Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
АЛЕКСЕЕВ Кирилл Сергеевич
СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ НУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗ ESCHERICHIA COLI
03.01.03 - Молекулярная биология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва 2012
Работа выполнена в Лаборатории стереохимии ферментативных реакций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А.
Энгельгардта Российской академии наук.
Научный консультант: заведующий Лабораторией стереохимии ферментативных реакций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, доктор химических наук, профессор С.Н. Михайлов
Официальные оппоненты: главный научный сотрудник Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова доктор химических наук, профессор М.Б. Готтих ведущий научный сотрудник Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им.
В.А. Энгельгардта Российской академии наук, доктор химических наук В.Л. Туницкая
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук
Защита диссертации состоится л____ _____________ 2012 г. в _____ часов на заседании диссертационного Совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетным учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.
Автореферат разослан л____ _____________ 2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук А.М. Крицын
Актуальность исследования.
Настоящая работа посвящена изучению субстратной специфичности важной группы ферментов - нуклеозидфосфорилаз, которые осуществляют обратимый фосфоролиз нуклеозидов с образованием соответствующего гетероциклического основания и 1-фосфата моносахарида. К этим ферментам относятся тимидинфосфорилаза (ТФ) (КФ 2.4.2.4), уридинфосфорилаза (УФ) (КФ 2.4.2.3) и пуриннуклеозидфосфорилаза (ПНФ) (КФ 2.4.2.1). Нуклеозидфосфорилазы играют важную роль в метаболизме нуклеозидов. В опухолевых клетках наблюдается повышенный уровень активности этих ферментов, которые могут быть использованы в качестве маркеров онкологических заболеваний. Эти ферменты применяются в промышленности для синтеза лекарственных препаратов и практически важных нуклеозидов. В качестве примера можно привести известные ферментативные превращения нуклеозидов под действием УФ и ПНФ: -D-арабинофуранозилурацил + УФ + неорганический фосфат урацил + -D-арабинофуранозил-1-фосфат + ПНФ + аденин -D-арабинофуранозиладенин.
Также эти ферменты используются для количественного определения неорганического фосфата.
Следует отметить, что субстратная специфичность этих ферментов исследована недостаточно полно. Это связано с отсутствием удобных методов определения кинетических параметров фосфоролиза нуклеозидов. Несмотря на большое количество работ, посвященное этим ферментам, не определена роль функциональных групп нуклеозидов при формировании продуктивного ферментсубстратного комплекса. Практически отсутствуют данные о влиянии структуры нуклеозида и гетероциклического основания на положение равновесия реакции фосфоролиза, что важно для практического применение этих ферментов. Вышесказанное и определяет актуальность и большой интерес к изучению субстратной специфичности и архитектуры активного центра этих ферментов.
Целью работы являлось изучение субстратной специфичности рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз E.coli.
В ходе исследования решались следующие задачи:
- разработка удобных методов определения констант равновесия, констант Михаэлиса и констант ингибирования для этих ферментов;
- изучение фосфоролиза большой группы нуклеозидов, модифицированных как по углеводному остатку, так и гетероциклическому основанию;
- изучение роли гидроксильных групп нуклеозидов в связывании с ферментами;
- расширение возможностей использования ферментов для получения модифицированных нуклеозидов и гетероциклических оснований.
Научная новизна и практическая значимость работы Для изучения пиримидиннуклеозидфосфорилаз предложены новые субстраты - 4-тиотимидин и 4тиоуридин. Разработан удобный хроматографический метод определения констант равновесия ферментативной реакции. Изучена реакция фосфоролиза более 50 производных нуклеозидов, катализируемого нуклеозидфосфорилазами, определены константы Михаэлиса, константы ингибирования, а также константы равновесия. Полученные данные сопоставлены с данными рентгеноструктурного анализа и сделаны выводы об организации фермент-субстратного комплекса.
Результаты работы важны для оптимизации ферментативных методов создания N-гликозидной связи и расширения возможностей использования ферментов для получения биологически важных нуклеозидов, гетероциклических оснований и их производных.
Апробация работы.
Основные положения диссертационной работы были представлены на XII Международной конференции УНовые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологииФ (Гурзуф, Украина, 2004); International conference Biocatalysis-2005: fundamentals & applications.
(St.Petersburg, RF, 2005); XIX International Round Table УNucleosides, Nucleotides and Nucleic AcidsФ (Lyon, France, 2010); XV Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components (Czech Republic, Cesky Krumlov. 2011).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 5 тезисов докладов.
Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы ( наименований). Работа изложена на страницах, включает рисунков, ЕЕ...схем и таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Общая характеристика ферментов и методы изучения кинетики и констант равновесия.
Нуклеозидфосфорилазы обнаружены почти у всех организмов, при этом эволюционные различия невелики и гомология между ферментами E. coli и млекопитающих составляет > 25 % для УФ, > 33 % для ТФ и > 20 % для ПНФ (M.J.Pugmire, S.E.Ealick, Biochem. J. 361, 1-25, 2002).
Нуклеозидфосфорилазы участвуют в дополнительном пути биосинтеза нуклеозидов и катализируют обратимую реакцию расщепления рибонуклеозидов и 2-дезоксирибонуклеозидов с образованием гетероциклического основания и (2-дезокси)рибозо-1-фосфата (схема 1).
