Скрининг и разработка новых антимикробных препаратов 06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Краснодар

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по сельскому хозяйству

На правах рукописи

МОГИЛЬНЫЙ НИКОЛАЙ ГЕННАДЬЕВИЧ

Скрининг и разработка новых антимикробных препаратов

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

Краснодар - 2012

Работа выполнена в ГНУ Краснодарский научно-исследовательский ветеринарный институт Россельхозакадемии.

Научный руководитель:	заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор Антипов Валерий Александрович
Официальные оппоненты:	доктор ветеринарных наук, заведующая лабораторией фармакологии Краснодарского НИВИ Семененко Марина Петровна
	кандидат ветеринарных наук, старший преподаватель кафедры терапии и фармакологии Кубанского ГАУ Шантыз Азамат Хазретович
Ведущая организация:	ФГБОУ ВПО Ставропольский государственный аграрный университет

Защита состоится л12 октября 2012 г. в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 220.038.07 при ФГУ ВПО Кубанский государственный аграрный университет по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кубанского государственного аграрного университета по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.

Автореферат размещен на официальном сайте ФГБОУ ВПО Кубанский ГАУ л11 сентября 2012 г. и официальном сайте ВАК РФ

Автореферат разослан л11 сентября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Родин И.А.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из наиболее проблемных направлений фармакологической науки является целенаправленный поиск новых высокоэффективных и безопасных лекарственных веществ.

Современные антибиотики и синтетические антимикробные средства занимают ведущее место в лечении бактериальных инфекций. Их применение при различных инфекционно-воспалительных заболеваниях достигает 70-100% больных в хирургии, гинекологии и других заболеваний, до 50-60% при болезнях молодняка.

Трудности лечения и профилактики инфекционных заболеваний, обусловленные разнообразием биологических форм возбудителей, постоянным возникновением мультирезистентных форм, появлением новых видов опасных патогенов, определяют актуальность проблемы создания новых противомикробных средств.

Необходимость в новых препаратах обусловлена разнообразными причинами: расширение антимикробного спектра, повышение активности, активность в отношении устойчивых возбудителей, улучшение фармакокинетических свойств, снижение токсичности и др.

При проведении микробиологического мониторинга за 5 лет был отмечен возросший удельный вес полирезистентных метицилинрезистентных штаммов Staphilacoccus aureus (10,2-66,7%); Pseudomonas aeruginosa (5,2-18,8%); множественная лекарственная устойчивость Staphilacoccus epidermidis (14,1-55,6%) к трем и более препаратам антимикробного действия (П.В. Горшенин, Р.Н. Мамлев, М.Е. Марусина 2002).

В этих условиях появление в клинической практике новых антибактериальных препаратов, активных в отношении полирезистентных штаммов, представляют огромный интерес.

Представленная работа посвящена скринингу вновь синтезированных соединений на предмет их антимикробной активности, а так же разработке и изучению перспективы использования нового дезинфицирующего средства на основе четвертичных аммонийных соединений.

Цель работы. Основной целью работы явился поиск новых высокоэффективных соединений с противомикробной активностью среди продуктов органического синтеза и изучение биологической активности перспективных соединений с целью внедрения в ветеринарную практику и установление зависимости биологической активности от химической структуры. А так же разработка и экспериментальное обоснование применению нового высокоэффективного дезинфектанта на основе четвертичных аммонийных соединений (ЧАС).

Задачи исследований:

Провести скрининг противомикробной активности среди новых продуктов органического синтеза и выявить высокоактивные соединения по отношению к тест - культурам микроорганизмов;
Провести углублённые исследований, выявленных при скрининге веществ с высокой биологической активностью, на специфическую активность по отношению тест-штаммам бактерий: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumonia, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa и грибов рода Candida albicans;

Выявить взаимосвязь между химической структурой соединений и биологической активностью исследуемых веществ.
Разработать новый дезинфицирующий препарат на основе ЧАС.
Изучить фармакологические и токсикологические свойства нового препарата

Научная новизна. В результате проведенных исследований изучена противомикробная активность 270 вновь синтезированных соединений по отношению к скрининговым штаммам - Staphilacoccus aureus, Esherichia coli и Candida albicans. Проведённые опыты позволили выявить 7 соединений принадлежащих двум классам химических веществ, обладающих высокой противомикробной активностью и значительно превосходящие эффект эталонных препаратов. Проведены углублённые исследования двух вновь синтезированных веществ. Выявлена зависимость противомикробной и фунгицидной активности в зависимости от химической структуры соединений. Показана перспективность целенаправленного синтеза и поиска соединений с противомикробной активностью среди конкретных химических классов. Разработан новый дезинфицирующий препарат на основе четвертичных солей аммония (ЧАС), и проведена его фармако - токсикологическая оценка.

Практическая значимость работы. Полученные данные дают базу об биологической активности вновь синтезированных соединений, разных химических групп. В проведенных экспериментах на основе скрининга выявлено 53 соединений, обладающих противомикробной активностью к грамположительным и грамотрицательным микроорганизмам, из них 11 соединений - рекомендованы для углублённого исследования.

На основании микробиологических и фармакологических исследований доказана эффективность нового дезинфицирующего препарата на основе четвертичных солей аммония с названием албиоцид.

Основные положения, выносимые на защиту

Результаты скрининговых исследований вновьсинтезированных соединений по отношению к тест - культурам микроорганизмов Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Candida albicans.
Результаты исследований выявленных в ходе скрининга биологически активных соединений, по отношению, к основном патогенным микроорганизмам, в том числе проявляющих высокую резистентность к противомикробным препаратам.
Установлена взаимосвязь галогенового радикала в составе 2-галогенпиридин-3-карбонитриловых соединений.
Результаты исследований разработанного препарата, на основе четвертичных аммонийных соединений, для дезинфекции объектов ветеринарного надзора.
Результаты фармакологической и токсикологической оценки разработанного дезинфицирующего препарата

Апробация материалов диссертации. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на внутри вузовских научно-практических конференциях КубГАУ (2009-2011гг); на международной научно-практической конференции Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях, посвящённой 65 -летию Краснодарского НИВИ (2011г).

Публикация материалов исследований. По материалам исследования опубликовано 7 научных работ, в том числе 6 в рецензируемом издании, рекомендуемом ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 180 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, собственных исследований, заключения, выводов. Библиография включает 162 литературных источника, в том числе 126 отечественных и 36 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 3 рисунками.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнялась в период с 2009 по 2012 годы в лаборатории паразитологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ГНУ Краснодарского научно-исследовательского ветеринарного института (Краснодарского НИВИ) и сельскохозяйственных предприятиях Краснодарского края.

Исследованию были подвергнуты 270 вновь синтезированных соединений и 30 препаратов на предмет их биологической активности. Исследования проводились совместно с ООО Поливит г. Уфа и НИИ ПАВ г. Волгодонск.

Производственные опыты проводили на животноводческих фермах Краснодарского края: ЗАО Воронцовское Ейского района и ООО Мария Белореченского района.

Алгоритм исследований:

Изучение биологической активности вновь синтезированных соединений.
Проведение углублённые исследования биологически активных соединений к расширенному числу микробиологических штаммов, и дать токсикологическую оценку наиболее эффективным из них.

Установить взаимосвязи химической природы соединений и их активность в отношении исследуемых штаммов микроорганизмов.

Изучение биологических свойств препарата албиоцид - на основании оценки антибактериальной и фунгицидной активности.
Исследование токсикологических свойств препарата албиоцид - путём определения острой и хронической токсичности, общего влияния на организм, кумуляции и раздражающего действий
Определение экономической эффективности применения соединений ЧАС в ветеринарии - путём проведения экономических расчётов.

Изучение биологической активности соединений in vitro проводили методом серийных разведений по стандартной методике разведений дезинфектантов и антисептиков в питательном агаре на 2 тест-культурах бактерий (Escherichia coli и Staphylococcus aureus) и культуре грибов (Candida albicans).

Опыт по определению антимикотической активности соединений проявляющих высокую активность в отношении тест-культур проводили в трех повторностях с использованием контрольного посева без препарата. В качестве объектов исследования использовали бактерипльные культуры: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Candida albicans, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus, Pseudomonas aeruginosa, а также грибы Candida albikans и Trichophyton mentagrophytes.

В ходе экспериментального исследования применялись клинические, фармакологические, токсикологические, микробиологические и другие методы исследований.

Острая и хроническая токсичность препаратов определялась согласно методическим рекомендациям по изучению общетоксического действия фармакологических средств (Е.В. Арзамасцев, 1997).

Исследуемый препарат албиоцид относится к группе веществ четвертичных аммониевых соединений. В качестве действующих веществ содержащий: алкилбензилдиметиламмоний хлорид, дидецилдиметиламмоний хлорид, этандиал, диформиль, щавелевый альдегид и глутаровый альдегид. Представляет собой прозрачную маслянистую жидкость желтого цвета, со специфическим запахом.

Изучение антимикробной активности препарата албиоцид, проводили методом серийных разведений in vitro по стандартной методике разведений дезинфектантов и антисептиков в питательном агаре на 8 культурах бактерий.

Изучение острой токсичности препарата проводили на 30 белых крысах. Препарат вводился в нативном виде в желудок, белым крысам-самцам живой массой тела 120-160 г, с помощью металлического зонда. Было испытано 4 дозы: 1, 2, 3 и 5 г/кг массы тела. За животными вели наблюдение в течение 2-х недель после введения, отмечая сроки гибели и клиническую картину интоксикации. Учитывали общее состояние животных, сохранение двигательных функций, аппетита, состояние шерстного покрова, дыхания, реакцию на внешние раздражители.

Расчёт средне-смертельных дозы (ЛД50) проводился методом пробит- анализа в модификации Прозоровского В.Б. Этот метод позволял определить угол наклона зависимости доза - летальный эффект и соответственно получить параметры ЛД84 и ЛД16. Приближённое значение стандартной ошибки ЛД50 вычисляли по эмпирической формуле Гаддама.

Субхроническая токсичность изучалась в течение 28 дней на 30 белых крысах с массой тела 100 - 120 г, подобранных по методу пар-аналогов

Дозу препарата вводили через зонд внутрижелудочно. За животными велось ежедневное наблюдение, учитывая аппетит и общее состояние. Также проводились морфологические исследования крови перед каждым повышением дозы препарата. Гибель животных регистрировали на 16, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 27 сутки от начала опыта.

Изучение аллергизирующего действия препарата албиоцид проводили путем воспроизведения местных аллергических реакций (феномена Артюса-Сахарова, скарификационного теста).

Для воспроизведения феномена Артюса-Сахарова было подобрано 2 группы кроликов по три кролика в каждой массой тела 1,8-2 кг. Всем кроликам в области спины выстригали небольшие участки шерсти.

В первой группе в подкожную клетчатку выстриженных участков вводили раствор албиоцид в концентрации 600 мг/л в дозе 1 мл/кг, во второй (контрольной) группе - сыворотку крови лошади в той же дозе.

Препараты вводили шестикратно с интервалом шесть дней. Наблюдение за животными вели ежедневно, в течение всего срока назначения препаратов и 6 дней после его окончания, учитывая воспалительную реакцию в местах инъекции.

Антибактериальную активность препарата албиоцид изучали in vitro по стандартной методике, в соответствии с методическим указанием о порядке первичной апробации новых дезинфицирующих средств, для ветеринарной практики

Дезинфицирующие свойства препарата албиоцид определяли на контаминированных тест-культурами (Escherichia coli и Staphylococcus aureus) тест-объектах. В качестве тест-объектов использовались деревянные, кирпичные и металлические поверхности. Контаминированный тест-объект подсушивали в течении одного часа при комнатной температуре, а затем обрабатывали средством албиоцид из опрыскивателя. Температура рабочего раствора дезинфицирующего средства и воздуха во время проведения опытов была в пределах 18-20С, относительная влажность 65-75%. Все опыты были поставлены в пятикратной повторности.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Изучение биологической активности вновь синтезированных соединений

Были проведены скрининговые исследования по изучению противомикробной активности 270 вновь синтезированных соединений, принадлежащих к разным химическим группам, по отношению к тест-культурам - St. aureus (spp), Е. coli (K-88) и Candida albicans.

По результатам исследования было выявлено, что 74 соединений проявляют активность по отношению к St. aureus, что составляет 24,9%. Не оказывали существенного влияния на данный микроорганизм 223 изученных соединений (75,1%). По отношению к грамотрицательным микроорганизмам, в частности, к кишечной палочке эти показатели составляют: 54 (18,2%) и 243 (80,4%), соответственно (таблица 1).

Таблица 1 - Результаты первичного скрининга антимикробных соединений (n=297)

Производные соединений	Активность в отношении :
Производные соединений	Escherichia coli. K-88	Staphylococcus aureus	Candida albicans
Оксиранов (134)	21	30	8
Пиридинов (98)	8	15	3
Изатина (27)	1	8	0
ЧАС (38)	24	21	15
Всего (297)	54	74	26

Низкую противомикробную активность (МПК 125-1000 мкг/мл) по отношению к изучаемым штаммам показали 85,6% к Staphylococcus aureus и соединений 91,5% к Escherichia coli. Наименьшую активность показали соединения изатина.

По результатам скрининговых исследований выявлено 74 соединения проявивших высокую ПМА по отношению к Staphylococcus aureus и 54 к Escherichia coli. В отношении Staphylococcus aureus производные изатина проявляют ПМА в диапазоне 0,6-4,8 мкг/мл. При этом высокую активность к St. aureus имеют 3 соединения.

Наиболее активное соединение обладает МПК=0,3 мкг/мл и проявляет высокую активность к стафилококку: МПК по отношению к St. aureus составляет 25-62 мкг/мл.

В группе производных оксиранов получены следующие результаты: активность к Escherichia coli проявили 6 соединений, МПК которых находится в диапазоне 53-98 мкг/мл, что свидетельствует об умеренной активности.

Так же высокую активность показали соединения четвертичных солей аммония (ЧАС), соединения этой группы проявляли активность в отношении широкого спектра возбудителей, в том числе резистентных к антимикробным препаратам, и были отобраны для дальнейших исследований по разработки нового препарата.

Среди веществ, проявивших наиболее высокую активность, 7 соединений были исследованы по активности к 10 тест - культурам для определения биологической активности к штаммам: Сitrobacter frendii, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes.

Соединения, проявляющие противомикробную активность в отношении данных штаммов, имеют перспективность к дальнейшим исследованиям. При анализе противомикробной активности по отношению к отдельным штаммам получены следующие данные (табл. 2). Наибольшую активность в отношении кокковой микрофлоры проявляют соединения пиридинов, в отношении же бактерий кишечной группы и патогенных грибов большую активность показали производные оксиранов.

При анализе противомикробной активности по отношению к отдельным штаммам получены следующие данные (табл. 2). Наибольшую активность в отношении кокковой микрофлоры проявляют соединения 2-йод-5,6,7,8-тетрагидрохонололин-3,4-дикарбонитрил и 2-{амино[3-(4-метилфенил)-2-цианооксиран-2-л]метилен}малононитрил, в отношении же бактерий кишечной группы (грамм -) 2-{амино[3-(4-фторфенил)-2-цианооксиран-2-ил]метилен}малононитрил.

Наибольшую активность в отношении всех изучаемым штаммов микроорганизмов показало соединение 2-йод-5,6,7,8-тетрагидрохонололин-3,4-дикарбонитрил. Максимальная активность соединения проявилась в отношении Candida albicans (МПК составляет 19 мкг/мл). Соединение 2-амино-6-(3-

Таблица 2. Активность вновь синтезированных соединений в отношении широкого спектра микроорганизмов

Виды бактерий Исследуемые соединения		Citrobacter frendii	Staphylococcus epidermidis	Streptococcus pyogenes	Klebsiella pneumonia	Pseudomonas aeruginosa	Proteus vulgaris	Bacillus subtilis	Salmonella typhimurium	Candida. albicans	T. mentagrophytes
№	Синтезированные соединения	Минимальная подавляющая концентрация МПК, мкг/мл
Производные оксиранов
№1	2-амино-6-(3-бромфенил)-4-(дицианометилен)-3-азабицикло[3,1,0]гекс-2-ен-1,5дикарбо-нитрил*	250	44	16	230	230	172	250	250	21	31
№2	2-[амино(3-фенил-2-цианооксиран-2-ил)метилен]малононитрил*	98	115	44	98	98	24	115	98	44	61
№3	2-{амино[3-(4-фторфенил)-2-цианооксиран-2-ил]метилен}малононитрил*	98	109	32	44	60	26	98	62	31	44
№4	2-{амино[3-(4-метилфенил)-2-цианооксиран-2-ил]метилен}малононитрил*	51	53	37	62	62	98	116	96	61	62
Производные пиридинов
№5	2-Хлор-5,6,7,8-тетрагидрохонололин-3,4-дикарбонитрил*	44	59	41	44	66	39	36	62	62	66
№6	2-Бром-5,6,7,8- тетрагидрохонололин-3,4-дикарбонитрил*	55	62	44	51	62	29	44	58	33	58
№7	2-йод-5,6,7,8-тетрагидрохонололин-3,4-дикарбонитрил *	29	24	53	32	24	26	28	31	19	24
контроль	Фуразолидон	62	83	29	66	68	61	250	66	32	44

Таблица 3. Активность соединений ЧАС в отношении широкого спектра микроорганизмов

Виды бактерий Исследуемые соединения		Citrobacter frendii	Staphylococcus epidermidis	Streptococcus pyogenes	Klebsiella pneumonia	Pseudomonas aeruginosa	Proteus vulgaris	Bacillus subtilis	Salmonella typhimurium	Candida. albicans	T. mentagrophytes
№	Синтезированные соединения	Минимальная подавляющая концентрация МПК, мкг/мл
Алкилбензилдиметиламмоний хлориды
№1	Катапав 1214 C50 (алкил 12-14 изопропанол)	416	416	277	277	416	277	416	1277	416	416
№2	Катапав 1214 C80	124	124	82	124	82	82	124	124	124	124
№3	Катапав 1214 C80 c Br	185	185	124	124	124	124	185	188	124	188
№4	Катапав 1214 C80 c J	82	124	82	82	82	82	98	124	82	124
№5	Катапав 1816	>1000	625	>1000	>1000	938	>1000	>1000	>1000	>1000	>1000
Алкилтриметиламмоний хлориды
№6	Алкопав 1816	416	416	416	625	416	625	625	416	277	416
№7	Алкопав 1618	277	277	416	416	416	416	625	416	277	416
№8	Алкопав 1618 с Br	416	416	416	625	416	625	625	416	416	416
№9	Алкопав 1618 с J	277	277	416	277	416	416	416	416	277	416
Дидецилдиметиламмоний хлориды
№10	Сетопав C70	124	124	124	82	124	124	185	124	185	185
№11	Сетопав C30	>1000	625	938	>1000	>1000	938	>1000	>1000	>1000	>1000
контроль	Фуразолидон	62	83	29	66	68	61	250	66	32	44
Контроль (для ЧАС)	Бромоцид	625	277	350	625	625	625	625	416	625	625

* - соединения проявляющие активность более чем 1000 мгк/мл далее не исследовались

** - разведения использовались для определения концентрации концентрация 125 мкг/мл считается эффективной для ЧАС

бромфенил)-4-(дицианометилен)-3-азабицикло[3,1,0]гекс-2-ен-1,5дикарбо-нитрил угнетает рост Candida albicans в 21 мкг/мл. При этом соединение 2-йод-5,6,7,8-тетрагидрохонололин-3,4-дикарбонитрил проявляет максимальное бактериостатическое действие в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов: St. aureus, Е. coli, St. epidermidis, Ps. aeruginosa с МПК 30 мкг/мл. Соединение 2-амино-6-(3-бромфенил)-4-(дицианометилен)-3-азабицикло[3,1,0]гекс-2-ен-1,5дикарбо-нитрил угнетает рост штаммов грибов рода кандида и трихофитон в концентрации 31 мкг/мл, так же оказывает выраженную активность в отношении грамм положительной микрофлоры.

Соединения ЧАС выбранные для исследования в отношении широкого спектра микроорганизмов исследовались на тех же культурах. Что и вновьсинтезированные соединения. Результаты исследования представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3 наиболее эффективными являются соединения алкилбензилдиметиламмоний хлорид (катапав С80) и дидецилдиметиламмоний хлорид (сетопав С70). Высокоэффективными противомикробными средствами на основе ЧАС являются соединения с МПК менее 125мкг/мл. Активность данных соединений обусловлена углеродными показателями соединений, так как установлено, что наибольшую активность проявляют ЧАС с углеродным показателем С12-16.

Введение в состав соединений галогенового радикала приводило к существенному изменению свойств соединений, как химических, так и бактерицидных. Так введение брома (Br) приводило к уменьшению биологической активности соединений, в отношении бактериальных и грибковых патогенов Введение же йодного (J) радикала увеличивает бактерицидную и фунгицидную активность соединений, при этом работа с соединениями осложняется низкой стабильностью соединений, а так же высокой окислительной способностью галогена.

Остальные соединения, отобранные для углублённого исследования, проявили среднее бактериостатическое действие по отношению к грибам и спорообразующим бактериям.

3.1 Противомикробная активность синтетических соединений

Производные оксиранов - содержат напряжённый трёхчленный цикл и карбонильную группу, что создаёт предпосылки к каскадным процессам циклизации, приводящим к образованию гетероциклических соединений сложного функционального окружения.

Наибольшую активность среди скрининговых соединений оксиранов показали 2-амино-6-фенил-4-(дицианометилен)-3-азабицикло[3.1.0]гекс-2-ен-1,5-дикарбонитрил и 2-{амино[3-(4метилфенил-2-цианооксиран-2-ил]метилен} малононитрил.

Производные данных соединений имеющие в молекуле - малонитрил оказывают существенно большую активность по отношению к бактериям кишечной группы, при этом активность в отношении кокковой микрофлоры и грибов остаются на достаточно низком уровне.

Соединение 2-амино-6-фенил-4-(дицианометилен)-3-азабицикло-[3.1.0]-гекс-2-ен-1,5-дикарбонитрил оказывает выраженную фунгицидную активность, а так же высокую МПК по отношению к кокковой микрофлоре. При этом для дальнейших исследований было выбрано соединение 2-{амино[3-(4-фторфенил)-2-цианооксиран-2-ил]метилен} малононитрил так как это соединение проявляем активность к наибольшему числу возбудителей.

Производные пиридинов - гетероциклические соединения, содержащие в своём составе никотиновую кислоту или её амид, что обуславливает широкую биологическую активность.

Наибольшую активность среди изученных производных пиридинов проявили 2-галоген-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-3,4-дикарбонитрилы. Активность соединений существенно изменяется в зависимости от галогена входящего в состав молекулы, что подтверждается данными лабораторных исследований. Производные данного соединения показали результаты показавшие их перспективность для дальнейших исследований. Особый интерес представляет 2-йод-5,6,7,8-тетрагидрохонололин-3,4-дикарбонитрил, имеющий в составе йодный радикал, что позволяет предположить высокую активность и низкую скорость развития резистентность у патогенов.

Производные изатина - показали высокую активность в отношении грамм положительной микрофлоры, однако, их активность в отношении бактерий кишечной группы была незначительной.

Наибольшую активность среди производных изатина проявил 1-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензил)-1Н-индол-2,3дион, МПК которого составил 24мкг/мл для St. aureus.

Соединения ЧАС показали достаточно высокую активность в отношении широкого спектра микроорганизмов. При этом соединения с МПК125мкг/мл считали перспективными.

К основным элементам структуры, которые обуславливают противомикробные свойства ЧАС, относятся гидрофильные полярные четвертичные аммониевые группы и гидрофобные углеводородные радикалы. ПМА в гомологических рядах моно- и бис- четвертичных аммониевых солей зависит от типа заместителей у атома азота, длины углеродной цепи радикала, степени его насыщенности и разветвленности, наличия гидроксильных, эфирных групп и т.п. Соединения, содержащие короткоцепочечные углеводородные радикалы (С<8) у атома четвертичного азота, лишены или проявляют умеренные противомикробные свойства. Увеличение количества атомов углерода в радикале приводит к появлению поверхностной активности и вместе с ней противомикробных свойств. Активность повышается при введении в структуру ЧАС ненасыщенных углеводородных радикалов, ассиметричного атома азота, простых эфирных связей.

Как видно из таблицы 3, наибольшую активность показали: алкилбензилдиметиламмоний хлорид (С12-14) и децилдиметиламмоний хлорид обладающие поверхностно активным действием, за счет достаточно длинной углеродной цепи. Механизм их антимикробного действия связан с нарушением проницаемости мембран клеток, позволяя проникать в них низкомолекулярным соединениям, а также наличием в составе молекулы заряженного пятивалентного азота.

Таким образом, на основании углублённых и доклинических исследований соединений 2-йод-5,6,7,8-тетрагидрохонололин-3,4-дикарбонитрил и 2-{амино[3-(4-фторфенил)-2-цианооксиран-2-ил]метилен}малононитрил выявлено, что соединения проявляют высокую противомикробную активность по отношению к штаммам грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, выделенных от больных животных (в том числе полирезистентным штаммам): Ps. aeruginosa, Kl. pneumonia, St. aureus, St. epidermidis, Sal. haemolyticus, E. faecalis, Str. pneumonia, S. pyogenes и С. albicans.

При изучении противостафилококковой активности соединений установлены минимальные бактериостатические и бактерицидные концентрации, равные 1,5-6,2 мкг/мл.

Установлена зависимость активности соединений в группе 2-галоген-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-3,4-дикарбонитрилов установлена зависимость биологической активности от галогенового радикала. Достоверно установлена наибольшая активность йод содержащих соединений.

Для увеличения эффективности, а также времени возникновения резистентности было решено использовать сочетание алкилбензилдиметиламмоний хлорида и децилдиметиламмоний хлорида показавших высокую эффективность в ходе скрининговых исследований.

3.2 Токсические свойства соединений.

Для проведения опыта использовали крысятях с живой массой 99,6 Ц110,8г, отобранных по методу аналогов. Животным внутрижелудочно вводили определённую дозу препарата: 550, 800, 1200, 1600, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000 и 6000 мг/кг, после чего за ними велось постоянное клиническое наблюдение в течение 24 часов.

За 4 часа до начала опыта кормление и поение опытных животных прекращалось. Выбранные дозы препарата вводились крысятам внутрь в виде водного раствора при температуре 37С, после чего они помещались в клетки. Через два часа после введения препарата животным предоставляли свободный доступ к воде и пище.

В процессе проведения опыта было установлено, что после введения соединений животным в дозах 4000, 5000, 6000 мг/кг, у крыс проявлялось сильное беспокойство в течение 15 - 30 минут, которое затем переходило в угнетение. Через три часа после введения препарата отмечалась диарея. Спустя пять часов с момента введения 2-йод-5,6,7,8-тетрагидрохонололин-3,4-дикарбонитрила у животных, которым ввели соединение, в дозе 6000 мг/кг наблюдали клонические судороги и непроизвольное мочеиспускание. Животные не отвечали на внешние раздражители и, через несколько минут, констатировали гибель.

Исходя из факта гибели опытных животных, не перенёсших дозу 6000 мг/кг живой массы, и оставшихся в живых животных с введённой дозой - 3000мг/кг живой массы, по условию методики была выбрана средняя между двумя крайними дозами 4500мг/кг.

В процессе проведения опыта было установлено, что после введения препарата животным в дозах 3000, 4000, 5000 мг/кг, у крыс проявлялось сильное беспокойство в течение 15 - 30 минут, которое затем переходило в угнетение. Через три часа после введения препарата отмечалась диарея. Спустя пять часов с момента введения 2-{амино[3-(4-фторфенил)-2-цианооксиран-2-ил]метилен}малононитрил у животных которым ввели 5000мг/кг наблюдали клонические судороги, непроизвольное мочеиспускание. Животное не отвечало на внешние раздражители и через несколько минут погибало.

Исходя из факта гибели животных, не перенесших дозу 5000 мг/кг живой массы, и оставшегося в живых животного получившего дозу - 2500мг/кг живой массы, по условию методики была выбрана средняя между двумя крайними дозами 3750мг/кг.

После предварительного нахождения LD50, у 2-йод-5,6,7,8-тетрагидрохонололин-3,4-дикарбонитрила доза составила 4500 мг/кг живой массы, а у 2-{амино[3-(4-фторфенил)-2-цианооксиран-2-ил]метилен} малононитрил 3750 мг/кг, дозы были введены двум группам животных по 10 крыс в каждой, подобранных по принципу пар-аналогов по полу и живой массе. С соблюдением всех условий, как в опыте по предварительному нахождению смертельной дозы. По результатам опыта установлена гибель 50% животных.

Доза 3000 мг/кг живой массы тела, не вызвавшая гибель животных, является максимально переносимой дозой препарата при его однократном пероральном введении для 2-йод-5,6,7,8-тетрагидрохонололин-3,4-дикарбонитрила (LD0). Доза 4500 мг/ кг живой массы является средней смертельной дозой при однократном введении (LD50). Доза 5000 мг/кг массы тела является - абсолютно смертельной (LD100).

Следовательно, вещество 2-йод-5,6,7,8-тетрагидрохонололин-3,4-дикарбонитрил по классификации химических веществ, при однократном оральном пути введения относится к III классу токсичности - умеренно токсические вещества. Данный опыт был также проведён по отношению 2-{амино[3-(4-фторфенил)-2-цианооксиран-2-ил]метилен} малононитрила.

Исследование острой токсичности данных соединений на мышах показало их принадлежность к классу низко токсичных соединений (3-й класс опасности). Величина ЛД50 соединений 2-Йод-5,6,7,8-тетрагидрохонололин-3,4-дикарбонитрил и 2-{амино[3-(4-фторфенил)-2-цианооксиран-2-ил]метилен} малононитрил равна 4500,0 и 3750,0 мг/кг т.е. они в 14,5-17,4 раза менее токсичны, чем эталонный препарат (натриевая соль мефенамовой кислота).

3.3 Биологическое действие препарата албиоцид.

При концентрации препарата албиоцид то 2% до 0,125% включительно рост всех микроорганизмов отсутствовал. Данные изучения бактериальной активности препарата приведены в таблице 4.

Таблица 4. Бактерицидное действие препарата албиоцид на E.coli и St.aureus

Тест-культура	Концентрация препарата, % при экспозиции 30 мин. и расходе препарата 350мл/м2
	3%	1%	0,5%	0,05%	0,005%
	Результаты обезвреживания
Escherichia coli (K-88)	-	-	-	-	+
Staphylococcus aureus (spp.)	-	-	-	-	+

Приведённые в таблице 4 данные свидетельствуют, о высоком бактерицидном действии препарата. Из данных таблицы видно, что инактивация кишечной палочки (Escherichia coli) произошла при обработке тест-объектов рабочим раствором препарата албиоцид при концентрации 0,05% экспозиции 30 мин. Инактивация золотистого стафилококка произошла при концентрации рабочего раствора препарата албиоцид 0,05%, экспозиции 30 мин. Опыт проводился на тест-объектах без использования органической защиты тест-культур.

3.4 Фармако - токсикологические свойства препарата албиоцид.

Острая токсичность. Данные смертельного эффекта использовались для определения параметров - LD16, LD50 и LD84. По результатам токсикологических исследований установлено, что ЛД50 препарата албиоцид составило - 4,61г/кг, что свидетельствует о его принадлежности к 3-ему классу умеренно токсичных соединений (ГОСТ 12.1.007-76).

Установлено, что албиоцид не вызывает феномен Артюса-Сахарова. У всех опытных животных после шестикратного введения препарата на месте инъекций не отмечалось характерных для геморрагического воспаления признаков (отеки, уплотнения). Сразу после инъецирования в местах укола образовывались небольшие инфильтраты, размером с маленькую горошину и отек, вызванные травматическим повреждением кожи, которые рассасывались в течение 3-24 часов.

Субхроническая токсичность. Препарат задавали ежедневно в различных дозах от LD50 (4600 мг/кг) по схеме представленной в таблице 5.

В IV период погибло 3,3 % животных - одна крыса, на 16-е сутки. В V период погибло 20 % животных - две крысы на 18-е сутки, три крысы на 19-е сутки, одна крыса на 20-е сутки. В VI период погибло 10 % животных от общего числа крыс до начала опыта. Одна крыса погибла на 22-е сутки, две крысы на 24-е сутки. В VII период погибло 10 % животных. Две крысы на 26-е сутки и одна крыса на 27-е сутки.

Таблица 5. Субхроническая токсичность препарата албиоцид.

Номер периода	I	II	III	IV	V	VI	VII
Сутки от начала опыта	1-4	5-8	9-12	13-16	17-20	21-24	25-28
Доли от LD50	0,1	0,15	0,22	0,34	0,5	0,75	1,12
Доза от LD50	200	300	440	680	1000	1500	2240
Гибель (%)	0	0	0	3,3	20	10	10
Суммарная доза за период (на 1 кг массы тела)	800	1200	1760	2720	4000	6000	8960
Суммарная доза (на 1 кг массы тела)	800	2000	3760	6030	10030	16030	24990

LD50 при многократном скармливании препарата, суммарная доза препарата за I - V периоды опыта - 10480 мг/кг массы тела животного (800+1200+1760+2720+4000).

Коэффициент кумуляции (Кк) при многократном применении препарата албиоцид рассчитываем по формуле Ю.С. Кагана и В.В. Станкевича (1964): Кк = LD50 хроническая/ LD50 острая , Кк = 10480 : 4600 = 2,28.

Коэффициент кумуляции равен 2,28 что относит препарат ко второй группе - вещества с выраженной кумуляцией (по Л. И. Медведю, 1964)

Таблица 6. Влияние албиоцид на показатели крови крыс (Мm)

Показатель	IЦпериод 1Ц4 сутки		IIЦпериод 5Ц8 сутки		IIIЦпериод 9Ц 12 сутки		VIЦпериод 13Ц16 сутки		VЦпериод 17Ц20 сутки
группы	опыт 800 мг/кг	контроль	опыт 1200мг/кг	контроль	опыт 1760 мг/кг	контроль	опыт 2720мг/кг	контроль	опыт 4000мг/кг	контроль
Эритроциты, 1012/л	7,610,23	7,690,33	7,50,33	7,80,33	6,940,15*	7,660,19	7,80,27	6,370,33	7,920,44	6,90,66
ейкоциты, 109/л	9,771,4	10,561,2	9,890,7	8,940,7	10,61,3	9,740,7	12,61,1	8,561,42	13,381,0	9,11,42
Гемоглобин, г/л	16,30,35	16,70,16	16,10,16	16,91,3	16,30,53	16,80,72	16,40,23	15,61,2	17,40,1	16,10,87
СОЭ, мм/ч	3,30,25	2,40,33	2,91,23	2,70,25	3,11,56	2,50,6	4,71,32	2,40,38	5,30,21	2,60,23
ейкограмма:
Палочкоядерные нейтрофилы, %	2,20,56	3,00,16	2,50,27	2,550,24	2,10,48*	2,90,62	2,40,75	3,01,54	2,31,14	2,91,23
Сегментоядерные нейтрофилы, %	31,64,09	20,33,64	24,12,69	31,751,72	22,13,04	26,63,2	20,31,4	26,30,23	18,40,42	26,13,4
Эозинофилы, %	2,50,87	3,10,98	3,1041*	4,350,53	3,81,29*	4,60,29	3,00,99	4,50,81	2,61,65	4,260,69
Базофилы, %	0,10,1	00	00	0,050,05	0,10,1	00	00	0,10,1	0,10,1	00
Моноциты, %	0,10,1	0,20,12	00	0,20,11	0,10,1	00	0,20,11	0,20,12	00	0,20,11
имфоциты, %	63,74,96	74,24,57	70,72,91	60,951,64	72,33,49	65,83,71	74,51,2	65,40,2	77,53,84	67,41,54

* P<0,05

Влияние албиоцид на показатели крови крыс

В ходе эксперимента по изучению субхронической токсичности препарата албиоцид были проведены гематологические исследования крови от шести животных из каждой группы. Результаты представлены в таблице 6.

Из полученных данных определённый интерес представляет изменение количества лейкоцитов, СОЭ, а также изменения в лейкоцитарной формуле опытных животных.

На 9Ц12 сутки от начала опыта при суммарной дозе препарата албиоцид 1760 мг/кг, происходило прогрессивное возрастание лейкоцитов на 7,8 % по сравнению с начальным периодом (суммарная доза - 800 мг/кг), на 8,1 % по сравнению с контролем и на 26,2 % - на 17Ц20 сутки. Это говорит о нарастающей воспалительной реакции в организме. На 13Ц16 сутки повысилась скорость оседания эритроцитов на 29,8 % по сравнению с началом опыта и на 49 % - по сравнению с контролем. На 13Ц16 сутки повысилась скорость оседания эритроцитов на 29,8 % по сравнению с началом опыта и на 49 % - по сравнению с контролем.

Высокие концентрации албиоцид (800Ц1760 мг/кг) влияют на эритропэз: происходит снижение количества эритроцитов (с 7,61 до 6,95 1012/л) в опытных группах на 9 %, к концу опыта возросло количество клеток на 14 % по отношению к контролю.

Изменения в лейкоцитарной формуле также указывают на происходящие перемены в организме животных опытных групп. Количество лимфоцитов возрастало с увеличением суммарной дозы препарата с 63,7 до 77,5 % и в дозе 4000 мг/кг уже превышало верхнюю границу нормы. На фоне лимфоцитоза происходило снижение количества сегментоядерных нейтрофилов с 31,6 до 18,4 % , что ниже уровня нормы на 7 %. У животных опытных групп выявляли моноцитопению и низкий процент эозинофилов.

Раздражающее действие препарата албиоцид определяли методом конъюнктивальных проб. Реакцию учитывали дважды. После нанесения албиоцид спустя 5 минут наблюдали гиперемию слёзного протока и склеры в направлении к роговицы.

Указанные изменения постепенно не исчезали через 2 - 5 часов, полное исчезновение в течение 48 часов, видимых признаков раздражения конъюнктивы и осложнений не отмечали.

Таким образом, препарат албиоцид проявляет умеренное аллергизирующее и раздражающего действия

3.5 Клинические испытания препарата албиоцид.

Используя Методические указания о порядке испытания новых дезинфекционных, средств для ветеринарной практики, от 06.05.1987г. №739-768-М, и согласно Правилам, проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора МСХ от 15.07.2002. и положительных результатов лабораторных испытаний были проведены производственные испытания эффективности препарата албиоцид. Дезинфекцию проводили препаратом албиоцид на Животноводческой ферме ЗАО Воронцовское Ейского района Краснодарского края.

Из таблицы 7 видно, что общее количество микробных клеток не превышает 30000 тыс. микробных клеток, подсчитанных на пяти чашках Петри, на которые производились смывы-разведения 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000. Коли - титр равен 1,0 или более из этих результатов по Рекомендации по санитарно-бактериологическому исследованию смывов с поверхностей объектов подлежащих ветеринарному надзору, качество проведённой дезинфекции расценивается как удовлетворительное.

Таблица 7. Результаты бактериологических исследований после дезинфекции препаратом албиоцид на животноводческой ферме

Объект	Показатели
Объект	Escherichia coli	Staphylococcus	Анаэробные бактерии	Общее число микробных клеток в 1 мл	Коли-титр.
Стены	Не выявлены	Не выявлены	Не выявлены	до 30000 микр/клеток	-
Кормушки	Не выявлены	Не выявлены	Не выявлены	до 10000 микр/клеток	-
Поилки	Не выявлены	Не выявлены	Не выявлены	от 10000- 20000 микр/клеток	-
Станок	Не выявлены	Не выявлены	Не выявлены	до 10000 микр/клеток	Более 1,0
ворота	Не выявлены	Не выявлены	Не выявлены	до 30000 микр/клеток	1,0
Молоко-провод	Не выявлены	Не выявлены	Не выявлены	до 10000 микр/клеток	1,0
скребок	Не выявлены	Не выявлены	Не выявлены	От 10000 -20000 микр/клеток	1,0

Расчёт себестоимости дезинфекции объектов ветеринарного надзора производили в сравнительном аспекте, по сравнению с используемыми, для этих целей дезинфектантами, при одинаковых затратах на проведение профилактической дезинфекции. При проведении дезинфекции использовали 1%-ный рабочий раствор препарата албиоцид из расчета 350 мл/м2 обрабатываемой поверхности с использованием аэрозольного генератора ДУК - 2 на животноводческой ферме. За аналоги препарата албиоцид использовали препараты на основе четвертично аммониевого соединения мегадез, вироцид и дезолайн. Сравнительная себестоимость обработки 1000м2 препаратом албиоцид с указанными препаратами представлена в таблице 8.

Таблица 8 Сравнительная стоимость препаратов и себестоимость обработки из расчёта на 100м2

Препарат	Стоимость препарата (руб/литр)	Расход препарата л/100м2 методом орошения	Стоимость обработки на 1000м2 (руб)	Концентрация рабочего раствора
Вироцид	479	3,0	1437	1%
Дезолайн	203	4,0	812	1%
Мегадез	770	3,0	2310	1%
албиоцид	350	3,0	1050	1%

Приведённые в таблице 8 данные показывают, что при всех прочих равных затратах на проведение дезинфекции из расчёта на 100 м2 поверхности, дезсредство албиоцид выгодно отличается от выше приведённых препаратов, так как цена обработки указанной площади составляет 1050 руб., что значительно ниже стоимости этой же обработки препаратами: вироцид - 1437 руб. и мегедез - 2310 руб. при качестве обработки не только не уступающем аналогам, но по ряду показателей даже превосходя их.

Стоит отметить возможность полного цикла производства данного препарата из отечественного сырья, так как все высокоэффективные аналоги дезинфицирующих средств на основе ЧАС производятся в странах ЕС и не имеют производственных мощностей на территории России.

ВЫВОДЫ

Проведены скрининговые исследования биологической активности 270 новых химических соединений, из которых 7 были подвержены углублённым исследованиям, по результатом которых два соединения рекомендованы к дальнейшему изучению. По результатам доклинических исследований 2 соединения, 2-йод-5,6,7,8-тетрагидрохонололин-3,4-дикарбонитрил и 2-{амино[3-(4-фторфенил)-2-цианооксиран-2-ил]метилен}малононитрил, показали высокую противомикробную активность. Соединения проявляют высокую противомикробную активность по отношению к штаммам грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, выделенных от больных животных, в том числе: Е. coli, St. aureus, Ps. aeruginosa, Kl. pneumonia, St. epidermidis, Salm. haemolyticus, E. faecalis, St. pneumonia, С. albicans.
Установлена зависимость активности соединений в группе 2-галоген-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-3,4-дикарбонитрилов установлена зависимость биологической активности от галогенового радикала. Достоверно установлена наибольшая активность йод содержащих соединений. Соединения 2-йод-5,6,7,8-тетрагидрохонололин-3,4-дикарбонитрил и 2-{амино[3-(4-фторфенил)-2-цианооксиран-2-ил]метилен} малононитрил принадлежат к классу малотоксичных веществ (III класс опасности).
Разработан новый препарат на основе комбинации ЧАС: алкилбензилдиметиламмоний хлорида и дидецилдиметиламмоний хлорида и глутарового альдегида, для дезинфекции объектов ветеринарного надзора, обладающий высокой активностью к наиболее часто встречающимся патогенным микроорганизмам.
Установлена биологическая активность препарата албиоцид в отношении следующих микроорганизмов: Е. coli, St. aureus, Citrobacter frendii, Staphylococcus epidermidis,Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, и грибов Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes
Установлено, что применение 1% раствора препарата при норме расхода 350мл/м2 и экспозиции 30 минут, эффективно при инфицировании бактериями и грибами относящимися к устойчивым (2-я группа), при которых контроль качества обеззараживания, оценивается по выделению бактерий группы кишечной палочки и стафилококков.
Препарат албиоцид по степени воздействия на организм относится к 3-ему классу, умеренно опасных веществ, в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76. Токсичность препарата ЛД50 составляет 4,6+0,5 г/кг при введении в желудок. Обладает слабо выраженными кумулятивными свойствами и сенсибилизующим действием
Отработаны оптимальные режимы и технологии дезинфекции объектов ветеринарного надзора (животноводческие фермы) раствором препарата албиоцид способом протирания, промывания, погружения, орошения и в виде полидисперсного аэрозоля, которые рекомендуется применять в отсутствие животных.

Экономический эффект составляет 1050 руб. при расходе 3,5 литра концентрата препарата албиоцид на 1000м обрабатываемой поверхности (в ценах 2012 г.).

Препарат албиоцид не представляет экологической и санитарно-гигиенической опасности, так как, обладая свойствами четвертично-аммониевых соединений, не оказывает коррозионного действия и по токсичности относится к умеренно опасным соединениям, что существенно улучшает экологическую обстановку на объектах его применения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Практической ветеринарии предлагаются новый дезинфицирующий препарат - албиоцид. Препарат эффективен при бактериальном загрязнении объектов ветеринарного контроля, для текущей и заключительной дезинфекции.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

Термохимия гетероатомных соединений. Расчет энтопии сгорания образования функционализированных производных изатина. Гуревич П.А., Саттарова Л.Ф., Могильный Н.Г., Писцов М.Ф., Босяков В.И., Сидельникова В.А., Овчинников В.В. Вестник Казанского технологического университета. 2011. № 20. С. 7-10.
Синтез полигексаметиленгуанидин гидрохлорида линейного сгорания. Гуревич П.А., Струнина И.Б., Сапожников Ю.Е., Прохницкий А.В., Могильный Н.Г., Струнин Б.П. Вестник Казанского технологического университета. 2012. № 1. С. 85-89.
Синтез и биологическая активность 2-галоген-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-3,4-дикарбонитрилов. Гуревич П.А., Максимова В.Н., Липин К.В., Ершов О.В., Насакин О.Е., Саттарова Л.Ф., Могильный Н.Г., Струнин Б.П. Вестник Казанского технологического университета. 2012. № 1. С. 90-93.
Синтез оксиранов и циклопропанов на основе арилиденпроизводных димера малонитрила и изучение влияния заместителей в бензольном кольце на биологическую активность. Гуревич П.А., Бардасов И.Н., Михайлов Д.Л., Лыщиков А.Н., Саттарова Л.Ф., Могильный Н.Г., Струнин Б.П. Вестник Казанского технологического университета. 2012. № 6. С. 133-136.
Синтез и асследование антимикробной активности 4- ароил-6-хлорпиридин-3,5-дикарбонитрилов. Гуревич П.А., Карпов С.В., Григорьев А.А., Насакин О.Е., Саттарова Л.Ф., Могильный Н.Г., Струнин Б.П. Вестник Казанского технологического университета. 2012. № 10. С. 195-197.

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по сельскому хозяйству

Blog