Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по химии
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова На правах рукописи
Рязанова Александра Юрьевна
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА С5-ЦИТОЗИНОВОЙ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ SsoII И ЕЕ КОМПЛЕКСОВ С ДНК-ЛИГАНДАМИ
02.00.10 - биоорганическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
МОСКВА - 2012
Работа выполнена на факультете Биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в отделе химии нуклеиновых кислот Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Научный консультант: доктор химических наук, профессор Кубарева Елена Александровна
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН Цетлин Виктор Ионович доктор биологических наук Лунин Владимир Глебович
Ведущая организация:
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск
Защита состоится 29 мая 2012 года в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан 27 апреля 2012 г.
Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Смирнова И.Г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Реакция метилирования ДНК является одной из основных в биохимии клетки. У млекопитающих метилирование ДНК играет существенную роль в регуляции экспрессии генов, импринтинге, упаковке хроматина, эмбриональном развитии, возникновении онкологических заболеваний. У прокариот метилирование ДНК обеспечивает защиту клетки от чужеродной ДНК, а также тесно связано с регуляцией экспрессии генов и с процессами репликации и репарации ДНК.
Метилирование ДНК катализируется важнейшим классом ферментов нуклеинового обмена - ДНК-метилтрансферазами (МТазами).
С5-Цитозиновые ДНК-МТазы обнаружены как у прокариот, так и у эукариот.
Аминокислотные последовательности каталитических доменов бактериальных и эукариотических С5-цитозиновых ДНК-МТаз характеризуются общей структурной организацией. Не так давно было установлено, что многие МТазы в клетке осуществляют не только метилирование ДНК, но и обладают другими функциями (например, регуляторной). Так, в базе данных Pfam ( содержатся 5065 аминокислотных последовательностей, в которых идентифицируется домен С5-цитозиновая ДНК-МТаза (PF00145). Из них лишь 61% содержит только один МТазный домен. В остальных 39% наблюдаются удвоения этого домена и/или какие-либо дополнительные домены. Молекулярные основы взаимодействия такого рода белков с ДНК, особенно с операторными (регуляторными) последовательностями, мало изучены.
Данная работа направлена на исследование механизмов узнавания ДНК бифункциональными МТазами на примере прокариотической С5-цитозиновой ДНКМТазы SsoII (M.SsoII), входящей в систему рестрикцииЦмодификации (РЦМ) II-го типа SsoII. M.SsoII узнает в двутяжевой ДНК последовательность 5'-СCNGG-3' (где N = A, C, G или T) и в присутствии кофактора S-аденозил-L-метионина (AdoMet) метилирует внутренний остаток цитозина с образованием остатка 5-метилцитозина.
Интересной особенностью М.SsoII является ее протяженный N-концевой участок (1Ц71 аминокислотные остатки (а. о.)), наличие в котором мотива спиральЦповорот - спираль (СПС) обусловливает способность МТазы выступать в роли фактора транскрипции и регулировать экспрессию собственного гена, а также гена, кодирующего эндонуклеазу рестрикции SsoII (R.SsoII). Регуляция осуществляется благодаря специфическому взаимодействию М.SsoII с промоторной областью генов системы РЦМ SsoII (Karyagina et al., 1997; Shilov et al., 1998). Основное число контактов М.SsoII с промоторной областью обеспечивает локализованный внутри последней 15-звенный инвертированный повтор (в дальнейшем называемый регуляторным участком).
Таким образом, М.SsoII представляет собой бифункциональный белок: с одной стороны это фактор транскрипции, а с другой - фермент, катализирующий реакцию метилирования ДНК. Какова взаимосвязь между активностями, которые обеспечиваются разными доменами в составе одной полипептидной цепи, - вопрос, для МТаз практически не исследованный. Это определяет актуальность всестороннего изучения структурно-функциональной организации комплексов M.SsoII с участком метилирования и с регуляторным участком.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлась структурнофункциональная характеристика С5-цитозиновой ДНК-метилтрансферазы SsoII и ее комплексов с ДНК-дуплексами, содержащими участок метилирования и регуляторный участок.
В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.
1. Охарактеризовать третичную и четвертичную структуру апо-формы M.SsoII и ее делеционных мутантов.
2. Изучить комплексообразование M.SsoII с ДНК-дуплексами, содержащими участок метилирования или регуляторный участок:
Х стехиометрию комплексов;
Х эффективность связывания M.SsoII с ДНК-дуплексами;
Х скорости комплексообразования M.SsoII с ДНК-дуплексами.
3. Проанализировать структурную организацию комплекса M.SsoII с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок.
4. Детализировать модель функционирования М.SsoII в клетке как фермента модификации и как фактора транскрипции.
Научная новизна и практическая значимость работы. Показано, что M.SsoII в апо-форме является мономером. Продемонстрировано, что при взаимодействии M.SsoII с ДНК-дуплексами различной длины (от 15 до 60 пар нуклеотидов (п. н.)), содержащими участок метилирования, образуются специфические ДНК-белковые комплексы со стехиометрией 1:1. Получены структуры низкого разрешения M.SsoII в апо-форме и в комплексе с 15-звенным ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования. Радиус инерции комплекса уменьшается, что свидетельствует о его более компактной структуре по сравнению с апо-формой белка.
Показано, что делеционный мутант, представляющий собой N-концевую область SsoII-подобных ДНК-МТаз, сохраняет вторичную структуру: он содержит 32% -спиралей и 20% -тяжей. Впервые подобраны условия, в которых данный делеционный мутант способен формировать специфические комплексы с 60-звенным ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что в полноразмерной M.SsoII N-концевая область существует в виде структурно обособленного домена. С помощью внутримолекулярной сшивки под действием бис-малеимидоэтана продемонстрировано, что линкер, соединяющий Nконцевую область M.SsoII с областью M.SsoII, ответственной за метилирование, является подвижным.
Показано, что при взаимодействии M.SsoII с 60-звенным ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок, образуются два специфических комплекса. Один из них имеет стехиометрию 1:1, в то время как второй состоит из двух субъединиц M.SsoII и одного ДНК-дуплекса. Впервые показано, что в комплексе M.SsoII с регуляторной ДНК остаток Cys142 в каталитическом центре фермента сближен с ДНК. Предложена структура комплекса M.SsoII с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок: N-концевые области белка специфически взаимодействуют с регуляторным участком, а области M.SsoII, ответственные за метилирование, неспецифическим образом связаны с ДНК, фланкирующей регуляторный участок.
По-видимому, связывание области, ответственной за метилирование, с ДНК в непосредственной близости от регуляторного участка придает дополнительную стабильность этому комплексу.
Впервые показано, что метилтрансферазная и регуляторная активности M.SsoII являются взаимоисключающими: комплексообразование этого белка с регуляторным участком предотвращает его связывание с участком метилирования. Изучение кинетики взаимодействия M.SsoII с ДНК-лигандами свидетельствует о том, что связывание этого белка с участком метилирования происходит значительно быстрее, чем с регуляторным участком. Проведена теоретическая оценка числа участков метилирования и числа регуляторных участков в ДНК клетки. Эффективное метилирование клеточной ДНК обеспечивается M.SsoII за счет большей скорости связывания с участком метилирования и за счет значительного избытка участков метилирования относительно регуляторных участков.
Полученные в настоящей работе данные о свойствах M.SsoII расширяют знания о бактериальных системах РЦМ, позволяют понять особенности поведения МТаз как транскрипционных факторов и могут быть использованы для конструирования новых регуляторных белков. Так как ответственные за метилирование домены С5-цитозиновых ДНК-МТаз из разных источников имеют сходную первичную структуру и для них постулирован единый механизм метилирования ДНК, результаты исследования могут быть использованы для объяснения механизмов взаимодействия эукариотических МТаз с ДНК.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано статьи в российском и международных периодических изданиях. Результаты были представлены на IV-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, май 2008 г.), на конференциях Ломоносов-2009 (Москва, Россия, апрель 2009 г.), Ломоносов-2010 (Москва, Россия, апрель 2010 г.), IV Slovak Biophysical Symposium (Модра-Гармония, Словакия, апрель 2010 г.), Workshop УEnzymes and enzyme complexes acting on nucleic acidsФ of the International Research Training Group Gieen/MarburgЦMoscow (DFG/RFBR-funded) (Вильнюс, Литва, май 2010 г.), л6th New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification (Бремен, Германия, август 2010 г.) и Химия в молекулярной биологии (Москва, Россия, декабрь 2011 г.).
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 1страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен структурно-функциональной характеристике доменов, входящих в состав С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз), обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 76 рисунками и 18 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 3цитированных работы.
Работа выполнена при поддержке РФФИ и программы РФФИ-ННИО Международные исследовательские группы с участием молодых ученых.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
* 1. Характеристика объектов исследования На данный момент известны шесть SsoII-подобных систем РЦМ, обнаруженных в различных бактериальных штаммах. Помимо самой SsoII из Shigella sonnei 47, это Ecl18kI из Enterobacter cloacae 18k, Kpn2kI из Klebsiella pneumoniae 2k, StyD4I из Salmonella typhi D4, SenPI из Salmonella enteritidis P1, а также система РЦМ, пока не получившая названия, кодируемая плазмидой pCE10C из штамма E. coli O7:K1 CE(GenBank: CP003037.1). Во всех SsoII-подобных системах РЦМ гены эндонуклеазы рестрикции (ЭР) и МТазы расположены дивергентно, их нуклеотидные последовательности идентичны на 99%, а соответствующие белки различаются однимЦдвумя аминокислотными остатками. Можно предположить одинаковый механизм функционирования этих систем РЦМ.
Объектами изучения в данной работе являлись 4 белка - M.SsoII, M.Ecl18kI, делеционный мутант (72Ц379)M.Ecl18kI, который представляет собой N-концевую область M.Ecl18kI, ответственную за регуляцию транскрипции, и M.NlaX, которая является гомологом области M.SsoII, ответственной за метилирование. Плазмиды, несущие гены этих белков, были любезно предоставлены д.б.н. А. С. КарягинойЖулиной (ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития РФ, г. Москва) и к.б.н. А. С. Солониным (НИИ физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина РАН, г. Пущино). Все белки, использованные в данной работе, несут дополнительную N-концевую последовательность, содержащую блок из шести остатков гистидина, что позволяет выделять их методом аффинной хроматографии. Ранее было показано, что наличие такой дополнительной аминокислотной последовательностей на N-конце белковой молекулы не влияет на * Отдельные части работы были выполнены под руководством д-ра Г. С. Качаловой в лаборатории проф. Х.-Д. Бартуника в Институте имени М. Планка (г. Гамбург, Германия); совместно с д-ром П. В. Конаревым под руководством проф. Д. И. Свергуна и д-ра Г. С. Качаловой в Европейской молекулярно-биологической лаборатории (EMBL; г. Гамбург, Германия); под руководством проф.
П. Фридхоффа в Институте биохимии Университета имени Ю. Либиха (г. Гиссен, Германия); под руководством проф. Т. Гианика в отделении ядерной физики и биофизики факультета математики, физики и вычислительной техники Университета имени Коменского (г. Братислава, Словакия).
ферментативную активность M.SsoII и M.NlaX (Карягина, 1997). Молекулярные массы рекомбинантных белков составляют 44,9 кДа (M.SsoII), 44,2 кДа (M.Ecl18kI), 9,4 кДа ((72Ц379)M.Ecl18kI) и 36 кДа (M.NlaX).
Для изучения особенностей взаимодействия этих белков с ДНК использовали дуплексы, различные по длине и нуклеотидной последовательности, которые представлены в табл. 1.
Таблица ДНК-дуплексы, использованные в работе Название Нуклеотидная последовательность* 5Т-AGAGCCAGGAACCGA-3Т 15met 3Т-TCTCGGTCCTTGGCT-5Т 5Т-GTATGAAGCTAGAGCCAGGTTGGCAGCATTC-3Т 31met 3Т-CATACTTCGATCTCGGTCCAACCGTCGTAAG-5Т 5Т-GACTTACAGTTGATAGTATGAAGCTAGAGCCAGGTTGGCAGCATTCTACTCATGTACTTG-3Т 60met 3Т-CTGAATGTCAACTATCATACTTCGATCTCGGTCCAACCGTCGTAAGATGAGTACATGAAC-5Т 5Т-ATCAAAACAGGACAAATTGTCCTAAAACCAA-3Т 31reg 3Т-TAGTTTTGTCCTGTTTAACAGGATTTTGGTT-5Т 5-ACGTTCATAATTGGAATCAAAACAGGACAAATTGTCCTAAAACCAACACTTAATTCTGGT-3 60reg 3-TGCAAGTATTAACCTTAGTTTTGTCCTGTTTAACAGGATTTTGGTTGTGAATTAAGACCA-5 5Т-AGTACTAATTAGCAT-3Т 15ns 3Т-TCATGATTAATCGTA-5Т 5Т-GATCAGTACTAATTAGCATTATAAAGGATCA-3Т 31ns 3Т-CTAGTCATGATTAATCGTAATATTTCCTAGT-5Т 5Т-GACTTACAGTTGATAGATCAGTACTAATTAGCATTATAAAGGATCATACTCATGTACTTG-3Т 60ns 3Т-CTGAATGTCAACTATCTAGTCATGATTAATCGTAATATTTCCTAGTATGAGTACATGAAC-5Т * Синим цветом выделен участок метилирования, красным цветом - регуляторный участок.
2. Выделение рекомбинантных ДНК-метилтрансфераз Культуры клеток выращивали в присутствии канамицина и ампициллина.
Экспрессию целевого белка индуцировали с помощью добавления изопропил-1-тио-D-галактопиранозида. M.NlaX и (72Ц379)M.Ecl18kI демонстрировали высокий уровень экспрессии. Напротив, уровень экспрессии M.SsoII и M.Ecl18kI был чрезвычайно низок, так как эти ферменты токсичны для клетки в высоких концентрациях (Карягина, 1997).
В данной работе была существенно усовершенствована методика выделения M.NlaX и M.SsoII, разработанная ранее (Karyagina et al., 1995). Предложены два варианта выделения этих белков. Для изучения структуры M.NlaX и M.SsoII методами гель-фильтрации и малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) использовали препараты, выделенные по Методике 1. Она включала лизис клеток в присутствии ДНКазы I и ингибиторов протеаз Complete, EDTA free (Roche, Швейцария), центрифугирование лизата и хроматографию надосадочной жидкости на гепарин-сефарозе (как для M.NlaX, так и для M.SsoII), а затем - на Ni-сефарозе (для M.SsoII).
Во всех остальных экспериментах использовали препараты M.SsoII, M.Ecl18kI и (72Ц379)M.Ecl18kI), выделенные по Методике 2. Она включала лизис клеток в буфере, содержащем 1 М NaCl, в присутствии фенилметилсульфонилфторида - ингибитора сериновых протеаз, центрифугирование лизата и хроматографию надосадочной жидкости на Ni2+-NTA-агарозе (как для M.SsoII и M.Ecl18kI, так и для (72Ц379)M.Ecl18kI), а затем - на гепарин-сефарозе (для M.SsoII и M.Ecl18kI).
Последней стадией был диализ. Высокая ионная сила в буфере для лизиса клеток приводила к разрушению любых комплексов изучаемых белков с нуклеиновыми кислотами клетки, что позволяло без использования ДНКазы I получать препараты белка, не содержащие примеси ДНК. Препараты белка не содержали и других веществ нуклеотидной природы - кофактора реакции метилирования AdoMet и его нереакционноспособного аналога S-аденозил-L-гомоцистеина (AdoHcy), которые обычно выделяются в комплексе с ДНК-МТазами (Piekarowicz and Brzezinski, 1980;
Kumar et al., 1992; Szczelkun and Connolly, 1995; Sсhluckebier et al., 1997).
Выходы M.SsoII составили 0,14 мг и 0,56 мг на 1 л культуры клеток при выделении по Методике 1 и Методике 2, соответственно. Таким образом, Методика позволяет получить в 4 раза больший выход M.SsoII, чем Методика 1.
3. Олигомерное состояние и структура низкого разрешения ДНК-метилтрансфераз SsoII и NlaX в апо-форме Большинство ДНК-МТаз являются мономерами в растворе, хотя существуют и исключения. Факторы транскрипции часто функционируют в форме димеров.
Поскольку M.SsoII является и ДНК-МТазой, и фактором транскрипции, требовалось экспериментально определить олигомерное состояние этого белка. В качестве контроля использовали M.NlaX - гомолог M.SsoII, на 67% идентичный ее области, ответственной за метилирование, и не способный регулировать транскрипцию.
Методом гель-фильтрации на сорбенте Superdex 75 молекулярная масса M.NlaX была оценена как 36 кДа, а M.SsoII - как 41 кДа. Это свидетельствует о том, что оба белка существуют в растворе в мономерной форме. Тот же вывод следует из данных, полученных методом SAXS (табл. 2).
Таблица Параметры, определенные методом SAXS Образец Rg, нм Dmax, нм Мr, кДа M.NlaX 2,36 0,04 7,0 0,5 33 M.SsoII 3,01 0,04 11,0 0,5 38 M.SsoIIЦAdoHcyЦ15met 2,79 0,04 11,0 0,5 - Rg - радиус инерции, Dmax - максимальный диаметр, Мr - молекулярная масса.
Метод SAXS позволяет получить структуры низкого разрешения для белков в растворе. Такие структуры для М.SsoII и М.NlaX были получены моделированием ab initio - то есть только на основе экспериментальных данных по рассеянию рентгеновских лучей. Молекула M.NlaX представляет собой компактную глобулу, которая по своей форме и размерам близка к структуре гомологичной ДНК-МТазы HhaI (M.HhaI), полученной методом РСА (рис. 1а). Молекула M.SsoII, напротив, имеет продолговатую форму (рис. 1б). При этом домен 1 молекулы M.SsoII по своей форме и размерам близок к структуре M.HhaI, что позволяет считать его областью белка, ответственной за метилирование. Можно предположить, что полость в домене 1 является ДНК-связывающим центром, а домен 2 представляет собой N-концевую область M.SsoII.
Рис. 1. (а) Совмещение модели M.NlaX (серые шарики), построенной ab initio с помощью программы DAMMIN, с кристаллографической моделью мономера М.HhaI (синие линии).
(б) Модель M.SsoII, построенная ab initio в программе DAMMIN.
а б 4. Характеристика N-концевой области SsoII-подобных ДНК-метилтрансфераз Для проверки гипотезы о том, что N-концевая область SsoII-подобных ДНКМТаз является структурно обособленным доменом, использовали делеционный мутант (72Ц379)M.Ecl18kI. Методом спектроскопии кругового дихроизма продемонстрировали, что он содержит 32% -спиралей и 20% -тяжей.
(72Ц379)M.Ecl18kI способен формировать специфические ДНК-белковые комплексы при взаимодействии с 60-звенным ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок (рис. 2а). В контрольном эксперименте с 60-звенным ДНКдуплексом, не содержащим участков узнавания, комплексы не образовывались (рис. 2б). Таким образом, делеционный мутант (72Ц379)M.Ecl18kI сохраняет ядро своей структуры, необходимое для узнавания специфической последовательности в ДНК. Эти данные свидетельствуют в пользу возможности существования N-концевой области M.SsoII в виде структурно обособленного домена в полноразмерной M.SsoII.
K 1 2 3 4 5 6 K 1 2 3 4 5 6 Неспецифические ДНК-белковые комплексы Специфический ДНК-белковый комплекс ДНК-дуплекс а б Рис. 2. Анализ равновесного связывания 16,6 мкМ (72Ц379)M.Ecl18kI с 0,12 мкМ 5-32Р-меченными ДНК-дуплексами (а) 60reg и (б) 60ns в присутствии гепарина методом торможения в 12%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в неденатурирующих условиях.
Дорожка К содержит свободный ДНК-дуплекс. Дорожки 1Ц7 содержат 0, 3,1, 9,4, 31,3, 62,5, 125 и 313 мкМ гепарина, соответственно.
5. Конформационная подвижность линкера, соединяющего домен ДНК-метилтрансферазы SsoII, ответственный за регуляцию транскрипции, с доменом, ответственным за метилирование Анализ аминокислотной последовательности, а также данные SAXS позволяют предположить, что в полноразмерной M.SsoII остатки 56Ц71 формируют линкер, обеспечивающий определенную подвижность N-концевого домена M.SsoII, необходимого для регуляции транскрипции, относительно области белка, ответственной за метилирование. Для проверки этого предположения использовали метод поперечной сшивки полипептидной цепи за счет формирования двух ковалентных связей. В качестве реагентов выступали бис-малеимидоэтан (BMOE) и 1,11-бис-малеимидотетраэтиленгликоль (BM[PEO]4) - соединения, имеющие две малеимидные группы, разделенные линкером разной длины, которые способны взаимодействовать с тиольными группами остатков цистеина белка (табл. 3).
Рекомбинантная M.SsoII содержит 2 остатка цистеина: Cys142 в каталитическом центре фермента и Cys(Ц1) в N-концевом дополнительном пептиде, содержащем блок из шести остатков гистидина. Инкубация M.SsoII с BMOE или BM[PEO]4 может приводить к одному продукту внутримолекулярной сшивки, Cys(Ц1)ЦCys142, и к трем продуктам межмолекулярной сшивки: Cys(Ц1)ЦCys(Ц1), Cys(Ц1)ЦCys142 и Cys142ЦCys142. Для того чтобы различить эти продукты, аналогичные реакции параллельно проводили с M.Ecl18kI, аминокислотная последовательность которой идентична M.SsoII на 99%, но содержит только один остаток цистеина - Cys142 в каталитическом центре. Очевидно, что в случае M.Ecl18kI имелась возможность образования только одного продукта межмолекулярной сшивки, Cys142ЦCys142, а формирование продукта внутримолекулярной сшивки было невозможным.
В результате реакции M.SsoII с BMOE или с BM[PEO]4 получен продукт внутримолекулярной сшивки CysЦCys (рис. 3а, дорожка 1). Его выход близок к 50% для обоих реагентов, что свидетельствует об отсутствии стерических ограничений для сближения боковых цепей остатков Cys(Ц1) и Cys142 на расстояние менее чем 10,5 . В случае M.Ecl18kI, содержащей только Cys142, данный продукт не образовывался (рис. 3а, дорожка 3). Высокий выход внутримолекулярной сшивки CysЦCys свидетельствует о подвижности линкера, соединяющего N-концевой домен M.SsoII и область белка, ответственную за метилирование (рис. 3б).
Таблица Реагенты, использованные для ковалентной сшивки остатков цистеина ДНК-метилтрансферазы SsoII Расстояние между Модифиципрореагировавшими Сшивающий агент Формула руемая группами в продукте группа сшивки O O Бис-малеимидоэтан N N До 10,5 ЦSH (BMOE) O O O O 1,11-Бис-малеимидоN тетраэтиленгликоль N O До 17,8 ЦSH O O O (BM[PEO]4) O O O 4-(N-малеимидо)- ЦSH и До 11,4 N бензофенон (BPM) неселективно O а б Рис. 3. (а) Продукты сшивки M.SsoII и M.Ecl18kI с помощью BMOE. Анализ методом гель-электрофореза по Лэммли. (б) Предполагаемое взаимное расположение остатков цистеина в молекуле M.SsoII при образовании продукта внутримолекулярной сшивки Cys(Ц1)ЦCys142 с помощью BMOE. Голубым цветом выделен N-концевой домен M.SsoII (а. о. 1Ц59), желтым - линкер (а. о. 60Ц71), зеленым - область M.SsoII, ответственная за метилирование (а. о. 72Ц379). Остатки цистеина выделены синим, AdoHcy - коричневым, BMOE - красным. Из дополнительного N-концевого пептида, содержащего гексагистидиновый блок, показан только Cys(Ц1).
6. Стехиометрия комплексов ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК-лигандами Методом SAXS был исследован комплекс M.SsoII с AdoHcy и 15-звенным ДНКдуплексом, содержащим участок метилирования (15met). Максимальный диаметр комплекса совпадает с таковым для апо-формы M.SsoII, а значения радиуса инерции близки (табл. 2). Таким образом, M.SsoII в комплексе с 15met сохраняет мономерную структуру. Стоит отметить, что немного меньшее значение радиуса инерции в случае комплекса (2,79 0,04 нм) свидетельствует о более компактной структуре комплекса по сравнению с апо-формой белка (3,01 0,04 нм). Согласно данным для гомологичной ДНК-МТазы HhaI, компактизация происходит благодаря закрыванию каталитической петли при взаимодействии с субстратом и только в том случае, когда фермент связывается с ДНК, содержащей участок метилирования. Методом моделирования ab initio получена структура низкого разрешения M.SsoII в комплексе с 15met (рис. 4).
Рис. 4. Пространственная структура комплекса M.SsoII с AdoHcy и ДНК-дуплексом 15met, полученная моделированием ab initio в программе MONSA. Желтым цветом выделена ДНК, красным - белок.
Для оценки стехиометрии комплексов M.SsoII с более длинными ДНКлигандами (31- и 60-звенными) изучали их подвижность в гелях с различным содержанием полиакриламида. Молекулярную массу определяли по калибровочному графику, построенному на основе данных о подвижности в этих гелях белковмаркеров. При использовании 31-звенного ДНК-дуплекса, содержащего участок метилирования (31met), наблюдалось образование ДНК-белкового комплекса, имеющего стехиометрию 1:1, с выходом более 95% (рис. 5а).
Рис. 5. Анализ равновесного связывания 9 мкМ M.SsoII с ДНК-дуплексами (а) 31met (10 мкМ) и 31ns (10 мкМ); (б) 31reg (10 мкМ) и 60reg (3 мкМ) методом торможения в 9%-ном ПААГ в неденатурирующих условиях. Комплексообразование проводилось в присутствии AdoHcy. Гель окрашен кумасси.
а б Для сравнения изучали неспецифическое комплексообразование M.SsoII с 31-звенным ДНК-дуплексом 31ns, не содержащим участков узнавания этого белка.
Были детектированы четыре ДНК-белковых комплекса, формировавшиеся с примерно одинаковым выходом (рис. 5а).
M.SsoII связывается с 31-звенным ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок (31reg), образуя ДНК-белковый комплекс со стехиометрией 1:1 (выход более 95%) (рис. 5б). При увеличении длины ДНК-дуплекса до 60 п. н. наблюдаются два ДНК-белковых комплекса - К1 и К2 (рис. 5б). Как показывают эксперименты с добавлением в реакционную смесь гепарина (рис. 6), оба этих комплекса являются специфическими. Комплекс К1 содержит один ДНК-дуплекс и одну субъединицу M.SsoII. Молекулярная масса комплекса К2 позволяет предположить, что он состоит или из одного ДНК-дуплекса и двух субъединиц M.SsoII, или из двух ДНК-дуплексов и одной субъединицы M.SsoII.
K 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 6. Анализ равновесного Неспецифические связывания 1,4 мкМ M.SsoII с ДНК-белковые 0,12 мкМ 5-32Р-меченным ДНКкомплексы дуплексом 60reg в присутствии KСпецифические гепарина методом торможения ДНК-белковые в 7%-ном ПААГ в неденатукомплексы Kрирующих условиях. Дорожка К - исходный ДНК-дуплекс.
Дорожки 1Ц8 содержат 0, 0,28, 0,70, 1,4, 2,8, 6,3, 18,7 и 31,3 мкМ ДНК-дуплекс гепарина, соответственно.
При добавлении глутарового альдегида в реакционные смеси, содержащие M.SsoII и различные 60-звенные ДНК-дуплексы, продукт сшивки наблюдался только при взаимодействии M.SsoII с 60reg (рис. 7, дорожки 5 и 6). Таким образом, в специфическом комплексе M.SsoII с 60reg имеются сближенные белковые субъединицы, то есть в состав комплекса M.SsoIIЦ60reg входят две субъединицы M.SsoII и один ДНК-дуплекс.
M.SsoII M.SsoII M.SsoII + + + M.SsoII 60met 60reg 60ns M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 21120 Сшитые 1молекулы M.SsoII M.SsoII Рис. 7. Анализ продуктов сшивки M.SsoII (1,2 мкМ) с помощью глутарового альдегида методом гель-электрофореза по Лэммли. Гель окрашен кумасси. Дорожки 1Ц3 содержат ДНК-дуплекс 60met (2,4 мкМ), дорожки 4Ц6 - ДНК-дуплекс 60reg (2,4 мкМ), дорожки 4Ц6 - ДНК-дуплекс 60ns (2,4 мкМ). Реакционные смеси в дорожках 1, 4, 7 и 10 не содержат глутарового альдегида. В дорожках 2, 5, 8 и 11 реакция остановлена через 5 мин инкубации с глутаровым альдегидом, в дорожках 3, 6, 9 и 12 - через 17 мин. Дорожка М содержит белкимаркеры. Их молекулярная масса в кДа указана слева.
7. Взаимное расположение доменов ДНК-метилтрансферазы SsoII в ее комплексе с ДНК, содержащей регуляторный участок Для изучения окружения остатка цистеина в комплексе M.SsoII с регуляторной ДНК использовали метод фотосшивки ДНК-белкового комплекса с помощью бифункционального фотоактивируемого реагента 4-(N-малеимидо)бензофенона (ВРМ) (табл. 3). Его малеимидная группа специфически реагирует с тиольной группой остатка Cys. При облучении УФ-светом бензофеноновая группа возбуждается и может встраиваться по радикальному механизму в любую связь CЦH.
Смеси M.SsoII с ДНК-дуплексами выдерживали 30 мин при 37 С для формирования комплексов. Затем добавляли ВРМ и облучали УФ-светом с длиной волны 365 нм. Половину каждой реакционной смеси наносили на неденатурирующий гель для подтверждения комплексообразования M.SsoII с ДНК (рис. 8а). Вторую половину наносили на гель по Лэммли для обнаружения продуктов сшивки. Видно, что сшивка образуется только в комплексе M.SsoII с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок (рис. 8б), и ее выход увеличивается с увеличением времени УФ-облучения.
Контрольный эксперимент с M.Ecl18kI, имеющей только один остаток Cys (в каталитическом центре), показал, что именно этот остаток Cys участвует в реакции с ВРМ. В экспериментах с P-меченным ДНК-дуплексом наблюдалось включение радиоактивной метки в продукт фотосшивки (рис. 8в), что свидетельствовало об образовании ДНК-белкового, а не белок-белкового конъюгата. Следовательно, происходила пришивка белка к ДНК. Таким образом, в комплексе M.SsoII с регуляторной ДНК остаток Cys142 каталитического центра фермента сближен с ДНК.
а б в Рис. 8. Продукты фотосшивки M.SsoII, M.Ecl18kI и их комплексов с ДНК-дуплексами 60met и 60reg с помощью BPM. Время УФ-облучения указано над дорожками. (а) Анализ методом электрофореза в 6%-ном ПААГ в неденатурирующих условиях. Гель окрашен бромидом этидия. (б) Анализ методом гель-электрофореза по Лэммли. Гель окрашен кумасси. (в) Анализ методом гель-электрофореза по Лэммли. P-меченная ДНК детектирована методом авторадиографии.
Предполагаемая структура комплекса M.SsoIIЦ60reg приведена на рис. 9.
N-Концевые области двух субъединиц M.SsoII взаимодействуют с регуляторным участком, каждая со своей половиной палиндрома. Область M.SsoII, ответственная за метилирование, связывается с ДНК, фланкирующей регуляторный участок.
Поскольку участков метилирования в этом ДНК-дуплексе не содержится, такое связывание является неспецифическим, то есть основано на электростатических взаимодействиях M.SsoII с углеводофосфатным остовом ДНК и не зависит от нуклеотидной последовательности.
Для того чтобы такая структурная организация была возможна, требуется высокая подвижность линкера, соединяющего N-концевую область M.SsoII с областью, ответственной за метилирование. Эта подвижность была продемонстрирована в данной работе в ходе экспериментов по сшивке остатков Cys(Ц1) и Cys142 M.SsoII (см. раздел 5). По-видимому, связывание области M.SsoII, ответственной за метилирование, с ДНК около регуляторного участка придает дополнительную стабильность этому комплексу, а также предотвращает связывание M.SsoII с участком метилирования.
Рис. 9. Предполагаемая структурная организация комплекса, состоящего из двух субъединиц M.SsoII и одного ДНК-дуплекса 60reg. Серым цветом обозначена ДНК, красным выделен регуляторный участок. Скобкой отмечена область, которую M.SsoII защищает от гидролиза ДНКазой I (Karyagina et al., 1997). Голубым цветом выделен N-концевой домен M.SsoII (а. о. 1Ц55), желтым - линкер (а. о. 56Ц71), зеленым - область M.SsoII, ответственная за метилирование (а. о. 72Ц379). Остатки цистеина выделены синим. Из дополнительного Nконцевого пептида M.SsoII, содержащего гексагистидиновый блок, показан только Cys(Ц1).
8. Сравнение сродства ДНК-метилтрансферазы SsoII к ДНК-дуплексам, содержащим участки узнавания, в равновесных условиях Поскольку взаимодействие M.SsoII с ДНК-дуплексом 60reg приводит к образованию двух специфических ДНК-белковых комплексов, а с ДНК-дуплексом 60met - только одного, значения равновесных констант диссоциации (Kd) этих комплексов нельзя сравнивать напрямую. Наиболее простой эксперимент, необходимый для сравнения сродства M.SsoII к ДНК-дуплексам 60reg и 60met, состоит в изучении взаимодействия M.SsoII с ДНК-лигандами обоих типов, присутствующими в реакционной смеси одновременно. Для этого 5 нМ M.SsoII добавляли к смеси, содержащей 5 нМ радиоактивно меченный ДНК-дуплекс и различные количества немеченого дуплекса-конкурента. Реакционные смеси выдерживали 40 мин при 37 С, затем анализировали методом гель-электрофореза в неденатурирующих условиях. В качестве контрольных использовали реакционные смеси, не содержащие дуплекса-конкурента. Выход радиоактивно меченного ДНКбелкового комплекса в этих смесях принимали за 100%. Строили график зависимости выхода радиоактивно меченного комплекса от концентрации дуплекса-конкурента.
Экспериментальные точки аппроксимировали кривой и по ней определяли значение IC50, то есть концентрацию дуплекса-конкурента, при которой выход радиоактивно меченного ДНК-белкового комплекса снижается на 50% (табл. 4).
Таблица Значения IC50 для дуплексов-конкурентов Избыток дуплекса-конкурента ДНК-белковый ДуплексIC50, нМ* относительно меченого комплекс конкурент дуплекса в точке IC60reg 2,75 0,M.SsoIIЦ60met 60ns 265 60met 885 1M.SsoIIЦ60reg, K60ns 4805 960met 600 1M.SsoIIЦ60reg, K60ns 2575 5Если M.SsoII способна связывать одновременно оба типа ДНК-лигандов, то на геле должна появляться дополнительная зона, несущая радиоактивную метку (второй ДНК-белковый комплекс в случае смеси M.SsoII с меченым дуплексом 60met и третий - в случае смеси M.SsoII с меченым дуплексом 60reg). Однако экспериментально новых комплексов зафиксировано не было, несмотря на то что комплексообразование изучали в широком диапазоне концентраций дуплексаконкурента. Напротив, добавление дуплекса-конкурента приводило к снижению выхода радиоактивно меченного ДНК-белкового комплекса. Это подтверждает вывод о невозможности одновременного связывания M.SsoII с обоими ДНК-лигандами, сделанный на основе результатов ковалентной сшивки M.SsoII и 60reg с помощью BPM (см. раздел 7).
При добавлении к комплексу M.SsoIIЦ60met эквимолярного количества ДНКдуплекса 60reg наблюдается более чем 50%-ное вытеснение M.SsoII из этого комплекса. С другой стороны, для 50%-ного вытеснения M.SsoII из комплекса К2, содержащего две молекулы белка и один ДНК-дуплекс 60reg, требуется 120-кратный избыток дуплекса-конкурента 60met. Следовательно, сродство M.SsoII к ДНКдуплексу 60reg значительно превышает сродство к ДНК-дуплексу 60met.
Стоит подчеркнуть, что хотя M.SsoII обладает высоким сродством к неспецифической ДНК, в качестве конкурента ДНК-дуплекс без участков узнавания значительно менее эффективен, чем ДНК-дуплекс, содержащий участок узнавания.
Так, исходя из значений IC50 (табл. 4), ДНК-дуплекс 60met является примерно в 5 раз более эффективным конкурентом ДНК-дуплекса 60reg, чем ДНК-дуплекс 60ns.
Кроме того, ДНК-дуплекс 60reg - почти в 100 раз более эффективный конкурент ДНК-дуплекса 60met, чем ДНК-дуплекс 60ns.
9. Кинетика взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК-дуплексами, содержащими участки узнавания Для изучения кинетики взаимодействия M.SsoII с ДНК-дуплексами, содержащими участки узнавания, использовали метод акустической детекции на пьезоэлектрическом сенсоре. Он позволяет регистрировать связывание белка с поверхностью, на которой иммобилизована ДНК. Константы скорости ассоциации показали, что связывание с ДНК-дуплексом 60met происходит в 11 раз быстрее, чем с ДНК-дуплексом 60reg (табл. 5). Скорость диссоциации комплекса M.SsoIIЦ60met в 2 раза выше, чем M.SsoIIЦ60reg. Эти данные демонстрируют, что связывание M.SsoII с участком метилирования происходит более эффективно за счет большей скорости процессов ассоциации и диссоциации.
Кроме того, кинетику взаимодействия M.SsoII с ДНК-дуплексами изучали методом лостановленного потока. Этим методом также было показано, что связывание M.SsoII с ДНК-дуплексом 60met происходит быстрее, чем с ДНКдуплексом 60reg.
Таблица Параметры связывания ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК-дуплексами, полученные методом акустической детекции на пьезоэлектрическом сенсоре ДНК-дуплекс ka, 104 MЦ1сЦ1 kd, 10Ц3сЦ1 Kd, мкМ (f)max, Гц 60met 10,2 0,20 3,60 0,85 0,035 0,008 47,0 4,60reg 0,93 0,20 1,93 0,65 0,210 0,080 60,0 7,60ns 0,72 0,13 1,46 0,10 0,203 0,039 50,0 7,ka - константа скорости ассоциации; kd - константа скорости диссоциации; Kd - кажущаяся равновесная константа диссоциации, рассчитанная как kd/ka; (f)max - максимальное изменение резонансной частоты сенсора, полученное в результате нанесения на сенсор 0,5 мкМ M.SsoII.
10. Особенности существования системы рестрикцииЦмодификации SsoII в клетке Если бактериальная ДНК метилирована полностью, то после ее репликации все участки узнавания M.SsoII оказываются монометилированными, и МТаза выполняет функцию поддерживающего метилирования. Такое состояние не несет угрозы для клетки, поскольку R.SsoII неспособна гидролизовать монометилированные участки.
Наиболее опасным для клетки является момент, когда в процессе конъюгации она получает систему РЦМ впервые, поскольку в этом случае МТаза должна осуществить метилирование всей клеточной ДНК de novo. Хотя в случае отсутствия в растворе молекул M.SsoII транскрипция гена ssoIIM идет значительно более эффективно, чем транскрипция гена ssoIIR, некоторое количество молекул R.SsoII все же образуется (Karyagina et al., 1995). Вполне возможно, что M.SsoII не успевает метилировать de novo все участки до того, как в клетке появляются молекулы R.SsoII. В таком случае образуются двуцепочечные разрывы ДНК. По-видимому, некоторые клетки успевают репарировать их, а некоторые погибают. Однако после того как первый цикл метилирования клеточной ДНК пройден, существование системы РЦМ становится практически безопасным для клетки, а также защищает ее от вторжения чужеродной ДНК.
В данной работе показано, что связывание M.SsoII с регуляторным участком делает невозможным связывание этого белка с участком метилирования, а значит, две функции этого белка являются взаимоисключающими. Роль переключателя между этими функциями для конкретной молекулы M.SsoII играют процессы ассоциации - диссоциации этой молекулы c регуляторным участком. В свете этих данных центральным становится вопрос о том, как происходит выбор МТазы между связыванием с регуляторным участком и связыванием с участком метилирования.
Полученные нами результаты свидетельствуют о значительно большем сродстве M.SsoII к регуляторному участку по сравнению с участком метилирования. В таком случае как M.SsoII выполняет свою основную функцию - метилирование ДНК? Впервые показано, что существенную роль играет кинетика связывания M.SsoII с ДНК: как ассоциация M.SsoII с участком метилирования, так и диссоциация полученного комплекса происходят значительно быстрее, чем с регуляторным участком. Кроме того, важную роль играет соотношение числа участков метилирования и регуляторных участков в клетке. В случайной последовательности ДНК участок метилирования 5-CCNGG-3/3-GGNCC-5 (где N = A, C, G или T) должен встречаться в среднем один раз на 44 = 256 нуклеотидов. Геном одного из штаммов S. sonnei составляет 4,8 106 п. н. (Yang et al., 1995). В таком геноме должно содержаться примерно 4,8 106 / 256 2 104 участков метилирования. С другой стороны, 15-звенный регуляторный участок должен встречаться в случайной последовательности ДНК в среднем один раз на 415 109 нуклеотидов, что значительно превышает размер генома S. sonnei. Следовательно, вероятность обнаружить регуляторный участок в геноме чрезвычайно мала, и число регуляторных участков в клетке равно числу содержащихся в этой клетке плазмид Р4 (кодирующих систему РЦМ SsoII). Наиболее вероятно, что в процессе конъюгации в клеткуреципиент попадает только одна плазмида Р4. Можно принять приближение, что в то время, когда M.SsoII метилирует ДНК данной клетки de novo, в клетке находится только одна такая плазмида. В этом случае число участков метилирования в 2 104 раз превышает число регуляторных участков в клетке, что должно обуславливать связывание M.SsoII именно с участком метилирования.
После проведения реакции метилирования M.SsoII диссоциирует от этого участка и связывается со следующим. Постепенно количество неметилированных и монометилированных участков снижается, их избыток относительно регуляторных участков уменьшается, и равновесие смещается в сторону комплексообразования M.SsoII с регуляторным участком. Это приводит к подавлению транскрипции гена ssoIIM. Однако к этому моменту концентрация M.SsoII в клетке, по-видимому, уже достаточно велика, поскольку при транскрипции одного гена может быть получено много молекул мРНК, а при трансляции одной мРНК - много молекул белка.
Учитывая то, что число генов ssoIIM в клетке равно числу плазмид Р4 и числу регуляторных участков, количество молекул M.SsoII в клетке значительно превышает количество регуляторных участков. Поэтому после присоединения двух молекул M.SsoII к каждому регуляторному участку в клетке остается достаточно свободных молекул M.SsoII для проведения метилирования генома до конца.
Итак, в данной работе получила дальнейшее развитие и детализацию маятниковая модель функционирования системы РЦМ SsoII in vivo (Карягина, 1997). Сформулированы два существенных уточнения этой модели.
1. Существование системы РЦМ SsoII in vivo практически не представляет опасности для клетки-хозяина после того, как было проведено полное метилирование клеточной ДНК.
2. Продемонстрировано значительно большее сродство M.SsoII к регуляторному участку по сравнению с участком метилирования. По-видимому, эффективное выполнение M.SsoII функции МТазы обеспечивается за счет кинетических факторов и за счет значительного избытка участков метилирования относительно регуляторных участков в клетке.
ВЫВОДЫ 1. Впервые получены структуры низкого разрешения ДНК-метилтрансферазы SsoII и ее комплекса с 15-звенным ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования, в присутствии S-аденозил-L-гомоцистеина. ДНК-метилтрансфераза SsoII является мономером в апо-форме и в комплексе с метилируемой ДНК. Показана компактизация молекулы белка при связывании с ДНК-субстратом.
2. Экспериментально доказано, что ДНК-метилтрансфераза SsoII взаимодействует с регуляторным участком в составе межгенной области системы рестрикции - модификации SsoII с образованием комплекса, состоящего из двух молекул белка и одного ДНК-дуплекса. В этом комплексе остаток Cys142 каталитического центра ДНК-метилтрансферазы SsoII сближен с ДНК, фланкирующей регуляторный участок.
3. Установлено, что делеционный мутант, представляющий собой N-концевую область SsoII-подобных ДНК-метилтрансфераз, сохраняет ярко выраженную вторичную структуру и способен специфически связывать ДНК, содержащую регуляторный участок. Продемонстрирована высокая подвижность линкера, соединяющего N-концевую область ДНК-метилтрансферазы SsoII (аминокислотные остатки 1Ц71) и область этого белка, ответственную за метилирование.
4. Впервые показано, что метилтрансферазная и регуляторная активности SsoII являются взаимоисключающими: комплексообразование этого белка с регуляторным участком предотвращает его связывание с участком метилирования. Эффективное метилирование клеточной ДНК обеспечивается метилтрансферазой SsoII за счет большей скорости связывания с участком метилирования и за счет значительного избытка участков метилирования относительно регуляторных участков.
Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:
1. Рязанова А.Ю., Молочков Н.В., Абросимова Л.А., Алексеевский А.В., Карягина А.С., Проценко А.С., Фридхофф П., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. Вторичная структура N-концевой области SsoII-подобных С5-цитозиновых ДНКметилтрансфераз, определенная методом спектроскопии кругового дихроизма. // Молекулярная биология. 2010. Т. 44, № 4, с. 1Ц11.
2. Ryazanova A.Yu., Kubareva E.A., Grman I., Lavrova N.V., Ryazanova E.M., Oretskaya T.S., Hianik T. The study of the interaction of (сytosine-5)-DNA methyltransferase SsoII with DNA by acoustic method. // Analyst. 2011. Vol. 136, No. 6, pp. 1227Ц1233.
3. Ryazanova A.Yu., Winkler I., Friedhoff P., Viryasov M.B., Oretskaya T.S., Kubareva E.A. Crosslinking of (cytosine-5)-DNA methyltransferase SsoII and its complexes with specific DNA duplexes provides an insight into their structures. // Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 2011. Vol. 30, No. 7Ц8, pp. 632Ц650.
4. Ryazanova A., Kubareva E., Lavrova N., Karyagina A., Kachalova G., Konarev P., Svergun D.I., Bartunik H.D. Small-angle X-ray scattering studies of the (cytosine-5)-DNA methyltransferase NlaX from Neisseria lactamica. // HASYLAB Annual Report 2006. Part II, pp. 369Ц370.
5. Рязанова А.Ю., Качалова Г.С., Конарев П.В., Свергун Д.И., Кубарева Е.А., Бартуник Х.Д. Исследование структуры С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз SsoII и NlaX в растворе. // Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 2008, Новосибирск, Россия, с. 86.
6. Абросимова Л.А., Молочков Н.В., Рязанова А.Ю. ДНК-метилтрансфераза SsoII как фактор транскрипции: особенности структуры белка и стехиометрии его комплексов с ДНК. // Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2009. Биоинженерия и биоинформатика.
Физико-химическая биология. Москва, Россия, с. 1.
7. Абросимова Л.А., Рязанова А.Ю. Стехиометрия ДНК-белковых комплексов, образующихся при взаимодействии SsoII-подобных ДНК-метилтрансфераз с регуляторным участком ДНК. // Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2010. Биоинженерия и биоинформатика. Физико-химическая биология. Москва, Россия, с. 1.
8. Hianik T., Ryazanova A.Yu., Kubareva E.A., Grman I., Lavrova N.V., Ryazanova E.M., Oretskaya T.S. Application of surface acoustic method to study the interaction of proteins with nucleic acids. // Abstract book of IV Slovak Biophysical Symposium, 2010, Modra-Harmonia, Slovakia, p. 43.
9. Ryazanova A.Yu., Abrosimova L.A., Winkler I., Oretskaya T.S., Friedhoff P., Kubareva E.A. Structural aspects of (cytosine-5)-DNA methyltransferase SsoII interaction with its target DNAs. // Abstract book of the Workshop УEnzymes and enzyme complexes acting on nucleic acidsФ of the International Research Training Group Gieen/Marburg - Moscow (DFG/RFBR-funded), 2010, Vilnius, Lithuania, p. 19.
10. Ryazanova A.Yu., Abrosimova L.A., Burenina O.Yu., Kubareva E.A. (Cytosine-5)DNA methyltransferase SsoII interaction with its target DNAs: structural aspects. // Abstract book of the 6th New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification, 2010, Bremen, Germany, Р52.
11. Ryazanova A.Yu., Winkler I., Friedhoff P., Oretskaya T.S., Kubareva E.A. Crosslinking of (cytosine-5)-DNA methyltransferase SsoII and its complexes with specific DNA duplexes provides an insight into their structures. // Abstract book of the Workshop УChemistry in molecular biologyФ, 2011, Moscow, Russia, p. 18.