Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Аллекрад Хафиз РЕГУЛЯЦИЯ
СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ГОМЕОСТАЗА ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ У КРЫС
Специальность 03.01.04. - Биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Воронеж - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Воронежский государственный университет (ФГБОУ ВПО ВГУ) Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Попова Татьяна Николаевна
Официальные оппоненты: Ершова Антонина Николаевна доктор биологических наук, профессор Воронежский государственный педагогический университет, заведующая кафедрой биологии растений и животных Лущик Марина Валерьевна кандидат биологических наук Экспертно-криминалистическая служба Управления Федеральной службы РФ по контролю за оборотом наркотиков по Воронежской области, старший эксперт Государственное научное учреждение Ведущая организация Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии
Защита состоится 28 мая 2012 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д.212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 390006, Воронеж, Университетская пл., 1, ауд. 59.
Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета Автореферат разослан 26 апреля 2012 года.
Ученый секретарь диссертационного совета Грабович М.Ю.
доктор биологических наук ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы. Хронический алкоголизм, его распространенность и обусловленные им негативные социальные и медицинские последствия являются серьезной проблемой здравоохранения. В настоящее время среди болезней алкогольной этиологии ведущее место по смертности и инвалидизации больных занимает алкогольное поражение печени. Воздействие алкоголя на сердечнососудистую систему недооценивается, хотя алкогольная миокардиодистрофия - одна из самых тяжелых форм поражения миокарда. Алкогольная интоксикация приводит к окислительному стрессу путем усиления образования свободных радикалов и разрушения антиоксидантной системы (АОС) защиты организма. Окислительный стресс ведет к повреждению мембран, нарушению жизнедеятельности клеток и их апоптотической гибели. Очевидно, что поиск лекарственных средств, способных влиять на процесс развития оксидативного стресса при хронической алкогольной интоксикации, является актуальной задачей.
В последние годы неуклонно повышается интерес к средствам антиоксидантной защиты, в основе которых лежат естественные метаболиты клеток.
В связи с этим активно изучается механизм антиоксидантного действия мелатонина - гормона эпифиза, вырабатываемого также и в экстрапинеальных тканях. Помимо классических эффектов своего действия (участия в создании циркадного и циркадиадного ритмов), он может взаимодействовать с рядом свободнорадикальных форм кислорода и азота (Reiter, 2000), стимулировать иммунную систему (Maestoni, Conti, 1998) и усиливать синтез ряда антиоксидантных ферментов (Rodriguez C., 2004). Способность мелатонина растворяться в воде и липидах, проникать через мембраны и сосудисто-тканевые барьеры, накапливаясь в ядрах клеток, обеспечивает его активность в защите мембранных структур и ДНК от свободнорадикального повреждения. Предполагают, что именно снижение уровня мелатонина является одной из основных причин ослабления АОС при старении (Скулачев В.П., 2009).
Имеются данные, что мелатонин может оказывать гепатопротекторное действие при обтурации желчных протоков (Montilla P., 2001), остром панкреатите (Ni Y., 2008), воздействии ряда ксенобиотиков (Sewerynek E., 1995; El-Sokkary G.H., 2007; Hong R.T., 2009). Тиоктовая (-липоевая) кислота все чаще применяется при различных заболеваниях. Основное значение тиоктовой кислоты заключается в ее участии в качестве кофактора в окислительном декарбоксилировании пирувата и 2оксоглутарата. Антиоксидантный эффект -липоевой кислоты обусловлен наличием двух тиоловых групп в молекуле, а также способностью связывать молекулы радикалов и ионы металлов, предотвращая их участие в свободнорадикальных реакциях. Тиоктовая кислота также обеспечивает поддержку работы других антиоксидантных звеньев, в частности, системы глутатиона и убихинона (Deneke, 2000). Тем не менее, молекулярные механизмы действия тиоктовой кислоты и мелатонина при хронической алкогольной интоксикации остаются практически не исследованными.
Таким образом, исследование возможного протекторного действия мелатонина и тиоктовой кислоты при хронической алкогольной интоксикации представляется весьма актуальным.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование влияния мелатонина и тиоктовой кислоты на интенсивность свободнорадикального окисления (СО) биомолекул, функционирование АОС и активность ряда ферментов окислительного метаболизма в тканях крыс при хронической алкогольной интоксикации.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Оценка влияния мелатонина и тиоктовой кислоты на активность маркерных ферментов цитолиза клеток печени и сердца (аланинаминотрансферазы (ААТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и креатинкиназы МВ (КК-МВ) в сыворотке крови крыс при хроническом воздействии этанола.
2. Исследование влияния различных доз мелатонина и тиоктовой кислоты на показатели, отражающие интенсивность свободнорадикальных процессов (параметры биохемилюминесценции и концентрация продуктов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) - диеновых конъюгатов (ДК), в печени, сердце и сыворотке крови с хронической алкогольной интоксикацией 3. Исследование влияния мелатонина и тиоктовой кислоты на степень фрагментации ДНК - критерий апоптоза, в печени и сердце крыс с хронической алкогольной интоксикацией 4. Определение интенсивности функционирования ферментов антиоксидантной защиты (каталазы, супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГП) и глутатионредуктазы (ГР) в печени, сердце и сыворотке крови крыс с хронической алкогольной интоксикацией при введении различных доз мелатонина и тиоктовой кислоты.
5. Оценка активности ферментов окислительного метаболизма - поставщиков НАДФН для глутатионпероксидазной-глутатионредуктазной антиоксидантной системы (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и НАДФизоцитратдегидрогеназы (НАДФ-ИДГ) - в печени, сердце и сыворотке крови крыс с хронической алкогольной интоксикацией при введении различных доз мелатонина и тиоктовой кислоты.
6. Исследование влияния различных доз мелатонина и тиоктовой кислоты на концентрацию неферментативных антиоксидантов (восстановленного глутатиона (GSH) и цитрата), а а также на активность ферментов, участвующих в метаболизме цитрата (аконитатгидратазы (АГ) и цитратсинтазы (ЦС), в печени, сердце и сыворотке крови крыс с хронической алкогольной интоксикацией.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование интенсивности СО биомолекул, активности ферментативного звена АОС и ряда ферментов окислительного метаболизма, а также содержания низкомолекулярных антиоксидантов в тканях крыс при хронической алкогольной интоксикации и воздействии мелатонина и тиоктовой кислоты. Установлено, что введение тиоктовой кислоты и мелатонина при хронической алкогольной интоксикации приводит к снижению интенсивности свободнорадикальных процессов во всех исследованных тканях и к повышению общей антиоксидантной активности в печени и сердце крыс.
Выявлены звенья АОС, наиболее чувствительные к действию мелатонина и тиоктовой кислоты; проведен сравнительный анализ эффектов различных доз исследуемых веществ. Исследовано воздействие мелатонина и тиоктовой кислоты на функционирование ферментов, генерирующих НАДФН, необходимого для работы глутатионовой антиоксидантной системы. Впервые исследовано влияние мелатонина и тиоктовой кислоты на метаболизм цитрата при хроническом воздействии этанола.
