Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине  

На правах рукописи

       

Шмыгарева Анна Анатольевна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КРУШИНЫ ЛОМКОЙ И КРУШИНЫ  СЛАБИТЕЛЬНОЙ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Самара - 2012

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовантельном учреждении высшего профессионального образования Самарский госундарственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социальнного развития Российской Федерации

Научный руководитель:

Куркин Владимир Александрович - доктор фармацевтических наук, профессор 

Официальные оппоненты:

Киселева Татьяна Леонидовна -  профессор кафедры фармакогнозии Государственного бюджетного образовантельного учреждения высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова Министерства здравоохранения и социальнного развития Российской Федерации, доктор фармацевтических  наук, профессор

Буланова Анджела Владимировна - профессор кафедры физической химии и хроматографии Федерального бюджетного образовантельного учреждения высшего профессионального образования Самарский госундарственный университет, доктор химических наук, профессор        

                               

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионнального образования Курский государственный медицинский университет Миннистерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится 02 ноября 2012 г. в 10.00 часов на заседании диссертационнного совета Д 208.085.06 при Государственном бюджетном образовантельном учреждении высшего профессионального образования Самарский госундарственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социальнного развития Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К.Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовантельного учреждения высшего профессионального образования Самарский госундарственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социальнного развития Российской Федерации (г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171).

Автореферат разослан л________________ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук,

доцент И.К. Петрухина

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В настоящее время интерес к лекарственным средствам на основе растительного сырья по-прежнему велик, причем в Государственном реестре лекарственных средств Российской Федерации наблюдается тенденция к увеличению удельного веса препаратов растительного происхождения (Самылина И.А., 2006;  Киселева Т.Л., 2010; Куркин В.А., 2007). На отечественном фармацевтическом рынке группа слабительных лекарственных средств в основном представлена препаратами на основе сырья сенны или кассии. Что же касается зарегистрированной в РФ номенклатуры препаратов крушины ломкой и крушины слабительной (жостера слабительного), то она хотя и разнообразна  (Рамнил, Викаир, Викалин, Сироп крушины,  Холагол, Желудочный сбор № 3, Проктофитол, фиточай Целебная поляна № 3 для похудения и др.), однако ее реальный ассортимент в аптечных организациях представлен в основном сырьем коры крушины ломкой и плодами жостера слабительного.

Одной из важнейших предпосылок  создания лекарственных препаратов  на основе коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного является необходимость глубокого изучения химического состава, а также совершенствования методов стандартизации. Дело в том, что литературные  данные  относительно химического состава коры крушины ломкой не лишены противоречивости. Кроме того, фитохимические аспекты показателей качества сырья крушины ломкой и жостера слабительного также нуждаются в дальнейшем изучении. Так, раздел Качественные реакции в фармакопейной статье (ФС) Кора крушины ломкой (Государственная фармакопея СССР XI издания) включает только пробирочные реакции, хотя в этом плане перспективным методом является тонкослойная хроматография (ТСХ). Методика количественного определения суммы антраценпроиз-водных в коре крушины является многостадийной, включает такие стадии, как кислотный гидролиз, многократную экстракцию сырья, обработку диэтиловым эфиром - легкокипящим огнеопасным растворителем. При этом расчет содержания  суммы производных антрацена осуществляется на отсутствующий в сырье истизин, причем с использованием построения калибровочного графика раствора кобальта хлорида. Что же касается плодов жостера слабительного, то в разделе Качественные реакции ФС представлены  лишь пробирочные реакции, при этом  раздел Количественное определение  отсутствует. Актуальна также задача по изучению коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного в сравнительном плане.

Решение проблемы совершенствования химической стандартизации новых лекарственных средств (ЛС) связано с разработкой объективных и унифицированных методов анализа сырья и препаратов, причем с использованием стандартных образцов (Арзамасцев А.П. и др., 2000; Самылина И.А. и др., 1994; 2006).

Цель и задачи исследования. Сравнительное фармакогностическое  исследование  коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного в плане совершенствования методов стандартизации сырья данных растений.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Сравнительное изучение химического состава коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного.
2. Разработка новых подходов к стандартизации сырья коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного.
3. Сравнительное исследование анатомо-гистологических признаков коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного для уточнения диагностических особенностей данного лекарственного растительного сырья.
4. Разработка методик качественного анализа коры крушины ломкой.
5. Разработка методик качественного анализа плодов жостера слабительного.
6. Разработка методики количественного определения суммы антраценпроизводных в коре крушины ломкой.
7. Разработка методики количественного определения суммы антраценпроизводных в плодах жостера слабительного.
8. Разработка и оформление проектов нормативной документации (НД) на сырье Крушины ломкой кора и Жостера слабительного плоды.

