Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
Богачук Мария Николаевна
Совместное определение водорастворимых витаминов в витаминных комплексах методом капиллярного электрофореза
14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Москва - 2012
Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России
Научный руководитель:
Передеряев Олег Игоревич - кандидат фармацевтических наук
Официальные оппоненты:
Титова Анна Васильевна - доктор фармацевтических наук, начальник отдела организации контроля качества лекарственных средств ФГБУ Информационно-методический центр по экспертизе, учету и анализу обращения средств медицинского применения Росздравнадзора
Чистяков Виктор Владимирович - доктор фармацевтических наук, профессор кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России
Ведущая организация:
ФГБУ Научный центр экспертизы средств медицинского применения Минздравсоцразвития России
Защита состоится л17 октября 2012 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова, по адресу: 119991, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М.Сеченова по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.
Автореферат разослан л___ _____________2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета Д.208.040.09, | ||
доктор фармацевтических наук, профессор | Наталья Петровна Садчикова | |
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Витамины являются одними из важнейших биологически активных веществ. Физиологическая роль витаминов разнообразна. Большинство витаминов в результате биотрансформаций в организме человека переходят в форму коферментов - составных частей ферментов, участвующих в различных биохимических реакциях организма человека.
Повышенная психическая и физическая нагрузка, резкая смена климатических условий, интенсивный рост, беременность, нерациональное питание и др., а также различные патологические состояния приводят к повышенной физиологической потребности в витаминах, вследствие чего возникают состояния полигиповитаминозов, которые усугубляются дефицитом некоторых аминокислот и ионов металлов. Это обусловило создание комплексных поливитаминных препаратов с макро- и микроэлементами, а также аминокислотами, которые используются как в профилактических, так и в лечебных целях. В настоящее время обширный список поливитаминных препаратов дополняют биологически активные добавки (БАД) к пище - источники ввитаминов [Спиричев В.Б. и др., 2004 г.; В.И.Покровский, 2004 г.].
С каждым годом номенклатура поливитаминных препаратов (ПВП) увеличивается, что делает актуальным вопрос их стандартизации.
Для идентификации и количественного определения витаминов в ПВП и БАД к пище в нашей стране используются различные методы. Так наибольшее распространение получили титриметрические, спектрофотометрические, полярографические, флуориметрические, фотоэлектроколориметрические методы (BP 2009, EP 6.0, JP 15, USP 30).
Подходы к определению водорастворимых витаминов в Государственной Фармакопее (ГФ) РФ, Британской Фармакопее (BP), Европейской Фармакопее (EP), Японской фармакопее (JP) и Фармакопее США (USP) основаны на методах, направленных на исследование отдельных витаминов или их групп. Методики, позволяющие одновременно проанализировать несколько водорастворимых витаминов, встречаются преимущественно в USP (с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)) [United States Pharmacopeia 30, 2007г.], в то время как именно такой подход является наиболее рациональным и позволяет уменьшить затраты времени и средств.
С этой целью наиболее часто помимо метода ВЭЖХ применяют метод капиллярного электрофореза (КЭ). Метод КЭ основан на принципе разной скорости миграции заряженных частиц и молекул в постоянном электрическом поле и имеет ряд преимуществ по сравнению с ВЭЖХ: высокая эффективность разделения, экономичность и малый расход реактивов [Бёккер Ю., 2009г.].
Метод капиллярного электрофореза как фармакопейный метод анализа описан в BP 2009, EP 6.0, JP 15, USP 30. Общая фармакопейная статья (ОФС) Капиллярный электрофорез представлена для включения во 2-ой том ГФ XII.
КЭ используется в ФС на глутатион (анализ его чистоты), в анализе аминокислотного состава, в исследовании энантиомеров ропивакаина, идентификации соматропина, также широко КЭ применяется для составления трипсин-пептидных карт [British Pharmacopoeia, 2009 г.; European Pharmacopoeia 6.0, 2007 г.; The Japanese Pharmacopoeia 15, 2007 г.; United States Pharmacopeial 30, 2007 г.].
Цель исследования
Разработать методику совместного качественного и количественного определения водорастворимых витаминов методом капиллярного электрофореза в витаминных препаратах и БАД к пище.
Задачи исследования:
- изучить свойства и номенклатуру витаминных препаратов и БАД к пище, представленных на рынке РФ;
- изучить существующие методы анализа водорастворимых витаминов;
- подобрать условия электрофоретического разделения и количественного определения водорастворимых витаминов;
- оптимизировать условия выделения водорастворимых витаминов из анализируемых объектов;
- провести валидацию разработанной методики;
- апробировать разработанную методику на витаминных препаратах и БАД к пище;
- разработать проект фармакопейной статьи Совместное определение водорастворимых витаминов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии.
Научная новизна. Впервые разработана методика совместного определения водорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах и БАД к пище методом капиллярного электрофореза.
Практическая значимость. Методика совместного определения водорастворимых витаминов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) была использована для анализа состава витаминных комплексов, являющихся источниками водорастворимых витаминов, и витаминных и витаминно-минеральных премиксов, используемых в фармацевтической и пищевой промышленности. Разработанная методика успешно используется при гигиенической экспертизе образцов сырья и БАД к пище, а также витаминных премиксов в ФГБУ НИИ питания РАМН. Методика определения водорастворимых витаминов МЭКХ представлена в виде проекта фармакопейной статьи.
Апробация работы. Результаты исследований доложены на V Конференции молодых ученых России с международным участием: Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины (г. Москва, 2008 г.), на XI, XII и XIIIаВсероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов Питание и здоровье (г. Москва, ноябрь-декабрь 2009 г., ноябрь-декабрь 2010 г., декабрь 2011 г.), на Всероссийской научно-методической конференции с международным участием Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ (г. Воронеж, апрель 2010 г.), на XVIII Российском Национальном Конгрессе ЧЕЛОВЕК И ЛЕКАРСТВО (г. Москва, апрель 2011 г.), на научно-практической конференции Аспирантские и докторские чтения: дерзания нового времени - поиск инноваций (г. Москва, февраль 2012 г.).
Апробация работы проведена на межлабораторной конференции кафедры фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета ФГБУ ВПО Первый МГМУ им.аИ.аМ.аСеченова (11 апреля 2012аг.).
ичный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в разработке методики, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, применялась методика, разработанная автором, проводилась аналитическая и статистическая обработка результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально - теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях, докладах и внедрения в практику. Установлены научно обоснованные подходы к этапам исследования поливитаминных препаратов методом капиллярного электрофореза, разработан проект ФС.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта специальности фармацевтическая химия, фармакогнозия.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК России.
Связь темы исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической и токсикологической химии Первого МГМУ имени И.М. Сеченова Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований. Номер государственной регистрации: 01.2.006 06352.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Методика совместного качественного и количественного определения водорастворимых витаминов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии: тиамина хлорида, рибофлавина, никотиновой кислоты и никотинамида, пантотеновой кислоты, пиридоксина гидрохлорида, фолиевой кислоты, аскорбиновой кислоты, биотина в поливитаминных препаратах и БАД к пище - источника водорастворимых витаминов;
- Проект фармакопейной статьи Определение водорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах методом мицеллярной электрокинетической хроматографии.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 157 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследования и их обсуждения, выводов, библиографического указателя, включающего 129 источника, и 5 приложений. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 39 таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты исследования, приборы и реактивы
В ходе эксперимента были исследованы 17 витаминных препаратов, 6 витаминных премиксов (см. табл. 1), а также 29 БАД к пище (источников водорастворимых витаминов).
Таблица 1.
Данные о наименовании, витаминном составе, производителе и форме выпуска исследованных образцов.
№ п/п | Наименование, серия и дата изготовления образца | Состав витаминов | Производитель и форма выпуска |
Витаминные препараты | |||
Компливит, серия №010110, дата изготовления 01.01.2010 г. | А, Е, В1, В2, В6, С, РР, В9, В12, пантотенат кальция | ОАО Фармстандарт - УфаВИТА, РФ Форма выпуска - таблетки | |
Селмевит, серия №270509, дата изготовления 27.05.2009 г. | А, Е, В1, В2, В6, С, РР, В9, В12, пантотенат кальция | ОАО Фармстандарт - УфаВИТА, РФ Форма выпуска - таблетки | |
Витрум, серия № AD040, дата изготовления 01.2010 г. | А, Е, D3, K1, В1, В2, В6, С, РР, В12, пантотенат кальция, биотин | Юнифарм, США Форма выпуска - таблетки | |
Дуовит, серия № L56118, дата изготовления 19.01.2010 г. | D3, Е, В1, В2, В6, С, РР, В9, В12, пантотенат кальция | КРКА, Словения Форма выпуска - таблетки | |
Био-Макс, серия № 610310, дата изготовления 04.2010 г. | А, Е, В1, В2, В6, С, РР, В9, В12, пантотенат кальция | ОАО Валента Фармацевтика, РФ Форма выпуска - таблетки | |
Пиковит, серия № С50560, дата изготовления 02.2010 г. | А, D3, С, В1, В2, В6, С, РР, В12, пантотенат кальция | КРКА, Словения Форма выпуска - сироп | |
Комплигам, дата изготовления 02.05.2009 г. | В1, В6, В12 | ЗАО ФармФирма Сотекс Форма выпуска - раствор для инъекции | |
Комбилипен, серия № 1051009, дата изготовления 10.2009 г. | В1, В6, В12 | ОАО Фармстандарт - УфаВИТА, РФ Форма выпуска - раствор для инъекции | |
Мильгамма, серия № 1001144, дата изготовления 20.01.2010 г. | В1, В6, В12 | Верваг Фарма ГмбХ и Ко.КГ, Германия Форма выпуска - раствор для инъекции | |
Берокка плюс, серия № L5K699, дата изготовления 12.2009 г. | В1, В2, В6, С, РР, В9, В12, пантотенат кальция, биотин | Байер Консьюмер Кэр АГ, Швейцария Форма выпуска - таблетки шипучие | |
Джунгли, серия № 083418, дата изготовления 08.2008 г. | А, Е, D3, В1, В2, В6, С, В9, РР, В12 | Сагмел, США Форма выпуска - таблетки | |
Фенюльс, серия № 9014354, дата изготовления 04.2010 г. | В1, В2, В6, С, РР, пантотенат кальция | Ранбакси лабораториз лимитед, Индия Форма выпуска - капсулы | |
Аэровит, серия №050210, дата изготовления 05.02.2010 г. | А, Е, В1, В2, В6, С, РР, В9, В12, пантотенат кальция | ОАО Фармстандарт - УфаВИТА, РФ Форма выпуска - таблетки | |
Гексавит, серия №120510, дата изготовления 12.05.2010 г. | А, В1, В2, В6, С, РР | ОАО Марбиофарм, Республика Марий Эл, РФ Форма выпуска - драже | |
Ангиовит, серия №080510, дата изготовления 08.05.2010 г. | В6, В9, В12 | ЗАО Алтайвитамины, РФ Форма выпуска - таблетки | |
Макровит, серия № L56021, дата изготовления 01.2010 г. | А, D3, Е, В1, В2, В6, С, В9, РР, В12 | КРКА, Словения Форма выпуска - таблетки | |
Велмен, серия № WE918T, дата изготовления 11.2009 г. | А, D3, В1, В2, В6, С, В9, РР, В12, пантотенат кальция, биотин | Витабиотикс Лтд., Великобритания Форма выпуска - капсулы | |
Витаминные премиксы | |||
Премикс витаминный 928/4, дата производства 10.2008 г. | В1, В2, В6, РР, В9, пантотеновая кислота | DSM Nutritional Products Europe Ltd., Франция Форма выпуска - порошок | |
Премикс витаминно-минеральный Ровифарин 4S, дата производства 01.2009 г. | В1, В2, В6, РР, В9 | DSM Nutritional Products Europe Ltd., Франция Форма выпуска - порошок | |
Премикс витаминно-минеральный NUTR RU11620, дата производства 04.2009 г. | А, D3, E, B1, B2, В6, РР, В9, пантотеновая кислота, C | DSM Nutritional Products Europe Ltd., Франция Форма выпуска - порошок | |
Сухой премикс для производства продуктов детского питания - Комплекс инулина с витаминами Fl-1, дата производства 03.2009 г. | А, Е, С, РР, В1, В6, В9 | Adams Food Ingredients Limited, Великобритания Форма выпуска - порошок | |
Премикс MB FOLLOW ON CODEX F N, дата производства 12.2009 г. | Е, В1, В6, В12, РР, пантотеновая кислота, С, В2, В9, биотин | Nutricia Cuijk B.V., Нидерланды Форма выпуска - порошок | |
Витаминный премикс Valentina, дата производства 02.2010 г. | А; D3; Е; В1; В2, В6; РР; В9; В12; С | DSM Nutritional Products Europe Ltd., Франция Форма выпуска - порошок | |
Исследованные образцы БАД к пище: Крохайодин (серия № К-144, дата изготовления 01.2010 г.), Таблетки Мультивитаминный комплекс АВС Плюсо (№420286-01, 06.2010 г.), КИЛО ОФФ (№826КАА, 04.2010 г.), Тяньши с кальцием и витаминами (№11-86, 08.2010 г.), НАТУРЕТТО мультивитамины (№011581, 15.04.2010 г.), Кардио Саппорт (№001020, 15.04.2010 г.), Нутрилайт Дабл Икс с витаминами, минералами и фитонутриентами (№ NL-000123, 05.2010 г.), ДУОВИТо Элеганс (№D00218, 09.2010 г.), Формула здоровья Вазотензин Плюс (№0406, 05.2009 г.), Формула здоровья Формула для женщин (№0315, 03.2009 г.), Энергетик Нутрилайт 1 (№N00310, 03.2008 г.), Экопам энерджи (№Е-00145, 04.2008 г.), Фитослим Актив (№0045, 02.2008 г.), Мульти-табсо Энергия здоровья с Омега-3 (№О3-265, 12.2008 г.), Формула здоровья Супер Стресс Формула (№V0255, 02.2008 г.), Формула здоровья Антилит (№V0344, 04.2008 г.), Формула здоровья МультиВита (№0278, 06.2009 г.), Гесталис (№G-0481, 01.2009 г.), Сидерал Бимби (№S-0505, 02.2009 г.), Виталарикс-Кардио (№150109, 01.2009 г.), Рекицен-РД с экстрактом боярышника (№0109, 01.2009 г.), ДУОВИТо Сила со вкусом кофе (№D00420, 09.2009 г.), ДУОВИТо Сила со вкусом Экзотик (№D00381, 09.2009 г.), БИОНо 3 Активэйт (№В0503, 11.2008 г.), Фемисс Маг В6 (№0103, 01.2009 г.), МультиМишки (№MB-0356, 03.2009 г.), Супер Сжигатель Жира (№S0402, 03.2009 г.), Доппельгерцо актив. Витамины для больных диабетом (№D0345, 04.2009 г.), Нутрилайт. Жевательные таблетки с мультивитаминами (№ M0504, 12.2008 г.).
Стандартные образцы
При разработке методики и проведении аналитических исследований по содержанию водорастворимых витаминов в качестве стандартных образцов нами были использованы коммерчески доступные индивидуальные вещества фирмы Fluka Chemie GmbH (аскорбиновая кислота 99% Cat.№ 95210, никотиновая кислота 99,5% САТ № 72309, никотинамид 99,5% САТ № 72340, пиридоксина гидрохлорид 99% САТ № 95180, рибофлавин 98% САТ № 95170, фолиевая кислота 97% САТ № 47620, тиамина хлорид 99% САТ № 95160, кальциевая соль D-пантотеновой кислоты 99% САТ № 21210, (+)-Биотин 99% САТ № 14400).
Электрофоретическая система
Система капиллярного электрофореза Agilent 3D-CE (США) с диодноматричным детектором и кварцевым капилляром Agilent Lэфф/Lобщ=56/64 см, ID=50 мкм, оснащенная компьютером с установленной программой л3D-CE Chemstation Rev. B.04.03 (16). Диапазон напряжений: от 0 до + 30 кВ, величина тока: от 0 до 300 мкА, величина мощности: от 0 до 6 Вт, гидродинамическое и электрокинетическое введение образца, внутренний диаметр капилляров: 50, 75 и 100 мкм, детектор типа фотодиодная матрица (режим сканирования в диапазоне от 190 до 600 нм), продолжительность периода сканирования: 0,1 сек, термостатирование капилляра на 25С.
Вспомогательное оборудование: весы аналитические AND GH-120, рН-метр Sartorius PB-11, УЗ - ванна CT BRAND CT-400 D, дистиллятор ДЭ-10, баня водяная лабораторная с электрическим подогревом, аппарат для получения деионизированной воды MilliQ, центрифуга Eppendorf 5418 (Германия) с относительной силой центрифугирования (RCF) не менее 4000, шейкер Biosan OS-10 (Biosan, Латвия); шприцевой фильтр с диаметром пор 0,45амкм.
Реактивы: вода, очищенная на системе Milli-Q, очищенная вода ГОСТа6709, натрий тетраборнокислый 10-водный марки ч.д.а., натрия додецилсульфат 98,5 % (фирмы Sigma), калия гидроксид марки х.ч., натрия гидроокись ч.д.а., метанол для жидкостной хроматографии по ГФ XII, ацетонитрил для жидкостной хроматографии по ГФ XII, спирт этиловый 96% по ГФ XII, универсальная индикаторная бумага рН 0-12 (ЛАХЕМА, Чехия).
Оптимизация условий анализа на коротком конце капилляра
При подборе условий электрофоретического разделения водорастворимых витаминов с помощью метода капиллярного зонального электрофореза (КЗЭ) был подобран оптимальный состав буферного раствора, а именно: 50 мМ боратный буфер, рН=9,3. Для сокращения времени анализа и повышения селективности на основе данных, полученных в исследованиях методом КЗЭ, были подобраны условия электрофоретического разделения водорастворимых витаминов методом МЭКХ на коротком конце капилляра (эффективная длина 8 см). Для перехода к методике МЭКХ необходимо было подобрать мицеллообразователь и его концентрацию в буферном растворе.
На основе литературных данных, в качестве мицеллообразователя был выбран натрия додецилсульфат. В ходе работы было изучено влияние различных концентраций мицеллообразующего агента на разделяющую способность боратного буфера. Натрия додецилсульфат относится к анионным поверхностно-активным веществам и мигрирует при нормальных условиях электрофоретического разделения по направлению к аноду (т.е. в направлении, противоположном направлению электроосмотического потока). В случае выполнения анализа на коротком конце капилляра (эффективная длина 8 см) необходимым условием является изменение полярности высокого напряжения на концах капилляра (катод меняется с анодом местами). Поскольку электроосмотический поток обычно быстрее скорости миграции мицелл при нейтральных или щелочных значениях рН, вектор итогового движения совпадает с направлением этого потока. Во время миграции, мицеллы могут взаимодействовать с растворенными веществами так, как это обычно происходит в хроматографии (благодаря гидрофобным и электростатическим взаимодействиям).
Концентрацию мицеллообразователя подбирали таким образом, чтобы достигнуть концентрацию выше 8-9 мМ (критическая концентрация мицеллообразования для натрия додецилсульфата). Для определения оптимальных условий были использованы следующие концентрации: 10 мМ, 20 мМ, 50 мМ, 75 мМ, 100 мМ и 150 мМ (рис. 1 и 2). Лучший результат был достигнут при добавлении 75 мМ натрия додецилсульфата.
Рис. 1. Сравнение разделяющей способности боратного буферного раствора с добавками 10, 20 и 50 натрия додецилсульфата.
Рис. 2. Сравнение разделяющей способности боратного буферного раствора с добавками 75, 100 и 150 натрия додецилсульфата.
В итоге были подобраны оптимальные условия разделения (см. табл. 2 и рис. 3) и количественного определения водорастворимых витаминов методом МЭКХ. В подобранных условиях удалось быстро (в течение 5 мин.) провести определение содержания водорастворимых витаминов в исследуемых образцах.
Таблица 2.
Условия разделения водорастворимых витаминов методом МЭКХ.
Характеристика методики | Условия анализа |
Ввод пробы | 50 мбар, 10 с |
Длина волны | 210, 254, 270, 291, 450 нм |
Напряжение (отрицательное) | 0 мин. - 0 кВ; 1 мин. - -30 кВ |
Температура термостата | 25 С |
Время анализа | 5 мин. |
Рабочий буферный раствор | 50 мМ боратный буфер рН=9,3, 75 мМ натрия додецилсульфат |
Рис. 3. Пример разделения определяемых витаминов.
Условия детектирования
Поскольку определяемые витамины имеют различное поглощение электромагнитного излучения, детектирование проводили на определенных длинах волн для каждого витамина или группы витаминов. Для выбора аналитических волн детектирования были изучены спектры имеющихся стандартных веществ в УФ- и видимой области. В качестве аналитических волн детектирования при анализе сложной матрицы предпочтительно использование полос поглощения с большей длиной волны, как более специфичных, при этом учитывалось значение коэффициента молярной экстинкции.
В таблице 3 представлены специфические длины волн для определяемых витаминов.
Таблица 3.
Характерные длины волн для определяемых витаминов.
Определяемые витамины | Характерные длины волн, нм |
Аскорбиновая кислота | 254, 270 |
Фолиевая кислота | 254, 291 |
Рибофлавин | 254, 450 |
Никотиновая кислота | 254, 270 |
Никотинамид | 254, 270 |
Тиамина хлорид | 254 |
Пиридоксина гидрохлорид | 291 |
Кальциевая соль D-пантотеновой кислоты | 210 |
Пантотеновая кислота (пересчет) | 210 |
Биотин | 210 |
Пробоподготовка
В процессе работы был проведен подбор условий экстракции (состав и рН экстрагента, время, температура) водорастворимых витаминов из витаминных препаратов, БАД к пище и витаминных премиксов.
Основным экстрагентом для исследуемой группы веществ является вода очищенная. Однако для растворения некоторых изучаемых витаминов требуется создание дополнительных условий. Так, в случае фолиевой кислоты и биотина было найдено значение рН, при котором наблюдалось наиболее оптимальное растворение субстанции. Были изучены следующие диапазоны значений рН, начиная с рН=7,0 и заканчивая рН=11,5 с шагом в 0,5. Контроль полноты экстракции осуществляли по методике МЭКХ (см. рис. 4).
Было выявлено, что наиболее оптимальный диапазон рН для экстракции обоих витаминов 9,5-12,0 (значение рН устанавливали добавлением 0,1 М раствора натрия гидроксида).
Согласно литературным данным, рибофлавин трудно растворим в воде при комнатной температуре и мало растворим в кипящей воде. Для его экстракции из объектов исследования навеску образца помещали в мерную колбу и проводили экстракцию водой очищенной с нагреванием образца на водяной бане в течение 10-15 минут.
Рис. 4. Влияние рН водного раствора на полноту экстракции фолиевой кислоты (В9) и биотина (Н)
Подготовка таблетированных и порошкообразных форм образцов: около 0,05-0,2 г (точная навеска) тщательно измельченного образца помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, экстрагировали 30 мл воды очищенной (подщелоченной в случае фолиевой кислоты и биотина до рН=9,5-12,0 по универсальной индикаторной бумаге), интенсивно встряхивали на шейкере в течение 10 мин., озвучивали на УЗ-ванне в течение 5 мин. Для наилучшей экстракции рибофлавина пробу нагревали на водяной бане в течение 10-15 мин.
Подготовка жидких форм образцов (сиропы, растворы для инъекций, капли, напитки): около 1 г (точная навеска) или 1 мл (точный объем) образца помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, экстрагировали 30 мл воды очищенной (подщелоченной в случае фолиевой кислоты до рН=9,5-12,0 по лакмусу), интенсивно встряхивали на шейкере в течение 10 мин.
После этого в обоих указанных случаях объем раствора образца доводили до метки водой очищенной и перемешивали. Полученный раствор фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм или центрифугировали при 20000 g в течение 10 мин.
В случае, когда образец содержал фолиевую кислоту, рибофлавин и остальные водорастворимые витамины, готовили 3 пробы каждого образца (только в случае таблетированных и порошкообразных форм): отдельно с подщелачиванием для экстракции фолиевой кислоты и биотина, отдельно с нагреванием на водяной бане для экстракции рибофлавина и отдельно для экстракции остальных водорастворимых витаминов. Приготовленные пробы анализировали в течение суток.
В таблице 4 представлены параметры разделения анализируемых витаминов в условиях МЭКХ.
Таблица 4
Параметры разделения водорастворимых витаминов в условиях МЭКХ, ввод пробы гидродинамический (50 мбар, 10 с), мертвый объем t0=1,2, длина волны 210 нм
Водорастворимые витамины | tR, мин. | k` | N | Asym | Rs | |
Никотинамид | 1,30 | 0,08 | 27500 | 0,77 | 1,23 1,08 1,04 1,21 1,03 1,16 1,07 1,14 5 | 3,09 0,77 0,42 3,33 0,58 2,25 0,82 1,51 5 |
Биотин | 1,60 | 0,23 | 30700 | 1,02 | ||
Пиридоксина гидрохлорид | 1,73 | 0,08 | 18550 | 0,75 | ||
Рибофлавин | 1,80 | 0,04 | 23000 | 1,35 | ||
Аскорбиновая кислота | 2,17 | 0,21 | 17150 | 1,12 | ||
Пантотеновая кислота | 2,24 | 0,03 | 13700 | 1,17 | ||
Никотиновая кислота | 2,60 | 0,16 | 17150 | 1,16 | ||
Тиамина хлорид | 2,80 | 0,08 | 2550 | 1,42 | ||
Фолиевая кислота | 3,20 | 0,14 | 6330 | 1,84 |
где: tR - время миграции вещества, kТ - коэффициент разделения, N - число теоретических тарелок, Asym - асимметрия, - селективность, Rs - разрешающая способность.
Как следует из таблицы, эффективность капилляра и буферного раствора составила от 2550 до 30700 т.т.; селективность для всех витаминов была более 1,0, а разрешение составило от 0,42 до 3,33.
Также была проведена оценка параметров разделения витаминов в условиях разработанной методики в сравнении с методикой ВЭЖХ [Передеряев О.И., 2006 г.]. Для этого был использован раствор стандартных веществ водорастворимых витаминов следующего состава: тиамин хлорид, никотинамид, никотиновая кислота, пиридоксина гидрохлорид и пантотеновая кислота. На рис. 5 приведен пример разделения витаминов ВЭЖХ-методикой.
Рис. 5. Разделение водорастворимых витаминов в условиях ВЭЖХ.
В таблице 5 приведены параметры разделения смеси водорастворимых витаминов в условиях МЭКХ и ВЭЖХ (жидкостной хроматограф Agilent 1100 Series с фотодиодноматричным детектором; колонка: Atlantis C18, 4,6*250 мм, 5мкм; скорость потока Ц0,9 мл/мин. Общее время анализа составляет 32 минуты; подфижная фаза - градиентное элюирование смесью ацетонитрила (А) и фосфатного буфера (7,4 мМ дигидрофосфата калия + фосфорная кислота) рН=2,5 (Б): 0 мин. - 0% А, 5 мин. - 0% А, 22 мин. - 40% А, 23 мин. - 0% А, 30 мин. - 0% А.)
Таблица 5
Сравнение параметров разделения смеси водорастворимых витаминов в условиях МЭКХ и ВЭЖХ, длина волны 210 нм (МЭКХ/ВЭЖХ)
Витамины | tR, мин. | k` | Nх103 | Asym |
| Rs |
Никотинамид | 1,30/4,7 | 0,08/0,34 | 27,5/6,4 | 0,77/1,78 | 4,13/1,38 0,88/0,15 0,55/5,78 0,50/1,68 5 | 12,28/8,80 9,71/1,64 2,85/8,45 2,16/27,84 5 |
Пиридоксина гидрохлорид | 1,73/6,9 | 0,33/0,47 | 18,6/12,3 | 0,75/1,35 | ||
Пантотеновая кислота | 2,2/7,4 | 0,29/0,07 | 13,7/9,3 | 1,17/1,57 | ||
Никотиновая кислота | 2,6/10,4 | 0,16/0,40 | 17,2/12,8 | 1,16/1,77 | ||
Тиамина хлорид | 2,8/17,5 | 0,08/0,68 | 2,5/13,7 | 1,42/0,96 |
Как следует из таблицы 5, эффективность больше в условиях МЭКХ-методики, что объясняется различием принципа разделения двух этих методов. Разрешающая способность выше у ВЭЖХ-методики, но время анализа МЭКХ-методики в 3 раза меньше (20 минут для ВЭЖХ и 6 минут для МЭКХ).
Валидация разработанной методики
Валидация разработанной методики проводилась по параметрам, указанным в таблице 6.
Для оценки специфичности методики была составлены модельные смеси вспомогательных веществ, часто используемых при производстве твердых лекарственных форм (кукурузный крахмал, глюкоза, лактоза, лимонная кислота, краситель тартразин), и солей железа, марганца, меди, цинка, магния, кобальта, содержащихся в витаминно-минеральных комплексах (см. рис. 6). Для исключения влияния буферного раствора и экстрагента (воды очищенной) были получены их электрофреграммы в подобранных условиях методики.
Рис. 6. Электрофореграммы смеси витаминов и модельной смеси вспомогательных веществ с солями железа.
Оценку инейности разработанной методики проводили методом абсолютной калибровки с построением калибровочной кривой по 6-ти точкам. С помощью программы л3D-CE Chemstation Rev. B.04.03 (16) были построены калибровочные кривые, рассчитаны коэффициенты корреляции (линейности) и выведены уравнения линейности при прохождении кривой через 0. Коэффициент корреляции составил от 0,996 до 0,999. На рис. 7 представлены примеры калибровочных прямых, полученных для пиридоксина гидрохлорида и рибофлавина.
А | Б |
y= 459,34*x + 0, где | y= 498,68*x + 0, где |
y - площадь определяемого пика витамина; Х - концентрация витамина, найденная по калибровочной прямой | |
Рис. 7. Калибровочные прямые и уравнения для рибофлавина (А) и пиридоксина гидрохлорида (Б).
Оценка сходимости результатов и промежуточной прецизионности проводилась на 2 сериях из 6 концентраций определяемых витаминов. В случае промежуточной прецизионности другой сотрудник лаборатории в другой день провел измерение 6-ти концентраций. Также рассчитывались критерии Стьюдента и Фишера для 2-ух серий и сравнивались с табличными значениями. Расчетный коэффициент Фишера не превышает табличное значение и попадает в зону неопределенности, что говорит об однородности выборок, полученных в условиях МЭКХ-методики разными сотрудниками.
Коэффициент Стьюдента используется для проверки равенства средних значений в двух выборках. Расчитанный t-критерий должен быть меньше или равен табличному значению при доверительной вероятности Р=0,95. При сравнении двух выборок для МЭКХ-методики значение t-критерия не привысило табличное.
Для оценки правильности разработанной методики МЭКХ проводили по 9 измерений 3-х концентраций витаминов из диапазона применения. Полученные результаты сравнивали с ожидаемыми. Коэффициент вариации составил от 0,03 до 2,89 %, фактор отклика от 95 до 103 %.
При подборе условий электрофоретического разделения было показано, что методика робастна, если соблюдены следующие условия: кварцевый капилляр HPCE stndrd cap Lэфф/Lобщ=56/64 см (короткий конец 8,0 см), ID=50 мкм или аналогичный; 50 мМ боратный буфер рН=9,3, 75 мМ натрия додецилсульфат; гидродинамический ввод пробы 50 мбар в течение 10 с; температура термостата 25С; детектирование (диодная матрица) 210, 254, 270, 291 и 450 нм.
Поскольку была доказана линейность в диапазоне линейных концентраций, количественное определение проводили следующим образом:
Сх(%)= | СstахаSx аxVаха100 |
mаx Sst |
где:
Сх(%) - концентрация в образце, %;
Сst - концентрация стандартного образца, мг/мл;
Sx - площадь образца, полученная в результате исследований;
V - общий объём пробы, мл;
m - масса навески, мг;
Sst - площадь стандартного образца.
Таблица 6
Сравнение параметров валидации методики МЭКХ с требования ICH
№/№ | Параметр валидации | Критерий приемлемости | Рекомендованное значение (по ICH) | Полученное значение | Вывод |
1. | Специфичность | Хроматограммы плацебо-смесей | Отсутствие сигнала в области пика действующего вещества | В области пиков витаминов посторонние сигналы отсутствуют | Вспомогательные вещества, а также катионы металлов не влияют на параметры разделения водорастворимых витаминов либо их влияние не существенно |
2. | инейность | Коэффициент корреляции | 0,99 | От 0,996 до 0,999 | Соответствует требованиям ICH |
3. | Границы количественного определения (диапазон линейных концентраций) | Коэффициент вариации (не менее 6 заколов) | < 15% | От 0,08 до 5,22 % | Соответствует требованиям ICH |
4. | Сходимость | Серия 1: коэффициент вариации (не менее 6 заколов). Также были рассчитаны стандартное отклонение и доверительный интервал | 4% | Не более 3,33% | Соответствует требованиям ICH |
5. | Промежуточная прецизионность | Серия 2: коэффициент вариации (не менее 6 заколов) | 4% | Не более 3,13% | Соответствует требованиям ICH |
Максимальное отклонение среднего значения из обеих серий | < 10% | Не более 10% | Соответствует требованиям ICH | ||
F-критерий | Fрасчит. Fтабл. (Fтабл.= 6,39 при f=4 (n-1) и =0,05) | От 0,81 до 1,62 | Выборки однородны. | ||
t-критерий | tрасчит. tтабл. (tтабл.= 2,5705818 при n=5 и Р=0,95) | От 0,051 до 0,489 | Средние значения в двух выборках сопоставимы | ||
6. | Правильность | Фактор отклика | Среднее значение 95-105 % | От 95 до 103% | Соответствует требованиям ICH |
Коэффициент вариации | 4% | От 0,03 до 2,89 % | Соответствует требованиям ICH | ||
7. | Робастность | Изменение условий (значение рН буферного раствора, температуры термостатирования капилляра, другой капилляр и т.д.) | - | Подбор условий электрофоретического разделения | Методика робастна при соблюдении условий элетрофоретического разделения |
ВЫВОДЫ
- Изученные физико-химические свойства водорастворимых витаминов обосновывают необходимость их разделения на три группы (по способу пробоподготовки), в то время как методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза обеспечивают возможность их совместного определения в поливитаминных препаратах и БАД к пище в рамках одного исследования.
- На текущий момент используемые фармакопейные методики ориентированы на определение отдельных витаминов или их групп, что требует дополнительных затрат времени и расходных материалов.
- Для разрабатываемой методики определены оптимальные условия пробоподготовки для поливитаминных препаратов и БАД к пище. Изучено влияние условий экстракции на степень извлечения водорастворимых витаминов из матрицы витаминных препаратов и БАД к пище.
- Разработана методика совместного определения водорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах и БАД к пище методом мицеллярной электрокинетической хроматографии, а именно: аскорбиновой, никотиновой, пантотеновой и фолиевой кислот, никотинамида, пиридоксина гидрохлорида, тиамина хлорида, рибофлавина, биотина.
- Проведена валидация разработанной методики мицеллярной электрокинетической хроматографии по следующим параметрам: специфичность, линейность, диапазон линейных концентраций, сходимость, промежуточная прецизионность, правильность, робастность. Результаты оценки критериев приемлемости удовлетворяют требованиям ICH для методик ВЭЖХ.
- Разработанные методики были апробированы на 17 поливитаминных препаратах, 6 премиксах и 29 БАД к пище - источников витаминов и прошедших испытания в соответствующих аккредитованных лабораториях. Результаты соответствовали спецификациям производителей и приложенным сертификатам анализа, что дало возможность применения разработанной методики для анализа поливитаминных препаратов, БАД к пище и витаминных и витаминно-минеральных премиксах.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
- Малинкин А.Д., Богачук М.Н., Передеряев О.И. Определение водорастворимых витаминов методом капиллярного электрофореза// Сборник материалов XIаВсероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов Питание и здоровье, Москва, 30аноября-02адекабря 2009 г., С. 97.
- Богачук М.Н. Исследование содержания витаминного состава поливитаминных лекарственных средств методом капиллярного электрофореза на коротком конце капилляра// XVIII Российский национальный конгресс Человек и лекарство Москва, 11-15 апреля 2011 года, С.580-581.
- Богачук М.Н. Определение водорастворимых витаминов в поливитаминных комплексах методом капиллярного электрофореза// Всероссийская с международным участием научно-методическая конференция Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ г. Воронеж, 20-21 апреля 2010 г., стр. 64-66.
- Богачук М.Н., Медведев Ю.В. Определение никотинамида и никотиновой кислоты в пищевых продуктах и биологически активных добавках к пище методом капиллярного электрофореза// Сборник материалов XIIаВсероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов Питание и здоровье, Москва, 29аноября-01адекабря 2010 г., С. 15-16.
- Богачук М.Н., Передеряев О.И., Малинкин А.Д. Определение пиридоксина гидрохлорида в молоке и молокосодержащих продуктах детского питания методом капиллярного электрофореза// Сборник материалов XIIаВсероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов Питание и здоровье, Москва, 29аноября-01адекабря 2010 г., С. 16.
- Медведев Ю.В., Малашенко Е.А., Богачук М.Н. Определение гидроксикоричных кислот, кофеина и тригонеллина в зеленых и обжаренных зернах кофе методами ВЭЖХ и капиллярного электрофореза// Сборник материалов XIIаВсероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов Питание и здоровье, Москва, 29аноября-01адекабря 2010 г., С. 51-52.
- Бессонов В.В., Передеряев О.И., Богачук М.Н. Влияние свойств крахмалов на биодоступность ряда минорных биологически активных компонентов пищевых продуктов и сохранность их жирового компонента// Ж. Вопросы детской диетологии, 2011, № 1, С. 22-26.
- Богачук М.Н., Бессонов В.В., Передеряев О.И. Методика количественного определения водорастворимых витаминов в витаминных премиксах и пищевых продуктах с использованием мицеллярной электрокинетической хроматографии на коротком конце капилляра// Ж. Вопросы питания, 2011, № 3, С. 67-74.
- Богачук М.Н., Передеряев О.И., Раменская Г.В. Определение водорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах методом капиллярного зонального электрофореза// Ж. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2011, № 9, С. 14-22.
- Богачук М.Н., Малинкин А.Д., Байгарин Е.К. Высокоэффективная жидкостная хроматография как метод определения водорастворимых витаминов// Сборник материалов XIIIаВсероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов с международным участием Персонифицированная диетология: настоящее и будущее, Москва, 5-7адекабря 2011 г., С. 22-23.
- Богачук М.Н. Мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ) на коротком конце капилляра как метод определения водорастворимых витаминов// Сборник материалов научно-практическая конференция Аспирантские и докторские чтения: дерзания нового времени - поиск инноваций Москва, 8 февраля 2012 г., С. 33-34.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине