СТРУКТУРНАЯ РЕОРГАНИЗАЦИЯ СЛУХОВОЙ КОРЫ ПРИ ВИСОЧНОЙ ЭПИЛЕПСИИ 03. 00. 25 - гистология, цитология, клеточная биология А В Т О Р Е Ф Е Р А Т диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Владивосток

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по разное

На правах рукописи

ДУДИНА Юлия Викторовна

СТРУКТУРНАЯ РЕОРГАНИЗАЦИЯ СЛУХОВОЙ КОРЫ ПРИ ВИСОЧНОЙ ЭПИЛЕПСИИ

03. 00. 25 - гистология, цитология, клеточная биология

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Владивосток - 2008

Работа выполнена в ГОУ ВПО Владивостокском государственном медицинском университете Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Мотавкин Павел Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинский наук, профессор Рыжавский Борис Яковлевич

доктор медицинских наук, профессор Елисеева Екатерина Валерьевна

доктор медицинских наук Кириллов Олег Иванович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Ярославская государственная

медицинская академия Росздрава

Защита состоится л_______________________2008 года в л____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при ГОУ ВПО Владивостокский государственный медицинский университет Росздрава по адресу: 690950, г. Владивосток, пр. Острякова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан л____ _________ 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Доктор медицинских наук, профессор Рева Г.В.

Актуальность проблемы. Несмотря на достижения современных нейронаук остается открытым вопрос о патогенезе синдрома гипервозбудимости при эпилептическом поражении головного мозга у человека. Статистика указывает на непрерывный рост заболеваемости эпилепсией и закономерное преобладание парциальных припадков над первично-генерализованными.

Согласно данным Гехт и соавт. (2006) стандартизированная по полу и возрасту взрослого населения распространенность эпилепсии в России составляет 3,39 человек на 1000 населения. Среди выявленных пациентов 82,47% страдают фокальными синдромами эпилепсии (Мухин, Петрухин, 2005; Зенков, 2002; Henshall, 2007). При хирургическом лечении фармакорезистентных форм эпилепсий в 94,6% случаев очаг эпилептиформной активности локализуется в височной доле (Гайкова, 2001).

Механизмы эпилептогенеза в новой коре развиваются в условиях повышенной эффективности глутаматергической трансмиссии пирамидных клеток при снижении ГАМК-ергической активности тормозных интернейронов: корзинчатых клеток, клеток-канделябров и нейроглиеформных клеток (Дудина и др., 2006). Поврежденные (лэпилептизированные) пирамидные нейроны генерируют сверхмощное возбуждение, которое реализуется в избыточной выработке глутамата и экстрасинаптической диффузии медиатора. В свою очередь, цитотоксическое действие возбуждающих аминокислот ведет к истощению ГАМК-ергических интернейронов, не способных ингибировать объёмный пул глутаматергической медиации (Dalby, Mody, 2001). В последние годы разработаны эффективные модели для изучения нейрофизиологических основ эпилепсии у человека. Результаты этих исследований свидетельствуют об изменении формы нейронов после генерации эпилептической активности и о разной чувствительности нейрохимических паттернов клеток к эпилептогенным веществам.

Гиперпродукция глутамата и его токсическое влияние на клетки-мишени со стороны патологически расторможенных пирамидных клеток инициируют нейродеструктивные процессы в эпилептическом очаге, которые реализуются посредством образования свободных радикалов, перекисного окисления липидов и индукции NO-синтазы. Чрезвычайно токсичным для нейронов остаются дериваты NO, особенно его недоокисленные продукты и пероксинитриты (Bao, Liu, 2003). Их накопление усиливает цитотоксические эффекты свободных радикалов с непременным развитием некроза и апоптоза нервных клеток, находящихся в зоне эпилептического повреждения. Исследование этих особенностей дает ключ к пониманию важнейших феноменов, ведущих к развитию эпилепсии.

Структурная реорганизация корковых нейронов вследствие перевозбуждения сводится к метаболическим изменениям цитоплазмы и синапсомодификации (Morris et al., 2006). Ранним признаком этого процесса является появление в дендритах включений различной степени плотности. Структурные изменения в фокусе ишемии показывают наличие неспецифических дистрофических и некротических изменений нейронов и синапсов, очаговые выпадения клеток, нейронофагии, разрежение нейропиля и глиоз. При эпилептическом статусе в височной коре крыс постоянно обнаруживается интенсивная реакция зрелых астроцитов с иммунореактивным глиальным кислым фибриллярным белком. Выработка белка является маркером раздраженных клеток, обычно сопровождается активацией трофических факторов, защищающих астроциты и нейроны от перевозбуждения и гибели (Hanbury et al., 2003; Дудина, 2003).

Протективные механизмы коры включают утилизацию глутамата глиальными клетками, индукцию нейрональной формы NO-синтазы, супероксиддисмутазы, нейротрофинов и антиапоптотических ферментов. На уровне отдельных нейронов и синапсов эти механизмы реализуются через локальную регуляцию гемодинамики, которую опосредуют нейровазальные мессенджеры и нейротрансмиттеры. Баланс нейротоксического и цитопротективного эффектов определяет избирательную устойчивость отдельных хемотипов нейронов к эпилептическому перевозбуждению и окислительному стрессу, что в перспективе может служить основой для разработки направленной фармакологической коррекций этих нарушений.

Диагностика нейронных структур, метаболизирующих NO и свободные радикалы, ведет к выяснению механизмов, возникающих при взаимодействии между синаптической медиацией определенных нейроанатомических паттернов и окислительным стрессом, что, вероятно, позволит вскрыть ключевые связи, которые развиваются в новой коре в период становления эпилептической активности. Перспективность этого направления связана также с выяснением динамики апоптоза корковых нейронов и его патогенетического значения при эпилепсии.

Целью настоящей работы является исследования гистофизиологии слуховой коры при парциальной эпилепсии и установление роли апоптоза и окислительного стресса в механизмах эпилептогенеза.

Задачи исследования:

Установить значение структурных изменений внутримозговых сосудов при эпилепсии.
Исследовать гистофизиологию нейронов и глии и участие апоптоза в развитии феномена гипервозбудимости при эпилепсии.
Исследовать топохимическое распределение конститутивной и индуцибельной NO-синтаз и кальций-связывающих белков в эпилептических очагах.
Изучить изменение активности гидролаз (кислой и щелочной фосфатазы) и оксиредуктаз (цитохромоксидазы и сукцинатдегидрогеназы) как возможно наиболее ранних признаков поражения нейронов при развитии эпилептогенеза.
Исследовать миелиновые волокна в зонах белого вещества, прилежащих к эпилептическому очагу.
На основе собственных и литературных данных обосновать патогенетическое значение структурной реорганизации слуховой коры, апоптоза и оксида азота в развитии височной эпилепсии.

Научная новизна и теоретическое значение работы: а) впервые на материале височной коры человека проведен комплексный анализ локализации и активности ферментов, запускающих механизмы окислительного стресса и цитотоксичности от эпилептического перевозбуждения; б) изучено состояние оксиредуктаз и гидролаз в эпилептических нейронах; в) проведен анализ участия ГАМК/NO-ергических нейронов неокортекса в формировании судорожной реакции; г) проведена иммуноцитохимическая диагностика кальций-связывающих белков - кальретинина, кальбиндина и парвальбумина - в височной коре крыс с каинат-индуцированной эпилепсией, установлена нейрохимическая гетерогенность ГАМК-ергических корковых нейронов и дана их детальная количественная характеристика; д) описаны морфологические изменения внутримозговых сосудов в эпилептогенном фокусе и в зоне его проекции, а электронномикроскопическое исследование капилляров и гистохимическое выявление щелочной фосфатазы в микрососудах позволило установить характер поражения микроциркуляторного русла при парциальной эпилепсии у человека и экспериментальных животных; е) впервые на материале головного мозга человека и крысы описана динамика апоптоза корковых нейронов при судорожном синдроме; ж) впервые установлено наличие индуцибельной NO-синтазы в пирамидных нейронах эпилептогенного очага у человека при парциальной эпилепсии; з) исследованы глиальные реакции серого и белого вещества головного мозга человека и крысы в проекции эпилептогенного очага.

Полученные данные позволяют дополнить существующие концепции коркового эпилептогенеза. Выявленные изменения состояния NADPH-диафоразы, индуцибельной NO-синтазы и цитохимических маркеров ГАМК-ергической нейропередачи достаточно объективно свидетельствуют о прямом и неоднозначном влиянии оксида азота на дискретные хемотипы нейронов. Данные по апоптозу поврежденных корковых нейронов у человека являются приоритетными. Результаты работы важны для обоснования закономерностей, лежащих в основе формирования эпилептического статуса и разработки препаратов его фармакологической коррекции.

Практическая ценность работы: Полученные данные о значении апоптоза и окислительного стресса в развитии височной эпилепсии могут быть использованы в различных областях медицинской науки: нейрохимии, психофармакологии, психиатрии, клинической и экспериментальной неврологии и токсикологии. Эти результаты важны для выяснения патогенетических механизмов височной эпилепсии, а также для поиска и оценки фармакологических протекторов направленного действия.

Положения, выносимые на защиту:

Структурные изменения при локализации эпилептогенного очага в височной доле происходят в артериях, венах и капиллярах.
Эпилептический очаг височной коры формируется не только в результате альтерации NO-ергических интернейронов, но и за счет повреждения пирамидных нейроцитов при индукции в них нитроксидсинтазы. Гибель нервных клеток происходит путем некроза и апоптоза.
При синдроме гипервозбудимости отмечается раннее статистически достоверное изменение активности гидролаз (кислой и щелочной фосфатазы) и оксиредуктаз (цитохромоксидазы и сукцинатдегидрогеназы).
Характер поражения NO-ергических тормозных интернейронов обусловлен содержанием в них различных кальций-связывающих белков (парвальбумина, кальретинина и кальбиндина).
Эпилептическое поражение сопровождается демиелинизацией аксонов белого вещества головного мозга в проекции очага гипервозбудимости.
Эпилептический очаг характеризуется выраженным глиозом белого и серого вещества, а астроциты экспрессируют NO-синтазу и NADPH-диафоразу.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на I Тихоокеанской научно-практической конференции с международным участием, г. Владивосток, 2000; Международном симпозиуме Сознание и наука: взгляд в будущее, г. Владивосток, 2000; конференции Института мозга РАМН Организация и пластичность коры больших полушарий головного мозга, г. Москва, 2001; 4-ом Международном конгрессе по интегративной антропологии, г. Санкт-Петербург, 2002; Международной конференции, посвященной 150-летию со дня рождения А.С. Догеля, г. Томск, 2002; Международной научной конференции Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере, г. Сургут, 2002; IV Тихоокеанской научно-практической конференции с международным участием, г. Владивосток, 2003; конференции: Механизмы синаптической пластичности. Структурно - функциональные основы организации мозга в норме и патологии, г. Москва, 2004; I Международной научно-практической конференции Научный потенциал мира 2004, г. Днепропетровск, 2004; Международном конгрессе по клинической патологии, Таиланд, 2005; Первом и Втором Международных Междисциплинарных Конгрессах Достижения нейронауки для современной медицины и психологии, Судак, Крым, Украина, 2005, 2006; VIII Конгрессе Международной ассоциации морфологов, г. Орёл, 2006; IX Конгрессе Международной ассоциации морфологов, г. Бухара, Узбекистан, 2008.

Публикация результатов работы. По теме диссертации опубликовано: 1 монография и 29 статей в отечественных и международных журналах и сборниках.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 6 глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Объём диссертации составляет 293 страницы машинописного текста. Иллюстративный материал включает 21 таблицу, 18 рисунков и 211 микрофотографий. Библиографический указатель включает 427 источников. Диссертация изложена на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная часть работы состояла в комплексном исследовании состояния нейронов височной коры человека и крыс в условиях эпилептической гипервозбудимости и оксислительного стресса. Для этого нейроны идентифицировали в соответствии с их морфологическим типом, медиаторной и нейрохимической специализацией. Определяли изменения активности NADPH-диафоразы, индуцибельной NO-синтазы (iNOS), кальбиндина, кальретинина, парвальбумина, кислой и щелочной фосфатаз, сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы, а затем исследовали апоптотический индекс корковых нейронов в фокусах эпилептического повреждения. Топографию нейронов, полученных на срезах, обработанных гисто- и иммуноцитохимическими методами, сопоставляли с соответствующими рисунками и схемами стереотаксических и цитоархитектонических атласов (Mannen, 1988; Paxinos, Watson, 1998; Светухина, 1962) и цитоархитектонического атласа коры больших полушарий человека, изданного Институтом мозга РАМН. Мякотные волокна исследовали на фронтальных и сагиттальных срезах белого вещества головного мозга человека и крысы в проекции эпилептогенного очага. Сосудистое русло височной коры крысы и человека исследовали с помощью рутинных гистологических методик и гистохимии кислой и щелочной фосфатаз.

Основной раздел работы составили исследования, выполненные на материале 35 нелинейных крысах-самцах массой 250-300 г, содержащихся в стандартных условиях вивария и аутопсийном материале мозга четырех людей, имевших в анамнезе височную форму эпилепсии.

Животных содержали в виварии в соответствии с Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (от 6.04.1993г.). Кормили в соответствии с нормами, утвержденными приказом МЗ СССР от 10.03.1996 г. № 163. Все эксперименты выполнены в соответствии правилами бережного обращения с лабораторными животными в соответствии с Приложением 4 к приказу № 755 МЗ СССР. Исследования начинали через 10-15 минут после забоя.

Образцы мозга человека получили при патологоанатомических вскрытиях трупов лиц (3-е мужчин и 1 женщина) в возрасте 63, 37, 43 и 34, лет, имевших в анамнезе височную эпилепсию (протоколы вскрытия № 391 от 17.10.06; № 187 от 21.11.06; № 189 от 23.11.06; № 93 от 02.12.2006).

Мужчина, 63 года. В анамнезе 9 лет назад тяжелая черепно-мозговая травма, в результате которой развилась симптоматическая эпилепсия с височной локализацией эпилептического очага справа (по данным ЭЭГ). Нерегулярно принимал бензонал, без эффекта. Отмечалась склонность к статусному течению заболевания. Смерть больного наступила после приема алкоголя в результате тотального геморрагического панкреонекроза, осложнившегося ферментативным и гнойно-геморрагическим перитонитом.

Мужчина, 37 лет. В течение 12 лет страдал психомоторными пароксизмами на фоне сохранного сознания, отмечались слуховые галлюцинации, явления ранее виденного, слышанного, приступы сопровождались явлениями деперсонализации и дереализации. На ЭЭГ - очаг эпилептифомной активности в височных отведениях слева. На МРТ - артериальная аневризма средней мозговой артерии слева. Смерть больного наступила в результате разрыва аневризмы и кровозлияния в левую гемисферу с прорывом в боковые желудочки.

Мужчина, 43 года. В анамнезе в 1994 году тяжелая черепно-мозговая травма с потерей мозгового вещества, ушиб головного мозга, перелом костей основания черепа. В последствии развилась битемпоральная посттравматическая парциальная эпилепсия с частыми полиморфными припадками. У врача наблюдался, лечение получал (вальпроаты). Смерть больного наступила в результате инфаркта миокарда передне-перегородочного отдела стенки левого желудочка сердца, тромбоза передней нисходящей ветви левой венечной артерии.

Количество наблюдений, выполненных различными методами

Серии экспериментов	Количество наблюдений
Серии экспериментов	А	Б	В	Г	Д
Контрольные животные				5
Каинатная модель эпилептогенеза					30
Импрегнация по методу Гольджи	4	5	3	4	26
Импрегнация по методу Кахаля	4	5	4	5	25
Окрашивание гематоксилином-эозином	4	5	5	4	21
Окрашивание железным гематоксилином	4	5	5	4	21
Окрашивание по методу Романовского-Гимза	4	5	5	4	21
Окрашивание по методу Ниссля	4	5	5	5	30
Окраска мякотных оболочек по Лизону и Даньелю	4	5	2	5	25
Выявление дегенерирующих мякотных нервных волокон по методу Марки	4	5	2	5	25
Иммуноцитохимия iNOS	4	5	4	5	25
Гистохимия NADPH-d	4	5	3	5	30
Гистохимия кислой фосфатазы				5	25
Гистохимия щелочной фосфатазы	4	5	5	5	25
Гистохимия сукцинатдегидрогеназы				5	25
Гистохимия цитохромоксидазы				5	25
Иммуноцитохимия кальретинина, кальбиндина, парвальбумина				5	25
Иммуноцитохимическое определение апоптоза (метод TUNEL)	4	5	5	5	30
Окрашивание по методу Браше	4	5	5	5	30
Электронная микроскопия	4	3	1	1	5
Всего	183			556
Всего	739

А - материал мозга человека с височной эпилепсией; Б - контроль: височная кора человека; В - контроль - зрительная кора человека; Г - крысы (контроль); Д - крысы с каинат-индуцированной эпилепсией.

Женщина, 34 года. С детства страдала простыми и сложными парциальными эпилептическими припадками со вторичной генерализацией. На ЭЭГ - фокус эпилептиформной активности в правой височной доле. КТ - каротидно-кавернозное соустье справа с аневризматически расширенными сосудами. Наблюдалась в поликлинике по месту жительства с диагнозом: симптоматическая (каротидно-кавернозное соустье справа с аневризматически расширенными сосудами) парциальная эпилепсия с частыми полиморфными припадками с височной локализацией эпилептического очага справа, получала вальпроаты, лечение с незначительным эффектом. В декабре 2006 года больная доставлена в стационар в тяжелом состоянии. Выражена неврологическая симтоматика. Состояние без положительной динамики. Констатирована биологическая смерть. На патологоанатомическом вскрытии обнаружено субарахноидально-паренхиматозное кровоизлияние вследствие разрыва аневризмы с образованием внутримозговой гематомы в правой височно-теменной области, размерами 10*7*14 см, с прорывом крови в правый боковой желудочек и дно IV желудочка, осложнившийся отеком и дислокацией головного мозга.

Материал мозга человека (верхняя височная извилина и поперечные височные извилины правого и левого полушарий) исследовали не позднее 3-6 часов после наступления смерти. Для контроля использовали зрительную кору больных эпилепсией и материал мозга 5 человек, погибших в результате дорожно-транспортных происшествий, полученный при судебно-медицинских вскрытиях (височная и зрительная кора). Материал мозга человека исследовали в соответствии с законом РФ о погребении и похоронном деле от 08. 12. 95. Приложение 2. ст. I2; законом РФ о трансплантации органов и (или) тканей человека. 1992; основами законодательства РФ об охране здоровья граждан. 1993; методическими рекомендациями о консервировании трупов и отдельных органов в учебных целях (утверждены МЗ СССР) / Под ред. Г. В. Ковешникова, М.Г. Привеса. МР. Санина и др. М, 1948. - 15 с.; постановлении Совмина СССР N 630 oт 10 авг. 1972 г. (о передаче трупного материала и безродных трупов из лечебных учреждений институтам для учебных и научных целей; приказом МЗ СССР N 318 от 31 марта 1981 г. (о предоставлении права больницам, психоневрологическим интернатам, домам хроников, инвалидов и престарелых передавать трупы, не востребованные в течение 72 часов после смерти, институтам для учебных и научных целей).

Формирование феномена гипервозбудимости

Формирование локальных очагов перевозбуждения корковых нейронов вызывали путем введения раствора каиновой кислоты - селективного агониста одноименных глутаматных рецепторов. Каинат оказывает проконвульсантное действие и одновременно при экзогенном подведении выступает как нейродеструктивный фактор, который потенцирует возникновение феномена цитотоксичности. Избирательное действие каината на глутаматные рецепторы реализуется в формировании стойких очагов эпилептиформной активности, которые на поведенческом уровне проявляются в виде судорог, агрессии, адипсии и афагии.

Каиновую кислоту (Sigma) вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг каждый час до наступления эпилептического статуса. Через 1,5 часа судорожного синдрома, соответствующего статусу, крысам вводили диазепам в дозе 4 мг/кг. Животных умерщвляли через 2,5 часа, на 1, 3, 5, 7 и 21 сутки посредством передозировки эфирного наркоза. Мозг извлекали на стекло и обрабатывали для гистохимических и иммуноцитохимических исследований.

Височная (слуховая) область новой коры у крыс соответствует координатам в положении брегма от -5.3 мм до -6.3 мм. Срезы изготавливали в поперечной и сагиттальной плоскостях, принимая во внимание различную ориентацию исследуемых клеток в трехмерном пространстве коры. Морфологические изменения нейронов в очагах эпилептического повреждения изучали с помощью метода Гольджи и Кахаля. Для уточнения топологии и соматодендритной морфологии клеток, часть срезов височной коры докрашивали толуидиновым синим по методу Ниссля, гематоксилином-эозином, железным гемптоксилином и по методу Романовского-Гимза. Нейроны с препаратов, обработанных красителями, зарисовывали с помощью рисовального аппарата (camera lucida). В некоторых случаях применялась трехмерная реконструкция и компьютерное моделирование окрашенных клеток.

Морфологические методы исследования

Рутинные гистологические методики

Для подсчета клеток в срезах ткани мозга и распределения их по слоям использовали ряд рутинных гистологических методик: окраска по Нисслю, гематоксилином-эозином, по Романовскому-Гимза, железным гематоксилином Вейгерта и метиловым зеленым по методу Браше.

Импрегнация по методу Гольджи в модификации Бюбенета

В работе использован метод Гольджи в модификации Бюбенета на кусочках ткани мозга. Головной мозг фиксировали 2 сут в 4% растворе параформальдегида. Кусочек, положенный на вату, экспонировали 2 дня в 2.5% растворе бихромата калия при 37С. Блок обсушивали фильтровальной бумагой, споласкивали 2% раствором азотнокислого серебра и помещали в такой же раствор при температуре 37С на 2-4 дня. По окончании импрегнации образцы обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в парафин. На ротационном микротоме готовили серийные фронтальные срезы толщиной 10-50 мкм. Срезы монтировали на предметные стекла и заключали в бальзам.

Импрегнация по методу Кахаля

Материал фиксировали 24 часа в 96 спирте, после чего разрезали его на кусочки толщиной 2,5-3 мм. Их импрегнировали в 1,5% растворе азотнокислого серебра 7 дней при температуре 32С. Ополаскивали дистиллированной водой 1 мин и восстанавливали 24 часа в смеси: 1,5 г гидрохинона, 5 см3 нейтрального формалина и дистиллированной воды до 100 см3. Ополаскивали в течение 5 мин в дистиллированной воде, быстро обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в парафин. Готовили серийные фронтальные срезы толщиной 30-50 мкм.

Окраска мякотных оболочек по Лизону и Даньелю

Кусочки мозга фиксировпали в нейтральном формалине 1:9 3 дня, затем промывали в дистиллированной воде, погружали в 50 и 70 спирты по 1 мин. Далее образцы окрашивали в свежефильтрованном насыщенном растворе судана черного в 70 спирте 15 часов в хорошо закрытой чашке, промывали в дистиллированной воде и заключали в глицерин-желатину.

Выявление дегенерирующих мякотных нервных волокон по методу Марки

Кусочки фиксированного мозга клали на вату и помещали в большое количество жидкости Мюллера. Жидкость в первую неделю сменяли каждые 2 дня, затем каждую неделю. Продолжительность обработки составила 3 недели. Затем материал разделяли на пластинки толщиной 1-3 мм, накладывали друг на друга, а между ними прокладывали по несколько слоев фильтровальной бумаги и помещали в широкую склянку с притертой пробкой, наполненную смесью Марки (2 части жидкости Мюллера, 1 часть 1% осмиевой кислоты) на 14 дней. Материал извлекали, промывали водопроводной водой 1-2 дня, затем 3 часа в дистиллированной воде. Кусочки обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, заливали в парафин и готовили серийные фронтальные срезы толщиной 30 мкм.

Гистохимические методы исследования

Гистохимия NADPH-диафоразы

Гистохимическая реакция локализации активности нейрональной NADPH-d (нейрональной NOS) основана на образовании формазана в присутствии экзогенного NADPH (Hope and Vincent, 1989). Мозг разрезали на части толщиной до 5 мм и фиксировали 1 час при температуре 4С в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7,4), после чего промывали в 15% растворе сахарозы в течение 2 суток с 7-8-кратной сменой раствора. Кусочки замораживали в криостате, где изготавливали срезы толщиной 20-30 мкм, которые монтировали на предметные стекла и высушивали в токе холодного воздуха, подаваемом вентилятором. Высушенные срезы помещали в инкубационную среду и термостатировали 1 час при 37 С. Состав инкубационной среды был следующим: 50 мМ Трис-буфер, 0,2% Тритон X-100 (Sigma), 0,8 мг/мл -NADPH (Sigma), 0,4 мг/ мл НСТ; рН 8,0 (Hope, Vincent, 1989). После инкубации срезы 3-х-кратно промывали в дистиллированной воде, обезвоживали в спиртах и заключали в бальзам.

Интенсивность окрашивания нейроцитов соответствует активности выявляемого энзима и позволяет выделить три группы NADPH-d-позитивных клеток с высокой, умеренной и очень низкой активностью фермента.

Метод выявления щелочной фосфатазы по Гомори

Небольшие кусочки ткани фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине 10 часов при температуре 4С. Криостатные срезы толщиной 15-25 мкм, монтировали на предметные стекла, высушивали и инкубировали в течение 2 часов при температуре 37С в среде следующего состава: 3%-ный натрий-β-глицерофосфат - 10 мл, 2%-ный веронал-натрий - 10 мл, 2%-ный CaCl2 - 20 мл, 5%-ный сульфат магния - 1 мл, дистиллированная вода - 5 мл (pH 9,4 - для выявления капилляров; рН 7,6 - для выявления фермента в нейронах).

После инкубации срезы промывали в дистиллированной воде, обрабатывали 2%-ным раствором нитрата кобальта. После повторной промывки в дистиллированной воде на срезы наносили 1%-ный раствор сульфида аммония на 20-30 сек. Затем срезы обезвоживали, просветляли в ксилоле и заключали в бальзам по общепринятой методике. Контрольные срезы для фосфатаз инкубировались в среде без -глицерофосфата.

Метод выявления кислой фосфатазы по Гомори

Небольшие кусочки ткани фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине 10 часов при температуре 4С. Криостатные срезы толщиной 15-25 мкм, монтировали на предметные стекла, высушивали и инкубировали в течение 2 часов при температуре 37С в среде следующего состава: ацетатного буфера (рН 4,7) - 12 мл, 0,1 М раствор азотнокислого свинца - 10 мл, дистиллированная вода - 74 мл, 3,2 %- ный натрий-β-глицерофосфат - 4 мл.

Инкубировали 24 часа в термостате при 37С. Затем промывали в воде, далее 2 минуты в растворе сульфида натрия и снова в воде. Затем срезы обезвоживали, просветляли в ксилоле и заключали в бальзам по общепринятой методике.

Метод выявления сукцинатдегидрогеназы

Сукцинатдегидрогеназа определялась по методу Нахласа (Пирс, 1962) с НСТ при рН - 7,6. Свежезамороженные срезы инкубировались в среде по прописи Пирса. После фиксации в 10% формалине срезы заключались в глицерин-желатину. Синий осадок формазана в виде гранул свидетельствует о наличии фермента, который выявляется в цитоплазме клеток. Контрольные срезы инкубировались в среде, лишенной сукцината, или предварительно нагревались до 100С в течение 1 минуты для инактивации фермента.

Метод выявления цитохромоксидазы

Цитохромоксидаза определялась по методу Нахласа. Использовались свежезамороженные срезы, инкубированные в парафенилендиамине с НСТ на фосфатном буфере с рН 7,4. Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего заключались в глицерин-желатину. Реакция оценивалась по наличию гранул фиолетового или синего цвета, указывающие на активность фермента. Контрольные срезы предварительно обрабатывались горячей водой.

Иммуноцитохимические методы исследования

Иммуноцитохимия индуцибельной NO-синтазы

окализацию активности iNOS выявляли с использованием поликлональных антител (Sigma) и набора реактивов для иммунопероксидазной реакции (Immuno-detection kit, ICN). Материал фиксировали в течение суток при 4С в 10% нейтральном формалине. Из залитого в парафин материала готовили срезы толщиной 10 мкм. Депарафинированные срезы промывали в течение 5 минут в трис-HCl-буфере (pH 7,6) и в течение 20 минут обрабатывали смесью 50% этанола и 0,3% перекиси водорода для блокирования неспецифического фона эндогенной пероксидазы.

Срезы височной коры выдерживали в течение 3-4 ч при 4С в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4), содержащем 3% нормальную сыворотку козы и 0,25% Тритон Х-100. Затем на срезы наносили поликлональные первичные антитела против iNOS (ICN) в разведении 1:200, инкубировали в течение 48 ч при 4С, после чего промывали в трех порциях фосфатного буфера по 5 мин в каждой смене раствора. После промывки срезы инкубировали в течение 1 ч с биотинилированными вторичными антителами против Ig кролика, выработанных у козы, в разведении 1:100 (Vector Laboratories), а затем в растворе авидин-пероксидазного комплекса (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories) также в течение 1 ч. Обработку заканчивали выявлением пероксидазы АВС-комплекса с помощью 0,03%-го раствора диаминобензидина и 0,001%-ой перекиси водорода в 50 мМ Трис-HCl-буфере (рН 7,4) в течение 10-20 мин. Затем срезы тщательно отмывали в фосфатном буфере, обезвоживали и заключали в бальзам по общепринятой методике. В качестве контроля из среды исключали первичные антитела, окрашивание клеток отсутствовало.

Иммуноцитохимия кальций-связывающих белков

Типологическую и нейрохимическую гетерогенность корковых нейронов изучали с помощью иммунореактивных кальций-связывающих белков кальретинина, кальбиндина и парвальбумина.

Мозг извлекали на стекло, кору разрезали на кусочки размером 1х0,5 см фиксировали в в течение 10-12 часов при 4С в смеси 2% параформальдегида и 0,2% глутаральдегида. После фиксации образцы промывали в забуференном 30% растворе сахарозы в течение 12-24 часов при 4С. Срезы толщиной 25-40 мкм изготавливали во фронтальной и сагиттальной плоскостях на замораживающем микротоме и помещали в фосфатный буфер. Иммуноцитохимическое окрашивание срезов включает несколько последовательных этапов: преинкубация, обработка в растворе первичных антител, обработка вторичными антителами и постановка иммунопероксидазной реакции.

Для преинкубации свободно плавающие срезы выдерживали в течение 3-4 часов при 4С в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 3% нормальную козью сыворотку (НКС) и 0,25% Тритон Х-100 (Serva).

Обработка первичными антителами. В работе использованы кроличьи поликлональные антисыворотки против кальретинина и кальбиндина и мышиные моноклональные антитела против парвальбумина. Сыворотки растворяли в отдельных порциях 0,1М фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 0,25% Тритона Х-100, 3% НКС и 0,01% азида натрия (Sigma). Срезы инкубировали при 4С, после чего промывали в трех сменах фосфатного буфера по 5 мин в каждой смене раствора.

Обработка вторичными антителами. Срезы инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем биотинилированную козью антисыворотку против IgG кролика (Vector Laboratories) в разведении 1:200 и 3% НКС, затем трехкратно промывали в фосфатном буфере.

Для проведения иммунопероксидазной реакции срезы инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с комплексом авидин-биотинилированная пероксидаза хрена (Vectastain Elite ABC kit, Vector) в разведении 1:100. После инкубации срезы промывали в фосфатном буфере и помещали в среду, содержащую 0,05% раствор 3,3'-тетрагидрохлорида диаминобензидина (Sigma) на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4) и 0,01% перикиси водорода. Окрашивание пероксидазы хрена, как правило, происходит в течение 3-10 минут при комнатной температуре. Затем срезы тщательно отмывали в фосфатном буфере, монтировали на предметные стекла, обезвоживали и заключали в бальзам по общепринятой методике. Позитивная иммуноцитохимическая реакция характеризуется отложением в цитоплазме нейронов мелко- или грубозернистого преципитата коричневого цвета. В контрольных опытах срезы инкубировали в среде без первичных антител, в результате чего окрашивания нейронов и их отростков не наблюдалось.

Оценка апоптоза корковых нейронов: пероксидазный метод TUNEL

Апоптоз изучали с помощью иммуноцитохимического пероксидазного метода TUNEL, основанного на выявлении фрагментированных цепочек ДНК. После фиксации кусочки ткани мозга промывали в течение суток в 0,1М фосфатном буфере с 7 - 8-кратной сменой раствора, затем погружали в 30% раствор сахарозы на 0,1М фосфатном буфере. Срезы мозга толщиной 25 мкм изготавливали на замораживающем микротоме. Для выявления TUNEL-позитивных структур использовали набор реактивов Apoptag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (Chemicon). Для блокады эндогенной пероксидазы на срезы наносили 1% раствор перекиси водорода на 3 минуты, после чего промывали дважды по 5 минут в фосфатном буфере. На срезы наносили 75 мкл выравнивающего буфера и выдерживали не менее 10-15 секунд при комнатной температуре. Далее срезы слегка подсушивали и немедленнонаносили TdT-энзим из расчета 55 мкл/5см2 и инкубировали во влажной камере 1 час при температуре 37С. Затем на 10 минут погружали в стоп-буфер. Срезы промывали в фосфатном буфере трехкратно по 1 минуте в каждой смене раствора. Срезы снова подсушивали и наносили 65 мкл/5 см2 конъюгат анти-дигоксигенина, после чего инкубировали во влажной кмере течение 30 минут. Срезы промывали в фосфатном буфере 4 раза по 2 минуты при комнатной температуре.

Для выявления продуктов реакции срезы инкубировали в субстрате для выявления пероксидазы (VIP Substrate Kit, Vector Labs, Burlingame, USA), контролируя прцесс развития окраски под микроскопом, срезы промывали в трех сменах фосфатного буфера и монтировали на предметные стекла. Ядра клеток докрашивали метиловым зеленым по методу Браше. Обезвоживали по стандартной методике и заключали в бальзам.

Электронная микроскопия

В качестве дифференциальной диагностики некроза и апоптоза корковых клеток, а также для изучения состояния микроциркуляторного русла применялось электронномикроскопическое исследование височной коры. Кусочки коры размером 0.50.5 см фиксировали в смеси 2%-го глутаральдегида и 4%-го параформальдегида, приготовленных на 0.1 М какодилатном буфере (рН 7.3) с 5% D-сахарозой. Затем образцы обрабатывали в 1%-ном растворе четырехокиси осмия, разведенном на 0.1 М какодилатном буфере в течение 1ч, обезвоживали в спирте, ацетоне и заливали в Эпон-812.

Срезы готовили на ультратоме LKB-3, контрастировали в 2% спиртовом растворе уранилацетата. Препараты просматривали под трансмиссионным электронным микроскопом JEM-100B при увеличении от 4000 до 50000 и ускоряющем напряжении 80кВ.

Морфометрия и статистическая обработка данных

Для количественной оценки результатов исследования в каждом гистохимическом препарате выбирали срез стандартной толщины. Изображения срезов с малой кривизной поверхности височной коры вводили в компьютер с помощью камеры. Подсчет клеток и измерения площадей производили с помощью компьютера.

Препараты изучали с помощью светового микроскопа Olimpus, в окуляр которого была вставлена сетка с равновеликими квадратами, позволяющая подсчитать все клетки избранной структуры мозга, прореагировавшими с субстратами инкубационной среды в данном срезе. Содержание позитивно окрашенных нейронов в височной коре человека и крыс определяли как разность между суммой нейронов, окрашенных по Нисслю и суммой нейронов, выявляемых при гисто- и иммуноцитохимическом окрашивании срезов. Визуализацию изображений микропрепаратов, обработанных на NADPH-d, цитохромоксидазу и сукцинатдегидрогеназу, кислую и щелочную фосфатазы получали с помощью видеосистемы, смонтированной на микроденситометре Vickers М-85 и выражали в единицах оптической плотности (ЕОП).

Цифровую обработку изображений проводили с помощью программ Corel Draw graphics suite 13.0 и Microsoft Excel 2003.

Для количественной оценки содержания апоптических клеток использовали показатели апоптического индекса (АИ), который характеризует количество TUNEL-позитивных клеток с морфологическими признаками апоптоза. АИ рассчитывают по формуле (Фильченков, Стойка, 1999): АИ= количество апоптотических клеток *100

общее количество клеток

Апоптотический индекс (АИ) определяли как отношение общего числа TUNEL-позитивных ядер (NTUNEL) к количеству клеток, окрашенных толуидиновым синим и имеющих видимое непикнотизированное ядро (NТ) по формуле: АИ= NTUNEL *100

Полученные количественные показатели подвергались стандартной статистической обработке на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ Statgraphics 3.0 фирмы Statistical Graphics Corporation (USA). Они включали расчет среднего значения, ошибки средней и квадратичного отклонения. Оценка различий средних значений проводилась с определением t-критерия достоверности по Стьюденту. Разница между средними значениями исследованных показателей принималась достоверной с вероятностью 95% и выше. Вероятность Р < 0,5 считалась достаточной для вывода о существенности различий, полученных в результате проведенных исследований.

инейные размеры нейронов определяли по наибольшему и наименьшему диаметру (Амунц, 1960) и классифицировали как сверхмалые (5-10/5-10 мкм), малые (11-12/5-10 мкм), средние (13-22,5/7,5-22,5 мкм) и крупные (23-30/7,5-30 мкм).

Диаметр капилляров измеряли с помощью окуляр-микрометра МОБ-1-15 при увеличении объектива х 40 в 10 полях зрения для каждого случая.

Показатель длины капилляров, или относительную плотность капилляров в единице объема вещества мозга, вычисляли по формуле неравномерного распределения капилляров в ткани (Блинков, Моисеев, 1961): Lо = NoNг/Nв(2+4 (Nв-Nг)/3Nг),

где Lо - суммарная длина капилляров в 1 мм3 ткани, No - количество открытых концов на 1 мм2, Nг - число пересечений горизонтальных линий сетки окуляр-микрометра, Nв - число пересечений вертикальных линий сетки.

Площадь обменной поверхности капилляров в 1 мм3 ткани мозга вычисляли по формуле: S = d L,

где = 3,14, d - средний диаметр капилляров, L - длина капилляров в 1 мм3 головного мозга.

Для определения объема крови в капиллярном русле 1 мм3 ткани мозга использовали формулу: V= (d2/4) L,

где = 3,14, d - средний диаметр капилляров, L - длина капилляров в 1 мм3 головного мозга.

Количество крови, приходящееся на единицу поверхности капилляра, вычисляли по формуле: V1= V/ S,

где V - объем крови в капиллярном русле 1 мм3 ткани мозга, S - площадь обменной поверхности капилляров в 1 мм3 ткани мозга.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Нами исследован аутопсийный материал мозга людей с височной эпилепсией в анамнезе. Основной симптомокомплекс заболевания проявлялся в виде простых, сложных фокальных и вторично-генерализованных судорожных припадков или их сочетания. Для исследования наиболее ранних реакций головного мозга на эпилептизацию мы использовали каинатную модель экспериментального эпилептогенеза.

Известно, что височная эпилепсия развивается по законам экспериментальной киндлинг-эпилепсии (Годухин, 2005; Зенков, 2002; Карлов, 1990; Spenser, 1998, 2007). Воспроизводимая нами повышенная судорожная готовность у крыс при введении каината является состоянием фармакологического киндлинга, в условиях которого формируется прогрессивно нарастающая и самоподдерживающаяся эпилептиформная активность во многом сходная с развитием эпилепсии у человека (Collingridge, 2003; Semyanov, Kullmann, 2000, 2001). Полученные данные свидетельствуют о патогенетической роли системы возбуждающих аминокислот в формировании повышенной судорожной готовности и цитотоксическом повреждении коры при каинатном киндлинге. Описанные изменения совпадают с повышением активности NADPH-d и экспрессией iNOS в цитоплазме нейронов, капиллярных эндотелиоцитов и астроцитарной глии (Дудина, 2003, 2005; Дудина и др., 2006).

Патологическое (эпилептогенное) действие каината опосредуется возбуждением одноименных рецепторов и воспроизводит картину эпилептиформной активности корковых нейронов. Биофизические свойства рекомбинантных каинатных рецепторов во многом похожи на свойства других подтипов глутаматных рецепторов: они быстро активируются и десенситизируются, имеют сходные проводимость одиночного канала и проницаемость для Са+ (Mayer et al., 1984; Semyanov et al., 2000). Каинатные рецепторы опосредуют возникновение медленных возбуждающих постсинаптических токов (ВПСТ) в синапсах афферентных волокон (Ito, 2001; Iriarte et al., 2006) и в некоторых тормозных интернейронах (Houser, 1991). По всей видимости, функциональное значение каинатных рецепторов связано в основном с модуляцией разрядов клеток-мишеней в условиях их перевозбуждения и/или гиперпродукции медиаторного пула возбуждающих аминокислот. Последнее обстоятельство находит поддержку в свете фактов о диффузной трансмиссии медиаторов и модуляторной роли пресинаптических каинатных рецепторов (Semyanov, Kullmann, 2001). Подобная локализация рецепторов вызывает дополнительную деполяризацию афферентного входа и усиливает высвобождение глутамата (Scharfman, 2002; Semyanov, Kullmann, 2001). Более того, пресинаптические каинатные рецепторы способны значительно увеличивать высвобождение ГАМК (Семьянов, 2002; Dalby, Mody, 2001). Этот феномен влечет за собой повышение внеклеточной концентрации ГАМК, которая уже вторично ведет к десенситизации тонических ГАМКА-рецепторов на пирамидных нейронах и закономерному снижению эффективности их ГАМК-ергического торможения (Frerking et al., 1999). Таким образом, опосредованное каинатными рецепторами усиление ГАМК-ергической передачи в интернейронах принимает участие в подавлении ГАМК-ергического торможения пирамидных клеток. Очевидно, совокупное действие всех описанных факторов определяет повышенную возбудительную емкость корковых нейронов при запуске индуцированной каинатом эпилептиформной активности с развитием проконвульсантных и эксайтотоксических последствий.

Оценка полученных нами гистологических изменений слуховой коры человека требует исключения возрастных особенностей нервных элементов и возможных посмертных изменений. Данные литературы указывают на редукцию клеток, дегенеративные изменения в нейронах, увеличение глиального индекса и изменения в микроциркуляторном русле головного мозга в процессе старения организма (Шемяков, 2001; Шемяков, Михайлова, 2002; Черток, 1985; Фролькис, 1991). По данным Мотавкина П.А. (1962), редукция клеточных элементов к 60 годам по сравнению с 20 годами составляет 2,5%. Однако, нетрудно заметить, что пациенты с височной эпилепсией, материал мозга которых мы исследовали, в основном попадают в группу первого зрелого возраста (22-44 года). Указаний на наличие у них в анамнезе гипертонической болезни, изменения при которой сходны с таковыми при эпилепсии (Гайкова, 2001) нет. Кроме того, для контроля нами использовался как аутопсийный материал мозга больных височной эпилепсией (зрительная кора), так и материал мозга людей, полученный при судебно-медицинских вскрытиях (височная и зрительная кора). Такой двойной контроль позволил нам отличить и исключить возрастные изменения головного мозга человека и структурную реорганизацию при парциальной эпилепсии.

В изученных контрольных случаях нами отмечены умеренные морфологические изменения. В любом возрасте визулизируются единичные клетки в состоянии хроматолиза и/или гиперхроматоза с изменениями ядерного аппарата. Глиальные узелки встречаются крайне редко. В контрольных случаях атипичные клетки нами не обнаружены. И, наконец, количество измененных клеточных элементов никогда не достигало степени морфологических нарушений, обнаруженных при парциальной эпилепсии.

В своих исследованиях мозга человека мы придерживались сроков забора материала 3-6 часов, что является оптимальным временем для исключения повреждения и посмертной гибели нейронов (Мотавкин, 2003). Установлено, что при комнатной температуре в течение первых 18-24 часов нервные клетки сохраняют ту же структуру, что и непосредственно после смерти, а при хранении трупов в помещении с температурой не выше 10С аутолитические изменения в нейронах наступают не ранее 36 часов (Мотавкин, 1962). Кроме того, мы считаем, что возможные посмертные изменения при наличии контрольного материала, который извлекался в те же сроки, могут быть исключены.

Изменения сосудистого русла при височной эпилепсии

Одним из ведущих патогенетических звеньев в развитии эпилепсии, по мнению многих авторов, выступает сосудистый фактор (Карлов, 2003; McNamara, 1994; Estrada, De Felipe, 1998; Jacobs et al., 1999; Dalby, Mody, 2001; Briellmann et al., 2002; Chang, Lowenstein, 2003; Kovesdi et al., 2007; Spenser, 1998, 2007). Разбалансировка регуляции кровоснабжения при синдроме гипервозбудимости связана со срывом ауторегуляции сосудистого тонуса (Корочкин, Михайлов, 2000; Janigro, 1999).

Каждый эпилептический приступ сопровождается изменением системной и локальной гемодинамики, что выражается в кратковременном подъеме артериального давления, массивных вегетативных и метаболических расстройствах и ведет к гипоксии и/или аноксии ткани мозга вследствие вазоспазма (Карлов, 2003; Spenser, 1998, 2007).

Нами установлено, что при височной эпилепсии у человека происходит альтерация всех звеньев кровообращения. Отмечено, что в наибольшей степени поражаются артерии в проекции эпилептогенного очага. В артериях, питающих кору, постоянно обнаруживаются явления склероза, утолщение стенок, что ведет к сокращению их просвета иногда до полной облитерации и свидетельствует о выраженном нарушении притока артериальной крови. Избыточная перфузия в первые минуты эпилептического припадка приводит к нарушению проницаемости сосудистой стенки, пропитыванию ее белками и плазмой. Явления склероза в радиальных артериях были обнаружены нами в 38% случаев. Отмечается атония и складчатость стенки артериол. Гиалиноз стенок артериол был найден в 18,7% исследованных нами препаратов.

Изменения в стенках вен принципиально не отличаются от патоморфологии артериального русла слуховой коры при данной патологии. Отмечается утолщение стенки вен, а выраженный фиброз ведет к атонии венозных сосудов с образованием глубоких складок. Часть вен значительно расширена, что свидетельствует в пользу венозного застоя.

Результаты наших исследований подтверждаются клиническими данными. Обнаружено, что в интериктальном периоде у больных эпилепсией, по данным РЭГ отмечается увеличение кровенаполнения мозга со снижением тонуса мозговых сосудов, замедление интракраниального венозного оттока. Как указыванют авторы, эти нарушения могут играть роль в патогенезе эпилепсии, вызывая ишемию, нарушения метабонлизма, повышая судорожную готовность мозга (Бердичевский, 1989; Евтушенко, 2006; Притыко и др., 1999).

Обращает на себя аномальная штопорообразная извитость сосудов в очаге гипервозбудимости и зоне его проекции, которая вероятно обусловлена повышением перфузионного давления, а затем его резким падением во время припадка (Сергеев и др., 2007; Spenser, 2007) и/или уменьшением объема нервной ткани, вызванной редукцией клеточных элементов.

Патоморфологические изменения мелких сосудов способствуют образованию аневризматических выпячиваний, интрамуральных и околососудистых геморрагий. В просветах сосудов обнаруживаются явления стаза. Достаточно часто мы отмечали диапедезные кровоизлияния, периваскулярный отек и очаги гибели нервной ткани, имеющих вид весьма значительных по величине полостей, которые располагались чаще очагами на фоне относительно сохранной цитоархитектоники височной коры и/или субкортикально. Гибель эндотелиоцитов подтверждается данными, полученными с помощью метода TUNEL и электронной микроскопии.

Сходную морфологическую картину поражения сосудов при эпилепсии описывают О.Н. Гайкова (2001), Б.Н. Бейн и др. (2000), С.К. Евтушенко (2006). Так при исследовании материала, полученного при открытых вмешательствах по поводу очаговой эпилепсии (преимущественно височной) у больных О.Н. Гайкова (2001) обнаружила грубые перестройки сосудистой сети мозга по гипертоническому типу, которые захватывают артерии, вены и капилляры. Кроме того, О.Н. Гайкова в 58,1% случаев отмечает наличие очагов периваскулярного разрежения нервной ткани размером 2-3 мм, которые автор квалифицирует как псевдокистозные образования (Новожилова, Гайкова, 1996, 1997).

Подобные изменения сосудистого русла головного и спинного мозга человека описаны при гипертонической болезни (Мотавкин и др., 1994; Мчедлишвили, 1968; Карлов, 1990; Ганнушкина, 1973) и в условиях коллатерального и редуцированного кровообращения (Ганнушкина, 1973). Авторы отмечают гиалиноз стенок мелких артерий и вен головного и спинного мозга, экстрасосудистые и интрамуральные плазморрагии, периваскулярный отек, стаз в венах и капиллярах.

Сходство в патоморфологии при поражении сосудистого русла в эпилептогенном очаге и при артериальной гипертензии обусловлено, вероятно, общими механизмами, ведущими к срыву компенсации регуляции мозгового кровообращения (Мчедлишвили, 1968; Janigro, 1999; Spenser, 2007). Известна роль магистральных и пиальных артерий в нормальных условиях и при сосудистой патологии (Мчедлишвили, 1968, 1973; Ганнушкина, 1973; Stannless et al., 1997). В опытах на кошках с внутрикаротидным введением стрихнина показано, что на фоне судорожной активности и усиленного притока крови в мозг наблюдается сужение магистральных сосудов и расширение пиальных артерий, что наблюдается как при эпилепсии, так и при артериальной гипертензии (Janigro, 1999; Cornford et al., 1998).

В отличие от пиальных артерий характерными осонбенностями мелких артерий коры мозга является сужение их пронсвета при экстремальных условиях (Ингвар, Мчедлишвили, 1966). На наших препаратах постоянно отмечается сужение и деформация радиальных артерий и артериол неокортекса, просвет некоторых из них полностью закрыт, в части сосудов отмечаются явления стаза, который дополнительно создает повышенное сопротивление в микрососудах. Если уменьшение просвета не очень значительное, то вследствие небольшой протяженности этих артерий (по сравнению с пиальными) это может заметно не увеличивать сосудистое сопротивление. Однако в некоторых случаях сужение внутримозговых сосудов Ч особенно мелких артерий Ч бывает настолько значительным, что не может не создавать препятствия для перемещения эритроцитов, и вызывает резкое ослабление кровоснабжения ткани мозга. Сужение просвета прекапиллярных артериол и капиллянров на 50% и больше ведет к тому, что в нем уже не могут проходить даже деформированные эритроциты (Meyer, Waltz, 1959). Данное обстоятельство обусловливает значительное повышение сопротивленния для тока крови в очаге эпилептиформной активности и дефицит его кровоснабженния.

Несмотря на то, что по данным ЭЭГ и МРТ пациенты, мозг которых мы изучали, имели эпилептический очаг в одной гемисфере, наши исследования показали практически симметричное поражение сосудов слуховой коры обоих полушарий. Важно отметить, что височная доля является классическим примером зоны обширного смежного кровоснабжения (Шмидт, 1975). Данные литературы свидетельствуют о наличии немногочисленных, но достаточно крупных артерио-артериальных анастомозов в височной доле человека (Ганнушкина, 1973). Структуры височной доли получают питание как из системы внутренней сонной артерии (средняя мозговая артерия), так и системы позвоночных артерий (задняя мозговая артерия). Согласно концепции И.В. Ганнушкиной (1973) о коллатеральном и редуцированном коллатеральном кровообращении, локальный кровоток изменяется не только в зоне поврежденной артерии, но также затрагивает все ее анастомозы и артерии зон смежного кровоснабжения. Вероятно, это в известной степени объясняет факт возникновения вторичных повреждений внутримозговых сосудов и мозговой ткани в контралатеральном полушарии в условиях гемодинамических нарушений при судорожной активности.

Наиболее венроятной причиной возникновения недостаточности кровоснабжения неокортекса в очаге сундорожной активности является резкое сужение просвета мельчайших внутримозговых сосудов, которое обусловлено вполне отчетливыми микроскопическими изменениями сосудистых стенок. Наши исследования показали, что при парциальной эпилепсии у человека в значительной степени страдает микроциркуляторное русло. Капилляры мозга имеют извитой ход с колбообразными расширениями, в которых задерживаются форменные элементы крови. При импрегннации этих сосудов обнаруживается утолщение их стенок, развитие аргирофильных волокон, запустевание просветов, капиллярофиброз. Местами импрегнация открывает пакеты, состоящие из множества причудливо переплетенных капилляров с фиброзно утолщенными стенками.

При электронной микроскопии нами установлено, что просвет микрососудов деформирован, образует складки, наблюдается вакуолизация и расслоение сосудистой стенки, очаги периваскулярной деструкции нервной ткани. Отмечается увеличение микровыростов и открытых межклеточных контактов, утолщение базальной мембраны и потеря ею фибриллярной структуры. Ядра эндотелиальных клеток деформированы, цитоплазма выглядит отечной. Базальная мембрана рыхлая, неравномерная по толщине с очагами расщепления и включениями электронноплотных частиц. Нередко базальная мембрана расслаивается и образует многокамерные пространства, в которых расположены перициты и ножки астроцитов. Периваскулярные отростки астроцитов выглядят отечными и содержат множество вакуолей.

Результаты наших исследований подтверждаются данными литературы (Гайкова, Новожилова, 1998; Новожилова, Гайкова, 1996, 1997; Гайкова, 2001; Stannless et al., 1996, 1997; Janigro, 1999). Авторами отмечено, что у кошки уже через 30 сек. после апплинкации стрихнина обнаруживаются изменения в мышечных клетнках, которые производят впечатление неравномерно набухших и впячиваются в сосудистый просвет. При более длительном воздействии (5-10 мин.) медия корковых артерий местами начинает расслаиваться продольно, а в дальнейшем описанные изменения стенок нарастают, причем стенка как бы гомогенизируется и утолщается, неравнонмерно суживая просвет (Мчедлишвили и др., 1973; Зенков, 2002).

Известно, что показатель интенсивности транскапиллярного обмена коррелирует с активностью щелочной фосфатазы (ЩФ) (Черток, 1985). В микроциркуляторном русле головного мозга человека с височной эпилепсией при реакции на ЩФ мы обнаружили достоверное снижение длины капилляров и площади обменной поверхности (на 6,8% и на 4,6% соответственно) (таблица 1, 2). Диаметр микрососудов напротив незначительно увеличивается: на 2,24% (таблица 1). Данные, отражающие динамику гистофизиологии капилляров мозга человека, показывают, что, несмотря на отсутствие достоверных отличий объема крови в капиллярном русле и количества крови, приходящееся на единицу поверхности капилляра в контроле и в эпилептическом мозге (таблица 3) интенсивность транскапиллярного обмена в последнем случае значительно падает (таблица 4). Возрастает количество функционально интактных капилляров, которые при реакции на ЩФ на препаратах не визуализируются. Достоверно снижается количество капилляров с высоким и средним уровнем активности фермента на 37,4% и 23,7% соответственно. Количество капилляров с низким уровнем ЩФ напротив возрастает на 37,9%.

Таблица 1

Длина и диаметр капилляров в 1 мм2 нервной ткани (*P<0,05)

Объект	Длина, мм*	Диаметр, мкм
Височная кора интактного мозга*	3676,9	6,540,16
Зрительная кора	3568	6,70,14
Височная кора больного эпилепсией*	3425,8	6,690,15

Таблица 2

Площадь обменной поверхности капилляров в 1 мм2 нервной ткани (*P<0,05)

Объект	Площадь обменной поверхности, мкм2
Височная кора интактного мозга*	7,53*106
Зрительная кора	7,49*106
Височная кора больного эпилепсией*	7,18*106

Таблица 3

Количество и объем крови в единице поверхности в 1 мм2 нервной ткани (*P<0,05)

Объект	Объем крови в капиллярном русле, мкм3	Количество крови, приходящееся на единицу поверхности капилляра мозга, мкм3/ мкм2
Височная кора интактного мозга*	113*106	15*106
Зрительная кора	112*106	14,9*106
Височная кора больного эпилепсией*	108*106	15*106

Таблица 4

Активность щелочной фосфатазы в 1 мм2 нервной ткани (P<0,05)

Объект	Активность фермента в ЕОП		Капилляры с различной степенью активности фермента, %
Объект	максимальный	средний	высокая	умеренная	низкая
Височная кора интактного мозга	13,30,4	7,30,5	29,01,5	39,62,8	31,42,3
Зрительная кора	12,60,4	6,40,12	27,61,4	38,82,7	33,62,4
Височная кора больного эпилепсией	15,30,5	6,230,4	17,71,8	29,93,3	52,43,6

Исследование ранних изменений сосудистого русла при экспериментальном эпилептогенезе выявило полнокровие внутримозговых сосудов и подоболочечные мелкоточечные кровоизлияния более чем в 71,4 % случаев. Значительных морфологических изменений в сосудистой стенке слуховой коры эпилептизированных крыс нами не отмечено, однако атонию артериол и диапедезные кровозлияния мы наблюдали довольно часто. Отмечается некоторая извитость сосудистой сети головного мозга крысы и начальные явления фиброза. Ранняя стадия экспериментального эпилептогенеза у крысы характеризуется увеличением всех морфометрических показателей микроциркуляторного русла височной доли, что вероятно направлено на восполнение энергетических затрат при эпилептическом статусе и более эффективное снабжение мозга кислородом (таблица 5, 6, 7). Однако при подсчете микрососудов с различной степенью активности ЩФ мы обнаружили такую же динамику, как и в слуховой коре головного мозга человека с длительно текущей височной эпилепсией (таблица 8). Количество капилляров с высоким уровнем активности ЩФ снижается на 16,44%. Капилляры с умеренной активностью ЩФ выявляются реже на 17,4%. Количество капилляров с низким уровнем активности ЩФ, напротив, значительно возрастает: на 31,79%. Максимальная активность ЩФ в капиллярном русле височной коры крысы при каинатном киндлинге зафиксирована нами на 7-е сутки эксперимента, однако средние значения активности фермента в связи с увеличением функционально неактивных капилляров никогда не достигали контрольных величин.

Таблица 5

Длина и диаметр капилляров (в 1 мм2 нервной ткани (P<0,05))

Объект	Длина, мм	Диаметр, мкм
Височная кора интактного мозга	5893,2	4,280,13
Височная кора крысы при каинатном киндлинге, 3-и сутки	6044,3	4,480,19
Височная кора крысы при каинатном киндлинге, 7-е сутки	6124,6	5,130,12

Таблица 6

Площадь обменной поверхности капилляров (в 1 мм2 нервной ткани (P<0,05))

Объект	Площадь обменной поверхности, мкм2
Височная кора интактного мозга	7,91*106
Височная кора крысы при каинатном киндлинге, 3-и сутки	8,49*106
Височная кора крысы при каинатном киндлинге, 7-е сутки	9,85*106

Таблица 7

Количество и объем крови в единице поверхности (в 1 мм2 нервной ткани (P<0,05))

Объект	Объем крови в капиллярном русле, мкм3	Количество крови, приходящееся на единицу поверхности капилляра, мкм3/ мкм2
Височная кора интактного мозга	84,69*106	10,7*106
Височная кора крысы при каинатном киндлинге, 3-и сутки	95,16*106	11,2*106
Височная кора крысы при каинатном киндлинге, 7-е сутки	126,43*106	12,8*106

Таблица 8

Активность щелочной фосфатазы (в 1 мм2 нервной ткани (* достоверно по сравнению с контролем, P<0,05))

Объект	Активность фермента в ЕОП		Капилляры с различной степенью активности фермента, %
Объект	максимальный	средний	высокая	умеренная	низкая
Контроль	12,60,4	7,60,5	37,81,1	27,61,2	34,62,1
Крыса, каинат, 3-и сутки	12,90,5	7,30,4	33,41,2*	23,20,9*	43,42,7*
Крыса, каинат, 7-е сутки	13,00,2	7,00,5	31,61,6*	22,81,1*	45,62,2*

итературные данные указывают на наличие в очаге судорожной активности не только отнонсительного, но и абсолютного дефицита кровоснабжения. Было показано, что после местной аппликации стрихнина на кору головного мозга кошек кровоток в ней усиливался в среднем на 45 %, а затем нанчинал ослабевать, хотя судорожные разряды, как правило, сонхранялись значительно дольше. Сопоставленние интенсивности кровообращения с количеством судорожных разрядов в коре показало, что первое ослаблялось в среднем в четыре раза быстрее, чем судорожная активность. Обычно последняя обнаруживалась в коре в течение многих минут после того, как усиление кровотока не только исчензало, но он становился значительно меньше исходного (Spenser, 2007; McNamara, 1994).

Таким образом, нами установлено, что при височной эпилепсии происходит реорганизация всех структурных элементов сосудистой сети слуховой коры человека и крысы. Длительно текущая эпилепсия способствует грубым морфологическим перестройкам артерий, вен и капилляров. В наибольшей степени страдает функция микроциркуляции, что выражается в снижении практически всех ее морфометрических показателей.

Ранний эпилептогенез характеризуется умеренными морфологическими изменениями. В отличие от материала мозга человека, морфометрия капиллярного русла эпилептизированных крыс показала компенсаторное увеличение объема крови в капиллярном русле. Однако даже на ранних стадиях эпилептогенеза функция микроциркуляции страдает, что отражается в снижении активности щелочной фосфатазы в капиллярах мозга и увеличение количества функционально неактивных микрососудов. Последнее обстоятельство обусловливает нарастание гипоксии ткани мозга и ишемии нейронов и способствует формированию эпилептогенных цепей.

Энергетический дисбаланс нейронов в очаге эпилептиформной активности

Потребление кислорода тканью мозга в нормальных уснловиях составляет 3,3-3,5 мл на 100 г/мин, причем весь имеющийся в мозге кислонрод расходуется за 7-10 секунд. Это позволяет считать, что основным поставщиком энергии в мозге является аэробное окисление глюкозы до СО2 и Н2О, а снижение внутриклеточного содержания АТФ всего на 25-30% ведет к падению интенсивности всех энергозависимых функций клетки на 75-80% от исходной величины (Danial et al., 2003). Гликолитический распад глюкозы с обнразованием молочной кислоты дает не более 7 % энергии (Ганнушкина, 1973; Телушкин, Ноздрачев, 1999).

Мысль о том, что интенсивность мозгового кровотока соответствует величине локального метаболизма и функциональной активности, была высказана впервые почти 120 лет назад в классической статье Роя и Шеррингтона (1890). Адекватное кровоснабжение подразумевает соответствие между интенсивностью капиллярного кровообращения и метаболической потребностью ткани, окружающей капилляры (Cornford et al., 1998; Briellmann et al., 2007). Наши исследования микроциркуляторного русла показали, что на фоне гиперфункции эпилептических нейронов в очаге эпилептиформной активности существует дефицит притока артериальной крови, что ведет к неадекватному кровоснабжению ткани мозга и отражается на энергетическом статусе нейроцитов.

Корректно исследовать энергетическую функцию нервных клеток при эпилепсии представляется возможным лишь при использовании экспериметального эпилептогенеза. Наиболее ранние изменения, которые нам удалось зафиксировать при становлении феномена гипервозбудимости на каинатной модели эпилепсии у крысы, касаются разбалансировки в работе двух систем: получения и использования энергии. Учитывая, что в наибольшей степени поражаются нейроны на уровне афферентного входа, т.е в слоях II-III слуховой коры крысы, именно здесь мы исследовали активность окиредуктаз и гидролаз, что позволило нам установить четкую корреляцию между активностью данных энзимов и синтетическими возможностями клетки.

Митохондрии являются своего рода энергетическими станциями нейронов. По оценкам разных авторов митохондрии утилизируют до 95-99% поступающего в клетку кислорода (Inoue et al., 2007). Под воздействием агрессивных агентов при синдроме гипервозбудимости функция этого компартмента страдает, что ведет к нарушению процессов окислительного фосфорилирования.

Важнейшими звеньями окислительной системы являются сукцинатдегидрогеназа и цитохромоксидаза, расположенные соответственно в начале и в конце дыхательной цепи. Данные окиредуктазы организованы в кристах митохондрий комплексными ансамблями с правильными промежутками. Важно отметить, что превращение сукцината в фумарат посредством сукцинатдегидрогеназы является единственной дегидрогеназной реакцией цикла лимонной кислоты, в ходе которой осуществляется прямой перенос водорода с субстрата на флавопротеин без участия NAD+ (Henshall, 2007; Мари и др., 1993). По активности сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы можно судить об уровне энергетических функций клетки, состоянии цикла Кребса и редокс-процессах в нейроне.

Заметные изменения активности сукцинатдегидрогеназы наблюдаются спустя трое суток от начала эксперимента (таблица 9). К этому времени отмечается уменьшение величины цитоплазматических гранул и снижение интенсивности их окраски, что особенно заметно в клетках с эктопированным ядром. В таких элементах интенсивно синие гранулы лежат кольцом вокруг прозрачного ядра. Максимальное угнетение активности энзима нами отмечены на 7-е сутки от начала каинат-индуцированного эпилептического статуса. В этот период цитоплазма нейронов выглядит в значительной степени обесцвеченной, так как содержит минимальное количество мелких гранул голубого или лилового цвета.

Таблица 9

Активность сукцинатдегидрогеназы в эпилептическом очаге головного мозга крысы при каинатном киндлинге (в ед. опт. пл., Р<0,05)

Этапы эксперимента	Контроль	Каинат
1-е сутки	3,90,30	3,80,2
3-и сутки	---	3,00,3
5-е сутки	---	1,10,02
7-е сутки	---	0,40,08

Изменение активности цитохромоксидазы во многом сходны с изменениями сукцинатдегидрогеназы Таблица 10). На 3-и сутки от начала каинатного киндлинга активность цитохромоксидазы снижалась как в мелких, так и крупных нейронах. В цитоплазме уменьшалось количество гранул. В части нейронов ядро занимало краевое положение. На 5-е сутки от начала эксперимента угнетение функций фермента становится более очевидным. Цитоплазма поврежденных нейронов содержит мелкие бледно-голубые и фиолетовые гранулы диформазана.

Таблица 10

Активность цитохромоксидазы в эпилептическом очаге головного мозга крысы при каинатном киндлинге (в ед. опт. пл., Р<0,05)

Этапы эксперимента	Контроль	Каинат
1-е сутки	3,550,50	3,440,2
3-и сутки	---	2,90,5
5-е сутки	---	1,60,32
7-е сутки	---	0,50,12

Нами отмечено, что падение активности окислительных ферментов при феномене гипервозбудимости коррелирует с состоянием митохондрий в клетках с поврежденными профилями. Мы обнаружили, что к 5-7 суткам от начала эпилептического статуса по мере углубления процесса умирания и вакуолизации цитоплазмы количество крист в митоходриях резко уменьшается.

Сходные данные получены при ишемическом поражении неокортекса. Исследование функции митохондрий показало, что эфнфективность окислительного фосфорилирования при ишемии уменьшанется, а уменьшение поглощения О2 срезами ишемизированной конры можно объяснить повреждением белков-ферментов, активирующих реакции окисления и/или истощением запасов энергетического мантериала. (Завалишин, Захарова, 1996; Лукьянова, 2000; Раевский, 1996; Akcali et al., 2005; Cheung et al., 2007; Danial, Korsmeyer, 2004; Кометиани и др.,1969). В ответ на снижение концентрации О2 в неокортексе происходит кратковременное усиление, а затем подавление активности НАДН-оксидазного пути окисления. Как следствие происходит нарушение переноса электронов на участке НАДН-СоQ и сопряженного с ним процесса окислительного фосфорилирования. При увеличении тяжести и/или длительности гипоксии нарушение транспорта электронов распространяется от субстратного к цитохромному участку дыхательной цепи - на область цитохромов b-c и, наконец, к цитохромоксидазе, которая в условиях аноксии практически инактивируется (Лукьянова, 2000).

Кислая и щелочная фосфатазы (КФ и ЩФ) активно участвуют в гидролитических процессах фосфорных соединений при различных физиологических и патологических состояниях. Явные изменения активности кислой и щелочной фосфатаз отмечены нами уже через сутки от начала каинатного киндлинга. В 1-3-и сутки от начала эпилептического статуса регистрируется повышение активности энзимов, а далее на всем протяжении эксперимента нами отмечено падение активности гидролаз в нейронах слоев II-III височной коры крысы (рис. 1, 2).

Рис. 1. Активность кислой фосфатазы в эпилептическом очаге головного мозга крысы.

Рис. 2. Активность щелочной фосфатазы в эпилептическом очаге головного мозга крысы.

Повышение активности кислой и щелочной фосфатаз на 1-3-и сутки эксперимента мы связываем с усиленным потреблением энергии для реализации пластичности нервных сетей при эпилептогенезе (восстановление утраченных связей и активный коллатеральный рост). Стоит отметить, что в отмирающих клетках активность энзимов неуклонно падает, подобная динамика отмечена нами на 5-е сутки от начала эксперимента, а на 7-е сутки количество подобных клеточных элементов практически совпадает с результатами исследования погибающих клеток в эпилептическом очаге рутинными гистологичесими и иммуноцитохимическими методами.

Наши исследования показали, что альтерация нейронов в очаге эпилептиформной активности сочетается с изменением активности окислительных ферментов, кислой и щелочной фосфатаз. Гиперфункция нейроцитов эпилептического очага, направленная на восстановление утраченных связей и реактивный коллатеральный рост ведет к неспецифическим клеточным реакциям, а именно к дисфункции ферментативных клеточных систем. При эпилептическом статусе эффективность работы митохондрий может регулироваться несколькими лимитирующими скорость дыхания факторами: доступностью АДФ и субстратов, возможностями самой дыхательной цепи при насыщающих количествах всех субстратов и компонентов и доступностью кислорода. В условиях гипоксии и окислительного стресса при эпилептической эксайтотоксичности неизбежно страдает каждое из этих звеньев, что отражается на активности митоходриальных оксидаз. Снижение активности окислительных ферментов дыхательной цепи - сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы, которое максимально выражено на 5-7-е сутки эксперимента указывает на поражение энергетической функции митохондрий при синдроме гипервозбудимости. На этом фоне значительно возрастает энергопотребление и связанные с ним гидролитические процессы. На ранних этапах эпилептогенеза отмечается активация кислой и щелочной фосфатаз, которые очевидно участвуют в гидролизе макроэргических соединений необходимых для восполнения энергетических затрат на разрастание отростков, гипертрофию клеточных тел и терминальных пуговок синапса. Однако по мере прогрессирования эпилептогенеза при продолжающемся статусе судорожных припадков в условиях неадекватного кровоснабжения активность фосфатаз постоянно снижается, что указывает на альтерацию жизненноважных функций нейрона и по времени совпадает с появлением наибольшего количества погибших элементов II-III слоев височной коры.

Таким образом, мы склонны рассматривать обнаруженную нами диссоциацию между продуцированием и использованием энергии в очаге эпилептиформной активности как одно из важнейших патогенетических звеньев эпилептогенеза.

Известно, что полярность мембраны нейронов поддерживается за счет деятельности ионного насоса, требующего адекватного энергетического обеспечения. Митохондриальная дисфункция эпилептизированных нейронов ведет к нарушению активного транспорта ионов в результате дефицита энергии и, следовательно, к нестабильности клеточных мембран. Вероятно, именно это обстоятельство объясняет почему современные эпилептологи зачастую рассматривают эпилептическую болезнь как своеобразную форму каналопатий (Зенков, 2002; Дудина, 2003; Зенков, Ронкин, 2004; Chang and Lowenstein, 2003; Dudina, 2006; Zhu et al., 2007). Склонность нейронов в очаге эпилептиформной активности к деполяризации способствует нарастанию пароксизмальной активности и поражению нейронов вследствие глутаматной цитотоксичности (Дудина и др., 2006; Smyth, Deshmukh, 2007). Альтерация локальной гемодинамики в эпилептическом очаге усугубляет расстройство метаболической генерации энергии, необходимой для ремоделирования нервных сетей в ответ на эпилептогенные стимулы, замыкая, таким образом, порочный круг (Мухин, Петрухин, 2005; McNamara, 1994; Lopez et., 2007).

Патоморфология корковых нейронов при эпилепсии

Гиперфункция эпилептических нейронов в условиях дефицита кровоснабжения и митохондриальной недостаточности ведет к структурной реорганизации слуховой коры. Комплекс морфологических изменений при височной эпилепсии складывается из дистрофических процессов и разрастания нервных элементов с образованием атипичных клеток и новых структур.

Мы обнаружили, что очаг эпилептиформной активности и зона его проекции характеризуется высокой степенью клеточной атипии. При эпилептизации мозга выявляется два типа изменения нейронов. Один тип характеризует дистрофию, некроз и апоптоз клеток. Другой вызывает гиперпродукцию дендритов, гипертрофию синаптических терминалей, избыточный синтез базофильного вещества, что рассматривается в качестве компенсации на утрату значительного числа нейронов. Кроме того, избыточные разрастания, вероятно, формируют новые пути для реализации эпилептического припадка, и играет, таким образом, определенную роль в патогенезе заболевания.

При исследовании височной коры людей с парциальной эпилепсией в анамнезе обнаружено, что основные патологические изменения сосредоточены в слоях II, III и IV коркового отдела слухового анализатора. Нами установлено, что морфологическим перестройкам подвергаются преимущественно крупные интернейроны, а также пирамидные клетки слоев III и V.

На препаратах импрегнированных по Гольджи и Кахалю обращает на себя внимание некоторая мозаичность поражения: на фоне морфологически полноценных клеточных элементов располагаются нейроны с причудливой геометрией тел и отростков. Аномальные нейроциты располагаются отдельно либо группируются в кластеры по 5-8 и более клеток и занимают площадь диаметром 200-410 мкм.

Отдельные группы клеток столь гиперимпрегнированны, что напоминают лохматые спутанные клубки, в которых с трудом удается идентифицировать клеточные тела и арборизацию их дендритов. Дендриты гипертрофированны, с неровными контурами и варикозными утолщениями. Особенно сильно страдает шипиковый аппарат дендритов, часть из них полностью лишена шипиков, что соотносится с данными литературы (Douglas, Martin, 2004). Так авторами отмечено, что характерной особенностью эпилептического мозга является альтерация главным образом аксодендритических связей и преобладание аксосоматических, характеризующихся лёгкостью запуска мембранных потенциалов (Зенков, 2002; Карлов, 2003; Барашкова и др., 2006; Glass, Dragunow, 1995; Douglas, Martin, 2004; Spenser, 2007).

Молекулярные механизмы, защищающие нейроны от excite-токсичности, являются частью надсинаптической антиэпилептической системы, которая реализуется через пластические изменения нервных связей, бурный коллатеральный рост и синапсомодификацию, что способствует значительному изменению естественной арборизации нейроцитов (Дудина, 2003; Охотин, Калиниченко, Дудина, 2002; Котляр, 1986; Calcagnotto et al., 2002; Dalby, Mody, 2001; Douglas, Martin, 1990). В височной доле головного мозга человека с парциальной эпилепсией нами отмечено увеличение количества и гиперплазия отростков нейронов, гипертрофия концевых пуговок синапса и трансформация их в шаровидные образования. Большинство концевых утолщений имеет гомогенный интенсивный черный или коричневый цвет. Гипертрофия синапсов, очевидно, связана с редукцией их численности при становлении феномена гипервозбудимости и массовой гибелью клеточных элементов в очаге эпилептиформной активности.

Вероятно, синапсомодификацию при височной эпилепсии можно отнести к адаптационной синаптической пластичности, которая обусловлена длительной активацией существующих функциональных систем мозга и появлением новых функциональных систем мозга в процессе адаптации к эпилептогенным стимулам (Степанов, Семченко, 2000; Семченко и др., 2008). В результате отмечается устойчивая реорганизация активных синапсов и нейронных сетей, которая реализуется через активацию долгосрочных гено- и фенотипических механизмов. Изменения экспрессии факторов транскрипции являются одним из наиболее важных этапов в каскаде клеточно-молекулярных событий, участвующих в долговременных перестройках активности клеток мозга при киндлинге (Годухин, 2005; Semyanov, Kullmann, 2001). Наиболее ранний ответ генома, или первая волна экспрессии генов, на внеклеточный стимул обычно вовлекает усиление транскрипции и трансляции факторов транскрипции семейства генов раннего ответа (ГРО). Индукция ГРО может опосредовать связь между периодическими кратковременными внеклеточными стимулами и долговременными структурно-функциональными изменениями в мозге, ассоциированными с развитием киндлинга. Так, по данным Годухина (2005) раскачивающая стимуляция миндалины или гиппокампа вызывает билатеральную экспрессию ГРО: с-foc, с-jun, jun B, jun D и Кгох-2 в коре и лимбических областях мозга.

Проявления синаптической пластичности на уровне нейрона зависят от функционального состояния, типа нейрона и существенно отличаются в различных отделах его дендритного дерева (Douglas, Martin, 1990, 2004; Gabbott, Bacon, 1996; Glass, Dragunow, 1995; Kisvarday et al., 1990). На уровне синапса пластичность проявляется изменением его формы, типа и эффективности передачи импульса (Семченко и др., 2008). Особое значение имеет реорганизация взаимоотношений между специфическими сенсорными и неспецифическими возбуждающими и тормозными системами мозга. Так, более высокая пластичность синапсов молекулярного слоя неокортекса, где преобладают восходящие неспецифические и возвратные возбуждающие проекции, ведет к подавлению тормозных систем и способствует распространению возбуждения по коре мозга (Степанов, Семченко, 2000).

Снижение судорожной реакции в цепях нейронов к систематически предъявляемым эпилептогенным стимулам развивается в результате временных структурных преобразований в активированных синапсах: привыкания, депотенциации или длительной депрессии (Охотин, Калиниченко, Дудина, 2002). Концепция взаимосвязи механизмов физиологической и патологической нейропластичности базируется на данных о сходстве электрографических и молекулярных механизмов, лежащих в основе длительной потенциации (LTP), дегенерации, повреждения и ишемии (Калеменев и др., 2000; Котляр, 1986; Collingridge, 2003). Эти процессы развиваются в глутаматергических синапсах, инициируя изменения внутриклеточной сигнализации, что ведет к стойким изменениям длительности эффективности синаптической передачи (Douglas, Martin, 2004; Ito, 2001).

LTP в условиях патологии может выступать в качестве триггера эпилептогенеза (Дудина, 2003). Согласно современным представлениям, киндлинг, LTP и LTD (длительная депрессия) находятся в состоянии динамического равновесия и образуют континуум, который обеспечивает преемственность между физиологическими и патологическими формами нейропластичности (Степанов, Семченко, 2000; Охотин, Калиниченко, Дудина, 2002).

LTD и LTP - сбалансированные и взаимообратимые явления. Равновесие между ними нарушают эпилептогенные факторы. Они необратимо смещают его в сторону LTP, после чего процесс выходит из под контроля тормозных механизмов. Нерегулируемая патологическая форма LTP приводит к запуску киндлинга, перевозбуждению нейронов и их гибели.

Поражение нейронов объективно подтверждается данными количественного анализа, выявляющего существенную редукцию клеток. По сравнению с контролем количество клеточных элементов в слоях II-IV снижается в среднем на 23,4 % (рис. 3). Кроме того, в ткани мозга постоянно выявляются очаги глиальной пролиферации.

При окрашивании толуидиновым синим, выявляются темные, сморщенные клетки с явлениями гиперхроматоза ядра и цитоплазмы. Встречаются нейроны с полной, средней, слабой или частичной гиперхромией вещества Ниссля. Ядра таких нейронов фрагментированы или сегментированы.

Рис.3. Редукция клеточных элементов височной коры человека при эпилепсии по сравнению с контролем.

Наряду со сморщенными клетками в очагах эпилептического поражения постоянно выявляются набухшие клетки, плохо воспринимающие основной краситель. В цитоплазме нейронов наступает распад хроматофильных глыбок на более мелкие и бледно окрашенные зерна, главным образом в центре тела клетки. Вероятно, хроматолиз опосредуется гиперфункцией, регенерацией, реактивным коллатеральным ростом и глубоким нарушением обмена в клетке с первичным подавлением окислительных процессов (Keller et al., 2007). Массовая гибель клеточных элементов в эпилептическом очаге способствует пролиферации глиальных элементов, нарушая, таким образом, цитоархитектонику неокортекса и соотношение массы клетки и ее поверхности, усугубляя действие патологических факторов. Картины классического первичного раздражения, обнаруженные нами в височной коре головного мозга человека при парциальной эпилепсии могут быть обусловлены не только неадекватной гипервозбудимостью нейронов в результате массивного выброса квантов глутамата, но и, очевидно, прямым повреждением аксонов.

Морфологическая картина раннего эпилептогенеза у экспериментальных животных мало отличается от ремоделирования нейронных сетей у человека с парциальной эпилепсией. В височной коре крыс нами обнаружены очаги тканевой деструкции, очевидно, связанные с гибелью нейронов, набуханием и отеком нейропильного пространства и дегенерацией волокон. Важно отметить, что гиперимпрегнированные нейроны появляются уже через 2,5 часа от начала эпилептического статуса, их количество возрастает к исходу первых суток и на 3-и сутки закономерно снижается. Наибольшая плотность гиперимпрегнированных клеток регистрируется в слоях II-IV височной коры крысы. Поражение нейронов носит отчетливый очаговый характер.

При окрашивании толуидиновым синим в нейронах отмечается как растворение тигроида и исчезновение ядра, что можно рассматривать как явные признаки некроза, так и сморщенные клетки с маргинальным расположением ядерного хроматина, количество которых превалирует над некротическими. Они располагаются во всех слоях коры, иногда в субкортикальном белом веществе, но чаще концентрируются в виде дискретных лостровков диаметром 150-300 мкм в слоях II-IV.

Для идентификации отдельных клеточных хемотипов, участвующих в эпилептогенезе мы проследили в эксперименте динамику поражения ГАМК-ергических нейроцитов, содержащих кальций-связывающие белки, которые выступают показателем интенсивности метаболических процессов в терминалях ГАМК-ергических интернейронов. Известно, что кальций-связывающие белки утилизируют избыток Ca2+, возникающий при массивной активации NMDA-каналов, и, таким образом, предотвращают развитие окислительного стресса и эксайтотоксичности и защищают клетки от перевозбуждения и гибели (Celio, 1990; Caillard et al., 2000).

Иммуноцитохимия кальретинина, кальбиндина и парвальбумина в височной коре интактного мозга крысы позволила идентифицировать непирамидные клетки с полиморфной соматодендритной организацией. Хорошо контурируются тела нейронов, начальные сегменты их дендритов и иногда вторичиные или третичные отростки. Все слои коры пронизывают вертикальные или косо направленные фрагменты иммунопозитивных волокон, принимающие на субпиальном уровне горизонтальную ориентацию.

Каинатный киндлинг ведет к значительному разрежению иммунореактивных нейронов во всех слоях неокортекса эпилептизированных крыс (рис. 4). По сравнению с контролем количество кальбиндин-иммунопозитивных элементов снизилась на 5,3%, кальретинин-содержащих клеток - на 5,1% и парвальбумин-иммунореактивных клеток - на 3,3%.

Рис. 4. Количественная характеристика кальретинин-, кальбиндин- и парвальбумин-иммунопозитивных нейронов в височной коре головного мозга крысы в норме и при каинатном киндлинге. На оси абсцисс указан кальций-связывающий белок. На оси ординат - указан % от общего числа нейронов. Иммунореактивные клетки подсчитывались на площади среза ткани мозга в 1 мм2.

Нами установлено, что наиболее устойчивыми к эпилептогенным стимулам являются парвальбумин-иммунореактивные тормозные интернейроны, к которым относятся корзинчатые клетки и клетки-канделябры. Именно этих подтипы образуют наиболее многочисленную популяцию тормозных интернейронов и с их редукцией связывают развитие эпилепсии (DeFelipe, 1999; Ribak, 1985; Ribak, Bakay, 1999; Ribak et al., 2000; Дудина, 2003; Дудина и др., 2006). В височной коре человека корзинчатые клетки выступают интеграторами аксо-соматического торможения для различных по величине и медиаторной ёмкости пирамидных клеток (Douglas, Martin, 2004; Kisvrday et al., 1993). Уникальность клеток-канделябров обусловлена наличием специализированных образований - картриджей, которые устанавливают контакт на инициальном сегменте аксона пирамидного нейрона и, таким образом модулируют интегрированные принципальным нейроном импульсы, предупреждая избыточную глутаматергическую передачу (Kisvrday et al., 1990; Thom et al., 2000).

Нами отмечено, что у эпилептизированных крыс парвальбуминовые корзинки располагаются чаще в слоях II/III, однако в инфрагранулярных слоях, где в контроле обнаруживается их наибольшее количество, они практически не встречаются. Можно полагать, что корзинчатые нейроны вовлекаются в формирование патологической гипервозбудимости, главным образом, в популяциях крупных пирамидных нейронов, развивающих кортико-кортикальные ипси- и контрлатеральные проекции.

Наряду с редукцией клеток-канделябров мы регистрировали значительное снижение количества их аксонных окончаний (картриджей), которое вероятно обусловливает гипофункцию интернейронов с акркадным ветвлением аксонов и неэффективность аксо-аксонального торможения (DeFelipe, 1999).

Наименее устойчивыми к эпилептогенным стимулам в слуховой коре крысы при подведении каината оказались кальбиндин-иммунореактивные нейроциты. В слое I нами зарегистрировано снижение количества веретеновидных и биполярных нейронов, которые отвечают морфологической характеристике нейронов Кахаля-Ретциуса (Marin-Padilla, 1998). Кроме того, в супрагранулярных слоях мы наблюдали редукцию клеток малой величины (15 мкм) с бедной дендритной арборизацией, которые мы квалифицировали как нейроглиеформные клетки (Lund, Lewis, 1993; Conde et al., 1994; Gabbott, Bacon, 1996). Последние принимают участие в торможении и избирательной настройке нейронных ансамблей на уровне микромодульной (интра- и интерламинарной) организации коры.

По устойчивости к цитотоксическим эффектам при каинатном киндлинге кальретинин-иммунореактивные нейроны, к которым относят поздно разряжающиеся (late spiking cells) двухбукетные клетки (Kawaguchi, 1995) занимают промежуточное положение, их количество снизилось по сравнению с контролем на 5,1%.

Таким образом, становится очевидным, что, в результате запуска эпилептиформной реакции страдают как интра- так и интерламинарные связи интернейронов, контролирующие активность пирамидных клеток как на локальном уровне, так и в составе крупномасштабных сетей. Хотя в латеральном торможении принимают участие возвратные аксонные коллатерали проекционных нейронов инфрагранулярных слоев, крупные корзинчатые нейроны, ингибируя внутриколончатые тормозные интернейроны (мелкие корзинки и двухбукетные клетки), вызывают непрямую дезингибицию или фасилитацию пирамид родительской колонки (Kisvarday et al., 1990).

Феномен фасилитации, т.е. облегчения и гиперактивации пирамидных клеток, имеет большое значение для понимания гистофизиологии патологической гипервозбудимости. Установлено, что аксон корзинчатого нейрона может покидать свое корковое поле, вступать в белое вещество и через мозолистое тело достигать соседнего полушария (Дудина и др., 2006; Douglas, Martin, 2004). Подобные корзинчатые нейроны конвергируют на ипсилатеральные пирамиды и одновременно тормозят контралатеральные корзинчатые нейроны, дезингибируя пирамиды противоположного полушария (Douglas, Martin, 2004). Участие ассоциативных длинноаксонных систем тормозных интернейронов в синхронизации межполушарной активности предположительно указывает на специфическое значение тормозных функций в формировании феноменов зеркальных очагов и вторичного коркового эпилептогенеза (Jacobs et al., 2000; Sutula, 2001; Теу1ег et al., 2001).

Кроме того, наряду со снижением количества тормозных интернейронов редукция пирамидных клеток слуховой коры в эпилептическом мозге нарушает естественную цитоархитектонику неокортекса. В этой связи на первый план выходит взаимное торможение в паре или кластерах реципрокно связанных ГАМК-ергических нейронов, что в свою очередь способствует синхронизации пирамидных нейронов и их эпилептизации (Dalby, Mody, 2001; Markram et al., 2004; Scharfman, 2002).

Апоптоз в структурах височной доли при эпилепсии

Итак, нами установлена существенная редукция клеточных элементов слуховой коры при парциальной эпилепсии у человека и экспериментальных животных. Нас интересовал, какой механизм гибели клеток превалирует в эпилептическом очаге: некроз и/или апоптоз. В современной литературе весьма активно обсуждается вопрос о роли некроза и апоптоза в эпилептогенезе (Завалишин, Захарова, 1996; Годухин, 2005; Дзугаева и др., 2006; Лю Б., Лю М., 2006; Araki et al., 2002; Chen et al., 2007; Greene et al., 2007; Henshall, 2007; Henshall et al., 2004, 2005). Безусловно, и мы не могли обойти эту проблему. Следует отметить, что подавляющее количество работ посвящено биохимическим аспектам апоптоза при парциальной эпилепсии у человека и животных. Морфологических работ, дающих четкую картину удельной доли апоптоза в эпилептогенном очаге нам не встретилось.

Для решения этой задачи мы использовали как рутинные гистологические методики, так и электронную микроскопию и современные иммуноцитохимические методы (пероксидазный метод TUNEL).

При окрашивании срезов слуховой коры больных с височно-долевой эпилепсией толуидиновым синим и железным гематоксилином Вейгерта сморщенные нейроциты с сегментированными ядрами обнаружены нами преимущественно в слоях II-III. Небольшое количество подобных клеточных элементов отмечается также в слоях IV и V. Нейроны с морфологическими признаками апоптоза расположены как небольшими группами по 2-3 клетки, так и кластерами. Отдельные препараты характеризуются очаговым расположением погибших клеток, которые сплошь усеивают поле зрения. Отметим, что в основном это крупные интернейроны, хотя довольно часто такая картина наблюдается и в пирамидных нейронах слоев III, IV и V. Электронная микроскопия подтвердила данные рутинных морфологических методик и позволила идентифицировать классические стадии апоптоза в корковых нейронах височной доли.

Для первой стадии характерна агрегация и маргинация ядерного хроматина. Контуры ядра становятся неровными. Иногда в центральной части ядра обнаруживаются мелкие гранулы хроматина. Цитоплазма нейроцитов становится конденсированной. Конденсация цитоплазмы и образование выпячиваний на поверхности клетки (блеббинг) обусловливает увеличение соотношения площади поверхности к ее объему. По данным Kondratyev, Gale (2004) и Henshall (2007) глутаматная цитотоксичность, сопутствующая эпилептическому припадку, ведет к массивному поступлению ионов Са2+ и активации цистеиновых и сериновых протеаз. Последние расщепляют белки цитоскелета и наряду со сшивками белковых молекул под действием трансаминазы приводят к появлению пузырей и гофрированию мембраны при апоптозе.

Во второй стадии происходит образование ограниченных мембраной апоптозных телец различной конфигурации: от округлой до неправильной. Количество, размер и состав этих образований варьируют. Через дефекты ядерной оболочки хроматин может выходить в цитоплазму нейрона и свободно в ней располагаться. Третья стадия характеризуется фагоцитозом апоптозных телец. При этом воспалительная реакция, которая постоянно обнаруживается при некрозе, отсутствует. И, наконец, четвертую стадию мы определяли по наличию остаточных телец.

Пероксидазный метод TUNEL подтвердил данные световой микроскопии. При наличии эпилептогенного очага в структурах височной доли головного мозга человека основная масса TUNEL-позитивных нейронов сосредоточена в слоях II и III височной коры. Пораженные нейроциты расположены отдельно на фоне относительно сохранных клеток либо образуют кластеры по 2-5 и более нейронов. В отдельных случаях TUNEL-позитивные нейроны сплошь усеивают поле зрения.

В контрольных препаратах височной и зрительной коры апоптотические клетки встречаются не чаще, чем 1-2 на 500-600 клеток. Совершенно иной паттерн гибели клеточных элементов наблюдается в очаге эпилептиформной активности. На тот же объем нейроцитов в височной коре эпилептического мозга нами обнаружено до 4-9 TUNEL-позитивных элементов, а в отдельных участках до 35-40% клеток являются TUNEL-позитивными.

Таким образом, нами установлено, что эпилептогенный очаг характеризуется интенсивным апоптозом нервных клеток. Степень наибольшего скопления апоптотических клеток наблюдается на уровне афферентного входа (слои II-III). При синдроме гипервозбудимости в височной коре головного мозга человека путем апоптоза погибают преимущественно крупные интернейроны, а также пирамидные клетки слоев III и V.

При исследовании апоптотических клеток в неокортексе эпилептизированных крыс прослеживаются четкие очаги поражения височной коры. TUNEL-позитивные элементы располагаются как по одиночке, так и кластерами. Однако, в отличие от материала мозга человека, височная кора крысы при каинатном киндлинге в основном характеризуется наличием крупных кластеров из множества TUNEL-позитивных клеток. Подобные группы визуализируются преимущественно во II-IV слоях височной коры крысы, что соотносится с результатами, полученными при окрашивании ткани мозга толуидиновым синим. Отдельные кластеры из 6-9 клеток встречаются также в слое I и V.

Экспериментальный эпилептогенез показал, что в целом эпилептогенный очаг мозга крысы характеризуется более высоким уровнем апоптоза по сравнению с тканью мозга человека, и отдельные срезы поражают количеством TUNEL-позитивных клеток, а апоптотический индекс здесь достигает 50%.

Полученные данные позволяют нам заключить, что интенсивность апоптоза в эпилептическом очаге и зоне его проекции не зависит от длительности заболевания. Более того, апоптотический индекс при каинат-индуцированной эпилепсии у животных зачастую превышает таковой у человека при данной патологии. Вероятно, это свидетельствует в пользу того, что гибель клеток путем апоптоза происходит именно в иктальном и/или раннем постиктальном периоде, когда наиболее выражены нарушения микроциркуляции, энергетический дисбаланс (а функция апоптоз-индуцирующих белков семейства Bcl-2 напрямую зависит от уровня окислительного фосфорилирования) и процессы адаптационной и репаративной синаптической пластичности.

NO как апоптоз-индуцирующий фактор

Полученные нами материалы по распределению NO-синтезирующих энзимов свидетельствуют о неоднозначном участии NO-ергической компоненты в цитотоксическом поражении нейронов при височной эпилепсии у человека и экспериментальных животных. Они показывают как общие, так и специфические источники монооксида азота, которые формируют различные пулы нейронов, эндотелиоцитов и глиальных элементов головного мозга (таблица 11, 12).

Таблица 11

Показатели гистохимической активности NADPH-d в структурах височной коры человека при парциальной эпилепсии (в ЕОП, (P<0,05))

Объект	Активность NADPH-d в контроле	Активность NADPH-d при височной эпилепсии
Интернейроны слоев II/III	73,63,8	114,63,9
Интернейроны слоя IV	70,44,2	81,43,2
Интернейроны слоя V	71,22,6	81,64,1
Интернейроны слоя VI	68,63,3	79,22,4
Пирамиды слоев II/III	Ц	82,12,2
Пирамиды слоя V	Ц	76,73,1
Астроциты	Ц	69,23,4
Микроциркуляторное русло	45,44,3	62,36,2

В исследованном нами патологическом материале височной коры человека выявляется картина редукции численности NADPH-d-позитивных интернейронов, которые практически не маркируются или имеют очень низкую активность энзима. Нейропиль коры приобретает плотное диффузное окрашивание, где только в весьма редких случаях можно идентифицировать волокна и терминальные образования. Профили нейронов сильно повреждены. Наблюдается деформация клеточных тел и извитость отростков с варикозными утолщениями. Микрососудистая система коры и подкоркового белого вещества имеет интенсивную реакцию с NADPH-d. На отдельных участках серого вещества можно обнаружить лостровки астроцитарной пролиферации с высокой активностью NADPH-d.

Существенной особенностью NADPH-d-позитивного окрашивания в зонах эпилептического повреждения коры у человека является наличие высокой активности энзима в цитоплазме пирамидных нейронов, чего мы не наблюдали в интактном мозге. Эти нейроны имеют диаметр 25-30 мкм и локализуются обычно во II-III слоях коры. В слое V изредка выявляются более крупные клетки, размер которых достигает 40-50 мкм в поперечнике. Кроме того, нейроны в очаге гипервозбудимости экспрессируют iNOS.

Таблица 12

Показатели активности NADPH-d в структурах височной коры крыс при каинатном киндлинге (в 1 мм2 нервной ткани (P<0,05))

Тканевые элементы височной коры	Активность NADPH-d в контроле (ЕОП)	Динамика активности NADPH-d на разных стадиях эксперимента (ЕОП)
Тканевые элементы височной коры	Активность NADPH-d в контроле (ЕОП)	1-е сутки	3-е сутки	7-е сутки
Интернейроны слоев II/III	71,44,1	121,31,3	117,42,3	97,61,1
Интернейроны слоя IV	74,42,8	78,23,3	74,25,2	72,45,3
Интернейроны слоя V	71,44,3	112,54,3	111,24,2	87,21,3
Интернейроны слоя VI	75,42,1	115,22,3	112,31,3	80,12,3
Пирамидные клетки	Ч	Ч	Ч	Ч
Астроциты	Ч	76,21,3	77,31,3	75,42,3
Эндотелий м/сосудов	46,46,3	58,73,3	67,32,2	65,42,3

При экспериментальном эпилептогенезе типологический паттерн NADPH-d-позитивных нейронов по сравнению с интактным мозгом крысы остается без изменений, однако количество окрашенных клеток и степень активности фермента существенно увеличивается в ответ на введение каината. При этом активность NADPH-d в структурах височной коры также варьирует на разных стадиях эксперимента. Если судить по количеству и оптической плотности формазанового преципитата, пик активности нейронального и эндотелиального пулов фермента приходится на первые сутки от введения каината. В этот период на срезах визуализируются исключительно непирамидные клетки и интенсивно прокрашенные микрососуды, а в нейропиле между ними - обилие NADPH-d -позитивных астроцитов. На 3-и - 7-е сутки отмечается значительная редукция NADPH-d-позитивных интернейронов. Среди NO-ергических непирамидных клеток в слуховой коре крысы мы, как правило, регистрировали веретеновидные и биполярные подтипы. Реже выявляются крупные мультиполяры с низкой и умеренной степенью окрашивания на NADPH-d. Большинство NADPH-d-позитивных клеток располагается на периферии очагов. Почти все корковые астроциты реагируют на iNOS, которая постоянно маркирует их с 1 по 7 день эксперимента. iNOS также выявляется в небольшой субпопуляции интернейронов III/IV слоев.

Таким образом, наши исследования показали, что у человека кроме интернейронов и астроцитов в нитроксидергические механизмы включаются и пирамидные клетки. Повышение NADPH-d-позитивной реактивности при эпилептическом поражении височной доли головного мозга человека вероятно связано с экспрессией iNOS, на что определенно указывает солокализация данных маркеров в одних и тех же нейронных популяциях. Редукция клеточных элементов, экспрессирующих NO при височной эпилепсии у человека соотносится с данными, полученными при исследовании гибели клеток путем апоптоза на светооптическом, электронномикроскопическом уровне и с помощью метода TUNEL.

Безусловно, роль оксида азота в эпилептогенезе представляется полярной. С одной стороны на ранних этапах судорожного припадка на первый план выступает его нейропротективная функция (Buisson et al., 1993; Homayoun et al., 2002; Jinno, Kosaka, 2002; Zhou et al., 2007; Раевский, 1997). Она включает ограничение входа ионов Ca2+ через каналы NMDA-рецепторов, ингибирование выработки супероксидных радикалов, повышение эффективности локального кровотока и ряд других механизмов. Однако при массивном поступлении оксида азота, особенно в результате экспрессии индуцибельных изоформ NOS (Башкатова, Раевский, 1998; Завалишин, Захарова, 1996; Реутов и др., 2005), что отмечено нами в очаге эпилептиформной активности и десенситизации NMDA рецепторов, компенсаторная функция этого механизма снижается (Dawson, Snyder, 1994).

При образовании в тканях чрезмерно большого количества NO, он способен оказывать повреждающее действие на клетки. Такие большие количества NO образуются в мозге, например, при ишемии, локальном нарушении кровоснабжения, когда из клеток мозга выделяется L-глутамат, стимулирующий NMDA-рецепторы, через ионный канал которых в цитоплазму поступают ионы кальция. Эти ионы, связываясь с кальмодулином, активируют NO-синтазу, которая образует большие количества NO, действующего как нейротоксин (Homayoun et al., 2002).

Как известно, внутриклеточными мишенями для оксида азота выступают дыхательные ферменты, ферменты цикла Кребса, а также ферменты синтеза белка и ДНК и белки, содержащие SH-группы (Реутов и др., 2005). Токсический эффект NO обусловлен, по-видимому, тем, что, связываясь с супероксидным анионом (О2-) этот газ образует пероксинитрит (ONOO). Это приводит к повреждению клеточной ДНК, что считается ключевым моментом в развитии нейротоксичности. Происходит дезаминирование нуклеиновых оснований ДНК, что ведет к ее фрагментации. А это в свою очередь вызывает НАДФ-зависимое АДФ-рибозилирование ядерных белков. Такие ферментативные реакции протекают весьма интенсивно, что приводит к быстрой потере нейронами АТФ и НАДФ, то есть энергетические запасы клетки исчерпываются, и она погибает (Брюне и др., 1998; Охотин, Калиниченко, Дудина, 2002; Estvez et al., 1998; Mlsch et al., 1994). Подобная энергетическая дисфункция отмечена нами в слуховой коре человека и экспериментальных животных при становлении феномена перевозбуждения.

В реализации нитроксид-индуцированного апоптоза ведущую роль играют митохондрии, в которых дериваты NO вызывают деполяризацию внутренней митохондриальной мембраны и открытие митохондриальных пор. По данным Monti et al. (2001) NO способен и напрямую активировать открытие пор, способствуя выходу цитохрома С и запуску каспазного каскада. В состоянии постэпилептического гипервозбуждения высокие дозы NO полностью парализуют энергетический обмен в результате блокады анаэробного и митохондриального механизмов синтеза ATФ. Кроме того, NO и его производные вызывают перекисное окисление фосфолипидов и окисление тиольных групп белков митохондриальной мембраны, что также сопровождается высвобождением в цитозоль апоптогенных факторов (Lerner-Natoli et al., 1994; Bidmon et al., 2001; Ferri, 2000; Cha et al., 2004). Аппликация доноров NO в гиппокамп при одновременной экспозиции конвульсантов приводит к деполяризации митохондриальных мембран и прогрессивному снижению внутриклеточного уровня ATФ (Охотин, Калиниченко, Дудина, 2002; Ohkuma, Katsura, 2001; Lafuente et al., 2007; Kumar et al., 2007).

Подобные изменения отмечаются и при ишемии головного мозга различной этиологии. Boling et al. (2006) и Bruehl et al. (1998) сообщают, что в области ишемии наступает ясно выраженное увеличение сондержания сульфгидрильных групп в пирамидных нейронах и клетках нейроглии. При этом особенно выделяется второй слой, в контором число средних и малых пирамид велико, и прирост количества реактивных сульфгидрильных групп более заметен. Как правило, их концентрация осонбенно увеличивалась в цитоплазме тела клетки и начальном отрезке верхушечного дендрита. Общему увенличению содержания сульфгидрильных групп в цитоплазме нейронов почти всегда сопутствовало повышение количества этих групп в ядерном аппарате клетки (Охотин, Калиниченко, Дудина, 2002; Chang, Lowenstein, 2003; Chen et al., 2007). Сопоставление колебаний содержания сульфгидрильных групп со структурными изменениями в клетках позволило прийти к заключеннию, что накопление этих групп всегда предшествует деструктивным изменениям. Так, у большинства нервных клеток, содержащих большое количество сульфгидрильных групп, можно было обнаружить явления огрубения, резко выраженной варикозности и извитости отростков; наблюдалось также появление склеротических нейронов и клеток с дегенеративными изменениями ядерного аппарата (пикноз, кариорексис) (Кометиани и др., 1969; Dudina, 2006).

Кроме того, оксид азота способен и опосредованно выступать как апоптоз-индуцирующий фактор. Выше мы отмечали, что в условиях нарушения локальной гемодинамики отмечается гиперфункция как эпилептизированных нейронов неокортекса, так и клеток из их ближайшего микроокружения, направленная на восстановление утраченных связей в результате массивной гибели нейроцитов эпилептического очага.

Участие NO в опосредовании многообразных функций центральной нервной системы как в условиях физиологической нормы, так и при патологии, включая феномен глутаматной нейротоксичности и связанных с ним судорожных состояний, в настоящее время не вызывает сомнения (Дудина, 2003; Дудина и Мотавкин, 2005). При выделении из пресинаптической мембраны глутамата и связывании его с NMDA-рецепторами наблюдается активация систем внутри- и межклеточной сигнализации. В этих системах NO через систему cGMP выполняет сигнальную функцию (Охотин, Калиниченко, Дудина, 2002).

Действие NO направлено на увеличение и пролонгирование выброса квантов глутамата из пресинаптической терминали, с одной стороны, а с другой - связано с повышением сенситизации и количества постсинаптических рецепторов (Уразаев, Зефиров, 1999; Kotliar, 1992; Wheal et al., 1998; Ito, 2001; Zhou, Poo, 2004). Эти изменения достигаются посредством обратимой нейрохимической и структурной модификации пре- и постсинаптических участков активированных синапсов. NO влияет на пластические свойства нейронов, участвует в процессах долговременной синаптической потенциации, модулирует активность нейромедиаторных систем, а также влияет на синтез и секрецию нервными клетками нейромедиаторов (Philippides et al., 2000; Prast, Philippu, 2001; Yasuda et al., 2001).

NO как ретроградный мессенджер, индуцирует и пролонгирует длительную потенциацию, которая в условиях гипервозбудимости может выступать в качестве триггера эпилептогенеза (Schuman, Madison, 1991; Wheal et al., 1998; Collingridge et al., 2003). Первопричинная взаимосвязь этих явлений послужила поводом рассматривать эпилепсию как феномен патологической пластичности межнейронных связей (Scharfman, 2002; Theard et al., 1995). Если в норме при индукции и поддержании длительной потенциации монооксид азота выступает как ретроградный мессенджер, то его чрезмерная наработка может приводить к перевозбуждению потенциированных синапсов и здесь NO уже получает роль самостоятельного этиологического фактора эпилептогенеза (Kubova et al., 1999).

В результате процессов адаптационной и репаративной пластичности, которую опосредует оксид азота, изменяется интегративно-пусковая деятельность нейронов и характер распространения информации по нейронным сетям (Семченко и др., 2008). Таким образом, повышение эффективности каналов передачи информации по вновь образованным нервным сетям стимулирует формирование патологической эпилептической системы. Массивный выброс квантов возбуждающих аминокислот неизбежно будет вновь стимулировать наработку оксида азота, избыток которого индуцирует окислительный стресс и цитотоксические эффекты NO, а, следовательно, и апоптоз.

Пролиферация глии в слуховой коре при височной эпилепсии

Наши исследования показали, что в эпилептическом мозге человека глиальная реакция проявляется преимущественно в виде пролиферации астроцитов. Как правило, мы отмечали явления диффузного глиоза и кластеры из 5-10 астроцитов, которые располагаются периваскулярно. Небольшое количество астроглиальных островков обнаружено вне связи с сосудами.

Клеточный глиоз серого вещества головного мозга человека при височной эпилепсии обнаружен нами в 43% препаратов. В 16,8% случаев глиоз был резко выраженным и в 38% - умеренным. Глиальный индекс височной коры человека с эпилепсией составил 3,716 и увеличился по сравнению с контролем на 56,7% (таблица 13).

Таблица 13

Глиальный индекс коры головного мозга человека при височной эпилепсии (в 1 мм2 нервной ткани (*P<0,05))

Объект	Количество нейронов*	Количество глиоцитов*	Глиальный индекс
Височная кора интактного мозга*	47918	79836	1,671,2
Зрительная кора	42714	7837	1,831,9
Височная кора человека с эпилепсией*	3468	127624	3,71,1

Клеточный глиоз серого вещества при экспериментальном эпилептогенезе обнаружен нами в 97% случаев и, как правило, был выраженным и/или умеренным (таблица 14). Импрегнация ткани височной коры головного мозга крысы при подведении каината показала, что очаги астроцитарной пролиферации появляются уже к исходу первых суток от начала эпилептического статуса. Количество астроцитов нарастает к третьим и седьмым суткам эксперимента и стабилизируется к 21 дню. Кластеры астроцитов располагаются в виде очагов округлой или овальной формы как в связи с сосудами, так и отдельно от них.

Таблица 14

Глиальный индекс слуховой коры головного мозга при каинатном киндлинге (в 1 мм2 нервной ткани (*P<0,05))

Объект	Количество* нейронов	Количество* глиоцитов	Глиальный индекс
Слуховая кора контрольных животных	41416	6839	1,650,6*
Слуховая кора каинатный киндлинг, 3-и сутки	31918	7168	2,240,9
Слуховая кора каинатный киндлинг, 7-е сутки	2489	88411	3,560,4*

Формирование глиоза в эпилептических очагах отмечено большинством исследователей на секционном, операционном и экспериментальном материале (Новожилова, Гайкова, 2001; Krishnan et al., 1994; Prince, 1998). Предполагается, что в основе ранней стадии развития эпилептиформного припадка лежит гипертрофия астроцитов и избыточное формирование межнейронных связей. Stringer et al. (1997) на модели экспериментальной эпилепсии показали, что уже через 24 часа у животных объем фракции отростков астроцитов увеличивается на 37%, а число синапсов на 25%. Одни авторы считают глиоз вторичным процессом (аналогичным рубцеванию), который развивается на месте гибели нейронов. Другие полагают, что глиоз может тормозить формирование эпилептической системы, препятствуя патологической реорганизации мозга (Семченко и др., 2008).

На стадии раннего эпилептогенеза мы склонны рассматривать пролиферацию астроцитарной глии как компенсаторное явление, возникающее в ответ на повреждение мозга и гиперфункцию отдельных хемотипов нейронов, участвующих в эпилептогенезе и массивном выбросе квантов возбуждающих и тормозных нейротрансмиттеров. Известно, что астроциты выступают интегративным звеном локальной регуляции нервной активности. Долговременное возбуждение нейронов и связанные с ним метаболические изменения оказывают непосредственное влияние на генетический аппарат астроцитов и могут стимулировать экспрессию генов, кодирующих структуру энзимов медиаторного обмена (Steward et al., 1991; Muller, 1992). Мембрана астроцитов содержит практически весь спектр ионотропных глутаматных рецепторов, насыщение которых вызывает в клетках индукцию NO-синтазы и глиального кислого фибриллярного белка, что защищает нейроны от перевозбуждения и гибели (Garthwaite, 1991; Hicks, Conti, 1996; Дудина, 2003; Калиниченко, Дудина и др., 2004). Кроме того, нейропротективная роль глии связана с образованием глиальными элементами нейротрофических факторов (Manto et al., 2006; Семченко и др., 2008).

Однако массивное образование NO в астроцитах при длительно предъявляемых эпилептогенных стимулах оказывает токсическое влияние на ближайшее микроокружение посредством циркуляции анион-радикалов (Дудина, 2003, Дудина и Мотавкин, 2005). Кроме того, важно отметить, что при длительно текущей эпилепсии редукция клеточных элементов и пролиферация астроцитарной глии, которая принимает характер выраженного и/или резко выраженного глиоза могут выступать самостоятельными этиологическими факторами эпилептогенеза.

Глиоз серого вещества головного мозга при височной эпилепсии ведет к нарушению в системе нейроцит-глиоцит-капилляр и усугубляет перманентное состояние гипоксии нейронов в очаге эпилептиформной активности и нарушает естественное ветвление отростков нервных клеток, способствуя гиперсинхронизации больших популяций нейронов и альтерации тормозной системы неокортекса.

Поражение миелиновых волокон при эпилепсии

При световой микроскопии миелиновые волокна в проекции очага гипервозбудимости практически постоянно выглядят гиперимпрегнированными. При импрегнации ткани мозга обращает на себя внимание неровность контуров мякотных волокон, толщина которых варьирует в широких пределах на протяжении одного и того же волокна. По ходу волокон отмечаются четковидные утолщения и вздутия. Одни участки выглядят истонченными, другие - напротив - утолщены с шарообразными выпячиваниями и наплывами аксоплазмы.

При выявлении дегенерирующих мякотных нервных волокон по методу Марки мы обнаружили очаги затемнения, которые соответствуют зонам демиелинизации. Очаги располагались как в связи с сосудами, так и независимо от них. По расположению участков демиелинизации отмечено, что они локализуются в основном около вен и венул. Подобная перивенозная демиелинизация при эпилепсии была отмечена Chang и Lowenstein (2003) и Гайковой, 2001. Сходная картина описана авторами при аутоиммунном поражении головного мозга, например при рассеянном склерозе (Акимов, Одинак, 2001).

При большом увеличении ясно визуализируются отдельные поврежденные мякотные волокна, которые окружает поясок просветления, свидетельствующий, вероятно, в пользу наличия отека в эпилептическом очаге. Волокно неровное, но имеет достаточно четкие контуры. Миелиновые оболочки теряют непрерывность и распадаются на фрагменты. Отчетливо видны участки декомпозиции миелина. Некоторые волокна полностью демиелинизированы, однако, осевые цилиндры относительно сохранны. Математическая обработка результатов нашего исследования показала альтерацию миелиновых волокон при височной эпилепсии более чем в половине исследованных нами препаратов (52%).

Чаще всего отмечалось изменение тинкториальных свойств миелина, гиперимпрегнация и деформация миелиновых волокон (98,7%). Расслоение миелиновых оболочек и их фрагментация составила 74,2%. Полная демиелинизация обнаружена нами в 46% исследованных препаратов (рис. 5).

Рис. 5. Структура поражения миелиновых волокон головного мозга человека с височной эпилепсией.

Электронная микроскопия показала поражение всех слоев миелиновых оболочек. Чаще на электронограммах встречаются участки истончения миелина. Обращают на себя очаги слияния нескольких слоев миелина между собой и их гомогенизация. Постоянно в зоне эпилептогенного очага визуализируются разволокненные миелиновые оболочки, между которыми образуются светлые полости. Подобные изменения не имеют диффузного характера и располагаются очагами по периметру волокна. На фоне относительно сохранных слоев миелина обнаруживаются зоны тотального поражения миелиновой оболочки.

При световой микроскопии миелиновых волокон в проекции очагов эпилептиформной активности головного мозга крысы при подведении каината специфических морфологических изменений нами не обнаружено. Очень редко встречались миелиновые волокна с неровными контурами, которые, однако, совсем не повторяли картины деформированных с варикозными утолщениями мякотных волокон головного мозга человека с височной эпилепсией.

Процессов перивенозной демиелинизации, фрагментации и разволокнения миелиновых оболочек нами не зарегистрировано, а реакция Марки на выявление дегенерирующих мякотных нервных волокон постоянно была отрицательной.

Можно полагать, что процесс демиелинизации запускается лишь при длительном течении заболевания. В связи с этим отметим, что продолжительность височной эпилепсии у исследованных нами людей составила в среднем 12 лет.

Таким образом, факт демиелинизации нервных проводников при длительно текущей височной эпилепсии очевиден. Это патогенетическое звено в прогрессировании эпилептизации мозга трудно не оценить. Нарушение проведения нервного импульса в результате разизоляции проводников делают возможной диффузную несинаптическую нейротрансмиссию, которая влечет за собой гиперсинхронизацию работы нейронов и неконтролируемое возбуждение. Это неизбежно будет вести к эксайтотоксичности и гибели нейронов путем некроза и апоптоза.

Глиоз белого вещества головного мозга при височной эпилепсии

Наши исследования белого вещества головного мозга человека в проекции эпилептогенного очага показали увеличение количества глиальных элементов в 63% исследованных нами препаратов. По степени выраженности глиоза мы разделили его на слабо выраженный, умеренный и резко выраженный (таблица 15). В контрольных срезах ткани мозга количество клеточных элементов составило 26,72,3 клеток на 1 мм2. При глиозе белого вещества головного мозга при височной эпилепсии количество клеток возросло на 73,7%.

Глиоз белого вещества в проекции очага эпилептиформной активности, как правило, носил диффузный характер, резко очерченных очагов нами не обнаружено. Однако по степени выраженности глиальной реакции в ответ на эпилептизацию мозга наблюдались очаги выраженного глиоза на фоне умеренного и/или слабо выраженного.

Таблица 15

Количество клеточных элементов в очагах клеточного глиоза белого вещества головного мозга человека при височной эпилепсии и процентное соотношение типов глиоза (в 1 мм2 нервной ткани)

Тип глиоза	Количество клеток	Процентное соотношение
Слабо выраженный глиоз	42,23	42%
Умеренный глиоз	59,62,3	40,4%
Резко выраженный глиоз	101,22,8	17,6%

Обнаружить связь очагового глиоза с какими-либо анатомическими образовавниями мозга нам не удалось. Лишь небольшое количество астроцитов располагалось преимущественно периваскулярно. При импрегнации ткани белого вещества головного мозга человека с височной эпилепсией нами идентифицировано небольшое количество астроцитарной глии. Кроме того, на препаратах визуализируется значительное количество мелких малодифференцированных клеток округлой формы, практически лишенных отростков. Подобные клетки в эпилептическом мозге отмечены также Гайковой (2001), Vinters et al. (1992) и Ferrer et al. (1992). Авторы полагают, что они могут представлять дополнительный источник эпилептической активности.

При окраске ткани мозга суданом черным В в очагах глиоза нами обнаружены клетки, количество которых коррелирует с выраженностью глиальной реакции. Учитывая морфологию этих клеточных элементов и наличие суданофильных цереброзидов и фосфолипидов в них (Пирс Э., 1962), мы предположили, что это олигодендроглиоциты. Мы полагаем, что стимулом к увеличению количества олигодендроглиоцитов в белом веществе может служить демиелинизирующий процесс и нарушение изолирующей функции миелиновых оболочек аксона. В этой связи глиоз можно рассматривать как компенсаторную реакцию белого вещества, направленную на миелинизацию поврежденных мякотных оболочек и обеспечение ремиелинизации аксонов.

Исследование белого вещества головного мозга крысы при подведении каината не дало столь однозначной картины глиоза как при длительно текущей височной эпилепсии у человека. При окрашивании гаматоксилином-эозином и азур-эозином нами отмечено лишь незначительное увеличение количества глиальных элементов.

В современной литературе имеются лишь скудные отрывочные данные, посвященные исследованию белого вещества головного мозга при эпилепсии. Вероятно, это обусловлено господством теории о корковом водителе ритма при данной патологии. Нам встретилось лишь две работы, которые вызывают интерес (Новожилова, Гайкова, 2001, Гайкова, 2001). При исследовании клеточного глиоза белого вещества большого мозга человека при височной эпилепсии авторы обнаружили умеренный и резко выраженный глиоз в 79,8% случаев. Зон преимущественного развития глиоза не выявлено. Не отмечено также зависимости между выраженностью глиоза и давностью заболевания (Новожилова, Гайкова, 2001, Гайкова, 2001).

Таким образом, наши исследования показали, что очаги глиоза белого вещества головного мозга человека при височной эпилепсии содержали до 10-14% астроцитарной глии, 18-23% олигодендроглии и до 67% аргирофильных малодифференцированных мелких клеток округлой формы Ц возможно глиобластов, предшественников астроцитов и/или олигодендроглиоцитов, которые выступают камбием для формирования зрелых глиоцитов.

Итак, мы рассматриваем височную эпилепсию как патологию с изначальным дисбалансом возбуждающих и тормозных механизмов неокортекса (Дудина, 2003, 2005, 2007; McNamara, 1994; Henshall, 2007; Spenser, 1998, 2007), который возникает под воздействием эндо- и экзогенных факторов в периоде раннего эмбриогенеза и постнатального развития (рис. 6). Альтерация клеток Кахаля-Ретциуса и интерстициальных клеток белого вещества нарушает формирование корковой пластинки, дифференцировку и миграцию нейроцитов, а также элиминацию избыточно образовавшихся клеток и связей. Это ведет к возникновению мальформаций, дубликатуры корковой пластинки, эктопии нейроцитов, дисплазиям и дисгенезиям, которые выступают как важные факторы эпилептогенеза.

Возбуждающие механизмы неокортекса формируются пирамидными нейронами, шипиковыми звездами, нейронами Кахаля-Ретциуса и биполярными нейроцитами. Тормозные связи обеспечиваются локальными интернейронами: нейроглиеформными клетками, корзинчатыми нейронами, клетками-канделябрами, двухбукетными клетками и клетками Мартинотти. Формирование очага гипервозбудимости в височной доле обусловлено дисбалансом тормозных и возбудительных процессов в коре. Одновременно происходит угнетение пролиферативной активности нейробластов и их миграции, что вызывает увеличение количества и протяженности адгезивных и коммуникативных межнейрональных контактов. Воздействие оксистрессовых факторов ведет к очаговому выпадению и диффузному разрежению нервных клеток как за счет гибели ГАМК-иммунопозитвных элементов, так и принципальных нейронов.

Утрата нервных связей в результате редукции значительного числа клеточных элементов неокортекса стимулирует процессы адаптационной и репаративной синаптической пластичности, направленные на восстановления нервных связей. Однако, продолжающееся воздействие эпилептогенных стимулов, способствует формированию патологической эпилептической системы и вовлечению в эпилептогенез новых нейронных ансамблей.

Наши исследования показали, что очаг судорожной активности характеризуется грубыми морфологическими перестройками сосудистой сети неокортекса, нарушением микроциркуляции и снижением транскапиллярного обмена. Особая уязвимость неокортекса определяется чрезвычайной чувствительностью к снижению интенсивности окислительных реакций в результате гипоксии и/или аноксии нейронов и глиальных клеток в условиях эпилептического перевозбуждения. В эпилептизированных нейронах нами зарегистрирован энергетический дисбаланс, выражающийся в диссоциации продукции и потребления энергии. На фоне повышения активности неспецифических гидролаз в результате интенсивного пластического и энергетического обмена отмечается снижение эффективности окислительного фосфорилирования. Нарушение цитоархитектоники неокортекса при эпилепсии в результате гибели нейронов стимулирует пролиферацию астроцитарной глии, что нарушает функциональное взаимодействие в системе нероцит-глиоцит-капилляр и усугубляет гипоксию коры. Вероятно, в результате неадекватного кровоснабжения запускается процесс демиелинизации, который нарушает проведение нервного импульса по волокну и повышает эффективность несинаптической глутаматергической трансмиссии.

Гиперпродукция глутамата и его токсическое влияние на клетки-мишени со стороны патологически расторможенных пирамидных клеток инициируют нейродеструктивные процессы в эпилептическом очаге, которые реализуются посредством образования свободных радикалов, перекисного окисления липидов и индукции NO-синтазы. Чрезвычайно токсичным для нейронов являются дериваты NO, особенно его недоокисленные продукты и пероксинитриты, которые промотируют запуск каспазного каскада при височной эпилепсии у человека и животных. Гиперпродукция оксида азота способствует снижению мембранного потенциала митохондрий и выходу цитохрома С, активации каспазы-9, -3 и -7. А инициация CAD (caspase-activated DNase) и перемещение последней в ядро ведет к фрагментации ДНК и апоптозу нейрона.

Рис. 6. Схема эпилептизации нейрона при височной локализации очага гипервозбудимости. КР - клетки Кахаля-Ретциуса, ИКБВ - интерстициальные клетки белого вещества, ВЭ - височная эпилепсия, НГ - нейроглиеформные клетки, КН - корзинчатый нейрон, КК - клетки-канделябры, ДБ - двухбукетные клетки, М - клетки Мартинотти, П - пирамидный нейрон, Б - биполярные нейроны, ШЗ - шипиковые звезды, МК - - микроциркуляция, NO - монооксид азота, iNOS - индуцибельная NO-синтаза, Цит. С - цитохром С, CAD - caspase-activated DNase.

ВЫВОДЫ

Структурная реорганизация слуховой коры при височной эпилепсии характеризуется морфологическими и гистоиммуноцитохимическими регрессивно-дистрофическими и компенсаторно-приспособительными преобразованиями в нейронах, мякотных нервных волокнах, глии, кровеносных сосудах.
Ранние и, очевидно, первичные (судя по результатам экспериментальных исследований) изменения происходят в кровеносных сосудах, обеспечивающих микроциркуляцию и транскапиллярный обмен:

Уменьшается плотность капиллярных сетей (длина капилляров), площадь обменной поверхности, изменяется диаметр капилляров.
Снижается активность щелочной фосфатазы в микрососудах с высокой активностью энзима, увеличивается число капилляров с низкими ферментативными показателями.

При ультраструктурном исследовании регистрируется коллабирование стенки, ее отечность, наличие вакуолей, разволокнение, образование микроворсинок, не свойственных для эндотелия капилляров мозга.

При длительно текущей эпилепсии артерии мозга поражаются склерозом, гиалинозом, белковой имбибицией, наблюдается гиперплазия и расслоение внутренней эластической мембраны, складчатость стенок; наличие внутристеночных аневризм. В венах отмечается фиброз и атония стенок, явления сладжа и стаза, диапедезные микрогеморрагии.
В нейронах наиболее ранние изменения происходят с ферментами энергетического обмена:

Снижается активность сукцинатдегидрогеназы (транспортирующей Н+ на систему цитохромов) и цитохромоксидазы, завершающей окислительное фосфорилирование.
Повышается активность неспецифических гидролаз - щелочной и кислой фосфатазы - участвующих в гидролизе ортофосфорных соединений, в том числе АТФ.
Происходит набухание митохондрий, резкое снижение электронной плотности матрикса, уменьшение числа крист и их размеров в митохондриях.
Диссоциация - снижение активности образующих и повышение активности ферментов, обеспечивающих метаболизм энергии, ведет к ее дефициту.

Очаг эпилептиформной активности и зона его проекции характеризуется высокой степенью клеточной атипии. Для одних нейронов типичны дистрофия (вакуолизация, хроматолиз, пикноз), некроз и апоптоз; для других - гиперпродукция дендритов, гипертрофия синапсов, избыточный рост пресинаптических аксонов, увеличение синтеза базофильного вещества и, соответственно, шероховатого эндоплазматического ретикулума.
Основные патологические изменения сосредоточены в слоях II, III и IV коркового отдела слухового анализатора, где отмечается существенная редукция числа тормозных NO-ергических нейронов с различными кальций связывающими белками (парвальбумином, кальбиндином и кальретинином) и пирамид с высокой активностью нитрооксидсинтазы.
Эпилептогенный очаг характеризуется интенсивным апоптозом нервных клеток. Их наибольшее количество наблюдается на уровне афферентного входа в кору (слои I-III). Погибают преимущественно интернейроны и пирамиды, в меньшем количестве - пирамидные клетки слоя V. Очаг эпилептиформной активности у крыс характеризуется более высоким уровнем апоптоза. В отдельных срезах количество TUNEL-позитивных элементов достигает 50%.
Интенсивность апоптоза не зависит от длительности заболевания. При каинат-индуцированной эпилепсии гибель клеток происходит в иктальном и/или раннем постиктальном периоде, что связано с нарушением микроциркуляции и энергетическим дисбалансом.
Адаптационная синаптическая пластичность как ответ на гибель нейронов реализуется через увеличение числа дендритов, избыточный рост аксонов и гипертрофию их терминалей. Формирующиеся новые нервные связи участвуют в эпилептической гипервозбудимости головного мозга.
Массовая демиелинизация мякотных волокон очага эпилептиформной активности и прилегающих к нему проводящих путей вызывает поперечную нейротрансмиссию и генерализацию нервных импульсов с одновременным вовлечением в эпилептогенез различных областей мозга.
Как ответ на массовую гибель нейронов в височной коре развивается глиоз белого и серого вещества:

Очаги глиоза белого вещества головного мозга человека при височной эпилепсии содержат до 10-14% астроцитов, 18-23% олигодендроцитов и до 67% аргирофильных малодифференцированных мелких клеток - возможно глиобластов.
В сером веществе в основном пролиферируют астроциты, экспрессирующие NO-синтазу и NADPH-диафоразу.

Первичными и причинными факторами структурной реорганизации слуховой коры мы считаем гипоксию, опосредованную поражением микроциркуляторного русла и дисбалансом энергии в нейронах, связанным с нарушением коррелятивных функций между оксиредуктазами и гидролазами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Монографии:

Дудина Ю.В. Симптоматическая височная эпилепсия. - Владивосток: ОАО Дальприбор, 2008. - 300 с.

Статьи:

Дудина Ю.В. Оксид азота как ретроградный мессенджер в центральной нервной системе млекопитающих // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: сб. науч. трудов I Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых медиков с международным участием: тезисы докл. - Владивосток, 2000. С. 11-12.
Дудина Ю.В. Влияние NO на механизмы синаптической пластичности и эпилептогенез: нейроморфологические и нейрофармакологические аспекты // В Сб. Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на севере. Сургут , 2002. С. 271-273.
Дудина Ю.В. Нейрохимическая характеристика височной коры крыс с аудиогенной эпилепсией // В Сб.: Механизмы синаптической пластичности. Структурно - функциональные основы организации мозга в норме и патологии. Москва, 2004, С. 38.
Дудина Ю.В. Цитотоксическое и нейропротективное действие оксида азота и его роль в развитии коркового эпилептогенеза // Первая международная научно-практическая конференция Научный потенциал мира 2004. Том 34. Медицина.- Днепропетровск: 1-15 октября, 2004. С. 21-23.
Дудина Ю.В. Состояние NADPH-диафоразы и кальций-связывающих белков в нейронах гиппокампальной формации крыс при экспериментальной эпилепсии, вызванной каинатом // Журнал Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2005, том 139, № 3. С. 287-290.
Dudina Yu.V. Effect of Kainate-Induced Experimental Epilepsy on NADPH-Diaphorase and Calcium-Binding Proteins in Rat Hippocampal Neurons // Bulletin of Experimental Biology and Medicine, March 2005, Volume 139, Number 3, Pages:а309 - 312 .
Дудина Ю.В. Клеточные и нейрохимические механизмы коркового эпилептогенеза // Тихоокеанский медицинский журнал, 2005, № 4, с. 11-17.
Дудина Ю.В. NO и окислительный стресс как инициаторы эпилептогенеза // Международный конгресс по клинической патологии. Таиланд, 2005. С. 57-58.
Дудина Ю.В. Гистоэнзимология цитотоксических и нейропротективных механизмов в височной коре человека при эпилетическом статусе // Второй Международный Междисциплинарный Конгресс Достижения нейронауки для современной медицины и психологии. Судак, Крым, Украина, 2006, С. 84-85.
Dudina Yu.V. Histoensymology of cytotoxic and neuroprotective mechanisms in the human temporal cortex at status epilepticus // Neuroscience for medicine and psychology. Second International Interdisciplinary Congress. Sudak, Crimea, Ukraine, June 10-21, 2006. P. 85-86.
Дудина Ю.В. Состояние супероксиддисмутазы в нейронах височной коры крыс при экспериментальной эпилепсии // Журнал Морфология. 2006, № 4. С. 47-48.
Дудина Ю.В. Иммунологические проблемы эпилептического мозга // Дальневосточный медицинский журнал, 2007, № 4, с 116-118.
Дудина Ю.В. Морфологическая характеристика неокортекса при височной эпилепсии // Морфология, 2008, № 2. - с. 47.
Дудина Ю.В., Калиниченко С.Г. Медиаторные механизмы коркового эпилептогенеза // Первый Международный Междисциплинарный Конгресс Достижения нейронауки для современной медицины и психологии. Судак, Крым, Украина, 2005. С. 185-186.
Dudina Yu.V., Kalinichenko S.G. Mediatory mechanisms of cortical epileptogenesis // Progress in neuroscience for medicine and psychology. First International Interdisciplinary Congress. Sudak, Crimea, Ukraine, June 10-21, 2005. P. 186-187.
Дудина Ю.В., Калиниченко С.Г., Мотавкин П.А. Состояние ГАМК-ергических интернейронов височной коры при экспериментальной эпилепсии // Журнал Неврологии и психиатрии им. Корсакова, Эпилепсия, приложение к журналу, 2006, № 1. С. 83-88.
Дудина Ю.В., Калиниченко С.Г., Охотин В.Е. Локализация NO-синтазы в височной коре крыс линии Крушинского-Молодкиной и участие NO в механизмах эпилептогенеза // В Сб.: Международный симпозиум Сознание и наука: взгляд в будущее. Владивосток, 2000. С. 346-354.
Калиниченко С.Г., Дудина Ю.В., Дюйзен И.В., Мотавкин П.А. Индукция NO-синтазы и глиального кислого фибриллярного белка в астроцитах височной коры крыс с аудиогенной эпилептиформной реакцией // Журнал Морфология. 2004, № 2. С. 68-73.
Kalinichenko S. G., Dudina Yu.V., Dyuzen, I.V., Motavkin P.A. Induction of NO synthase and glial acidic fibrillary protein in astrocytes in the temporal cortex of the rat with audiogenic epileptiform reactions // Neuroscience and Behavioral Physiology, July 2005, vol. 35, no. 6, pp. 629-634.
Калиниченко С.Г., Дудина Ю.В., Мотавкин П.А. Нейроглиеформные клетки: нейрохимическая характеристика, пространственная организация и роль в тормозной системе новой коры // Журнал Цитология, 2006, том 48, №6, июнь, с.508-514.
Мотавкин П.А. и Дудина Ю.В. Роль оксида азота в эпилептогенезе // Дальневосточный медицинский журнал, 2005, № 1. С.109-112.
Охотин В.Е., Дудина Ю.В. NO-ергические интернейроны гиппокампа, их пространственная организация и значение в механизмах эпилептогенезаа// В Сб.: Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии. Томск, 2002. С. 54-55.
Охотин В.Е., Дудина Ю.В., Калиниченко С.Г. NO-синтаза в эпилептиформных очагах височной коры крыс линии Крушинского-Молодкиной // В кн.: Организация и пластичность коры больших полушарий головного мозга. М.: 2001. С. 64.
Гуляев С.А., Горбач Т.А., Руденко А.А., Павлинич С.Н., Дудина Ю.В. Ультразвуковая допплерографическая диагностика внутричерепных сосудистых мальформаций // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: сб. науч. трудов IV Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием: тезисы докл. - Владивосток, 2003. С. 109.
Калиниченко С.Г., Охотин В.Е., Дудина Ю.В. Нейрохимическая специализация клеток Люгаро и их значение в структурно-функциональной организации модуля коры мозжечка // В Сб. Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии. Томск, 2002. С. 39-40.
Охотин В.Е., Калиниченко С.Г., Дудина Ю.В. NO-ергическая трансмиссия и NO как объёмный нейропередатчик. Влияние NO на механизмы синаптической пластичности и эпилептогенез // Успехи физиол. наук // Успехи физиол. наук. 2002. Т. 33, № 2. С. 41-55.
Охотин В.Е., Калиниченко С.Г., Дудина Ю.В. Значение NO как объёмного нейропередатчика в интеграции межнейронных связей // В Сб. трудов Конгресса по интегративной антропологии. Санкт-Петербург, 2002. С. 125-130.
Дудина Ю.В. и Мотавкин П.А. Типология корковых нейронов и их значение в организации процессов торможения и возбуждения при височной эпилепсии // Морфология, 2008, (в печати).
Дудина Ю.В. Морфологические и биохимические аспекты апоптоза при височной эпилепсии у человека и животных // Тихоокеанский медицинский журнал, 2009 (в печати).

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по разное

Blog