Предложена гипотетическая схема влияния тиоктовой кислоты и мелатонина на свободнорадикальный гомеостаз при хронической алкогольной интоксикации.
Практическая значимость. Полученные данные расширяют и углубляют фундаментальные представления о молекулярных механизмах, обеспечивающих общность регуляции метаболизма и свободнорадикальных процессов в условиях окислительного стресса, и особенностей их реализации в присутствии веществ, обладающих протекторным действием. Результаты работы вносят вклад в решение проблемы по выявлению нарушений метаболизма при хронической алкогольной интоксикации и способствуют поиску оптимальных путей их коррекции. Полученные экспериментальные данные дают основу для разработки новых подходов в антиоксидантной терапии при хроническом алкогольном поражении печени и сердца.
Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном и фармацевтическом факультетах Воронежского государственного университета при чтении спецкурсов, при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 13 публикациях - 10 статьях и 2 тезисах.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международном симпозиуме Адаптационная физиология и качество жизни:
проблемы традиционной и инновационной медицины, посвященного 80-летию академика РАМН Н.А. Агаджаняна (Москва, 2008), Всероссийской с международным участием научно-методической конференции Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ (г.
Воронеж, 2010), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 1000-летию Ярославля (г. Ярославль, 2010), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием Биологические науки (г. Уфа, 2010), Первых международных Беккеровских чтениях (г. Волгоград, 2010), VIII Международной конференции Биоантиоксидант (Москва, 2010), XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (г. Калуга, 2010) На защиту выносятся следующие положения:
1. Выявлено дозозависимое протекторное действие тиоктовой кислоты и мелатонина при хронической алкогольной интоксикации. Введение исследуемых веществ приводит к снижению активности ферментов-маркеров цитолиза гепатоцитов и кардиомиоцитов в сыворотке крови и способствует торможению развития свободнорадикальных процессов, интенсифицирующихся в тканях при воздействии этанола.
2. Введение тиоктовой кислоты и мелатонина на фоне хронического воздействия этанола приводит к приближению большинства параметров, отражающих общую антиоксидантную активность организма и функционирование отдельных звеньев АОС, а также активностей ряда ферментов окислительного метаболизма к показателям контрольных животных.
3. Мелатонин и тиоктовая кислота оказывают наиболее выраженный стимулирующий эффект на глутатионовое звено АОС, которое в условиях хронического воздействия этанола подвержено наибольшему депрессивному воздействию.
4. На основе полученных данных предложена гипотетическая схема влияния тиоктовой кислоты и мелатонина на свободнорадикальный гомеостаз при хронической алкогольной интоксикации.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 162 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (4 главы), списка литературы (309 источников). Иллюстрационный материал включает 24 рисунка и 2 таблицы.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования. В качестве объекта исследования использовали белых лабораторных крыс-самцов массой 150-200 г. Животные были разделены на экспериментальных групп: в 1-й контрольной группе (n=20) животных содержали на стандартном рационе вивария; 2-ю группу (n=19) составляли животные с хронической алкогольной интоксикацией, вызываемой путем добавления к стандартному рациону 15% этанола регулярно в течение месяца (Бардина Л.Р., 1999);
в 3-й группе (n=15) животным с 14 дня развития хронической алкогольной интоксикации внутрибрюшинно вводили тиоктовую кислоту в дозе 35 мг на кг каждые 48 часов в течение последующих 14 дней; крысам 4-й группы (n=15) по аналогичной схеме вводили тиоктовую кислоту в дозе 70 мг на кг; крысам 5-й группы (n=18) по представленной выше схеме вводили мелатонин в дозе 1 мг на кг; крысам 6й группы (n=16) по той же схеме вводили мелатонин в дозе 2 мг на кг. Материал для исследования забирали через 28 дней после начала алкоголизации.
Подготовка материала для исследования. Сердце и печень после многократного перфузирования ледяным изотоническим раствором измельчали, гомогенизировали в охлажденной среде выделения следующего состава: 0,1 М трисНСl-буфер (рН 7,8), содержащий 1 мМ ЭДТА, 1% -меркаптоэтанол и центрифугировали при 10000 g в течение 12 мин. Полученный гомогенат использовали для дальнейших исследований. Забор крови осуществляли из сердца.
Кровь помещали на 0,5 часа в термостат при температуре 37 0С и центрифугировали при 3000g в течение 10 мин. Полученную сыворотку использовали для дальнейших исследований.
Определение интенсивности свободнорадикальных процессов. Для определения интенсивности свободнорадикальных процессов применяли метод индуцированной биохемилюминесценции (БХЛ). Использовали биохемилюминометр БХЛ-06М с программным обеспечением. Кинетическую кривую биохемилюминесценции регистрировали в течении 30 секунд и определяли следующие параметры БХЛ: светосумму (S), интенсивность вспышки (Imax) и величину тангенса угла наклона касательной к нисходящей ветви кривой (tg2) (Любитский О.Б., 1996). Содержание ДК определяли спектрофотометрически при 2нм. [Стальная].
Определение интенсивности апоптоза. ДНК выделяли фенольнохлороформным методом. Степень фрагментации ДНК определяли методом электрофореза.
Определение активности ферментов. Активность ферментов определяли спектрофотометрическим методом на СФ-56. Активности ААт, АсАТ и КК-МВ определяли с помощью наборов реактивов фирмы Витал Диагностик, СанктПетербург. Активность СОД определяли по ингибированию скорости восстановления нитросинего тетразолия в неэнзиматической системе феназинметасульфата и НАДН при 540 нм (Матюшин Б.Н., 1991). Определение активности каталазы проводили методом, основанным на способности пероксида водорода образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс с максимумом поглощения при 410 нм. (Королюк М.А., 1988). Активность НАДФ-зависимых ферментов определяли при 340 нм. О скорости реакций, катализируемых Г6ФДГ и НАДФ-ИДГ, судили по возрастанию оптической плотности в результате восстановления НАДФН. О скорости ГР-реакции судили по уменьшению оптической плотности в результате окисления НАДФН, протекающего за счет реакции восстановления глутатиона. О скорости ГПреакции судили по уменьшению оптической плотности в результате окисления НАДФН, протекающего за счет осуществления сопряженных ферментативных реакций: образования окисленного глутатиона под действием ГП и его последующего восстановления, взаимосвязанного с окислением НАДФН, под действием ГР.
Aктивность AГ определяли при 233 нм. О скорости ЦС-реакции судили по увеличению оптической плотности при 412 в ходе восстановления 2-нитробензойной кислоты при образовании коэнзима А. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ продукта за 1 мин при 25С.
Активность ферментов выражали в ферментативных единицах (Е) на 1 мг белка или Е в расчете на 1 г сырой массы материала (мл сыворотки). Общий белок определяли по методу Лоури (Lowry, 1951).
Определение содержания низкомолекулярных антиоксидантов.