Научная новизна. В результате изучения химического состава коры крушины ломкой (Frangula alnus Mill.) и плодов жостера слабительного (Rhamnus cаthartica L.) выделены и идентифицированы с использованием УФ-, 1Н-ЯМР- ИК-спектроскопии и масс-спектрометрии, а также результатов химических превращений 5 индивидуальных соединений, среди которых доминирующие антраценпроизводные вещества (франгулин А и франгулин В) и флавоноидное вещество (3-О-рутинозид рамнетина) впервые описаны в РФ для данных растений. Показана целесообразность проведения стандартизации сырья коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного по антраценпроизводным (ведущая группа БАС) с использованием стандартного образца франгулина А.

Разработаны подходы к стандартизации, заключающиеся в обнаружении диагностического доминирующего антраценпроизводного - франгулина А в коре крушины ломкой и доминирующего флавоноида - 3-О-рутинозида рамнетина в плодах жостера слабительного с использованием ТСХЦанализа, УФ-спектроскопии.

       Практическая значимость. Разработаны методики качественного анализа коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного с использованием ТСХ и УФ-спектроскопии. Разработана методика количественного определения суммы антраценпроизводных в коре крушины ломкой с использованием спектрофотометрии (аналитическая длина волны - 524 нм) и методического подхода, исключающего такие стадии, как кислотный гидролиз, многократную экстракцию сырья, обработку диэтиловым эфиром, построение калибровочного графика раствора кобальта хлорида. Разработана методика количественного определения суммы антраценпроизводных в плодах жостера слабительного. В проекты ФС Крушины ломкой кора и Жостера слабительного плоды предложено ввести новые разделы Качественные реакции и Количественное определение и числовые показатели Содержание суммы антраценпроизводных не менее 5,0%  для коры крушины  и Содержание суммы антраценпроизводных не менее 2,5% для плодов жостера.

Разработаны проекты ФСП Крушины ломкой кора и Жостера слабительного плоды, которые рекомендованы для включения  в Государственную Фармакопею Российской Федерации XII издания.

       Результаты исследований используются в научных изысканиях и в учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета (акты внедрения от 07.09.2012 г.). Получено рационализаторское предложение Методика количественного определения суммы  антраценпроизводных в  лекарственном растительном сырье - плодах жостера слабительного (2012 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты анатомо-гистологического исследования коры крушины ломкой.
2. Результаты анатомо-гистологического исследования плодов жостера слабительного.
3. Результаты сравнительного изучения химического состава коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного.
4. Результаты исследований по разработке подходов к стандартизации ЛРС - коры крушины ломкой,  плодов жостера слабительного.
5. Методики качественного анализа ЛРС Крушины ломкой кора с использованием РСО франгулина А, ТСХ, спектрофотометрии и ВЭЖХ.
6. Методики качественного анализа ЛРС Жостера слабительного плоды с использованием РСО франгулина А, ТСХ, спектрофотометрии и ВЭЖХ.
7. Методики количественного определения антраценпроизводных ЛРС Крушины ломкой кора с использованием спектрофотометрии и стандартного образца франгулина А.
8. Методики количественного определения антраценпроизводных в ЛРС Жостера слабительного плоды с использованием спектрофотометрии  и стандартного образца франгулина А.

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная ранбота выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего пронфессионального образования Самарский государственный медицинский универсинтет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по темам: Комплексные исследования по проблеме создания новых лекарственных препаратов природного и синтетического происхождения (№ Государственной регистрации 01200900658) и Фармакогностическое и химико-фармацевтическое исследование лекарственных растений и фитопрепаратов  (№ Государственной регистрации 01200405620), а также соответствует  тематике Проблемной комиссии по химико-фармацевтическим наукам Государственного бюджетного образовантельного учреждения высшего профессионального образования Самарский госундарственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социальнного развития Российской Федерации.

Апробация работы и публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на 4-ой Всероссийской  с международным участием научно-методической конференции Фармобразование 2010 (Научные основы создания новых лекарственных средств, Воронеж, 2010); на межвузовской конференции Аспирантские чтения (Самара, 2010, 2011, гг.); на Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 75-летию со дня рождения В.В. Кормачева Современные проблемы химической науки и образования (Чебоксары, 2012); на II Международном конгрессе Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации (Москва, 2012).

Основное содержание диссертации опубликовано в 12 научных работах, из них 6 статей в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на  148 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц, 38 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, пяти глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований,  их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 138 источников, из которых 48 на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту. Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований крушины ломкой и жостера слабительного, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава растения, фармакологической активности, применению в медицинской практике. В главе 2 представлены характеристика объектов и методов исследования. Приведены методики химического, физического и физико-химического изучения лекарственного сырья и индивидуальных веществ. В главе 3 обсуждаются результаты сравнительного анатомо-морфологического исследования коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного. В главе 4 приведены результаты сравнительного химического исследования коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного. В главе 5 рассматриваются результаты сравнительного исследования компонентного состава коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. В главе 6 приводятся результаты  исследования методов по совершенствованию методов стандартизации коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного.

В главе 7 представлены результаты исследований по разработке проектов нормативной документации на сырье Крушины ломкой кора и Жостера слабительного плоды.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Сравнительное анатомо-морфологическое исследование коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного

Исследования морфолого-анатомического строения изучаемого сырья (рис. 1-4) проводили с использованием цифрового микроскопа Motic DM111 (с кратностью увеличения 4х10; 10х10; 40х10; 100х10) и цифрового стереоскопического микроскопа Motic DM-39С-N9GO-A (возможность увеличения: х 20; х 40). Приготовление микропрепаратов проводили в соответствии с ГФ СССР XI издания.

Рис.  1.  Поперечный срез двухлетнего побега крушины ломкой (х40) Обозначения: I - покровные ткани; II - ткани первичной коры; III - ткани вторичной коры (луб); IV - древесина; V - сердцевина; 1 - пробка; 2 - колленхима; 3 - слизесодержащие вместилища в паренхиме первичной коры; 4 - мягкий луб; 5 - первичные волокнистые пучки; 6 - сосуды древесины; 7 - слизесодержащее  вместилище в паренхиме сердцевины.

Рис. 2. Схизогенное вместилище в первичной коре стебля крушины ломкой (окраска раствором сернокислого анилина) (х400) Обозначения: 1 - клетки паренхимы; 2 - выстилающие клетки вместилища; 3 - полость; 4 - первичные механические волокна.

Микроскопическое исследование коры крушины (рис. 1 и 2) позволило выявить диагностические признаки сырья, заключающиеся в наличии темно-красного широкого слоя пробки;  пластинчатой колленхимы; паренхимы, состоящей из овальных клеток  и  содержащей большое количество друз оксалата кальция. Характерны слизесодержащие вместилища в паренхиме первичной коры; одно-, двух-, трехрядные  изогнутые сердцевинные лучи с желтым содержимым; мягкий луб; первичные волокнистые пучки; сосуды древесины;  группы  желтоватых  одревесневших лубяных волокон с толстыми стенками, окруженными кристаллоносной обкладкой; слизесодержащее  вместилище в паренхиме сердцевины.

Рис.  3. Поперечный срез двухлетнего побега жостера слабительного (х 40) Обозначения: I - покровные ткани; II - ткани первичной коры; III - ткани вторичной коры (луб); IV - древесина; V - сердцевина; 1 - пробка; 2 - колленхима; 3 - первичные волокнистые пучки; 4 - разрывы паренхимы первичной коры; 5 - твердый луб;  6 -  сосуды; 7 -  древесина;  8 -  клетка сердцевины.	Рис. 4. Поперечный срез коры жостера слабительного (х100) Обозначения: 1 - фрагмент чечевички; 2 -  пробка; 3 - колленхима; 4 - первичные механические волокна;  5  - луб.

Основной  диагностический признак, отличающий кору крушины ломкой (рис. 1 и 2) от коры жостера слабительного (3 и 4), - наличие слизесодержащих вместилищ в паренхиме первичной коры только у крушины ломкой. Необходимо отметить, что указанный диагностический признак отсутствует в ФС № 2. С целью  усовершенствования раздела Микроскопия в ФС на плоды жостера слабительного проводились сравнительные исследования их анатомии и гистологии с плодами крушины ломкой. Важно подчеркнуть, что плоды крушины являются примесью к плодам жостера, при этом морфологически имеют схожее строение, не позволяющее отличить их на макроскопическом уровне. Были подтверждены имеющиеся в тексте ФС анатомические и гистологические признаки плодов, заключающиеся в особенностях строения экзо- и мезокарпия,  а также особенностях строения кожуры семени (рис. 5 и  6).

Рис. 5. Поперечный срез плода жостера слабительного  (х 40)

Рис.  6.  Поперечный срез плода крушины ломкой (х 40)

Из-за особенностей морфологии плода плодоножка остается на нем. В большинстве случаев она попадает в сырье, ввиду чего является постоянным компонентом сырья и может быть использована для его диагностики.

Необходимо отметить тот факт, что особенности анатомии плодоножки  ранее не использовались в диагностике изучаемых нами видов. Поперечные срезы плодоножек неоднородны, нами в анализе плодоножки использованы срезы апикальной и базальной части. При первичном рассмотрении общей картины  поперечный срез плодоножки жостера имеет строго округлую форму, а у крушины он неравномерно-ребристый. Отличительным признаком являются также особенности гистологии первичной коры. Особенности заключаются в наличии пигмента красно-фиолетового цвета в клетках паренхимы плодоножек жостера на фоне отсутствия такового у крушины. Паренхима плодоножек крушины в свою очередь отличается от жостера наличием слизесодержащих вместилищ  (рис. 7 и 8).

По результатам проведенных исследований нами выявлены отличительные особенности плодов жостера от плодов близкородственного вида  крушины ломкой, а также  усовершенствован раздел Микроскопия в ФС на плоды жостера.

Рис. 7.  Поперечный срез плодоножки жостера слабительного (х100)	Рис. 8.  Поперечный срез плодоножки крушины ломкой (х100)

2. Сравнительное исследование химического состава коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного

2.1. Фитохимическое исследование лекарственного растительного сырья  коры крушины ломкой

В результате изучения химического состава коры крушины ломкой выденлены и идентифицированы 3 индивидуальных соединения, относящиеся к антраценпроизводным, среди которых впервые в Российской Федерации выделены франгулин А и франгулин В (табл. 1).

Для установления структуры выделенных веществ использованы данные ТСХ-анализа, УФ-, 1Н-ЯМР-спектров, масс-спектрометрии, ИК-спектрометрии, результаты химических превращений, а также ненпосредственное сравнение с достоверными образцами веществ.

Таблица 1

Физико-химические константы веществ,

выделенных из коры крушины ломкой

№	Название, химическая формула	Состав	М+	Т.пл., оС	λmax(EtOH), нм
1.	Франгулин А	С21Н20О9	270 (М+ агли-кона)	227-230	225, 262, 285, 300пл, 434
2.	Франгулин В	С20Н18О9	270 (М+ агли-кона)	184-187	224, 263, 285, 300пл, 434
3.	Эмодин	С15Н10О5	270	254-255	222, 250, 268, 290, 439, 461

В частности, в 1Н-ЯМР-спектре франгулина А (1) обнаруживаются два однопротонных  синглетных сигнала при 11.85 и 12.00 м.д., принадлежащих 5-ОНЦ и 8-ОН группам (рис. 9), что свидетельствует о присоединении рамнозы к 6-ОН-группе франгула-эмодина (3). Наличие рамнозы в молекуле франгулина А подтверждается результатами кислотного гидролиза, а также характерным трехпротонным дублетным сигналом 1Н-ЯМР-спектре с J = 6 Гц при 1.14 м.д. (СН3 рамнозы) и уширенным синглетом при 5.60 м.д. (Н-11 рамнопиранозы).

Рис.  9. 1Н-ЯМР-спектр франгулина А в дейтерированном ДМСО

2.2. Фитохимическое исследование лекарственного растительного сырья плодов жостера слабительного

В результате изучения химического состава плодов жостера слабительного выделены 3 индивидуальные вещества, относящиеся к антраценпроизводным (франгулин А, 1-О--D-глюкопиранозид эмодина) и флавоноидам (3-О-рутинозид рамнетина) (табл. 2).

Для установления структуры выделенных веществ использованы данные ТСХ-анализа, УФ-, 1Н-ЯМР-спектров, результаты химических превращений, а также ненпосредственное сравнение с достоверными образцами веществ.

Таблица 2

Физико-химические константы веществ,

выделенных из плодов жостера слабительного

№	Название, химическая формула	Состав	М+	Т.пл., оС	λmax(EtOH), нм
1.	Франгулин А	С21Н20О9	270 (М+ агли-кона)	227-230	225, 262, 285, 300пл, 434
2.	3-О-рутинозид рамнетина	С28Н32О16	318 (М+ агли-кона)	193-195	264, 272 пл, 368 нм
3.	1-О--D-глюкопиранозид эмодина	С21Н20О10	270 (М+ агли-кона)	225-229	229, 271, 422

На основании данных УФ-спектров можно сделать выводы лишь об относительной схожести данных лекарственных растений (рис. 10 и 11). Как в крушине ломкой, так и в жостере содержатся антраценпроизводные, что обусловливает их медицинское применение. Однако в плодах жостера, в отличие от коры крушины, где доминирующим веществом является франгулин А (рис. 10), доминирует флавоноид - 3-О-рутинозид рамнетина (рис. 11).

Рис. 10 . Электронные спектры раствора водно-спиртового извлечения коры крушины ломкой (1), испытуемого раствора (2) и раствора франгулина А (в присутствии щелочно-аммиачного раствора) (3)

Рис. 11. Электронные спектры раствора водно-спиртового извлечения плодов жостера слабительного (1), щелочно-аммиачного раствора плодов жостера слабительного (2)

В результате сравнительного исследования компонентного состава водно-спиртовых извлечений коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного методом ИК-спектрометрии определено, что в случае крушины ломкой диагностическое значение имеют антрагликозиды  франгулин А и франгулин В (в  ИК-спектрах франгулина А и В, в структуре которых имеются  две карбонильные группы, обнаруживаются две характерные  интенсивные полосы поглощения в области 1625-1620 см-1), тогда как в случае  жостера слабительного - флавоноидное соединение - 3-О-рутинозид рамнетина, который является доминирующим компонентом сырья данного растения.

Полученные результаты ИК-спектрометрии могут быть использованы для целей стандартизации сырья и препаратов близкородственных  растений (раздел Качественные реакции).

3. Сравнительное исследование компонентного состава коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии

Принимая во внимание то обстоятельство, что химический состав коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного имеет как общие, так и отличительные признаки, нами предпринята попытка изучить возможности использования высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для целей стандартизации сырья и препаратов данных растений.

Сравнительное исследование компонентного состава водно-спиртовых извлечений из коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного методом ВЭЖХ осуществляли с использованием веществ, выделенных из сырья данных растений, а именно: франгулин А (6-О--L-рамнопиранозид франгула-эмодина), франгулин В (6-О--D-апиофуранозид франгула-эмодина), франгула-эмодин, или эмодин (1,6,8-тригидрокси-3-метилантрахинон), 1-О--D-глюкопиранозид эмодина, 8-О--D-глюкопиранозид эмодина и 3-О-рутинозид рамнетина (3,5,31,41-тетрагидрокси-7-метоксифлавон).

Полученное извлечение анализировали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографе (колонка Себсил С-18, Jasco в изократическом режиме, стационарная фаза - Separon  С-18, подвижная фаза - смесь ацетонитрила и воды (4:6) с добавлением 1% ледяной уксусной кислоты, скорость потока - 0,1 мл/мин), детекцией веществ при длине волны max  420 нм (антраценпроизводные) и 260 нм (флавоноиды).

Исследование показало, что доминирующим компонентом водно-спиртовых извлечений из коры крушины ломкой является франгулин А (антрагликозид) (рис. 12), время удерживания  которого практически совпадает с таковым на хроматограмме франгулина А  и обнаруживается также на хроматограмме водно-спиртовых извлечения из плодов жостера слабительного (рис. 13). В случае водно-спиртовых извлечения из плодов жостера слабительного доминирует 3-О-рутинозид рамнетина (флавоноид) (рис. 13), время удерживания  которого практически совпадает с таковым на хроматограмме 3-О-рутинозида рамнетина. Что касается других компонентов, то с точки зрения диагностической значимости в коре крушины ломкой представляет интерес франгулин В, хотя обнаруживаются и другие вещества, в частности, 8-О-глюкопиранозид франгула-эмодин и эмодин. В случае плодов жостера слабительного диагностическим компонентом следует считать флавоноидное соединение - 3-О-рутинозид рамнетина, который является доминирующим компонентом.

Рис. 12.  Схема хроматограммы ВЭЖХ водно-спиртового извлечения из коры крушины ломкой (длина волны Ц 420 нм)

Обозначения пиков веществ:

1. - франгулин В;
2. - 8-О--D-глюкопиранозид эмодина;
3. - франгулин А;
4. - эмодин.

Рис. 13. Схема хроматограммы ВЭЖХ водно-спиртового извлечения из плодов жостера слабительного (длина волны - 260 нм)

Обозначения пиков веществ:

1. - 3-О-рутинозида рамнетина + франгулин В;
2. - 1-О--D-глюкопиранозид эмодина;
3. - 8-О--D-глюкопиранозид эмодина;
4. - франгулин А.

4. Исследование по совершенствованию методов стандартизации коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного

Наряду с определением внешних и микроскопических диагностических признаков  значительное место в комплексной оценке подлинности и качества ЛРС занимает фитохимический анализ. Согласно современным требованиям нормативной документации (НД) на ЛРС, фитохимический анализ включает задачи качественного и количественного анализа ЛРС по содержанию ведущих групп БАС, обеспечивающих фармакологическую активность.

В настоящее время для целей стандартизации существует методика количественного определения коры крушины ломкой с методом фотоэлектроколориметрии (ГФ СССР XI издания), однако данная методика громоздкая и многостадийная. Она включает гидролиз и многочисленную экстракцию диэтиловым эфиром, что нельзя признать целесообразным с точки зрения точности методики и неизбежной потери антраценпроизводных, растворимых в вышеперечисленных растворителях.  Что касается плодов жостера слабительного, то в нормативной документации  на плоды жостера слабительного отсутствует раздел Количественное определение.

4.1. Качественный анализ сырья крушины ломкой и жостера слабительного

       Для определения подлинности коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного разработана методика тонкослойной хроматографии (ТСХ) и  спектрофотометрии.

4.1.1. Тонкослойная хроматография

В задачу исследования входил подбор системы растворителей и способа детектирования зон адсорбции на хроматограмме, позволяющих идентифицировать антраценпроизводные и флавоноиды. Разделение антраценпроизводных и флавоноидов было оптимальным в системе растворителей: хлороформ - метанол - вода (26:14:3) (лSilufol UV 254) (Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ, Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ). В данных условиях четко разделяются антраценпроизводные и флавоноидные соединения. Для обнаружения веществ на хроматограмме использовали детекцию в УФ-свете (254 нм и 366 нм).

Рис. 14.  Хроматографический профиль водно-спиртового извлечения из акоры крушины ломкой Обозначения: 1 - водно спиртовое извлечение сырья; 2 - франгулин А; 3 - франгулин В; 4 - франгула-эмодин; 5 - глюкофрангулин А; 6 - глюкофрангулин В.	Рис. 15. Хроматографический профиль водно-спиртового извлечения из аплодов жостера слабительного Обозначения: 1 - водно спиртовое извлечение сырья; 2 - франгулин А; 3 - 1-О--D-глюкопиранозид  эмодина; 4 - 3-О-рутинозид рамнетина; 5 - эмодин.

При просмотре хроматограммы крушины в УФ-спектре при длине 254 нм 6-О--L-рамнопиранозид франгула-эмодина обнаруживается в виде доминирующего пятна с оранжево-красной флуоресценцией (Rf  около 0,7) (рис. 14). На хроматограмме водно-спиртового извлечения из плодов жостера в УФ-спектре при длине 254 нм 3-О-рутинозид рамнетина обнаруживается в виде доминирующего пятна с ярко желтой флуоресценцией (Rf  около 0,6), 6-О--L-рамнопиранозид франгула-эмодина обнаруживается в виде пятна с оранжево-красной флуоресценцией (Rf  около 0,7) (рис.15). Для обнаружения веществ хроматограммы просматривали в видимом свете, УФ-свете (254 и 366 нм) и после проявления с раствором диазобензолсульфокислоты.

4.1.2. Спектрофотомерия

Электронные спектры антраценпроизводных  соединений и суммарных извлечений из ЛРС, содержащих антраценпроизводные, характеризуются максимумом поглощения при длине волны  λ max = 524± 2 нм (антраценпроизводные)  (рис. 10 и 11). При исследовании УФ-спектров водно-спиртового извлечения из плодов жостера слабительного максимум поглощения в коротковолновой и длинноволновой области спектра находится при  λ max = 260 ± 2 нм и 410 нм ± 2 нм (рис.11).

4.2.1. Количественное определение суммы антраценпроизводных в коре крушины ломкой

В ходе разработки методики количественного определения суммы антраценпроизводных в коре крушины ломкой изучены УФ-спектры водно-спиртовых извлечений из данного сырья. Регистрацию спектров проводили с помощью спектрофотометра Specord 40 (Analytik Jena).

Исследование УФ-спектров показало, что максимум поглощения щелочно-аммиачного раствора водно-спиртового извлечения из коры крушины ломкой в длинноволновой области спектра находится при 524+2 нм (рис.10). В длинноволновой области электронного спектра щелочно-аммиачного раствора франгулина А  также наблюдается четкий максимум поглощения при 524+2 нм (рис. 10). Следовательно, в качестве аналитической длины волны может быть использовано значение 524 нм, а стандартным образцом может служить доминирующий антрагликозид - франгулин А, причем в случае отсутствия стандарта в расчетной формуле может быть использовано теоретическое значение  удельного показателя поглощения (E) - 180. Интересно, что в Европейской фармакопее также предусмотрено использование значения E (204), но для глюкофрангулина А (аналитическая длина волны - 515 нм).

Содержание антраценпроизводных в коре крушины находится в диапазоне 5,87-9,02 %.

Метрологические характеристики методики количественного определения коры крушины ломкой методом спектрофотометрии представлены в таблице03. Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения антраценпроизводных в коре крушины с довенрительной вероятностью 95% составляет 4,07 %.

Таблица 3

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы антраценпроизводных в коре крушины

f		S	P, %	t (P, f)	Х	E, %
10	9,02	0,1646	95	2,23	0,367	4,07

4.2.2. Количественное определение суммы антраценпроизводных в  плодах жостера слабительного

В результате разработки методики количественного определения суммы антраценпроизводных в плодах жостера слабительного изучены УФ-спектры водно-спиртовых извлечений из данного сырья (рис.  11). Исследование УФ-спектров плодов жостера слабительного показало, что максимум поглощения щелочно-аммиачного раствора водно-спиртового извлечения из плодов жостера слабительного  находится при 410+2 нм (рис. 11), что подтверждает высокое содержание флавоноидов в сырье жостера слабительного. Второй четкий максимум находится в области 524+2 нм, что соответствует максимуму поглощения щелочно-аммиачного раствора франгулина А. Несмотря на высокое содержание флавоноидов в плодах жостера слабительного, целесообразнее рассчитывать количественное содержание антраценпроизводных, так как плоды в медицине используются в качестве слабительного средства. В качестве аналитической длины волны может быть использовано значение 524 нм, а стандартным образцом может служить антрагликозид - франгулин А.

Содержание антраценпроизводных в плодах жостера слабительного варьирует от 2,63 % до  5,30 %.

Метрологические характеристики методики количественного определения антраценпроизводных в плодах жостера слабительного методом дифференциальной спектрофотометрии представлены в таблице 4.

Таблица 4

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы антраценпроизводных в плодах жостера

f		S	P, %	t (P,f)	ΔX	E, %
10	5,40	0,1131	95	2,23	+0,252	+4,67

ВЫВОДЫ

1. В результате сравнительного фармакогностического исследования сырья близкородственных видов семейства Крушиновые (Rhamnaceae) - коры крушины ломкой (Frangula alnus Mill.)  и плодов жостера слабительного (Rhamnus cathartica L.) выявлены как общие, так и отличительные диагностические анатомо-гистологические и химические признаки.

2. При анатомо-морфологическом исследовании сырья Жостера слабительного плоды определены морфолого-анатомические особенности строения экзо- и мезокарпия,  а также особенности строения кожуры семени, которые положены в основу разделов Внешние признаки и Микроскопия проекта ФСП Жостера слабительного плоды.

4. Сравнительное анатомо-диагностическое исследование коры крушины ломкой и коры жостера слабительного позволило выявить, что их главным отличительным признаком является наличие слизевых вместилищ в паренхиме коры крушины ломкой.

5. В результате сравнительного анатомо-диагностического исследования плодов жостера слабительного и плодов крушины ломкой, а также плодоножек жостера слабительного и крушины ломкой определены главные отличительные особенности плодоножек: срез плодоножки жостера имеет строго округлую форму, а у крушины неравномерно-ребристую форму; наличие пигмента красно-фиолетового цвета в клетках паренхимы плодоножек жостера и отсутствие такового у крушины; наличие слизевых вместилищ в паренхиме коры крушины ломкой.

6.  В ходе изучения химического состава коры крушины ломкой впервые в Российской Федерации выделены антрагликозиды франгулин А и франгулин В, идентификация которых осуществлялась с помощью УФ-, 1Н-ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии, а также результатов химических превращений.

7. В результате изучения химического состава плодов жостера выделены три индивидуальных вещества: 3-О-рутинозид рамнетина (флавоноид), франгулин А, 1-О--D-глюкопиранозид эмодина (антраценпроизводные), причем установлено, что выделенный флавоноид является доминирующим компонентом сырья данного растения.

8. Разработаны методики качественного анализа сырья Крушины ломкой кора и Жостера слабительного плоды с использованнием стандартного образца франгулина А, ТСХ, спектрофотометрии и ВЭЖХ.

9. Обоснована целесообразность стандартизации сырья Жостера слабительного плоды по содержанию суммы антраценпроизводных в пересчете на франгулин А с использованием метонда дифференциальной спектрофотометрии при аналитической длине волны 524 нм.
10. Разработаны методики количественного определения суммы антраценпроизводных в сырье Крушины ломкой кора и Жостера слабительного плоды с использованием стандартного образца франгулина А, а также методического подхода, исключающего такие стадии, как кислотный гидролиз, многократную экстракцию сырья, обработку диэтиловым эфиром, построение калибровочного графика.
11. На основе результатов фармакогностического исследования разработаны проекты ФСП Крушины ломкой кора и Жостера слабительного плоды с целью рекомендации включения данной НД в Государственную фармакопею Российской Федерации XII издания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Шмыгарева, А.А. Сравнительное морфолого-анатомическое исследование коры крушины ломкой и жостера слабительного / А.А. Шмыгарева, В.А. Куркин // Медициннский альманах. - 2010. - № 3 (12). - С. 206-209.
2. Куркин,  В.А. Фитохимическое исследование коры крушины ломкой / В.А. Куркин, А.А. Шмыгарева // Медициннский альманах. - 2012. - № 1 (20). - С. 218-220.
3. Шмыгарева, А.А. Определение антраценпроизводных в коре крушины / В.А. Куркин А.А. Шмыгарева // Фармация. - 2010. - Т. 58, № 8. - С. 9-12.
4. Шмыгарева, А.А. Сравнительное фитохимическое исследование коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного / В.А. Куркин, А.А. Шмыгарева // Традиционная медицина. - 2012. - №  5. - С.  23-25.
5. Куркин, В.А. Антрагликозиды коры крушины ломкой (Frangula alnus Mill.) / В.А. Куркин, А.А. Шмыгарева, Е.Д. Даева, В.И. Каденцев // Химия растительного сырья. - 2012. - № 1. С. 83-86.
6. Шмыгарева, А.А. Разработка новых подходов  к стандартизации  плодов жостера слабительного / В.А. Куркин А.А. Шмыгарева // Фармация. - 2012. - № 6. - С. 10-14.
7. Шмыгарева, А.А. Сравнительное фитохимическое исследование коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного // В.А. Куркин, А.А. Шмыгарева, А.Н. Саньков // Оренбургский медицинский вестник. - 2012. - № 1  - С. 5-8.
8. Шмыгарева, А.А. Современные подходы к стандартизации коры крушины ломкой / А.А. Шмыгарева // Аспирантские чтения. - Самара, 2010. - С.279-282.
9. Шмыгарева, А.А. Анализ номенклатуры слабительных лекарственных препаратов, представленных на российском рынке / А.А. Шмыгарева // Аспирантские чтения. - Самара, 2011. - С.340-342.
10. Шмыгарева, А.А. Методика количественного определения суммы антраценпроизводных в коре крушины ломкой / А.А. Шмыгарева //Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты: материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Самара, 2011. - С.89-91
11. Шмыгарева, А.А. Новые подходы к химической стандартизации сырья коры крушины ломкой и плодов жостера слабительного / А.А. Шмыгарева // Современные проблемы химической науки и образования: материалы Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 75-летию со дня рождения В.В. Кормачева. - Чебоксары, 2012. - Т.II. - С. 165.
12. Шмыгарева, А.А. Сравнительное морфолого-анатомическое исследование коры крушины ломкой и жостера слабительного / В.А. Куркин, А.А. Шмыгарева // Фармобразование 2010: тезисы 4-ой Всероссийской  с международным участием научно-методической конференции.  - Воронеж, 2010. - С. 462.

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине