Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по химии  

На правах рукописи

ДОЦЕНКО ГЛЕБ СЕРГЕЕВИЧ

Свойства рекомбинантных целлюлаз и гемицеллюлаз Chrysosporium lucknowense

02.00.15 - кинетика и катализ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва - 2012

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии

Химического факультета Московского государственного университета

имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор

Синицын Аркадий Пантелеймонович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор,

зав. лабораторией физиологически активных биополимеров

Федерального государственного бюджетного учреждения науки

Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова

Российской академии наук

Ямсков Игорь Александрович

доктор биологических наук, профессор,

зав. лабораторией молекулярных основ биотрансформаций

Федерального государственного бюджетного учреждения науки

Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Королева Ольга Владимировна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

РАН, г. Пущино

       Защита состоится  л    ноября  2012 года  в  15oo часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

       С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

       Автореферат разослан  л 25 октября  2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета, 

кандидат химических наук         Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Развитие человеческой цивилизации во все времена было тесно связано с освоением и использованием различных источников энергии. При этом для сохранения темпов развития требовалось поддержание определённого уровня энергозатрат, а для открытия новых горизонтов оказывалось необходимым увеличение энерговложений. Поэтому поиск новых источников энергии и их эффективное использование всегда являлось актуальной задачей, стоящей перед человечеством. Не стало исключением и наше время, суть этой задачи сохранилась, однако 21 век всё же внёс свою специфику в постановку этой задачи и в требования к её предлагаемым решениям. Так, современный источник энергии должен удовлетворять критериям доступности, мощности, экологичности, возобновляемости, а также конкурентоспособности с традиционными углеводородными энергоносителями. Растительное сырьё удовлетворяет всем выдвинутым критериям, и усилия биотехнологов направлены на разработку наиболее эффективных способов его использования.

Промышленная технология ферментов начала развиваться в первой четверти 20 века, и довольно скоро стало понятным, что большое разнообразие ферментов и их характеристик предоставляет широкие возможности не только для эффективной переработки растительного сырья, но и для всевозможных контролируемых модификаций различных растительных биополимеров с последующим получением продуктов, обладающих ценными, заранее определёнными свойствами. В настоящее время интенсивный поиск новых продуцентов ферментов по-прежнему продолжается, а изучение свойств этих ферментов и их генно-инженерных модификаций является неотъемлемой частью современной биотехнологии.

В результате совместных исследований, проведённых на кафедре химической энзимологии МГУ имени М. В. Ломоносова, в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина и нашими зарубежными коллегами, был найден перспективный продуцент ферментов, обладающих ценными биотехнологическими свойствами и способных гидролизовать различные углеводсодержащие субстраты - гриб Chrysosporium lucknowense, в последнее время известный также под названием Myceliophthora thermophila. Ранее в нашей лаборатории были изучены свойства некоторых эндоглюканаз, целлобиогидролаз и ксиланаз этого гриба. Дальнейшее изучение свойств новых ферментов C.lucknowense (как, впрочем, и ферментов любого другого перспективного продуцента) является важной и актуальной задачей, поскольку получаемые сведения имеют как теоретическую ценность, так и практическое значение, расширяющее потенциал современной биотехнологии.

Цели и задачи исследования. Целью данной диссертационной работы являлось изучение свойств новых, не исследованных ранее ферментов гриба C.lucknowense. Выбор этой цели был продиктован как необходимостью систематизировать знания о составе и свойствах индивидуальных компонентов, входящих в состав ферментного комплекса C.lucknowense, так и перспективой их использования в процессах трансформации углеводсодержащего растительного сырья.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1) Изучить биохимические свойства десяти новых ферментов C.lucknowense: трёх эндоглюканаз, двух α-галактозидаз, -маннаназы, -маннозидазы, двух -ксилозидаз и α-арабинофуранозидазы.

2) Исследовать возможности модификации полисахаридных субстратов гомогенными ферментами, их смесями между собой и с ферментами других грибных продуцентов.

3) Исследовать возможности гидролиза биотехнологического растительного сырья гомогенными ферментами, их смесями между собой и с ферментами других грибных продуцентов.

Научная новизна работы. Впервые охарактеризованы биохимические свойства - субстратная специфичность, каталитические параметры гидролиза специфических субстратов, рН- и температурные зависимости активности, термостабильность, характер изменения молекулярно-массового распределения (ММР) полимерного субстрата в процессе его гидролиза - десяти новых, не изученных ранее ферментов, кодируемых молчащими генами C.lucknowense - трёх эндоглюканаз, двух α-галактозидаз, -маннаназы, -маннозидазы, двух -ксилозидаз и α-арабинофуранозидазы. Предложена новая, не рассмотренная ранее в литературе статистическая модель, описывающая распределение замещенных и незамещенных звеньев полимерной цепи галактоманнанов, позволяющая характеризовать как структуру этих полисахаридов, так и субстратную специфичность галактоманнан-гидролизующих ферментов.

Практическая значимость работы. Изучены возможности практического применения исследованных ферментов как в гомогенном виде, так и в составе смесей с другими ферментами (секретируемыми как C.lucknowense, так и другими грибными продуцентами) для модификации специфических субстратов, а также для осахаривания целлюлозосодержащего сырья. В результате проведённых исследований обнаружена уникальная эндоглюканаза C.lucknowense ЭГ6, являющаяся, по-видимому, белком-энхансером. Показано, что комбинированное применение двух -галактозидаз (αГал1, αГал2), -маннаназы (βМан2) и -маннозидазы (βМнз9) C.luсknowense позволяет эффективно трансформировать как полисахаридные, так и олигосахаридные галактозо- и маннозосодержащие субстраты в продукты с определённой степенью полимеризации (СП) и структурой. Обнаружена уникальная -ксилозидаза (Ксз5), обладающая нехарактерной для ферментов своего класса широкой субстратной специфичностью, способная с высокой степенью конверсии гидролизовать не только ксилозо-, но и глюкозосодержащие полисахаридные и олигосахаридные субстраты по механизму экзо-деполимеризации.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на XVII, XVIII и XIX международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2010, 2011, 2012 (Москва, 2010, 2011, 2012), на VI московском международном конгрессе Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 2011) и на международной научной конференции Достижения и перспективы развития биотехнологии (Саранск, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора (две главы); отдельной главы, посвященной материалам и методам исследования; трёх глав, в которых приведены результаты и их обсуждение; выводов; списка литературы, содержащего ссылки на 196 источников, и приложения. Объем диссертации составляет 135 страниц и включает 54 рисунка и 29 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

итературный обзор посвящен рассмотрению состава и структуры основных компонентов растительной биомассы, а также описанию общих свойств карбогидраз. Рассмотрено общее строение и свойства целлюлозы и гемицеллюлоз, особое внимание уделено ксилансодержащим полисахаридам, а также полисахаридам, содержащим галактозу и маннозу. С учётом последних литературных данных описаны основные свойства эндоглюканаз, -ксилозидаз, α-галактозидаз, -маннаназ, -маннозидаз и α-арабинофуранозидаз.

Отдельная глава посвящена описанию использованных в работе методов исследования, приводится список использованных субстратов, реактивов, ферментов и ферментных препаратов.

В последующих главах для всех исследуемых ферментов по единому плану приводятся результаты исследования и их обсуждение. Так, сначала описывается субстратная специфичность гомогенных ферментов, затем приводятся каталитические параметры гидролиза ими специфических субстратов, после этого рН- и температурные зависимости активности, термостабильность. Затем полученные данные дополняются информацией о характере изменения ММР полимерного субстрата в процессе его ферментативного гидролиза, а также сведениями о составе конечных продуктов гидролиза этого субстрата. В заключение обсуждаются возможности практического применения исследуемых ферментов как в гомогенном виде, так и в составе смесей с другими ферментами для контролируемой модификации специфических субстратов, а также для осахаривания целлюлозосодержащего сырья.

1. СВОЙСТВА ЭНДОГЛЮКАНАЗ ЭГ1, ЭГ6, ЭГ7 С.lucknowense

Все три эндоглюканазы C.lucknowense (ЭГ1, ЭГ6, ЭГ7) обладали активностями по карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ), -глюкану и ламинарину. Для ЭГ7 была характерна более высокая активность по ламинарину, чем по 1,4--глюкану ячменя, то есть гидролиз 1,3--D-глюкозидных связей для этого фермента является более предпочтительным, чем гидролиз 1,4--D-глюкозидных связей (табл. 1).

Таблица 1. Удельные активности и биохимические параметры эндоглюканаз ЭГ1, ЭГ6, ЭГ7 (40С и рН5,0 для п-нитрофенил-гликозидов; 50С и рН5,0 для прочих субстратов).

Субстрат	Активность, ед/мг
	ЭГ1	ЭГ6	ЭГ7
п-нитрофенил-β-D-целлобиозид	3,3	0,01	0,00
п-нитрофенил-β-D-глюкопиранозид	0,01	0,01	0,00
п-нитрофенил-β-D-лактопиранозид	7,3	0	0,00
КМ - (выход восстанавливающих сахаров)	71	0,5	4
КМ - (вискозиметрия)	413	2	39
1,4--глюкан ячменя	1300	1,0	16
аминарин	6	0,3	21
ксилоглюкан	1	0	0
ксилан березы	2	0,1	3
микрокристаллическая целлюлоза	0,00	0,01	0,01
Биохимические параметры
Молекулярный вес, кДа	55	40	43
рI	4,8	4,7	5,9
Тип действия	эндо	эндо	эндо
Семья гликозилгидролаз	7	6	6

Значение КМЦ-азной активности, измеренной вискозиметрическим методом, для ЭГ1 (413 ед/мг) было значительно выше, чем для ЭГ6 и ЭГ7 (2 и 39 ед/мг, соответственно). Это свидетельствует о менее упорядоченном механизме действия ЭГ1 на полимерный субстрат по сравнению с ЭГ6 и ЭГ7. Отсутствие активности ЭГ1 по микрокристаллической целлюлозе (МКЦ), а также низкая активность ЭГ6 и ЭГ7 по этому субстрату, свидетельствует об отсутствии целлюлозосвязывающего модуля в структуре молекул этих ферментов.

ЭГ6 характеризовалась относительно низким значением Vм/[E] (табл. 2), а ЭГ1, напротив, обладала повышенной каталитической эффективностью по сравнению с большинством описанных в литературе эндоглюканаз. Ингибирования исследуемых эндоглюканаз продуктом гидролиза целлюлозы - D-глюкозой - до концентрации D-глюкозы 10 мг/мл - обнаружено не было.

Таблица 2. Каталитические параметры гидролиза КМ - эндоглюканазами C.lucknowense (рН5,0; 50С).

Эндоглюканаза	Kм, мг/мл	Vм/[E], 1/с
ЭГ1	5,90,4	20811
ЭГ6	2,90,2	0,70,1
ЭГ7	2,00,1	141

рН- и температурные оптимумы активности ферментов являются их важными биохимическими параметрами, используемыми для сравнения свойств ферментов между собой и учитываемыми при выборе оптимальных условий биотехнологических процессов. В табл. 3 приведены обобщенные результаты проведённых исследований pH- и температурных зависимостей активности эндоглюканаз C.lucknowense. Согласно полученным данным, эндоглюканазы ЭГ6 и ЭГ7 обладали схожими рН- и температурными оптимумами КМЦ-азной активности.

Таблица 3. рН- и температурные оптимумы активности эндоглюканаз C.lucknowense, определенные по гидролизу КМЦ.

Эндоглюканаза	Оптимальные значения
	Топт, С (рН5,0)	рНопт (50С)
ЭГ1	64	4,9
ЭГ6	60-65	5,3
ЭГ7	60-66	5,4

Помимо исследования зависимости активности эндоглюканаз C.lucknowense от температуры и рН, определенных при кратковременном (10 мин) инкубировании ферментов в выбранных условиях, была изучена способность ЭГ1, ЭГ6 и ЭГ7 сохранять свою активность при продолжительном инкубировании при 50, 60, 65 и 70С (рН5,0). ЭГ1 проявила большую стабильность при 50 и 60С, чем ЭГ6 и ЭГ7. При этом ЭГ1 сохраняла почти 100% активности при инкубировании при этих температурах в течении 5 ч, в то время как ЭГ6 и ЭГ7 за 4 ч инкубирования при 50С теряли 20-40% исходной активности, а при увеличении температуры до 60С активность обеих эндоглюканаз уменьшалась на 75% за 30 мин. При 65 и 70С стабильность всех трёх эндоглюканаз заметно снижалась - полная потеря активности происходила менее чем за 30 минут.

Для классификации эндоглюканаз C.lucknowense по типу действия на полимерный субстрат было проанализировано изменение ММР -глюкана в процессе его гидролиза. Полученные данные подтверждают, что исследуемые ферменты являются эндо-деполимеразами. Основными низкомолекулярными продуктами исчерпывающего гидролиза -глюкана ЭГ1, ЭГ6 и ЭГ7 C.lucknowense, общими для всех трех эндоглюканаз, являлись глюкоза и целлобиоза в различных соотношениях; ЭГ7 образовывала так же небольшое количество целлотетраозы, а ЭГ6 - целлотриозы и целлотетраозы.

Помимо исчерпывающего гидролиза растворимых полисахаридных субстратов эндоглюканазами C.lucknowense было проведено исследование возможности осахаривания нерастворимых целлюлозосодержащих субстратов - МК - и предобработанных паровым взрывом кукурузных стеблей (ПКС) как гомогенными ферментами, так и их смесями с другими гомогенными ферментами (целлобиогидролазой ЦБГ1 P.verruculosum, 66 кДа и -глюкозидазой βГлз A.japonicus) и с ферментными препаратами C.lucknowense (G3#1821.3 и G5#1821.2). Эти препараты были получены на основе рекомбинантных штаммов C.lucknowense, продуцирующих полноценный целлюлазный ферментный комплекс и несущих дополнительные копии генов либо одного фермента (гомологичной -глюкозидазы в случае ферментного препарата G3#1821.3), либо двух ферментов (гомологичных -глюкозидазы и эндоглюканазы II, препарат G5#1821.2). На рис. 1 приведено сравнение выходов ВС (%), полученных в ходе этих экспериментов.

Было установлено, что использование индивидуальных гомогенных эндоглюканаз C.lucknowense для гидролиза нерастворимых целлюлозосодержащих субстратов нецелесообразно. Однако следует отметить, что ряд композиций ЭГ6 с другими ферментами целлюлазного комплекса приводил к значительному увеличению выхода гидролиза растительного сырья по сравнению с аналогичными смесями с остальными эндоглюканазами ЭГ1, ЭГ7. Это позволяет предположить, что ЭГ6 является т.н. белком-энхансером (недавно открытым ферментом, обладающим достаточно низкой собственной гидролитической активностью, но при этом способным значительно увеличивать эффективность гидролиза нерастворимых субстратов другими ферментами).

Ферментные препараты G3#1821.3 и G5#1821.2 оказались близки по способности гидролизовать целлюлозосодержащие субстраты и обеспечивали глубину гидролиза в выбранных экспериментальных условиях 16-19% для МК - и 25-29% для ПКС. Для достижения наиболее высоких выходов ВС при гидролизе МК - достаточно использовать только ферментные препараты G3#1821.3 и G5#1821.2, а при гидролизе ПКС можно рекомендовать использовать смеси на основе препарата G3#1821.3 или G5#1821.2 с эндоглюканазой ЭГ6 C.lucknowense ЭГ6 + G3/5 или с ЦБГ1 P.verruculosum ЦБГ1 + G3/5.

а)

б)

Рисунок 1. Сравнение выходов ВС (%), полученных при гидролизе МК - (а) и ПКС (б), 100 мг/мл; рН5,0, 50С. Общая концентрация гомогенных ферментов составляла 2мг на 1г субстрата, концентрация белка ферментного препарата 5мг белка на 1г субстрата. При этом концентрации гомогенных ферментов в смесях ЭГ1/6/7 + βГлз + ЦБГ1, ЦБГ1+ βГлз, и ЭГ1/6/7 + βГлз относились как 3:1:6, 6:1 и 3:1, соответственно.

2. СВОЙСТВА -МАННАНАЗЫ βМан2, -МАННОЗИДАЗЫ βМнз9

и α-ГАЛАКТОЗИДАЗ αГал1, αГал2 С.lucknowense

-Маннаназы и -маннозидазы относятся к ферментам, гидролизующим основную полимерную цепь маннанов, при этом -маннаназы действуют неупорядоченно, осуществляя разрыв цепи полимера по статистическому механизму, а -маннозидазы катализируют отщепление концевых остатков маннозы на невосстанавливающем конце полимерной цепи.

Исследование субстратной специфичности βМан2 C.luсknowense проводили в сопоставлении со свойствами -маннаназы Trichoderma reesei (табл. 4).

Таблица 4. Удельные активности и биохимические параметры βМан2 C.luсknowense, βМан T.reesei и βMнз9 C.luсknowense (40С и рН5,0 для п-нитрофенил-гликозидов, 50С и рН5,0 для прочих субстратов).

Субстрат	Активность, ед/мг
	βМан2 C.luсknowense	βМан T.reesei	βMнз9 C.luсknowense
п-нитрофенил--D-галактопиранозид	0,1	0,22	0
п-нитрофенил-β-D-галактопиранозид	0,00	0,02	0
п-нитрофенил-β-D-маннопиранозид	0,00	0,00	6
КМЦ	0,4	0,5	0
ксилан березы	0,4	0,0	0
-глюкан ячменя	4,3	0,0	0
карубин	76	25	0
гуаран	52	23	0
тараГМ	56	19	0
глюкоманнан	41	12	0
Вискозиметрическая активность (ед/мг)
карубин	288	126	0
гуаран	1225	1395	0
тараГМ	1838	2512	0
Биохимические параметры
Молекулярный вес, кДа	48	52	97
рI	6,2	5,1	5,2
Тип действия	эндо	эндо	-
Семья гликозилгидролаз	5	5	2

Обе -маннаназы были активны преимущественно по полимерным маннозид-содержащим субстратам галактоманнанам (ГМ) со способностью резко снижать вязкость растворов ГМ, что свидетельствует об эндо-деполимеразном механизме действия ферментов. βМан2 C.luсknowense отличалась от фермента T.reesei более высокими (в 2-3 раза) значениями удельных активностей, определенных по выходу ВС при гидролизе ГМ, в то время как βМан T.reesei превосходила фермент C.luсknowense по способности снижать вязкость растворов галактоманнанов гуарана и тараГМ. Оба фермента оказались инертными по отношению к п-нитрофенил-β-D-маннопиранозиду (пНФМ), что также свидетельствует об их специфичности к полимерным субстратам. Качественный и количественный состав низкомолекулярных продуктов исчерпывающего гидролиза карубина -маннаназами C.luсknowense и T.reesei был почти идентичным (в исследованных пробах присутствует манноза и различные олигосахариды), а сходство состава продуктов исчерпывающего гидролиза гуарана и тараГМ этими ферментами оказалось менее выраженным. При гидролизе всех трёх субстратов -маннаназами C.luсknowense и T.reesei образовывались олигосахариды со СП>3. Для классификации исследуемых ферментов по типу действия на полимерный субстрат было проанализировано изменение ММР карубина в процессе его гидролиза. Полученные данные подтверждают, что -маннаназы C.luсknowense и T.reesei относятся к эндо-деполимеразам.

-Маннозидаза C.luсknowense (βMнз9) проявила активность исключительно по пНФМ.

Исследование субстратной специфичности двух -галактозидаз C.luсknowense (αГал1 и αГал2) проводили в сравнении с двумя -галактозидазами Penicillium canescens, αГаА и αГаС, свойства которых были исследованы в нашей лаборатории ранее. В табл. 5 приведены удельные активности четырёх -галактозидаз, определенные по отношению к различным олигосахаридным и полимерным субстратам.

αГал1 C.luсknowense проявила наибольшую активность по синтетическому субстрату п-нитрофенил--D-галактопиранозиду (пНФГал) и по полимерным галактозидсодержащим субстратам - галактоманнанам, отличающимся друг от друга происхождением из различных растительных источников и характером распределения заместителей (галактоза) в основной полимерной цепи. Фермент также обладал небольшой активностью по галактоолигосахаридам раффинозе и стахиозе, что является востребованным свойством галактозидаз в биотехнологических процессах. Как видно из табл. 5, субстратная специфичность αГал1 весьма схожа со специфичностью αГаА P.canescens, с тем различием, что αГаА характеризуется несколько большей активностью по пНФГал (~ в 4 раза). Таким образом, αГал1 C.luсknowense, также как и αГаА P.canescens, может быть отнесена к типу галактозидаз, гидролизующих преимущественно полисахаридные субстраты.

Таблица 5. Удельные активности и биохимические параметры αГал1 и αГал2 C.luсknowense, а также αГаА и αГаС P.canescens (40С и рН5,0 для п-нитрофенил-гликозидов, 50С и рН5,0 для прочих субстратов).

Субстрат	Активность, ед/мг
	αГал1	αГал2	αГаА	αГаС
	C.luсknowense		P.canescens
п-нитрофенил--D-галактопиранозид	26	65	98	1255
п-нитрофенил-β-D-галактопиранозид	0	0	0	0
п-нитрофенил-β-D-маннопиранозид	0	0	0	0
п-нитрофенил--D-ксилопиранозид	0	0	0	0
п-нитрофенил-β-D-ксилопиранозид	0	0	0	0
п-нитрофенил-β-D-глюкопиранозид	0	0	0	0
п-нитрофенил--L-рамнопиранозид	0	0	0	0
сахароза	0,0	0	0	0
раффиноза	0,6	0,3	1,2	296
стахиоза	0,2	0,7	0,52	256
арабинан неразветвл.	0	0	0	0
арабинан	0	0	0	0
арабиноксилан	1,1	0	0	0
галактан	1,1	0	0	0
арабиногалактан	1,3	0	0	0
карубин	16,8	0	20	2
гуаран	11,0	0	11	4
тараГМ	25,3	0	15	2
Биохимические параметры
Молекулярный вес, кДа	60	43	61	80
рI	4,6	4,6	5,1	4,8
Тип действия	экзо	-	экзо	экзо
Семья гликозилгидролаз	27	27	27	36

αГал2 C.luсknowense проявила основную активностью по синтетическому субстрату пНФГал и характеризовалась относительно низкой активностью по олигосахаридным субстратам раффинозе и стахиозе, оставаясь инертной по отношению к полимерным галактозидсодержащим субстратам. Таким образом, αГал2 отличается от исследованных ранее αГаА и αГаС, и может быть отнесена к третьему типу -галактозидаз, которые высокоспецифичны к  пНФГал. Продуктами исчерпывающего гидролиза стахиозы αГал2 C.luсknowense являлись галактоза, сахароза и раффиноза. Основным низкомолекулярным продуктом исчерпывающего гидролиза карубина, гуарана  и тараГМ -галактозидазами P.canescens и αГал1 C.luсknowense была галактоза. Характер изменения ММР карубина в ходе его гидролиза αГалA P.canescens и αГал1 C.luсknowense соответствовал действию экзо-деполимераз на полимерный субстрат.