Концентрацию GSH определяли с помощью реакции с 5,5ЦдитиоЦбисЦ(2 - нитробензойной) кислотой, в результате которой образуется тионитрофенильный анион, имеющий максимум поглощения при 412 нм (Бузлама В.С., 1997). Количество цитрата определяли по методу Нательсона (Афанасьев В.Г., 1973).
Статистическая обработка экспериментальных данных. Опыты проводили не менее чем в 15-кратной биологической и 2-4-кратной аналитической повторности.
Результаты опытов сравнивали с контролем. В таблице и на рисунках приводятся средние арифметические значения активностей фермента и их стандартные ошибки.
Полученные данные обрабатывали с использованием t-критерия Стьюдента, обсуждаются статистически достоверные результаты при р<0,05 (Ллойд, Ледерман, 1990).
ИССЛЕДОВАНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ И ОБЩЕЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ И ПРИ ДЕЙСТВИИ ВЕЩЕСТВ-ПРОТЕКТОРОВ Согласно полученным результатам, повышенная в сыворотке крови крыс при хронической алкогольной интоксикации активность трансаминаз и КК-МБ при введении протекторов снижалась. Так, активность ААТ при действии тиоктовой кислоты в дозе 35 мг/кг снижалась в 1,3 раз, в дозе 70 мг/кг - в 1,4 раза, при действии мелатонина в дозе 1 мг/кг - в 1,4 раза, 2 мг/кг - до уровня контроля (рис. 1).
Полученные данные могут свидетельствовать об уменьшении степени цитолиза гепатоцитов и кардиомиоцитов.
При хронической алкогольной интоксикации происходило увеличение параметров БХЛ, характеризующих интенсивность свободнорадикальных процессов:
S и Imax (табл. 1). Выявлено также снижение значений tg2, отражающего общий антиоксидантный потенциал, в печени в 1,6 раза, в сердце - в 2,6 раза по сравнению с контрольными животными. Однако в сыворотке крови величина tg2 возрастала в 1,раза по сравнению с контролем, что может быть связано с выходом в кровяное русло ферментов антиоксидантной защиты при цитолизе клеток (табл. 1). Введение исследуемых протекторов крысам с хронической алкогольной интоксикацией приводило к приближению значений S и Imax к показателям контрольной группы животных. Снижение интенсивности свободнорадикальных процессов в тканях крыс при хронической алкогольной интоксикации под влиянием тиоктовой кислоты и мелатонина может быть связано с повышением антиоксидантного потенциала в тканях крыс, о чем свидетельствует увеличение изменение значений tg2 (табл. 1).
Рис. 1. Активность аланинаминотрансферазы в сыворотке крови крыс в контроле (1), при алкогольной интоксикации (2) и действии тиоктовой кислоты в дозе 35 мг/кг (3) и 70 мг/кг (4) и мелатонина в дозе 1 мг/кг (5) и 2 мг/кг (6) Таблица 3.1 - Параметры биохемилюминесценции в тканях крыс в контроле (1), при алкогольной интоксикации (2) и действии тиоктовой кислоты в дозе 35 мг/кг (3) и 70 мг/кг (4) и мелатонина в дозе 1 мг/кг (5) и 2 мг/кг (6) Светосумма вспышки Интенсивность Тангенс угла падения хемилюминесценции максимальной вспышки кинетической кривой (tg2) (S), mV x c (Imax), mV 1 23,71 14,54 31,71 4,30 2,43 5,99 1,51 1,82 0,1,11 0,72 1,51 0,10 0,11 0,23 0,07 0,06 0,2 30,45 22,63 50,72 6,35 4,37 7,87 0,94 0,71 1,1,42 0,94 2,46 0,24 0,14 0,36 0,04 0,08 0,3 25,84 19,32 40,05 4,41 2,60 6,48 1,11 0,98 1,1,29* 0,92* 1,39* 0,14* 0,12* 0,27* 0,03* 0,07* 0,07* 4 24,71 18,12 38,42 4,34 2,48 6,34 1,21 1,32 1,1,09* 0,87* 1,12* 0,13* 0,12* 0,27* 0,04* 0,08* 0,06* 5 28,81 20,13 44,22 4,82 3,78 8,33 1,26 1,18 1,260,1,23* 0,96* 1,76* 0,21* 0,14* 0,36* 0,01* 0,01* 5* 6 24,29 16,22 34,05 4,27 2,57 6,07 1,49 1,80* 1,1,21* 0,82* 1,62* 0,20* 0,11* 0,29* 0,02* 0,03* 0,05* Примечание - * отличия от данных группы 2 достоверны (p0,05) При хронической алкогольной интоксикации уровень ДК в сердце крыс возрастал на 59% по сравнению с интактными животными (рис. 2). При введении тиоктовой кислоты в дозе 35 и 70 мг/кг наблюдалось снижение содержания ДК на 22% и 46% в сердце крыс по сравнению с патологией. При введении мелатонина концентрация ДК в сердце не отличалась от контрольных значений (рис. 5).
Аналогичные изменения в содержании ДК были выявлены в печени подопытных животных. Уровень ДК в сыворотке крови достоверно не отличался в контрольной и опытных группах животных. Полученные результаты свидетельствуют о снижении уровня липопероксидации под действием тиоктовой кислоты и мелатонина.
Группы животных печень сердце сыворотка крови печень сердце сыворотка крови печень сердце сыворотка крови Рис. 2. Содержание диеновых конъюгатов в сердце крыс в контроле (1), при алкогольной интоксикации (2) и действии тиоктовой кислоты в дозе 35 мг/кг (3) и мг/кг (4) и мелатонина в дозе 1 мг/кг (5) и 2 мг/кг (6) Полученные данные об изменениях параметров БХЛ и содержания ДК при хронической алкогольной интоксикации соотносятся с результатами оценки фрагментации ДНК. Выявлено, что ДНК образцов тканей крыс с патологией фрагментирована по сравнению с ДНК контрольных проб, и фрагменты образуют характерную лапоптозную лестницу. Степень фрагментации ДНК тканей крыс, которым вводили протекторы, менее выражена по сравнению с ДНК образцов при алкогольной интоксикации.
АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ И ПРИ ДЕЙСТВИИ ВЕЩЕСТВПРОТЕКТОРОВ В условиях хронической алкогольной интоксикации в печени крыс происходило повышение активности СОД, выраженной в Е/г сырой массы, в 1,7 раза по сравнению с контрольными значениями (рис. 3). Активность СОД в сыворотке крови при этом возрастала в 1,5 раза. Возрастание активности СОД, вероятно, связано с увеличением экспрессии данного белка. Существуют данные, указывающие на то, что наиболее ранним ответом клеток на окислительный стресс является активация экспрессии не только СОД, но и каталазы и ГП [Зенков Н.К., 2001].
В сердце животных с алкогольной интоксикацией было обнаружено снижение активности СОД по сравнению с нормой в 1,3 раза, что может быть результатом инактивации молекул фермента под действием АФК. В частности, H2O2 может восстанавливать Cu2+ в активном центре фермента до Cu+, который, взаимодействуя с новой молекулой пероксида водорода, образует Cu2+OHХ [Casano et al., 1997]. Этот связанный in situ радикал OHХ, а также свободные радикалы OHХ и пероксинитрит [Yang ES, 2008] вызывают окислительную модификацию аминокислотных последовательностей в активном центре фермента, что приводит к его инактивации.
При введении протекторов животным с хронической алкогольной интоксикацией было отмечено приближение активности СОД в тканях к значениям контроля (рис. 3). Снижение активности СОД в печени и сыворотке крови может быть следствием уменьшения нагрузки на антиоксидантную систему при введении тиоктовой кислоты и мелaтонина. Оба исследуемых протектора могут непосредственно перехватывать свободные радикалы, выступая в качестве их универсальной ловушки [Барабой В.А., 2000, Бустаманте, 2001]. В то же время антиоксидантная активность исследуемых веществ в применяемых дозах, видимо, была недостаточна, чтобы снизить уровень окислительного стресса и соответствующий уровень экспрессии антиоксидантных ферментов в сердце крыс в значительной степени. Результатом антиоксидантного действия протекторов в сердце стала активация СОД, видимо, за счет уменьшения степени повреждения молекул фермента свободнорадикальными соединениями.
а б Рис. 3. Активность супероксиддисмутазы в печени (а) и сыворотке крови (б) в контроле (1), при алкогольной интоксикации (2) и действии тиоктовой кислоты в дозе 35 мг/кг (3) и 70 мг/кг (4) и мелатонина в дозе 1 мг/кг (5) и 2 мг/кг (6) Известно, что каталаза и СОД представляют собой звенья одной системы утилизации АФК [Чеснокова Н.П., 2006]. Согласно полученным результатам, при алкогольной интоксикации в печени крыс наблюдалось повышение активности каталазы, выраженной в Е/г сырой массы, в 2,7 раза (рис. 4), в сердце крыс в 2,2 раза по сравнению со значениями в контроле. Активность каталазы в сыворотке крови превышала контрольное значение в 3 раза. Повышение удельной активности каталазы было менее выражено, что может быть объяснено возрастанием содержания общего белка при патологии. Активация каталазы при алкогольной интоксикации может иметь важное значение для ускорения процессов окисления этанола и для обезвреживания пероксидов [Lieber C.S, 1996]. Введение веществ-протекторов приводило к дозозависимому уменьшению активности каталазы в тканях животных с алкогольной интоксикацией. Так, при введении тиоктовой кислоты в дозах 35 и мг/кг было выявлено снижение активности фермента в печени в 1,8 и 1,9 раза (рис. 4).
Полученные данные могут быть объяснены с точки зрения проявления антиоксидантных свойств тиоктовой кислоты и мелатонина, вследствие чего снижается нагрузка на ферментативную антиоксидантную систему.
Рис. 4. Активность каталазы в печени в контроле (1), при алкогольной интоксикации (2) и действии тиоктовой кислоты в дозе 35 мг/кг (3) и 70 мг/кг (4) и мелатонина в дозе 1 мг/кг (5) и 2 мг/кг (6) Установлено, что на фоне хронической алкогольной интоксикации уровень GSH в печени снижался в 1,8 раза относительно контроля (рис. 8). Содержание GSH в сердце и сыворотке крови крыс также было ниже контроля в 4,8 и 4,5 раза соответственно. Уменьшение концентрации GSH, вероятно, связано с тем, что образующийся в ходе метаболизма этанола ацетальдегид способен реагировать с SНгруппами глутатиона, в результате чего последний подвергается окислению [Lieber CS. 1993]. Кроме того, для обеспечения необходимых условий метаболизма этанола важное значение имеет поддержание высокой скорости обмена коэнзима А (КоА) за счет активизации цистеин-глутатионового оборота при посредничестве гаммаглутамилтрансферазы [Горюшкин И.И., 2001]. При введении протекторов на фоне хронической алкогольной интоксикации уровень GSH в печени был близок к контрольным показателям (рис. 5), что было характерно и для других исследованных тканей. Существует предположение, что мелатонин и тиоктовая кислота не только обладают собственным антиоксидантным потенциалом, но также могут индуцировать синтез ряда антиоксидантных ферментов [Petersen Shay K, 2008, Rodrigues, 2004]. В частности, тиоктовая кислота индуцирует транскрипцию -глутамилцистеиниллигазы - ключевого фермента синтеза глутатиона [Petersen Shay K, 2008]. В литературе также имеются сведения, что -липоевая кислота препятствует возрастному снижению уровня GSH в миокарде путем повышения доступности цистеина для синтеза глутатиона благодаря способности восстанавливать цистин [Petersen Shay, K, 2008].
Рис. 5. Содержание глутатиона в печени контрольных животных (1), крыс с хронической алкогольной интоксикацией (2) и животных с патологией, которым вводили тиоктовую кислоту в дозах 35 мг/кг (3) или 70 мг/кг (4), мелатонин в дозах мг/кг (5) или 2 мг/кг (6) Исследование функционирования ферментов глутатионовой антиоксидантной системы показало, что при алкогольной интоксикации происходит снижение активности ГР и селеновой ГП в тканях крыс. Так, активность ГП, выраженная в Е/г сырой массы, уменьшалась в сердце крыс в 2,2 раза (рис. 6)., в печени - в 1,8 раза по сравнению с нормой. Активность ГР, выраженная в Е/г сырой массы, в печени снижалась в 2,5 раза, однако в сердце практически не отличалась от контрольного уровня. Уменьшалась также активность ГП и ГР в сыворотке крови крыс, выраженная в Е/мл, в 2,8 и 1,6 раза (рис. 7) соответственно по сравнению с контролем. Повидимому, снижение активности ГР в тканях крыс вносит существенный вклад в уменьшение содержания GSH при хронической алкогольной интоксикации.
Рис. 6. Активность глутатионпероксидазы в сердце крыс в контроле (1), при алкогольной интоксикации (2) и действии тиоктовой кислоты в дозе 35 мг/кг (3) и мг/кг (4) и мелатонина в дозе 1 мг/кг (5) и 2 мг/кг (6) Наблюдаемое уменьшение активности ГП, вероятно, связано с тем, что при хронической алкогольной интоксикации происходит снижение содержания селена, который необходим для синтеза селеноцистеина, играющего важную роль в катализе [Rabiere C., 1992]. В данных условиях, по-видимому, основная нагрузка по обезвреживанию пероксидов органических кислот приходится на неселеновую ГП - глутатионтрансферазу, активность которой в кардиомиоцитах возрастает, по литературным данным. Однако в печени активность ГТ при хроническом употреблении алкоголя не изменяется, что, вероятно, является причиной большей подверженности гепатоцитов ПОЛ [Rabiere C., 1992].
Рис. 7. Активность глутатионредуктазы в сыворотке крови (в) крыс в контроле (1), при алкогольной интоксикации (2) и действии тиоктовой кислоты в дозе 35 мг/кг (3) и 70 мг/кг (4) и мелатонина в дозе 1 мг/кг (5) и 2 мг/кг (6) При введении протекторов наблюдалось увеличение активности ферментов ГП/ГР-системы по сравнению с патологией. Так, при введении мелатонина в дозе мг/кг активность ГП в сердце крыс, выраженная в Е/г сырой массы, возрастала в 1,раза относительно данных при патологии (рис. 6), а активность ГР превышала контрольный уровень на 18%, что может быть связано как с активацией данных ферментов под действием мелатонина, так и с индукцией их синтеза. Активность ГР в сыворотке при этом увеличивалась в 1,9 раза (рис. 7). Известно, что мелатонин может выступать индуктором ряда ферментов, в том числе ГП [Rodriguez C, 2004].
В качестве поставщика восстановительных эквивалентов для функционирования глутатионовой антиоксидантной системы может выступать НАДФ-ИДГ. При хронической алкогольной интоксикации активность НАДФ-ИДГ, выраженная в Е/г сырой массы, снижалась в печени крыс в 1,9 раза, в сердце - в 1,раза. Активность фермента в сыворотке крови крыс, выраженная в Е/мл, уменьшалась на 10% по сравнению с показателями контроля. Удельная активность фермента снижалась в большей степени (рис. 8). В литературе имеются сведения, что снижение активности НАДФ-ИДГ при хронической алкогольной интоксикации может быть обусловлено повреждением молекулы фермента пероксинитритом [Yang, ES, 2008].
Активность НАДФ-ИДГ в печени и сердце крыс при введении протекторов увеличивалась по сравнению с показателями животных с патологией (рис. 8). Так, применение тиоктовой кислоты в дозе 35 и 70 мг/кг сопровождалось возрастанием активности фермента в печени крыс в 1,8 и 1,9 раза, в сердце - в 1,6 и 1,7 раза соответственно, в сыворотке - до уровня контроля. Введение мелатонина в дозе 2 мг/кг приводило к увеличению активности фермента, выраженной в Е/г сырой массы, в печени и сердце крыс в 2,1 раза. Увеличение активности НАДФ-ИДГ при введении мелатонина может быть обусловлено как снижением степени повреждения молекулы фермента за счет прямого антиоксидантного действия мелатонина, так и индукцией синтеза НАДФ-ИДГ [Rodriguez C, 2004].
Рис. 15. Удельная активность НАДФ-изоцитратдегидрогеназы в печени крыс в контроле (1), при алкогольной интоксикации (2) и действии тиоктовой кислоты в дозе 35 мг/кг (3) и 70 мг/кг (4) и мелатонина в дозе 1 мг/кг (5) и 2 мг/кг (6) Г6ФДГ - ключевой фермент пентозофосфатного пути, в настоящее время рассматривается как один из основных поставщиков НАДФН в клетке.
Предполагается, что Г6ФДГ взаимодействует с 6-фосфоглюконатдегидрогеназой и ГР с образованием мультиферментного комплекса [Rosemeyer M.A., 1987]. При хронической алкогольной интоксикации активность Г6ФДГ, выраженная в Е/г сырой массы, увеличивалась в 1,4 раза в печени и сердце крыс. Активность фермента в сыворотке крови, выраженная в Е/мл, увеличивалась в 1,3 раза (рис. 9).
Рис. 9. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в сыворотке крови крыс в контроле (1), при алкогольной интоксикации (2) и действии тиоктовой кислоты в дозе 35 мг/кг (3) и 70 мг/кг (4) и мелатонина в дозе 1 мг/кг (5) и 2 мг/кг (6) Можно предположить, что при развитии хронической алкогольной интоксикации происходит возрастание роли пентозофосфатного пути как поставщика восстановительных эквивалентов. При введении протекторов активность Г6ФДГ снижалась по сравнению с показателями животных с патологией. Так, действие мелатонина в дозе 2 мг/кг приводило к приближению активности фермента в тканях крыс к уровню контроля. При применении тиоктовой кислоты в дозах 35 и 70 мг/кг активность фермента, выраженная в Е/г сырой массы, в сердце крыс уменьшалась в 1,3 и 1,4 раза, в печени - в 1,3 раза. Активность Г6ФДГв сыворотке крови крыс, выраженная в Е/мл, снижалась в 1,2 раза по сравнению с патологией (рис. 9).
Изменения удельной активности фермента сохраняли ту же тенденцию.
На интенсивность свободнорадикальных процессов, как известно, в значительной мере влияет содержание ионов Fe2+. Увеличение внутриклеточной концентрации Fe2+ происходит при окислительном стрессе за счет высвобождения из вне- и внутриклеточных депо, разрушения Fe-S-кластера аконитазы супероксидным радикалом [Скулачев В.П., 2000], а также распада других Fe2+-содержащих белков и восстановления Fe3+ в составе ферритина [Vsquez-Vivar J., 2000]. Известно, что после выхода из трансферрина ионы Fe2+ хелатируются цитратом [Skulachev V.P., 1997]. Можно предполагать, что увеличение содержания цитрата может быть механизмом снижения внутриклеточного уровня Fe2+. При хронической алкогольной интоксикации содержание цитрата в сердце и сыворотке крови увеличивалось в 2,3 и 1,2 раза соответственно по сравнению с контролем (рис. 10). При введении тиоктовой кислоты в дозе 70 мг/кг было отмечено уменьшение данного показателя в сердце в 1,раза. В сыворотке крови не было выявлено достоверного изменения исследуемого параметра. При действии мелатонина в дозе 2 мг/кг уровень цитрата снижался в сердце в 1,4 раза (рис. 10), в сыворотке крови - в 1,2 раза относительно значений при патологии.
В печени крыс при хронической алкогольной интоксикации наблюдается снижение уровня цитрата (в 1,3 раза), что, вероятно, связано с особенностями метаболизма данного органа при развитии алкогольной интоксикации. При введении протекторов животным с алкогольной интоксикацией было выявлено повышение содержания цитрата в печени, то есть был отмечен сдвиг в сторону нормы. При введении тиоктовой кислоты в дозах 35 и 70 мг/кг уровень цитрата возрастал в 1,раза, мелатонина в дозе 2 мг/кг - в 1,1 раза.
Основная роль в регуляции обмена цитрата принадлежит цитратсинтазе и аконитатгидратазе. ЦС катализирует реакцию конденсации оксалоацетата с ацетиКоА с образованием цитрата, тогда как АГ обеспечивает утилизацию цитрата с образованием изоцитрата. Молекула АГ легко разрушается активными формами кислорода [Gardner P.R., 1994], что приводит к накоплению цитрата, а в случае цитоплазматической АГ - еще и к образованию из ее молекулы Fe-чувствительного РНК-связывающего белка, который регулирует экспрессию белков, вовлеченных в обмен железа, на посттранскрипционном уровне. Кроме того, падение активности митохондриальной АГ ведет к замедлению скорости функционирования ЦТК и уменьшению потока электронов через дыхательную цепь. В результате снижается уровень АФК, генерируемых в дыхательной цепи митохондрий, а цитрат направляется на синтез липидов [Armstrong J.S, 2004]. Нами установлено, что при хронической алкогольной интоксикации активность АГ в сердце крыс, выраженная в Е/г сырой массы, снижалась в 1,3 раза (рис. 11), в сыворотке крови крыс - в 3,0 раза.
Удельная активность фермента снижалась еще значительней. Введение протекторов на фоне развития хронической алкогольной интоксикации приводило к восстановлению активности АГ в сердце и сыворотке крови крыс. Так, при введении тиоктовой кислоты в дозах 35 и 70 мг/кг активность фермента, выраженная в Е/г сырой массы, возрастала в сердце крыс в 1,2 и 1,3 раза (рис. 11), активность фермента, выраженная в Е/мл сыворотки крови, возрастала в 1,9 раза по сравнению с патологией. При введении мелатонина в дозе 2 мг/кг активность АГ в сердце и сыворотке крови крыс была выше показателей животных с хронической алкогольной интоксикацией в 1,3 и 2,9 раза соответственно (рис. 11). Активация АГ, вероятно, связана с восстановлением структуры железо-серного кластера в активном центре фермента, что происходит при снижении степени окислительного стресса.
а б Рис. 10. Концентрация цитрата в печени (а) и сердце (б) контрольных животных (1), крыс с хронической алкогольной интоксикацией (2) и животных с патологией, которым вводили тиоктовую кислоту в дозах 35 мг/кг (3) или 70 мг/кг (4), мелатонин в дозах 1 мг/кг (5) или 2 мг/кг (6) В печени крыс при хронической алкогольной интоксикации наблюдалось увеличение активности АГ, выраженной в Е/г сырой массы, в 1,8 раза, что, вероятно, связано с особенностями метаболизма данного органа. Введение веществпротекторов на фоне развития патологии приводило к приближению активности АГ в печени крыс, выраженной в Е/г сырой массы, к значениям контроля (рис. 11).
Изменения удельной активности АГ имели ту же тенденцию.
При хронической алкогольной интоксикации активность ЦС, выраженная в Е/г сырой массы, в сердце крыс снижалась на 15%, тогда как в сыворотке крови крыс не было выявлено достоверных отличий от контроля (рис. 12). При введении протекторов активность ЦС в сердце крыс приближалась к показателю контрольной группы, тогда как в сыворотке крови крыс не было выявлено достоверных отличий.
Максимальный протекторный эффект был характерен для мелатонина в дозе 2 мг/кг.
а б Рис. 11. Активность аконитатгидратазы в печени (а) и сердце (б) в контроле (1), при алкогольной интоксикации (2) и действии тиоктовой кислоты в дозе 35 мг/кг (3) и мг/кг (4) и мелатонина в дозе 1 мг/кг (5) и 2 мг/кг (6) В печени крыс при алкогольной интоксикации наблюдалось увеличение активности ЦС в 1,7 раза (рис. 12), что, вероятно, связано с особенностями метаболизма данного органа в условиях избытка ацетил-КоА, образующегося из этанола. Действие протекторов приводило к повышению содержания цитрата и снижению активности АГ и ЦС в печени крыс. В результате показатели метаболизма цитрата изменялись в сторону контроля. В частности, при введении тиоктовой кислоты в дозах 35 и 70 мг/кг уровень цитрата в печени возрастал в 1,3 раза, мелатонина в дозе 2 мг/кг - на 10%. (рис. 10). Активность ЦС в печени крыс, выраженная в Е/г сырой массы, при введении тиоктовой кислоты в дозах 35 и 70 мг/кг снижалась в 1,2 раза, при введении мелатонина в дозах 1 и 2 мг/ - в 1,1 и 1,3 раза (рис.
12). Данная тенденция прослеживалась и при расчете удельной активности ЦС в различных тканях крыс.
а б Рис. 12. Активность цитратсинтазы в печени (а) и сердце (б) в контроле (1), при алкогольной интоксикации (2) и действии тиоктовой кислоты в дозе 35 мг/кг (3) и мг/кг (4) и мелатонина в дозе 1 мг/кг (5) и 2 мг/кг (6) ЗАКЛЮЧЕНИЕ Согласно современным воззрениям, в развитии многих патологий значительную роль играет окислительный стресс [Н.К. Зенков, 1996]. При этом наблюдаются окислительные повреждения различных структур клетки, в первую очередь мембран, что негативно сказывается на энергообеспечении клеток и может приводить к их гибели [Осипов А.Н., 1990, Свободнорадикальные процессы, 2008, Скулачев В.П. 2000]. Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о возможности коррекции нарушений метаболических процессов при хронической алкогольной интоксикации с помощью введения веществ, обладающих антиоксидантными свойствами - тиоктовой кислоты и мелатонина.
В сыворотке крови крыс, подвергавшихся хроническому воздействию этанола, активность ферментов-маркеров цитолиза гепатоцитов и кардиомиоцитов (ААТ, АсАТ, КК-МВ) была повышена. Введение тиоктовой кислоты и мелатонина приводило к снижению активности маркерных ферментов в сыворотке крови крыс.
Протекторное действие мелатонина и тиоктовой кислоты может быть связано с антиоксидантными свойствами данных соединений.
Результаты исследований параметров биохемилюминесценции, уровня ДК, активности АГ, фрагментации ДНК свидетельствуют, что при хронической алкогольной интоксикации в тканях печени, сердца и крови экспериментальных животных наблюдается усиление процессов СО биомолекул, накопление продуктов липопероксидации и активация апоптоза. Наряду с этим в печени и сердце крыс имеет место снижение общей функциональной активности АОС.
При исследовании отдельных звеньев АОС установлено, что наиболее чувствительной к длительному воздействию этанола является глутатионовая АОС. В частности, происходило истощение запасов восстановленного глутатиона, который активно связывает ацетальдегид, а также функционирует как ловушка для свободнорадикальных молекул. Скорость регенерации восстановленного глутатиона из окисленного в при хронической алкогольной интоксикации снижена вследствие падения активности ГР в печени. Следует отметить, что интенсивность синтеза глутатиона de novo лимитирована доступностью циcтеина, за который в условиях постоянного поступления этанола конкурируют реакции биосинтеза ацетил-КоА.
Более того, по литературным данным, при хронической алкогольной интоксикации GSH используется для синтеза цистеина [Горюшкин И.И., 2001]. Подавление глутатионовой антиоксидантной системы выражалось также и в снижении активности ГП в тканях крыс, что, по-видимому, связано со снижением содержания селена, играющего важную роль в катализе [Rabiere C., 1992].
При хронической алкогольной интоксикации происходит также изменение активностей ферментов - основных поставщиков НАДФН для функционирования ГР/ГП-системы. Согласно полученным нами результатам, при хронической алкогольной интоксикации наблюдалось уменьшение активности НАДФ-ИДГ в тканях крыс, активность Г6ФДГ, напротив, возрастала относительно контрольного уровня. Поддержание определенного уровня НАДФН необходимо для липогенеза, который усилен в условиях хронической алкогольной интоксикации [Lieber C.S., 1994]. Кроме этого, НАДФН играет важную роль для обеспечения нормального функционирования каталазы, предотвращая ее инактивацию [Гулак П.В., 1985].
При хронической алкогольной интоксикации наблюдается повышение активности каталазы в тканях крыс, что имеет большое значение для ускорения окисления алкоголя и для обезвреживания пероксидов, концентрация которых на фоне снижения активности ГП может резко возрастать. Изменения активности СОД при хронической алкогольной интоксикации носили тканеспецифичный характер: в печени и сыворотке крови крыс происходило повышение супероксиддимутазной активности, в сердце выявлено снижение активности СОД. Падение активности фермента может быть связано с инактивацией его молекул под действием продукта реакции - Н2О2, концентрация которого может возрастать на фоне снижения активности ГП и недостаточной активации каталазы. Согласно полученным данным, увеличение активности каталазы относительно контроля в сердце крыс при развитии патологического процесса менее выражено, а уменьшение скорости протекания ГПреакции, наоборот, более выражено по сравнению с данными показателями в печени.
При хронической алкогольной интоксикации было выявлено значительное снижение активности АГ в сердце и сыворотке крови крыс, что сопровождалось накоплением цитрата, повышение уровня которого могло иметь адаптивное значение для торможения СО биомолекул путем хелатирования ионов Fe2+, играющих роль прооксидантов. Активность другого фермента, связанного с метаболизмом цитрата, - ЦС, снижалась в сердце крыс незначительно. В печени крыс наблюдалось существенное увеличение активности АГ и ЦС, сопровождающееся снижением уровня цитрата. По-видимому, это сопряжено с особенностями метаболизма в гепатоцитах при алкогольной интоксикации, связанными с усиленным синтезом ацетил-КоА. Таким образом, при хронической алкогольной интоксикации на фоне интенсификации свободнорадикальных процессов наблюдается торможение функционирования одних звеньев антиокисидантной защиты организма (глутатионовой АОС) и повышение активности других (каталазы во всех тканях, СОД в печени, накопление цитрата в сердце и сыворотке крови).
При введении тиоктовой кислоты и мелатонина происходило снижение параметров, отражающих интенсивность свободнорадикальных процессов.
Результаты исследования параметров биохемилюминесценции, уровня первичных продуктов ПОЛ, активности АГ указывают, что наибольший позитивный эффект при хронической алкогольной интоксикации оказывал мелатонин в дозе 2 мг на кг, который проявлял как кардиопротекторное, так и гепатопротекторное действие. Для тиоктовой кислоты было характерно преобладание гепатопротекторного эффекта.
При введении протекторов происходило возрастание как общего антиоксидантного потенциала организма, так и активности отдельных звеньев антиоксидантной системы. Так, наблюдалось повышение уровня восстановленного глутатиона, а также увеличение активности ГП/ГР-системы по сравнению с патологией, что сопровождалось изменением активностей НАДФН-генерирующих ферментов (Г6ФДГ и НАДФ-ИДГ) в сторону показателей контроля. В большинстве случаев также наблюдалось дозозависимое изменение активности СОД и каталазы в сторону нормы, а также нормализация показателей обмена цитрата.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности коррекции нарушений метаболических процессов при хронической алкогольной интоксикации с помощью введения тиоктовой кислоты и мелатонина. При этом максимальное действие оказывал мелатонин в дозе 2 мг/кг, который, обладая амфифильными свойствами, способен проникать в различные ткани и оказывать антиоксидантное действие как за счет непосредственного обезвреживания АФК, так и за счет стимуляции работы антиоксидантной защиты организма. На основании проведенных исследований предложена гипотетическая модель участия тиоктовой кислоты и мелатонина в регуляции свободнорадикального гомеостаза в клетке при хронической алкогольной интоксикации (рис. 13).
Согласно полученным данным, тиоктовая кислота и мелатонин, благодаря способности связывать свободные радикалы, уменьшают степень свободнорадикального окисления биомолекул при хроническом алкоголизме, и снижают нагрузку на основные звенья АОС. В результате уменьшения степени свободнорадикального повреждения молекул восстанавливается активность ряда ферментов окислительного метаболизма (АГ в сердце и сыворотке крыс, ЦС, НАДФИДГ, Г6ФДГ во всех исследованных тканях), антиоксидантных ферментов (СОД в сердце крыс, ГР, ГП во всех исследованных тканях). Кроме того, способность тиоктовой кислоты включать в хелатное кольцо ряд ионов металлов ведет к снижению интенсивности протекания реакций Фентона и ПОЛ.
Участие тиоктовой кислоты в поддержании физиологического равновесия в системе глутатиона выражается в способности индуцировать синтез глутатиона de novo [Petersen Shay, 2009]. Тиоктовая кислота также может выступать донором сульфгидрильных групп, замещая глутатион. В основе благоприятного действия мелатонина на глутатионовую АОС может лежать способность данного гормона индуцировать ряд антиоксидантных ферментов, в том числе ГП (Rodriguez C., 2004).
Как для мелатонина, так и для тиоктовой кислоты характерна амфифильность, что делает возможным накопление данных протекторов в различных компартментах клетки. Таким образом, благодаря своим структурно-функцональным особенностям тиоктовая кислота и мелатонин могут рассматриваться как регуляторы свободнорадикального гомеостаза на различных уровнях и как потенциальные терапевтические агенты для применения в комплексном лечении поражений печени и сердца при хроническом алкоголизме.
тк Рис. 13. Гипотетическая схема участия тиоктовой кислоты и мелатонина в регуляции свободнорадикального гомеостаза при хронической алкогольной интоксикации ВЫВОДЫ 1. Введение тиоктовой кислоты и мелатонина на фоне хронической алкогольной интоксикации приводит к снижению активности ферментов-маркеров цитолиза гепатоцитов и кардиомиоцитов (аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, креатинкиназы МВ) в сыворотке крови крыс.
2. Тиоктовая кислота и мелатонин, вводимые на фоне хронической алкогольной интоксикации, снижают интенсивность свободнорадикального окисления биомолекул в тканях крыс, оцениваемого по параметрам биохемилюминесценции, концентрации диеновых конъюгатов и степени фрагментации ДНК. Наиболее эффективным является мелатонин в дозе 2 мг/кг.
3. Введение тиоктовой кислоты и мелатонина на фоне хронического воздействия этанола ведет к повышению общей антиоксидантной активности в тканях крыс по сравнению с патологией и приближению большинства параметров, отражающих функционирование отдельных звеньев антиоксидантной системы, к показателям контрольных животных.
4. Мелатонин и тиоктовая кислота оказывают наиболее выраженный стимулирующий эффект на глутатионовую антиоксидантную систему, которая в условиях хронической алкогольной интоксикации подвержена наибольшему депрессивному воздействию.
5. Хроническое воздействие этанола приводит к повышению активности СОД в печени и сыворотке крови, снижению активности СОД в сердце и активации каталазы во всех исследованных тканях крыс. Результатом введения протекторов является приближение активности каталазы и СОД к показателям контроля.
6. При хронической алкогольной интоксикации наблюдается повышение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и снижение активности НАДФизоцитратдегидрогеназы в тканях крыс. Введение протекторов приводит к изменению активностей этих НАДФН-генерирующих ферментов в сторону показателей контрольных животных.
7. Изменения метаболизма цитрата при хронической алкогольной интоксикации имеют тканевые особенности: в печени наблюдается активация аконитазы и цитратсинтазы и снижение концентрации цитрата, тогда как в сердце и сыворотке крови крыс снижение активности аконитазы сопровождается накоплением цитрата, при этом активность цитратсинтазы не претерпевает изменений. Введение тиоктовой кислоты и мелатонина приводит к изменению показателей метаболизма цитрата в направлении контрольных значений.
8. Действие тиоктовой кислоты и мелатонина на все исследуемые показатели носит дозозависимый характер, причем зависимость эффекта от дозы более выражена для мелатонина.
9. Предложена гипотетическая схема влияния тиоктовой кислоты и мелатонина на свободнорадикальный гомеостаз при хронической алкогольной интоксикации.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ 1. Попова Т. Н, Рахманова Т.И., Горбенко М.В, Аллекрад Х., Власова Е.С.
Функционирование глутатионовой антиоксидантной системы при хронической алкогольной интоксикации и действии тиоктовой кислоты // Материалы Международного симпозиума Адаптационная физиология и качество жизни:
проблемы традиционной и инновационной медицины, посвященного 80-летию академика РАМН Н.А. Агаджаняна, Москва, 15-16 мая 2008 г. - С. 287-289.
2. Аллекрад Х., Горбенко М.В., Горбенко Ю.В., Рахманова Т.И., Попова Т.Н.
Уровень глутатиона в тканях крыс при хронической алкогольной интоксикации и действии протекторов // Сборник трудов Организация и регуляция физиологобиохимических процессов. Воронеж: ООО Центрально-Черноземное книжное издательство, 2009. -Вып. 11. - С. 37-40.
3. Попова Т.Н., Панченко Л.Ф., Семенихина А.В., Рахманова Т.И., Аллекрад Х.
Влияние тиоктовой кислоты и мелатонина на глутатионовую антиоксидантную систему и активность некоторых НАДФН-генерирующих ферментов в печени и сыворотке крови крыс при хронической алкогольной интоксикации // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2010. - № 2. - С. 20-23.
4. Аллекрад Х., Попова Т.Н., Рахманова Т.И., Семенихина А.В., Матасова Л.В.
Влияние мелатонина и тиоктовой кислоты на активность аконитатгидратазы и уровень цитрата в сердце и сыворотке крови крыс при хронической алкогольной интоксикации // Материалы Всероссийской с международным участием научнометодической конференции Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ. г. Воронеж, 20-апреля 2010 г.- Воронеж: Изд-во ВГУ, 2010. - С. 23Ц26.
5. Аллекрад Х., Попова Т.Н., Рахманова Т.И., Матасова Л.В., Горбенко М.В.
Влияние мелатонина на активность глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы при хронической алкогольной интоксикации у крыс // Материалы Всероссийской с международным участием научно-методической конференции Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ. г. Воронеж, 20-21 апреля 2010 г.- Воронеж: Изд-во ВГУ, 2010. - С. 27Ц30.
6. Аллекрад Х., Гладченко И.Б., Склярова Е.И. Метаболизм цитрата в печени крыс при хронической алкогольной интоксикации и влиянии мелатонина // Актуальные вопросы медицинской науки: Сборник научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 1000-летию Ярославля. - Ярославль: OOO ЯрМедиаГруп, 2010 г. - 414 с. - С. 33.
7. Аллекрад Х., Попова Т.Н., Семенихина А.В., Матасова Л.В. Влияние мелатонина на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и НАДФизоцитратдегидрогеназы при хронической алкогольной интоксикации у крыс // Биологические науки: Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Т.II. ЧУфа: РИ - БашГУ, 2010. Ч C. 144-148.
8. Аллекрад Х., Попова Т.Н., Горбенко М.В., Рахманова Т.И., Горбенко Ю.В..
Параметры биохемилюминесценции в тканях крыс при хронической алкогольной интоксикации и действии различных доз тиоктовой кислоты и мелатонина // Первые международные Беккеровские чтения. Сб. научн. тр. по материалам научнопрактической конференции. 27 - 29 мая 2010 г., Волгоград. По ред. д.б.н., проф.
В.А. Сагалаева. В 2-х частях. - Часть 2. - С. 4-6.
9. Аллекрад Х., Попова Т.Н., Матасова Л.В., Клокова А.И. Активность каталазы в тканях крыс при хронической алкогольной интоксикации и действии мелатонина // Биоантиоксидант: Тезисы докладов VIII Международной конференции.
Москва, 4 - 6 октября 2010 г. - М.: РУДН, 2010. - С. 21-23.
10. Аллекрад Х., Попова Т.Н., Матасова Л.В., Горбенко М.В. Интенсивность пероксидного окисления липидов в тканях крыс при хронической алкогольной интоксикации и действии мелатонина и тиоктовой кислоты // Материалы XXI съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. - г. Калуга, 19-25 сентября 2010 г. - М.: ООО БЭСТ-принт - С. 22-23.
11. Аллекрад Х., Попова Т.Н., Макеева А.В., Склярова Е.И., Матасова Л.В..
Влияние тиоктовой кислоты на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и НАДФизоцитратдегидрогеназы в сердце крыс при хронической алкогольной интоксикации // Материалы Всероссийской с международным участием научно-методической конференции Проблемы здоровьесбережения дошкольников, учащихся и студентов, новые здровьесберегающие тенденции в фармации и медицине. Воронеж, 26-апреля 2011 г. - Воронеж: Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета, 2011. - С. 325-328.
12. Попова Т.Н., Аллекрад Х., Рахманова Т.И., Семенихина А.В., Матасова Л.В. Влияние тиоктовой кислоты на глутатионовую антиоксидантную систему и активность НАДФН-генерирующих ферментов в сердце крыс при хронической алкогольной интоксикации // Хим.-фарм. журнал. - 2011. - Т.10, № 45. - С. 7-8.
13. Попова Т.Н., Аллекрад Х., Матасова Л.В., Сафонова О.А., Семенихина А.В.
Влияние мелатонина на свободнорадикальный гомеостаз при хронической алкогольной интоксикации у крыс // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -2012. - № 2. - C. 44 - 47.
Статьи № 3, 12 и 13 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК.