Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
АВТУХ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ
СИСТЕМАТИКА АКТИНОМИЦЕТОВ РОДА KRIBBELLA
03.02.03 Микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Пущино - 2012
Работа выполнена в отделе Всероссийская коллекция микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.
Научный консультант: доктор биологических наук Евтушенко Людмила Ивановна Научный консультант: доктор химических наук Шашков Александр Степанович ФГБУН Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН
Официальные оппоненты: Лысак Людмила Вячеславовна доктор биологических наук ФГОУ ВПО Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Факультет почвоведения, кафедра биологии почв, доцент Капаруллина Елена Николаевна кандидат биологических наук ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, лаборатория радиоактивных изотопов, научный сотрудник
Ведущая организация: ФГБУ Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН
Защита состоится л29 июня 2012 г. в 1000 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.
Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., проспект Науки, д. 5.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.
Автореферат размещён на сайтах и
Автореферат разослан л____ мая 2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук Доронина Н.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Представители порядка Actinomycetales (Stackebrandt et al. 1997) выделяются среди других прокариот высоким содержанием ГЦ-пар в ДНК (более 50%), сложной организацией и большими размерами генома (до 12 млн.
п.н.), разнообразием морфологии клеток и жизненных циклов, химического состава клеточной оболочки (Goodfellow et al., 1984; Gao & Gupta, 2012). Актиномицеты превосходят другие группы микроорганизмов по способности синтезировать биологические активные соединения (Anderson & Wellington, 2001). Вместе с тем, значительная часть этих уникальных бактерий с высоким биотехнологическим потенциалом остается неизученной или слабо исследованной в таксономическом аспекте.
К одной из таких групп относится род Kribbella Park et al., 1999 emend. Sohn et al. 2003, который в настоящее время включает 17 видов (www.bacterio.cict.fr). Согласно описанию, представители рода образуют фрагментирующийся вегетативный и воздушный мицелий, имеют тип I клеточной стенки (LL-диаминопимелиновая кислота, отсутствие дифференцирующих сахаров), фосфолипиды типа PIII (фосфатидилхолин в качестве диагностического компонента) и доминирующй менахинон МК-9(Н4). Особенностью рода Kribbella является высокое сходство видов по нуклеотидным последовательностям гена 16S рРНК (97,1Ц99,7/100%) (Kirbi et al., 2010;
Cui et al., 2010; Xu et al., 2012). Этот факт и проблема разграничения близких видов/геномовидов криббелл по традиционным фенотипическим признакам (общая для бактериальной систематики) являются одной из причин того, что система классификации организмов этого рода остается разработанной крайне слабо и не отражает их реального природного разнообразия.
Ключевую роль в развитии систематики актиномицетов в домолекулярный период сыграло изучение хемотаксономических признаков (структура пептидогликана, состав сахаров клеточной стенки, тип менахинонов, фосфолипидов, жирных кислот) (Goodfellow, 1989). Отличия по этим признакам, наряду с обособленным филогенетическим положением организмов, являются определяющим фактором при обосновании выделения нового рода актиномицетов и в настоящее время (Stackebrandt, 2006). Результаты изучения тейхоевых кислот клеточных стенок актиномицетов показали огромное разнообразие этих биополимеров и возможность использования их структур и структурных компонентов для дифференциации видов и групп видов внутри рода (Naumova et al., 2001; Потехина, 2005). Структуры других типов анионных полимеров установлены у представителей отдельных групп и не исследованы в таксономическом аспекте.
Белки и пептиды клетки, регистрируемые методом масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ МС) - другая группа биомолекул, которая в последние годы успешно используется при идентификации и классификации бактерий, преимущественно патогенных (Welker & Moore, 2011). Имеющиеся в литературе данные о МАЛДИ масс-спектрах актиномицетов весьма фрагментарны.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось таксономическое изучение актиномицетов рода Kribbella.
В задачи исследования входило:
1. Формирование рабочей коллекции штаммов рода Kribbella.
2. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК и gyrB и определение филогенетического положения организмов.
3. Изучение культурально-морфологических, физиолого-биохимических и хемотаксономических признаков штаммов рабочей коллекции.
4. Определение состава гликополимеров клеточных стенок криббелл.
5. Анализ МАЛДИ масс-спектров представителй рода Kribbella и выявление таксон-специфичных компонентов спектров.
6. Определение видового состава изученных штаммов на основе принципов полифазной такономии и характеристика новых видов рода Kribbella.
7. Оценка положения рода Kribbella в системе высших таксонов бактерий.
Научная новизна. Методами фазово-контрастной и электронной микроскопии обнаружены ранее неизвестные для рода Kribbella репродуктивные формы (спорангиеподобные структуры, состоящие из полиморфных клеток). В составе сахаров клеточных стенок криббелл обнаружены мадуроза и рамноза, а также 2,3-ди-Oметил--галактоза, найденная у грамположительных бактерий впервые. Впервые у организмов рода Kribbella определён состав гликополимеров клеточной стенки. Обнаружены уникальные тейхулозоновые кислоты (с псевдаминовой кислотой в основной цепи), относящиеся к новому классу биогликанов, и новые структуры тейхуроновых кислот. Выявлены специфичные для криббелл фосфолипиды и компоненты МАЛДИ масс-спектров. Выявлено и охарактеризовано 10 новых видов и предложено дополненное описание рода Kribbella. Предложены новые семейства "Kribbellaceae" и "Actinopolymorphaceae" в составе порядка "Propionibacteriales", а также изменение границ семейства Nocardioidaceae. Для новых и ревизованного семейств определены маркерные (сигнатурные) нуклеотиды гена 16S рРНК; в описания семейств включены фенотипические характеристики.
Практическая значимость. Создана коллекция охарактеризованных штаммов рода Kribbella, выделенных из почв разных регионов России, которые доступны широкому кругу специалистов для дальнейших исследований. Таксономические предложения и полученные данные о нуклеотидных последовательностях генов 16S рРНК и gyrB, компонентах клеточных стенок, МАЛДИ масс-спектров и других фенотипических признаках представителей рода Kribbella способствуют усовершенствованию системы классификации бактерий, развитию экспресс-методов идентификации криббелл на уровне вида и могут быть полезны при решении ряда практических задач эко- и биотехнологии, а также вопросов, касающихся защиты интеллектуальной собственности на штаммы. Полученные результаты могут быть использованы для аннотации геномов, данных метагеномики и метапротеомики, при исследованиях в области биохимии и химии природных полимеров.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийском симпозиуме с международным участием Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов (Москва, 2009); Молодежной школе-конференции с международным участием Актуальные аспекты современной микробиологии (Москва, 2009 и 2010); Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых Биология - наука XXI века (Пущино, 2010); Всероссийском симпозиуме с международным участием Автотрофные микроорганизмы (Москва, 2010); Всероссийской школе-конференции Химия и биохимия углеводов (Саратов, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, приложений.
Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы и 24 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 190 ссылок.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. В работе были исследованы 38 штаммов нокардиоформных актиномицетов, выделенных из образцов почв и лиственного опада различных районов РФ и сохраняемых в рабочем фонде Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ). Штаммы выращивали при 28C в течение 3Ц5 суток на пептонно-дрожжевом агаре (ПДА) (г/л): пептон - 5, дрожжевой экстракт - 3, глюкоза - 5, дигидрофосфат калия - 0,2, агар - 15, рН = 7,2, поддерживали на ПДА при 4C и сохраняли в лиофилизованом виде.
Культуральные и морфологические признаки определяли после инкубирования штаммов на ПДА и ISP-средах (Гаузе с соавт., 1983) в течение 3, 7 и 14 суток.
Морфологические характеристики изучали с помощью фазово-контрастной и электронной микроскопии.
Физиолого-биохимические признаки определяли по стандартным методикам (Методы общей бактериологии под ред. Герхардта, 1984; Методы почвенной микробиологии, 1980; Methods in Microbiology, 2011).
Хемотаксономические признаки. Культуры для анализов выращивали на пептонно-дрожжевой среде и собирали на логарифмической фазе роста. Биомассу отмывали и осаждали центрифугированием. Липиды и менахиноны экстрагировали по ранее описанной методике (Collins et al., 1977). Менахиноны разделяли методом ТСХ, анализировали с использованием ВЭЖХ и масс-спектромет-рии. Полярные липиды определяли методом двумерной ТСХ (Minnikin et al., 1979). Состав жирных кислот изучали с помощью газовой хроматографии (Евтушенко и Зеленкова, 1989).
Изомеры диаминоаминопимелиновой кислоты в гидролизатах клеток определяли методом ТСХ (Staneck & Roberts, 1974). Клеточную стенку получали методом дифференциального центрифугирования из сырого мицелия, разрушенного ультразвуком (Стрешинская с соавт., 1979). Аминокислотный состав клеточной стенки определяли на аминокислотном анализаторе (УHitachiФ, Япония) после гидролиза (6N HCl, 12 ч). Состав сахаров в гидролизатах клеточных стенок анализировали методом бумажной хроматографии (TulТskaya et al., 1991). Гликополимеры экстрагировали 10% ТХУ, выделяли методом гель-хроматографии и подвергали кислотному гидролизу. Состав полученных компонентов изучали методами препаративного электрофореза и бумажной хроматографии с использованием различных проявителей (TulТskaya et al., 1991). Структуры гликополимеров определяли с использованием различных методов ЯМР-спектроскопии (Shashkov et al., 2001, 2009).
Для МАЛДИ масс-спектрометрии суспензию клеток в 50%-ном растворе ацетонитрила, содержащего 2,5% ТФУ, обрабатывали ультразвуком (30 мин, 37С) с рабочей частотой 35 кГц. В качестве матрицы использовали -циано-4-гидрокси коричную кислоту в 50%-ном водном растворе ацетонитрила. Масс-спектры регистрировали на приборе Autoflex II (УBrukerФ, Германия) как описано (Plotnikova et al., 2011), и обрабатывали с использованием программ Flex analysis 2.2 и MALDI Biotyper 2.0 (УBruker DaltonicФ, Германия).
Генотипические характеристики и филогенетический анализ. Содержание ГЦ-пар в ДНК определяли методом тепловой денатурации (Marmur & Doty, 1962).
ДНК-типирование проводили методом мультиплексного ПЦР с использованием праймеров (5'-ACCGGATACGACAACCGATT-3' и 5'-GGGTCCGTAAGGGTCCTAT-3'), специфичных для родов Kribbella и Nocardioides (Cook & Meyers, 2003). Для амплификации фрагмента гена 16S рРНК использовали универсальные бактериальные праймеры 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и 1492r (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3').
Фрагменты гена gyrB амплифицировали с использованием праймеров KgyrB-F9(5'-CSGTGCACACBTTCGCGAACG-3') и KgyrB-R1892 (5'-CCSAGRCCCTTGWAGCGCTGG-3') (Kirby et al., 2010). Последовательности нуклеотидов определяли на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL (УBeckman CoulterФ, США) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Филогенетический анализ и построение дендрограмм проводили с помощью программы MEGA 5 (Tamura et al., 2011). Уровни сходства нуклеотидных последовательностей определяли с помощью алгоритмов на сервере EzTaxon (www.eztaxon.org; Chun et al., 2007).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Формирование коллекции По результатам ДНК-типирования из 38 штаммов были отобраны 15 потенциальных представителей рода Kribbella (табл. 1), которые были охарактеризованы на филогенетическом и фенотипическом уровне.
Таблица 1. Источники выделения изученных штаммов № Номер штамма Источник выделения 1 ВКМ Ac-2500 Луговая почва, Мордовия 2 ВКМ Ac-2527 Каменистая почва, Северный Кавказ 3 ВКМ Ac-2538 Техногенная почва, п. Никель, Оренбургская обл.
4 ВКМ Ac-2539 Листва опада, г. Туапсе, Краснодарский край 5 ВКМ Ac-2540 Садовая почва, Мордовия 6 ВКМ Ac-2541 Погребённая почва, г. Волгоград 7 ВКМ Ac-2566 Почва, окрестность г. Воткинск, Удмуртия 8 ВКМ Ac-2568 Почва, пойма р. Оки, г. Пущино 9 ВКМ Ac-2569 Почва у ручья, п. Кизитажка, Оренбургская обл.
10 ВКМ Ac-2570 Луговая почва, Калужская обл.
11 ВКМ Ac-2571 Луговая почва, п. Третьяки, Воронежская обл.
12 ВКМ Ac-2572 Чернозём, Белгородская обл.
13 ВКМ Ac-2573 Луговая почва, Калужская обл.
14 ВКМ Ac-2574 Луговая почва, п. Третьяки, Воронежская обл.
15 ВКМ Ac-2575 Луговая почва, п. Третьяки, Воронежская обл.
2. Филогенетический анализ и генотипические признаки Содержание ГЦ-пар в ДНК изученных штаммов составило 65Ц67 мол.%, что соответствует содержанию ГЦ-пар у описанных видов рода Kribbella.
Филогенетическое положение изученных штаммов на основе анализа гена 16S рРНК (около 1400 п.н.) представлено на рис. 1.
ВКМ Ac-25Kribbella aluminosa HKI 0478T (EF126967) 0.ВКМ Ac-25ВКМ Ac-25ВКМ Ac-25Kribbella swartbergensis HMC25T (AY995147) ВКМ Ac-25ВКМ Ac-25ВКМ Ac-25Kribbella jejuensis HD9T (AY253866) Kribbella solani DSA1T (AY253862) Kribbella hippodromi S14T (EF472955) Kribbella karoonensis Q41T (AY995146) ВКМ Ac-25Kribbella lupini LU14T (AJ811962) ВКМ Ac-25ВКМ Ac-25 Kribbella sandramycini KAAC 20249T Kribbella yunnanensis YIM 30006T (AY082061) Kribbella sancticallisti BC633T (AM778577) Kribbella antibiotica YIM 31530T (AY082063) Kribbella ginsengisoli Gsoil 001T (AB245391) Kribbella koreensis LM 161T (Y09159) ВКМ Ac-25Kribbella catacumbae BC631T (AM778574) ВКМ Ac-25ВКМ Ac-25 ВКМ Ac-251Kribbella alba YIM 31075T (AY082062) Kribbella amoyensis XMU 198T (HM368615) Kribbella flavida IFO 14399T (AF005017) ВКМ Ac-25Рис. 1. Филогенетическое положение штаммов рода Kribbella на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК; группировка по методу ближнего соседа (Уneighbor-joiningФ). Масштаб - одна замена на каждые 100 нуклеотидов. Указаны значения статистической достоверности порядка ветвления для 1000 альтернативных деревьев (выше 50%). В качестве внешней группы использована нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК Streptomyces avermitilis Ma-4680T (BA000030).
Уровни сходства изолятов с типовыми штаммами видов криббелл - от 97,01% (для ВКМ Ас-2527ЦK. jejuensis) до 99,70% (для ВКМ Ac-2540ЦK. hippodromi). Эти значения соответствуют показателям сходства между известными видами рода Krib bella (97,1Ц99,7/100%). ВКМ Ас-2527 с уровнем сходства 97,0Ц98,3% по отношению ко всем включённым в филогенетический анализ организмам занимал обособленное положение при всех алгортимах построения деревьев. Штаммы ВКМ Ac-2566, ВКМ Ac-2569, ВКМ Ac-2571 и ВКМ Ac-2574 (лгруппа ВКМ Ас-2566) имели идентичные последовательности. Другие пары наиболее близких изолятов имели 99,92% сходства (ВКМ Ac-2500 и ВКМ Ac-2568) и 99,72% (ВКМ Ac-2538 и ВКМ Ac-2572).
Филогенетическое положение изученных штаммов на основе анализа фрагмента гена gyrB (390 п.н., позиции 1010Ц1400) представлено на рис. 2.
ВКМ Ac-250. ВКМ Ac-25 ВКМ Ac-25 Kribbella catacumbae DSM 19601T (FJ917358) Kribbella yunnanensis DSM 15499T (EU434815) Kribbella sancticallisti DSM 19602T (FJ917357) Kribbella lupini DSM 16683T (EU434811) Kribbella alba DSM 15500T (EU434820) Kribbella koreensis CIP 108301T (EU434810) Kribbella ginsengisoli DSM 17941T (JF775846) Kribbella flavida CIP 107494T (gEU434809) Kribbella amoyensis XMU 198T (JF520392) ВКМ Ac-25ВК М Ac-25 ВКМ Ac-25 ВКМ Ac-25 ВКМ Ac-25Kribbella swartbergensis DSM 17345T (EU434808) ВКМ Ac-25Kribbella sandramycini DSM 15626T (EU434812) ВКМ Ac-25Kribbella jejuensis CIP 108509T (EU434818) Kribbella hippodromi DSM 19227T (EU434817) Kribbella solani CIP 108508T (EU434813) Kribbella antibiotica DSM 15501T (EU434819) ВКМ Ac-25Kribbella aluminosa DSM 18824T (EU434807) Kribbella karoonensis DSM 17344T (EU434816) Streptomyces avermitilis MA-4680T (BA000030) Рис. 2. Филогенетическое положение штаммов рода Kribbella на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента (390 п.н.) гена gyrB; группировка по методу ближнего соседа (Уneighbor-joiningФ). Масштаб - десять замен на каждые 100 нуклеотидов. Указаны значения статистической достоверности порядка ветвления для 1000 альтернативных деревьев (выше 50%).
Показатели эволюционных расстояний между изученными штаммами и описанными видами рода Kribbella, равные 0,031Ц0,121 (87,6Ц96,1% сходства фрагментов гена gyrB), выше минимальных значений между близкими описанными видами:
0,008 (K. ginsengisoliЦK. koreensis), 0,013 (K. solaniЦK. antibiotica) и 0,015 (K. solaniЦ K. hippodromi). Значения расстояний между более удаленными известными видами - от 0,028 до 0,128. Минимальные показатели эволюционных расстояний между изученными штаммами, равные 0,008 и 0,018 (99,4 и 98,1% сходства фрагментов гена gyrB), выявлены для пар штаммов ВКМ Ac-2566ЦВКМ Ac-2574 (100% сходства по гену 16S рРНК) и ВКМ Ac-2500ЦВКМ Ac-2568 (99,9% сходства по гену 16S рРНК).
Показатели расстояний между ВКМ Ас-2569 и штаммами ВКМ Ac-2566 и ВКМ Ac2574 - 0,038 и 0,036.
3. Культурально-морфологические признаки На всех ISP-средах цвет колоний изученных штаммов бесцветный или слегка желтоватый, растворимые пигменты отсутствовали. Колонии на ранних стадиях роста плотные или пастообразные, складчатые, иногда гладкие, матовые, обычно вросшие в агар. Белый воздушный мицелий образуется на ряде сред в течение 5Цсуток. Тонкие разветвлённые вегетативные и воздушные гифы слабо или интенсивно фрагментируются с возрастом на палочковидные неподвижные элементы (рис.
3а). Морфология изученных штаммов характерна для описанных видов криббелл.
Рис. 3. Морфология клеток штамма ВКМ Ac-2538. Световая (а, б) и электронная (в) микроскопия.
У ряда штаммов при росте на жидкой и агаризованных средах наблюдались клетки сферической и угловатой формы (рис. 3а). Штаммы ВКМ Ас-2538 и ВКМ Ас-2541 формировали спорангиеподобные структуры (рис. 3б, 3в), достигавшие мкм в диаметре в свежевыделенных культурах. Электронно-микроскопическое изучение срезов этих структур выявило наличие плотных конгломератов полиморфных клеток, делящихся септами в продольном и поперечном направлениях (рис. 3в). При помещении в жидкую среду клетки прорастали, образуя гифы. Подобная морфология и способы репродукции свойственны ряду актиномицетов (Geodermatophilus, Modestobacter и др.), но не были ранее описаны для представителей рода Kribbella.
4. Физиолого-биохимические признаки Все штаммы росли в аэробных условиях при 28С и концентрации NaCl ниже 4%, не росли при 7% NaCl, а также при температурах 6 и 50С. Почти все штаммы были способны расти при pH 5Ц11 и не росли при pH 4. Все или большинство штаммов использовали в качестве единственного источника углерода различные моно- и дисахариды, несколько слабее был рост на полиолах. Не росли на метаноле в качестве источника углерода. Несколько штаммов росли на среде без добавления источников углерода, а также в микроаэрофильных условиях на среде с глюкозой. Все штаммы были каталазоположительные, разжижали желатин (табл. 4, стр. 16).
5. Хемотаксономические признаки Все штаммы содержали в клеточной стенке LL-диаминопимелиновую кислоту и глицин (тип пептидогликан A3; Shleifer & Kandler, 1972), а также маннозу и галактозу в разных количествах. У одиннадцати штаммов обнаружена глюкоза, у ВКМ Ac-2527 - рамноза. Шесть штаммов содержали мадурозу и редкий сахар 2,3ди-O-метилгалактозу, ранее найденный в составе липополисахарида фотосинтезирующих бактерий (Weckesser et al., 1979). Доминирующий менахинон у всех штаммов - МК-9(Н4). В составе фосфолипидов обнаружены фосфатидилхолин, фосфатидилинозит, фосфатидилглицерин и дифосфатидилглицерин (тип фосфолипидов PIII), а также неидентифицированный полярный липид L1 и 2Ц5 минорных компонентов (гликолипиды, фосфолипиды и липиды) (рис. 4).
Рис. 4. Состав полярных липидов представителей изученных штаммов рода Kribbella.
Состав жирных кислоты изученных штаммов характерен для рода Kribbella.
Преобладали anteiso-15:0 (19,1Ц40,4%) и iso-16:0 (11,0Ц35,2%) кислоты. У всех изученных штаммов также обнаружены кислоты, которые ранее отмечались у большинства [iso-15:0 (3,6Ц14,5%)] или отдельных видов рода [anteiso-17:0 (5,5Ц17,1%), iso-17:0 (3,6Ц13,2%), iso-17:1 (4,0Ц12,2%), iso-14:0 (0,9Ц8,8%), 16:0 (0,7Ц3,0%) и 16:17cis (0,2Ц3,0%)]. У штаммов ВКМ Ac-2500, ВКМ Ac-2538 и ВКМ Ac-2541 обнаружены в минорных количествах 2-OH-iso-17:0 и 11Me-18:1 кислоты, у ВКМ Ac 2570 - 10Ме-17:0. По процентному содержанию доминирующих типов жирных кислот и их гомологов среди изученных штаммов выделялись штаммы ВКМ Ac-2527 и ВКМ Ас-2538, у которых преобладали изо-разветвленные кислоты iso-14:0, iso-16:и iso-18:0 (в сумме), и восемь штаммов (ВКМ Ac-2539, ВКМ Ac-2540, ВКМ Ac2568, ВКМ Ac-2569, ВКМ Ac-2572, ВКМ Ac-2573, ВКМ Ac-2574 и ВКМ Ac-2575), у которых доминировали антеизо-разветвленные кислоты anteiso-15:0 и anteiso-17:0.
6. Гликополимеры клеточных стенок Наряду с пептидогликаном, клеточные стенки всех изученных штаммов содержали нейтральный гликополимер (разветвлённый маннан), а также по два или три разных по структуре анионных полимера (табл. 2), в числе которых тейхоевая кислота (ТК), две тейхуроновые (ТУК-1 и ТУК-2) и три тейхулозоновые кислоты (ТУЛК-1, ТУЛК-2 и ТУЛК-3).
Таблица 2. Гликополимеры клеточных стенок изученных штаммов Нейтральный Анионные Штаммы полимер полимеры ВКМ Ac-2566, ВКМ Ac-2570, ВКМ Ac-2571, ВКМ Ac-2573 Маннан ТК, ТУК-ВКМ Ac-2538, ВКМ Ac-2540, ВКМ Ac-2569, ВКМ Ac-2574 Маннан ТУК-ВКМ Ac-2539 Маннан ТУК-ВКМ Ac-2541 Маннан ТУЛК-ВКМ Ac-2500, ВКМ Ac-2568 и ВКМ Ac-2575 Маннан ТУЛК-ВКМ Ac-2527 Маннан ТУЛК-ВКМ Ac-2572 Маннан ТУК-2, ТУЛК-Полимерная цепь маннана (более 20 повторяющихся звеньев) образована -1,6связанными остатками маннопиранозы, замещённых в положении 2 терминальными остатками -маннопиранозы. Полимер такой структуры найден у прокариот впервые. Наличие разветвлённого маннана в клеточных стенках всех изученных штаммов и маннозы у большинства известных видов криббелл (отсутствует у K. gingengisoli, K. hippodromi и K. lupini), позволяют полагать, что этот полимер может являться хемотаксономическим маркером рода Kribbella.
Тейхоевая кислота - 1,3-поли(глицерофосфат), частично замещённый -глюкозой, найдена в препаратах клеточных стенок четырёх изученных штаммов. Подобный полимер ранее обнаружен в клеточных стенках ряда актиномицетов и других групп грамм-положительных бактерий.
Тейхуроновые кислоты найдены у десяти изученных штаммов и представлены двумя структурами, неизвестными ранее:
4)--D-Manp2,3NAcA-(16)--D-Glcp2,3NAc-(1 (ТУК-1) 4)--D-ManpNAcA-(16)--D-Glcp2,3NAc,4OAc-(1 (ТУК-2) В основной цепи тейхулозоновых кислот, обнаруженных у шести штаммов, присутствуют остатки сиалоподобного кислого моносахарида - 5,7-диацил-амидо3,5,7,9-тетрадезокси-L-глицеро--L-манно-нонулозоновой кислоты (-псевдаминовой кислоты, -Pse), ацилированные по N7 остатками 4-гидрокси-бутирата (Bu), которые гликозилированы по О4 остатком Pse или другим моносахаридом, входящим наряду с Pse в основную цепь полимера. Гидроксильная группа при С4 Pse обычно замещена остатками моносахаридов: 3-O-метил--галактозы (-Galp3OМe), 2,3-ди O-метил--галактозы (-Galp2,3 OМe) или L-рамнозы (-L-Rhap). Длина цепей полимеров примерно 30Ц40 сахарных остатков в цепи с -Pse и -галактозой.
Повторяющееся звено ТУЛК-1:
-Pse OH COOH H3C O Bu O N ТУЛК-1:
H RO R = H (45%), -D-Galp3OMe (37%), O NHAc -D-Galp2,3OMe (18%).
ТУЛК-2 представляет собой гетерополимер, в котором преобладающие фрагменты A с остатками -Galp, Bu и -Pse в основной цепи нерегулярно чередуются с фрагментами B:
B A OH -Pse OH -Pse COOH COOH H3C H3C O O O O N N H H -D-Galp RO RO HO O O Bu Bu NHAc NHAc O HO ТУЛК-2: R = H или -D-Galp3OMe, или -D-Galp2,3OMe.
OH ТУЛК-3:
R = -D-Galp3OMe, или -D-Galp2,3OMe, или -L-Rha.
O ТУЛК-3 отличается от ТУЛК-2 наличием остатков -L-Rhap (наряду с Galp3OMe и -Galp2,3OМe) в положении 4 остатков Pse.
Новый класс гликополимеров с альдулозоновыми кислотами в основной цепи, названный тейхулозоновыми кислотами (Knirel, 2009), был открыт сравнительно недавно (Shaskov et al., 2000). Тейхулозоновые кислоты обнаружены пока только в клеточных стенках ряда актиномицетов (Shaskov et al., 2000; 2002; Тульская с соавт., 2007а, 2011). Во всех описанных ранее случаях эти полимеры содержали 3-дезоксиD-глицеро-D-галакто-нон-2-улозоновую кислоту (Kdn). Тейхулозоновые кислоты с псевдаминовой кислотой найдены впервые. Производные псевдаминовой кислоты обнаружены ранее в составе липополисахаридов грамотрицательных бактерий (Knirel et al., 2003; Schoenhofen et al., 2006; Vimr et al., 2004).
7. МАЛДИ масс-спектры Анализ МАЛДИ масс-спектров 15 изученных штаммов показал, что спектры имели до 40 пиков и значительно различались по числу и составу компонентов.
Дендрограмма, отражающая сходство штаммов по МАЛДИ масс-спектрам, представлена на рис. 5.
Штаммы ВКМ Ac-2566, ВКМ Ac-2569 и ВКМ Ac-2574 с идентичными нуклеотидными последовательностями гена 16S рРНК имели 23 одинаковых компонента масс-спектра и формировали общий кластер, в то время как штамм ВКМ Ac-25значительно отличался от них по составу спектра (всего пять общих пиков с этой группой) и занимал обособленное положение на дендрограмме (рис. 5, 6).
Рис. 5. Дендрограмма, отражающая сходство изученных штаммов по МАЛДИ масс-спектрам.
Рис. 6. МАЛДИ масс-спектры штаммов ВКМ Ac-2566 и ВКМ Ac-2571.
Масс-спектры штаммов ВКМ Ac-2500 и ВКМ Ac-2568 (99,9% сходства по нуклеотидным последовательностям гена 16S рРНК, содержали 13 общих компонентов.
Спектры штаммов ВКМ Ac-2500, ВКМ Ac-2538 и ВКМ Ac-2541, кластерирующихся вместе, имели десять общих пиков. Спектры остальных штаммов содержали от пяти до десяти общих пиков. У всех изученных штаммов выявлены четыре общих пика (m/z = 4372, 5200, 5543, 5577 Да) разной интенсивности, которые могут являться хемотаксономическими маркерами рода Kribbella.
8. Видовой состав изученных штаммов Из полученных результатов следует, что изученные штаммы и описанные виды рода Kribbella имеют более 97% сходства генов 16S рРНК (1400 п.н.). Для отнесения штаммов к новому виду при таких уровнях сходства требуется в общем случае ДНК-ДНК гибридизация (Stackebrandt et al., 2002; Tindal et al., 2010). Однако для видов рода Kribbella было показано, что уровень сходства ДНК хорошо согласуется с показателями эволюционного расстояния, определённого по фрагментам гена gyrВ длиной 1108 и 390 п.н. (позиции 292Ц1400 и 1010Ц1400) (Kirbi et al., 2010; Cui et al.
2010; Xu et al., 2012). При этом значения эволюционных расстояний для большинства видов, вычисленных по фрагменту 390 п.н., равны или выше 0,028 даже при уровнях сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК более 99%.
Для трёх пар видов эти показатели ещё ниже (0,008; 0,013; 0,015) (рис. 7а).
Минимальные показатели эволюционных расстояний (gyrВ) между изученными штаммами и описанными видами рода Kribbella при любых значениях сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК не ниже 0,031 (рис. 7б). Вышеизложенные данные, а также значительные отличия от известных видов по фенотипическим признакам, в том числе, по составу сахаров и гликополимеров клеточных стенок, свидетельствуют о том, что все изученные штаммы, для которых определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена gyrВ, относятся к нескольким новым видам рода Kribbella.
Представителями шести новых видов являются штаммы ВКМ Ac-2500, ВКМ Ac-2539, ВКМ Ac-2540, ВКМ Ac-2566, ВКМ Ac-2570 и ВКМ Ac-2572, эволюционные расстояния между которыми находятся в интервале от 0,044 до 0,097 (табл. 3).
Эти штаммы отличаются также на фетотипическом уровне (табл. 4).
Новый вид представляет собой и штамм ВКМ Ac-2538, близкий к ВКМ Ac-25по нуклеотидным последовательностям фрагментов генов 16S рРНК (99,7%) и gyrB (эволюционное расстояние 0,026), но отличающийся от него по морфологии (образует спорангиеподобные структуры), хемотаксономическим признакам (наличию тейхуроновой кислоты, МАЛДИ масс-спектру, составу жирных кислот и полярных липидов) и ряду физиолого-биохимических характеристик (табл. 4).
К новым видам безусловно относятся штаммы ВКМ Ас-2527 и ВКМ Ас-2541, для которых отсутствуют данные по гену gyrB. Штамм ВКМ Ас-2527 наиболее удален от других представителей рода по данным анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК (97,0Ц98,3% сходства; рис. 1) и выделяется наличием в клеточной стенке ТУЛК-3 (гетерополимер с нерегулярной структурой и рамнозой при C4 Pse). От большинства изученных изолятов он отличается минорным количеством маннана, составом жирных кислот (доминируют изо-разветвленные насыщенные iso-14:0 и iso-16:0 - 40%) и рядом других признаков (табл. 4).
(а) Известные виды между собой 100,99,99,98,98,97,97,0,00 0,02 0,028 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,gyrB (390 н.п.), эволюционные расстояния (б) Известные виды с изученными штаммами 100,99,99,98,98,97,97,0,00 0,02 0,028 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,gyrB (390 н.п.), эволюционные расстояния Рис. 7. Сходство нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и эволюционные расстояния (рассчитанные по фрагменту гена gyrB, 390 п.н.) для известных видов рода Kribbella (а) и изученных штаммов по отношению к известным видам (б).
Таблица 3. Эволюционные расстояния между изученными штаммами (по 390 п.н. гена gyrВ) № Штаммы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 ВКМ Ac-252 ВКМ Ac-2538 0,03 ВКМ Ac-2539 0,046 0,04 ВКМ Ac-2540 0,079 0,044 0,05 ВКМ Ac-2566 0,067 0,064 0,085 0,06 ВКМ Ac-2568 0,018 0,077 0,046 0,085 0,07 ВКМ Ac-2569 0,067 0,054 0,077 0,044 0,038 0,08 ВКМ Ac-2570 0,062 0,054 0,085 0,044 0,059 0,067 0,09 ВКМ Ac-2572 0,074 0,026 0,095 0,049 0,056 0,077 0,046 0,010 ВКМ Ac-2573 0,072 0,056 0,097 0,031 0,054 0,077 0,054 0,054 0,011 ВКМ Ac-2574 0,069 0,067 0,082 0,056 0,008 0,079 0,036 0,062 0,059 0,0 Сходство по 16S рРНК, % Сходство по 16S рРНК, % Таблица 4. Характеристики, дифференцирующие изученные штаммы Признак 16S рРНК, % 99.9 99.7 99.3 1gyrB 0.018 0.026 0.031 0.008Ц0.0Морфология М М М М М М, К М М, К М М М М (М),Ф (М),Ф (М),Ф ТУК2 ТК ТК ТК ТК ТУЛК3 ТУЛК2 ТУЛК2 ТУЛК2 ТУК2 ТУЛК1 ТУК1 ТУК1 ТУК1 ТУКПолимеры ТУЛК2 ТУК1 ТУК1 ТУК1 ТУКмад мад мад Сахара клеточ- мад мад мад дмг дмг (глю) дмг (глю) (глю) глю глю глю (глю) (глю) глю ной стенки дмг дмг дмг рам (глю) (глю) Поляр. липиды PL1 PL1 PL1 PLФосфолипиды PL1 PL3 PL1 PL1 PL1 PL1 PL1 PL1 PL2 PL1 - PL2 PL2 PL2 PLG1 G1 G1 G1 G1 G1 G1 G1 G1 G1 G1 GГликолипиды G1 G1 GG3 G2 G3,G4 G3,G4 G2 G3 G3 G2 G3 G3,G4 G2 G3,GЛипиды - L2 L2 - L2 - L2, L3 L2 L2 L2 - Ц - L2 - Жирн. к-ты, % i14:0, i16:0, 40.0 14.4 26.5 19.4 16.5 23.2 21.1 43.8 23.6 18.3 33.6 33.2 21.3 19.9 28.i18: i15:0, i17:0 20.2 13.0 20.0 17.2 16.3 14.2 15.9 15.8 10.1 14.3 7.2 16.8 13.2 12.3 15. a15:0, a17:0 25.2 46.0 33.4 42.8 49.3 37.0 40.0 26.4 43.0 49.4 35.4 35.6 49.7 46.6 36.10, 11Me-разв. - Ц 1.6 - Ц 0.3 - 0.8 - Ц 1.6 - Ц - Ц 17:0 17:0 17:0 i16:1 i16:Другие - Ц 17:0 I16:1 - Ц - i16:1 - 15:i18:1 i18:0 17:1c 17:1c 17:1c Рост при 37С + + - Ц + + + - + + - Ц + + + Рост при 42С - Ц - Ц - + - Ц - Ц - Ц + - Ц NaCl, % 1Ц3 1Ц4 1Ц4 1Ц4 1Ц4 1Ц4 1Ц4 1Ц4 1Ц4 1Ц4 1Ц4 1Ц4 1Ц5 1Ц4 1ЦРост без C - Ц - Ц - + - + + - Ц - Ц + + В микроаэроф.
+ + - Ц - Ц + + + + - + + + + условиях Образов. H2S - + - Ц - Ц - + - Ц - Ц + + + Деградация Гипоксантин - Ц - Ц + + + - + + - Ц - + - Казеин + + - Ц + + + + + + + + + + - Ксантин + + + + + + - + + - + + + + Крахмал - + - + - + + + + + + + + + + Твин-80 - - + - Ц + + + + - + + + L-Тирозин - + - + + + - Ц + - Ц - + + - Уреаза + - - + + + + + + + + + + + Эскулин + - Ц - + + + - + + + + + + + Утилизация L-Арабиноза - + + + + + + + - + + + + + + D-Ксилоза - + + + - + + + + + - + + + + D-Лактоза + + + + + + + + + + - + + + + D-Манноза + + + + + + + + + + - + + + + L-Рамноза - + + + + + + + + + - + + + + Раффиноза - + + + + + + + + + + + + + + Сахароза - + + + + + + + + - Ц + + + + Целлюлоза - Ц - Ц - Ц - Ц - Ц - Ц - Ц Глицерин - + + + + + + + - + - + + + + D-Маннит - + + + + + + + + - Ц + + + + Сорбит - + + + - + - Ц - + - Ц + Примечание: выделенным шрифтом указаны представители новых видов; У+Ф - рост, УФ - слабый рост, УЦФ - рост отсутствует; М - длинный ветвящийся мицелий, Ф - мицелий, быстро распадающийся на фрагменты, К - спорангиеподобные структуры и/или кластеры клеток; ТК - тейхоевая, ТУК - тейхуроновые, ТУЛК - тейхулозоновые кислоты; дмг - 2,3-диметилгалактоза, глю - глюкоза, (глю) - следы глюкозы, мад - мадуроза, рам - рамноза; PL - фосфолипид, G - гликолипид, L - липид.
ВКМ ВКМ ВКМ ВКМ ВКМ ВКМ ВКМ ВКМ ВКМ ВКМ ВКМ ВКМ ВКМ ВКМ ВКМ Ac-25Ac-25Ac-25Ac-25Ac-25Ac-25Ac-25Ac-25Ac-25Ac-25Ac-25Ac-25Ac-25Ac-25Ac-25Штамм ВКМ Ас-2541, наиболее близкий по гену 16S рРНК к ВКМ Ас-2538, ВКМ Ас-2572 и K. sandramycini (99,4, 99,3 и 98,9% сходства), отличается от них и других штаммов криббелл наличием в клеточной стенке мадурозы, 2,3-ди-O-метил--галактозы и ТУЛК-1 (с регулярной структурой); от большинства других изученных организмов - морфологией, относительно бедным спектром полярных липидов, способностью расти на среде без источника углерода и при 42С.
Штамм ВКМ Ас-2575, представитель ещё одного нового вида, наиболее близок к K. alba и K. koreensis по нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК (99,4% и 99,2% сходства). Отличается от них и других описанных видов рода присутствием в клеточной стенке мадурозы и 2,3-ди-O-метил--галактозы и, следовательно, иной структурой или типом гликополимеров. От других близких организмов (K. catacumbae, ВКМ Ac-2539, ВКМ Ac-2500; 99,0-99,1% сходства 16S рРНК) отличается медленным ростом, составом анионных полимеров и липидов, МАЛДИ масс-спектром и физиолого-биохимическими характеристиками.
Помимо перечисленных, к новым видам (подвидам) могут быть отнесены и некоторые другие исследованные нами штаммы, в частности, ВКМ Ас-2573 и представители группы ВКМ Ас-2566, отличные от других организмов по генам gyrB, МАЛДИ масс-спектрам и фенотипическим признакам.
9. Дополнение описания рода Kribbella На основании полученных данных предложено дополненное описание рода Kribbella Park et al. 1999 emend. Sohn et al. 2003, включающее новые признаки рода.
Ряд организмов образует спорангиеподобные репродуктивные структуры, состоящие из плотных конгломератов полиморфных клеток, формирующихся пуём деления септами в продольном и поперечном направлениях. В составе сахаров клеточных стенок ряда видов присутствуют мадуроза, 2,3-ди-O-метил--галактоза и Lрамноза. Клеточные стенки содержат нейтральный гликополимер (разветвлённый маннан). Анионные полимеры различных видов представлены тейхулозоновыми кислотами (с -псевдаминовой кислотой в основной цепи) или тейхуроновыми кислотами (с производными -маннопиранозидов уроновых кислот) и 1,3-поли(глицерофосфат)ом. Виды рода содержат дополнительно от двух до пяти минорных полярных липидов (гликолипиды, фосфолипиды и неидентифицированные соединения). МАЛДИ масс-спектры включают четыре компонента (m/z = 4372, 5200, 5543, 5577 Да) разной интенсивности, характерные для большинства видов рода.
10. Ревизия семейства Nocardioidaceae Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК организмов порядка "Propionibacteriales" (Ludwig et al., 2011), включающего род Kribbella, показал, что представители семейства Nocardioidaceae Nesterenko et al., 1985, 1990 emend. Rainey et al., 1997 emend. Zhi et al., 2009 образуют три кластера, которые находятся примерно на равном филогенетическом расстоянии друг от друга и от кластера семейства Propionibacteriaceae (рис. 8). Каждый кластер имеет уникальный набор сигнатурных нуклеотидов гена 16S рРНК (табл. 5). Представители кластеров, для которых секвенированы полные геномы (Nocardioides sp. JS614 и Kribbella flavida DSM 17836), отличаются также по их размеру (4,99 и 7,58 Mb) и числу генов, кодирующих белки (4645 и 7086) (Copeland et al., 2006; Pukall et al., 2010).
Порядок "Propionibacteriales" Порядок УJiangellales" Порядок "Glycomycetales" Рис. 9. Филогенетическое положение рода Kribbellа и других родов порядка "Propionibacteriales" (анализ выполнен с использованием программы MEGA5).
В соответствии с изложенными данными и современными тенденциями развития системы классификации прокариот три кластера в составе семейства Nocardioidaceae могут быть квалифицирован как отдельные семейства. При такой таксономической структуре рассматриваемой группы более чётко выражены границы семейств в терминах эволюционных расстояний и нуклеотидных сигнатур, и каждое семейство приобретает индивидуальные фенотипические контуры и таксономические маркеры (табл. 5).
Таблица 5. Характеристики семейств Nocardioidaceae nom. rev., "Kribbellaceae" fam. nov.
и "Actinopolymorphaceae" fam. nov.
Nocardioidaceae "Kribbellaceae" "Actinopolymorphceae" Семейство (кластер I) (кластер II) (кластер III) Nocardioides Actinopolymorpha Роды, входящие Aeromicrobium Kribbella Flindersiella в семейство Marmoricola Thermasporomyces 134:305 (GЦT), 371:372 134:305 (AЦC), 371:372 134:305 (GЦC), 371:3Сигнатурные (GЦA), 386 (C), 391:392 (CЦG), 386 (T), 391:392 (CЦA), 386 (C), 391:3нуклеотиды (TЦC), 672 (A), 678:714 (CЦG), 672 (G), 678:714 (TЦG), 672 (G), 678:716S рРНК (TЦG), 736:777 (TЦG) (CЦA), 736:777 (CЦT) (TЦG), 736:777 (CЦG) нефрагментирующиеся Морфологический неправильные палочки нокардиоформы гифы, полиморфизм, тип кокки, нокардиоформы нокардиоформы фрагментация, Способ фрагментация, фрагментация, дробление, выраженное деления клеток бинарное деление дробление почкование Подвижность Ц/+ - Ц анионные: без фосфатов (тейхулозоновые Типы анионные, фосфатсодерили тейхуроновые киполисахаридов жащие (тейхоевые кисло- не определено слоты) или фосфатсоклеточной стенки ты или сахарофосфаты) держащие (тейхоевые);
нейтральные: маннан Тип фосфолипидов PI (PII, PIII у единичных) PIII PI Тип менахинонов 8/4, 9/4 9/4 9/4, 10/4, 11/4, 9/6, 10/Примечание: *новые неодобренные названия таксонов (Ludwig et al., 2011).
Для новых семейств "Kribbellaceae" и "Actinopolymorphaceae" и ревизованного семейства Nocardioidaceae Nesterenko et al. 1985, 1990 emend. Rainey et al., 19emend. Zhi et al. 2009 предложены описания, включающие наборы сигнатурных нуклеотидов генов 16S рРНК, а также фенотипические характеристики.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ По приблизительным оценкам, число видов прокариотных микроорганизмов, обитающих на Земле, составляет около 107Ц109. Принято считать, что организмы пока неописанных видов составляют значительную часть некультивируемых в лабораторных условиях, а также являются компонентами слабо изученных (экстремальных) экосистем и микробных сообществ, ассоциированных с высшими организмами. Результаты проведённых исследований продемонстрировали, что множество новых видов можно обнаружить и среди известных групп относительно легко культивируемых почвенных актиномицетов, имеющих высокий уровень сходства генов 16S рРНК (более 99%) с описанными видами. Метод МАЛДИ масс-спектрометрии позволяет выявить потенциальных представителей новых видов среди филогенетически близких штаммов.
На примере изучения филогенетически близких актиномицетов рода Kribbella показано, что такие организмы могут обладать уникальными свойствами, неизвестными ранее как для генетически близких описанных видов, так и прокариот в целом.
При этом виды, обнаруженные в одном почвенном образце, зачастую различались между собой значительно больше, чем организмы, выделенные из почв географически удалённых районов.
В работе получены новые данные о морфологических структурах, физиологобиохимических свойствах и составе компонентов клетки и клеточной стенки (моносахаров, гликополимеров, фосфолипидов) актинобактерий рода Kribbella. В клеточных оболочках представителей новых видов обнаружены биополимеры с ранее неизвестными структурами - тейхолузоновые кислоты с псевдаминовой кислотой в основной цепи и тейхуроновые кислоты с производными маннопиранозидов уроновой кислоты и редким диаминосахаром. Клеточные стенки всех изученных штаммов содержали маннозу и нейтральный полимер - маннан необычной структуры, обнаруженный у прокариот впервые. На основании полученных в данной работе данных предложена усовершенствованная структура высших таксонов, включающих род Kribbella, а также фенотипические маркеры новых и ревизованного семейств.
Результаты изучения бактерий рода Kribbella, часто ассоциированных с растениями, могут быть полезны для выявления элементов естественной системы, понимания закономерностей функционирования и эволюции популяций, сообществ микроорганизмов и экосистем, для аннотации геномов и данных метагеномики и метапротеомики, а также при исследовании разнообразия природных биополимеров.
ВЫВОДЫ 1. Проведено таксономическое исследование 15 филогенетически близких штаммов рода Kribbella Park et al. 1999 emend. Sohn et al. 2003, выделенных из почв различных регионов России. На основании анализа гено- и фенотипических характеристик установлено, что изученные штаммы представляют собой не менее 10 новых видов.
Эволюционные расстояния между изученными организмами и типовыми штаммами описанных видов (0,031Ц0,121), определённые по фрагменту гена gyrВ, выше минимальных показателей расстояний между известными видами.
2. Впервые у нокардиоформных актиномицетов рода Kribbella обнаружены спорангиеподобные репродуктивные структуры, состоящие из плотных конгломератов полиморфных клеток, образующихся путем деления септами в продольном и поперечном направлениях.
3. В составе сахаров клеточных стенок криббелл впервые найдены мадуроза, L-рамноза и редкий сахар 2,3-ди-O-метил--галактоза; выявлены значимые отличия видов по составу жирных кислот и полярных липидов.
4. У всех изученных штаммов рода Kribbella (впервые у прокариот) обнаружен нейтральный гликополимер, состоящий из -1,6-связанных остатков маннопиранозы с -маннопиранозой в терминальном положении. Анионные гликополимеры представлены ранее неизвестными тейхулозоновыми кислотами, в состав которых входит сиалоподобный кислый моносахарид - псевдаминовая кислота, и тейхуроновыми кислотами, содержащими производные маннопиранозидов уроновой кислоты и диаминоглюкозы. У ряда штаммов найден 1,3-поли(глицерофосфат), замещённый глюкозой.
5. Показано, что метод МАЛДИ масс-спектрометрии позволяет обнаружить потенциальных представителей новых видов среди филогенетически близких штаммов рода Kribbella. Анализ МАЛДИ масс-спектров выявил наличие общих для всех штаммов компонентов (m/z = 4372, 5200, 5543 и 5577 Да), которые являются хемотаксономическими маркерами рода.
6. На основании полученных данных предложено дополненное описание рода Kribbella. Предложны два новых семейства в составе порядка "Propionibacteriales" - "Kribbellaceae" и "Actinopolymorphaceae", ревизован состав семейства Nocardioidaceae. Определены наборы сигнатурных нуклеотидов генов 16S рРНК и предложены фенотипические маркеры новых и ревизованного семейств.
БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает искреннюю благодарность коллегам за помощь и консультации при выполнении работы на различных её этапах и соавторам публикаций: к.б.н.
.М. Барышниковой, к.б.н. Е.В. Арискиной, к.б.н. Б.П. Баскунову, Н.Г. Винокуровой, к.б.н. Л.В. Дорофеевой, к.х.н. Н.Ф. Зеленковой, к.б.н. А.Е. Китовой, В.Я. Лысанской, Н.В. Присяжной, к.б.н. Н.Е. Сузиной (Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН); д.б.н. Е.М. Тульской и к.б.н. Г.М. Стрешинской (Биологический факультет МГУ); к.х.н. С.Н. Сенченковой (Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН).
Работа выполнена при поддержке Программы Президиума РАН Молекулярная и клеточная биология и ФЦП Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007Ц2013 годы (государственные контракты № 16.518.11.7035 и № 16.552.11.7050).
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи 1. Shashkov A.S., TulТskaya E.M., Streshinskaya G.M., Senchenkova S.N., Avtukh A.N., Evtushenko L.I. New cell wall glycopolymers of the representatives of the genus Kribbella // Carb. Res. 2009. V. 344. № 8. P. 2255Ц2262.
2. TulТskaya E.M., Streshinskaya G.M., Shashkov A.S., Senchenkova S.N., Avtukh A.N., Baryshnikova L.M., Evtushenko L.I. Novel teichulosonic acid from cell walls of some representatives of the genus Kribbella // Carb. Res. 2011. V. 346. № 12. P. 2045Ц2051.
3. Автух А.Н., Винокурова Н.Г., Арискина Е.В., Дорофеева Л.В., Барышникова Л.М.
Состав полярных липидов как хемотаксономический маркер видов рода Kribbella // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2011. № 4/1. С. 71.
Тезисы докладов и сообщений 4. Автух А.Н., Присяжная Н.В., Василюк Н.В., Шашков А.С., Винокурова Н.Г., Хасаева Ф.М., Барышникова Л.М. Видовое разнообразие актиномицетов рода Kribbella // Сборник тезисов Молодежной школы-конференции с международным участием Актуальные аспекты современной микробиологии. Москва, октябрь, 2009. С. 3.
5. Автух А.Н., Барышникова Л.М., Тульская Е.М., Шашков А.С., Евтушенко Л.И.
Физиолого-биохимические и хемотаксономические характеристики актиномицетов рода Kribbella // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов. Москва, декабрь, 2009.
6. Автух А.Н., Присяжная Н.В., Малошицкая О.А., Барышникова Л.М., Евтушенко Л.И. Характеристика актинобактерий рода Kribbella с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии // Сборник тезисов 14-ой Пущинской международной школыконференции молодых ученых Биология - наука XXI века. Пущино, апрель, 2010.
Т. 2. С. 209.
7. Автух А.Н., Винокурова Н.Г., Зеленкова Н.Ф., Арискина Е.В., Тульская Е.М., Шашков А.С., Барышникова Л.М. Филогенетические и хемотаксономические характеристики новых актиномицетов рода Kribbella // Сборник тезисов Молодежной школы-конференции с международным участием Актуальные аспекты современной микробиологии. Москва, октябрь, 2010. С. 3.
8. Автух А.Н., Барышникова Л.М., Евтушенко Л.И. Факультативные автотрофы - представители новых актиномицетов рода Kribbella // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием Автотрофные микроорганизмы. Памяти академика РАН Е.Н. Кондратьевой. Москва, декабрь, 2010.
9. Тульская Е.М., Стрешинская Г.М., Шашков А.С., Сенченкова С.Н., Автух А.Н., Присяжная Н.В., Арискина Е.В., Барышникова Л.М. Гликополимеры клеточных стенок как хемотаксономические маркеры актиномицетов рода Kribbella // Сборник тезисов Всероссийской школы-конференции Химия и биохимия углеводов. Саратов, сентябрь, 2011.