Полученные значения Kм (табл. 6) свидетельствуют о достаточно высокой субстратной специфичности исследуемых ферментов.

Таблица 6. Каталитические параметры гидролиза специфических субстратов αГал1, αГал2, βMнз9 и βМан2 C.luсknowense (рН5,0 и 40С для пНФГал и пНФM; рН5,0 и 50С для карубина).

Фермент/субстрат	Kм	Vм/[E]
αГал1/пНФГал	0,080,01 мM	3521 1/с
αГал2/пНФГал	0,470,03 мM	817 1/с
βMнз9/пНФM	0,390,03 мM	151 1/с
βМан2/карубин	1,30,1 мг/мл	675 1/с

рН-оптимумы Гал1, βМан2 и βMнз9 располагались в слабокислой области (рН5,0-5,5), что типично для большинства гликозилгидролаз из грибных источников и позволяет использовать данные ферменты совместно для одновременного проведения различных процессов модификации и трансформации субстратов, а рН-оптимум Гал2 оказался смещён относительно них в кислую область. Температурные оптимумы α-галактозидаз αГал1 и αГал2 оказались идентичными, а температурные оптимумы βМан2 и βMнз9 отличались друг от друга (табл. 7).

Таблица 7. рН- и температурные оптимумы активности αГал1, αГал2, βМан2 и βMнз9 C.luсknowense.

Фермент	Субстрат	Оптимальные значения
		Топт, С (рН5,0)	рНопт
αГал1	пНФГал	60	4,9-5,1 (40С)
αГал2	пНФГал	60	3,6-4,1 (40С)
βМан2	карубин	69	5,3 (50С)
βMнз9	пНФM	40	5,3 (40С)

Несмотря на идентичные значения температурных оптимумов активности, αГал1 и αГал2 обладали различной устойчивостью к длительному воздействию повышенной температуры. В диапазоне температур 40-65С αГал1 более стабильна, чем αГал2. βМан2 оказалась гораздо более устойчива к действию повышенных температур, чем βMнз9. Было показано, что при длительной инкубации βМан2 при 40 и 45С в течении 10 часов исходная активность фермента практически не менялась, в то время как βMнз9 при аналогичном температурном воздействии сохраняла менее 20% исходной активности за 20 и 90 минут соответственно.

Был исследован процесс исчерпывающего гидролиза галактоманнанов из различных источников (карубина, гуарана и тараГМ) индивидуальными гомогенными βМан2 и αГал1 C.lucknowense, а также αГаА и αГаС P.canescens. В качестве объекта сравнения для βМан2 C.lucknowense была выбрана βМан T.reesei. Независимо от источника ГМ, выход ВС при применении αГалA P.canescens и αГал1 C.lucknowense более чем в десять раз превосходил выход ВС при использовании αГаС P.canescens. Наибольшей степени конверсии ГМ (независимо от его источника) в ходе исчерпывающего гидролиза при индивидуальном действии двух исследованных β-маннаназ удалось добиться при использовании βМан T.reesei.

Из литературных данных известно, что довольно часто в биотехнологических процессах -маннаназы и -галактозидазы применяют совместно, что обусловлено различными сайтами гидролиза ГМ данными ферментами и взаимным синергетическим эффектом. Поэтому были проведены соответствующие эксперименты с совместным использованием этих ферментов. При составления ферментных композиций для гидролиза карубина использовали βМан2 C.luсknowense, βМан T.reesei, αГал1 C.luсknowense (αГал2 C.luсknowense не использовали, т.к. этот фермент не проявляет активности по полимерным субстратам, табл. 5) и αГалA P.canescens (значительно более эффективную в процессе гидролиза ГМ, чем αГаС P.canescens). Были исследованы возможности гидролиза карубина при одновременном, а также последовательном использовании -маннаназ и -галактозидаз (в том числе при различном порядке добавления этих ферментов). В проведённых экспериментах глубина гидролиза карубина при совместном применении -маннаназ и -галактозидаз увеличивалась относительно глубины исчерпывающего гидролиза этого субстрата индивидуальными ферментами (табл. 8).

Для изучения возможностей гидролиза глюкоманнана были выбраны βМан T.reesei, βМан2, βМнз9, β-глюкозидаза (далее βГлз) и ЭГ1 C.luсknowense. Было установлено, что гомогенные ферменты неспособны обеспечить гидролиз этого субстрата на существенную глубину, а гидролитическая способность наиболее эффективных ферментативных смесей достигала 55%.

В результате действия ЭГ1 и смеси ЭГ1 с βГлз на глюкоманнан образовывался ряд олигосахаридов различной СП (было обнаружено, по крайней мере, 9 таких олигосахаридов). Действие -маннаназ на глюкоманнан также приводило к образованию олигосахаридных продуктов, которые в присутствии -маннозидазы и -глюкозидазы почти полностью конвертировались в глюкозу и маннозу. Возможность полного превращения природного полимерного субстрата в моносахариды широко востребована в биотехнологических процессах конверсии растительной биомассы.

Таблица 8. Выход ВС (% от максимально возможного) в ходе исчерпывающего гидролиза галактоманнана карубина и глюкоманнана (Послед - последовательно, Одновр Ц одновременно; ДО - до выпадения осадка, ПО - после выпадения осадка частично дегалактозилированного галактоманнана).

Фермент (последовательность действия ферментов) при гидролизе карубина	Выход ВС, %
βМан2 C.luсknowense	16
βМан T.reesei	23
αГалA P.canescens	18
αГал1 C.luсknowense	16
βМан2 C.luсknowense + αГалA P.canescens; Послед	36
βМан T.reesei + αГалA P.canescens; Послед	44
αГалA P.canescens + βМан2 C.luсknowense; Послед, ДО	48
αГалA P.canescens + βМан T.reesei; Послед, ДО	43
αГалA P.canescens + βМан2 C.luсknowense; Послед, ПО	31
αГалA P.canescens + βМан T.reesei; Послед, ПО	27
(βМан2 + αГал1) C.luсknowense; Послед	42
βМан T.reesei + αГал1 C.luсknowense; Послед	48
(αГал1 + βМан2) C.luсknowense; Послед, ДО	51
αГал1 C.luсknowense + βМан T.reesei; Послед, ДО	48
(αГал1 + βМан2) C.luсknowense; Послед, ПО	30
αГал1 C.luсknowense + βМан T.reesei; Послед, ПО	28
(βМан2 + αГал1) C.luсknowense; Одновр	50
βМан T.reesei + αГал1 C.luсknowense; Одновр	43
βМан2 C.luсknowense + αГалA P.canescens; Одновр	42
βМан T.reesei + αГалA P.canescens; Одновр	48
Фермент (ферментная смесь) при гидролизе глюкоманнана
ЭГ1 C.luсknowense	7
βМан2 C.luсknowense	26
βМан T.reesei	31
βMнз9 C.luсknowense	2
βГлз C.luсknowense	2
(βМан2 + ЭГ1) C.luсknowense; Одновр	30
βМан T.reesei + ЭГ1 C.luсknowense; Одновр	34
(βМан2 + βМнз9) C.luсknowense; Одновр	34
βМан T.reesei + βMнз9 C.luсknowense; Одновр	37
(ЭГ1 + βГлз) C.luсknowense; Одновр	10
(βМан2 + βMнз9 + ЭГ1) C.luсknowense; Одновр	43
βМан T.reesei + (βМнз9 + ЭГ1) C.luсknowense; Одновр	52
(βМан2 + βMнз9 + βГлз) C.luсknowense; Одновр	51
βМан T.reesei + (βMнз9 + βГлз) C.luсknowense; Одновр	54

Согласно полученным ранее экспериментальным данным (табл. 4), βМнз9 C.luсknowense проявила активность исключительно по синтетическому субстрату пНФМ, оставаясь при этом инертной к маннозид-содержащим полимерным субстратам (галактоманнанам). Тем не менее, представляло интерес изучить влияние этого фермента на эффективность гидролиза галактоманнана эндо-деполимеразами (βМан2 C.luсknowense и βМан T.reesei). Было установлено, что добавление βМнз9 C.luсknowense приводит к увеличению глубины гидролиза карубина (16 и 23% при использовании индивидуальных βМан2 C.luсknowense и βМан T.reesei и 21 и 29% при добавлении βМнз9 соответственно). Анализ низкомолекулярных продуктов гидролиза свидетельствовал о том, что добавление βМнз9 к βМан2 C.luсknowense и βМан T.reesei приводит к увеличению выхода маннозы, в то время как качественный состав продуктов гидролиза остаётся почти неизменным.

Для описания распределения замещенных и незамещенных звеньев полимерной цепи ГМ была предложена новая, не рассмотренная ранее в литературе статистическая модель, позволяющая характеризовать как структуру ГМ, так и субстратную специфичность ГМ-гидролизующих ферментов. В соответствии с этой моделью, вероятность обнаружения m замещенных остатков (Гал/Ман)m в полимерной цепи ГМ, следующих подряд и окруженных незамещенными остатками задаётся формулой:

P[(Гал/Ман)m]=q2*(1-q)m,

а вероятность обнаружения n незамещенных остатков (Ман)n, следующих подряд и окруженных замещенными остатками - формулой:

P [(Ман)n] = (1 - q)2 qn,

где q является долей незамещенных звеньев в полимерной цепи, (1-q) - долей замещенных звеньев, m - числом последовательных замещенных звеньев (Гал/Ман)m, окруженных незамещенными звеньями, а n - числом последовательных незамещенных звеньев (Ман)n, окруженных замещенными звеньями. На основании предложенной модели было показано, что βМан T.reesei  способна гидролизовать цепь ГМ в участках с четырьмя и более незамещенными остатками маннозы, в то время как βМан2 C.luсknowense более специфична и гидролизует полимерную цепь в участках с пятью и более незамещенными остатками маннозы.

3. СВОЙСТВА β-КСИЛОЗИДАЗ βКсз1, βКсз5

и α-L-АРАБИНОФУРАНОЗИДАЗЫ АФ7 С.lucknowense

На основании анализа а.к. последовательностей βКсз1 и βКсз5 C.lucknowense было установлено, что эти ферменты принадлежат к 3-ей семье гликозилгидролаз. Для представителей этой семьи характерно проявление либо глюкозидазной, либо ксилозидазной активности. С учетом этого было проведено исследование субстратной специфичности βКсз1 и βКсз5 C.lucknowense по широкому спектру низкомолекулярных (синтетических и природных) и полисахаридных субстратов, содержащих как ксилозидные, так и глюкозидные группы. Как видно из табл. 9, исследуемые ферменты проявляли одновременно как глюкозидазную, так и ксилозидазную активности, что нехарактерно для известных β-ксилозидаз из 3-ей гликозилгидролазной семьи. Глюкозидазная и ксилозидазная активности различались между собой примерно на три порядка для каждого фермента, причем для βКсз1 ксилозидазная активность превышала глюкозидазную, а для βКсз5, наоборот - глюкозидазная активность превышала ксилозидазную. Для βКсз5 эта закономерность наблюдалась не только для синтетических субстратов - пНФ-производных ксилозы и глюкозы, но и для олигосахаридных и растворимых полимерных субстратов, содержащих фрагменты этих сахаров.

Таблица 9. Удельные активности и биохимические параметры βКсз1 и βКсз5 C.lucknowense (рН5,0 и 40С для п/о-нитрофенил-гликозидов; рН5,0 и 50С для прочих субстратов).

Субстрат	Активность βКсз1, ед/мг	Активность βКсз5, ед/мг
о-нитрофенил-β-D-ксилопиранозид	2,0	1,0
п-нитрофенил-β-D-целлобиозид	0,2	5,3
п-нитрофенил-β-D-глюкопиранозид	0,1	18,8
п-нитрофенил-β-D-ксилопиранозид	5,0	0,03
п-нитрофенил--L-арабинофуранозид	0,03	0,004
ксилобиоза	6,2	0
целлобиоза	0,0	15,5
-софороза	0,0	17,7
-гентиобиоза	0,0	43,5
ксилан берёзы	1,8	0,5
ксилан бука	1,1	0,6
ксилоглюкан	0,1	0,05
-глюкан ячменя	0,1	5,1
аминарин	0,0	74,6
КМЦ	0,0	0,5
крахмал	0,0	0,0
арабиноксилан	1,2	0,3
Биохимические параметры
Молекулярный вес, кДа	78	120
рI	5,6	4,9
Тип действия	экзо	экзо
Семья гликозилгидролаз	3	3

βКсз5 была способна гидролизовать не только 1,3--D-глюкозидные связи (ламинарин), но также 1,4- (целлобиоза, КМЦ), 1,2- (-софороза) и 1,6- (-гентиобиоза) -D-глюкозидные связи, хотя наибольшая активность соответствовала всё же гидролизу 1,3--D-глюкозидных связей.

Следует отметить, что впервые в практике нашей лаборатории была обнаружена истинная β-ксилозидаза (βКсз1) с ксилобиазной активностью, преобладающей над ксиланазной. В соответствии с проявленной субстратной специфичностью β-ксилозидаз, следует заключить, что βКсз1 является -1,4-ксилозидазой (истинной ксилобиазой), а βКсз5 - -1,3/1,4-экзо-глюкозидазой, проявляющей -ксилозидазную активность. Изменение ММР ксилана в ходе его гидролиза исследуемыми β-ксилозидазами свидетельствовало об экзо-деполимеразном действии этих ферментов на полимерный субстрат.

Для изучения субстратной специфичности АФ7 был выбран широкий спектр возможных субстратов, включающий низкомолекулярные (синтетические пНФ-производные) и полисахаридные субстраты. Полученные результаты приведены в табл. 10.

Таблица 10. Удельные активности и биохимические параметры АФ7 C.lucknowense (рН5,0 и 40С для п-нитрофенил-гликозидов; рН5,0 и 50С для прочих субстратов).

Субстрат	Активность АФ7, ед/мг
п-нитрофенил--D-галактопиранозид	0
п-нитрофенил-β-D-галактопиранозид	0
п-нитрофенил--L-арабинофуранозид	0,02
п-нитрофенил--L-арабинопиранозид	0
КМЦ	0
аминарин	3,5
-глюкан	0
ксилоглюкан	0
ксилан берёзы	0
арабиноксилан пшеницы	39,9
арабинан	1,8
арабиногалактан	0
гуаран	0
тара ГМ	0
карубин	0
арабинан неразветвл.	0
Биохимические параметры
Молекулярный вес, кДа	61
рI	4,9
Тип действия	экзо
Семья гликозилгидролаз	43

Исследуемый фермент обладал высокой специфичностью к полимерному субстрату арабиноксилану и характеризовался весьма небольшими активностями (или их отсутствием) по другим арабинозо-содержащим субстратам - как по низкомолекулярным синтетическим субстратам п-нитрофенил--L-арабинофуранозиду и п-нитрофенил--L-арабинопиранозиду, так и по высокомолекулярным - арабинану и арабиногалактану. Характер изменения ММР арабиноксилана в ходе его гидролиза АФ7 соответствовал действию экзо-деполимераз на полимерный субстрат.

Каталитические параметры исследуемых ферментов приведены в табл. 11. По сравнению с описанными в литературе ферментами, βКсз5 характеризовалась повышенной эффективностью гидролиза пНФГ.

Таблица 11. Каталитические параметры гидролиза пНФК, пНФГ и арабиноксилана под действием βКсз1, βКсз5 и АФ7 C.luсknowense (рН5,0 и 40С для пНФК и пНФГ; рН5,0 и 50С для арабиноксилана)

Фермент/субстрат	Kм	Vм/[E]
βКсз1 / пНФК	1,50,1 мМ	151 1/с
βКсз5 / пНФГ	0,30,1 мМ	887 1/с
АФ7 / арабиноксилан	1,70,1 мг/мл	443 1/с

рН- и температурные зависимости активности βКсз1, βКсз5 и АФ7 C.lucknowense были исследованы на примере гидролиза пНФК, пНФГ и арабиноксилана, полученные результаты обобщены в табл. 12.

Таблица 12. рН- и температурные оптимумы активности βКсз1, βКсз5 и АФ7 C.lucknowense.

Фермент	Субстрат	Оптимальные значения
		Топт, С (рН5,0)	рНопт
βКсз1	пНФК	60	4,8 (40С)
βКсз5	пНФГ	75	4,6 (40С)
АФ7	арабиноксилан	70	4,0-5,5 (50С)

Согласно полученным экспериментальным данным, рН-оптимумы исследованных ферментов располагались в слабокислой области (рН4,5-5,0). Температурные оптимумы активности этих ферментов оказались различными - наиболее высокотемпературный оптимум соответствовал βКсз5, а наиболее низкотемпературный - βКсз1.

Исследование процессов температурной инактивации βКсз1, βКсз5 и АФ7 C.lucknowense показало, что температурная стабильность этих ферментов уменьшается в ряду βКсз5, АФ7 и βКсз1, что полностью согласуется со значениями температурных оптимумов этих ферментов.

Исчерпывающий гидролиз -глюкана и ламинарина под действием βКсз5 C.lucknowense приводил к практически количественному выходу глюкозы. Ферменты экзо-деполимеразного действия, способные проводить конверсию полимерного субстрата подобным образом (по т.н. процессинговому механизму) весьма интересны с точки зрения потенциального использования в биотехнологических процессах. По сравнению с почти полной конверсией -глюкана и ламинарина βКсз5, степень исчерпывающего гидролиза ксилана и арабиноксилана гомогенными βКсз1 и АФ7 оказалась значительно меньше (50% и 13% соответственно).

На примере гидролиза ксилана берёзы была изучена возможность глубокой деструкции ксиланов под действием смесей исследуемых ксилозидаз и ксиланазы βКсил1 C.lucknowense, свойства которой были ранее изучены в нашей лаборатории. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что гомогенная βКсз1 обеспечивает более высокую степень конверсии ксилана берёзы при исчерпывающем гидролизе, чем гомогенная βКсз5 (50% и 20% соответственно), при этом эффективность смесей этих ферментов с βКсил1 оказалась примерно одинаковой (60% и 64% соответственно). Анализ низкомолекулярных продуктов гидролиза показал, что единственным конечным продуктом гидролиза ксилана берёзы βКсз1 и βКсз5, а также их смесями с βКсил1 является ксилоза. При этом действие гомогенной βКсил1 на этот субстрат приводит к образованию ксилозы и ксилобиозы.

Была изучена возможность использования АФ7 для гидролиза арабиноксилана пшеницы совместно с βКсил1 и βКсз1 (показавшей себя более эффективной, чем βКсз5 при гидролизе ксилана берёзы). Полученные данные свидетельствуют о значительной эффективности АФ7, как компонента ферментной смеси, осуществляющей кооперативную деструкцию арабиноксилана. При гидролизе растительного сырья (багасса, ПКС) АФ7 оказалась менее эффективной, чем при гидролизе арабиноксилана, что объясняется относительно небольшим содержанием арабиноксиланов в этих видах растительного сырья.

ВЫВОДЫ

1. Определена субстратная специфичность, каталитические и биохимические параметры десяти ферментов, кодируемых молчащими генами Chrysosporium lucknowense: трёх эндоглюканаз (ЭГ1 гликозилгидролазная семья (ГС) 7; ЭГ6 ГС6; ЭГ7 ГС6), двух -галактозидаз (αГал1, αГал2 ГС27), -маннаназы (βМан2 ГС5), -маннозидазы (βМнз9 ГС2), двух -ксилозидаз (βКсз1, βКсз5 ГС3) и α-L-арабинофуранозидазы (АФ7 ГС43).

2. Показано, что эти ферменты отличаются от продуцируемых грибом C.lucknowense целлюлаз и гемицеллюлаз и представляют широкий спектр гликозилгидролаз, обладающих различной субстратной специфичностью и свойствами.

3. Среди гликозилгидролаз, кодируемых молчащими генами C.lucknowense, обнаружены ЭГ6, являющаяся, по-видимому, белком-энхансером, увеличивающим эффективность гидролитического действия других целлюлаз на нерастворимые целлюлозосодержащие субстраты, и βКсз5, обладающая нехарактерной для ферментов своего класса широкой субстратной специфичностью и способная гидролизовать до высоких степеней конверсии не только ксилозо-, но и глюкозосодержащие полисахаридные и олигосахаридные субстраты по механизму экзо-деполимеризации.

4. Показано, что комбинированное применение двух -галактозидаз (αГал1, αГал2), -маннаназы (βМан2) и -маннозидазы (βМнз9) C.luсknowense позволяет эффективно трансформировать как полисахаридные, так и олигосахаридные галактозо- и маннозосодержащие субстраты в продукты с определённой химической структурой и степенью полимеризации.

5. Предложена новая статистическая модель, описывающая распределение замещенных и незамещенных звеньев полимерной цепи галактоманнанов (ГМ), позволяющая характеризовать как структуру ГМ, так и субстратную специфичность ГМ-гидролизующих ферментов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Klyosov A.A., Dotsenko G.S., Hinz S.W.A., Sinitsyn A.P. Structural features of 1,4--D-galactomannans of plant origin as a probe for 1,4--mannanase polymeric substrate specificity. Carbohydrate Research, 2012, v. 352, p. 65-69.

2. Dotsenko G.S., Sinitsyna O.A., Hinz S.W.A., Wery J., Sinitsyn A.P. Characterization of a GH family 3 β-glycoside hydrolase from Chrysosporium lucknowense and its application to the hydrolysis of β-glucan and xylan. Bioresource Technology, 2012, v. 112, p. 345-349.

3. Доценко Г.С., Семёнова М.В., Синицына О.А., Хинц С.В.А., Вери Я., Зоров И.Н., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. Клонирование, выделение и характеристика галактоманнан-гидролизующих ферментов Myceliophthora thermophila. Биохимия, 2012, т. 77, с. 1556-1566.

4. Доценко Г.С., Синицын А.П. Свойства -галактозидазы, -ксилозидазы и арабинофуранозидазы микромицетного гриба Chrysosporium lucknowense. Материалы VI Московского международного конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития, Москва, 2011, часть 1, с. 317-318.

5. Доценко Г.С. Исследование свойств α-галактозидазы, маннаназы и эндоглюканаз гриба Chrysosporium lucknowense. Материалы XVII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2010, секция Химия, Москва, 2010.

6. Доценко Г.С. Свойства -галактозидазы, -ксилозидазы и арабинофуранозидазы гриба Chrysosporium lucknowense. Материалы XVIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2011, секция Химия, Москва, 2011, с. 400.

7. Доценко Г.С., Клёсов А.А., Синицын А.П. Использование 1,4-β-D-галактоманнанов различного строения для изучения специфичности действия 1,4-β-маннаназ, Материалы XIX международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2012, секция Химия, Москва, 2012, с. 524.

8. Доценко Г.С., Синицын А.П. Эндоглюканазы ЭГ1, ЭГ6 и ЭГ7 Сhrysosporium lucknowense: биохимические свойства и применение для осахаривания целлюлозосодержащего сырья. Материалы международной научной конференции Достижения и перспективы развития биотехнологии, Саранск, 2012, с. 138.

  Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по химии