 и 4,6 раза соответственно, и снижением LIF в 4,3 раза по сравнению с группой женщин с абсолютным нормоценозом. При этом повышения уровня провоспалительных цитокинов отмечено не было, что, по-видимому, связано с отсутствием воспалительной реакции.
При воспалительных процессах во влагалище беременных наблюдалась выраженная реакция клеток вагинальных соскобов в виде повышения уровня экспрессии ряда провоспалительных цитокинов (IL1B, TNF, IL6, LIF, IL8, IFNG), а также иммунорегуляторного IL10 и общего лейкоцитарного антигена CD45.
Анализ течения родов показал, что структура методов родоразрешения не различалась между группами. Осложнения родов и послеродового периода статистически значимо чаще встречались в группе беременных с признаками воспаления слизистой влагалища (p=1,3*10-5, OR=10,4 (3,28-32,94)), при этом различия между подгруппами женщин без признаков воспаления не были статистически значимыми. В подгруппе женщин с относительным нормоценозом из 12 женщин с осложнениями родов и послеродового периода у выявлена уреаплазма в количестве более 104 ГЭ/образец.
Таким образом, Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/образец может рассматриваться как фактор риска осложнений родов и послеродового периода, что согласуется с данными зарубежных исследователей (Zhou H. et al., 2006). Однако в нашем исследовании было установлено, что осложнения в послеродовом периоде возникали 2 раза чаще при сочетании Ureaplasma spp. более 104 ГЭ/образец и локальной воспалительной реакции.
У женщин с бессимптомным носительством дрожжеподобных грибов рода Candida не было ни одного случая осложнений родов и послеродового периода, в то время как у женщин с кандидозным вагинитом осложнения родов и послеродового периода отмечались в 77,7% случаев. По данным литературы, более чем в 40% случаях при беременности ВВК, носит характер бессимптомного кандидоносительства и не вызывает осложнений (Sherrard J.
et al., 2011), что согласуется с результатами нашего исследования. Candida spp. может рассматриваться как фактор риска осложнений родов и послеродового периода только при наличии локальной воспалительной реакции.
Данные об осложнениях течения родов и послеродового периода у женщин с различным профилем экспрессии генов цитокинов представлены в таблице 3.
Таблица Осложнения родов и послеродового периода Осложнения Группа 1 (Нормоценоз) Группа Абсолютный Относительный Вагиниты нормоценоз (n=42) нормоценоз (n=35) (n=24) Кол. % Кол. % Кол. % Преждевременное изли- 7 16,7 6 17,1 7 29,тие околоплодных вод Разрывы мягких тканей 1 2,4 5 14,3 7 29,2* родовых путей Послеродовые осложне- 3 7,1 3 8,6 6 25,0* ния, всего Из них:
Раневая инфекция - - - - 1 2,Субинволюция матки 3 7,1 2 5,7 3 14,Послеродовый эндомет- - - 1 2,8 2 8,3* рит Всего женщин с ослож- 9 21,4 12 34,3 13 54,2* нениями * - достоверные различия между группами 1 и 2 (р<0,05) Наиболее часто встречающимся осложнением родового акта явилось преждевременное излитие околоплодных вод. Разрывы мягких тканей родовых путей достоверно чаще наблюдались во 2 группе - (29,2%) по сравнению с группой 1 (7,8%) (p=0,012, OR=4,87 (1,48-16,10)). Общее количество осложнений послеродового периода в группе с признаками воспаления слизистой влагалища было статистически значимо высоким (р=0,033) и составило 25,0% случаев по сравнению с группой беременных без признаков воспаления, где осложнения пуэрперия наблюдались в 7,8% (OR=3,94 (1,1613,44)).
Таким образом, помимо качественного и количественного состава микробиоты влагалища существенным фактором риска послеродовых осложнений является наличие локальной воспалительной реакции слизистой влагалища.
В качестве объективного метода диагностики воспалительных заболеваний при беременности была предложена модель с использованием оценки уровней экспрессии мРНК генов IL1B, IL8, IL10 и IL18, что позволило своевременно предпринять меры по профилактике послеродовых осложнений.
Кроме того, в рамках нашего исследования, мы провели типирование лактобактерий (рисунок 4).
