Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Соболева Юлия Викторовна
Структурно-функциональная характеристика микросимбиоценозов верхних дыхательных путей человека
03.02.03 - Микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Оренбург - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук.
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор Усвяцов Борис Яковлевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО Оренбургская государствен- ная медицинская академия Минздрава России Челпаченко Ольга Ефимовна кандидат медицинских наук, доцент Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИКВС УрО РАН Черкасов Сергей Викторович
Ведущая организация: ГБОУ ВПО Челябинский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита диссертации состоится л20 декабря 2012 г. в 13_ часов на заседании диссертационного совета Д 208.066.03 при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д.6, аудитория 205, конференц зал. Тел.: (3532) 40-35-62; факс: (3532) 7724-59; e-mail: orgma_ds1@esoo.ru, официальный сайт: www.orgma.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии Министерства здравоохранения Российской Федерации Автореферат разослан л__ ___________ 20__ г., автореферат и текст объявления размещен на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Немцева Наталия Вячеславовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Микрофлора верхних дыхательных путей (ВДП), как в норме, так и при развитии различных патологических процессов, характеризуется достаточным разнообразием видового состава бактерий и их биологических свойств. Микроорганизмы в таких условиях не существуют дискретно, а постоянно взаимодействуют друг с другом, формируя микросимбиоценоз (Бухарин О.В. с соавт., 2011). С современных позиций микросимбиоценоз представляет собой единую динамическую систему, обладающую выраженной способностью к ауторегуляции и аутостабилизации, состоящую из многовидовых консорциумов микроорганизмов, образующих симбиотические связи между собой и макроорганизмом с целью создания благоприятных условий для своей жизнедеятельности и оказывающих непосредственное влияние на состояние здоровья организма хозяина (Перунова Н.Б., 2011). Микросимбиоценозы слизистых оболочек ВДП представляют собой сложную микроэкологическую систему (Андрианова Е.Н. с соавт., 2009; Skoulakis Ch. et al., 2008), характеризующуюся не только многокомпонентностью, но и разнообразием входящих в них микроорганизмов Ч сапрофитов-комменсалов, условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (Башкина О.А. с соавт., 2003; Кузнецов В.Ф. с соавт., 2003; Извин А.И. с соавт., 2009; Owen Hendley J. et al., 2005; Winther B., 2007).
На слизистых оболочках ВДП обнаружены ассоциации стафилококков (Коленчукова О.А. с соавт., 2008), стрептококков и Moraxella catarrhalis (Страчунский Л.С. с соавт.,2002; Маккаев Х.М., 2003; Ball P., 1995), грибов рода Candida (Кулагина В.В., 2005) и достаточно разнообразные бактериально-грибковые ассоциации (Белобородова Н.В., 1998; Гуров А.В., 2007; Крюков А.И., 2008).
Изменения биологических характеристик участников микросмибиоценоза существенно отражаются на течении заболевания. Известно, что тонзиллярная микрофлора больных, по сравнению со здоровыми, чаще обладает комплексом факторов патогенности и антибиотикорезистентностью, а возбудители в монокультуре реже, чем в ассоциациях, проявляют факторы патогенности и резистентность к двум и более антибиотикам (Хуснутдинова Л.М., 2004). Также известно, что межбактериальные взаимодействия на слизистой оболочке миндалин человека характеризуются разнотипной направленностью модификации факторов патогенности и антибиотикорезистентности в зависимости от видовых характеристик бактерий-симбионтов и состояния микробного биоценоза (Азнабаева Л.М. с соавт., 2010). Однако оценка межмикробных взаимодействий с позиций популяционно-коммуникативных аспектов функциониро вания микросимбиоценоза ранее не проводилась. Не изучены изменения микросимбиоценозов слизистой носа при развитии хронического инфекционного процесса в смежном биотопе - миндалинах. Также ранее не рассматривалась структура биотопов слизистой оболочки полости носа и миндалин и е динамика с позиций оценки коммуникативной активности бактерий при межмикробных взаимодействиях. Вышеизложенное предопределило целевую установку настоящей работы.
Цель и задачи исследования: Изучить структуру и динамику микросимбиоценозов слизистых оболочек полости носа и миндалин человека в норме и при хроническом тонзиллите с учетом коммуникативной активности микробных симбионтов.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Провести сравнительную количественную и качественную характеристику микрофлоры слизистых оболочек носа и миндалин у здоровых лиц и больных хроническим тонзиллитом.
2. Изучить межмикробные взаимодействия представителей микробиоценозов различных биотопов верхних дыхательных путей человека, определить коммуникативную активность микросимбионтов в норме и при хроническом тонзиллите.
3. Выявить динамику изменений, происходящих в микробных биоценозах больных хроническим тонзиллитом и здоровых лиц.
Научная новизна. Установлено, что микробиоценозы слизистых оболочек полости носа и миндалин больных хроническим тонзиллитом, по сравнению с биоценозами здоровых, имеют большую степень сходства по составу родов микроорганизмов и по составу отдельных видов стафилококков.
Впервые произведена оценка коммуникативных связей в микросимбиоценозах ВДП человека в норме и при хроническом тонзиллите. Показано, что независимо от состояния здоровья структура биотопов слизистой оболочки полости носа и миндалин существенно не различается. Однако в функциональном плане выявлены определенные различия, позволившие выделить два варианта структуры коммуникативных взаимоотношений в микросимбиоценозе. При первом, нормобиоценотическом варианте, отмечено доминирование индифферентных коммуникативных взаимодействий (55%), в меньшей степени - антагонистических (35%). Второй, патобиоценотический вариант, характеризуется превалированием синергидных коммуникативных взаимоотношений (55%) по сравнению с индифферентным (23%) и антагонистическим (22%).
Показано, что резидентная микрофлора изучаемых биотопов здоровых лиц представлена индигенными микроорганизмами, тогда как у больных хроническим тонзиллитом длительно сохраняются условно-патогенные виды (S.
aureus, S. haemolyticus). В биотопах верхних дыхательных путей здоровых людей с течением времени сохраняются штаммы с индифферентной коммуникативной активностью, направленной на снижение экспрессии факторов патогенности и персистенции симбионтов. У больных хроническим тонзиллитом, напротив, длительно сохраняющиеся штаммы с высокой коммуникативной активностью способствуют повышению патогенного и персистентного потенциала симбионтной микрофлоры, что может приводить к длительному течению инфекционного процесса.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе данные расширяют теоретические представления о структуре микросимбиоценозов слизистых оболочек ВДП и функции симбионтов на слизистых оболочках носа и миндалин в норме и при патологии и могут быть использованы для оценки стабильности микросимбиоценозов, а также разработки новых методов диагностики, профилактики и лечения хронических тонзиллитов. Полученные материалы используются в курсе преподавания медицинской микробиологии для студентов, а также на этапах постдипломной подготовки специалистов (протокол практического использования от 24.01.2012 г.).
Положения, выносимые на защиту:
1. Биотопы верхних дыхательных путей (слизистая оболочка носа и миндалин) при хроническом тонзиллите характеризуются выраженным сходством по микробному составу и более высокой распространенностью патогенных и персистентных свойств в сравнении с микробиоценозами здоровых лиц.
2. При хроническом тонзиллите у больных со слизистых оболочек полости носа и миндалин, высеваются условно-патогенные микроорганизмы с высокой коммуникативной активностью, направленной на стимуляцию факторов патогенности и персистенции микросимбионтов, тогда как у здоровых лиц, напротив, высевается микрофлора, с индифферентной коммуникативной активностью либо подавляющей патогенный и персистентный потенциал бактерий.
3. Динамическая структура микросимбиоценозов слизистых верхних дыхательных путей при хроническом тонзиллите характеризуется сохранением микроорганизмов с высокой коммуникативной активностью (не менее 4 недель), направленной на усиление патогенного и персистентного потенциалов симби онтов, тогда как у здоровых лиц такие штаммы элиминируются в течение 1 недели.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
VIII научно-практической конференции эпидемиологов, микробиологов, инфекционистов и паразитологов (Оренбург, 2010); научной конференции с международным участием Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней (Иркутск, 2010); конференции Дни молодежной науки в Оренбургской области (Оренбург, 2011); I Всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии. (Пермь, 2011);
VI, VII Российской научной конференции Персистенция микроорганизмов (Оренбург, 2009, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, 3 из них в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, три главы собственных исследований, заключение, выводы. Указатель литературы содержит 172 источника, из них 114 отечественных и 58 зарубежных. Текст иллюстрирован 18 таблицами и 30 рисунками.
Связь работы с научными программами. Работа выполнена в соответствии с программой Президиума РАН Механизмы формирования и регуляция ассоциативного симбиоза человека (09-П-4- 1007) и является частью открытого плана НИР ИКиВС УрО РАН Формирование и функционирование микробных симбиозов в живых системах (№ гос. регистрации 01201067427).
____________________________________________________________________ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. Материалом для исследования послужили 728 штаммов микроорганизмов, выделенных со слизистых оболочек носа (285 штаммов) и миндалин (443 штамма) клинически здоровых и больных хроническим тонзиллитом в стадии ремиссии лиц. Группу здоровых изначально составили 30 человек, группу больных - 25 человек в возрасте 19-25 лет.
Обследование проводилось пятикратно с интервалом 7 дней. Из исследования были исключены 9 здоровых и 16 больных лиц из-за нарушения протокола обследования (критерии исключения: отказ обследуемых, развитие острых воспа лительных заболеваний). В дальнейшем учитывали результаты обследования здорового и 9 больных хроническим тонзиллитом.
Выделение и идентификацию штаммов микроорганизмов проводили на основании общепринятых методов (Биргер М.О., 1982; Фельдман Ю.М., с соавт., 1984). Дальнейшая идентификация до вида проводилась с помощью дифференциально-диагностических тест-систем STAPHYtest, STREPTOtest, ENTEROtest, NEFERMtest (LaChema, Чехия). У выделенных микроорганизмов изучали факторы патогенности: (гемолитическую, лецитовителлазную активности), колонизации (лизоцимную активность и бактериоциногению) и персистенции (антилизоцимную активность) по общепринятым методикам (Усвяцов Б.Я., 1967; Биргер М.О., 1982; Бухарин О.В. с соавт., 1984). Для подтверждения идентичности штаммов, выделенных при повторных обследованиях, определяли резистовары (Самикова В.Н., 2009).
С целью изучения степени сходства исследуемых микробиоценозов применяли коэффициент Серенсена (Семкин Б.И., 2009).
Для оценки модификации факторов патогенности и персистенции микроорганизмов использовали метод перекрестного посева штаммов-симбионтов (Хуснутдинова Л.М., 2004). На основании активности микроорганизмов по модификации факторов патогенности и персистенции симбионтов определялись выраженность и направленность коммуникативной активности микроорганизмов (Бухарин О.В. с соавт., 2009).
Все полученные результаты обработаны с использованием методов вариационной статистики (С. Гланц, 1999) с применением лицензионного пакета прикладных статистических программ BIOSTAT, STATISTICA v.5.0, а также с помощью процессора электронных таблиц Microsoft Excel 2003 в составе пакета программ Microsoft Office 2003 for Windows XP.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Сравнительная оценка микробиоценозов носа и миндалин здоровых лиц и больных хроническим тонзиллитом.
При анализе состояния биоценоза изучаемых биотопов оценивали состав родов и видов изолированной микрофлоры с учетом количественных характеристик последней. В микросимбиоценозе слизистой носа общий показатель микробной обсемененности (ОПМО) у больных лиц был на 2 порядка выше, чем у здоровых (106 КОЕ/тампон против 104 КОЕ/тампон). Повышение ОПМО происходило за счет увеличения количества энтеробактерий и стафилококков (S. epidermidis, S. hominis и S. aureus). С другой стороны, у больных, по сравнению со здоровыми, снижалось количество коринебактерий и стрептококков.
В микросимбиоценозе слизистой миндалин больных ОПМО также был на 2 порядка выше, чем у здоровых (108 КОЕ/тампон против 106 КОЕ/тампон).
Увеличение ОПМО происходило за счет стафилококков, микрококков, нейссерий, а также появления на слизистой оболочке миндалин в большем количестве энтеробактерий (до 105 КОЕ/тампон) и энтерококков (до 107 КОЕ/тампон), которые отсутствовали на миндалинах здоровых лиц. Наряду с этим у больных на 2 порядка снижалось количество нормальной стрептококковой флоры. На слизистой миндалин больных хроническим тонзиллитом показатель микробной обсемененности отдельными видами стафилококков (S. haemolyticus, S. warneri S. epidermidis, S. hominis, S. aureus) на 3-4 порядка превышал показатели здоровых. Полученные результаты согласуются с литературными данными (Беляева Е.В. с соавт., 2006).
При сравнении двух биотопов одной группы обследуемых отмечено, что независимо от состояния здоровья ОПМО в полости носа в среднем на 2 порядка ниже, чем на миндалинах.
Была изучена частота встречаемости различных таксонов в микросимбиоценозах слизистой оболочки полости носа и слизистой оболочки миндалин здоровых обследуемых и больных хроническим тонзиллитом. Независимо от состояния здоровья, чаще всего со слизистой оболочки полости носа высевались Staphylococcus spp. (рис. 1). Немалую долю микробиоценоза слизистой носа здоровых лиц составляли Streptococcus spp., Micrococcus spp., Corynebacterium spp., а у больных - Streptococcus spp., Neisseria spp. и Enterococcus spp.
Следует отметить, что Klebsiella spp. были изолированы в ряде случаев только у больных хроническим тонзиллитом. Аналогичные данные были представлены другими исследователями (Белобородова Н.В., 1998).
У здоровых, по сравнению с больными, было зафиксировано большее разнообразие стафилококковой флоры: 11 видов против 7-и. У больных отсутствовали такие виды, как: S. capitis, S. cohnii, S. schleiferi, S. kloosii, S. arlettae, S. simulans. От здоровых людей не высевались S. warneri и S. haemolyticus. Со слизистой оболочки полости носа здоровых, по сравнению с больными реже высевался S. hominis (6,80,21% и 10,10,27%, р<0,05) и S. aureus (4,10,16% и 8,70,25 %, р<0,05). Основное отличие стрептококковой флоры здоровых лиц заключалось в отсутствии у них S. pyogenes.
* * * * * * 0 10 20 30 40 50 % здоровые больные Рис. 1. Частота выделения со слизистой оболочки носа микроорганизмов различных родов.
*- р<0,05 для различий между группами 1- Staphylococcus spp., 2- Streptococcus spp., 3- Micrococcus spp., 4- Corynebacterium spp., 5- Enterobacteriaceae spp., 6- Enterococcus spp., 7- Bacillus spp., 8- Neisseria spp., 9- Klebsiella spp.
Микрофлора слизистой оболочки миндалин здоровых людей (рис. 2) была преимущественно представлена микроорганизмами рода Streptococcus, тогда как у больных чаще высевались Staphylococcus spp. С миндалин здоровых людей чаще высевались представители родов Aerococcus, Moraxella, а от больных - Neisseria spp. Кроме того, со слизистой оболочки миндалин больных хроническим тонзиллитом в небольшом количестве были выделены микроорганизмы Enterococcus spp., Klebsiella spp. и Enterobacteriaceae spp., которые от здоровых не высевались. Полученные результаты согласуются с литературными данными (Лямин А.В., 2008).
Стафилококковая флора здоровых людей, по сравнению с больными, была более разнообразной: 17 видов против 12-и. В биоценозах больных хроническим тонзиллитом не встречались: S. equorum, S. cohnii, S. mucilaginosus, S. simulans, S. carnosus, S. saprophyticus, S. gallinarum, S. lentus. У здоровых отсутствовали S. arlettae, S. schleiferi и S. auricularis. От больных, по сравнению со здоровыми, чаще высевались S. haemolyticus (6,50,19 % против 0,80,05% р<0,05), S. aureus (11,90,25 % против 4,30,13%, р<0,05) и S. warneri (9,20,% против 2,30,10%, р<0,05).
* * * * * 0 10 20 30 40 50 здоровые больные % Рис. 2. Частота выделения со слизистой оболочки миндалин микроорганизмов различных родов.
*- р<0,05 для различий между группами 1- Staphylococcus spp., 2- Streptococcus spp., 3- Micrococcus spp., 4- Aerococcus spp., 5- Moraxella spp., 6- Neisseria spp., 7- Enterococcus spp., 8- Enterobacteraceae spp., 9- Klebsiella spp.
Видовой спектр стрептококков на миндалинах больных отличался от такового у здоровых лиц наличием S. pyogenes и снижением доли S. sanguis (2,70,12% против 3,50,12%, р<0,05), S. salivarius (4,90,16 % против 10,10,20%, р<0,05) и S. vestbularis (1,10,07% против 2,70,10%, р<0,05).
При сравнении двух биотопов - полости носа и миндалин между собой было установлено, что у здоровых лиц микробный пейзаж слизистой оболочки носа был представлен преимущественно стафилококками (55,84,1%), на слизистой оболочке миндалин преобладали стрептококки (45,73,1%). В полости носа присутствовали Corynebacterium spp., Enterococcus spp., Enterobacteriaceae spp. и Bacillus spp., которые отсутствовали на слизистой миндалин. На слизистой миндалин обнаружены Moraxella spp. и Aerococcus spp., которые не встречались на слизистой носа. У больных одинаково большой в обоих биоценозах была доля стафилококков (51,54,3% на слизистой носа и 533,7% на слизистой миндалин). На слизистой оболочке миндалин были микроорганизмы родов Moraxella и Aerococcus, которые не присутствовали в полости носа, где наличествовали микроорганизмы рода Corynebacterium, которые со слизистой оболочки миндалин не высевались.
Способность бактерий заселять ту или иную экологическую нишу обеспечивается наличием определенного набора факторов колонизации, патогенности и персистенции (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., 1996). Штаммы, выделенные из биотопов больных хроническим тонзиллитом, чаще характеризовались наличием факторов патогенности по сравнению с микрофлорой, выделенной от здоровых лиц (рис. 3). Штаммы, выделенные со слизистой миндалин больных тонзиллитом, чаще обладали всеми оцениваемыми факторами патогенности, а со слизистой носа - антилизоцимной (АЛА) и лецитиназной (ЛецА) активностями.
60 * * * Здоровые * % * * Больные нос миндалины нос миндалины нос миндалины нос миндалины ГА ЛецА ЛА АЛА Рис. 3. Сравнительные данные распространенности факторов патогенности у микроорганизмов, изолированных со слизистых оболочек полости носа и миндалин здоровых и больных лиц.
*- р<0,05 для различий между группами (в пределах биотопа).
Основной вклад в формирование этой тенденции вносили стафилококки.
Отмечено, что ЛецА и АЛА у стафилококков, выделенных со слизистой носа больных, выявлялась в 1,5 раза чаще, чем у нормобиоценотических штаммов (33,85,6% против 21,94,6% и 70,45,4% против 46,35,5% соответственно, р<0,05). Staphylococcus spp., выделенные со слизистой миндалин больных тонзиллитом, чаще проявляли все факторы патогенности, чем стафилококки, выделенные со слизистой оболочки миндалин здоровых людей: ЛецА в 2,7 раза (43,84,9% против 15,83,6%, р<0,05), гемолитической активностью (ГА), лизоцимной активностью (ЛА) и АЛА в 1,6 раза (69,34,6% против 42,54,9%;
525,1% против 31,74,6%; 55,15% против 34,64,7% соответственно, р<0,05).
Похожая тенденция наблюдалась при оценке частоты встречаемости ГА и АЛА у стрептококков, изолированных с миндалин больных в сравнении с группой здоровых - 37,76,6% против 16,93,4% (р<0,05) и 35,86,6% против 16,93,4% (р<0,05) соответственно, т.е. в 2,1 раза чаще.
При сравнении биологических свойств микрофлоры двух биотопов здоровых лиц было выявлено, что стафилококки, выделенные из полости носа, чаще экспрессируют АЛА (46,35,5% против 34,64,7%, р<0,05). В биотопах больных лиц стафилококки, выделенные со слизистой оболочки миндалин, чаще обладали ГА и ЛА (69,34,6% против 43,65,9%; 525,1% против 25,35,2% соответственно, р<0,05), а выделенные со слизистой оболочки носа - АЛА (70,45,4% против 55,15%, р<0,05).
При анализе видового состава изучаемых микросимбиоценозов было установлено, что индекс сходства микрофлоры слизистых носа здоровых и больных людей составил 0,88, а индекс сходства микробного пейзажа слизистых миндалин здоровых и больных лиц - 0,80, что в обоих случаях следует расценивать как высокое сходство микробиоценозов. При сравнении по родовому составу микробиоценозов слизистых носа и миндалин выявлено меньшее сходство этих биоценозов у здоровых лиц, чем у больных (индексы сходства 0,57 и 0,82 соответственно).
Структурно-функциональная организация изучаемых микросимбиоценозов.
На слизистых оболочках ВДП как в норме, так и при патологии формируются различные микробные сообщества (Гуров А.В. с соавт., 2007; Габедава В.А.
с соавт., 2008), в которых между микроорганизмами складываются сложные и неоднозначные связи (Башкина О.А. с соавт., 2003; Бухарин О.В. с соавт., 2003). При этом межбактериальные взаимодействия можно дифференцировать по направленности действия на синергидные, антагонистические и индифферентные (О.В. Бухарин с соавт., 2003). Исходя из этого, на втором этапе исследования была изучена модификация биологических свойств штаммовсимбионтов, на основании которой определялась коммуникативная активность.
Коммуникативная активность (КА) - интегральный показатель, отражающий направленность и выраженность реализованных межбактериальных связей микроорганизма в отношении микросимбионтов в условиях микробного сообщества.
Для определения уровня выраженности и направленности КА рассчитывали показатель активности симбионта при межмикробных взаимодействиях (Бухарин О.В. с соавт., 2009).
Коммуникативная структура микросимбиоценозов слизистых носа в норме и при патологии имела принципиальные различия: в биотопах здоровых чаще встречались микроорганизмы с индифферентной КА (54,4% против 31,9% у больных) тогда как у больных лиц - с высокой и средней КА (рис.4). При рассмотрении видового состава штаммов с высокой КА, выявлено, что у больных в эту группу входили микроорганизмы всех родов, высеваемых из биотопа, тогда как у здоровых - 6 из 8-и. Обнаружены различия в частоте проявления высокой КА: у больных в 4,4 раза чаще был высокоактивен S. aureus (9,23,6 % против 21,9%, р<0,05). Сравнивая штаммы с индифферентной КА, отмечено, что в полости носа стафилококки в 1,7 раз чаще входят в эту группу у здоровых лиц, чем у больных (47,45,6% против 27,36,7%, р<0,05).
Рассматривая направленность действия штаммов с высокой и средней КА, можно отметить, что значительный вклад в снижение экспрессии биологических свойств симбионтов на слизистой носа здоровых вносили штаммы с высокой КА (коагулазоотрицательные стафилококки (КОС), негемолитические стрептококки, микрококки и непатогенные коринебактерии). В меньшей степени этот эффект проявляли штаммы, обладающие КА средней выраженности (КОС, негемолитические стрептококки, микрококки, непатогенные коринебактерии и энтеробактерии).
Штаммы, усиливающие экспрессию факторов патогенности и персистенции, встречались гораздо реже (рис. 4). На слизистой оболочке полости носа здоровых они были представлены всего тремя родами с высокой КА (Staphylococcus spp. в т.ч. S. aureus, Streptococcus spp. и Enterococcus spp.) и двумя - со средней КА (Staphylococcus spp. и Enterobacteriaceae spp.).
У больных наиболее часто со слизистой носа выделялись штаммы, стимулирующие факторы патогенности и персистенции симбионтов (рис.4). Среди штаммов с высокой КА такое влияние оказывали Staphylococcus spp., в т.ч.
S. haemolyticus, S. aureus, S. warneri; Streptococcus spp.; Neisseria spp.; Enterococcus spp. и Enterobacteriaceae spp., в т.ч. Klebsiella spp. Среди штаммов со средней КА - Staphylococcus spp., в т.ч. S. aureus, S. haemolyticus и S. warneri; Streptococcus spp., в т.ч. S. pyogenes; Klebsiella spp. и Micrococcus spp.
Штаммы, снижающие экспрессию факторов патогенности и персистенции симбионтов в полости носа больных хроническим тонзиллитом, встреча лись почти в три раза реже (чем у здоровых лиц) и были представлены 5-ю группами с высокой КА (Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterobacteriaceae spp., Micrococcus spp., Corynebacterium spp.) и четырьмя - со средней КА (Staphylococcus spp., Micrococcus spp., Klebsiella spp. и Neisseria spp.).
Рис. 4. Коммуникативная активность штаммов, изолированных со слизистой оболочки полости носа здоровых и больных лиц.
При оценке структуры микросимбиоценозов миндалин в норме и при патологии (рис. 5) наблюдалась аналогичная тенденция: со слизистых здоровых людей чаще изолировались штаммы с индифферентной КА (55% против 15,2% у больных), в то время как от больных лиц - с высокой КА (52,5%) и средней КА (32,3%).
На слизистой миндалин больных высокую КА проявляли 8 родов микроорганизмов и их доля составила 57,8%, тогда как у здоровых - только 5 (31%).
Staphylococcus spp., выделенные от больных, проявляли высокую КА в 1,9 раза чаще по сравнению со стафилококками, выделенных от здоровых (50,54,8% против 26,34,9%, р<0,05). Следует отметить, что S. warneri и S. aureus, выделенные от больных, в 2-5 раз чаще демонстрировали высокую КА в сравнении с нормобиоценотическими штаммами (6,52,4 % против 1,31,2% и 13,13,3% против 2,51,7% соответственно, р<0,05). Только в условиях патобиоценоза S. haemolyticus и S. pyogenes проявляли высокую КА (оба по 6,52,4%). У здоровых лиц, в 3-4 раза чаще высокой КА обладали штаммы S. salivarius, и S. mitis (12,53,7% против 2,81,6 % и 6,32,7% против 1,91,3% соответственно, р<0,05). Штаммы с индифферентной КА у здоровых лиц были представлены всеми родами, высевающимися из биотопа, а у больных - только 7-ю из 9-и.
Отмечено, что стрептококки, выделенные от здоровых, в 1,4 раза чаще обладали индифферентной КА, чем стрептококки, выделенные от больных (40,84,1% против 28,68,5%, р<0,05).
У больных хроническим тонзиллитом стимулирующее влияние на экспрессию патогенных и персистентных свойств симбионтов чаще всего оказывали штаммы с высокой КА (Staphylococcus spp., в т.ч. S. haemolyticus, S. aureus, S. intermedius и S. warneri; Streptococcus spp., в т.ч.S. pyogenes; Micrococcus spp.;
Aerococcus spp.; Enterobacteriaceae spp.; Enterococcus spp. и Moraxella spp.), в меньшей степени - со средней КА (Staphylococcus spp., в т.ч. S. haemolyticus, S. aureus, S. warneri,; Streptococcus spp., в т.ч. S. pyogenes; Micrococcus spp.;
Neisseria spp. и Klebsiella spp.).
Стимулирующее влияние на экспрессию патогенных и персистентных свойств симбионтов штаммов, выделенных со слизистых миндалин здоровых лиц отмечено всего в 13,4% (Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Aerococcus spp., Micrococcus spp. и Moraxella spp.) (рис. 5).
Рис. 5. Коммуникативная активность штаммов, изолированных со слизистой оболочки миндалин здоровых и больных лиц.
Эффект подавления персистентного и патогенного потенциала симбионтов (рис. 5) был наиболее заметен при анализе КА штаммов, выделенных со слизистых миндалин здоровых лиц (с высокой КА - непатогенные Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Aerococcus spp., Micrococcus spp. и Moraxella spp.).
У больных хроническим тонзиллитом подавление биологических свойств симбионтов отмечалось реже (рис. 5). Этот эффект был обусловлен действием штаммов как с высокой КА (Staphylococcus spp., в т.ч. S. haemolyticus, S. aureus и S. warneri; Streptococcus spp; Aerococcus spp. и Micrococcus spp.), так и с КА средней выраженности (Staphylococcus spp., в т.ч. S. haemolyticus, S. aureus и S. warneri и Streptococcus spp.).
Таким образом, структура микросимбиоценозов слизистых оболочек верхних дыхательных путей в норме и при тонзиллите имела принципиальные различия: в биотопах здоровых чаще встречались микроорганизмы с индифферентной КА, тогда как у больных лиц - с высокой и средней КА. При этом КА микроорганизмов, выделенных от здоровых лиц, реализовывалась преимущественно в подавлении патогенного и персистентного потенциалов симбионтов (34,2%), а от больных, напротив, в стимуляции (54,2%). Следует отметить, что высокой КА на слизистой миндалин у здоровых людей чаще обладали стрептококки, а у больных - стафилококки.
Сопоставление микробиоценозов двух биотопов - носа и миндалин позволило выявить, что у здоровых лиц на слизистой оболочке полости носа высокой и средней КА чаще обладали Staphylococcus spp. (р<0,05), а на слизистой оболочке миндалин - Streptococcus spp. (р<0,05). На слизистой носа больных стафилококки в 1,2 раза и клебсиеллы в 3-4 раза чаще были высоко- и среднеактивны (р<0,05), а на слизистой миндалин - стрептококки (р<0,05).
При сравнении групп штаммов с индифферентной КА в двух биотопах здоровых лиц, показано, что Streptococcus spp. в 2 раза чаще были индифферентны в биоценозе миндалин (р<0,05), а Micrococcus spp. - в полости носа (р<0,05). У больных на слизистой миндалин по сравнению со слизистой носа в 1,5 раза чаще были индифферентны Streptococcus spp. и Staphylococcus spp.
(р<0,05), тогда как Neisseria spp. и Enterococcus spp., наоборот, в 2,2 и 3,8 раз чаще проявляли индифферентную КА в полости носа (р<0,05). Enterobacteriaceae spp. не влияли на биологические свойства симбионтов только на слизистой носа.
Полученные результаты позволяют выделить два варианта структуры коммуникативных взаимоотношений в микросимбиоценозе (рис. 6).
Рис. 6. Схема. Варианты коммуникативных взаимоотношений в микросимбиоценозах.
При первом, нормобиоценотическом варианте, наблюдается доминирование индифферентных коммуникативных взаимодействий (55%), в меньшей степени - антагонистических (35%). Второй, патобиоценотический вариант, характеризовался превалированием синергидных коммуникативных взаимоотношений (55%) в ущерб индифферентным (23%) и антагонистическим (22%).
Сравнительная оценка динамики исследуемых микросимбиоценозов.
На заключительном этапе исследования проведена сравнительная оценка изменений, происходящие в микробиоценозах слизистых носа и миндалин у здоровых и больных хроническим тонзиллитом с течением времени.
Изучение резидентной микрофлоры показало, что в биоценозе слизистой оболочки полости носа больных стабильно сохранялось больше штаммов, чем в полости носа здоровых (43,54,2% против 30,63,8%, р<0,05). Противоположная картина наблюдалась в микросимбиоценозах миндалин. Микроорганизмы длительнее сохранялись у здоровых лиц, чем у больных (56,23,0% против 48,63,7%, р<0,05).
При сравнении двух биотопов в пределах каждой группы обследуемых нельзя не отметить, что независимо от состояния здоровья более стабильным был микробный состав биотопа миндалин, причем в норме различия были вы ражены сильнее, чем при патологии (56,23,0%% против 30,63,8%, р<0,05 у здоровых и 48,63,7% против 43,54,2% у больных). Данное обстоятельство может быть объяснено барьерфиксирующей функцией лимфоидной ткани миндалин, тогда как биоценоз полости носа в норме сильнее подвержен изменениям за счет большого объема воздуха, проходящего через него и происходящей бактерийной контаминацией.
На слизистой носа здоровых и больных не было различий в количестве различных видов микроорганизмов, сохранившихся в течение 4-х недель (рис.7). Однако у здоровых длительно сохранялись только КОС, тогда как у больных КОС и коагулазоположительные стафилококки (КПС). На слизистой миндалин у здоровых лиц чаще, чем у больных сохранялись стрептококки (51,7% против 33,4%, р<0,05) и представители остальных родов микроорганизмов (17,3% против11%, р<0,05), и реже - стафилококки (31% против 55,6%, р<0,05) (рис. 7). Причем к резидентным стафилококкам относились КОС, тогда как у больных тонзиллитом - КОС и КПС. На миндалинах здоровых лиц длительно сохранялись представители всех 10 видов стрептококков, высевающихся из данного биотопа, а на слизистой оболочке миндалин больных хроническим тонзиллитом только 5 из 8-и.
Рис. 7. Состав микроорганизмов, сохраняющихся 4 недели на слизистых оболочках полости носа и миндалин здоровых и больных лиц.
* - р<0,05 для различий между группами больных и здоровых ** - р<0,05 для различий между группами нос и миндалины В целом микосимбиоценозы слизистых носа и миндалин здоровых лиц имеют больше различий по таксономическому составу резидентной флоры, чем при патологии. Высокое сходство биотопов больных обуславливается наличием и длительным присутствием стафилококков на слизистой миндалин, тогда как в норме этот биотоп колонизируется стрептококками. Следует отметить, что видовой состав длительно сохраняющейся стафилококковой флоры на слизистых носа и миндалин больных был абсолютно идентичен, в обоих биотопах на протяжении 4-х недель сохранялись S. epidermidis, S. xylosus, S. hominis, S. aureus, S. haemolyticus и S. warneri.
Динамическое исследование коммуникативной структуры микробиоценозов слизистых ВДП в норме и при хроническом тонзиллите позволило установить, что для биотопов больных было характерно длительное сохранение штаммов, проявляющих высокую и среднюю КА, а для биотопов здоровых - индифферентную.
В микросимбиоценозе слизистой оболочки миндалин (рис. 8) у больных на протяжении 4-х недель сохранялась половина штаммов с высокой и 1/5 часть штаммов со средней КА, тогда как у здоровых высокоактивные штаммы сохранялись реже, а среднеактивные - элиминировались из биоценоза (рис. 9).
Штаммы, не влияющие на экспрессию факторов патогенности и персистенции симбионтов длительно сохранялись только у здоровых лиц.
На протяжении 4-х недель треть штаммов с высокой и средней КА сохранялась в биотопе слизистой носа больных (рис. 10), тогда как у здоровых высокоактивные штаммы сохранялись реже, а среднеактивные - не сохранялись.
Они элиминировались из биоценоза. Противоположная картина наблюдалась со штаммами, обладающими индифферентной КА. На слизистой носа здоровых на протяжении 4-х недель сохранилась четверть индифферентных штаммов, что в 2 раза выше, по сравнению с больными (рис.11).
При рассмотрении двух биотопов здоровых лиц отмечено, что на протяжении 4-х недель на миндалинах сохранилось больше штаммов с высокой КА (37,55,4% против 19,65,6%, р<0,05) и индифферентной КА (56,34,2% против 254,8%, р<0,05). Индифферентные штаммы чаще элиминировались со слизистой носа, чем миндалин (43,85,5% против 33,13,9%, р<0,05).
У больных более стабильна была структура микросимбиоценоза полости носа. В течение 4-х недель штаммы с индифферентной КА сохранялись только на слизистой носа, а штаммы со средней КА на слизистой носа сохранялись чаще, чем на миндалинах (34,57,8% против 204,6%, р<0,05). Наряду с этим, штаммы со средней и индифферентной КА чаще элиминировалось из биотопа слизистой миндалин, чем носа (606,9% против 41,49,1%; 89,35,8% против 65,97,1% соответственно, р<0,05).
0 1, 2, 3 4 0 1, 2, 3 недели недели Рис.9. Динамика штаммов с разным Рис.8. Динамика штаммов с разным уровнем КА на слизистой миндалин уровнем КА на слизистой миндалин здоровых лиц.
больных.
высокая КА средняя КА высокая КА средняя КА индифферентная КА индифферентная КА По оси ординат исходный уровень По оси ординат исходный уровень штаммов с соответствующей КА, штаммов с соответствующей КА, принятый за 100%.
принятый за 100%.
0 1, 2, 3 0 1, 2, 3 недели недели Рис.11. Динамика штаммов с разным Рис.10. Динамика штаммов с разным уровнем КА на слизистой носа уровнем КА на слизистой носа здоровых лиц.
больных.
высокая КА средняя КА высокая КА средняя КА индифферентная КА индифферентная КА По оси ординат исходный уровень По оси ординат исходный уровень штаммов с соответствующей КА, штаммов с соответствующей КА, принятый за 100%.
принятый за 100%.
Таким образом, элиминация штаммов с высокой и средней коммуникативной активностью со слизистых здоровых людей может расцениваться как один из механизмов поддержания стабильности микросимбиоценоза верхних дыхательных путей. Постоянство состава микробного сообщества слизистых полости носа и миндалин при хроническом тонзиллите, по-видимому, поддерживается за счет элиминации изолятов, не влияющих на биологические свойства симбионтов, как не вносящих существенный вклад в пролонгацию инфекционного процесса.
При рассмотрении направленности действия длительно сохраняющихся штаммов, отмечено, что в полости носа здоровых 100% высокоактивных штаммов снижают проявления агрессии, а в полости носа больных, 906,7% высокоактивных и 6015,5% среднеактивных штаммов усиливают экспрессию факторов патогенности и персистенции микросимбионтов. На слизистой оболочке миндалин наблюдалась аналогичная картина. У здоровых лиц 86,76,2% высокоактивных штаммов ослабляло, а у больных 864,9% высоко- и 7014,5% среднеактивных штаммов усиливало патогенный и персистентный потенциал симбионтов.
При сравнении биотопов слизистой полости носа и слизистой миндалин как у здоровых, так и у больных лиц достоверных различий в направленности действия длительно сохраняющихся штаммов не выявлено.
Оценивая результаты работы в целом, следует подчеркнуть, что микробные биоценозы ВДП являются сложной динамической структурой, в состав которой входят резидентные и транзиторные микроорганизмы. В норме биотоп слизистой оболочки полости носа и слизистой оболочки миндалин колонизируется различными видами индигенной микрофлоры, характеризующейся достаточно большим видовым разнообразием и специфичностью для каждого биотопа и обладающей в обоих биотопах преимущественно индифферентным влиянием на факторы патогенности и персистенции симбионтов или подавляет их экспрессию. В биотопах больных хроническим тонзиллитом, напротив, присутствует патогенная и условно-патогенная микрофлора, которая активно влияет на экспрессию факторов патогенности и персистенции симбионтов, усиливая их. При развитии хронического тонзиллита отмечается снижение видового богатства микросимбиоценозов и сглаживание различий между микрофлорой миндалин и носа.
ВЫВОДЫ 1. Микробиоценозы слизистых носа и миндалин при хроническом тонзиллите характеризовались высокой степенью сходства по родовому составу микрофлоры и по видовому составу стафилококков, количественно преобладающих в обоих биотопах. В бактериальных сообществах на слизистых носа здоровых лиц доминировали стафилококки (55,8 %), а на слизистых миндалин чаще встречались стрептококки (45,7 %).
2. Микроорганизмы, выделенные со слизистой носа при хроническом тонзиллите в сравнении с микрофлорой здоровых лиц чаще обладали лецитиназной и антилизоцимной активностями, а со слизистой миндалин - еще и гемолитической и лизоцимной активностями (р<0,05).
3. При нормобиоценотическом варианте наблюдалось доминирование индифферентных коммуникативных взаимодействий (55 %), в меньшей степени - антагонистических (11 %) реализующихся в подавлении патогенного и персистентного потенциалов симбионтов. При развитии патобиоценоза отмечалось превалирование синергидных коммуникативных взаимоотношений (55 %), направленных на стимуляцию патогенных и персистентных свойств других участников микробного сообщества.
4. Резидентные штаммы у здоровых лиц были представлены Streptococcus spp. и непатогенными стафилококками. В биоценозах больных на миндалинах и на слизистой носа резидентные штаммы представлены, помимо нормальной микрофлоры (Streptococcus spp. и Staphylococcus spp.), видами S. aureus, S. haemolyticus.
5. Структура микробиоценозов слизистых миндалин, независимо от состояния здоровья, более стабильна, чем микробные сообщества слизистой носа.
У здоровых лиц чаще длительно сохранялись микроорганизмы с низкой коммуникативной активностью, а у больных тонзиллитом - с высокой. Резидентные высокоактивные штаммы в биоценозах здоровых лиц преимущественно снижали патогенный и персистентный потенциал микросимбионтов, а в биотопах больных - его увеличивали.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Исследование микробиоценозов слизистой оболочки носа и миндалин как один из показателей здоровья / Л.М. Хуснутдинова, Б.Я. Усвяцов, Ю.В.
Соболева, О.В. Бухарин // Гигиена и санитария.-2009.- №4.- С.80-82.
2. Соболева Ю.В. Особенности формирования микробиоценозов верхних дыхательных путей здоровых людей/ Ю.В. Соболева // Информационный архив. Медицина, биология, образование.- 2010.- Т. 4, №2.-С. 29-30.
3. Соболева Ю.В. Характеристика микробиоценозов верхних дыхательных путей при хронических заболеваниях ЛОР органов/ Ю.В. Соболева, Б.Я.
Усвяцов, Ю.А. Хлопко // Журнал инфекционной патологии.- 2010.- Т. 17, №3.-С. 130-131.
4. Соболева Ю.В. Особенности динамики иерархической структуры микробиоценозов верхних дыхательных путей в норме и при патологии / Ю.В.
Соболева // Вестник Оренбургского государственного университета.2011.- №4.-С. 54-56.
5. Соболева Ю.В. Популяционно-коммуникативный подход в изучении микросимбиоценозов верхних дыхательных путей в норме и при патологии/ Ю.В. Соболева // Вестник уральской медицинской академической науки.- 2011.- Т.38, №4/1.- С. 53.
6. Динамика микросимбиоценозов верхних дыхательных путей в норме и при патологии / Ю.В. Соболева, Б.Я. Усвяцов, Ю.А. Хлопко, О.В. Бухарин // Журн. микробиол., эпидемиол, и иммунобиол., 2012. №3. С. 55-61.
СОБОЛЕВА ЮЛИЯ ВИКТОРОВНА Структурно-функциональная характеристика микросимбиоценозов верхних дыхательных путей человека Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук _______________________________________________________________________ Оригинал макет подготовлен в программе Microsoft Office Word 20Подписано в печать 9.09.20Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 1,0. Печать оперативная.
Бумага офсетная. Гарнитура Times.
Тираж 100 экз.