Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по сельскому хозяйству
На правах рукописи
Якушева Людмила Ивановна
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ СТАДА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО ЛОКУСУ
BOLA DRB 3 КАК ФАКТОР ОЗДОРОВЛЕНИЯ ОТ ЛЕЙКОЗА
06.02.07 - разведение, селекция и генетика
сельскохозяйственных животных
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Ставрополь - 2012
Работа выполнена в Государственном научном учреждении
Северо - Кавказский научно - исследовательский институт
животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук
(ГНУ СКНИИЖ Россельхозакадемии)
Научный руководитель: доктор биологических наук
Ковалюк Наталья Викторовна
Официальные оппоненты:
Чижова Людмила Николаевна - доктор сельскохозяйственных наук, профессор, ГНУ Ставропольский научно - исследовательский институт животноводства и кормопроизводства Россельхозакадемии, заведующая лабораторией иммунологии, биохимии и общей химии
Мачкаева Наталья Тухтаровна - кандидат биологических наук, ФГБОУ ВПО Калмыцкий государственный университет, старший преподаватель кафедры общей биологии и физиологии
Ведущая организация:
ФГБОУ ВПО Кубанский государственный аграрный университет
Защита диссертации состоится л7 декабря 2012 года в л1300 часов на заседании диссертационного совета Д 006.078.01 при Ставропольском научно - исследовательском институте животноводства и кормопроизводства по адресу: Россия, 355017, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический, 15,
тел./ факс (8652) 71-70-33
E-mail: dissovetsniizhk@yandex.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Ставропольского научно - исследовательского института животноводства и кормопроизводства
Автореферат разослан л 7 ноября 2012 года
Ученый секретарь
диссертационного совета Кононова Лидия Валентиновна
- ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1.
Актуальность темы. Проблема лейкоза крупного рогатого скота является приоритетной для молочного скотоводства России (Гулюкин М.И., Симонян Г.А., Шишкин А.В., 2004). Существует как минимум два альтернативных подхода для повышения эффективности традиционных противолейкозных мероприятий: разработка методов эффективной ранней диагностики (Макаров В.В., Гринишин Д.П., 2005) и использование в селекционной практике признака устойчивости к персистентному лимфоцитозу (Сулимова Г.Е., Удина И.Г., Шайхаев Г.О., Захаров И.А., 1995).
Известно, что разные аллели гена BoLA DRB 3 играют не одинаковую роль в формировании устойчивости животных к персистентному лимфоцитозу, вызываемому вирусом лейкоза крупного рогатого скота (Levin H.A., Wu M.C., Steward J.A., 1988; Van Eijk M. J.T., Stewart - Haynes J.A., Beever J.E., 1992; Xu А., Van Eijk М. J.T., Park Ch., 1993; Mirsky M.L., Lewin H.A., 1998; Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Марков А., Пищулина В., 2010). Доказано, что животные, несущие аллели *11, *23, *28 - устойчивые (У), не склонны к переходу лейкоза в стадию персистентного лимфоцитоза, а животные, несущие в своем генотипе аллели *8, *16, *22, *24 - чувствительные (Ч), напротив, чаще других оказываются в выборке больных. Нейтральные (Н) аллели не ассоциируются ни с устойчивостью, ни с чувствительностью к персистентному лимфоцитозу.
Внедрение новых подходов в практику требует проведения широкого спектра исследований, направленных на оценку их прикладной значимости.
1.2. Цель исследований. Целью настоящей работы явилось изучение роли и результативности применения молекулярно - биологических методов в селекционной работе, для повышения резистентности крупного рогатого скота, и в ранней диагностике лейкоза.
Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:
- проанализировать генетическую структуру стада айрширского скота по локусу BoLA DRB 3 и определить частоту встречаемости аллелей, ассоциированных с устойчивостью к развитию лейкоза;
- путём соответствующего подбора быков - производителей, создать BoLA DRB 3 генетическую структуру стада крупного рогатого скота айрширской породы с усиленной генетической составляющей устойчивости к персистентному лимфоцитозу;
- разработать схему эффективной ранней диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) на основе использования ДНК - анализа;
- определить экономическую эффективность использования молекулярно - биологических методов.
1.3. Научная новизна работы состоит в том, что создана новая BoLA DRB 3 генетическая структура стада крупного рогатого скота айрширской породы с повышенной частотой встречаемости аллелей, ассоциированных с устойчивостью к развитию лейкоза.
Pазработана и апробирована диагностическая схема с использованием ДНК - анализа, эффективно позволяющая оздоравливать хозяйство от лейкоза крупного рогатого скота.
1.4. Практическая значимость исследований. На основании генотипирования по гену BoLA DRB 3 разработан способ подбора быков - производителей, направленный на повышение в стаде доли животных, с высоким уровнем устойчивости к персистентному лимфоцитозу. С использованием диагностической схемы, разработанной в ходе выполнения диссертационной работы, показана результативность выявления в раннем возрасте телят - носителей ВЛКРС.
1.5. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ СКНИИЖ Россельхозакадемии в 2011-2012 г., региональной научно - практической конференции Инновационные разработки молодых учёных Юга России (Ставрополь, 2012), на 5 международной научно - практической конференции Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных (Краснодар, 2012)
1.6. Связь темы с планом научных исследований. Настоящая работа проводилась в соответствии с государственным тематическим планом НИР Северо - Кавказского НИИ животноводства Россельхозакадемии по теме 01.2.006 07557 Разработать программу использования генетических маркеров в селекции сельскохозяйственных животных.
1.7. Основные положения, выносимые на защиту:
-создание новой BoLA DRB 3 генетической структуры стада крупного рогатого скота айрширской породы с повышенной устойчивостью к персистентному лимфоцитозу;
-схема оздоровления стада от лейкоза, основанная на использовании технологии ДНК - анализа.
1.8. Публикации результатов исследований. Автором опубликовано 4 печатных работы, в том числе 2 публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ: Якушева, Л.И. Изменение генетической структуры стада крупного рогатого скота как первый этап оздоровления от лейкоза /Л.И. Якушева, Н.В. Ковалюк // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2012. -№ 3. (36). - С. 260-263.
Якушева, Л.И. Совершенствование генетической структуры стада крупного рогатого скота айрширской породы с использованием маркера BоLA DRB 3 / Л.И. Якушева, В.Ф. Сацук, Н.В. Ковалюк, Е.В. Мачульская, Т.П. Горбунова // Проблемы биологии продуктивных животных.- 2012. -№ 3. - С.69-75.
1.9. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав: материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение результатов; выводов, предложений производству, списка литературы, включающего 181 источник, в том числе 99 - зарубежных авторов.
Диссертация изложена на 108 страницах компьютерного текста, включает 25 таблиц и 9 рисунков.
- МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования проводились на базе лаборатории биотехнологии Северо - Кавказского научно исследовательского института животноводства Россельхозакадемии в период с 2010 -2012 гг.
Объектом исследования были коровы и быки айрширской породы и их потомство. Материалом для исследований служила кровь животных ОАО Племзавод Дружба Калининского района, n = 841 и сперма быков-производителей, предоставленных ООО НПСХП Астер г. Краснодар, n = 23. Общий объём выборки составил 864 животных. Исследования проводили по схеме:
Рисунок 1. Схема исследований
Забор крови проводился с использованием одноразовых инструментов - вакуумных шприцов S - Monovette. Образцы семени быков поступали на анализ в пайеттах.
Для выделения ДНК из крови и семени, постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР), анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ПДРФ), электрофореза использовались стандартные методики (Van Eijk M. J. T., Stewart - Haynes J.A., Lewin H.A., 1992; Xu A., Van Eijk V. J. T., Park Ch.,1993; Херрингтон С., и др., 1999).
На рисунках 2-5 представлены электрофореграммы продуктов рестрикции амплификата участка гена BoLА DRB 3 размером 284 пары нуклеотидов (пн) эндонуклеазами HaeIII, BstX2I, Bst2UI и Rsa I, позволяющие определить BoLА DRB 3 генотип животного.
| Рис. 2. Электрофореграмма продуктов рестрикции амплификата участка гена BoLА DRB 3 эндонуклеазой Hae III. | Рис. 3. Электрофореграмма продуктов рестрикции амплификата участка гена BoLА DRB 3 эндонуклеазой BstX2I. |
Рис. 4. Электрофореграмма продуктов рестрикции амплификата участка гена BoLА DRB 3 эндонуклеазой Bst2UI. | Рис. 5. Электрофореграмма продуктов рестрикции амплификата участка гена BoLА DRB 3 эндонуклеазой Rsa I. |
На рисунке 6 представлена электрофореграмма продуктов амплификации участка гена gag провируса лейкоза крупного рогатого скота величиной 347 пар нуклеотидов.
Рис. 6. Выявление провирусной ДНК лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР.
№13 и №15 - носители провируса лейкоза крупного рогатого скота
-К 17 - отрицательный контроль
+К 18 - положительный контроль амплификации
Статистическая обработка результатов производилась по стандартным методикам Т.Ф. Лакина (1980) и с использованием программных возможностей Microsoft Exel.
- РЕЗУЛЬТАТЫ Собственных ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1.Изучение генетической структуры стада по локусу BoLA DRB 3.
Нами проанализирована генетическая структура стада по локусу BoLA DRB 3 и определена частота встречаемости аллелей, ассоциированных с устойчивостью к развитию лейкоза.
Для этого была генотипирована выборка коров и тёлок (n=50). Принцип отбора животных заключался в том, чтобы в группу для генотипирования пропорционально попадали дочери разных быков. При этом анализировалась таблица 14 СЕЛЭКС. Для анализа отбирались молодые животные (тёлки старше 10 месяцев, нетели и первотелки).
С использованием формулы: , где N1 - число гомозигот по исследуемому аллелю, а N2 - число гетерозигот, n - объем выборки, нами были установлены следующие частоты встречаемости аллелей BoLA DRB 3 (таблица 1). Очевидно, что в настоящее время генетический профиль животных хозяйства ОАО Племзавод Дружба насыщен аллелями BoLA DRB 3 *7, BoLA DRB 3 *24, BoLA DRB 3 *27.
Установлено, что частота встречаемости устойчивых аллелей в данном стаде очень низкая (в сумме BoLA DRB 3 *11, *23, *28 аллелей всего 7%). Это свидетельствует о том, что основная масса животных генетически предрасположена к инфекционным заболеваниям, в частности к лейкозу (таблица 1).
Генотипирование выборки показало, что количество гомозиготных животных составляет 14 %, гетерозиготных животных 86%.
Таблица 1. Результат анализа BoLA DRB3 генетического профиля стада ОАО л ПЗ Дружба
Аллель BoLA DRB 3 | Статус аллеля | Частота встречаемости аллеля, % |
1 | Н | 5 |
2 | Н | 7 |
3 | Н | 7 |
4 | Н | - |
5 | Н | 3 |
6 | Н | - |
7 | Н | 19 |
8 | Ч | 2 |
9 | Н | - |
10 | Н | - |
11 | У | - |
12 | Н | 4 |
13 | Н | - |
14 | Н | - |
15 | Н | - |
16 | Ч | 6 |
17 | Н | - |
18 | Н | 6 |
19 | Н | - |
20 | Н | - |
21 | Н | 4 |
22 | Ч | 2 |
23 | У | - |
24 | Ч | 15 |
25 | Н | - |
26 | Н | - |
27 | Н | 13 |
28 | У | 7 |
Итого: | Н | 68 |
У | 7 | |
Ч | 25 |
- Разработка схемы закрепления быков - производителей
Нами создана схема закрепления быков - производителей, позволяющая повысить BoLA DRB 3 гетерогенность стада и увеличить генетически обусловленную резистентность животных к этому заболеванию.
Быки были отобраны из базы данных по быкам -производителям ведущих племенных предприятий России, сформированной в лаборатории. Всего база содержит полную информацию (племенную и генетическую) по 800 быкам - производителям, принадлежащим 7 племенным предприятиям. Перечень айрширских быков, из которых был произведён отбор по всем традиционным критериям, был представлен 110 животными, генотипированными по BoLA DRB 3. Из них, 23 быка - производителя, были генотипированы в рамках проведённого исследования.
Выборка включала молодых быков 2007-2008-2009 годов рождения, принадлежащих ОАО Краснодарское по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных, ОАО Невское по племенной работе, ОАО Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных. Результаты генотипирования этих животных представлены в таблице 2.
Анализ генетического профиля животных и генотипированных быков - производителей, а так же генеалогической структуры стада позволил подобрать наиболее подходящих для данного стада быков - производителей. Для закрепления подбирали быков - производителей таким образом, чтоб они, во - первых, не имели общих предков с использованными ранее быками - производителями, во - вторых, имели высокий потенциал продуктивности, в третьих - несли в стадо редко встречающиеся в нём аллели, в - четвёртых, несли аллели устойчивости к лейкозу.
Таблица 2. Результаты генотипирования быков - производителей
№ животного | иния | BoLA DRB генотип | |
Тупси, 45585 | Дик 768 | 1 | 12 |
оск, 45587 | Р. Лихтинг 120135 | 1 | 27 |
Круиз, 45586 | Дик 768 | 18 | 22 |
Гламур, 45588 | Дик 768 | 1 | 18 |
Сэйл, 45583 | Дик 768 | 1 | 12 |
Ракурс, 45584 | Дик 768 | 1 | 27 |
Рекорд, 45590 | Дик 768 | 1 | 1 |
Вельвет, 45589 | Дик 768 | 12 | 18 |
Стиль, 1343 | Б.Юнкера 15635 | 22 | 28 |
Силвуд, 9756875 | О.Р. Лихтинг 120135 | 3 | 7 |
Волан,106202505 | снипетрум SRB-63640 | 1 | 18 |
Олшивер, 431 | О.Р. Лихтинг 120135 | 3 | 24 |
Олимп, 251 | О.Р. Лихтинг120135 | 7 | 12 |
Гейзер441, | С.В. Командор 174233 | 11 | 8 |
Галилей, 1181 | О.Р. Лихтинг 120135 | 7 | 2 |
Гранат, 711 | О.Р. Лихтинг 120135 | 3 | 12 |
Пан, 496 | Сниперум 63640 | 8 | 18 |
Пегас, 502 | Сниперум 63640 | 1 | 18 |
Отелло,5158 | С.Б. Командор 174233 | 8 | 18 |
Исканлаке, 574 | иния Лихтинга 120135 | 3 | 8 |
Зенит,727 | прочие | 1 | 24 |
Ауди, 715 | Прочие | 8 | 27 |
Уникум,684 | прочие | 8 | 18 |
Исходя из этих требований, нами для закрепления были рекомендованы три быка: Гейзер 441, имеющий генотип BoLA DRB 3 8 *11, Круиз 45586 - с BoLA DRB 3 генотипом - 18 *22, Тупси 76849 - с BoLA DRB 3 генотипом - 1 *12 (таблица 3).
Закрепление быков было произведено тройкой, со сменой быка после каждого перегула. Например, если после осеменения быком - производителем Гейзер 441, корова пришла в охоту (по нашим данным, на долю первого быка в тройке приходилось около 60% плодотворных осеменений), проводили осеменение быком - производителем Круиз 45586 (20 - 30 % плодотворных осеменений), а в случае следующего перегула - Тупси 76849 (около 10 - 20 % плодотворных осеменений).
Таблица 3. Характеристики закреплённых быков - производителей и молочная продуктивность их матерей по наивысшей лактации
Кличка, № | иния | Продуктивность матери | Генотип BoLA DRB 3 | |||
удой по наивысшей лактации, кг | содержание жира, % | содержание белка, % | ||||
Гейзер 441 | С.В. Командор 174233 | 14308 | 4,73 | 3,10 | 11 (У) | 8 (Ч) |
Круиз 45586 | Дик 768 | 10875 | 4,12 | 3,52 | 18 (Н) | 22 (Ч) |
Тупси 76849 | Дик 768 | 10991 | 4,28 | 3,50 | 1 (Н) | 12 (Н) |
Увеличение количества чувствительных аллелей, которое произойдёт при данном закреплении, судя по литературным данным (Shatif S., 2000), должно способствовать повышению обильномолочности стада, что было прописано хозяйством как обязательное условие при закреплении быков.
Подбор новых быков - производителей, несущих редкие для данного стада генетические блоки (аллели), способствовал значительному (на 19%) снижению расхода спермы на одно плодотворное осеменение по данным зоотехнического учёта. По нашему мнению, это, вероятно, объясняется устранением генетической несовместимости отцов и матерей.
Нами проанализированы 2 группы телят в возрасте до 2 -х месяцев. Телята первой группы (n=38) получены от быков - производителей, использовавшихся в хозяйстве до предложенного нами закрепления. В результате генотипирования установлено преобладание BoLA DRB 3 генотипов Н/Н - 52,63% (20 голов) и Н/Ч - 42,11 % (16 гол.). Полученные данные свидетельствуют о том, что если бы в хозяйстве не было изменено закрепление быков - производителей, устойчивые аллели в данном стаде были бы элиминированы.
Вторая группа телят (n=50) была получена уже от предложенных нами быков - производителей (через 1 год после закрепления). Результаты генотипирования показали, что в результате нового закрепления быков - производителей, частота встречаемости устойчивых аллелей увеличилась до 22%, чувствительных аллелей до 29%, нейтральных аллелей - снизилась до 49% (таблица 4).
Таблица 4. Частоты встречаемости аллелей BoLA DRB 3 в группе телят, полученных от предложенного закрепления (n=50)
Аллель | Статус аллеля | Частота встречаемости аллеля, % |
в результате закрепления у потомков | ||
1 | Н | 5 |
2 | Н | 4 |
3 | Н | 5 |
4 | Н | - |
5 | Н | - |
6 | Н | - |
7 | Н | 12 |
8 | Ч | 14 |
9 | Н | - |
10 | Н | - |
11 | У | 16 |
12 | Н | 5 |
13 | Н | - |
14 | Н | - |
15 | Н | 1 |
16 | Ч | 2 |
17 | Н | - |
18 | Н | 9 |
19 | Н | - |
20 | Н | 2 |
21 | Н | 0 |
22 | Ч | 7 |
23 | У | - |
24 | Ч | 6 |
25 | Н | - |
26 | Н | - |
27 | Н | 6 |
28 | У | 6 |
Итого | ||
Н | 49 | |
У | 22 | |
Ч | 29 | |
Такое закрепление способствовало увеличению разнообразия BoLA DRB 3 аллелей в стаде.
При сопоставлении частот встречаемости BoLA DRB 3 аллелей в материнском стаде с частотами встречаемости аллелей в группе телят, полученных от предложенного закрепления, выявлена существенная разница (P<0,001). В качестве критерия оценки достоверности разницы частот встречаемости генотипов применен критерий Фишера (χ) (соответствующий расчёт приведён в таблице 5)
Таблица 5. Расчет критерия χ
Аллели | Частоты встречаемости | (p - p) | (p - p) | (p - p)/p | χ | |
в материнском стаде (p) | у телят (p) | |||||
Н | 34 | 24 | 10 | 100 | 4,2 | 10,3 |
Ч | 13 | 15 | -2 | 4 | 0,3 | |
У | 3 | 11 | -8 | 64 | 5,8 |
Для расчета в качестве исходных данных использовано количество животных, носителей определённых аллелей (а не частоты встречаемости аллелей).
Таким образом, в хозяйстве ОАО ПЗ Дружба на основании генетических исследований заложена и практически получена новая BoLA DRB 3 структура стада.
3.3. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота с использованием полимеразной цепной реакции
С целью экспериментального подтверждения возможности снижения количества инфицированных телят при 100 % инфицированности матерей был поставлен эксперимент 1.
В хозяйстве выделили группу глубокостельных коров. Она состояла из 30 животных положительно реагировавших в РИД. После отёла у матери и телёнка брали пробы крови, которые исследовали на наличие провирусной ДНК ВЛКРС с использованием ПЦР. Процедуру повторяли каждые полтора месяца до достижения телятами возраста 6 месяцев. Полученные данные приведены в таблице 6.
Таблица 6. Динамика выявления инфицированных провирусом ВЛКРС телят в зависимости от возраста
Хозяйство | Инфицировано телят, % | ||||
при рождении | 1,5 мес. | 3 мес. | 4,5 мес. | 6 мес. | |
ОАО ПЗ Дружба | 0 | 7 | 7 | 7 | 7 |
Последнее ПЦР исследование совместили с плановым серологическим исследованием. По результатам первого исследования (при рождении) среди телят не было выявлено ни одного носителя провирусной ДНК. Вирусоносители выявлены по результатам второго исследования.
Важно отметить, что животные после рождения содержались в индивидуальных домиках, выпаивались молоком от РИД - отрицательных коров - кормилиц, инфицированных телят изолировали от здоровых. РИД - исследования в 6 месяцев дали положительный результат именно у ПЦР - положительных телят. Таким образом, уровень инфицированности удалось остановить на 7% рубеже при 100% инфицированности матерей.
В эксперименте 2 (таблица 7) были исследованы методом ПЦР две группы телят (n=50 и n=37). По результатам первого исследования (возраст 1 месяц) в первой группе от РИД отрицательных матерей не было выявлено инфицированных телят, а от РИД положительных было выявлено 2 (10%) инфицированных телёнка. Во второй группе от РИД негативных матерей не выявлено ни одного инфицированного животного, однако от РИД позитивных было выявлено 2 (13%) ПЦР положительных телёнка. Из второй опытной группы телята - вирусоносители были немедленно удалены, а в первой - оставлены со здоровыми.
Второе исследование было проведено через два месяца, по достижению трехмесячного возраста телят. В группе телят, полученных от РИД - негативных матерей, но содержащихся совместно с телятами, полученными от РИД - позитивных, добавилось два инфицированных телёнка.
Во второй группе после выведения животных - вирусоносителей не добавилось ни одного инфицированного телёнка. Это можно объяснить только тем, что перезаражение животных происходит при совместном содержании здоровых телят и вирусоносителей. РИД исследования телят обеих групп, проведённые в возрасте шести месяцев, полностью подтвердили результаты ПЦР - исследований.
Таблица 7. Выявление провирусной ДНК
Время проведения исследований | I - опытная группа (n=50) | II - опытная группа (n=37) | ||
от РИД негативных матерей | от РИД позитивных матерей | от РИД негативных матерей | от РИД позитивных матерей | |
количество животных | ||||
30 | 20 | 22 | 15 | |
1 исследование -1 мес. | - | 2 (10 %) | - | 2 (13 %) |
2 исследование -3 мес. | 2 (7%) | 2 (10%) | - | - |
Таким образом, нами было установлено:
- ПЦР позволяет диагностировать вирусоносительство на ранних сроках жизни животного (в возрасте около 1 месяца);
- ПЦР диагностика позволяет предотвратить перезаражение животных при условии изоляции вирусоносителей.
До проведения противолейкозных оздоровительных мероприятий уровень инфицированности животных в 6 - месячном возрасте составлял 20%.
Всего нами было проанализировано методом ПЦР в период с октября 2011 по март 2012 года 444 проб крови телят айрширской породы, принадлежащих ОАО Племзавод Дружба.
Анализ полученных результатов показал, что с использованием ПЦР удалось выявить 26 голов (или 6%) инфицированных телят.
Все ПЦР - положительные телята немедленно изолировались из стада. РИД - исследование группы телят, отрицательно прореагировавших в ПЦР (n = 418) и достигших возраста 6 месяцев дало отрицательный результат в 100% случаев.
В потомстве закреплённых нами быков - производителей произошло снижение количества телят - вирусоносителей. Так, из 351 телёнка, полученных от быков - производителей без учёта BoLA DRB 3 генотипов, вирусоносителями оказались 25 (или 7% телят), а из телят, полученных от закреплённых нами быков (n=93) лишь 1 оказался вирусоносителем (1%).
Таким образом, в ОАО Племзавод Дружба разработана эффективная схема оздоровления молодняка от лейкоза крупного рогатого скота, основанная на использовании молекулярно - биологических методов (рисунок 7).
Рисунок 7.Схема использования методов анализа ДНК для снижения уровня инфицированности
3.4. Геногеографические исследования вируса лейкоза крупного рогатого скота
Совместно с ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, на базе Центра коллективного пользования научным оборудованием Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных в рамках выполнения государственных контрактов с Минобрнауки России № 16.М04.11.0018 и № 14.740.12.0821. проведено типирование вируса лейкоза крупного рогатого скота, провирусная ДНК которого была выделена из крови животных айрширской породы. Материалом для исследований являлись пробы крови от РИД положительных коров.
ПЦР - анализ, направленный на выявление провируса лейкоза в крови коров показал, что не все РИД - положительные животные являются вирусоносителями детектируемых фрагментов генов gag и env. Исследованием ДНК 20 коров установлено, что 80 % РИД - положительных животных оказались носителями вируса лейкоза, детектируемого методом ПЦР. Как было показано ранее (Виноградова И.В., Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., 2011), данный факт может быть связан с тем, что либо животные находятся в стойкой алимфатической стадии, либо в начальной стадии персистирующего лимфоцитоза, чем и обусловлено низкое содержание провирусной ДНК в крови коров.
Молекулярно - генетические свойства провирусной ДНК гена env определяли с помощью методов nested - ПЦР (Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Ермилов А.А., и др. 2006), ПДРФ анализа (RFLP) (Beier D., Blankenstein P., Marquardt O., et al., 2001) и по методикам Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии (Виноградова И.В., Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., 2011).
Проведенный ПЦР - ПДРФ анализ фрагмента гена env ВЛКРС длиной 444 п.о. показал, что в изученном нами хозяйстве циркулирует две генетические разновидности вируса лейкоза, относящиеся по международной классификации к вирусам - лавстралийской и бельгийской подгрупп.
Таким образом, проведенные исследования позволили получить дополнительные данные по региональной филогении участка гена env вируса лейкоза крупного рогатого скота.
3.6. Экономическое обоснование исследований
Как отмечалось выше, одним из приемов повышения эффективности молочного скотоводства является получение здорового молодняка устойчивого к заболеваниям, неблагоприятным факторам, способного максимально реализовать свой генетический потенциал. Экономическая эффективность проводимых исследований оценивалась исходя из:
- сокращения расхода спермы на одно плодотворное осеменение в результате закрепления на 19% (по данным зоотехнического учёта) (таблица 8),
- сокращения выбраковки животных на 19% (таблица 9).
Таблица 8. Экономический эффект от сокращения расхода спермы
Количество коров в хозяйстве | 720,0 |
Количество тёлок в хозяйстве | 280,0 |
Количество доз спермы на одно плодотворное осеменение коровы | 3,9 |
Количество доз спермы на одно плодотворное осеменение тёлки | 2,0 |
Цена одной спермадозы, руб. | 130,0 |
Итого, руб. | 437840,0 |
Стоимость генетических анализов (1000 руб. / исследование), руб. | 50000,0 |
Снижение расхода спермы на одно плодотворное осеменение, % | 19,0 |
Итого новые затраты на сперму в год, руб. | 354650,4 |
Прибыль от экономии средств на сперму в год, руб. | 33189,6 |
Рентабельность, % | 66,4 |
Окупаемость затрат, мес. | 7,0 |
Таблица 9. Расчёт экономического эффекта за счет снижения выбраковки животных Ц вирусоносителей
Количество тёлок, (голов/год) | 446,0 |
Стоимость ДНК - анализов, руб. (150 руб./исследование) | 67000,0 |
Живая масса телёнка в 6 мес., кг. | 147,0 |
Себестоимость 1 кг привеса, руб. | 11,8 |
Дополнительная прибыль за счёт снижения выбраковки на 19%, руб. | 80441,0 |
Таким образом фактический экономический эффект от сокращения расхода семени составил 33189,6 рублей в год. Суммарный ожидаемый ежегодный экономический эффект от внедрения методов ДНК - анализа в данном хозяйстве составит 113630,6 рублей.
ВЫВОДЫ
- В стаде крупного рогатого скота айрширской породы ОАО ПЗ Дружба преобладают аллели BoLA DRB 3 *7, *24, *27, а частота встречаемости аллелей, детерминирующих устойчивость к персистентному лимфоцитозу, низка (в сумме BoLA DRB 3 *11, *23, *28 аллели встречаются с частотой всего 7%).
- Разработанная схема закрепления быков - производителей, позволила выровнять аллельный BoLA DRB 3 - профиль стада, увеличить количество животных - носителей аллелей устойчивости к персистентному лимфоцитозу на (15%), увеличить количество животных с гетерозиготными генотипами (на 12%).
- Реализована схема закрепления быков - производителей способствовала значительному (на 19%) снижению расхода спермы на одно плодотворное осеменение.
- Экспериментальными исследованиями установлено, что;
-ПЦР позволяет выявлять вирусоносительство на ранних сроках жизни животного (в возрасте около 1 месяца);
-ПЦР позволяет предотвратить перезаражение животных при условии изоляции вирусоносителей.
- В потомстве, закреплённых нами быков - производителей, произошло снижение количества телят - вирусоносителей в 7 раз.
- Комплекс генетических и диагностических исследований, проведённых в хозяйстве, способствовал снижению количества вирусоносителей в общей сложности с 20 до 1%.
- Типирование вируса лейкоза, выделенного у животных хозяйства показало, что в изученном нами стаде циркулирует две генетические разновидности вируса лейкоза, относящиеся по международной классификации к вирусам лавстралийской и бельгийской подгрупп.
- Ожидаемый общий экономический эффект от внедрения предложенной схемы в хозяйстве составит в год 113630,6 рублей.
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ
Сельхозпредприятиям по разведению крупного рогатого скота молочного направления продуктивности рекомендуется:
- проводить подбор родительских пар с учетом генотипа по локусу BoLA DRB 3, для повышения резистентности коров к персистентному лимфоцитозу, снижения количества телят - вирусоносителей и сокращения расхода семени на плодотворное осеменение;
- разделять телят с 1 месячного возраста на здоровых и вирусоносителей с изоляцией последних на основании результатов ДНК - анализа по предложенной нами схеме для оздоровления стад от лейкоза.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ:
- Якушева, Л.И. Изменение генетической структуры стада крупного рогатого скота как первый этап оздоровления от лейкоза / Л.И. Якушева, Н.В. Ковалюк // Труды Кубанского государственного аграрного университета. -2012. - №3 (36). - С. 260-263.
- Якушева, Л.И. Совершенствование генетической структуры стада крупного рогатого скота айрширской породы с использованием маркера BоLA DRB 3 /Л.И. Якушева, В.Ф. Сацук, Н.В. Ковалюк, Е.В. Мачульская, Т.П. Горбунова // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2012. -№3. - С.69-75.
Публикации в других изданиях:
- Якушева, Л.И. Практический опыт использования ПЦР - диагностики для оздоровления стада от лейкоза КРС/ Л.И. Якушева, В.Ф. Сацук, Н.В. Ковалюк, Е.В. Мачульская, Т.П. Горбунова // Материалы научно -практической конференции Инновационные разработки молодых ученых Юга России. Ставрополь - 2012. С.185 -187.
- Мачульская, Е.В. Повышение генетической гетерогенности стада, как фактор увеличения резистентности к инфекционным заболеваниям / Е.В. Мачульская, Н.В. Ковалюк, Л.И. Якушева, В.Ф. Сацук // Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных. Краснодар 2012. - С.12-14.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по сельскому хозяйству