100% 80% 60% 40% 20% 0% референс-группа обильные вагиниты (n=24) (n=42) выделения (n=35) несколько видов, включая 10
Из данных, представленных на рис. 4, видно, что доминирующими видами в составе лактофлоры были: L. crispatus, L. gasseri, L. jensenii и L. iners.
У женщин с нормоценозом влагалища в составе лактофлоры чаще доминировали L. сrispatus >90%. В группе беременных с вагинитами преобладали L.
iners - от 10 до 100% лактофлоры, что было достоверно выше по сравнению со здоровыми женщинами. Выявлено, что при наличии L. iners были повышены уровни экспрессии мРНК генов IL6, LIF, IL10 (рисунок 5).
У р о в е н ь э к с п р е с с и и м Р Н К -L.iners<10% IL6 IL10 IL18 LIF L.iners>10% цитокины Рис.5. Влияние L.iners на уровень экспрессии мРНК генов цитокинов Таким образом, повышенное количество L. iners можно расценивать как неблагоприятный прогностический признак при оценке состояния микробиоценоза влагалища, предрасполагающий к развитию воспалительных заболеваний половых органов. В свою очередь, повышенное количество L.
crispatus является благоприятным прогностическим признаком течения родов и послеродового периода при оценке микробиоценоза влагалища перед родами.
Таким образом, на основании полученных результатов мы выделили два фактора, ассоциированных с осложненным течением послеродового периода - это дисбиотические нарушения влагалищной микрофлоры и локальная воспалительная реакция. Выявление воспалительного профиля экспрессии генов цитокинов во влагалище является признаком локальной воспалительной реакции и может быть важным дополнительным диагностическим критерием, позволяющим объективно различить бессимптомное носительство условно-патогенной микрофлоры от проявлений вагинита.
абораторная оценка профиля экспрессии генов цитокинов во влагалище позволяет существенно повысить эффективность диагностики инфекционно-воспалительных заболеваний и может быть использован для своевременной профилактики осложнений родов и послеродового периода.
ВЫВОДЫ 1. Возраст большинства обследованных женщин составляет 25-лет (42,1%), паритет родов - первобеременные первородящие 45,9%. Репродуктивный анамнез пациенток не отягощен, предыдущие беременности закончились своевременными родами в 96,1% случаев. Частота встречаемости экстрагенитальной и генитальной патологии не отличается от популяционных данных. Вышеизложенное позволяет отнести обследованных женщин к группе низкого риска по развитию инфекционно-воспалительных осложнений и оценить именно влияние микробиоценоза и локального иммунитета на течение родов и послеродового периода.
2. При доношенной беременности видовой состав нормофлоры не отличается от таковой вне и при беременности. Абсолютный нормоценоз выявлен в 53,5% случаев и характеризуется преобладанием доли лактобактерий - более 80% от общей бактериальной массы, содержанием условнопатогенных аэробных и анаэробных микрооганизмов - менее 10% от общей бактериальной массы, абсолютным количеством грибов рода Candida и микоплазм - не более 104 ГЭ/образец. При относительном нормоценозе (36,3% случаев) на фоне высокого содержания лактобактерий выявляются грибы рода Candida и микоплазмы более 104 ГЭ/образец.
3. Дисбиотические состояния влагалища перед родами характеризуются снижением доли лактобактерий от 80% до 20% от общей бактериальной массы и увеличением доли аэробов и анаэробов (умеренный дисбиоз - 7,6%), а также снижением доли лактобактерий менее 20% от общей бактериальной массы и резким увеличением аэробов и анаэробов (выраженный дисбиоз - 2,5%).
4. Воспалительные заболевания нижних отделов репродуктивной системы беременных женщин сопровождаются изменением профиля экспрессии мРНК цитокинов. При этом повышается экспрессия генов IL1B в 9,раза, IL6 - в 13,1, IFNG - в 13,5, IL8 - в 6,1, СD45 - в 6,7, LIF - в 5,9, IL10 - в 5,2, TNF - в 2,7, снижается TGFB1 - в 1,8 раза, IL12A - в 1,7 и IL18 - в 3,7, что позволяет использовать данные маркеры для диагностики воспалительного процесса.
5. Нарушение структуры микробиоценоза влагалища перед родами является значимым фактором риска осложненного течения родов и послеродового периода, что приводит к травме мягких тканей родовых путей (25,0%), субинволюции матки (25,0%), эндометриту (12,5%), раневой инфекции (6,3%).
6. Помимо дисбиотических состояний влагалища, существенным фактором риска осложнений родов и послеродового периода является наличие локальной воспалительной реакции, приводящей к осложнениям в 54,2% случаев. При абсолютном нормоценозе частота выявления воспалительного профиля экспрессии генов цитокинов составляет 3,7%, а при выраженном дисбиозе в 10 раз выше (33,3%).
7. Типирование лактобактерий является важным в диагностике воспалительных заболеваний половых органов. Повышенное количество Lactobacillus iners вызывает активацию локального иммунитета увеличением IL6 - в 2,9 раза, LIF - в 2,5 раза, IL10 - в 2 раза, что можно расценивать как неблагоприятный прогностический признак при оценке состояния микробиоценоза влагалища и прогнозе воспалительных заболеваний половых органов.
8. Наличие Candida spp. и Ureaplasma spp. в количестве более 1ГЭ/образец во влагалище перед родами вне зависимости от сохранности нормофлоры приводит к осложнениям течения родов и послеродового периода только при наличии локальной воспалительной реакции (77,7% и 75% соответственно).
9. Высокий уровень Atopobium vaginae (102.1 ГЭ/образец и более) может рассматриваться как фактор риска развития осложнений родов и послеродового периода вне зависимости от наличия локальной воспалительной реакции.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Структура биоценоза перед родами при доношенной беременности соответствует таковой вне и в течение беременности и может оцениваться по тем же критериям. Абсолютный нормоценоз характеризуется преобладанием лактобактерий более 80% от ОБМ, долей условно-патогенных аэробных и анаэробных микрооганизмов менее 10% от ОБМ, абсолютным количеством грибов рода кандида и микоплазм не более 104 ГЭ/образец. Относительный нормоценоз характеризуется тем, что на фоне высокого содержания лактобактерий (более 80% от ОБМ) выявляются микоплазмы и/или грибы рода Candida более 104 ГЭ/образец. Умеренный дисбиоз - снижением лактобактерий от 80 до 20% ОБМ и увеличением доли аэробов и/или анаэробов. Выраженный дисбиоз - долей лактобактерий ниже 20% от ОБМ при резком увеличении анаэробов и аэробов.
2. Маркерами воспалительных заболеваний нижних отделов репродуктивной системы во время беременности являются изменения профиля экспрессии мРНК цитокинов. Наиболее информативно определение IL1B, IL8, IL10, IL18.
3. Наличие абсолютного нормоценоза влагалища перед родами свидетельствует о низком риске возможных осложнений родов и послеродового периода.
4. При выявлении относительного нормоценоза целесообразно определение профиля экспрессии генов цитокинов IL1B, IL8, IL10,IL18 в отделяемом влагалища и вычисление значения канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ). Значение КЛДФ выше cut-off свидетельствует о наличии локальной воспалительной реакции слизистой влагалища и требует проведения своевременной профилактики осложнений родов и послеродового периода.
5. При наличии умеренного или выраженного дисбиоза влагалища беременных следует относить к группе высокого риска по развитию осложнений родов и послеродового периода, что требует проведения необходимого комплекса лечебно-профилактических мероприятий.
6. Важным в диагностике воспалительных заболеваний половых органов является типирование лактобактерий. Преобладание в лактофлоре Lactobacillus crispatus можно расценивать как благоприятный прогностический признак при оценке состояния микробиоценоза влагалища. Повышение количества Lactobacillus iners предрасполагает к развитию воспалительных заболеваний половых органов и является неблагоприятным фактором в плане прогноза осложнений родов и послеродового периода.
7. Выявление в отделяемом влагалища Atopobium vaginae в количестве более 10 2,1 ГЭ/образец может рассматриваться как фактор риска по развитию осложнений родов и послеродового периода и требует проведения лечебно-профилактических мероприятий.
8. Наличие Candida spp. и Ureaplasma spp. более 104 ГЭ/образец перед родами вне зависимости от сохранности флоры влагалища может рассматриваться как фактор риска осложнений родов и послеродового периода только при наличии локальной воспалительной реакции. Бессимптомное кандидоносительство не требует лечения.
9. Сочетание дисбиотических состояний влагалища с локальной воспалительной реакцией у беременных перед родами требует тщательного контроля в послеродовом периоде с проведением полного комплекса лечебно-профилактических мероприятий.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Качественный и количественный состав микробиоценоза влагалища беременных женщин. / Донников А.Е., Тумбинская Л.В., Ворошилина Е.С., Муллабаева С.М., Меджидова М.К., Касабулатов Н.М. // Четвертый международный конгресс по репродуктивной медицине: Материалы конгресса.- Москва, 18-21 января, 2010.- С.67-68.
2. Оптимизация профилактики гнойно-воспалительных заболеваний послеродового периода. / Балушкина А.А., Меджидова М.К., Огай О.Ю., Тютюнник В.Л. // XIIый Всероссийский научный форум Мать и дитя:
Материалы форума.- Москва, 27-30 сентября, 2011.- С.17.
3. Особенности локального иммунитета при дисбиотических состояниях влагалища перед родами. / Меджидова М.К., Трофимов Д.Ю., Донников А.Е., Бурменская О.В., Тютюнник В.Л. // XIIый Всероссийский научный форум Мать и дитя: Материалы форума.- Москва, 27-30 сентября, 2011.- С.95-96.
4. Основные принципы терапии вульвовагинального кандидоза. / Ефимов Б.А., Тютюнник В.Л., Меджидова М.К. // Русский медицинский журнал.-2011.- Т.19, № 20.- С.1253-1256.
5. Неспецифический вагинит: этиология, патогенез, клиника, диагностика, современные принципы лечения. / Тютюнник В.Л., Михайлова О.И., Меджидова М.К. // Акушерство и гинекология.-2011.-№ 7-2.- С.92-96.
6. Профиль экспрессии мРНК генов цитокинов при дисбиотических состояниях влагалища у беременных накануне родов. / Меджидова М.К., Бурменская О.В., Донников А.Е., Трофимов Д.Ю., Тютюнник В.Л. // Шестой международный конгресс по репродуктивной медицине: Материалы конгресса.- Москва, 18-21 января, 2012.- С.40-41.
7. Инфекция гениталий. Акушерские и перинатальные исходы. / Карапетян Т.Э., Тютюнник В.Л., Меджидова М.К. // Шестой международный конгресс по репродуктивной медицине: Материалы конгресса.- Москва, 18-21 января, 2012.- С.66-67.
8. Современные представления и основные принципы лечения неспецифического вагинита. / Тютюнник В.Л., Михайлова О.И., Карапетян Т.Э., Меджидова М.К. // Русский медицинский журнал.-2012.- Т.20, № 1.- С.24-27.
9. Микробиоценоз влагалища и его особенности у беременных перед родами. / Меджидова М.К., Донников А.Е., Балушкина А.А., Тютюнник В.Л. // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии.-2012.- Т.11, № 2.- С.38-46.
10. Оценка локальной воспалительной реакции во влагалище по профилю экспрессии мРНК генов цитокинов у беременных накануне родов. / Меджидова М.К., Бурменская О.В., Донников А.Е., Непша О.С., Трофимов Д.Ю., Тютюнник В.Л., Сухих Г.Т. // Акушерство и гинекология.-2012.-№ 3.- С.26-31.
Алгоритм обследования микробиоценоза и локального иммунитета влагалища у беременных перед родами Оценка состояния микробиоценоза с помощью теста Фемофлор 16 Абсолютный Относительный Умеренный Выраженный нормоценоз нормоценоз дисбиоз дисбиоз Lactobacillus spp.> 80% Lactobacillus spp.> 80% Lactobacillus spp Lactobacillus spp и и 20-80% <20% Candida <104 Candida >104 Аэробы и/или Аэробы и/или и или Анаэробы >10% Mycoplasma spp.<104 Mycoplasma spp.>104 Анаэробы > 10% и или Ureaplasma spp.
Ureaplasma spp. <1>1Оценка профиля экспрессии генов цитокинов IL1B, IL8, IL10, ILВоспаления нет Воспаление есть Низкий риск Высокий риск Высокий риск развития осложнений развития осложнений развития осложнений в родах и в родах и в родах и послеродовом периоде послеродовом периоде. послеродовом периоде.
Необходимости в опредеРешение вопроса о при- лении профиля экспресменении антибактери- сии цитокинов нет.
альных препаратов. Провести этиотропную терапию.