Каталитический механизм этих ферментов не требует участия какого-либо кофермента или металла.
Характерной чертой нуклеозидфосфорилаз является механизм ферментативной реакции - аналогичный механизму кислотного гидролиза нуклеозидов. В таблице 1 приведены известные базовые характеристики нуклеозидфосфорилаз E. coli и человека.
HO HO B O O O O HO P OH O P OH + + B OH OH HO R HO R Схема 1. Реакция ферментативного фосфоролиза нуклеозидов, R = OH, H. B - гетероциклическое основание Таблица 1. Структурные особенности ТФ, УФ и ПНФ E. coli и человека.
НФ человека НФ E. coli Характеристики ферментов ПНФ УФ ТФ ПНФ УФ ТФ Субъединицы, кол-во 3 4 2 6 6 Аминокислотные 289 310 482 239 253 4остатки, кол-во Молекулярный вес 32 34 50 26 27 субъединицы, kDa pH оптимум 7,0 7,5 7,4 7,5 7,5 6,Наиболее специфичным ферментом является ТФ, субстратом которой является тимидин. УФ осуществляет фосфоролиз как тимидина, так и уридина, а цитидин не является субстратом для обоих ферментов. Наименее специфична ПНФ E. coli, субстратами которой являются все пуриновые нуклеозиды как рибо- так и 2-дезоксирибо- ряда. Следует отметить, субстратная специфичность ПНФ человека существенно уже, этот фермент не расщепляет производные аденозина. УФ и ПНФ также используют в качестве субстратов 1-(-D-арабинофуранозил)пиримидины или -пурины.
В настоящее время для определения активности нуклеозидфосфорилаз используются спектрофотометрические методы. Большинство ранних работ по изучению ингибиторов выполнено с использованием 14С-меченых по гетероциклическому основанию нуклеозидов.
Спектрофотометрические методы основаны на разности экстинкций нуклеозидов и соответствующих гетероциклических оснований при определенной длине волны. В литературе имеются противоречивые данные по экстинкциям нуклеиновых оснований. Для их уточнения в настоящей работе использовался ферментативный фосфоролиз нуклеозида непосредственно в кювете спектрофотометра, что позволяет избежать ошибок при разбавлении растворов. В реакции использовали большой избыток неорганического фосфата, и полноту образования нуклеинового основания контролировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В таблице 2 суммированы наши данные по УФ-спектрам природных нуклеозидов и нуклеиновых оснований. При выборе оптимальной длины волны, при которой проводилось определение кинетических характеристик нуклеозидов, руководствовались значениями молярных коэффициентов экстинкций пар нуклеозид/основание, а также рабочими концентрациями субстратов, учитывая технические возможности и чувствительность измерительного прибора при различных значениях концентраций соединений, содержащих хромофор.
На основании этих данных для каждого субстрата были выбраны оптимальные длины волн, при которых и определялись кинетические параметры фосфоролиза.
Таблица 2. Данные УФ-спектров природных нуклеозидов и гетороциклических оснований при 25С, 50 мМ буферный раствор KH2PO4, рН 7,0.
Молярный Условия, длина волны , нм Длина волны коэффициент Нуклеозид, (разность молярных , нм экстинкции , гетероциклическое коэффициентов экстинкции , M-1см-основание M-1см-1) min max min max Ado 226 259 2210 149275 (1008) Ade 225 260 2575 134Ino 222 248 3597 123275 (926) Hyp 220 249 2586 107Guo 222 252 2844 136273 (964) Gua 225 245 6855 108Urd 230 261 2187 100280 (2032) Ura 228 257 1823 81Thd 234 267 2196 96290 (1033) Thy 233 264 1918 784-SUrd 275 330 2276 216355 (3993) 4-SUra 275 328 1856 1864-SThd 278 336 1008 215355 (5354) 4-SThy 280 333 1140 195Ошибка измерений не превышала 15%.
Был предложен новый спектрофотометрический метод определения активности УФ и ТФ с использованием в качестве субстрата 4-тиоуридина и 4-тиотимидина. Отличительной особенностью этих субстратов является наличие максимума поглощения в видимой области, причем разница коэффициентов молярной экстинкции в паре 4-тиотимидин/4-тиотимин существенно больше, чем в случае природных соединений (рисунок 1, таблица 2). В результате определения кинетических характеристик ферментативного фосфоролиза 4-тиоуридина оказалось, что он является хорошим субстратом для УФ и реакция подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен. Аналогичные результаты были получены и в случае 4-тиотимидина и ТФ. Это позволяет использовать эти нуклеозиды для определения ингибиторных свойств гетероциклических соединений, включая производные нуклеозидов, имеющих максимум поглощения при 260-270 нм.
Рисунок 1. УФ-спектры тимидина, тимина, 4-тиотимидина и 4-тиотимина при 25 С и рН 7,0 (50 мМ буферный раствор KH2PO4).
Константу равновесия реакции фосфоролиза Нуклеозид + Pi Основание + (2-дезокси)рибозо-1фосфат определяли с помощью ВЭЖХ при различных рН и температуре 37С, используя различные соотношения концентраций нуклеозида и фосфата: 1:10, 1:20 1:50, 1:125 и 1:250. Например, к раствору производного уридина (0,2 мкмоль) в 1 мл буфера Трис-НСl (50 мМ, рН 7,5) добавляли мкмоля фосфата калия и начинали реакцию добавлением 0,03-0,3 ед. акт. УФ. Количество добавляемого фермента зависело от скорости реакции: для медленно превращающихся субстратов фермента добавляли больше. Смесь инкубировали при температуре 37С до установления равновесного состояния (1-2 часа). Реакцию анализировали методом ВЭЖХ (рисунок 2) и сигналы детектировали при длине волны 261 нм для производных уридина (267 нм для производных тимидина, 260 нм для производных аденозина и 330 нм для 4-тиоуридина). Константу равновесия рассчитывали по следующей формуле:
Кр = [основание][Rib-p]/[нуклеозид] [pi].
Равновесные концентрации определяли из интегралов сигналов гетероциклического основания и нуклеозида, учитывая их коэффициенты молярной экстинкции, и принимая [основание] = [Rib-p].
Этот удобный метод был использован для определения констант равновесия для большого числа различных нуклеозидов, модифицированных как по гетероциклическому основанию, так и по углеводному остатку. В работе были использованы рекомбинантные ТФ, УФ и ПНФ E.coli, любезно предоставленные старшим научным сотрудником ИБХ РАН к.х.н. Р.С. Есиповым (Prot. Expres. Purif.
24, 56-60, 2002).
а) Исходное соединение уридин б) Реакция фосфоролиза уридина, через 30 мин A262 A20,4 0, 0,2 0,0 2 4 6 8 10 12 t, мин 2 4 6 8 10 12 t, мин в) Состояние равновесия, через 2 часа г) Контроль, урацил A262 A20,4 0,0,2 0,0 2 4 6 8 10 12 t, мин 2 4 6 8 10 12 t, мин Рисунок 2. ВЭЖХ-анализ реакции фосфоролиза уридина. Условия анализа: 0-15% ацетонитрила за мин в 50 мМ буферном растворе ацетата натрия (pH 4,3) при 25С, детекция при длине волны 261 нм, колонка 4,6150 мм (5 мкм, Nucleosil-C18). Условия фосфоролиза: концентрация уридина 200 мкМ, Концентрация фосфата 4 мM (1:20), 1 мл 50 мM буферного раствора Tris-HCl (pH 7,5), 0,03 ед. акт.
УФ, 37C. RTUra-3,7 мин, RTUrd-5,9 мин.
2. Субстратная специфичность ТФ.
Для изучения субстратной специфичности нуклеозидфосфорилаз была использована большая библиотека модифицированных нуклеозидов, синтезированная в ИМБ РАН. Были измерены кинетические параметры и константы равновесия реакции ферментативного фосфоролиза производных тимидина, модифицированных по углеводному остатку. На основе данных рентгеноструктурного анализа и результатов молекулярной динамики выявлена роль гидроксильных групп углеводного остатка нуклеозида в связывании субстрата с аминокислотами активного центра и уточнен механизм работы тимидинфосфорилазы E.coli.
ТФ является специфичным ферментом и не катализирует фосфоролиз других природных нуклеозидов (уридин, цитидин, аденозин, инозин, ксантозин и гуанозин). В этом ряду только уридин является хорошим ингибитором ТФ. 4-Тиотимидин и 2'-дезоксиуридин, а также 5'-дезокситимидин являются хорошими субстратами ТФ. Замена гидроксильной группы в 5-положении на объемный заместитель не препятствует связыванию нуклеозида с ТФ (Таблица 3). Однако скорость реакции значительно снижается при увеличении размеров заместителя. Дальнейшее увеличение Ван-дерваальсова радиуса заместителя (5'-бром-5'-дезокситимидин) приводит к тому, что нуклеозид связывается с ферментом, но не подвергается фосфоролизу, а 5'-азидо-5'-дезокситимидин практически не связывается с ферментом. Замена 5-гидроксильной на аминогруппу позволяет субстрату связываться с ферментом с такой же константой, что и тимидин. При введении в 5-положении тимидина метильной группы или дополнительного метиленового звена наблюдается аналогичный эффект: константа связывания остается без изменений, а скорость фосфоролиза существенно уменьшается. Очевидно, что гидроксильная группа в 5-положении (и, вероятно, водородная связь, которую она образует) не имеет принципиального значения ни для связывания, ни для реакции.
Нуклеозиды, в которых отсутствует 3-гидроксильная группа или обращена конфигурация при С3, не являются субстратами ТФ, но ингибируют фермент с Ki, близкой к Km тимидина. 3'-Амино-3'дезокситимидин не является субстратом ТФ при рН 6,5, однако при увеличении рН до 8,0 начинается его фосфоролиз. Уридин и 5-метилуридин не являются субстратами ТФ, однако эффективно ингибируют ее активность. Следует отметить, что диальдегидное производное уридина (уридин, окисленный периодатом натрия), также эффективно связывается с ТФ.
ТФ катализирует фосфоролиз тимидина в широком диапозоне рН. График зависимости pKm от рН при действии ТФ на тимидин имеет форму колокола и узкий максимум, который находится в значении 6,5 с перегибами в 6,1 и 6,8. В интервале рН 7,0-8,5 Km меняется незначительно.
Для определения константы равновесия реакции ферментативного фосфоролиза тимидина реакционную смесь инкубировали при рН 6,5 и 8,2 и при разных температурах: 37С и 4С. При инкубировании реакционной смеси при рН 6,5 (37С) на графике зависимости количества субстратов от времени равновесное плато четко не формировалось (рисунок 3), а среди продуктов хроматографически определялась дезоксирибоза. На основании литературных данных о неустойчивости 2-дезоксирибозофосфата в кислых и нейтральных средах был сделан вывод о том, что смещение равновесия обусловлено вкладом химического гидролиза этого продукта. Поскольку известно, что скорость неферментативного гидролиза значительно зависит от температуры, мы постарались исключить вклад гидролиза и определяли константу равновесия реакции фосфоролиза тимидина при рН 8,2 и температуре 4С. В этих условиях равновесное плато было четко обозначено и концентрации основания и нуклеозида оставались неизменными в течение нескольких часов (рисунок 3). Увеличение концентрации фермента позволяет определить Кр 2'-дезоксинуклеозидов и при рН 7,(см. данные для УФ и ПНФ).
Рисунок 3. Зависимость количества субстрата и продукта от времени в реакции фосфоролиза тимидина. Значения Kp измерены в 50 мМ Tris-буфере (pH 6,5) при соотношении нуклеозид:фосфат 1:10. Цифрами обозначено: 1 - фосфоролиз тимидина при pH 6,5 и 4C; 2 - образование тимина при pH 6,5 и 4C; 3 - фосфоролиз тимидина при pH 6,5 и 37C; 4 - образование тимина при pH 6,5 37C.
Интересно отметить, что 2,3-дидегидро-3-дезокситимидин является субстратом с такой же константой Михаэлиса, как и в случае тимидина (Km = 350 мкM), но скорость реакции падает более чем в 100 раз и равновесие не устанавливается. Хорошо известно, что скорость кислотного гидролиза для 2,3-дидегидро-2,3-дидезоксипроизводных на два-три порядка выше скорости гидролиза природных нуклеозидов. Очевидно, что скорость гидролиза 2,3-дидегидро-2,3дидезоксирибозофосфата намного больше скорости обратной реакции образования нуклеозида, поэтому происходит смещение равновесия и определить константу равновесия невозможно.
Вероятность неспецифического гидролиза контролировали по инкубации без фермента. Все изученные константы равновесия лежат в диапазоне 0,04-0,1 и мало зависят от структуры субстрата.
Как видно из таблицы 3, любая модификация нуклеозида по углеводному остатку - удаление, замещение гидроксильных групп или введение дополнительных групп в 3- и 5-положении - практически не влияет на связывание субстрата (или ингибитора). В тоже время 3-ОН, но не 5-ОН, играет ключевую роль в формировании продуктивного фермент-субстратного комплекса.
На основании рентгеноструктурных данных комплекса ТФ с тимидином и симуляции молекулярной динамики предполагают, что формирование фермент-субстатного комплекса происходит за счет взаимодействия аминокислотных остатков Arg-178, Lys-190, His-85 с карбонильными группами С4=О, С2=О, Ser-186 c амидным протоном тимина и Thr-123 и Ser-113 с фосфатом. Считают, что движение доменов, которое начинается при образовании комплекса, приводит к существенному сближению имидазольного кольца His-85 и С2=О тимидина. Вследствие такого сближения происходит протонирование карбонильной группы, ослабляется гликозидная связь и подготавливается нуклеофильная атака фосфата на карбкатион.
Таблица 3. Кинетические параметры для ферментативного фосфоролиза ТФ тимидина и его производных, измеренные спектрофотометрически (50 мМ калий-фосфатный буфер, рН 6,5, температура 25С. Значения Кр измерены в 50 мМ Трис-буфере, рН 8,2, температура 4С, соотношение нуклеозид:фосфат 1:10).
Кm* (Кi), kcat** kcat/Km, субстрат Кр(1/Кр) мкМ с-1 мкМ-1/с-тимидин 0,07 (14,3) 300 198 0,66 переносимые 2'-дезоксиуридин 0,04 (25) 320 35 0,18 модификации субстрата S 4-тиотимидин 0,07 (14,3) 280 63 0,O 5'-дезокситимидин 0,05 (20) 400 260 0,Me H, Cl, CHNH 5'-хлор-5'-дезокситимидин 0,07 (14,3) 300 1,7 0,0N O HO O 5'-бром-5'-дезокситимидин (400) - 5'-иод-5'-дезокситимидин (400) - HO 5'-С-метил(D-алло)тимидин 0,14 (7.0) 330 0,1 0,005'-С-метил(L-тало)тимидин 0,1 (10) 350 0,45 0,005'-гомо-тимидин 0,068 (14,6) 300 0,06 0,003'-амино-3'-дезокситимидин (600) - 3'-амино-3'-дезокситимидин нд 400 1.1 0,00pH 8,5'-азидо-5'-дезокситимидин - - модификации, 2,3-дидегидро-3-дезоксинд 350 0,4 0,00тимидин приводящие к потере 3-дезокситимидин (850) - субстратных свойств O 2-дезокси--D-трео (450) - Br, I, Nпентафуранозилтимин NH -D (1000) - N O арабинофуранозилурацил HO O уридин (60) - OH 5-дезоксиуридин (450) - HO 2-тиоуридин (800) - H 5-метиридин (100) - урацил (350) - * л- Практически не ингибирует при концентрации 1мМ.
** л- Скорость реакции составляет менее 0,1% от скорости природного субстрата. нд - нет данных.
Ошибка измерений Km и kcat не превышала 20%. Ошибка измерений Кр не превышала 10%.
Полученные в настоящей работе результаты сопоставлены с известными данными рентгеноструктурного анализа и молекулярной динамики и сделаны следующие выводы. При связывании нуклеозида в активном центре ТФ за счет водородных связей гетероциклического основания, начинается движение -домена, которое приводит к значительному сближению нуклеозида и фосфата, и, вероятно, что это движение продолжается до тех пор, пока не образуется водородная связь 3-ОН группы с HN-группой основной цепи (Thr-123) и с атомами кислорода фосфата.
Образование этой связи завершает процесс формирования фермент-субстратного комплекса и размещает нуклеозид и фосфат в позиции, удобной для осуществления нуклеофильной атаки.
С литературной моделью, хорошо согласуется тот факт, что модификации в 5-положении тимидина не мешают связыванию нуклеозида в активном центре фермента и во многих случаях не влияют на фосфоролиз. В то же время, при наличии у 2-углеродного атома гидроксильной группы (рибонуклеозиды) возможно образование водородной связи с азотом His-85. Вероятно, что вследствие этой дополнительной связи увеличивается сродство нуклеозида к ферменту по сравнению с природным субстратом. С другой стороны образование водородной связи блокирует участие His-85 в протонировании С2=О и ингибирует реакцию.
3. Субстратная специфичность УФ.
УФ является менее специфичным ферментом по сравнению с ТФ. УФ катализирует фосфоролиз как уридина, так и тимидина (Таблица 4). В то же время пуриновые нуклеозиды, а также цитидин не являются субстратами. В случае УФ для образования фермент-субстратного комплекса необходимо образование водородных связей с гидроксильными группами в 2, 3 и 5-положении. Фосфоролиз 2'дезоксиуридина и 5'-дезоксиуридина, катализируемый УФ, протекает на порядок медленнее, чем в случае уридина. Введение метильной группы в 5-ое положение гетероцикла еще больше снижает эффективность реакции. Полученные данные важны для понимания механизма дискриминации природных уридина и тимидина пиримидиннуклеозидфосфорилазами. Тимидин превращается ТФ в раза эффективнее, чем 2'-дезоксиуридин.
Как и в случае ТФ, 4-тиопиримидиновые нуклеозиды являются хорошими субстратами для УФ, в то время как 2-тиоуридин практически не связывается с УФ. Все изученные константы равновесия лежат в диапазоне 0,05-0,2 и практически не зависят от структуры субстрата. Исключение составляет 6-метилуридин, который медленно превращается в 6-метилурацил. В данном случае обратная реакция не идет, как и в случае фосфоролиза 7-метил-пуриновых нуклеозидов ПНФ.
Интересные результаты были получены при изучении субстратных свойств С-метилуридинов. В этих соединениях сохраняются все функциональные группы природного уридина. При введении метильной группы в молекулу нуклеозидов изменяются конформационные свойства и реакционные способности соседних гидроксильных групп. Наличие объемных метильных групп может привести к возникновению межмолекулярных и внутримолекулярных стерических затруднений при фиксировании субстрата в определенной конформации в фермент-субстратном комплексе.
Рассмотрим два крайних случая применимости этого подхода. а) Аналог хорошо связывается и трансформируется ферментом, следовательно для конформаций субстрата в фермент-субстратных комплексах выполняются условия Eаналога ~ Eприродного соединения. б) Аналог не связывается с ферментом, тогда конформации субстрата следует искать в областях, где Eаналога >> Eприродного соединения при условии, что введение объемной метильной группы приводит к внутримолекулярным, а не межмолекулярным стерическим затруднениям. Применение этой концепции позволило уточнить конформацию субстрата в ходе его превращения некоторыми ферментами биосинтеза нуклеиновых кислот (С.Н.Михайлов, Ю.П.Лысов, Г.И. Яковлев. Молекулярная биология 33, 393-407, 1999).
5'-С-Метилуридины являются субстратами для УФ, причем эффективность фосфоролиза 5'-Сметилуридина с L-тало-конфигурацией совпадает с реакцией уридина. Второй диастереомер с D-аллоконфигурацией реагирует с фосфатом на порядок медленнее. 2-С-Метилуридин и 3-С-метилуридин не являются субстратами УФ и практически не связываются с ферментом. По опубликованным данным рентгеноструктурного анализа комплексов уридина с УФ в активном центре фермента нет аминокислотных остатков, которые могли бы контактировать с метильной группой. Согласно расчетным данным, в 3'-С-метилнуклеозидах для N-конформеров наблюдаются энергетически запрещенные конформации, в S-конформерах не происходит внутримолекулярных наталкиваний.
Введение в 2'-положение метильной группы приводит к значительному повышению энергетического барьера син-анти-перехода, связанного с наталкиванием протона в 6-положении или карбонильной группы во 2-ом (для пуриновых нуклеозидов, протона в 8-положении или азота 3-положении гетероцикла) на 2'-С-метильную группу.
Дополнительным доказательством необычной конформации субстрата, когда карбонильная группа находится вблизи 2'-протона, являются следующие факты. Эффективность фосфоролиза -Dарабинофуранозилурацила в 25 раз меньше по сравнению с 2'-дезоксиуридином. В то же время '-Оангидро--D-арабинофуранозилурацил, моделирующий сверх-син-конформацию субстрата, хорошо связывается с ферментом, несмотря на отсутствие протона в 3-положении гетероциклического основания, играющего важную роль в связывании субстрата.
Прямым доказательством необычной сверх-син-конформации субстрата являются рентгеноструктурные данные комплекса уридина и сульфата с УФ Shewanella oneidensis. (рисунок 4).
Этот фермент гомологичен УФ E.coli, а активный центр практически совпадает. Константы равновесия и кинетические характеристики этих ферментов в отношении уридина, тимидина и 5-метилуридина сходны. Необычная структура уридина характеризуется торсионным углом C2-N1-C1-C2 равным 9,4, длина гликозидной связи N1-C1 составляет 1,48 , а расстояние между атомом C1' уридина и OSO4 равняется 3,58 . Расстояние O2-C2 составляет 3,01 , что свидетельствует о значительных стерических затруднениях в данной конформации уридина.
Таблица 4. Кинетические параметры для ферментативного фосфоролиза УФ уридина и его производных, измеренные спектрофотометрически (50 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,5, температура 25С. Значения Кp измерены в 50 мМ Трис-буфере, рН 7,5, температура 37С, соотношение нуклеозид: фосфат 1:20).
Кm*(Кi), kcat** kcat/Km, субстрат Кр(1/Кр) мкМ с-1 мкМ-1/с-уридин 0,05 (18,6) 80 98 1,22 переносимые модификации субстрата 4-тиоуридин 0,06 (16) 120 49 0,S 5-метилуридин 0,06 (16) 65 4,8 0,0O 2'-дезоксиуридин 0,07 (14,3) 133 14 0,Me NH H, CH5'-гомо-уридин 0,09 (11,2) 174 97 0,N O HO O 5-дезоксиуридин 0,06 (16) 180 11 0,5'-дезокситимидин >0,01 ** - - HO OH тимидин 0,17 (5,9) 270 5 0,H 5'-С-метил(L0,09 (11,2) 280 360 1,тало)уридин 5'-С-метил(D0,23 (4,1) 400 45 0,алло)уридин модификации, приводящие к -D-арабино0,12 (8,3) 500 2 0,0фуранозилурацил потере субстратных свойств O 2-С-метилуридин - - NH 3-С-метилуридин - - Br,I S N O 2-тиоуридин - - HO O Me Me 6-метилуридин 1030 24 0,0HO OH '-О-ангидро--D (10) - арабинофуранозилурацил 3-дезокситимидин - - * л- Практически не ингибирует при концентрации 1мМ.
** л- Скорость реакции составляет менее 0,1% от скорости природного субстрата.
Ошибка измерений Km и kcat не превышала 20%. Ошибка измерений Кр не превышала 10%.
Рисунок 4. Связывание уридина и сульфата в активном центре УФ Shewanella oneidensis. Остатки Hisи Arg45 принадлежат соседней субъединице (данные получены ведущим научным сотрудником ИМБ РАН к.ф.-м.н. К.М.Поляковым) (разрешение 1,75 ).
4. Субстратная специфичность ПНФ.
ПНФ является наименее специфичным ферментом и катализирует фосфоролиз пуриновых нуклеозидов как рибо- так и 2'-дезоксирибо-ряда (таблица 5). В то же время пиримидиновые нуклеозиды не являются ее субстратами. ПНФ катализирует фосфоролиз 2-замещенных и N1метилпроизводных. Все изученные константы равновесия лежат в диапазоне 0,005-0,02 и мало зависят от структуры субстрата за исключением N1-метилпроизводных аденозина. В данном случае реакция фосфоролиза, по сравнению с пиримидиннуклеозидфосфорилазами, существенно сильнее сдвинута в сторону образования нуклеозида.
Таблица 5. Кинетические параметры для ферментативного фосфоролиза ПНФ производных нуклеозидов пуринового ряда, измеренные спектрофотометрически (50 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,5 при температуре 25С. Значения Кр измерены в 50 мМ Трис-буфере, рН 7,5 при температуре 37С, соотношение нуклеозид: фосфат 1:20).
Кm* (Ki), kcat** kcat/Km, Субстрат Kp (1/Kp) мкM с-1 мкМ-1/с-переносимые модификации инозин 0,0274 (36,5) 40 325 8,субстрата аденозин 0,013 (77) 50 343 6,CH2Ph гуанозин 45,6 260 5,0,013 (77) MeS,O= Me 2'-дезоксиаденозин 0,016 (62,5) 13,2 202 15,NH2 Me Me H,CHN 2'-дезоксигуанозин 0,007 (143) 71,4 627 8,78 N N HO N 2'-дезоксиинозин 0,02 (50) 67 667 9,95 O Me F,Cl 3'-дезоксиаденозин (850) - HO OH 2'-С-метиладенозин - - H 3'-С-метиладенозин нд 250 8,4 0,03'-С-этиладенозин - - 2-хлораденозин 0,0082 (121) 24,4 43,6 1,модификации, приводящие 2-хлор-2'0,0057 (176) 29,4 31,2 1,к потере субстратных дезоксиаденозин свойств 5'-С-метил(L-тало)0,0053 (189) 21,7 34,6 1,аденозин NH5'-С-метил(D-алло)- Br 0,0045 (222) 13,2 4,7 0,N аденозин N 5'-гомо-аденозин 0,0124 (81) 71,4 190 2,N HO N O 5,6- дидезокси-5,6Me нд 77 0,5 0,00дидегидро--DHO OH аллофуранозиладенин 2-фтораденозин 42 230 5,0,013 (77,5) 1-метиладенозин 0,053 (19) 28,6 23 0,1-метил-2'-дезокси 0,05 (20) 62,5 42,7 0,аденозин 8,3 55,4 6,7-метил-6-тиогуанозин 8-бромаденозин (760) - 8,2'-О-ангидро--D (9) - арабинофуранозилгуанин * л- Практически не ингибирует при концентрации 1мМ.
** л- Скорость реакции составляет менее 0,1% от скорости природного субстрата. нд - нет данных.
Ошибка измерений Km и kcat не превышала 20%. Ошибка измерений Кр не превышала 10%.
Как и в случае УФ, для образования фермент-субстратного комплекса необходимо образование водородных связей с гидроксильными группами в 3- и 5-положении. 2-С-Метиладенозин не является субстратом ПНФ и практически не связывается с ферментом. Введение объемной метильной группы в 3-положение аденозина приводит к существенному замедлению реакции, а фосфоролиз 3-Сэтиладенозина уже не идет. Согласно расчетным данным, в 3'-С-метилнуклеозидах для N-конформеров наблюдаются энергетически запрещенные конформации, в S-конформерах не происходит внутримолекулярных наталкиваний. Наличие объемных заместителей в 8-ом положении гетероцикла также приводит к потере субстратных свойств. В то же время '-О-ангидро--Dарабинофуранозилгуанин, моделирующий сверх-анти-конформацию субстрата, хорошо связывается с ферментом.
Суммируя полученные данные, можно предположить, что в продуктивном фермент-субстратном комплексе реализуется сверх-анти-конформация нуклеозида, в которой 8-ой протон пуринового основания находится в непосредственной близости к 2'- и 3'-протонами углеводного остатка, которой находится в N-конформации. Полученные и литературные данные указывают на сходство архитектуры активных центров УФ и ПНФ при связывании субстрата в напряженной конформации, в которой происходит внутримолекулярное наталкивание гетероциклического основания на протоны углеводного остатка.
В последние годы развиваются новые методы синтеза производных нуклеиновых оснований, в которых в качестве исходных соединений используются природные нуклеозиды. Следует отметить, что стоимость этих соединений, как правило, существенно ниже стоимости нуклеиновых оснований.
Кроме того, выделение и очистка производных нуклеозидов с помощью адсорбционной хроматографии на силикагеле менее трудоемка. Использование этой методологии позволяет существенно расширить и дополнить, а в ряде случаев и значительно упростить схемы получения гетероциклов с гидрофобными группами. Для гидролиза N-гликозидной связи обычно используются сильные кислоты, однако в случае получения кислотолабильных соединений целесообразнее использовать нуклеозидфосфорилазы. Разработка этого подхода позволит расширить практическое применение нуклеозидфосфорилаз.
Недавно в ИМБ РАН разработан удобный метод получения N6-замещенных аденозинов алкилированием N6-ацетил-2',3',5'-три-O-ацетиладенозина с последующим удалением ацетильных защитных групп. Был изучен фосфоролиз N6-замещенных аденозинов (таблица 6), кинетические параметры получены с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. В этом случае экстинкции N6-замещенных производных аденозина и соответствующих производных аденина практически совпадают и невозможно использовать спектрофотометрический метод. Как видно из таблицы 8, N6-производные аденозина являются хорошими субстратами для ПНФ, продукты их фосфоролиза - бензиламинопурин, кинетин и изопентениладенин являются природными цитокининами. Как уже отмечалось выше, равновесие реакции фосфоролиза ПНФ сдвинуто в сторону образования нуклеозида (a). Для сдвига равновесия в сторону искомых аденинов к раствору нуклеозида и ПНФ при рН 7,5 и 30C добавляли щелочную фосфатазу E.coli (b), которая гидролизует рибозо-1-фосфат до D-рибозы (схема 2). При охлаждении до 0С N6-замещенные аденины кристаллизовались непосредственно из реакционной смеси с хорошими выходами (50-68%). Таким образом показано, что ПНФ и щелочная фосфатаза могут быть использованы для гидролиза Nгликозидной связи в мягких условиях.
Таблица 6. Кинетические параметры для ферментативного фосфоролиза ПНФ N6-производных аденозина, измеренные помощью ВЭЖХ (50 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,5 при температуре 25С. Значения Кp измерены в 50 мМ Трис-буфере, рН 7,5 при, температуре 37С, соотношение нуклеозид: фосфат 1:20).
Нуклеозид Kр (1/Kр) Km(Ki), M kcat,с-1 kcat/Km, с-1/ M аденозин 0,013 (77) 45 301 6,N6-фурфуриладенозин 0,0088 (114) 28 165 5,N6-бензиладенозин 0,011 (88) 47 283 6,N6-изопрениладенозин 0,0082 (122) 15 135 Ошибка измерений Кm и kcat не превышала 20%. Ошибка измерений Кр не превышала 10%.
R R NH NH HO N O N O N a N O P OH + HO N N O HN N O OH HO OH + HO P OH b HO OH OH R NH HO O O N OH N HO P OH + + HN OH N HO OH Схема 2. Получение N6-производных аденина. a. ПНФ; b. щелочная фосфатаза.
ВЫВОДЫ 1. Для спектрофотометрического определения активности уридинфосфорилазы и тимидинфосфорилазы и измерения констант ингибирования предложены новые субстраты: 4тиоуридин и 4-тиотимидин. Разработан удобный метод определения констант равновесия реакции фосфоролиза нуклеозидов, катализируемой нуклеозидфосфорилазами E.coli.
2. Изучена субстратная специфичность тимидинфосфорилазы E.coli. Показано, что связывание субстрата с ферментом за счет водородных связей с атомами основания и 3-ОН, но не 5-ОН играет ключевую роль в формировании фермент-субстратного комплекса в закрытой конформации фермента и осуществлении реакции.
3. Для субстратной специфичности уридинфосфорилазы E.coli показана важная роль 3'- и 5'гидроксильных групп уридина и определена необычная конформация субстрата в активном центре фермента, в которой карбонильная группа во 2-ом положении находится вблизи 2'-протона углеводного остатка.
4. Выявлены функциональные группы субстрата, ответственные за связывание с пуриннуклеозидфосфорилазой E.coli. Определено сходство архитектуры активных центров УФ и ПНФ при связывании субстрата в напряженной конформации, в которой происходит наталкивание гетероциклического основания на протоны углеводного остатка.
5. Разработан удобный метод получения N6-замещенных аденинов исходя из соответствующих производных аденозина с использованием пуриннуклеозидфосфорилазы E.coli и щелочной фосфатазы E.coli.
Основное содержание работы
отражено в следующих публикациях:
Статьи 1. Н.Г. Панова, Е.В. Щевелева, К.С. Алексеев, В.Г. Мухортов, А.Н. Зуев, С.Н. Михайлов, Р.С. Есипов, Д.В. Чувиковский, А.И Мирошников. Использование 4-тиоуридина и 4-тиотимидина для изучения пиримидиннуклеозидфосфорилаз. // Молекулярная биология, 2004, т. 38, №5, 907-913.
2. Н.Г. Панова, К.С. Алексеев, А.С. Кузьмичев, Е.В. Щевелева, С.А. Гаврюшов, К.М. Поляков, А.М.
Крицын, С.Н. Михайлов, Р.С. Есипов, А.И. Мирошников. Субстратная специфичность тимидинфосфорилазы Escherichia coli. // Биохимия, 2007, т. 72, №1, 27-35.
3. N.G. Panova, C.S. Alexeev, K.M. Polyakov, S.A. Gavryushov, A.M. Kritzyn, S.N. Mikhailov. Substrate Specificity of Thymidine Phosphorylase of E. Coli: Role of Hydroxyl Groups. // Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2008, v. 27, №12, 1211-1214.
4. V. I. Tararov, S. V. Kolyachkina, C. S. Alexeev, S. N. Mikhailov. N6-Acetyl-2',3',5'-tri-O-acetyladenosine - a convenient, missed out substrate for regioselective N6-alkylations. // Synthesis, 2011, №15, 2483-2489.
Тезисы и предварительные сообщения 5. Н.Г. Панова, Е.В. Щевелева, К.С. Алексеев, С.Н. Михайлов, Р.С. Есипов, Д.В. Чувиковский, А.И.
Мирошников Изучение субстратной специфичности уридинфосфорилазы и пиримидинфосфорилазы E.coli. XII международная конференция Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (31 мая - 9 июня 2004, Гурзуф-Ялта, Украина). Секция Достижения современной биоорганической химии и перспективы их применения. Материалы конференции, с.6971.
6. N. G. Panova, C.S. Alexeev, A.S.Kuzmichev, S. N. Mikhailov. Effect of sugar modification of uridine and thymidine on the binding of nucleoside analogues to uridine phosphorylase and thymidine phosphorylase E.
coli. International conference Biocatalysis-2005: fundamentals & applications. St.Petersburg, RF, June 19-23, 2005. Abstract p.33.
7. C.S. Alexeev, N.G. Panova, K.M. Polyakov, S.N. Mikhailov. Substrate specificity of E. coli uridine phosphorylase. XIX International Round Table УNucleosides, Nucleotides and Nucleic AcidsФ Lyon, France, 29 August - 3 September 2010. Conference book, Abstract PA011, pages 94-95.
8. S.V.Kolyachkina, V.I.Tararov, C.S.Alexeev, S.N.Mikhailov. Synthesis of N6-substituted adenosines.
Сollection Symposium series, 12, 405-407 (2011). XV международный симпозиум по химии компонентов нуклеиновых кислот (XV Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components), (Hotel Ruze, Cesky Krumlov, Czech Republic, June 5-10, 2011).
9. Т.Н.Сафонова, К.М.Поляков, К.С.Алексеев, К.М.Бойко, В.О.Попов. Кристаллизация и предварительное рентгеноструктурное исследование уридинфосфорилазы из SHEWANELLA ONEIDENSIS. // Современные проблемы науки и образования, 2011, №6, с.13.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, программы Президиума РАН Молекулярная и клеточная биология и Министерства образования и науки РФ (государственный контракт № 16.512.11.2239).