Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по химии
На правах рукописи
Злобин Андрей Александрович
СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА ПЕКТИНОВ ПЛОДОВ ШИПОВНИКА МОРЩИНИСТОГО И РЯБИНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ (СЕМЕЙСТВО ROSACEAE)
02.00.10 - биоорганическая химия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Киров-Сыктывкар - 2012 г.
Работа выполнена на кафедре биотехнологии ФГБОУ ВПО Вятский государственный университет и в отделе молекулярной иммунологии и биотехнологии ФГБУН Институт Физиологии Коми Н - УрО РАН Научные руководители: доктор технических наук, профессор Жуков Николай Алексеевич кандидат химических наук, старший научный сотрудник ФГБУН ИФ Коми Н - УрО РАН Оводова Раиса Григорьевна
Официальные оппоненты: доктор химических наук, главный научный сотрудник ФГБУН ТИБОХ ДВО РАН Ермак Ирина Михайловна, доктор химических наук, старший научный сотрудник, заведующая кафедрой химии Института естественных наук ФГБОУ ВПО СыктГУ Кочева Людмила Сергеевна
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической химии Уфимского научного центра РАН (ИОХ УН - РАН), г. Уфа
Защита состоится л 2012 г. в часов на заседании диссертационного Совета Д 005.005.01 при федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН) Текст автореферата разослан л 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Черников О.В.
Общая характеристика работы
Актуальность темы. Большой объём исследований свойств, структуры и биологических функций пектинов связан с тем, что они оказывают многоплановое влияние на метаболизм человека и животных, являясь элементами питания (в качестве пищевых волокон).
В нашей стране производство пектинов в промышленных масштабах основано на использовании яблочных выжимок и свекловичного жома.
Однако известно, что проявляемая пектинами физиологическая активность определяется макромолекулярными и структурными характеристиками этих биополимеров. Поэтому актуальным является поиск их новых сырьевых источников. Такими источниками пектинов (в составе комплексных препаратов природного происхождения) могут быть представители семейства розоцветных (Rosaceae): шиповник Rosa L. и рябина обыкновенная Sorbus aucuparia L., которые распространены в средней полосе России. Промышленная переработка их плодов для производства витаминных препаратов природного происхождения (сиропы, экстракты и настои) налажена на ряде предприятий медицинской промышленности. Несмотря на достаточно широкое использование этих препаратов, строение и свойства пектиновых веществ данных растений не изучены.
Цель и задачи работы. Цель данной работы - химическая характеристика пектиновых полисахаридов плодов шиповника и рябины обыкновенной, названных нами розолинанами и сорбанами, соответственно, для обоснования ресурсо- и энергосберегающей технологии их переработки. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-определить особенности состава и свойств пектиновых веществ плодов шиповника и рябины обыкновенной;
-дать структурную характеристику розолинанов и сорбанов;
-определить состав и свойства пектиновых веществ каллусных тканей шиповника и рябины, т.к. они могут быть использованы в качестве моделей для исследования строения пектинов и закономерностей их биосинтеза;
-разработать рекомендации по получению из плодов шиповника витаминизированного сиропа с повышенным содержанием пектиновых веществ и их максимальным выходом.
Научная новизна работы. Впервые показано, что основные углеводные цепи розолинанов и сорбанов представлены линейными областями частично метилэтерифицированного галактуронана (рамногалактуронана) и разветвлёнными участками, содержащими нейтральные моносахаридные остатки, характерные для рамногалактуронана-I (RG-I). Впервые установлено, что розолинаны и сорбаны, входящие в протопектиновый комплекс каллусных тканей околоплодников шиповника морщинистого и стебля рябины обыкновенной, по составу и строению углеводных цепей идентичны пектиновым полисахаридам плодов данных растений.
Практическая значимость и реализация результатов работы.
Результаты работы использованы для разработки практических рекомендаций при организации ресурсо- и энергосберегающей технологии переработки плодов шиповника. Кроме того, дано обоснование применения шрота шиповника (отхода переработки плодов) в качестве кормовой добавки с точки зрения состава и свойств пектиновых полисахаридов, входящих в его состав.
Аппробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались на научно-технических конференциях, симпозиумах и конгрессах: III и IV Международном симпозиуме Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования, Москва-Пущино, 1999, 2001; II Международном Конгрессе Биотехнология: состояние и перспективы развития, Москва, 2003; Всероссийской научно-технической конференции Наука-производство-технология-экология, Киров, 2004, 2006; VI Международном форуме Биотехнология и современность, СанктПетербург, 2005; IV Международном конгрессе Биотехнология:
состояние и перспективы развития, Москва, 2007; Всероссийской научно-технической конференции Общество, наука, инновации, Киров, 2011.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 статей в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией РФ.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 1страницах машинописного текста, содержит 46 таблиц и 12 рисунков.
Работа включает следующие разделы: введение; главы 1-3; выводы и список использованных литературных источников, содержащий 1наименований. В главе 1 дана химическая характеристика пектинов, а также отражены вопросы накопления и изменения их состава в процессе онтогенеза растений. Материалы и методы, применявшиеся в работе, представлены в главе 2. Глава 3 посвящена обсуждению полученных экспериментальных данных.
Основное содержание работы
1. Общая характеристика розолинанов и сорбанов В качестве объектов для исследования состава пектиновых полисахаридов плодов шиповника и рябины были выбраны распространённые в средней полосе России виды: шиповник морщинистый Rosa rugosa Thunb., коричный R. cinnamomea L., собачий R. canina L. и рябина обыкновенная Sorbus aucuparia L. При обозначении названия фракций розолинанов и сорбанов использовали первые буквы родового и видового латинского названия растения, а также цифры, указывающие порядок их получения. Для выделения розолинанов мякоть плодов обрабатывали кипящей смесью метанола и хлороформа или 96%-ным этанолом, а затем экстрагировали её водой при 20 С и 68 С (фракции RRI и RRII, RCiI и RCiII, RCаI и RCаII).
Остаток растительного материала обрабатывали разбавленным раствором HCl (рН 3.8-4.0, 50 С) и экстрагировали 0.7%-ным раствором оксалата аммония при 68 С (фракции RRIII, RCiIII и RCаIII) (Табл. 1).
Таблица 1 - Выход и состав фракций розолинанов Вид Фракция Выход, Характери DM, Содержание, % % GalA Ara Gal Rha Xyl Man Glc %* стическая вязкость, дл/г R. rugosa. RRI 7.7 0.48 41 46 8.0 2.4 1.5 0.5 Сл. 9.RRII 1.8 1.32 37 57 8.6 4.0 1.7 0.4 Сл. 4.RRIII 2.9 0.20 9 69 10.9 4.8 3.4 0.3 0.2 0.R. RCiI 7.3 9.12 44 24 4.6 1.9 1.2 Сл. Сл. 17.cinnamоmea RCiII 1.2 1.43 43 46 17.1 3.3 1.7 2.9 0.8 9.RCiIII 2.8 1.40 29 60 12.8 4.3 3.0 Сл. Сл. 0.R. canina RCaI 7.0 0.23 58 47 9.6 0.7 0.5 Сл. Сл. 2.RCaII 2.3 1.32 64 46 11.6 0.9 0.5 Сл. Сл. 1.RCaIII 1.6 0.68 30 58 13.4 0.9 0.4 Сл. Сл. 0.* Примечания. в пересчёте на сухую массу обезжиренного материала; Сл. следовые количества Для выделения сорбанов из плодов рябины обыкновенной обезжиренный растительный материал экстрагировали водой при 68 С (фракция SAI) и после гидролиза протопектина разбавленным раствором HCl обрабатывали остаток сырья 0.7%-ным раствором оксалата аммония (фракция SAII) (Табл. 2). Полученные фракции полисахаридов имеют достаточно высокие значения характеристической вязкости. Их моносахаридный состав определяли после гидролиза 2 М раствором трифторуксусной кислоты (TFA) (1 С, 3-5 ч) в виде соответствующих ацетатов полиолов и триметилсилильных (ТМС) производных с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ) и хромато-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС).
Таблица 2 - Выход и состав сорбанов Фракция Выход, Характери DM Содержание, % стическая,% % GalA Ara Gal Rha Xyl Ma Glc Белок вязкость, n дл/г SAI 0.9 6.85 51 62 4.7 2.8 0.5 0.3 0.3 2.8 SAII 3.3 2.05 49 68 12.3 3.0 0.6 Сл. Сл. 1.3 Примечание. - в пересчёте на сухой растительный материал Основными нейтральными моносахаридными остатками розолинанов и сорбанов являются остатки арабинозы (Ara), галактозы (Gal) и глюкозы (Glc). В минорных количествах в них присутствуют остатки ксилозы (Xyl), рамнозы (Rha) и маннозы (Man). Фракции розолинанов и сорбанов содержат до 69 % остатков галактуроновой кислоты (GalA) со степенью метилэтерифицирования (DM) 9-64 %. В гидрозитах фракций RRII, RCiII и RCaII в виде ТМС-производных идентифицированы также следовые количества остатков глюкуроновой кислоты.
Таким образом, состав и свойства полученных фракций полисахаридов подтверждают их принадлежность к пектинам. Для дальнейших исследований были выбраны пектины двух видов семейства Rosaceae: R. rugosa и S. aucuparia.
2. Структурная характеристика розолинанов и сорбанов Гельхроматография на сефакриле S-500 и ионообменная хроматография на DEAE-целлюлозе розолинанов RRI, RRII и RRIII, а также сорбанов SAI и SAII показали, что, несмотря на гетерогенность полученных фракций по молекулярным массам, они близки по моносахаридному составу и, скорее всего, являются полимергомологами одного пектинового полисахарида (шиповника или рябины соответственно). Поэтому для структурной характеристики были использованы исходные фракции розолинанов и сорбанов.
2.1. Частичный кислотный гидролиз При обработке розолинана RRIII 0.05 М раствором TFA (80 С, ч) были получены фракции RRIII-1h (среднечисловая (Mn) и среднемассовая (Mw) молекулярные массы - 15356 и 95662 Да соответственно) и RRIII-2h (Mn - 6236 Да, Mw - 8983 Да) (Табл. 3).
Фракция RRIII-1h ([]20 =+171, с. 0.1) представлена пектиновыми D полисахаридами с содержанием остатков галактуроновой кислоты 94%.
Таблица 3 - Характеристика фрагментов розолинанов и сорбанов, полученных с помощью частичного кислотного гидролиза Фракция Выход, DM, % Содержание, % %* GalA Ara Gal Rha Xyl Man Glc Белок RRIII-1h 54 9 94 Cл. 0.8 0.4 Сл. Сл. Сл. 1.RRIII-2h 12 1 97 0.5 0.8 0.4 Сл. Сл. Сл. Сл.
SAII-1h 77 7 88 Cл. 0.3 Cл. 0.1 Cл. Cл. 7.SAII-2h 2 Н.о. 62 Cл. 2.4 Cл. 0.3 Cл. Cл. 13.Примечание. * - от исходного образца Из нейтральных моносахаридов в минорных количествах в её состав входят остатки арабинозы, галактозы и рамнозы. Фракция RRIII2h ([]20 =+160, с. 0.1) образована галактуронаном (содержание D остатков галактуроновой кислоты - 97 %). В результате гидролиза сорбанов SAII 0.05 М раствором TFA (80 С, 8 ч) с выходом 77 % была получена фракция SAII-1h ([]20 =+228, с. 0.1), которая представлена D относительно однородными по молекулярной массе пектиновыми полисахаридами (Mn - 19560 Да, Mw - 72183 Да) с содержанием остатков галактуроновой кислоты - 88 %. Из нейтральных моносахаридов в минорных количествах в её составе содержатся остатки галактозы и ксилозы, т.е. она, как и RRIII-1h, представлена фрагментами слаборазветвлённого RG-I. Фракция олигосахаридов SAII-2h близка по составу основной фракции. Наличие метоксильных групп во фракциях RRIII-1h и SAII-1h указывает на то, что они локализованы в основных углеводных цепях розолинанов и сорбанов.
С помощью ГЖХ-МС в спиртовых супернатантах гидролизатов RRIII и SAII в виде ТМС-производных идентифицированы остатки арабинозы, галактозы, рамнозы, маннозы, ксилозы, глюкозы и фукозы.
При жёстком частичном гидролизе розолинанов RRI, RRII, RRIII, а также сорбанов SAI и SAII 2М раствором TFA (100 С, 5 ч) получены фрагменты галактуронана с выходом 9-33 % и содержанием остатков D-галактуроновой кислоты 92-94 %, связанных между собой 1,4связями. О С1--конформации остатков галактуроновой кислоты свидетельствует наличие в ИК-спектрах данных фрагментов полос поглощения при 890 см-1, 834 см-1, 763 см-1 (для С1--конформации характерны полосы поглощения при 927 см-1, 880 см-1 и 780 см-1).
Таким образом, при частичном кислотном гидролизе розолинанов и сорбанов образуются фрагменты слаборазветвлённого RG-I и 1,4-D--галактуронан, представляющий линейные участки их основных углеводных цепей.
2.2. Ферментативный гидролиз розолинанов и сорбанов В результате обработки розолинанов RRI, RRII, RRIII и сорбанов SAI и SAII 1,4--эндо-полигалактуроназой (Rhizopus sp., 3.2.1.15) в водных растворах продуктов ферментолиза методом бумажной хроматографии обнаружена смесь свободной галактуроновой кислоты и олигосахаридов. При добавлении к ферментолизатам RRI, RRII и RRIII четырёхкратного объёма 96 %-ного этанола получены фрагменты пектиновых полисахаридов RRIF ([] =+100, с. 0.1), D RRIIF ([]20D =+120, с. 0.1) и RRIIIF ([] =+124, с. 0.1), которые D устойчивы к дальнейшему действию фермента (Табл. 4).
Таблица 4 - Характеристика фрагментов, полученных ферментативным гидролизом розолинанов Фракции DM,% Содержание, % Выход, % GalА Ara Gal Rha Xyl Man Glc RRIF 5 11 51 9.0 3.2 2.6 0.6 0.3 5.RRIIF 57 10 51 9.5 5.1 2.4 1.1 0.5 4.RRIIIF 23 17 55 8.1 3.1 3.1 0.6 Сл. 1.Примечание. * - от исходных розолинанов Значительное количество остатков галактуроновой кислоты (5155 %) в RRIF, RRIIF и RRIIIF и более высокое содержание в них остатков рамнозы по сравнению с исходными розолинанами указывает на разветвлённость их углеводных цепей. При ферментолизе сорбанов SAI и SAII получены фрагменты SAIF и SAIIF с повышенным содержанием остатков арабинозы (24.0 % и 18.7 % соответственно).
При последующей гельфильтрации этих фрагментов на сефакриле S500 получены фракции SAIFs (K - 0.49) и SAIIFs (K - 0.75) (Табл. 5).
av av Высокая степень метилэтерифицирования ограничивает гидролиз сорбанов эндо-полигалактуроназой. При омылении SAI и SAII 0.75 н раствором гидроксида натрия в течение 1 ч при комнатной температуре с последующей их обработкой 1,4--эндо-полигалактуроназой наблюдается существенная деградация сорбанов (выход фрагментов SAIHhF и SAIIHhF составляет 11-37% соответственно) (Табл. 5).
Таблица 5 - Характеристика фракций сорбанов после ферментативного гидролиза и гельфильтрации на сефакриле S-5Фракция Выход, DМ, Содержание, % % % GalA Ara Gal Rha Xyl Man Glc Белок 59 70 52 24.0 3.5 0.6 0.9 0.3 0.6 8.SAIF 55 73 44 18.7 4.1 1.0 1.0 0.3 1.1 7.SAIIF 64 34 65 17.6 3.7 Сл. 0.4 Сл. 0.9 Сл.
SAIFs 71 40 60 11.4 3.6 0.6 0.5 Сл. 1.3 Сл.
SAIIFs 37 Сл. 40 7.2 5.5 0.9 1.7 0.4 1.9 10.SAIHhF 11 Сл. 38 11.2 3.6 1.6 1.0 Сл. 0.4 7.SAIIHhF Примечание. * - от исходных сорбанов; * - от сорбанов, нанесённых на колонку Таким образом, данные ферментативного гидролиза подтверждают, что в составе главных углеводных цепей розолинанов и сорбанов содержатся линейные участки, образованные 1,4-связанными остатками -D-галактуроновой кислоты и разветвлённые области, устойчивые к действию фермента, которые содержат нейтральные моносахаридные остатки типичные для RG-I.
2.3. Метилирование розолинанов и сорбанов Для определения размеров окисных циклов и порядка связей нейтральных моносахаридных остатков, входящих в состав боковых углеводных цепей розолинанов, был использован метод метилирования Хакамори с последующим гидролизом полисахаридов 2М раствором TFA (100 С, 5 ч), восстановлением частично метилированных моносахаридов и их ацетилированием. Идентификацию полученных метилированных ацетатов полиолов проводили методом ГЖХ-МС (Табл. 6).
Таблица 6 - Результаты анализа розолинанов и сорбанов методом метилирования Положение метильных групп Связь 2,3-О-Ме2-Araf 5)-Araf-(1 2,3,4-О-Ме3-Xylр Xylр-(1 2,3-О-Ме3-Xylр 4)-Xylр-(1 2,3,4,6-О-Mе4-Glср Glср-(1 2,3,6-О-Me3-Glср 4)-Glср-(1 2,3,4-О-Me3-Galр 6)-Galр-(1 2,4-О-Me2-Galр 3,6)-Galр-(1 В состав боковых углеводных цепей RRIF, RRIIF и RRIIIF входят 1,4-связанные остатки ксилопиранозы, 1,5-связанные остатки арабинофуранозы, 1,4-связанные остатки глюкопиранозы и 1,6 связанные остатки галактопиранозы. В составе полисахаридов SAIs и SAIIs, а также фрагментов SAIFs и SAIIFs идентифицированы 1,5связанные остатки арабинофуранозы, 1,4-связанные остатки глюкопиранозы, 1,6-связанные и 1,3,6-связанные остатки галактопиранозы. Наличие в сорбанах 1,3,6-связанных остатков остатков галактопиранозы может указывать на то, что по ним возможно происходит разветвление боковых углеводных цепей.
Присутствие в продуктах метилирования сорбанов и розолинанов 2,3,4,6-тетра-О-метилглюкозы свидетельствует о том, что на терминальных концах боковых углеводных цепей локализованы остатки глюкопиранозы. Среди продуктов метилирования розолинанов, кроме 2,3,4,6-тетра-О-метилглюкозы, идентифицированы также остатки 2,3,4-три-О-метилксилозы, т.е. их углеводные цепи дополнительно содержат терминальные остатки ксилопиранозы.
2.4. Распад розолинана и сорбана по Смиту В результате окисления розолинана RRIII и сорбана SAII 0.03 М раствором периодата натрия, последующего восстановления боргидридом натрия, гидролиза полиспиртов 2%-ным раствором уксусной кислоты (100 С; 2 ч) и фракционирования на сефадексе G-получены полисахаридные фракции RRIIIS (Кav - 0.07) и SAIIS (Кav - 0.06) (Табл. 7).
Таблица 7 - Выход и состав фрагментов розолинана и сорбана, полученных при распаде по Смиту Фракция Выход, Содержание, % % GalA Ara Gal Rha Xyl Man Glc Белок RRIIIS 4.3 37 19.2 16.1 17.5 Сл. Сл. Сл. 4.SAIIS 1.7 34 3.0 18.5 6.1 4.1 Сл. 0.3 14.Примечание. - от количества образца, взятого на окисление Содержание в RRIIIS и SAIIS остатков галактуроновой кислоты (34-37 %) может указывать на то, что они О-ацетилированы или/и являются точками разветвления основных углеводных цепей полисахаридов RRIII и SAII. В результате метилирования фрагментов RRIIIS и SAIIS были идентифицированы 1,5-связанные остатки арабинофуранозы, 1,4-связанные остатки глюкопиранозы, 1,6связанные остатки галактопиранозы, 1,3,6-связанные остатки маннопиранозы и терминальные остатки глюкопиранозы. Кроме того, в продуктах гидролиза метилированного сорбана SAIIS обнаружены 2,6связанные остатки галактофуранозы.
Таким образом, существенное снижение количества остатков галактуроновой кислоты во фрагментах подтверждает наличие в составе углеводных цепей розолинанов и сорбанов областей линейного 1,4--галактуронана. Высокое содержание в RRIIIS и SAIIS остатков нейтральных моносахаридов (арабинозы, галактозы и рамнозы) и результаты их метилирования указывают на то, что боковые цепи розолинанов и сорбанов представлены разветвлёнными галактанами и арабинанами (арабиногалактанами).
2.5. ЯМР-спектроскопия розолинанов и сорбанов 13 Интерпретация С- и Н-ЯМР-спектров розолинана RRIII-2S и сорбана SAII представлена в табл. 8. Как свидетельствуют спектры 13СЯМР, в состав углеводных цепей полисахаридов RRIII-2S и SAII входят участки, образованные 1,4--связанными остатками D-GalpA, которые дают сигнал аномерного углеродного атома при 100.7 м.д.
Положение сигналов остальных атомов углерода остатков галактуроновой кислоты (69.1; 69.8; 80.0; 72.6; 174.7 м.д.) 13 соответствует С-ЯМР-спектрам 1,4--D-галактуронана. В С-ЯМРспектрах образцов полисахаридов присутствует сигнал С6-атома метилэтерифицированных остатков галактуроновой кислоты при 172.м.д., что дополнительно подтверждается сигналом С/Н при 54.1/3.80 в спектрах Н/13С-HSQC (Рис. 1 и 2). В состав основных углеводных цепей розолинана RRIII-2S и сорбана SAII входят также 1,2-связанные остатки -L-рамнопиранозы. В резонансной области аномерных атомов углерода в спектрах С-ЯМР наблюдается сигнал С1-атома углерода рамнопиранозы при 100.2 м.д., а сигнал при 18.0 м.д. обусловлен метильной группой рамнопиранозы (Рис. 1 и 2). Спектр Н1/13С HSQC (сигнал С5/Н5-атомов) указывает на то, что остатки рамнопиранозы находятся в -конфигурации. Часть остатков рамнопиранозы в розолинане и сорбане замещена по С4-положению (сигнал С4/Н4атомов). В составе боковых цепей розолинана RRIII-2S и сорбана SAII идентифицированы 1,5-связанные остатки -L-арабинофуранозы, терминальные остатки арабинозы и -D-галактопиранозы. Наличие 1,5связанных остатков -L-арабинофуранозы подтверждается химическими сдвигами сигналов аномерного и пятого атома углерода при 108.5 м.д. и 68.4 м.д. В розолинане часть остатков арабинофуранозы боковых цепей замещена по С3-положению, о чём свидетельствует наличие сдвига сигнала С3-атома в 13С-ЯМР-спектре.
В состав боковых углеводных цепей сорбана SAII входят 1,4 связанные остатки -D-галактопиранозы. На это указывает сигнал аномерного атома углерода при 104.9 м.д. и С4-атома при 79.2 м.д.
в13С-ЯМР-спектре.
13 Таблица 8 - Положение сигналов в спектрах С- и Н-ЯМР розолинана RRIII-2S и сорбана SAII Моносахаридные С NMR химические сдвиги, (ацетон 31.45) и остатки Н C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 CH3O H-1 H-2 H-3 H-4 H-5,5' H-6,6' 4)--D-GalpA-(1 100.7 69.1 69.8 80.0 72.6 174.7 - 5.08 3.80 3.98 4.44 4.4)--D-GalpA-6- 101.5 69.1 69.3 80.0 72.0 171.6; 54.OMe-(1 4.95; 4.92 3.75 3.98 4.44 5.08 172.0 3.2)--L-Rhap-(1 100.2 77.9 70.1 73.4 69.6 18.0 - 5.24 4.95 3.77 3.42 3.85 1.2)--L-Rhap-(1 100.2 78.1 70.0 81.8 69.2 18.2 - 5.24 4.00 4.00 3.74 3.90 1. 4) -L-Araf-(15 109.2 82.3 78.3 85.5 62.7 - - 5.08 4.13 4.00 4.05 3.83; 3.-L-Araf-(13 108.5 82.7 78.3 85.5 62.7 - - 5.15 4.13 4.00 4.05 3.83; 3.5)--L-Araf-(15 108.5 82.7 78.1 83.9 68.4 - - 5.15 4.13 4.03 4.21 3.88; 3.5)--L-Araf-(15 108.9 80.8 83.9 82.9 68.2 - - 5.11 4.28 4.09 4.30 3.94; 3. 3) -D-Galp-(1 105.9 73.3 74.1 70.2 76.7 62.6 - 4.61 3.70 3.65 3.92 3.68 3.82, 3.4)--D-Galp-(14 104.9 73.2 74.2 79.2 76.1 62.6 - 4.62 3.52 3.66 4.16 3.71 3.82; 3.4)--D-Galp-(16 104.9 72.3 73.8 79.2 76.1 62.6 - 4.50 3.53 3.76 4.16 3.71 3.82; 3.Кроме того, образцы розолинана RRIII-2S и сорбана SAII содержат О-ацетильные группы, наличие которых подтверждается корреляционными пиками С/Н-атомов при 72.2/5.10 и 5.18 м.д (Рис. 1 и 2).
Рисунок 1 - Спектр Н1/13С HSQC розолинана RRIII-2S Рисунок 2 - Спектр Н1/13С HSQC сорбана SAII 3. Розолинаны и сорбаны каллусных тканей Культивирование каллусной ткани околоплодников шиповника морщинистого проводили на среде Мурасиге-Скуга (MS), содержащей витамины по Стаба, а также глюкозу и сахарозу (по 15 г/л). В качестве фитогормонов использовали: 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) - 4.0 мг/л; 6-бензиламинопурин (6-БАП) - 0.2 мг/л. Каллусную ткань стебля рябины выращивали на среде MS, содержащей 30 г/л сахарозы, 2,4-Д - 1.0 мг/л и 6-БАП - 0.1 мг/л. Каллусы культивировали в темноте при 26 С в течение 21 сут. Экстракцию полисахаридов из каллусов проводили водой при 68 С (фракции RRcI и SAсI) и 0.7% ным оксалатом аммония при 68 С (фракции RRcII и SAсII) (Табл. 9).
Таблица 9 - Состав полисахаридных фракций каллусов шиповника и рябины Фракция Выход, DM,% Содержание, % % Гликуро Ara Gal Rha Xyl Man Glc Белок новые кислоты RRcI 2.3 Н.о. 4 5.0 19.0 0.5 3.7 0.8 16.5 47.RRcII** 5.1 11 45 2.6 5.2 1.4 0.8 0.4 1.8 8.SAсI 2.6 6 9 12.4 42.0 1.5 7.6 Сл. 21.6 Н.о.
SAсII** 2.4 25 66 4.7 4.7 1.9 1.3 0.2 1.7 6.Примечания. - в пересчёте на сухой растительный материал; ** - идентифицированы остатки галактуроновой кислоты Как следует из результатов, приведённых в табл. 9, фракции RRсI и SAсI (Mn - 18517 Да, Mw - 122565 Да) представлены полисахаридами с высоким содержанием остатков галактозы, глюкозы, арабинозы и ксилозы, т.е. в клетках каллуса наблюдается переключение биосинтеза углеводов на образование резервных полисахаридов. Полисахаридные фракции RRсII (Mn - 7728 Да, Mw - 40009 Да) и SAсII (Mn - 12480 Да, Mw - 80545Да) имеют состав, типичный для розолинанов и сорбанов протопектина плодов, но содержат меньше остатков арабинозы (примерно в 4,2 и 2,6 раза соответственно). При разделении полисахаридной фракции RRcI и розолинана RRcII на сефакриле S-5получены основные фракции RRcIs (K - 0.75, [] =+13, с. 0.1) и av D RRcIIs (K - 0.79, [] =+150, с. 0.1) с выходами 32 % и 57 % av D соответственно (Табл. 10).
Таблица 10 - Состав полисахаридов каллусной ткани шиповника после разделения на сефакриле S-5Фракция Выход, DM, Содержание, % % % Гликуроновые Ara Gal Rha Xyl Man Glc Белок кислоты RRсIs 31 Н.о. 6 9.4 28.9 1.0 5.3 0.7 16.3 8.RRсIIs** 57 Н.о. 63 3.6 6.5 1.9 1.0 Сл. 1.7 1.SAсIs 57 Н.о. 18 20.2 50.3 1.9 3.7 Сл. 5.2 6.SAсIIs** 66 29 70 5.5 4.2 0.6 0.6 Сл. 0.5 3. Примечания. - от количества полисахарида, нанесённого на колонку; ** - идентифицированы остатки галактуроновой кислоты Высокое содержание остатков галактозы и глюкозы во фракции RRcI-s указывает на то, что она образована галактанами и глюканами.
При разделении растворимых полисахаридов SAсI и сорбанов SAсII каллуса рябины на сефакриле S-500 также получены две основные фракции SAсIs и SAсIIs ([] =+104, с. 0.1), которые составляют D более половины от исходных SAсI и SAсII и имеют K равные 0.10 и, av 0.14 соответственно (Табл. 10). Фракции RRcII-s и SAсIIs, полученные при гельфильтрации розолинана и сорбана каллусов, представляют собой пектиновые полисахариды с содержанием остатков галактуроновой кислоты 63-70%, которые, в отличие от пектинов плодов, содержат меньше остатков арабинозы, галактозы и рамнозы.
Ионообменной хроматографией розолинана RRсII и сорбана SAсII на DEAE-целлюлозе были получены фракции полисахаридов, которые элюировались 0.2М (RRсII-1d, SAсII-1d) и 0.3М (RRсII-2d, SAсII-2d) растворами NaCl (Табл. 11).
Таблица 11 - Характеристика фракций полисахаридов после разделения розолинанов каллуса на DEAE-целлюлозе Фракция Выход, []20 DM, D %* % Содержание, % GalA Ara Gal Rha Xyl Man Glc Белок RRсII-1d 16 +173 Н.о. 67 5.3 4.6 2.5 0.3 Сл. 2.9 4.RRсII-2d 40 +189 Н.о. 71 2.3 2.1 1.6 Сл. Сл. 1.2 2.SAсII-1d 26 +128 Н.о. 75 3.4 1.0 0.2 Сл. Сл. Сл. 6.SAсII-2d 24 +226 14 77 1.0 0.6 0.4 0.2 Сл. Сл. 5. Примечания. - от количества полисахарида, нанесённого на колонку Как следует из приведённых в табл. 11 результатов они представлены низкометилэтерифицированным линейным галактуронаном или слаборазветвлённым рамногалактуронаном, содержащим минорные количества нейтральных моносахаридов (в основном остатки галактозы и арабинозы). Фракции SAсII-1d и SAсII2d относительно гомогенны по молекулярным массам (Mn - 13291 Да и 22035, Mw - 59894 Да и 66626 Да соответственно).
Анализ розолинана RRсIIs и сорбана SAcIIs каллусов шиповника и рябины методом метилирования указывает на то, что в состав их боковых углеводных цепей входят 1,4-связанные остатки ксилопиранозы и глюкопиранозы, 1,5-связанные остатки арабинофуранозы, 1,6-связанные остатки маннопиранозы и галактопиранозы. В составе углеводных цепей SAcIIs идентифицированы также 1,4-связанные остатки галактопиранозы. На терминальных концах углеводных цепей розолинанов и сорбанов локализованы остатки глюкопиранозы и ксилопиранозы.
4. Розолинаны в процессе созревания плодов R. rugosa Для изучения динамики накопления пектиновых полисахаридов и изменения их состава были выделены фракции розолинанов на разных стадиях созревания плодов шиповника морщинистого. Экстракцию розолинанов из плодов проводили водой при 68 С (фракции RRIV, RRV и RRVI) и 0.7 %-ным водным раствором оксалата аммония при С (фракции RRVII, RRVIII и RRIX) (Табл. 12).
Таблица 12 - Изменение состава розолинанов в процессе созревания плодов R. rugosa Степень Фракция Выход, Характер DМ, Содержание, % зрелости %* истическ % GalA Ara Gal Rha Xyl Man Glc плодов ая вязкость, дл/г Зелёные RRIV 7.4 6.57 73 48 6.3 2.8 1.1 0.4 2.0 10.RRVII 14.8 3.05 50 71 18.3 4.7 3.4 Сл. 0.3 1.Полузрелые RRV 19.7 3.35 63 69 9.1 2.3 2.2 0.4 0.7 6.RRVIII 9.7 1.11 49 72 17.7 3.5 3.7 0.6 0.3 0.Зрелые RRVI 14.1 0.80 42 62 11.5 4.8 2.9 0.6 0.6 6.RRIX 5.7 0.99 23 74 14.9 3.6 3.4 0.6 0.4 1.Примечание. * в пересчёте на сухую массу обезжиренного материала В процесс созревания плодов происходит рост содержания в них растворимых пектиновых полисахаридов с 7.4 % (RRIV) до 19.% (RRV), с последующим снижением до 14.1 % (RRVI) при достижении стадии физиологической зрелости. В то же время количество розолинанов, входящих в состав протопектина клеточных стенок последовательно снижается с 14.8 % до 5.7 %. Содержание остатков галактуроновой кислоты во фракциях розолинанов также претерпевает изменения. В растворимых розолинанах сначала наблюдается рост содержания галактуроновой кислоты до 69 %, а затем снижение её количества до 62 %. В розолинанах протопектинового комплекса происходит постепенное накопление галактуроновой кислоты до 74 %. Из нейтральных моносахаридов наибольшему изменению подвержены остатки арабинозы, глюкозы и маннозы. По мере созревания плодов снижается степень метилэтерифицирования остатков галактуроновой кислоты розолинанов и вязкость их водных растворов, что вероятно связано с активизацией действия пектинэстераз и эндо-полигалактуроназ.
5. Антимикробная активность розолинанов и сорбанов При определении антимикробной активности пектиновых полисахаридов показано, что сорбаны SAII практически полностью подавляют рост Staphylococcus aureus 6538-р АТСС уже через 1 ч воздействия на бактериальные клетки.
6. Обоснование ресурсо- и энергосберегающей технологии переработки плодов шиповника Предложена технологическая схема ресурсо- и энергосберегающей технологии переработки плодов шиповника, которая предусматривает отделение мякоти плодов от семян в начале технологической цепочки и их раздельную переработку с целью максимального выделения розолинанов и получения сиропа шиповника, обогащенного пектином (Рис. 3).
Плоды шиповника Механическое разделение Мякоть плодов Семена шиповника Экстракция органическим растворителем Каротолин (каротиноиды) Обезжиренная Шрот семян Масло шиповника мякоть Экстракция водой Сироп шиповника, обогащённый пектином Влажный шрот Кормовая добавка Рисунок 3 - Схема ресурсо- и энергосберегающей технологии переработки плодов шиповника Для этого на первой стадии проводят экстракцию из них липидной составляющей органическими растворителями, а на второй - водную экстракцию обезжиренной мякоти. Влажный остаток мякоти после гидротермической обработки смешивают с обезжиренным шротом семян и высушивают. Сухой продукт представляет собой кормовую добавку в рацион пушных зверей. Проведённые зоотехнические испытания показали эффективность её использования в рационах клеточной ондатры в период размножения.
Выводы 1. В ходе проведённого скрининга ряда растений семейства розоцветных Rosaceae показано, что водорастворимые полисахариды плодов шиповника морщинистого и рябины обыкновенной представлены пектинами: розолинанами и сорбанами.
2. Установлено, что углеводные цепи розолинанов и сорбанов имеют общий характер молекулярного строения. Они содержат протяжённые линейные области частично метилэтерифицированного гомогалактуронана (рамногалактуронана) и разветвлённые области, содержащие нейтральные моносахаридные остатки, характерные для рамногалактуронана-I (RG-I).
3. С помощью ЯМР-спектроскопии, периодатного окисления и метода метилирования выявлено, что в составе боковых углеводных цепей розолинанов и сорбанов содержатся области, образованные 1,5связанными остатками -L-арабинофуранозы. В их состав входят также 1,4- и 1,6-связанные остатки глюкопиранозы и 1,4-связанные остатки ксилопиранозы, а для сорбанов показано наличие 1,4-связанных остатков -D-галактопиранозы На терминальных концах углеводных цепей локализованы остатки -L-арабинофуранозы, -Dгалактопиранозы, глюкопиранозы и ксилопиранозы. Разветвление боковых цепей розолинанов имеет место по С3-положению остатков L-арабинофуранозы.
4. Впервые показано, что розолинаны и сорбаны, входящие в протопектиновый комплекс каллусов околоплодников шиповника морщинистого и стебля рябины обыкновенной по составу и строению основных и боковых углеводных цепей идентичны розолинанам и сорбанам плодов нативных растений.
5. При определении антимикробной активности пектиновых полисахаридов шиповника и рябины выявлено, что водные растворы сорбанов на 97% снижают количество жизнеспособных клеток Staphylococcus aureus.
6. Полученные данные позволяют обосновать технологию комплексной переработки плодов шиповника для получения витаминизированного сиропа с содержанием пектинов до 2,1 % и кормовой добавки на основе шрота шиповника.
Список публикаций, отражающих основное содержание работы Публикации в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией РФ:
1. Злобин А.А., Оводова Р.Г., Попов С.В. Общая химическая характеристика водорастворимых полисахаридов плодов шиповника морщинистого Rosa rugosa // Химия раст. сырья. - 2003. - №2. - С.
39-44.
2. Злобин А.А., Оводова Р.Г. Водорастворимые пектины в процессе созревания плодов Rosa rugosa (Rosaceae) // Раст. ресурсы. - 2007. - Т. 43, Вып. 2. - С 52-59.
3. Злобин А.А., Жуков Н.А., Оводова Р.Г., Попов С.В. Состав и свойства пектиновых полисахаридов шрота шиповника // Химия раст.
сырья. - 2007. - №4. - С. 91-94.
4. Злобин А.А., Жуков Н.А., Оводова Р.Г. Химическая характеристика водорастворимых полисахаридов каллусной ткани шиповника морщинистого Rosa rugosa Thunb. // Химия раст. сырья. - 2008. - №1. - С. 51-55.
5. Злобин А.А., Мартинсон Е.А., Литвинец С.Г., Овечкина И.А., Дурнев Е.А., Оводова Р.Г. Пектиновые полисахариды рябины обыкновенной Sorbus aucuparia L. rugosa // Химия раст. сырья. - 2011 - №. 1 - С. 39-44.
6. Злобин А.А., Мартинсон Е.А., Овечкина И.А., Дурнев Е.А., Оводова Р.Г., Литвинец С.Г. Состав и свойства пектиновых полисахаридов зверобоя продырявленного Hypericum perforatum L. // Химия раст. сырья. - 2011 - №1. - С. 33-38.
7. Злобин А.А., Мартинсон Е.А., Оводов Ю.С. Антиоксидантная и антимикробная активность пектинов ряда растений Европейского Севера России // Известия Коми научного центра УрО РАН. - Вып.
3(7). Тез. докл. - Сыктывкар. - 2011. - С. 33-37.
Публикации в других печатных изданиях:
8. Мартинсон Е.А., Злобин А.А., Жуков Н.А. Биологически активная добавка к пище на основе масла шиповника - бальзам Биойл. Тезисы докладов Всероссийской студенческой научной конференции с международным участием Студенты России - пищевой промышленности XXI века. Сб. докладов. - Краснодар, 1998.
- С. 108-109.
9. Мартинсон Е.А., Злобин А.А., Жуков Н.А. Об опыте производства биологически активных добавок из плодов шиповника в ВятГУ // Сборник материалов Всероссийской научно-технической конференции Лекарственные средства и пищевые добавки на основе растительного сырья. Тез. докл. - Бийск, 2001. - Т. 2. - С. 43-46.
10. Злобин А.А. Выделение и общая характеристика полисахаридов плодов шиповника Rosa cinnamomea и R. rugosa // Сборник материалов IV международного семинара Новые и нетрадиционные растения, перспективы их использования. Москва, Российский университет дружбы народов. - 2001. - Т.1. - С. 246-250.
11. Жуков Н.А., Мартинсон Е.А., Злобин А.А. Шире использовать ресурсы местного лекарственно-технического сырья.
Тезисы докладов. Второй областной общественной конференции Экология. Здоровье. Жизнь. - Киров, 2002. - С. 106-110.
12. Жуков Н.А., Мартинсон Е.А., Злобин А.А. Расширение ассортимента продуктов комплексной переработки плодов шиповника с повышенной биологической активностью. Тезисы докладов отчетной конференции Химия и химические продукты. - Киров, 2002. - С.
140.
13. Злобин А.А., Богданова М.М. Сезонное изменение состава и свойств пектиновых полисахаридов Rosa rugosa Thunb // Всероссийская научно-техническая конференция Наука-производство-технологияэкология. Сб. докладов. - Киров, 2004. - Т. 2. - С. 188-189.
14. Злобин А.А., Оводова Р.Г. Динамика содержания и состава пектиновых полисахаридов в процессе созревания плодов шиповника морщинистого Rosa rugosa. Всероссийская научно-техническая конференция Наука-производство-технология-экология. Сб.
материалов. - Киров, 2004. - Т.3. - С. 15-17.
15. Жуков Н.А., Злобин А.А., Мартинсон Е.А. Биохимия и биотехнология плодов дикорастущего шиповника VI Международный форум Биотехнология и современность Сб. материалов. - С.Петербург, 2005. - С. 46-47.
16. Злобин А.А., Жуков Н.А., Оводова Р.Г. Структурная характеристика пектиновых веществ мякоти плодов шиповника морщинистого Rosa rugosa Thunb. I и II Научные семинары Исследования, оценка и контроль качества биологически активных веществ. Сб. материалов. - Киров, 2006. - С. 69-78.
17. Злобин А.А., Рублева Л.И. Пектиновые полисахариды шрота шиповника Всероссийская научно-техническая конференция Наукапроизводство-технология-экология. Сб. материалов. - Киров, 2006. - Т.3. - С. 189-191.
18. Мартинсон Е.А., Кропачев Д.А., Злобин А.А., Жуков Н.А.
Биохимия и биотехнология плодов дикорастущих растений.
Международный конгресс по биотехнологии. Сб. материалов. - Москва, 2007. - С. 196.
19. Злобин А.А., Овечкина И.А., Зубова Ю.О. Структурнохимическая характеристика пектинов рябины обыкновенной Sorbus aucuparia L.// Сборник материалов Ежегодной научно-технической конференции Общество, наука, инновации - Киров, 2011. - Т. 3. - С.
19-21.