Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

Колокольцова Тамара Дмитриевна

создание аттестованных коллекций и банков культур клеток для научных исследований, производства препаратов,  диагностики и лечения

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Щелково - 2008

Работа выполнена в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии Вектор и ФГУН Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских иммунобиологических препаратов имени Л.А. Тарасевича

Научный консультант:

Доктор медицинских наук  Шалунова Нина Васильевна

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук, профессор Дьяконов Лев Петрович

доктор ветеринарных  наук,  Иванов Виктор Серафимович

доктор биологических наук, профессор Какпаков Виталий Туякович

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН

Защита диссертационной работы состоится  л_06__ июня 2008 г. в 1000 на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности российской академии сельскохозяйственных наук  (ВНИТИБП РАСХН) по адресу: 141142, Щелково, Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности  (российской академии сельскохозяйственных наук  ВНИТИБП) РАСХН по адресу: 141142, Щелково, Московской области.

Автореферат разослан л   2008 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 006.069.01

кандидат биологических  наук Фролов Юрий Дмитриевич

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Прогресс современной биотехнологии в значительной степени обусловлен применением культивируемых in vitro клеток различного происхождения. Развитие метода позволило получать не только перспективные линии клеток животных, широко использовать их в научных исследованиях, но и создавать на их основе новые современные и уникальные технологии производства препаратов. Число линий клеток животных постоянно растет, часто клетки внешне трудноразличимы. Наличие нескольких линий клеток в лаборатории, особенно, занимающейся получением собственных культур, создает предпосылки контаминации клеток не только посторонними микроорганизмами, но и клетками других линий. Использование клеток с отсутствием идентификационных характеристик ставит под сомнение адекватность получаемых результатов. Эти данные подчеркивают чрезвычайную важность и актуальность создания  специализированных коллекций и проведения контроля контаминации поступающих и вновь получаемых культур клеток, используемых в научных или прикладных исследованиях.

Современные технологии позволяют производить достаточно большие количества продукта в клетках. Культуры клеток получили распространение в разработке современных биотехнологий производства профилактических или диагностических препаратов. Общепризнанно применение клеток для получения генно-инженерных препаратов. Как оказалось, именно правильное гликозилирование и полноценная сборка полипептида эритропоэтина сделали культуру клеток животных наиболее перспективной для производства генно-инженерного ЭПО с высокой специфической активностью in vivo. И, хотя, полученные разными группами исследователей генно-инженерные штаммы клеток секретируют достаточно высокий уровень рекомбинантного гормона, создание новых более эффективных продуцентов человеческого ЭПО, пригодных для производства препарата, представляется актуальным.

Одним из ведущих направлений современной биотехнологии становится использование клеток для заместительной и органоспецифической терапии у больных с органной недостаточностью, при повреждении кожных покровов, метаболических нарушениях и нейродегенеративных процессах. Применение клеток в клинике в настоящее время ограничено отсутствием аттестованного клеточного материала, что предопределяет актуальность разработки Методических указаний по аттестации клеток, технологии выделения уникальных по свойствам клеток, а также получения новых перспективных штаммов клеток, пригодных для научных и медицинских исследований.

Известно, что объективность результатов и качество биопрепаратов, получаемых с использованием культур клеток, в большей степени зависит от происхождения культуры клеток, ее соответствия паспортным характеристикам и безопасности. Основой стабильного производства безопасного препарата должна быть стандартизованная и аттестованная культура клеток. Система создания двухъярусного банка клеток, при котором создаются посевной и рабочий банки клеток, является необходимым условием для обеспечения продолжительного производства продукта. Аттестация банков клеток в соответствии с современными требованиями ВОЗ, принимая во внимание контроль биологической безопасности клеток, и сохранение их функциональных свойств при длительном культивировании, обеспечит стабильность и безопасность производства получаемого продукта.

Таким образом, создание системы аттестованных клеток, включающей паспортизованные коллекции и аттестованные банки культур клеток, пригодных для научных исследований, разработки новых технологий производства препаратов и лечения, является актуальным и позволит обеспечить гарантии качества, стабильности и безопасности клеток.

Цель исследования

создание системы аттестованных культур клеток, пригодных для научных исследований и производства препаратов для иммунопрофилактики, диагностики и лечения.

Задачи исследования

• Создать специализированные коллекции культур клеток  человека, насекомых и других животных.
• Изучить условия получения новых линий клеток различного происхождения, перспективных для проведения научных исследований или производства препаратов.
• Изучить паспортные характеристики, включая контаминацию, культур клеток, впервые полученных или поступивших в коллекцию из других источников.
• Создать и аттестовать в соответствии с современными требованиями посевные и рабочие банки культур клеток, пригодных для разработки новых технологий и производства препаратов для иммунопрофилактики, диагностики и лечения.
• Исследовать характеристики генно-инженерных штаммов клеток-продуцентов рекомбинантного эритропоэтина человека, создать и аттестовать банки клеток наиболее перспективного штамма клеток-продуцентов рчЭПО. Изучить возможность создания новых лекарственных форм рекомбинантного препарата
• Создать и аттестовать банки культур диплоидных фибробластов человека, изучить условия культивирования, транспортировки и трансплантации клеток, пригодных для научных исследований и создания препаратов для заместительной терапии.
• Изучить условия получения, культивирования и дифференцировки  клеток для исследований или медицинского применения, учитывая влияние условий выделения, криоконсервации, культивирования и дифференцировки стволовых и малодифференцированных клеток из разных тканей и органов.
• Разработать Методические указания по контролю первичных культур клеток, используемых для проведения научных исследований или использования в регенеративной медицине, с учетом современных требований и методов контроля.
• Создать и аттестовать банки первичных малодифференцированных культур клеток для научных исследований или создания стандартных и безопасных препаратов для заместительной терапии.

Научная новизна полученных результатов

При нашем участии созданы и паспортизованы специализированные  коллекции культур клеток человека, насекомых и других видов животных. Паспорта культур клеток оформлены и изданы в виде 4-х томов Каталога культур клеток.

Впервые отработаны условия выделения и культивирования клеток чешуекрылых насекомых и впервые в стране получены 4 новые линии клеток хлопковой, озимой и капустной совок, основных вредителей сельского и лесного хозяйства. Новые линии клеток высокочувствительны к видоспецифичным вирусам ядерного полиэдроза и пригодны для проведения научных исследований и наработки энтомопатогенных препаратов.

Показано преимущество клеток СНО-рЕ в качестве продуцента рчЭПО по сравнению с другими генно-инженерно конструированными культурами клеток СНО-23 и СНО-972. Рекомбинантный эритропоэтин, продуцируемый впервые созданными генно-инженерными клетками, по физико-химическим свойствам соответствует природному аналогу, обладает специфической активностью по стимуляции эритропоэза.

Впервые создана технология получения таблетированной формы рчЭПО, показана эритростимулирующая активность экспериментальных серий препарата при пероральном применении.

Установлено, что для получения жизнеспособных стволовых и малодифференцированных клеток из разных тканей и органов, высокоперспективных для исследований или трансплантации, важным является время доставки органа, выбор методов выделения, условий культивирования и криоконсервации клеток.

Показано, что новые штаммы диплоидных фибробластов ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 обладают стабильными свойствами, безопасны и пригодны для научных исследований и разработки новых технологий получения препаратов.

Впервые предлагаются способы выращивания фибробластов на специальных пленках, пористых подложках или микрононосителях, что позволяет увеличивать количество клеток, транспортировать и поддерживать функциональноактивные клетки на ранах различной этиологии. Способ транспортировки клеток в геле или на микроносителях позволяет сохранять жизнеспособность клеток в течение 5 и более дней, что актуально при доставке клеток в дальние районы и при чрезвычайных ситуациях.

Впервые создана технология получения препарата Клеточные культуры диплоидные для заместительной терапии, высокоэффективного для лечения ожоговых и других ран. Система создания аттестованных посевных и рабочих банков фибробластов человека, впервые примененная к штаммам клеток для терапии ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2, позволяет обеспечивать стабильными по свойствам и безопасными по отсутствию контаминантов и туморогенных свойств клетками научные исследования и практическое применение при аллотрансплантации или заместительной терапии.

Предлагаемый подход к созданию и использованию клеток из аттестованных и криосохраняемых банков позволяет решать проблему дефицита донорского материала, актуальную в экстренных и чрезвычайных ситуациях.

Научная новизна и приоритет разработок диссертации защищены патентами и авторскими свидетельствами: № 1808009; № 1808010; №2182830; № 2152206; № 97108266; № 2189223; № 2142820; №2004126519; № 2004126518.

Практическая значимость работы

Аттестованные в соответствии с современными требованиями культуры клеток из коллекций могут быть использованы для проведения научных исследований, создания новых биотехнологий производства препаратов для иммунопрофилактики, лечения или диагностики.

Созданные и аттестованные посевные и рабочие банки линий клеток МДСК, 293, 4647 и Л-68 соответствуют современным требованиям и практически пригодны в качестве субстратов для производства вакцинных, диагностических и лечебных препаратов.

Банки генно-инженерно конструированных клеток СНО-рЕ, характеризующихся стабильностью, безвредностью и обладающих высокой продуктивностью рчЭПО, стали основой для создания технологий получения новых лекарственных форм препарата.

Посевные и рабочие банки диплоидных фибробластов человека ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ-16-2, аттестованные в соответствии с современными требованиями ВОЗ, пригодны для научных исследований, создания новых технологий и являются основой получения стабильного препарата для заместительной терапии. Разработана технология получения препарата Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии для лечения ожоговых и других ран.

Технология культивирования и доставки фибробластов в геле, на подложках или микроносителях позволяет применять клетки в разных условиях с учетом дальности и длительности доставки до больного и лечения ран разной этиологии.

Подобранные в результате проведенных исследований условия выделения малодифференцированных клеток, а также система создания аттестованных банков первичных культур клеток могут служить основой получения безопасных клеток для научных исследований и регенеративной медицины.

Впервые разработаны Методические указания Аттестация первичных или диплоидных культур клеток, пригодных для трансплантации, включающие современные методы контроля безопасности клеток.

Создание банков, впервые полученных культур малодифференцированных клеток, криоконсервированных и аттестованных в соответствии с новыми Методическими указаниями, позволяет иметь достаточные запасы аттестованного клеточного материала для проведения фундаментальных исследований и заместительной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Создание коллекций, посевных и рабочих банков клеток, аттестованных в соответствии с современными требованиями ВОЗ, позволяет обеспечивать научные и экспериментально-производственные исследования стабильными и безопасными культурами клеток.
• Стабильность характеристик и безопасность по отсутствию контаминантов и туморогенных свойств клеток линий МДСК, Л-68 и 4647 из посевных и рабочих банков позволяют рекомендовать их для применения в производстве препаратов для лечения, диагностики и иммунопрофилактики.
• Изменчивость кариотипа при длительном культивировании линии клеток 293 из посевного и рабочего банков, но стабильность других характеристик и высокая продуктивная активность клеток позволяют рекомендовать культуру 293 для производства противоракового препарата Канцеролизин.
• Стабильность характеристик клеток культуры СНО-рЕ и высокая продуктивность рчЭПО по сравнению с другими линиями клеток-продуцентов СНО-23 и СНО-972 при длительном их пассировании in vitro, делают культуру клеток СНО-рЕ наиболее пригодной для наработки препарата, регулирующего эритропоэз.
• Технология производства диплоидных фибробластов человека из аттестованных и криосохраняемых банков клеток позволяет обеспечивать стандартными и безопасными клетками при лечении больных с глубокими и обширными ожогами, в том числе и при чрезвычайных ситуациях.
• Для получения жизнеспособных клеток из разных тканей и органов человека и животных, содержащих высокоперспективные стволовые и прогениторные клетки, необходим индивидуальный выбор способа выделения малодифференцированных клеток, условий культивирования и криоконсервации клеток.

Внедрение результатов исследования в практику

Культуры клеток из аттестованных  коллекций используются как при проведении научно-исследовательских работ, так и при разработке новых технологий производства препаратов для лечения, иммунопрофилактики или диагностики. Сохранение и поддержание аттестованных коллекций культур клеток позволяет обеспечивать охарактеризованными клетками не только подразделения ГНЦ ВБ Вектор, но и научные и медицинские учреждения Сибири и Дальнего Востока.

Новые линии клеток насекомых, высокочувствительные к видоспецифичным вирусам ядерного полиэдроза, использованы при разработке новых технологий получения энтомопатогенных бакуловирусных препаратов, пригодных для борьбы с вредителями сельского и лесного хозяйства. Экспериментальные серии вирусов ядерного полиэдроза хлопковой совки Heliothis armigera и капустной совки Mamestra brassicae, полученные на новых линиях клеток МБ-ХС-685 или МБОзС4-788, показали высокую эффективность при лабораторных испытаниях препарата на гусеницах.

Клетки из аттестованных посевных и рабочих банков используются или могут быть использованы  в научных исследованиях и разработках новых вакцин против гриппа (клетки МДСК), против кори (клетки Л-68) и вакцины против гепатита А (клетки 4647). Линия клеток 293 является субстратом для производства препарата Канцеролизин, обладающего противоопухолевой активностью.

Рекомбинантная культура клеток СНО-рЕ имеет практическое значение как стабильный продуцент рекомбинантного эритропоэтина человека и используется в исследованиях по разработке новых технологий получения таблетированной формы лекарственного препарата для регуляции эритропоэза. Произведены экспериментальные серии препарата и начаты доклинические исследования.

Способы получения новых линий клеток, штаммов клеток- продуцентов или культур  клеток, пригодных для заместительной терапии, а также способы получения новых форм препаратов для иммунопрофилактики и лечения защищены 9 патентами на изобретение.

Культуры диплоидных фибробластов человека, охарактеризованные в соответствии с современными требованиями, используются при определении специфической активности субстанции и готовых лекарственных препаратов рекомбинантного интерферона-альфа-2 человека. Клетки используются как для проведения научных исследований в вирусологии или биотехнологии, так и при создании новых технологий производства препаратов для иммунопрофилактики, диагностики или лечения.

Вновь полученные и заложенные на хранение в виде аттестованных банков клеток культуры диплоидных клеток ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 показали хорошие заживляющие свойства при лечении ран. Основные результаты этих исследований легли в основу разработки новой технологии получения препарата Культуры клеток диплоидные для заместительной терапии, производимого в виде суспензии клеток, в геле или в монослое на подложках. Разработаны Регламент производства, ФСП и Инструкция по применению.

Результаты, полученные при выполнении настоящих исследований, вошли в научные отчеты по темам, выполняемым по Программе Центра, опубликованы в более, чем 50 научных трудах.

Результаты исследований используются в программе обучения на кафедрах биотехнологии и военно-полевой и экстремальной медицины Новосибирской государственной медицинской академии, на кафедре фундаментальной медицины медицинского факультета Новосибирского государственного университета.

Апробация диссертационного материала.

Основные положения и выводы диссертационной работы были доложены и обсуждены на научных конференциях: Всесоюзная научная конференция Энтомопатогенные вирусы и их роль в защите растений (Новосибирск, 1988); Всероссийская конференция "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1995 и 2001); 41 и 42 Congresses of ETCS (European Tissue Culture Society) (Verona Italy, 1994; Brno, Czech Republic, 1996); X International Congress of Virology (Jerusalem, Israel, 1996); XIV, XV, XVI, XVII, XVIII Meetings of the ESACT (European Society Animal Cell Technology) (Villamoura Portugal, 1996; Tour, France 1997; Lugano, Switzerland, 1999; Tylosand, Sweden 2001; Granada-Spain 2003); I и II Международные симпозиумы "Новые методы лечения ожоговых ран" (Тула, 1996; Саратов, 1998); Региональная научно-практическая конференция СО РАМН Фундаментальные аспекты медицины катастроф Сибири (Новосибирск, 1998); Российский Национальный конгресс Человек и лекарство (Москва, 1999); Научно-практическая конференция Клинические аспекты клеточной и тканевой терапии (Омск, 2000); International Meeting УBioartificial organs IIIФ (Davos, Switzerland, 2000); Научно-практическая конференция ФЗДРАВЭКСПО-СИБИРЬ-2001Ф Инновации в охране здоровья людей (Новосибирск, 2001); X, XI, XII, XIII Международная научная Конференция Новые информационные технологии в медицине и экологии (Гурзуф, 2002., 2003, 2004, 2005); International Congress of Virology: УThe World of MicrobesФ (Paris, 2002); УIX International Symposium on Biomedical Science and TechnologyФ (Antalya, Turkey, 2002); II Международный Конгресс БИОТЕХНОЛОГИЯ - 2003 (Москва, 2003); Всероссийская конференция Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении (Москва, 2003); III Российский Конгресс по патофизиологии Дисрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология) (Москва, 2004); III Всероссийский съезд по трансплантологии и искусственным органам, (Москва, 2005); The 5th International Conference УHigh medical technologies in XXI CenturyФ (Benidorm, Spain, 2006).

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича (протокол № 5 от 03 апреля 2007 г.), на расширенном научном семинаре ФГУН ГНЦ ВБ Вектор (Протокол № 109 от 28.08.07) , и рекомендована к защите.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано более 50 научных работ, в том числе 23 в изданиях, рекомендованных ВАК, 9 - авторские свидетельства и патенты, 1 - Методические указания.

Иисследования выполнены под руководством и при непосредственном участии автора в институте молекулярной биологии НПО Вектор, НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ Вектор и ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Исследования по отдельным разделам диссертации проведены при участии специалистов  ГНЦ ВБ Вектор (к.б.н. Царевой А.А., к.м.н. Нечаевой Е.А., д.б.н. Рябчиковой Е.И., к.х.н. Беловой Н.В., Юрченко Н.Д., Шумаковой О.В., к.б.н. Костиной Г.А., к.б.н. Богрянцевой М.П., Исаенко А.А, Колокольцовой О.А., Радаевой И.Ф., Немцова Ю.В., Вараксина Н., Рябичевой Т.А., к.б.н. Герасимовой Н.Г.), института Цитологии и генетики СО РАН (д.б.н., проф. Графодатский А.С., к.б.н. Рубцова Н.И.), НИИ Биологии гена РАН (к.б.н. Ревищин А.В.), Новосибирской государственной медицинской академии (чл.корр. РАМН д.м.н., проф. Ефремов А.В., д.м.н. проф. Колосов Н.Г.), НИИ Фармакологии СО РАМН (академик РАМН Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., д.ф.н. Жданов В.В.), НИИ ортопедии СО РАМН (д.м.н., проф. Зайдман А.И.). За что выражаю им благодарность.

Искренне признательна за ценную консультативную помощь при выполнении и оформлении работы моему научному консультанту д.м.н. Шалуновой Н.В., а также директору ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича академику РАМН д.м.н., проф.  Н.В. Медуницыну.

Выражаю глубокую благодарность за критические замечания и помощь при обсуждении и оформлении диссертационной работы моим коллегам д.м.н., проф. Воробьевой М.С., д.м.н., проф. Игнатьеву Г.М., д.б.н. Трошковой Г.П.,  д.м.н.,  проф. Никифорову С.Б.

Структура и объем  диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела материалы и методы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и приложения. Работа изложена на 300 страницах, иллюстрирована 6 таблицами и 45 рисунками. Список цитируемой литературы содержит 370 источников (135 отечественных и 235 зарубежных).

Связь выполненной работы с планом научных исследований

Работа выполнена в рамках ряда научно-исследовательских работ и научно-технических программ в ГНЦ ВБ Вектор (1977-2005 г.) и ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Исследования были поддержаны проектами МНТЦ №133 и 840, (рук. Нечаева Е.А.), PDG № 1911 и № 1858 (рук. Колокольцова Т.Д.); программой НИР ГНЦ ВБ Вектор 2000-2002 года по темам Разработка нового противоопухолевого препарата на основе мутантных штаммов аденовируса (рук. Сергеев А.Н), Создание таблетированной формы рекомбинантного эритропоэтина человека для перорального применения (рук Колокольцова Т.Д.), Разработка условий получения образцов лискусственной кожи при лечении ожоговых и других ран (рук Колокольцова Т.Д.). Исследования были финансово поддержаны также грантом  Наукограда п. Кольцова (рук. Колокольцова Т.Д.).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культуры клеток. В работе использовали первичные, диплоидные и гетероплоидные культуры клеток человека и животных, поступавшие в коллекцию из разных источников и получаемые нами в результате проводимых исследований. Культивирование клеток млекопитающих проводили в питательных средах (Игла МЕМ, RPMI 1640, DMEM, 199 среда и др.) с добавлением 10% FBS или СКРС в монослое или суспензии в соответствии с паспортными характеристиками клеток при температуре 370С. Для снятия клеток со стекла применяли 0,25%-ный раствор трипсина и 0,02%-ный раствор версена в соотношении 1:1.

Культуры клеток насекомых выращивали при температуре 280С. Клетки чешуекрылых и колорадского жука культивировали в питательной среде Грейса, обогащенной 10% FBS, клетки комаров - в питательной среде с 0,5%-ным раствором гидролизата лактальбумина на растворе Хэнкса с добавлением 0,075 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л сахарозы, 4 г/л  глюкозы и 7-10% СКРС или 10-15% FBS для клеток Aedes albopictus и Aedes pseudoscutellaris.

Криоконсервация клеток. Для замораживания клеток использовали питательную среду для культивирования с добавлением 10% сыворотки крови животных и 10% криопротектора (глицерин, ДМСО). Суспензию клеток разливали по ампулам в объеме 1 мл, запаивали и маркировали. Температуру ампул снижали со скоростью 1оС в минуту до температуры минус 25оС, после чего ампулы помещали в криохранилище с жидким азотом для длительного криосохранения клеток. Жизнеспособность определяли путем подсчета неокрашенных после размораживания клеток и после  окрашивания 0,04%-ным раствором трипанового синего.

Морфологический анализ. Клетки исследовали под инвертированным микроскопом и фотографировали без дополнительной фиксации или окрашивания. Для получения окрашенных препаратов клетки выращивали на покровных стеклах, фиксировали и окрашивали 0,01%-ным раствором акридинового оранжевого либо гематоксилин-эозином. Электронно-микроскопический анализ проводили после фиксации клеток. Срезы готовили на микротоме Reichert-Jung. Окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца. Препараты клеток исследовали под микроскопом JEM 100S или Hitachi при ускоряющем напряжении 80 или 75 кВ, соответственно.

Контроль контаминации бактериями и микоплазмами проводили методами микробиологического высева на селективную среду, гистохимического анализа (окраска флюорохромами Hoechst 33258, Dapi или оливомицином) согласно методам [Chen T.R., 1977, Михайлова Г.Р., Новохатский Ф.С., Родова М.А., 1981], электронно-микроскопически и методом ПЦР-анализа. Отсутствие посторонних вирусов подтверждали методами электронной микроскопии клеток, культивированием на чувствительных культурах клеток с последующим контролем с помощью реакции гемадсорбции и гемагглютинации, на куриных эмбрионах и лабораторных животных (мышах-сосунках, взрослых мышах, морских свинках и кроликах) в соответствии с регламентирующими документами [МУК 42-28-10-89, 1989].

Видовую идентичность клеток подтверждали методами анализа электрофоретической подвижности изоферментов и исследования кариотипа. Анализ электрофоретической подвижности изоферментов Г6ФДГ и ЛДГ проводили в вертикальном блоке полиакриамидного геля. Гомогенаты культур клеток готовили по OТBrien S.J., Shannon Y.E., Gall M.N., 1980. Кариологический анализ. Препараты хромосом культур клеток готовили общепринятым методом [Moorchead P, et al. 1960]. В культуральную жидкость на 2-4 сутки после пересева клеток вводили колхицин на 2 часа (для клеток теплокровных) или на 4-5 часов (для клеток насекомых). Гипотонию проводили в 0,56%-ном растворе KCl в течение 30 минут при температурах 370С или 280С, соответственно. Анализ хромосом проводили на фиксированных препаратах клеток в метафазе, используя методы дифференциального окрашивания (С, G и Q) и окраску азур - эозином [Moorchead P., 1960; Motara MA, Rai KS, 1977]. Для рутинного анализа и определения кривой распределения числа хромосом  исследовали не менее 50 метафаз. Число полиплоидных клеток определяли при анализе 1000 метафазных пластин диплоидных культур клеток на разных пассажных уровнях.

Аттестацию банков клеток культур клеток проводили согласно Методических указаний, утвержденных ГИСК им. Л.А. Тарасевича [МУК 42-28-10-89, 1989] и современным требованиям ВОЗ [World Health Organization Technical Report, 1998].

Определение количества рчЭПО в пробах осуществляли методом непрямого иммуноферментного анализа. Чистоту и молекулярную массу очищенных образцов рчЭПО определяли методом вертикального электрофореза в ПААГ. Электрофоретическое разделение белков проводили по методу Лэмли [Остерман Л.А., 1981]. Гель окрашивали красителем Coomassie Brilliant Blue R-250. Для количественной оценки содержания рчЭПО и определения процентного содержания примесных белков проводили сканирование влажного геля при помощи лазерного денситометра.

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием критерия Стьюдента и методом двухфакторного дисперсионного анализа [Ашмарин И.П., Воробьев И.А, 1962].

Результаты исследований и их обсуждение

Создание и характеризация коллекций культур клеток

Основой успешного развития вирусологических и биотехнологических работ с использованием культивируемых клеток является наличие коллекций культур клеток, охарактеризованных на современном методическом уровне в соответствии с общепринятыми требованиями (паспортом) и заложенных на хранение в количестве, позволяющем длительное время обеспечивать стандартными клетками развивающиеся направления исследований. Поэтому для проведения исследований в области вирусологии и биотехнологии, становится очевидной актуальность создания специализированных коллекции культур клеток человека и животных.

Формирование коллекций культур клеток человека и животных было проведено, главным образом, в период с 1978 по 1987 год под руководством к.б.н. Царевой А.А. За это время поступило более 300 культур клеток млекопитающих из разных институтов страны и компании Flow. Начиная с 1981 года, проводились работы по формированию коллекции клеток насекомых. Помимо известных линий клеток, поступивших извне, коллекции пополнялись за счет вновь получаемых нами первичных, диплоидных и гетероплоидных культур клеток человека, животных и насекомых, полученных в рамках данного исследования. С целью выделения штаммов клеток человека, перспективных для заместительной терапии, создавалась коллекция диплоидных фибробластов.

Создание коллекции культур диплоидных фибробластов человека. Для выделения фибробластов было исследовано более 50 образцов ткани, полученных от взрослого человека (ожоговые больные или донорские кусочки кожи, взятые во время операций) или 8-20 недельных плодов человека, абортированных по медицинским показаниям. Суспензию клеток получали методами механической и ферментативной дезагрегации [Юрченко Н.Д. и др., 1997] (см. Таблицу 1).

Таблица 1

Данные по количеству ампул с фибробластами человека, полученных из разных тканей и заложенных для хранения на ранних пассажах

Название культуры клеток	Количество ампул
	Первичная заморозка (№ пассажа)	Повторная заморозка (№  пассажа)
КОЖНО-МЫШЕЧНАЯ ТКАНЬ
ФЭЧ-10	108 (6)	200 (12)
ФЭЧ-14	50 (5)	Ц
ФЭЧ-16-2	33 (6)	217 (12)
ДК-4	12(5)	100 (13)
ДК-5	10(5)	100 (13)
ДК-7	17 (5)	100 (10)
ДК-13	6(4)	100 (12)
ДК-14	7(6)	100 (11)
ДК-16	37 (7)	Ц
ЕГКОЕ ЭМБРИОНА ЧЕЛОВЕКА
ДК-39	34 (4)	100 (12)
ДК-58	90 (3)	90 (7)
ДК-66	12(2)	300 (4)
ФЭЧ-16-1	30 (6)	205 (12)
-68	60 (12)	210 (12)
ФИБРОБЛАСТЫ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА
ФЧК-5	20 (11)	Ц
ФЧК-6	20 (6)	20 (19)
ФЧК-7	10 (11)	Ц
ФЧК-15	20 (10)	13 (15)

Исследования показали, что клетки, выделенные от ожоговых больных, как правило, были маложизнеспособны, число их практически не увеличивалось. При дальнейшем культивировании клетки быстро старели, что в комплексе делало их непригодными для ауто- или аллотрансплантации и, тем более, для получения больших запасов клеток и создания на их основе технологий получения препаратов. В противоположность этому, эмбриональные или фетальные фибробласты обладали лучшими культуральными характеристиками, имели достаточно высокую пролиферативную активность, равную 2,0-3,5. Через 2 суток клетки формировали равномерный плотный монослой.

Кроме анализа впервые выделенных штаммов фибробластов была  проведена ревизия ранее полученных Царевой А.А., Бакулиной Л.Ф и Подзоровой Т.И. штаммов клеток человека и сохранявшихся в жидком азоте. В таблице 1 они отмечены как ДК. На основании данных по отсутствию контаминантов, уровню пассажа и культуральных характеристик  были отобраны 18 штаммов диплоидных культур фибробластов и заложены для хранения на разных пассажных уровнях в количестве от 5 до 200 ампул (см. Таблицу 1).

Культуры фибробластов из первичных и повторных заморозок в дальнейшем контролировали на отсутствие контаминантов и характеризовали в соответствии с современными требованиями. Созданная и охарактеризованная таким образом коллекция диплоидных фибробластов человека может быть использована для проведения научных исследований или создания новых препаратов для диагностики и лечения на основе аттестованных клеток человека.

Анализ паспортных характеристик штаммов клеток показал стабильность и высокую перспективность использования в дальнейших исследованиях и технологиях двух штаммов диплоидных фибробластов человека ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ-16-2, полученных нами из тканей легкого или кожно-мышечной ткани эмбриона человека. Культуры клеток ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 были запатентованы как наиболее перспективные для применения в заместительной терапии [Патент № 2004126518, 2004].

Создание коллекции культур клеток насекомых. Создание коллекции культур клеток насекомых было определено необходимостью выбора известной линии клеток или получения новых, пригодных для проведения исследований по диагностике вирусных инфекций (клетки комаров) или разработки новых технологий получения энтомопатогенных препаратов (клетки чешуекрылых насекомых) для борьбы с вредителями сельского и лесного хозяйства.

Всего в коллекцию поступило 26 линий и сублиний клеток насекомых из разных институтов России, Украины и из Saint Christol (Франция). Среди поступивших были 4 линии клеток комаров (Aedes aegypti, Aedes albopictus и Aedes pseudoscutellaris), 2 линии клеток колорадского жука  и 20 линий и сублиний клеток чешуекрылых насекомых. Кроме того, проводились исследования по получению новых линий клеток.

Получение первичных и перевиваемых культур клеток насекомых. Для выделения первичных культур клеток использовали куколки, эмбрионы или 1-3 дневные личинки хлопковой, озимой и капустной совки, капустной металловидки, непарного шелкопряда и озимой совки. Поскольку поверхность яиц, куколок, гусениц и взрослых насекомых обильно загрязнена посторонними микроорганизмами, то в первую очередь были проведены исследования по подбору условий их стерилизации. При получении новых линий клеток из эмбрионов, личинок или куколок насекомых стерилизацию их поверхности проводили разными методами, включая обработку растворами 40-70% этилового спирта или 1,0-6,0% перекисью водорода, согласно опубликованным данным [Kitamura S.1977, Hsu S.H., Liu S.Y., Cross J.H. 1972]. Способ обработки насекомых 0,5%-ным водным раствором йода, примененный нами впервые, оказался одним из оптимальных способов стерилизации яиц и куколок для последующего получения первичных культур клеток чешуекрылых насекомых, свободных от контаминантов [Колокольцова Т.Д., Царева А.А, 1995].

Результаты более чем 200 экспериментов по выделению первичных клеток показали, что наилучшим источником для получения культуры клеток являются ткани яичников куколок и взрослых насекомых. По нашим данным в 48% случаях посева клеток из тканей яичников наблюдались активная миграция и деление клеток, причем около 20 культур клеток удалось культивировать в течение 1-4 пассажей in vitro. Далее клетки, как правило, погибали и лишь некоторые из них после длительного периода покоя, возобновляли свой рост in vitro. Опыт многих исследователей показал, что такой период для клеток насекомых составлял от 6 до 10 месяцев [Knudson D.L., Lescott T., Tinsley T.W., 1980; Quiott J.M., 1979].

Наблюдения показали, что мигрировали и делились в культуре, как правило, круглые клетки разного размера, иногда формировали шарообразные структуры. И довольно частое образование везикулярных структур в первичных культурах клеток может служить подтверждением того, что именно стволовые и малодифференцированные клетки формировали структуры, похожие на бластулы, что совпадает с данными литературы [Bolivar J., et al., 2006; Yuzo Niki et.al., 2006]

Наибольший интерес представляет культура клеток яичников хлопковой совки МБ ХС-685, которая достаточно активно начала делиться через 1,5 месяца и к концу 2-х лет культивирования прошла более 60 пассажей. На ранних пассажах культура отличалась полиморфизмом, позднее морфология и культуральные свойства клеток стабилизировались (см. Рис. 1), что совпадает с данными других авторов [Sudeep A.B., et.al., 2002]. Аналогичная картина наблюдалась и в культурах клеток озимой совки Agrothis segetum -ОзС-72 (МБ-ОзС5-688) и ОзС-73 (МБ-ОзС4-788), а позднее в культуре  клеток капустной совки Mamestra brassicae (МБ-КС-23).

а б

Рис. 1. Морфология культуры клеток МБ ХС-685 на 45-м (а) и МВ-ОзС4-788 на 22-м (б) пассажах. Ув.х40об.

В результате длительных исследований по поддержанию первичных клеток in vitro, нами впервые в стране были получены 4 новых линии клеток МБ ХС 685, МБ ОзС-688, МБ ОзС-788 и МБ КС-23, выделенные из яичников куколок хлопковой, озимой и капустной совок. Клетки отличались стабильными культурально-морфологическими свойствами и способностью к продукции вирусов ядерного и цитоплазматического полиэдроза (ВЯП И ВЦП). Показано, что перевиваемые клетки озимой совки A. segetum способны продуцировать бакуловирусы (ВЯП ОзС, ВЯП КС-3-86, ВЯП КС-10 и ВЦП ОзС) в количестве, достаточном для наработки вирусной биомассы. Кроме того, впервые полученные штаммы клеток могут служить системой для получения, клонирования и отбора наиболее патогенных или вирулентных штаммов вирусов, а также для наработки рекомбинантных ВЯП и ВЦП. Результаты легли в основу создания новых технологий получения энтомопатогенных препаратов и разработки новых биологических средств защиты растений от вредителей и болезней.

Паспортизация и идентификация культур клеток. Впервые поступающие в отдел линии клеток культивировали в отдельном боксе не более 10 пассажей. В этот период проводили контроль контаминации и осуществляли первичную заморозку культуры клеток в виде 5-15 ампул. На основании результатов предварительного контроля контаминации и значимости культуры принималось решение о сохранении культуры клеток в коллекции, деконтаминации ее от микоплазм, либо уничтожении. В дальнейшем клетки исследовали и проводили повторную закладку клеток на хранение при температуре жидкого азота в количестве не менее 30 ампул.

Контроль контаминации. Известно, что наибольшую опасность при работе с культурами клеток представляют линии, загрязненные микроорганизмами. Если контаминация бактериями или грибами проявляет себя сразу, то много опаснее представляются клетки, загрязненные микоплазмами. Микоплазмы существенно искажают результаты исследований и особенно опасны при использовании контаминированных клеток в производстве препаратов [Lincoln et al., 1998; Uphoff, C.C., H.G. Drexler, 2002].

Результаты исследования линий клеток, поступивших из разных институтов страны и из-за рубежа, показали достаточно высокую частоту контаминации клеток посторонними микроорганизмами, и более всего микоплазмами (см. Рис.2А).

А  Б

Рис.2. Микоплазмы в культуре клеток СПЭВ. До и после деконтаминации (А и Б). Окраска оливомицином. Ув.х90об.

Около 70% культур клеток, поступивших в коллекцию до 1985 года, были контаминированы микоплазмами. Чаще всего эти культуры клеток поступали из неспециализированных лабораторий, где этому не придавали особого значения или не проводили контроля контаминации. Снижение числа контаминированных культур клеток, поступивших позднее, обусловлено, прежде всего, появлением простых и удобных в применении методов контроля культур клеток с помощью ДНК-интеркалирующих флюорохромов [Михайлова Г.Р. и др., 1991].

Сравнение разных методов очистки культур клеток показали малую эффективность применения только антибиотиков, более того, подтвердило их токсичность. Обработка клеток методом термошока путем прогрева клеток при температуре 410С в течение 6-8 часов в сочетании с невысокими дозами антибиотиков позволила деконтаминировать ряд значимых линий клеток от микоплазм или значительно снизить их содержание (Рис 2Б).

Отсутствие вирусной и других видов контаминации подтверждено электронно-микроскопически. Практически все культуры клеток млекопитающих, а также линии и сублинии клеток чешуекрылых были свободны от контаминации вирусами. В клетках комаров (Мos 20A, Аа, A. albopictus и A. pseudoscutellaris) обнаружена контаминация вирусом денсонуклеоза, что совпадает с ранее описанным [Сутугина Л.П. с соавт., 1983]. Показано, что полученные нами новые культуры  фибробластов и клетки новых линий насекомых свободны от контаминантов.

Идентификация линий клеток. Одним из важных параметров безопасной работы с культурами клеток, получения адекватных и стабильных результатов, сопоставимых с данными других авторов, является подтверждение соответствия виду или линии используемых клеток. Идентификацию клеток проводили методами анализа кариотипа и изоферментного состава клеток. Анализ кариотипа ряда линий клеток млекопитающих показал наличие маркерных хромосом, характерных клеткам HeLa, что позволило выделить эти линии клеток, как дериваты HeLa [Царева А.А. Исаенко А.А., и др, 1998]. Остальные культуры клеток имели характеристики, сходные с ранее описанными [Графодатский А.С., Раджабли С.И, 1988]. Полученные данные по кариотипу исследуемых линий клеток в виде микрофото хромосом метафазной пластинки, раскладки дифференциально окрашенных хромосом и гистограммы распределения числа хромосом представлены в паспортных характеристиках линий клеток и опубликованы в 4 томах Каталога культур клеток. Данные изоферментного анализа  Г6ФДГ и ЛДГ клеток человека и животных соответствовали виду.

В связи с отсутствием характеристик кариотипа и изоферментного состава исследуемых видов насекомых для идентификации поступивших линий клеток проводили анализ кариотипа и изоферментного состава культивируемых клеток и клеток исходных насекомых. Как показано на рис. 3, клетки колорадского жука, полученные из гемолимфы, имели 36 убывающих по величине двуплечих хромосом и одну пару акроцентриков среднего размера. В клетках линий жука КЖ-1 и КЖ-2 обнаружено более 100 мелких голоцентрических хромосом, характерных для чешуекрылых (см. Рис. 3). Клетки комаров имели от 6 до 24 метацентрических хромосом (см. Рис. 4), что соответствует ранее описанным данным [Kurtti T.J., Munderloh U.G., 1984].

Анализ морфологии клеток КЖ-1, КЖ-2, дубового шелкопряда МСАр-1 и ряда других линий клеток показали удивительное сходство. Морфология клеток комаров различалась, что подтверждает различие линий клеток. Электрофоретическая подвижность изоферментов Г6ФДГ, ЛДГ, СОД, ИЦДГ и МДГ клеток и исходных насекомых показали соответствие клеткам непарного шелкопряда.

А

Б

В

Рис. 3. Кариотип клеток колорадского жука Leptinotarsa decemlineata (А), культуры клеток КЖ-1(Б) и линии клеток SCLd-135 (В).

А

Б

В

Г

Рис. 4. Метафазные пластинки разных линий клеток комаров:

А) A. aegypti; Б) MOS 20A; В)A. pseudoscutellaris; Г) A. albopictus .

Результаты исследования морфологии, кариотипа и изоферментного состава клеток насекомых показали сходство характеристик 11 линий и сублиний клеток насекомых, имевших разное видовое происхождение по названию, с клетками непарного шелкопряда линии SCLd-135. Характеристики других 10 линий и сублиний клеток насекомых, включая 4 новые линии клеток, подтвердили видовое соответствие.

Таким образом, в результате проведенных исследований были созданы и охарактеризованы специализированные коллекции культур клеток насекомых, диплоидных фибробластов и коллекция перевиваемых культур клеток животных и человека. Результаты контроля показали высокую вероятность контаминации культур клеток не только посторонними микроорганизмами, но и клетками других линий, как при попытке получения новых линий клеток, так и при длительном пассировании уже имеющихся. Вышеизложенное свидетельствует о необходимости обязательного контроля кариотипа и изоферментного состава культивируемых клеток и подчеркивает необходимость использования для исследований клеток только из специализированных коллекций культур клеток, охарактеризованных в соответствии с современными требованиями паспорта.

Создание и аттестация банков культур клеток, пригодных для научных исследований, производства вакцин и других препаратов

Создание и аттестация посевных и рабочих банков клеток. Прогресс в области вирусологии и биотехнологии в значительной степени обусловлен пригодностью культивируемых in vitro клеток для исследования или наработки вирусов или биопрепаратов. Создание посевного и рабочего банков перспективных культур клеток, их аттестация в соответствии с современными требованиями позволит обеспечить производство достаточным запасом стабильных и безопасных по своим свойствам клеток.

В результате работы было создано 3 посевных и 4 рабочих банка линий клеток МДСК, 293, 4647 и Л-68, наиболее перспективных для производства вакцинных, диагностических и лечебных препаратов. Данные по количеству ампул и жизнеспособности клеток в посевных и рабочих банках  представлены в таблице 2. Как видно из таблицы посевные и рабочие банки клеток представляли запас не менее 200 ампул с клетками, содержащими от 4 до 9 млн. клеток. Жизнеспособность клеток после восстановления составляла от 80 до 97%.

Таблица 2

Данные по посевным и рабочим банкам культур клеток

Название культуры клеток (номер пассажа)	Номер банка клеток	Количество ампул	Количество клеток в ампуле	Доля живых клеток после разморозки (%)
4647 (108 п)	ПБК №2112	257	5,5х106	79-85
4647 (112 п)	РБК № 2113	231	4х106	83-90
МДСК (39 п)	ПБК №2094	209	8х106	93-97
МДСК (41 п)	РБК №2095	242	9х106	94-96
293(15 п.)	ПБК №2110	240	6х106	80-85
293 (17 п.)	РБК № 2111	241	5х106	83-85
-68 (22 п)	РБК №1907	227	4х106	90

Банки клеток были созданы и предварительно контролированы в отделе культур клеток. Аттестацию клеток из посевных и рабочих банков клеток проводили в отделе культур клеток, ОБТК ГНЦ ВБ Вектор и в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Сравнительное исследование стабильности кариотипа проведено в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича по протоколам, представленным ГНЦ ВБ Вектор.

Исследование показало отсутствие контаминантов, стабильность и соответствие морфологических и культуральных характеристик клеток из посевных и рабочих банков. Изучение кариотипа клеток линии МДСК на 47 и 86 пассажах показало соответствие кариотипу собаки вида Canis familiaris, 2n=78, модальный класс составлял 85 хромосом (98% клеток). Клетки характеризовались присутствием нормальных (не перестроенных) аутосом, по некоторым аутосомам отмечена трисомия (пары 29, 30 и 38). Отмечена стабильность кариотипа клеток на разных пассажах (47 и 87 пассаж).

Анализ G-окрашенных метафазных хромосом культуры клеток Л-68 на 16 и 33 пассажах подтвердил соответствие нормальному кариотипу человека 2n=46, ХХ. По отсутствию хромосомных нарушений и низкому числу поли - и гетероплоидных клеток (не более 2%) кариотип Л-68 стабилен и соответствует требованиям Комитета экспертов ВОЗ, предъявляемым к диплоидным клеткам [World Health Organization Technical Report Series, 1998].

Кариотип культуры клеток 293 на уровне 18 и 38 пассажей характеризовался изменчивостью распределения числа хромосом в клетках на разных пассажных уровнях, кроме того, выявлены вариации в числе аутосом и маркерных хромосом, что свидетельствует о неустойчивости кариотипа клеток (Рис. 5). По структуре дифференциально-окрашенных хромосом клетки линии 293 соответствуют клеткам человеческого происхождения.

A Б

Рис. 5. G-окрашенные хромосомы клеток линии 293 с разным числом хромосом: А)  2n=27;  Б) 2n=72.

Кариотип клеток культуры 4647 представлял производную от нормального кариотипа зеленой мартышки, 2n=60 и характеризовался гетерогенностью по числу хромосом (Рис. 6). Распределение числа хромосом в клетках на 108 пассаже варьировало от 17 до 120, модальное число 60 хромосом. На 128 пассаже число хромосом наблюдалось от 52 до 136 на клетку. Модальный класс выражен нечетко. Доля полиплоидных клеток на 108 пассаже составляла 20%, к 128 пассажу число гиперплоидных клеток возрастало до 79%.

А

Б

Рис. 6. Распределение числа хромосом в клетках 4647 на 108 (А) и 128 пассажах (Б).

В отличие от культуры 293, в клетках почки зеленой мартышки 4647 наблюдалась стабильность реконструкции кариотипа. Клетки характеризовались присутствием нормальных (не перестроенных) аутосом, отмечена трисомия пары С2. Одна из Х хромосом перестроена. Маркерные хромосомы образованы в результате разнообразных транслокаций участков хромосом. Маркерных хромосом 6: М3 - включает материал хромосомы С5; М1, М2, М4, М5 и М6 трудно идентифицировать. Состав нормальных и маркерных хромосом клеток на 128 пассаже не отличался от такового клеток на 108 пассаже, что свидетельствует о стабильности кариотипа.

Известно, что клетки при культивировании in vitro могут генетически трансформироваться, инфицироваться онковирусами, индуцировать активность эндогенных онковирусов и, таким образом, приобретать туморогенные свойства. Такие изменения клеток значительным образом нарушают безопасность получаемого продукта, в том числе и вакцины. В связи с этим, обязательным этапом изучения безопасности аттестуемых культур клеток является контроль онкогенности клеток [Серия технических докладов ВОЗ, 1987].

Отсутствие эндогенных онковирусов в клетках линий 4647, МДСК, 293 и Л-68, культивированных до максимально рекомендуемых пассажных уровней использования для производства, подтверждено по низкому уровню активности обратной транскриптазы, близкому к значению отрицательного контроля. Исследования туморогенности клеток методом гетеротрансплантации в экспериментах на иммуносупрессивных мышах показали отсутствие туморогеных потенций клеток из аттестуемых посевных и рабочих банков. Все животные через 20 дней наблюдения после введения клеток оставались живыми, опухолевидных образований в органах не выявлено.

Отсутствие посторонних вирусов было подтверждено в контроле на чувствительных культурах клеток и лабораторных животных, используя мышей-сосунков не старше 24 ч (20 голов), мышей массой 15-20 г (10 голов), морских свинок массой 300-350 г (5голов) и кроликов массой 2,5-3, кг (5 голов). Отсуствие изменений в органах и тканях экспериментальных животных подтвердило данные предыдущего анализа и позволяет утверждать, что аттестуемые линии клеток 4647, МДСК, 293 и Л-68 безопасны в пределах исследуемых уровней пассажа (в среднем 20).

Таким образом было создано 3 посевных и 4 рабочих банка клеток, наиболее перспективных для производства профилактических, диагностических и лечебных препаратов. Аттестация банков клеток показала безопасность клеток по отсутствию бактериальной, микоплазменной и вирусной контаминации, отсутствию онкогенных потенций, по крайней мере, в течение 20 последовательных пассажей культивирования in vitro. Стабильность культуральных, морфологических и продуктивных свойств подтвердили постоянство характеристик исследуемых клеток. Стабильность кариотипа отмечена только в клетках МДСК, 4647 и Л-68.

Известно, что вирус кори Л-16 в достаточно высоких титрах размножается в клетках Л-68 [Царева А.А., 1991; Нечаева Е.А. и др, 2001]. Замена первичных клеток перепелов на аттестованные клетки человека Л-68 имеет значительное преимущество при наработке вакцинного штамма вируса кори [Nechaeva E.A.et.al, 2002]. Клетки Л-68 используются также для контроля специфической активности субстанции и готовых лекарственных форм препаратов рекомбинантного интерферона-2В, производимого в ДГУ Вектор-Фарм.

Поскольку культура клеток МДСК высокочувствительна к холодоадаптированным реассортантным штаммам вирусов гриппа A/47/Shandon/93/1 (H1N1), A/47/Johannesburg/94/2 (H3N2) или B/60/Petersburg/95/20 [Нечаева Е.А. и др., 2001; Nechaeva E.A. et.al, 2002], то созданные запасы аттестованных клеток делают культуру высокоперспективной для проведения научных исследований, диагностики и промышленного получения гриппозной вакцины.

Банки клеток 4647 могут быть использованы для производстве вакцины против гепатита А (ФСП 42-0168047806, 2006). Согласно данным литературы, культура клеток 4647 высокочувствительна и к другим вирусам (Аксенова Т.А. и др., 1985; Миронова Л.Л. и др., 1990; Грачев В.П. и др. 1990, Миронова Л.П., Хапчаев Ю.Х., 1995, Медуницын Н.В. и др. 2002), что определяет высокую значимость применения ее для диагностики или производства других МИБП.

Изменчивость кариотипа клеток линии 293 из посевного и рабочего банков, но стабильность других характеристик и высокая продуктивная активность клеток позволили рекомендовать культуру 293 для производства противоракового препарата Канцеролизин. Создание аттестованных банков культуры клеток 293 позволило приготовить производственный штамм Adel2 аденовируса, перспективный в качестве вирусного противоопухолевого препарата [Сергеев А.Н. и др., 2003, Вдовиченко Г.В. и др. 2005]. На основе мутантного варианта аденовируса, культивированного в клетках 293, был разработан препарат Канцеролизин, пригодный для терапии онкозаболеваний [Vdovichenko G.V et al., 2005], и приготовлены экспериментальные серии препарата, пригодные для проведения доклинических и клинических испытаний [Вдовиченко Г.В., и др.2005].

Ученый Совет ГИСК им. Л.А. Тарасевича и Комитет МИБП, на основании представленных данных по исследованию клеток и результатов собственного контроля выдал заключения о соответствии современным требованиям культур клеток 4647, МДСК, Л-68 из посевных и рабочих банков клеток и разрешил использовать их для разработки новых технологий и производства МИБП. В связи с актуальностью разработки и высокой эффективностью препарата Канцеролизин в терапии раковых заболеваний, но не достаточной стабильностью кариотипа, было рекомендовано использовать клетки линии 293 в производстве противоракового препарата.

Исследование клеток-продуцентов рекомбинантного эритропоэтина человека

Высокая потребность и коммерческая значимость рекомбинантного ЭПО подчеркивают актуальность и целесообразность проведения исследований по получению новых штаммов-продуцентов, изучению стабильности их продуктивных свойств и безопасности, а также разработке новых лекарственных форм препарата.

Три штамма клеток СНО-рЕ, СНО-972 и СНО-23, продуцирующие рчЭПО, были созданы в институте Молекулярной биологии ГНЦ ВБ УВекторФ с использованием двух разных векторов интегративного типа, а позднее переданы нам для исследования и разработки новых технологий получения лекарственных форм рчЭПО.

Сравнительные исследования рекомбинантных культур клеток показали частичное сходство свойств штаммов клеток СНО-972 и СНО-23, отражающее общность генетических конструкций и линий клеток-реципиентов, используемых для создания данных штаммов; а также полное различие в размерах, типах роста и морфологии клеток этих штаммов с клетками СНО-рЕ.

Анализ показал достаточно высокие культуральные и продуктивные свойства клеток СНО-рЕ и СНО-972, что стало основанием для патентования новых штаммов клеток СНО-рЕ и СНО-972, как перспективных для получения рекомбинантного препарата рчЭПО [Патент РФ 97108266, 1997; Патент RU 2070931, 1996]. Однако пересчет продукции ЭПО на определенное число клеток (удельная продуктивность на 1 млн. клеток) показал несомненные преимущества культуры клеток СНО-рЕ, в качестве продуцента рчЭПО (Рис.7).

Рис. 7. Удельная продуктивность рчЭПО рекомбинантных культур клеток (мкг/106кл/72 часа).

При выборе технологически перспективного штамма клеток важным является стабильность встроенной генно-инженерной конструкции в зависимости от условий культивирования и наличия или отсутствия селективного давления. Контроль продуктивности клеток в питательной среде с селективными добавками (МТХ для клеток СНО-23 и СНО-972 или ГАТ для клеток СНО-рЕ) или без них показал стабильность сохранения высоких продуктивных свойств клеток СНО-рЕ в течение 37 пассажей в селективной среде и не менее 8 пассажей без селективного давления (Рис. 8). И, таким образом, подтвердил стабильность амплифицированного состояния гена, в отличие от клеток СНО-972 и СНО-23, показавших большую зависимость от состава среды.

Рис. 8. Уровень продукции рчЭПО клетками линии СНО-рЕ, выращиваемой на среде с ГАТ или без селективного давления, Ед/мл по ИФА.

Стабильность культуральных, морфологических свойств, характеристик кариотипа и сохранение достаточно высокого уровня продукции рчЭПО клетками СНО-рЕ при длительном их пассировании in vitro, а также независимость продуктивности клетками рекомбинантного гормона от наличия селективных добавок в среде, по крайней мере, в течение 5-8 пассажей, делают культуру клеток СНО-рЕ наиболее перспективной для наработки препарата, регулирующего эритропоэз.

Анализ субстанции рчЭПО. Согласно данным электрофореграммы хроматографически очищенных концентратов эритропоэтина, полученного на разных культурах клеток, молекулярная масса всех трех образцов рчЭПО находилась в пределах значений 35-37 кД (см. Рис. 9), что соответствует молекулярной массе природного эритропоэтина (36 кД). Денситограмма геля показала, что содержание мономера рчЭПО в редуцирующих и нередуцирующих условиях составляет не менее 95% для всех очищенных образцов.

Специфическую активность образцов рчЭПО, полученных на разных культурах клеток, исследовали по гемостимулирующим свойствам или влиянию препарата на рост числа эритроидных колоний в экспериментах in vitro. Результаты показали, что препараты, полученные на культурах клеток СНО-рЕ и СНО-972, обладали колониестимулирующей активностью. Рост числа эритроидных колоний, вырастающих из 0,1 млн мышиных миелокариоцитов, был прямопропорционален увеличению концентрации препарата в диапазоне от 0,5 до 3 Ед/мл.

кД	1 2  3 4
95,0
67,0
45,0
29,0
21,0
12,0
6,5

Рис. 9. Электрофореграмма очищенных образцов рчЭПО, полученного на разных культурах клеток: 1-стандарты молекулярных масс (kD), 2- СНО-рЕ;  3- СНО-972, 4 - СНО-23. Окраска Commassie Brilliant Blue R-250.

Сравнительный анализ специфической активности рчЭПО, полученного в культуре клеток СНО-рЕ, и коммерческого препарата Recormon (УBoehringer MannheimФ), проведенный на культуре неприлипающих миелокариоцитов, показал близость кривых доза - эффект в диапазоне концентраций от 0,5 до 10 Ед/мл. Как видно из таблицы 3, при использовании равных концентраций гормона колониестимулирующий эффект рчЭПО, продуцируемого клетками линии СНО-рЕ, в некоторых случаях даже превышал таковой зарубежного аналога. Высокая эритропоэзстимулирующая активность препарата была показана и в экспериментах на лабораторных мышах.

Таблица 3

Зависимость роста числа эритроидных колоний, выросших из 105 неприлипающих миелокариоцитов, от разных концентраций рчЭПО (Х+ m )

Концентрация ЭПО (ED/мл)	Субстанция рчЭПО (ГНЦ ВБ Вектор)	Recormon (Швеция) для в/в, п/к введения
0	12,50+1,95	12,50+1,95
0,5	18,75+1,25	20,00+1,48
1,0	22, 3+1,01	25,10+0,76
1,5	22,50+1,78	27,50+2,75
4,0	22,15+2,15	25,82+2,55
8,0	28,45+2,15	25,35+0,85
60,0	8,92+2,10*	21,58+2,30*
90,0	17,50+2,95	14,38+1,32

Примечание: * - различия между параметрами существенны с вероятностью Р>0,95.

Таким образом, контроль физико-химических свойств субстанции рчЭПО, получаемой на всех трех культурах клеток, показал соответствие природному аналогу эритропоэтина человека по молекулярной массе, иммунореактивности и специфической активности по стимуляции эритропоэза в экспериментах in vivo и in vitro.

Учитывая полученные данные и перспективность клеток СНО-рЕ как продуцента для производства рчЭПО, были восстановлены клетки СНО-рЕ из ранее аттестованного национальным органом контроля в соответствии с современными требованиями посевного банка клеток, культивированы и заморожены в виде 2 рабочих банков клеток СНО-рЕ в количестве более 300 ампул. Контроль клеток показал отсутствие контаминантов, стабильность культурально-морфологических и продуктивных свойств.

Получение контролированных банков культуры клеток СНО-рЕ, создало основу для разработки новых технологий производства лекарственного препарата. В результате экспериментальных исследований была разработана впервые в мире технология получения таблетированной формы рчЭПО для перорального применения [Патенты РФ № 2182830 и №  2152206]. Эритростимулирующая активность таблетированной формы препарата в экспериментах на животных оказалась сравнимой с инъекционной (Гольдберг Е.Д. и др. , 2000).

Получение, культивирование и аттестация клеток, пригодных для научных исследований и создания препаратов для заместительной терапии

Одним из перспективных направлений современной биотехнологии является создание новых способов и технологий получения клеток для регенеративной медицины. Рассматриваются возможности конструирования тканей или всего органа с использованием биодеградируемых материалов со стволовыми или дифференцированными клетками. В связи с этим изучение условий получения, культивирования, дифференцировки, аттестации и применения клеток, полученных из разных тканей и органов, представляется актуальным, научно и практически значимым.

Выделение, культивирование и исследование первичных культур клеток из разных тканей и органов. Для получения первичных и диплоидных культур клеток разных тканей и органов использовали ткани эмбриона, взрослого человека или лабораторных животных. Забор эмбрионального материала осуществляли строго после медицинского аборта с соблюдением правил этики, закона об охране здоровья граждан и информированным согласием донора. Ткани и органы животных забирали соблюдая биоэтические нормы.

Клетки выделяли с использованием ферментов трипсина, коллазы, коллагеназы, протеазы или механическим измельчением ткани, криоконсервировали, используя разные криопротекторы (диметилсульфоксид, СКРС, FBS, альбумин сыворотки крови человека). Суспензию клеток или мелкие кусочки тканей разливали по ампулам и замораживали в виде первичных банков клеток. Затем восстанавливали ампулу и изучали жизнеспособность клеток, наличие контаминантов, возможность культивирования in vitro и состав клеток по уровню дифференцировки. В случае выявления контаминации клетки уничтожали.

Результаты исследований показали возможность получения уникальных культур клеток из разных тканей и органов человека и животных. Однако получение жизнеспособных клеток в значительной степени зависело от времени и условий доставки органов, способа выделения клеток, условий их культивирования и криоконсервации.

Для выделения эндотелиоцитов, миокардиоцитов, спинного мозга, мышечной или хрящевой ткани важным являлись не только выбор фермента, его концентрации, но температура и время его воздействия. Клетки печени или головного мозга лучше сохраняли жизнеспособность без применения ферментов для диссоциации, а выделением их в виде небольших конгломератов или групп клеток путем механического продавливания тканей через мелкоячеистый материал.

Использование аттестованного коммерческого альбумина сыворотки крови человека в среду для криоконсервации клеток человека, вместо сыворотки крови животных, позволяло сохранять первичные клетки человека при температуре жидкого азота и исключить вероятность передачи посторонних агентов через сыворотку крови животных.

Изучение условий культивирования показало, что клетки спинного мозга человека, хондроциты, миокардиобласты или эндотелиоциты лучше всего росли в питательной среде ДМЕМ/F12 или RPMI 1640 с добавлением сыворотки крови плодов коровы в количестве 10% - 20%. При выращивании, хондроцитов в данных условиях их число увеличивалось через 3 суток в 2-3 раза. Пересевая через 3-4 дня, клетки хрящевой ткани удавалось поддерживать in vitro в течение 4 и более пассажей. Использование других сред (Игла МЕМ, ДМЕМ) или других сывороток (СКРС, свиная сыворотка) приводило к гибели клеток уже на 1-3 пассаже.

Аналогичные результаты получены и с другими типами клеток. Вместе с тем отмечено, что лучший рост клеток, выделенных из тканей сердца, эндотелия сосудов или мышечной, наблюдался на поверхности, покрытой желатином. Культура клеток, выделенных из миокарда желудочков, была представлена смесью разных типов клеток с преобладанием крупных многоядерных полигональных клеток. После культивирования клеток в течение 20 и более дней исчезали мелкие и крупные многоядерные клетки, но оставались крупные полигональные клетки.

Первичные культуры клеток более всего ценны присутствием стволовых или малодифференцированных клеток. Выявление нестина в первичных клетках головного мозга плода человека с помощью меченых антител подтвердило присутствие нейральных стволовых или прогениторных клеток. Анализ клеток после культивирования in vitro в течение 1 пассажа показал наличие как нестинпозитивных нейральных стволовых клеток, окрашенных флюорохромом taxes red stain, так и ранних нейробластов, меченных антителами на -III тубулин.

При культивировании нейральные клетки головного мозга делились и мигрировали из кусочков ткани, иногда формировали шарообразные структуры, возможно, нейробластулы. Активного роста клеток мозговой ткани или клеток печени достичь не удалось и, впоследствии, наблюдалась гибель клеток, иногда замещение фибробластоподобными клетками. Из литературы известно, что при выращивании в среде с добавлением сыворотки крови часть клеток эмбрионального мозга плода человека дифференцируется по нейрональному типу [Полтавцева Р.А. и др., 2001].

Ультраструктурное исследование хондроцитов показало, что в ходе I-III пассажей возрастало содержание дифференцированных элементов с признаками синтезирующей активности и накоплением большого количество синтезированного материала. На III пассаже в клетках наблюдалось появление вторичных лизосом, содержащих фрагменты мембран, гранулы секрета и участки цитоплазмы. Структура клеток IV пассажа свидетельствовала о процессах затухания жизнедеятельности культивируемых хондробластов.

При световой микроскопии в культуре первичных хондробластов выделялись 3 типа клеток, отличавшихся размерами и количеством цитоплазмы (см. Рис. 10А). Анализ клеток на 2-3 пассаже, окрашенных альциановым синим, показал большое количество суммарных гликозаминогликанов, характерных для дифференцированных хондроцитов гиалинового хряща межпозвонковых дисков, в цитоплазме всех трех типов клеток. Гистохимическая реакция выявила в составе суммарных гликозаминогликанов гранулы хондроитинсульфата и кератансульфата, локализовавшиеся на периферии клеток всех трех типов. В межклеточном веществе отмечалась положительная реакция на коллаген II типа. Отмечено высокое содержание гликогена, особенно, в клетках 2 типа (Рис. 10Б). Полученные данные подтверждают присутствие малодифференцированных клеток гиалинового хряща в первичной культуре и разной степени их дифференцировки в процессе культивирования in vitro.

АБ

Рис.10. Первичная культура фетальных хондробластов человека.

А) Темной стрелкой обозначены клетки первого типа, двойной стрелкой - клетки 2 типа, светлой стрелкой - клетки 3 типа. Окрашено гематоксилин-эозином. Ув. х200.

Б) Реакция на гликоген в клетках разных типов. ШИК-реакция. Ув. х200.

Таким образом, проведенные исследования позволили определить условия выделения, сохранения и культивирования клеток из разных тканей и органов, перспективных для проведения научных исследований или практического применения. Результаты показали, что клетки головного мозга и гепатоциты лучше сохраняли жизнеспособность при выделении и хранении их в виде групп или конгломератов клеток, в то время как клетки других тканей и органов выделяли в виде суспензии отдельных клеток. Использование альбумина сыворотки крови человека позволяло сохранять первичные клетки человека при температуре жидкого азота и исключать вероятности передачи посторонних агентов через сыворотку крови животных.  При культивировании первичных культур клеток в среде без добавления специальных факторов стволовые и прогениторные клетки в культуре дифференцируются в течение 1-4 пассажей.

Создание и аттестация банков культур клеток, пригодных для научных исследований или получения препаратов для заместительной терапии.

Создание и аттестация банков первичных культур клеток. Для получения достаточного количества стволовых и малодифференцированных клеток, пригодных для научных исследований или практического применения создавали банки первичных клеток, как уже отмечалось выше. В результате было приготовлено 10 банков первичных культур клеток из разных тканей и органов человека и животных, включавших по 30-200 ампул с клетками.

При создании банка, например, клеток СКМ-30 из тканей головного мозга фетуса человека 20 недель было получено 190 ампул по 1,0х108 клеток в каждой. Однако жизнеспособность клеток оказалась низкой и составила 25%. Низкая доля живых клеток обусловлена высокой скоростью гибели нейральных клеток тканей головного мозга при доставке материала, длительности манипуляций, связанных с выделением, розливом клеток по ампулам и временем заморозки клеток. При ускорении процесса доставки материала, уменьшении количества ампул процедура создания банка сокращалась и позволяла получать суспензию клеток с долей живых не менее 50%.

При создании банка клеток печени плода человека СКП-30 было  получено 70 ампул по 1,0х108 клеток в каждой. Число живых клеток составляло 50%, что также свидетельствует о чувствительности клеток печени к влиянию временных и других факторов. Клетки других типов оказались более устойчивыми и, например, выделенные из мышечной ткани (банк СКМц-30, СКМц-16) имели жизнеспособность на уровне 80% и более. Полученные результаты совпадают с данными, описанными ранее, и подтверждают быструю гибель нейральных и нейрональных клеток головного мозга в процессе их выделения.

В настоящее время в России существуют Методические указания, касающиеся аттестации перевиваемых клеточных линий - субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов, соответствующие требованиям ВОЗ и разработанные ГИСК им. Л.А. Тарасевича в 1989 году [РД 42 28-10-89, 1989]. Для контроля клеток, пригодных для заместительной терапии, таких требований не было. Опираясь на приобретенный опыт при создании и аттестации банков первичных культур клеток разных тканей и органов и учитывая современный уровень методов контроля, нами были разработаны совместно с сотрудниками ГИСК им. Л.А. Тарасевича новые Методические указания Аттестация первичных или диплоидных культур клеток, пригодных для трансплантации. Новые требования включают, главным образом, контроль безопасности клеток, пригодных для научных или экспериментальных исследований и создания препаратов для трансплантаци или заместительной терапии. В новые требования введены контроли клеток с использованием современных методов ИФА- и ПЦР-анализов для исключения таких контаминантов, как вирус иммунодефицита человека, гепатиты, туберкулез, хламидии, микоплазмы, цитомегаловирусы и вирусы герпеса человека.

Учитывая требования новых Методических указаний, были проведены контроли первичных банков клеток и оформлены паспорта. По результатам проведенных исследований и по количеству ампул (не менее 100) были отобраны по 2 банка клеток головного мозга (СКМ-30 и СКМ-33) и фетальной печени человека (СКП-30, СКП-33) и представлены в ГИСК им. Л.А. Тарасевича для последующего контроля в национальном контрольном органе. Впервые созданные и аттестованные банки первичных и малодифференцированных клеток эмбриональной печени или нейральных клеток мозга человека не содержат контаминантов и могут быть использованы для проведения научных исследований или создания препаратов для заместительной терапии.

Создание посевных и рабочих банков культур диплоидных фибробластов человека и их аттестация. Известно, что фибробласты продуцируют важные элементы: коллаген, эластин, полисахариды, факторы роста и другие факторы, необходимые для формирования функциональной структуры кожи (Крихели Э. и др., 2004). Фибробласты обладают сильным стимулирующим действием на адгезию и пролиферацию кератиноцитов, продуцируя гормоны и факторы роста, при этом сами активно пролиферируют (Саркисов Д. С. и др. 1996). Именно эти свойства клеток и позволяют получать хорошие ранозаживляющие эффекты после трансплантации клеток на раны различной этиологии.

Возможность культивирования фетальных или эмбриональных фибробластов человека, сохраняющих стабильные свойства в течение десятков пассажей in vitro, подчеркивает перспективность наработки большого количества стандартных по биологическим свойствам клеток, создания на их основе аттестованных банков клеток, пригодных для научных исследований или разработки новых технологий производства препаратов для заместительной терапии.

Как отмечалось ранее, культуры фибробластов человека ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ-16-2, полученные из тканей легкого или кожно-мышечной ткани эмбриона человека, представлялись наиболее перспективными. Клетки восстанавливали из ампул, замороженных на 6 пассаже, и культивировали в питательной среде до 10-11 пассажа. Из собранного на одном пассажном уровне урожая клетки разливали в ампулы и замораживали при температуре жидкого азота. Так были приготовлены посевные банки клеток легкого ФЭЧ 16-1(ПБК № 1952) и кожно-мышечной ткани ФЭЧ 16-2 (ПБК №1948) в количестве 204 и 312 ампул, соответственно. Рабочие банки фибробластов ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 создавали из 1 ампулы посевных банков клеток после культивирования до 15-19 пассажа. Таким образом были созданы банки клеток ФЭЧ 16-1 (РБК № 1957, РБК №2137) и ФЭЧ 16-2 (РБК № 1953, РБК № 1958 и РБК 2138).

В результате было заложено на хранение 7 посевных и рабочих банков эмбриональных фибробластов человека, содержащих по 200-250 ампул с (1,0-1.5)х106  клеток в каждой. Банки клеток аттестовали в соответствии с современными требованиями ВОЗ [РД 42-28-10-89, 1989]. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составляла не менее 85% во всех случаях. Фибробласты сохраняли культуральные и морфологические характеристики, оставались субстратзависимыми, формировали монослой, который был представлен однотипными фибробластоподобными клетками с четко выраженной поточностью расположения.

Клетки имели диплоидный набор хромосом, соответствующий нормальному кариотипу человека, 2n=46, XX (см. Рис.11). Основной набор состоял из хромосом с 1-й по 23-ю пару. Модальный класс четко выражен. Маркерные хромосомы не обнаружены.  При просмотре 1000 клеток на 14, 30 и 33 пассажах отмечено отсутствие структурных перестроек и гиперплоидных клеток, полиплоидные клетки встречались в 0,4-3% случаев, число диплоидных клеток на 11 и 30 пассажах составляло не ниже 94,5%. Полученные данные свидетельствуют о стабильности кариотипа клеток и соответствии современным требованиям [РД 42-28-10-89, 1989].

Рис. 11. Кариотип культуры клеток ФЭЧ 16-1, 15 пассаж. G -oкраска.

Электрофоретический анализ изоферментов Г6ФДГ и ЛДГ показал видовое соответствие клеткам человека. Отсутствие контаминантов подтверждено методами высева на набор селективных сред, окрашиванием флюорохромом, высевом на чувствительные культуры клеток, на куриных эмбрионах и лабораторных животных. Отсутствие онкогенных потенций показано по отсутствию опухолевых образований у иммуносупрессивных животных через месяц после введения клеток. Отсутствие эндогенных онковирусов показано по низкому уровню активности обратной транскриптазы в исследуемых клетках.

Таким образом, в результате проведенных исследований создано 7 посевных и рабочих банков фибробластов человека, обладающих стабильными культуральными, морфологическими свойствами и неизменным кариотипом при культивировании клеток, по крайней мере, до 35 пассажа. Безопасность клеток подтверждена по отсутствию контаминантов и туморогенных свойств клеток. Национальным органом контроля - ГИСК им. Л.А. Тарасевича было подтверждено, что аттестованные клетки соответствуют современным требованиям. Комитет МИБП разрешил использование их в научных исследованиях и заместительной терапии.

Выбор условий культивирования, транспортировки и поддержания клеток на ране. Одним из перспективных направлений практического применения фибробластов представляется лечение ран различной этиологии [Саркисов Д.С. и др., 1991, 1995; Смирнов С.В., 1994]. Фибробласты субстратзависимы, легко снимаются с помощью трипсина и могут быть трансплантированы на рану в виде суспензии. Однако жидкая консистенция суспензии клеток не способна удерживаться на ране, стекает в повязку, приводит к гибели клеток и, таким образом, снижает их эффективность. В связи с вышеизложенным были проведены исследования по пригодности разных материалов в качестве подложки для выращивания клеток, переноса их и поддержания на ране.

В результате проведенных исследований были подобраны условия выращивания и переноса клеток на специально обработанной целлофановой пленке, на микроносителях или в геле, способы запатентованы [Патенты № 2142820, № 2189223]. Выращенные на прозрачной пленке клетки легко переносились на ровные ожоговые поверхности, рана при этом хорошо просматривалась. Клетки на микроносителях или в геле позволяли переносить клетки на глубокие и неровные раны.

Результаты исследования разных подложек в виде губки или прозрачной многослойной пленки с использованием природных компонентов показали наилучшие результаты при использовании экспериментальных образцов коллагена и хитозана, сшитых глутаровым альдегидом с добавлением альгината натрия, глутаровой кислоты, а также антисептика фурагина и анестетика анилокаина. В отличие от многих других указанные образцы не токсичны и клетки не только прикреплялись к ним, но и равномерно заселяли их, морфология клеток не менялась (см. Рис.12).

Рис.12. Монослой фибробластов на пленке из хитозана, сшитого с коллагеном глутаровым альдегидом. Ув. х20об.

Возможность приготовления субстрата в виде геля, губки или многослойной пленки, нетоксичность и пригодность их для выращивания и поддержания клеток делают данный материал наиболее перспективным для трансплантации клеток на раны различной глубины и формы. Разработанные условия выращивания клеток, транспортировки и удобства трансплантации в геле или на специальных пленках имеют несомненное практическое значение и могут быть использованы в регенеративной медицине.

Ограниченные клинические исследования по применению клеток на пленках, в геле или на микроносителях в ситуациях по жизненным показаниям показали высокую эффективность применения аттестованных фибробластов для лечения обширных и глубоких ожоговых ран; больных диабетом с длительно незаживающими трофическими язвами, больных с отморожениями конечностей или длительно незаживающими дефектами костной ткани [Ефремов А.В. и др., 1995; 1999; Юрченко Н.Д. и др., 2000, Колосов Н.Г. и др., 2005]. Применение клеток приводило к повышению эффективности сопутствующей терапии и ускорению сроков заживления ран, по сравнению с традиционными методами лечения [Колосов Н.Г. 1999; Колосов Н.Г. и др., 2005]. Использование аттестованных клеток позволяло исключить вероятность переноса инфекции и туморогенность препарата.

Уникальность и преимущества предлагаемого метода подчеркивается возможностью использования клеток из аттестованных банков при определенных показаниях: дефицит донорских ресурсов при обширных и глубоких ожогах, у больных с поливалентной аллергией, а также у лиц пожилого и старческого возраста, при показаниях не позволяющих осуществлять аутодермопластику, в детской комбустиологии и в случаях с инфицированными больными (гепатиты, ВИЧ)  без дополнительной травмы больного и создания дополнительных ран.

Создание аттестованных банков клеток и подбор условий для выращивания и транспортировки клеток легло в основу создания новой технологии получения стандартного, высокоэффективного и безопасного препарата Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии. Разработка и внедрение технологии применения клеток человека, заранее аттестованных и заложенных на хранение в ампулах в достаточном количестве, позволит обеспечивать стандартным клеточным материалом тяжело обожженных и больных при чрезвычайных ситуациях.

Использование нового метода в практической медицине позволит уменьшить процент смертности ожоговых больных, уменьшить хирургическое вмешательство, сократить размеры донорских участков, уменьшить сроки госпитализации и получить лучшие косметические эффекты. Полученные результаты исследований легли в основу разработки нормативной документации: Фармакопейной статьи предприятия, Регламента производства, Инструкции по применению. Новые штаммы клеток ФЭЧ - 16-1 и ФЭЧ-16-2 запатентованы, как пригодные для заместительной терапии.

ВЫВОДЫ

1. В результате многолетних исследований при нашем участии создана система аттестованных клеток, включающая паспортизованные коллекции и аттестованные банки первичных, диплоидных и перевиваемых культур клеток, пригодных для научных исследований, разработки новых технологий производства препаратов и лечения, соответствующая требованиями ВОЗ и обеспечивающая гарантии качества, стабильности и безопасности клеток и получаемых препаратов.
2. Изучены условия выделения новых культур клеток различного происхождения. Получены новые штаммы диплоидных культур клеток человека и 4 новые линии клеток насекомых МБ ХС-685, МБ ОзС-72, МБ ОзС-73 и МБ КС-23, выделенные из яичников куколок хлопковой, озимой и капустной совок. Клетки насекомых характеризуются стабильными культурально-морфологическими свойствами, способностью к продукции вирусов ядерного и цитоплазматического полиэдроза (ВЯП И ВЦП) и могут служить системой для проведения научных исследований или производства энтомопатогенных препаратов.
3. Созданы и аттестованы в соответствии с современными требованиями ВОЗ 7 посевных и рабочих банков технологически перспективных  культур клеток. Стабильные по свойствам и безопасные по отсутствию контаминантов и туморогенных потенций линии клеток МДСК, 4647 и Л-68 разрешены национальным органом контроля для создания новых технологий  производства вакцин и других МИБП. Изменчивость кариотипа клеток 293, но стабильность других характеристик и высокая продуктивная активность клеток позволили рекомендовать культуру клеток 293 для производства противоракового препарата Канцеролизин.
4. Выделенные и хроматографически очищенные образцы субстанции рчЭПО, полученные на трех рекомбинантных культурах клеток, показали высокую степень чистоты и отсутствие посторонних примесей, а также соответствие природному аналогу по молекулярной массе, иммунореактивности и специфической активности по влиянию на эритропоэз в экспериментах in vitro и in vivo на лабораторных животных. Полученные данные легли в основу разработки новой технологии получения  таблетированной формы рчЭПО для перорального применения.
5. Стабильность и высокие продуктивные и культуральные свойства культуры клеток СНО-рЕ по сравнению с другими рекомбинантными линиями клеток СНО-972 и СНО-23 показали большую перспективность данной культуры для производства генноинженерного эритропоэтина человека. Клетки СНО-рЕ, заложенные в виде рабочих банков, являются основой для организации стабильного производства препаратов рекомбинантного ЭПО человека.
6. Создана технология получения стандартного, высокоэффективного и безопасного препарата Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии с использованием впервые полученных штаммов диплоидных фибробластов человека ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 из аттестованных посевных и рабочих банков. Разработаны и утверждены ФСП, Регламент производства, Инструкция по применению, получен Сертификат производства.
7. Экспериментально обоснованы способы выращивания фибробластов на специальных пленках, пористых подложках или микрононосителях для трансплантации клеток на раны различной этиологии. Впервые примененная методика транспортировки клеток в геле или на микроносителях позволяет доставлять материал на большие расстояния, сохранять жизнеспособный материал в течение 5 дней, что может иметь значение при доставке клеток в дальние районы и при чрезвычайных ситуациях.
8. Отработаны условия выделения первичной суспензии клеток из разных тканей и органов, диспергирования и криоконсервации. Показано присутствие стволовых и малодифференцированных клеток в первичных культурах и быстрая их дифференциация при культивировании in vitro.
9. Разработаны Методические указания по контролю клеток, пригодных для научных исследований или трансплантации. Впервые созданы банки первичных малодифференцированных клеток, выделенных из разных тканей и органов и заложенных на хранение при температуре жидкого азота. Созданные и аттестованные в соответствии с современными требованиями  4 банка клеток печени и нейральных клеток головного мозга плода человека могут быть использованы для научных исследований или создания стандартных и безопасных препаратов для заместительной терапии.

сПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Идентификация линий клеток насекомых /Колокольцова Т.Д, Царева А.А., Немцов Ю.В., Исаенко А.А., Бочкова Т.Г. // Вопросы вирусологии. - 1987. - т.32. - № 1. - С. 87-95.
2. Каталог перевиваемых культур клеток / Царева А.А., Исаенко А.А., Немцов Ю.В, Колокольцова Т.Д., Юрченко Ю.А., Рубцова Н.В., Машукова С.И., Решетникова Г.Ф., Киц И.В., Дмитриева Е.В., Гетманова Т.Н., Чешенко И.О., Махова Н.М.. // Депонирован в ВИНИТИ, - Деп. № 865-В88, - M.,1988. - т. 1. - С. 1-186.
3. Каталог перевиваемых культур клеток / Царева А.А., Исаенко А.А., Немцов Ю.В, Колокольцова Т.Д., Юрченко Ю.А., Решетникова Г.Ф., Юрченко Н.Д., Махова Н.М., Рубцова Н.В., Урманова М.А., Машукова С.И., Дмитриева Е.В., Гетманова Т.Н., Чешенко И.О., Киц И.В. .// Депонирован в ВИНИТИ, - Деп. № 866-В88, - M., 1988. - т. 2.  -С. 1-150.
4. Каталог перевиваемых культур клеток. Царева А.А., Исаенко А.А., Немцов Ю.В, Колокольцова Т.Д., Юрченко Ю.А., Решетникова Г.Ф., Рубцова Н.В., Махова Н.М., Машукова С.И., Гетманова Т.Н., Чешенко И.О. // Депонирован в ВИНИТИ, Деп. № 867-В88, - M., 1988. - т.3, - С. 1-110.
5. Каталог перевиваемых культур клеток / Царева А.А., Исаенко А.А., Колокольцова Т.Д., Немцов Ю.В, Хромых Т.И., Рубцова Н.В., Юрченко Ю.А., Рябчикова Е.И., Ткачев В.К.. // Депонирован в ВИНИТИ. - Деп. № 869-В88, - M., 1988. - т. 4. - с. 1-141.
6. Штамм перевиваемых клеток эмбрионов Agrothis segetum (Schiff) для культивирования бакуловирусов / Колокольцова Т.Д., Герасимова Н.Г., Царева А.А. // Патент (СССР) № 1808009 Ф3, С12 N5/00, Ф01 № 63/00, опубл. в БИ № 13, 1993г.
7. Колокольцова Т.Д., Царева А.А. Штамм перевиваемых клеток яичников куколок хлопковой совки Heliothis armigera (Hubn), продуцент вирусов ядерного полиэдроза // Патент (СССР) № 1808010 Ф3. - БИ. - 1993. -№ 13.
8. Колокольцова Т.Д., ЦареваА.А. Выбор источника получения первичных культур клеток чешуекрылых насекомых // Цитология. - 1994. - № 4. -С.6-7.
9. Колокольцова Т.Д, Герасимова Н.Г. Получение новой линии клеток яичников куколок капустной совки Mamestra brassicae L. // Цитология. - 1994. - № 4. - С. 9-10.
10. ечение глубоких ожогов кожей, выращенной в искусственных условиях / Ефремов А.В, Юрченко Н.Д. Колосов Н.Г., Колокольцова Т.Д., Нечаева Е.А. // Сб. "Актуальные вопросы развития военно-медицинской службы СибВО на современном этапе". - Новосибирск, 1995. - С. 16-17.
11. Колокольцова Т.Д., Царева А.А. Морфологический и кариологический анализ первичных и перевиваемых культур клеток чешуекрылых насекомых // Вопросы вирусологии. - 1995. - № 2. - С. 91-95.
12. Колокольцова Т.Д., Герасимова Н.Г., Царева А.А., Получение первичных культур клеток чешуекрылых насекомых // Вопросы вирусологии. - 1995. - № 2. - С. 89-91.
13. Колокольцова Т.Д. Герасимова Н.Г., Царева А.А. Новая линия клеток яичников куколок хлопковой совки Heliothis armigera (HUBN) // Вопросы вирусологии. - 1995. - № 3. - С. 135-138.
14. Колокольцова Т.Д., Царева А.А. Методические основы получения первичных культур клеток насекомых.//Вопросы вирусологии. - 1995. - № 3. - С. 89-91.
15. Выяснение оптимального способа получения культур клеток кожи / Юрченко Н.Д., Колокольцова Т.Д., Колосов Н.Г., Нечаева Е.А. // Цитология.-1996. - т. 38. - № 2. - С. 262-263.
16. Выбор оптимальных условий получения суспензии жизнеспособных клеток кожи человека / Юрченко Н.Д, Колокольцова Т.Д, Колосов Н.Г, Шумакова О.В., Нечаева Е.А. // Биотехнология.- 1997. - № 11-12. - С. 37-47.
17. Перспективы использования аттестованных фетальных фибробластов человека при лечении ран различной этиологии / Колокольцова Т.Д., Юрченко Н.Д., Колосов Н.Г., Шумакова О.В., Нечаева Е.А. // Вестник РАМН.-1998.- № 3. - С. 32-35.
18. New technology of production recombinant human erythropoietin for peroral administration / Kolokoltsova T.D., Kostina N.E., Nechaeva E.A., Yurchenko N.D., Shumakova O.V., Rizikov A.B., Varacsin N.A., Rjabicheva T.G. // Proceedings of ESACT Meeting: "New Developments and New Application in Animal Cell Technology" / Ed. by Otto Wilhelm Merten, P. Perrin and B. Griffits. - Netherlands.: Kluwer Academic Publishers, 1998. - Р. 463-467.
19. Cultivation of skin cells suitable for recovery of  burn wound / Kolokoltsova T.D., Yurchenko N.D., Kolosov N.G., Khristo S.A., Shumakova O.V // Proceedings of ESACT Meeting: "New Developments and New Application in Animal Cell Technology" / Ed. by Otto Wilhelm Merten, P. Perrin and B. Griffits. - Netherlands: Kluwer Acad. Pub., 1998. - Р. 673-675.
20. Первый опыт применения культуры аллофибробластов при ожогах / Христо С.А., Колокольцова Т.Д., Юрченко Н.Д., Юдаев И.П // Сб: Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине.- Новосибирск, 1998. - С. 183-184.
21. Применение аттестованных фибробластов в Ожоговом Центре / Ефремов А.В., Колосов Н.Г., Колокольцова Т.Д., Юрченко Н.Д., Христо С.А., Юдаев И.Ю., Нечаева Е.А // Сб.:Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине. - Новосибирск, 1999. - С. 132-134.
22. Creation and maintenance of certified banks of cells suitable for production of healing and immunological preparations / Kolokoltsova T.D., Yurchenko N.D., Nechaeva E.А, Isaenko A.A., Shumakova O.V., Getmanova T.N // Proceedings of ESACT Meeting: Animal cell technology : products from cells, cells as products / A. Bernard (eds.). - Switzerland,: Kluwer Acad. Pub., 1999. - Р. 505-507.
23. Рекомбинантная плазмидная ДНК рКЕР-9, кодирующая эритропоэтин человека, штамм культивируемых клеток яичника китайского хомячка СНОрЕ-9 - продуцент эритропоэтина человека / Урманова М.А., Щелкунов С.Н., Поздняков С.Г., Колокольцова Т.Д., и др. // Патент РФ № 97108266. - БИ.- 1999. - № 1.
24. Аллотрансплантат для восстановления кожного покрова, способ его получения и способ восстановления кожного покрова при повреждениях различной этиологии / Юрченко Н.Д., Колокольцова Т.Д., Колосов Н.Г. и др. // Патент РФ № 2142820, - БИ. - 1999. -№ 35.
25. Создание аттестованных банков фибробластов человека, пригодных для лечения ран различной этиологии / Юрченко Н.Д., Колокольцова Т.Д., Щумакова О.В., Нечаева Е.А., Христо С.А. // Сб. Клинические аспекты клеточной и тканевой терапии. - Омск, 2000. - С. 182-184.
26. Гемостимулирующие свойства таблетированной формы рекомбинантного эритропоэтина человека в эксперименте / Голдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., Колокольцова Т.Д., Костина Н.Е., Минакова М.Ю., Нечаева Е.А.. Поженько Н., Сандахчиев Л.С., Симанина Е.В., Хлусов И.А. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2000. - т. 63.- № 5. - С. 37-40.
27. Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина для перорального применения и способ его получения / Сандахчиев Л.С., Колокольцова Т.Д., Костина Н.Е., и др. // Патент РФ № 2152206. - БИ. - 2000. - № 10.
28. The comparative study of cultural and productive characteristics of different recombinant cell lines producing human erythropoietin / Kolokoltsova O., Schumakova O., Belova N., Nechaeva E., Kolokoltsova T. // Proceedings of ESACT Meeting: УAnimal cell Technology: From target to MarketФ. / Ed. Lindner E., Chatzissavidou N., Lullau E. - New York/Boston/London: Kluver Academic Publishers, 2001.- Р. 75-78.
29. Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина / Сандахчиев Л.С, Колокольцова Т.Д., Вараксин Н. И др. // Патент РФ №2182830. - БИ. - 2002. - № 15.
30. Средство для лечения глубоких кожных дефектов / Юрченко Н.Д., Колокольцова Т.Д., Шумакова О.В, и др. // Патент РФ № 2189223. - БИ. -2002. - № 9.
31. Kim I., Kolokoltsova T. The production and storage of nucleus-containing cells from umbilical blood // Proceedings of the II Moscow International Congress УBIOTECHNOLOGY: State of the art and prospects of DevelopmentФ. - Moscow, Russia, 2003. - P. 121-124.
32. Vdovichenko G.V, Kolokoltsova T.D. The development of the method for production of cardiac cells and vascular endothelium // Proceedings of the II Moscow International Congress УBIOTECHNOLOGY: State of the art and prospects of DevelopmentФ. - Moscow, Russia, 2003. - P. 127-133.
33. Cell-based therapy of chronic degenerative diseases of the central nervous system / Pankratov YV, Ivanov AI, Kolokoltsova TD, Nechayeva YA, Radayeva IF, Korochkin LI, Revischin AV, Naumov SA, Khlusovi IA, Autenshlus AI. // Adv Exp Med Biol. - 2003. - № 534. Р. 97-105.
34. Структурно-функциональный анализ гена рибосомного белка L11 человека /Воронина Е.Н., Колокольцова Т.Д., Нечаева Е.А.,. Филипенко М.Л // Мол. Биол. - 2003. - т. 37. - № 3. - С. 425-435.
35. Вдовиченко Г.В., Колокольцова Т.Д., Фатюхина О.Е. Выбор субстрата для культивирования клеток сердца и эндотелия сосудов // Успехи современного естествознания. - 2004.- № 6. -т. 1. -С. 133-134.
36. Создание банка ядросодержащих клеток из пуповинной крови /Ким И.И., Хлусов И.А., Костина Г.А., Колокольцова Т.Д., Иванов А.И., Болгова О.П. // Успехи современного естествознания. - 2004.- № 6.- т. 1.- С. 135-136.
37. Проблемы аттестации культур клеток, пригодных для заместительной терапии / Колокольцова Т.Д., Костина Г.А., Нечаева Е.А., Радаева И.Ф, Шалунова Н.В. // Успехи современного естествознания. - 2004. - т.1.- № 6.- C. 127-128.
38. Зайдман А.М., Сахаров А.В., Колокольцова Т.Д. Культура хондробластов как потенциальный источник для тканевой инженерии при повреждениях и заболеваниях позвоночника // Хирургия позвоночника.-2004. - № 4. - C.115-121.
39. Опыт применения культивированных аллофибробластов при лечении ран различной этиологии /Колосов Н.Г., Ефремов А.В., Колокольцова Т.Д., Евланова Е.А., Шалунова Н.В. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2005. - № 3.- С. 57-59.
40. Культура хондробластов человека - как возможный донорский материал для коррекции нарушений хрящевой ткани / Зайдман А.М., Сахаров А. В., Корель А.В., Ким И., Колокольцова Т. Д. // Вестник трансплантологии и искусственных органов.- 2005. -№ 3.-С. 59-61.
41. Создание и аттестация банков перевиваемой культуры клеток MDCK для производства гриппозной вакцины / Радаева И.Ф., Колокольцова Т.Д., Нечаева Е.А., Мазуркова Н.А., Ильина Т.В., Гетманова Т.Н., Балтуева Л.С., Графодатский А.С., Гендон Ю. З., Петручук Е.М. // Вопросы вирусологии. -2005.- № 2.- С.  43-46.
42. Аттестация перевиваемой культуры клеток 293, используемой для культивирования антиракового лечебного препарата Канцеролизин / Радаева И.Ф, Вдовиченко Г.В., Сергеев А.А., Колокольцова Т.Д., Нечаева Е.А, Сергеев А.Н., Терновой В.А., Нетесов С.В. // Антибиотики и химиотерапия. - 2005. - т. 50. - № 5-6. - С. 7-10.
43. Колокольцова Т.Д., Шалунова Н.В., Петручук Е.М. К вопросу о контроле безопасности культур клеток, пригодных для заместительной терапии // Биопрепараты. - 2006. - № 2. - С. 8-12.
44. Создание банков перевиваемой культуры клеток 293 для производства антиракового лечебного препарата Канцеролизин / Вдовиченко Г.В., Радаева И.Ф., Сергеев А.А., Колокольцова Т.Д., Нечаева Е.А., и др. // Биотехнология. - 2006. - № 1. - С. 62-65.
45. Влияние имплантации клеток печени эмбриона человека на течение экспериментального токсического гепатита / Хлусов И.А., Наумов С.А., Нечаева Е,А., Колокольцова Т.Д., Хлусова М.Ю., Никифоров С.Б., Антипов С.А., Некрасова А.М. // Биопрепараты. - 2006. - № 2. - С. 17-21.
46. Евланова Е.А., Колокольцова Т.Д., Еремеев А.В. Выбор подложек, пригодных для культивирования и переноса клеток на раны различной этиологии // Биопрепараты. - 2006. - № 2. - С.  33-36.
47. Штамм диплоидных клеток человека для заместительной терапии (его варианты) / Колокольцова Т.Д., Нечаева Е.А., Костина Г.А,.и др. // Патент РФ № 2004126518 А61 К35/54. - Опубл. 2006.
48. Композиция на основе клеточных культур для лечения дефектов костной ткани при повреждениях воспалительной этиологии / Колокольцова Т.Д., Болгова О.П., Радаева И.Ф., и др. // Патент РФ № 2004126519 С12N5/00. - Опубл. 2006.
49. Получение аттестованных фибробластов человека, пригодных для научных и медицинских исследований // Колокольцова Т.Д., Юрченко Н.Д., Нечаева Е.А., Радаева И.Ф, Шалунова Н.В., Петручук Е.М., Бердникова З.Е., Колосов Н.Г. // Биотехнология. - 2007.- № 1. - С. 58-64.
50. Изучение морфофункциональных особенностей хондробластов, полученных из пластинки роста тел позвонков человека, при культивировании  in vitro //Сахаров А, Ким И.И., Колокольцова Т.Д., Рябчикова Е.И. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2007.-№3. - С. 154-158.
51. Оценка безопасности метода лазерно-индуцированной флюоресценции на модели культуры клеток диплоидных клеток человека // Фатюхина О., Колокольцова Т.Д., Трошкова Г.П. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2007.-№4. - С. 203 Ц206.

Список сокращений

FBS- сыворотка крови плодов коровы

ВОЗ- Всемирная Организация Здравоохранения

ВЯП - вирус ядерного полиэдроза

ФСП- фармакопейная статья предприятия

Г6ФДГ Цглюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ГАТ - гипоксантин, тимидин, аминоптерин

ИЦДГ- изоцитратдегидрогеназа

ИФА - иммуноферментный  анализ

ДГ- лактатдегидрогеназа

МДГ- малатдегидрогеназа

МИБП - медицинские иммунобиологические препараты

МТХ-метатрексат

ПБК- посевной банк клеток

ПЦР - метод полимеразно-цепной реакции

РБК-рабочий банк клеток

рчЭПО- рекомбинантный эритропоэтин человека

СКРС- сыворотка крови крупного рогатого скота

ЦПД- цитопатогенное действие

ЭПО - эритропоэтин

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии