Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
Учреждение Российской академии наукИнститут биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Станция искусственного климата Биотрон
На правах рукописи
ДОЛГОВ СЕРГЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ
Система совершенствования сортимента садовых растений методами генетической инженерии
03.01.06. - Биотехнология (в том числе бионанотехнология) ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2011
Официальные оппоненты:
Доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Высоцкий Валерий Александрович, Доктор биологических наук, профессор, Хрусталева Людмила Ивановна.
Доктор биологических наук, член-корр. РАН Лукьянов Сергей Анатольевич
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Центр Биоинженерия РАН.
Защита диссертации состоится л 2011 г., в часов на заседании диссертационного совета Д.006.027.01 при ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г.Москва, ул.Тимирязевская, д.42, Тел (495)976-65-44, Факс: (495) 977-09-47; e-mail;
iab@iab.ac.ru.
С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.
Автореферат разослан л 2011 г.
Ученый секретарь Диссертационнго совета Д.006.027.Кандидат биологических наук С.А.Меликова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. По данным FAO к 2030 году ожидается увеличение населения планеты до 8 - 10 миллиардов. В связи с этим в 21-ом веке человечество столкнется с рядом новых трудностей, для решения которых потребуются принципиально новые подходы. Основная проблема, ожидающая человечество в ближайшие десятилетия - продовольственная. Эффективность современного сельскохозяйственного производства не позволит удовлетворить постоянно растущие потребности человечества.
Несмотря на огромные достижения традиционной селекции растений, некоторые проблемы сельского хозяйства решить такими методами невозможно или очень сложно.
Хотя селекция ведется уже несколько тысяч лет, но ее общий принцип фактически остался прежним: скрещивание разнородных в генетическом отношении форм и последующий отбор в гибридном потомстве экземпляров с набором желательных признаков. Таким способом происходит совершенствование существующих культур за счет придания им новых ценных качеств. Но этот метод обладает несколькими недостатками, а именно:
продолжительностью селекционного процесса, случайностью комбинирования генов в результате рекомбинации, низким выходом нужных генотипов, невозможностью переноса признаков из филогенетически отдаленных видов, потребностью в больших площадях, зависимостью от времени года.
С развитием биологической науки, в селекции, кроме обычного скрещивания, стали использовать и другие методы, такие как мутагенез, клеточная селекция и вегетативная, или соматическая гибридизация. Но, несмотря на возлагавшиеся надежды, все эти методы не произвели ожидавшейся УреволюцииФ в селекции сельскохозяйственных культур. Мутагенез характеризуется случайностью мутаций и, как правило, полученные формы растений обладают пониженной жизнеспособностью.
Клеточная селекция направлена на реализацию признаков, уже заложенных в геноме исходных форм. Вегетативная, или соматическая гибридизация (слияние протопластов) позволяет преодолеть нескрещиваемость неродственных видов, но сочетание родительских признаков у получаемых форм так же случайно. Введение же определенного гена в организм с минимальным нарушением его генотипа стало возможным лишь с развитием методов генной инженерии.
Генная инженерия - это перенос генов, выделенных из одних организмов, в другие.
Главное преимущество генной инженерии в том, что она позволяет перенести отдельный ген, отвечающей за конкретный признак, что исключает случайные комбинации признаков и разрушение уже сложившегося и вполне удовлетворительного генотипа.
Универсальность генетического кода позволяет использовать гены, выделенные из любых организмов. Таким образом, становится возможным получение признаков недостижимых методами традиционной селекции, например, получить голубую розу. Опираясь на достижения молекулярной биологии и используя технику Уin vitroФ становится достижимой цель селекционеров - изменение единственного признака без нарушения сложившегося генотипа сорта. Комбинация методов генетической инженерии и традиционных способов селекции позволяет эффективно объединять полезные признаки, вносимые гетерологичным генетическим материалом и комплекс уникальных сортовых признаков, созданных многолетним трудом селекционеров. В мировой практике в настоящее время уже накоплен большой опыт генно-инженерного модифицирования сельскохозяйственных культур, приобретших после создания или повышения естественной устойчивости к болезням, вредителям и абиотическим стрессам повышенную продуктивность а также улучшенное качество продукции. Трансгенные растения становятся своебразными растительными фабриками для производства как препаратов медицинского назначения (антитела, съедобные вакцины и т.п.), так и сырья для биотехнологической промышленности например биодеградабельного пластика или паутинного шелка. Более того, по мере расширения генно-инженерных программ, в практическое использование вовлекаются все новые и новые гены, придающие растениям новые, иногда необычные свойства. Одним из ярких примеров создания по сути новой культуры явилось получение коллективом ученых возглавляемым Инго Потрикусом так называемого Золотого риса, способного как синтезировать провитамин А, так и аккумулировать достаточное для полноценного питания количество железа. Таким образом генно-инженерным методом удалось преодолеть основные недостатки этой основной для миллиардов людей продовольственной культуры и достичь сбалансированного состава ее питательных компонентов.
Технология генетического модифицирования растений впервые была разработана в середине 80-х годов в целях получения новых трансгенных сельскохозяйственных культур с улучшенными агрономическими характеристиками. Наиболее ярким показателем эффективности технологии генетического модифицирования (молекулярной селекции) являются данные о возделываемых площадях генетически модифицированных (ГМ) культур. Они также отражают темпы коммерциализации научных разработок в этой сфере и их внедрения в производство. Ежегодно на протяжении последних лет США, Бразилия, Аргентина, Канада и Китай являются странами, в которых возделывается подавляющая часть ГМ культур, таких как соя, кукуруза, хлопчатник и рапс. По данным на 2010 год мировая площадь угодий под ГМ культурами составила 148 миллионов га (James, 2011).
Прирост по сравнению с 2009 годом составил 10% или 14 млн. га, а по сравнению с 19годом площадь под ГМ культурами возросла более чем в 87 раз (от 1.7 до 148 млн. га).
Ведущими ГМ культурами по итогам 2010 года стали: соя - 53% (65.8 млн.га), кукуруза - 30% (37.3 млн.га), хлопчатник - 12% (15.5 млн.га), рапс - 5% (5.9 млн.га). На протяжении периода с 1996 до 2008 года устойчивость к гербицидам являлась неизменно ведущей новой агрономической характеристикой всех ГМ культур, после которой следует устойчивость к насекомым обусловленная Bt-токсином. Так, в 2001 году соя, кукуруза и хлопчатник, устойчивые к гербицидам, занимали 63% (79 млн.га) общей мировой площади ГМ культур, а культуры с геном Bt-токсина - 15% (19.1 млн.га), сорта с двумятремя признаками 22% (26.9 млн.га)(James, 2009).
Все приведенные выше статистические данные относятся исключительно к ГМ культурам, которые уже запущены в масштабное производство. Однако этих данных недостаточно для формирования полной картины скорости развития этой сферы знания, а также прогнозирования ожидаемых изменений в мировой сельскохозяйственной индустрии. Эти недостатки компенсируются широко доступной информацией о проводимых в мире полевых испытаниях трансгенных культур. Так, лидирующее место в мире по числу всех ежегодно проводимых полевых испытаний занимают США: с 1987 до 1998 гг общее их число возросло в 120 раз с 9 до 1086, в последующие годы оно равнялось 982 (1999 г), 882 (2000 г), 1111 (2001 г), 845 (2002 г). Из них на долю кукурузы приходится 4049, хлопчатника - 590, картофеля - 777, табака - 227. Необходимо также отметить, что ГМ формы таких ведущих плодово-ягодные культур как яблоня, груша, виноград и земляника по данным департамента сельского хозяйства США также успешно проходят стадию полевых испытаний: яблоня - 62, груша - 10, виноград - 80, земляника - 67 (FTR Database of USA).
Одним из основных направлений, где успешно применяется генетическая инженерия стало решение проблемы устойчивости к насекомым вредителям. В настоящее время в этой области достигнут значительный прогресс, гены, отвечающие за устойчивость к болезням и вредителям, клонированы, охарактеризованы и уже получены трансгенные растения. Одним из первых в растения был перенесен ген Bt-токсина Bacillus thuringiensis, широко применяющегося с 60-х годов инсектицида биологического происхождения (Perlak и др.,1990). Этот инсектицид обладает узконаправленной токсичностью к насекомым и является безвредным по отношению к животным и человеку. Поскольку ген имеет бактериальное происхождение, то экспрессия его в растениях недостаточна для эффективного подавления развития насекомых (тысячные доли трансгенного токсина от тотального белка растительной клетки). В связи с этим были проделаны успешные работы по оптимизации нуклеотидного состава, что позволило увеличить экспрессию в сотни раз. В последние годы уровень экспрессии нативных генов Bt-токсина Bacillus thuringiensis в растениях достигнут путем увеличения в тысячи раз копийности гена при переносе его в хлоропласты биолистическим методом (Mc Bridge и др.,1995).
Другой областью, в которой достигнуты значительные успехи, стала защита растений от вирусных заболеваний (Smith и др.,1994; Nelson и др.,1988). Потери продукции от вирусных заболеваний весьма ощутимы, особенно в отношении тех культур, которые размножаются вегетативно. Открытие в 2000е годы феномена РНК интерференции открывает возможности создания форм растений высокоустойчивых к большинству известных фитовирусов.
В последние годы появляется все больше и больше работ по использованию в селекции плодовых культур методов генной инженерии, которые позволяют преодолеть многие недостатки и ограничения традиционной селекции. Помимо прочих, в отношении плодовых культур генная инженерия обладает еще одним преимуществом. Мировое производство некоторых из наиболее экономически важных плодовых культур умеренной и субтропической зон основано на выращивании всего нескольких сортов. Эти сорта в основном удовлетворяют производителей и потребителей и их замена на новые, более лучшие, сорта идет очень медленно. Идеальным вариантом в этом случае было бы улучшение в привычных сортах только одного или нескольких признаков. К сожалению, этого не удается достичь с помощью традиционной селекции, но вполне возможно добиться методами генной инженерии. В настоящее время коммерчески возделывается в США устойчивая к вирусу папайя и в 2010 году получено разрешение на выращивание там же вирусоустойчивой сливы.
Исторически селекционная работа с культурными растениями всегда была направлена на увеличение урожайности, устойчивости к насекомым, повышение качества продукции, а также ее привлекательности для покупателя, что имеет особую актуальность в производстве продукции цветоводства. Усилия селекционеров в декоративном растениеводстве в основном направлены на изменение эстетических качеств - цвета, формы, аромата, на продолжительности жизни после срезки.
Наиболее привлекательная часть растения - это цветок. В идеале горшечное растение - это плотная шапка цветов, покрывающая зеленую часть растения.
Фитогормоны играют важную роль в контроле размера и формы растения. Соотношение ауксины:цитокинины может быть изменено в трансгенных растениях экспрессирующих онкогены из Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens или Ri-плазмид A.rhizogenes.
Например, констутивная экспрессия rolC гена, кодирующего цитокинин- -глюкозидазу из Ri-плазмиды привели к повышению уровня цитокининов, изменению архитектуры ряда растений.
Таким образом, технология генетического модифицирования нашла широкое применение в создании новых форм сельскохозяйственных культур с улучшенными характеристиками. Более того, в ближайшее десятилетие будет не только продолжаться рост площади мировых с/х угодий занятых ГМ культурами, но и принципиально расширится видовой ассортимент возделываемых культур.
Исходя из вышеизложенного, проблема разработки методов молекулярной селекции, в первую очередь генетической трансформации, и создание трансгенных сортов основных сельскохозяйственных культур России приобретает стратегическое значение с точки зрения продовольственной безопасности и независимости, а владение современными методами биотехнологии и диагностики растений является основой для предотвращения превращения России в свалку отходов биотехнологической индустрии развитых стран.
Цель исследований. Целью исследований являлась разработка генно-инженерных методов улучшения хозяйственно-ценных признаков садовых растений.
В ходе исследования решались следующие задачи:
Х достижение эффективной регенерации садовых растений из соматических тканей;
Х создание векторных систем для переноса и экспрессии гетерологичных генов в садовые растения и разработка методов их трансформации на основе подбора вирулентных штаммов и селективных агентов;
Х оценка влияния присутствия растительного интрона и сигналов клеточной компартментализации на уровень экспрессии гетерологичных генов в растениях;
Х изучения влияния экспрессии гена RolC на архитектуру и физиологию трансгенных растений на примере хризантемы и актинидии;
Х экспрессия гена bar в клоновых подвоях плодовых культур (яблони и груши) с целью получения растений устойчивых к гербицидам на основе фосфинотрицина Х оценка влияния модификации гипервариабельной области гена bt токсина CryIAbна изменения спектра его токсичности;
Х создание векторных конструкций для переноса в растения гена thaumaninII и изучение влияния его экспрессии на устойчивость к патогенам и вкусовые качества плодов трансгенных растений;
Х получение растений устойчивых к поражению вирусами с использованием постранскрипционного замалчивания генов;
Х проведение полевых испытаний полученных трансгенных растений на проявление перенесенных признаков.
Научная новизна и практическая значимость работы. На основе оптимизации состава питательных сред, источников эксплантов и условий культивирования разработана методика эффективной адвентивной регенерации побегов из соматических тканей декоративных, ягодных и плодовых культур, эффективность, которой, в частности для косточковых культур, значительно превосходит результаты, достигнутые другими исследователями.
Разработаны схемы негативной селекции по степени устойчивости к антибиотикам (канамицин, гигромицин, генетицин) и позитивной селекции на маннозе в том числе впервые для косточковых культур на примере вишни и культурного сорта сливы.
Проведен сравнительный анализ эффективности селекции трансформантов с различными селективными маркерными генами: nptII, hpt и pmi. Впервые при трансформации соматических тканей древесных были получены трансгенные растения с использованием метода позитивной селекции без генов устойчивости к антибиотикам.
Показано положительное влияние присутствия растительного интрона PIV2 в конструкции гетерологичного гена на уровень и стабильность его экспрессии в вегетативных и генеративных тканях земляники, яблони и груши. Впервые показана возможность использования различных лидерных последовательностей клонированных из травянистых видов растений, кодирующих сигнальные пептиды, для эффективной клеточной компартментализации продуктов экспрессии гетерологичных генов в трансгенных растениях косточковых культур на примере сливы.
Впервые получены трансгенные растения актинидии коломикты, трансформированные селективными генами nptII, hpt и, впервые, геном rolC A. rhizogenes.
Изучены некоторые морфологические особенности rolС - трансформантов актинидии, впервые изучено содержание активных форм цитокининов (зеатина и зеатин-рибозида), ИУК и АБК в растениях актинидии коломикты, трансформированных геном rolC.
Показано стабильное изменение гормонального статуса rolC-трансформантов актинидии по сравнению с нетрансформированными растениями. Показана потенциальная возможность изменения габитуса надземной части древесных растений посредством переноса в их геном гена rolC из A. rhizogenes.
Показано изменение гормонального статуса rolC-трансформантов хризантем сорта White Snowdon, предположительно являющегося причиной изменения: архитектуры растений; cтруктуры генеративных органов; морфологии пыльцевых зерен - ведущее к потере фертильности. Показана возможность использовать rolC гена в практическом цветоводстве для получения горшечных и декоративных форм у вегетативно размножающихся культур. При изучении изменений, вызванных экспрессией в растениях гена rolC из A.rhizogenes в хризантемах обнаружено присутствие гомологичных rolC гену последовательностей в геноме ряда сортов хризантем.
Впервые получены трансгенные растения хризантемы, экспрессирующие укороченный ген -эндотоксина Cry1Ab1. Впервые достоверно установлена токсичность продуктов генов -эндотоксина для нового класса членистоногих - акарид при их экспрессии в трансгенном растении.
Осуществлена трансформация клоновых подвоев яблони и груши геном обуславливающим устойчивость к гербицидам на основе фосфинотрицина и показана устойчивость полученных форм к высоким дозам коммерческих препаратов гербицидов в полевых условиях.
Впервые получены трансгенные растения земляники садовой яблони и груши с геном thaumatinII. Показано положительное влияние экспрессии тауматина на устойчивость к фитопатогену Botrytis cinerea на примере земляники. Достигнуто улучшения вкуса плодов у нескольких линий земляники, яблони и груши с экспрессией тауматина. Впервые в России проведены полевые испытания ГМ растений земляники? яблони и груши. По результатам молекулярно-генетических анализов, биологического тестирования и полевых испытаний среди трансгенных клонов, содержащих ген thaumatin II, отобраны перспективные линии с улучшенным вкусом плодов и повышенной устойчивостью к Botrytis cinerea. Отобранные перспективные линии с геном thaumatin II обладают улучшенными агрономическими характеристиками.
На основе использование феномена РНК интерференции и разработанных оригинальных методиках трансформации косточковых культур получены трансгенные линии культурного сорта сливы устойчивые к вирусу Шарки (PPV).
Полученные формы трансгенных растений прошли испытания в полевых условиях и продемонстрировали достоверное изменение агрономических характеристик обусловленное экспрессией гетерологичных генов и могут далее внедряться в с/х производство или использоваться в качестве исходного материала в традиционных селекционных программах.
Апробация работы основные результаты исследований доложены на международных научных конгрессах: 10th FESPP Congress УFrom molecular mechanisms to the plant: an integrated approachФ Firenze, Italy, September, 1996; XXV International Horticultural Congress Brussels, Benelux, August, 1998; EUCARPIA XV-th General Congress for Crop Quality and resistance, Veterbo, Italy, September, 1998; Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - Москва, (2003, 2005, 2007); XVth International plant protection congress. Beijing, China, May, 2004; 11th IAPTC&В Сongress Biotechnology and sustainable agriculture 2006 and beyond Beijing, China, August, 2006; 9-th International Plant Molecular Biology Congress, St.Louis, Missouri, USA,October, 2009; 12th IAPB Congress, St.Louis, Missouri, USA, June 2010; 28th International Horticultural Congress.
Lisboa, Portugal, August 2010; 2-й Международный Конгресс "ЕвразияБио-2010" Москва, Россия, апрель, 2010. симпозиумах и конференциях: EUCARPIA 19-th International Symposium Improvement of Ornamental Plants, Angers, France, July, 1998; Symposium of Fruit Breeding and Genetics, Dresden, Germany, September, 1999; VIII International Pear Symposium, Ferrara-Bologna, September, 2000; International Symposium on Asian Pears, Tottori, Japan, August, 2001; EUCARPIA 19-th International Symposium of Fruit Breeding and Genetics, Angers, France, September, 2003; Industrial microbiology and biotechnology conference. Anaheim, CA, USA, July, 2004; 5th International strawberry symposium. Coolum Beach, Queensland, Australia, September, 2004; ISHS International Symposium Genetic modifications- Challenges and Opportunities for horticulture in the world. Shi, Norway, September 2007; I International Symposium on Biotechnology of Fruit species. Dresden, Germany, September, 2008; First Symposium on Horticulture in Europe. Vienna, Austria, February 2008; 21st International conference on virus and other graft transmissible diseases of fruit crops" Neustadt, Germany, July 2009.; International Symposium on Plum pox virus, Sofia, Bulgaria September, 2010; XI International Pear Symposium. Rio Negro Valley of Argentina, November 2010.
Объем и структура диссертации. Диссертация в виде научного доклада изложена на страницах, иллюстрирована 20 таблицами и 23 рисунками, состоит из разделов Общая характеристика работы, лОбъекты и методы исследований, Результаты исследований, Выводы, списка работ по теме диссертации, включающего 58 статей в ведущих российских и зарубежных рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки, 3 патентов и 1 заявку, на которую получено положительное решение.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объекты исследований. В экспериментах по регенерации и генетической трансформации садовых растений использовались сорта и подвои следующих культур:
-яблони домашней (Malus domestica L.): гибрид селекции ВНИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина, Мичуринск, клоновый слаборослый подвой № 57-545 селекции профессора В.И.Будаговского, Плодоовощной институт им.
И.В.Мичурина, Мичуринск;
-груши обыкновенной (Pyrus communis L.): Надежда, Чижовская, Москвичка, Лада, Академическая селекции Московской сельскохозяйственной академии им.К.А.Тимирязева, Память Яковлева, Осенняя Яковлева селекции ВНИИ генетики и селекции плодовых растений им.И.В.Мичурина, г.Мичуринск, Космическая селекции Всесоюзного научно-исследовательского института садоводства им.И.В.Мичурина, г.Мичуринск, Бураковка сорт белорусской народной селекции, клоновые подвои ГП № 217, ГП № 218 селекции Всесоюзного научно-исследовательского института садоводства им.И.В.Мичурина, г.Мичуринск.
-хризантемы (Chrysanthemum morifolium Ramat.): 32 сорта из коллекции Латвийского Ботанического сада (ЛБС) (Саласпилс, Латвия) и Уin vitroФ коллекцией, любезно предоставленной сотрудницей кафедра вирусологии Московского государственного Университета Берзиной А.Г. и директором ЛБС К. Буйвидисом;
-вишни (Cerasus vulgaris Mill.): шесть промышленных сортов и вишне-черешневый гибрид Cerasus fruticosa Cerasus avium, полученный во ВНИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина; Мичуринск;
-земляники садовой (Fragaria ananassa): сорт Фейерверк селекции Зубова А.А., ВНИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина; Мичуринск, сорт Селекта канадской селекции.
-гвоздики ремонтантной (Dianthus caryophyllus L): 17 различных сортов относящихся к двум наиболее распространнным садовым группам мелкоцветных (Spray) и крупноцветных (Standart) гвоздик (в работе сортам присвоены номера от Dia1 до Dia33);
-актинидии коломикты (Actinidia kolomicta ) из коллекции ВНИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина; Мичуринск;
-сливы домашней (Prunus domestica): Ренклод колхозный, Ренклод Харитоновой, Венгерка итальянская, Ода, Синеокая, Радость, Евразия 21, Заречная ранняя, Этюд, Стартовая.
Для экспериментов по регенерации и трансформации использовали листья с укорененных in vitro растений, которые находились на среде для укоренения в течение 1,5-2 месяцев. Для регенерации брали молодые, но полностью развернутые листья. У листьев удаляли черешки (которые также использовали в качестве эксплантов) и верхушки (у крупных листьев - также и боковые стороны) и наносили несколько надрезов перпендикулярно центральной жилке, не доводя их до краев листа. Подготовленные таким образом экспланты помещали апоксиальной стороной на поверхность питательной среды для регенерации. Регенерацию проводили в чашках Петри размером 90х15 мм, которые содержали 30 мл среды. В каждую чашку помещали по 8-15 эксплантов в зависимости от культуры.
Агробактериальные штаммы и векторы Для трансформации применяли следующие штаммы A. tumefaciens:
1) Необезоруженный супервирулентный штамм A281 с бинарным вектором pBTP2) обезоруженный штамм GV3101 c бинарным вектором pPCV002rolC.
обезоруженные супервирулентные:
3) CBE21 (Revenkova et al., 1993) с бинарными векторами pBI121, pBIThau35, и pBIBar;
4) EHA105 (Hood et al., 1993) с бинарным вектором p35S GUSintron;
5) AGL0 созданный на основе А281 в центре PRI (Вагенинген, Нидерланды).
Трансформацию проводили следующими бинарными векторами:
1) pBI121 Цс маркерными генами gus и nptII (Jefferson et al., 1987).
2) pVec035SGUSint Цс геном gus, с модифицированным интроном PIV2 из картофельного гена ST-LS1 в своей 5 -концевой части (Vancanneyt et al., 1990). Вектор был создан УRhone-Poulenc AgrochimieФ (Франция) и любезно предоставлен центром Биоинженерии РАН, д.б.н. А.К.Гапоненко.
3) pBIThau35 - с геном cуперсладкого белка thaumatin II из тропического растения Thaumatococcus daniellii Benth. и маркерным геном nptII.
4) pGAGFP-AFVY Цс маркерным кодон-оптимизированным геном зеленого флуоресцентного белка (m-gfp5).
5) pBin35SmGFP5-ER - с маркерным кодон-оптимизированным геном зеленого флуоресцентного белка (m-gfp5) фланкированным лидерными последовательностями из хитиназы арабидопсиса.
6) рBIBar Цс модифицированным геном bar из S.hygroscopicus, любезно предоставлен проф. К.Г.Скрябиным (центр Биоинженерия РАН).
7) pBTP41 несущим укороченный фрагмент гена токсина Cry IAbI под контролем 35S CaMV промотора (Рукавцова, 1994).
8) pPCV002 несущим ген rolC (Spena et al.,1987) под контролем 35S CaMV промотора.
9) pPCV730 создан в лаборатории Д.Шелла Институт Макса Планка г.Кельн и любезно предоставлен Н.И.Стрижовым.
10) pNov35SGFP - с маркерным кодон-оптимизированным геном зеленого флуоресцентного белка (gfp). Для селекции регенерантов на маннозе вектор содержит ген фосфоманнозоизомеразы (pmi) из E.coli под контролем CMPS промотора (cestrium yellow leaf curling virus). Плазмида создана на станции искусственного климата ФБиотронФ, ФИБХ РАН (Пушин А.С.), на основе вектора pNov2819, любезно предоставленного фирмой ФSyngentaФ.
11) pCamPPVcp - бинарный вектор содержит ген белка оболочки вируса оспы сливы (PPV-CP) в прямой ориентации.
12) pCamPPVRNAiЦсодержит фрагменты гена белка оболочки вируса оспы сливы в обратной и прямой ориентациях, разделенных pdk - интроном (из вектора pHANNIBAL),.
Вектор был создан О.А. Шульгой в лаборатории генной инженерии растений ГНУ ВНИИСБ.
13) pCam35SGFP Цсодержит маркерный кодон-оптимизированный ген зеленого флуоресцентного белка (m-gfp5) под контролем CaMV35S промотора и Tnos терминатора и кодон-оптимизированный ген bar из Streptomyces hygroscopicus.
Методы анализа трансгенных растений. Определение агропина и активности NPT-II проводили согласно методике описанной Дж.Драйпером (1991). Гистохимическое и флюориметрическое определение активности GUS проводилось по методике Jefferson (1987). Гистохимическое определение GUS активности проводили с использованием 5бром-4-хлор-3-индолилглюкуронида (Х-GLUC, Duchefa).
Содержание фитогормонов определяли при помощи твердофазного иммуноферментного метода. Использовали готовые наборы реактивов для определения фитогормонов (АО УУралинвестФ Уфа).
Выделение ДНК проводилось по модифицированному нами протоколу. За основу бралась стандартная методика Rogers и Benedich (1994) с применением 2х СТАВ-буфера.
В качестве зонда для гибридизации по Саузерну использовали ДНК плазмиды pRTBt 90, содержащую ген bt-токсина. Растительную ДНК выделяли с протеиназой К (Драйпер, 1991) и очищали в градиент CsCl.
инии, полученные с помощью любой из использованных векторных конструкций, анализировались двумя парами праймеров: на вставку селективного маркера (nptII, hpt или pmi) и на вставку смыслового (rolC, thauII, bar, PPVcp) или репортерного генов (gus, gfp).
Иммунологическое определение содержания -эндотоксина и тауматина II в вегетативных тканях (листьях) и плодах трансгенных растений анализировались методом Western-блоттинга по модифицированному протоколу Faus et al. (1996). Для снижения уровня пигментов и полифенольных компонентов, ухудшающих эффективность иммунодетекции, экстракты из гомогенизированной листовой ткани переосаждались ацетоном и вновь растворялись в экстракционном буфере. Иммунодетекция проводилась поликлональными кроличьими антителами, полученными с использованием коммерчески доступного препарата тауматина II (Sigma) и очищенного -эндотоксина. Количество рекомбинантных белков в анализируемых образцах оценивалось сканированием мембран с последующей денсиометрией силы сигнала и сравнением с контрольными дорожками чистого тауматина (Sigma).
Анализ содержания пигментов проводили методом тонкослойной хроматографии (Courtney-Gutterson et.al., 1994).
Тест на инсектицидную устойчивость хризантем к паутинному клещу и сподоптере проводили по методикам Plant Research International (PRI) в г.Вагенинген, (Нидерланды).
Влияние чистого препарата тауматина II (Sigma) на прорастание спор Botrytis cinerea оценивалось в камерах Горяева. Трансгенные растения, полученные с помощью векторной конструкции pBIThau35 анализировались на устойчивость к фитопатогену Botrytis cinerea по модифицированной методике Peng и Sutton (1991).
Подсчет фертильных зерен проводился по стандартной методике на временных препаратах: пыльцевые зерна выдерживались в течении 1 минуты в ацетокармине, затем заключались в глицерин, зерна подсчитывались по трансекте, с интервалом в 2 мм, в каждой пробе подсчет доводился до 300 зерен. Для изучения структуры поверхности пыльцы было выполнено напыление платиной, обработанная таким образом пыльца была изучена под сканирующим микроскопом (СЭМ), HITASCI -450A.
Органолептический анализ плодов и устойчивость к гербицидам проводились по общепринятым в селекции плодовых культур методикам.
Полученные данные обрабатывали с помощью дисперсионного анализа:
однофакторного и двухфакторного для неравночисленных комплексов по методу Н.А.Плохинского (1980) и Г.Ф.Лакина (1990). Достоверность различий между вариантами устанавливали методом Шеффе (Лакин, 1980) РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1.Разработка методов регенерации садовых растений из соматических тканей.
юбой метод переноса генов в большинстве случаев приводит к получению трансформированных клеток с более-менее удовлетворительной частотой. Значительно сложнее регенерировать из полученных клеток несущих гетерологическую ДНК целые растения и этот этап часто становится лимитирующим фактором в получении трансгенных растений, особенно древесных культур. Поэтому, прежде чем приступать к экспериментам по переносу чужеродных генов в геномы садовых растений, необходимо было разработать методику, позволяющую регенерировать адвентивные побеги из соматических тканей выбранных культур с достаточно высокой частотой (не менее 50%) достаточной для успешных генно-инженерных манипуляций.
Факторы, определяющие адвентивный органогенез и его эффективность можно разделить на две группы. С одной стороны это источник эксплантов используемых для индукции морфогенеза - в первую очередь выбранный генотип, его физиологическое состояние (возраст, фаза онто-морфогенеза, условия культивирования), орган (лист, стебель, корень, лепесток, цветоножка и т.д.). С другой - непосредственно условия проведения экспериментов. Это относится как к методам использования эксплантов (предобработка, ориентация на среде), так и составу культуральных сред (минеральные соли, органические добавки, фитогормоны) и условиям проведения экспериментов (температура, освещенность и т.п.).
В результате проведенных исследований нами разработана эффективная методика регенерации целых растений земляники садовой из листовых эксплантов и выявлены сорта, обладающие высоким регенерационным потенциалом.
истовые экспланты сортов Фейерверк и Холидей на средах оптимального состава регенерировали адвентивные побеги с частотой более 90% (табл.1). Показатели регенерации этих сортов находились на уровне, достигнутом в работах Nehra et.al. (1989), James et.al. (1990), Toyoda et.al. (1990) к моменту начала наших первых экспериментов по генетической трансформации этой культуры.
Табл. 1. Оптимальный состав сред для регенерации побегов из листовых эксплантов различных сортов земляники.
Гидро- Сорт Сред Концентрация лизат KNO3, Частота Побегов а фитогормонов, казеина, мг/л регене- на мг/л мг/л рации, экспланте БАП ИМК ИУК % шт.
Фейер-верк MS 5,0 0,3 - 600 - 96,7 2,Холидей MS 4,0 0,3 - 300 - 93,3 2,Светлячок MS 5,0 0,5 - - - 60,0 1,Урожайная ЦГЛ MS 5,0 0,3 - - - 44,0 1,Рубиновый Кулон MS 2,0 - 0,2 - - 6,7 1,Зенга-Зенгана MS 4,0 1,0 - - 1000 4,0 1,Использование в дальнейших экспериментах тидиазурона (ТДЗ) в качестве цитокинина показало, что среда MS с 5,0 мг/л ТДЗ обеспечивала частоту порядка 99,3 %, при более чем трехкратном повышении среднего число побегов на один регенерирующий эксплант с 1,2 до 4,1.
Разработанная методика регенерации сортов Фейерверк и Селекта была использована в дальнейших работах по генетической трансформации земляники.
Оптимизация ряда факторов, имеющих важное влияние на регенерацию - минерального состава среды, концентрации сахарозы, регуляторов роста растений и предварительной обработки эксплантов позволила достичь высокого уровня индукции морфогенеза из соматических тканей груши. Результаты эксперимента представлены в таблице.
Таблица 2. Влияние оптимизации условий регенерации на способность продуцировать адвентивные побеги из листовых эксплантов у различных генотипов груши Сорт До оптимизации После оптимизации Частота Побегов на Частота Побегов на регене- экспланте, регене- экспланте, рации, % шт. рации, % шт.
Надежда 6.7 3.3 1.0 0.0 96.7 3.3 3.3 0.Чижовская 0 - 93.3 6.7 1.9 0.Москвичка 0 - 80.0 5.8 1.8 0.Лада 0 - 31.1 4.4 1.1 0.Академичес-кая 7.1 3.8 1.0 0.0 4.4 4.4 1.0 0.Бураковка 28.6 7.8 1.4 0.2 100.0 0.0 5.4 0.Память Яковлева 23.3 6.7 1.0 0.0 75.0 7.2 1.4 0.Осенняя Яковлева 0 - 93.3 3.8 1.9 0.Космическая 3.7 3.7 1.0 0.0 73.3 6.7 2.7 0.ГП № 215.6 3.4 1.2 0.2 47.5 5.4 1.2 0.ГП № 29.1 5.2 1.0 0.0 53.3 7.7 1.4 0.Условия до оптимизации: среда MS, 20 г/л сахарозы, 5 мг/л ТДЗ, 0.5 мг/л НУК, 0.1 мг/л ГК, до помещения на среду экспланты находились в воде.
Условия после оптимизации: среда NN, 30 г/л сахарозы, 3 мг/л ТДЗ, 0.5 мг/л НУК, 0.1 мг/л ГК, до помещения на среду экспланты находились в жидкой среде NN.
Сравнение с результатами, полученными при первоначальных условиях регенерации, показывает, что для большинства сортов регенерация резко возросла.
Увеличение частоты регенерации у большинства сортов свидетельствует о том, что разработанная нами методика регенерации в целом подходит для сортов груши различного генетического происхождения, то есть условия, необходимые для регенерации побегов, должны соответствовать неким требованиям, более-менее общим для различных генотипов.
Большая часть работ по генетической трансформации косточковых плодовых растений проводилась с использованием в качестве исходного материала зародышевых тканей, что объясняется их более высокой морфогенностью отсутствием протоколов эффективной регенерации из соматических клеток. Однако использование материала зиготического происхождения при трансформации древесных культур приводит к получению трансгенных Ддичков, агрономические качества которых неприемлемы, что являлось основным препятствием использования биотехнологических и генноинженерных методов в селекции косточковых культур.
Оценка морфогенетического потенциала 5 сортов отечественной селекции и оптимизация состава питательных сред (Табл.3).позволила выявить наиболее отзывчивые формы (Стартовая, Этюд) и достичь достаточно высокого уровня морфогенеза (60-46%) После оптимизации ряда факторов, имеющих важное влияние на регенерацию - минерального состава среды, регуляторов роста растений, возраста листовых эксплантов, возраста укорененных побегов-доноров эксплантов, предварительной обработки эксплантов и добавления в среду кальция пантотената, мы вновь провели оценку морфогенетического потенциала сортов УСтартоваяФ и ФЭтюдФ, но уже по новой методике регенерации. Использование оптимальной комбинации условий культивирования позволило повысить частоту регенерации побегов сорта УСтартоваяФ до 79,4% при той же концентрации фитогормонов.
Таблица 3. Оптимальные концентрации регуляторов роста для индукции морфогенеза из листовых эксплантов различных сортов сливы домашней (Prunus domestica) Побегов на Концентрация Частота регенеСорт экспланте, фитогормонов, мг/л рации, % шт.
Стартовая ТДЗ 4 НУК 0,5 59,57,6 2,40,Этюд БАП 5 ГК 0,5 ИМК 0,2 46,15,7 3,40, БАП 4 ИМК 0,5 31,76,0 1,70,Евразия 21 БАП 4 ИМК 0,2 32,65,6 3,30, ТДЗ 4 НУК 0,5 33,37,0 2,30,Радость БАП 4 НУК 0,5 28,45,5 1,10, БАП 3 НУК 0,2 25,05,4 1,30,Синеокая БАП 3 НУК 0,5 16,74,8 1,20,БАП 3 ИМК 0,2 15,94,6 2,30,В результате проведенных исследований созданы эффективные методики регенерации растений гвоздики (табл.4) и хризантемы из различных типов эксплантов и выявлены сорта, обладающие высоким регенерационным потенциалом. Использование среды МС с 1,0 мл БАП и НУК (Roest и др.,1975) позволило достичь почти 100% регенерации у сортов хризантем Parliament и Promenade тогда как на базовой среде эти частоты составляли соответственно 76 и 71%. Сорт Festival лучше всего регенерировал на среде содержащей 2,0мгл БАП и 0,2мгл НУК (Rout и др.,1997) 74% против 26% в исходном эксперименте.
При использовании укорененных растений в качестве источника листовых эксплантов частота регенерации выше 50% наблюдалась у 35% протестированных сортов, тогда как из листьев отобранных с растений находящихся на стадии размножения только у 14% сортов регенерация происходила со столь высокой частотой. В тоже время только у 13% сортов в первом случае эта частота не превышала 20% против 45% сортов при использовании мультиплицирующих растений в качестве источника листовых дисков. В целом влияние генотипа и физиологического состояния преобладало в определении эффективности процесса регенерации.
Несмотря на многочисленные исследования, проводившиеся с целью выяснения регенерационной способности изолированных листьев разных видов, нет четкого представления о том, какие именно условия оптимальны для инициации и реализации процесса регенерации. Ввиду этого, что разделение растений на формы с высоким и низким морфогенетическим потенциалом по степени способности к морфогенезу в конкретных условиях не может служить достаточным основанием для суждения о наследственной обусловленности способности к регенерации.
Не отрицая значительную роль генотипа, что если какой-либо сорт не образует регенерантов даже при применении ряда модификаций питательных сред, это еще не говорит о том, что неспособность к регенерации у данного сорта генетически детерминирована. Это свидетельствует лишь о том, что определенный эксплант данного сорта не способен к регенерации в конкретных условиях. Очевидно, что регенерационная способность изолированных органов значительно зависит от возраста тканей и целого ряда других факторов, поэтому вопрос заключается не только в том, в какой мере разные виды и сорта растений различаются по способности к корне- и побегообразованию из различных эксплантов, но и в том, в какой мере эта способность зависит от комплекса Таблица 4. Регенерация адвентивных побегов из различных типов экспланта нескольких сортов гвоздики ремонтантной (А - частота регенерации %, Б - количество побегов на экспланте) Листья растений Листья растений Лепестки Междоузлия Сорт in vitro in vivo А Б А Б А Б А Б Dia68 5 6.1 0.6 68 5 10.3 3.6 24 3 5.8 0.9 37 8 5.6 1.Dia3 - 0 0 - - 75 4 3.9 0.5 - Dia60 5 4.9 0.4 82 5 8.9 3.7 47 9 4.6 2.1 57 8 10.7 8.Dia54 6 4.3 0.9 61 5 6.2 2.8 13 3 4.7 1.0 8 4 6.1 2.Dia93 2 7.4 1.6 96 2 12.8 3.4 79 5 4.2 0.9 42 6 7.5 1.Dia50 5 3.9 0.4 71 6 4.4 2.0 2 1 1.4 0.4 41 4 2.7 1.Dia18 - - 81 11 4.2 0.3 - 7 4 3.1 0.9 - условий и какие из них являются наиболее благоприятными для регенерации. Мы согласны с мнением Л.А. Кучеренко (1991) о том, что работы по оптимизации технологии регенерации следует проводить в двух направлениях: 1) разработать базовую технологию, позволяющую получать требуемое количество регенерантов у большинства сортов; 2) вести поиск ключевых этапов в технологии, при изменении которых можно получить регенеранты или повысить их выход у трудных сортов.
Достигнутый высокий уровень и стабильность адвентивного морфогенеза большинства изучаемых культур позволила нам перейти на следующем этапе к разработке методов переноса в них гетерологического генетического материала.
2. Создание векторных систем для трансформации садовых растений.
Подбор вирулентных штаммов. Широкая вариабельность в спектре растенийлхозяев, наблюдаемая среди штаммов агробактерий, и ограниченная восприимчивость многих садовых растений, в частности яблони (James, 1987) и хризантемы ( ), к агробактериальной инфекции сделало актуальной задачу подбора штаммов, способных трансформировать садовые растения. С целью предварительной оценки вирулентности для яблони, как одной из наиболее важных садовых культур, нами использовались штаммов A.tumefaciens и A.rhizogenes, содержащих Ti и Ri плазмиды различных типов из коллекции лаборатории молекулярно-генетических взаимодействий микроорганизмов с растениями ИБФМ РАН, а также обезоруженный штамм GV3850, содержащий коинтегративный вектор pGV3850Neor с маркером устойчивости к канамицину.
К моменту проведения исследований рядом авторов, в частности J. Anne et al.
(1987), была показана возможность переноса в растительную ткань участка бинарного вектора ограниченного краевыми повторами, без переноса Т-ДНК Ti плазмиды содержащей онкогены и получения таким образом трансгенных растений. Подобный прием находил применение в конце 80-х - начале 90-х годов для трансформации маловосприимчивых к агробактериальной инфекции культур, пока не были созданы и не получили широкого распространения обезоруженные супервирулентные штаммы СВЕ21, серии ЕНА, AGL и позднее Chry5. Как будет показано ниже используя этот подход нам удалось в 1993 году успешно трансформировать и получить трансгенные растения хризантем экспрессирующие белок -эндотоксина Bac. thuringiensis.
В качестве донора в триродительских скрещиваниях использовался штамм E.coli HB101 с плазмидой pPCV730 размером около 8 кв. Реципиентами служили Rifr мутанты агробактериальных штаммов. Плазмида pPCV730 обеспечивала устойчивость трансформированных растительных тканей к антибиотику канамицину. Присутствие плазмиды pPCV730 в полученных штаммах подтверждено выделением щелочным методов и электрофорезом в агарозном геле (рис.1).
Рис.1. Проверка агробактериальных штаммов на присутствие плазмиды pPCV730.
1,10- контроль E.coli с pPCV730, 2- В6, 3- Ach5, 4- 181, 5-A.rhizogenes А4в, 6- A.rhizogenes 8196, 7- 519, 8- А281, 9- 8628.
Полученные таким образом бинарные векторные системы использовались для разработки методов генетической трансформации ряда плодовых культур.
Таблица 5. Вирулентность различных штаммов агробактерий для садовых культур Груша Вишня Яблоня Виноград Штамм/ Коперичка №6 Владимирская Подвой 54-118 Муромец плазмида Обр. Прим Обр. Прим. Образ. Прим. Образ. Прим.
кал. кал калл каллус pRi 8196 + +- + корни pRi A4abc + - - + корни pRi A4b ++ - ++ агропин - №8628 + ++ октопин ++ A348 pTi A6 ++ + октопин pTi 181 + нопалин A281 pTi Bo542 +++ агропин C58 pTi B6 - - - - pTi Ach5 + + +- + pTi C58 + + - - pTi 519 ++ корни ++ опины - pTi 518 - pTi 137 - + - pTi 37400 - - - - pTi 532 +++ - - - Проведенные исследования показали слабую вирулентность для большинства садовых растений наиболее распространенных штаммов, в частности Ach5, B6 и C58, использованных для получения лобезоруженных агробактерий- соответственно LBA4404, GV3101 и GV3850 и показали необходимость использования для их трансформации супервирулентных штаммов или их производных, что нашло подтверждение в дальнейших исследованиях. Исключение составляла груша, для которой корневой рак, вызываемый агробактериями, является одним из основных заболеваний.
Влияние различных селективных антибиотиков на частоту и эффективность трансформации. Успех в получении трансгенных растений во многом зависит от удачного выбора селективного агента, позволяющего отобрать возможно большее число трансформированных клеток, которые составляют весьма небольшую часть среди всех клеток экспланта. Селективный агент, используемый для селекции, должен быть токсичным для растительных клеток, но не настолько, чтобы продукты из погибших нетрансформированных клеток убивали соседние трансформированные клетки. Наиболее широко в качестве селективных используются гены nptII и hpt и в этих случаях для отбора применяют антибиотики канамицинового ряда или гигромицин.
Многие растения, в том числе садовые, успешно трансформируются с использованием в качестве селективного агента канамицина. В наших экспериментах при использовании селекции на канамицине эффективность трансформации земляники и актинидии была выше, чем на гигромицине, существенно не отличалась при трансформации хризантем и уступала в 1.5-2 раза при трансформации яблони и груши (табл.6).
Однако использование векторов содержащих селективный ген nptII оказалось безуспешным в экспериментах по трансформации гвоздики и косточковых культурах (вишне, сливе). Трансгенные растения вишни удалось получить, только используя селекцию на гигромицине, что согласуется с литературными данными о трудностях селекции косточковых культур на среде с канамицином (Dolgov S.V.,1999).
В последнее время все большую популярность приобретают альтернативные стратегии, при которых нетрансформированные клетки останавливались в развитии, а трансформированные получали метаболическое преимущество. Такие системы получили название позитивная селекция (galT, xylA, ipt, pmi и др.). Главное преимущество позитивной селекции заключается в отсутствие генов устойчивости к антибиотикам в трансгенных растениях. Использование вектора pNovGFP созданного на основе системы Positech (Syngenta) позволило осуществит приоритетные исследования по получению безмаркерных древесных растений на примере сливы, что имеет особую актуальность для плодовых растений, плоды которых потребляются в свежем виде.
Таблица 6. Эффективность трансформации садовых растений при использовании различных генов селективных маркеров.
Культура Средняя частота трансформации,% nptII (канамицин) hpt(гигромицин) pmi(манноза) Актинидия 8,5 2,Земляника 1,0-5,0 1,7-2,Хризантема 16,0 0,Яблоня Гибр. ЦГЛ 13,Яблоня №57-545 1,5-7,2 8,Груша Бураковка 11,4-59,Груша ГП217 0,4-3,1 6,2-11,Гвоздика 0 11,Вишня 0 6,Слива 0,5 2,2 1,Дальнейшие эксперименты по трансформации целевыми генами подтвердили полученные результаты. Так использование гигромицина (pCam35SGFP) для селекции трансформированных тканей сливы сорта УСтартоваяФ обеспечивало наибольшую частоту трансформации (2,2%) и сокращало время селекции, тогда как при использовании канамицина максимальная частота трансформации составила 0,5%. При использовании маннозы для позитивной селекции сливы, частота трансформации составила 1,4%, а на генетицине трансгенные линии получить не удалось (Mihaylov et.al 2007).
Репортерные гены Широкое применение находят также и репортерные гены, экспрессию которых можно определить визуально или количественно. Наиболее распространенными из них являются ген gus (uidA) и гены флуоресцирующих (gfp, yfp, rfp, cfp) и люминесцирующих (luxA, luxB, luc) белков. Если детекция продуктов экспрессии gus, luc генов требует добавления субстратов приводящих к гибели анализируемой ткани то ген зеленого флуоресцирующего белка (gfp), клонированный из медузы (Aequora victoria), лишен этого недостатка. Он дает возможность наблюдать экспрессию в интактных тканях и для наблюдения нет необходимости добавления экзогенных субстратов. Использование гена gfp для некоторых культур оказалось намного эффективнее, чем гена gus. Однако у ряда растений - хризантемы, томата и земляники наблюдался достаточно высокий уровень автофлуоресценции практически в том же диапазоне длин волн, что резко снижало возможности использования гена gfp в качестве репортерного. Высокий уровень транзиентной и стабильной экспрессии и легкость детекции позволили наблюдать динамику изменений в уровне экспрессии этого гена на всех стадиях селекции, включая начало каллусогенеза и регенерации побегов. Позднее, удачный выбор репортерного гена gfp был подтвержден высоким уровнем экспрессии GFP в различных тканях полученных трансгенных линий сливы.
Влияние присутствия растительного интрона на уровень и стабильность экспрессии гетерологичных генов в трансгенных растениях. Высокий и стабильный уровень экспрессия переносимого гена признака необходим для полноценного проявления кодируемого им хозяйственно-ценного признака и является залогом его успешного коммерческого применения. Одним из способов повышения уровня и стабилизации экспрессии гетерологичных генов в трансгенных растениях является присутствие в его последовательности интрона. Обнаружение влияния присутствия интрона в кодирующей последовательности гена на уровень его экспрессии впервые обнаружено при оценке уровней экспрессии репортерных генов gus. Мы также проводили трансформацию двумя генами gus, один из которых содержал интрон, а другой - нет, и оценивали экспрессию этих генов в трансгенных клонах груши, земляники и яблони.
Всего было получено и включено в эксперимент 9 линий грушевого подвоя ГП217, 21 подвоя яблони №57-545 и 12 земляники сорта Фейерверк трансформированных pBI1содержащей безинтронный ген gus и соответственно 10, 2, 3 линии с геном содержащим модифицированный интрон PIV2 из картофельного гена ST-LS1 в своей 5 -концевой части.
20 из 23 трансгенных линий клонового подвоя яблони №545 демонстрировали окрашивание листовых пластинок. Количественное измерение GUS активности в течение двух сезонов вегетации в теплице (1998, 1999 гг) показало как разницу между клонами, трансформированными одинаковой конструкцией, так и между ними. Детектируемый уровень активности GUS варьировал от 43 (уровня фоновой активности контрольных растений) до 8830 нМ 4-MU/мин/мг сырого веса листовой ткани у линии трансформированной интрон-содержащей конструкцией (Dolgov et al. 2000).
Флюориметрический анализ экспрессии гена gus, проведенный в 1998 году на тепличных растениях груши, показал, что активность GUS в клонах, трансформированных геном gus с интроном, была в среднем в 2.7 раз выше, чем в растениях с геном без интрона (147 и 54 нМ 4-MU/мин/мг сырого веса). Аналогичные результаты мы получили и в 19году, после прохождения растениями листопада и периода покоя. Интрон усилил экспрессию репортерного гена в 3.5 раза (162 и 48 нМ 4-MU/мин/мг сырого веса).
Мы также наблюдали различия в стабильности экспрессии генов с интроном и без в листьях трансгенных растений груши на протяжении 5 вегетационных периодов в условиях защищенного грунта и 3 полевых сезонов. Количественный анализ экспрессии гена uidA в тепличных растениях груши проведенный в 1999-2005 гг показал значительное варьирование активности фермента у различных линий (от 100 до 2900 нМ 4-MU/мин/мг).
Несмотря на значительную флуктуацию по годам, полного замолкания гена не наблюдалось. Ранее Fladung et al. (1997) также отмечал редкость этого явления у древесных растений. Сходные результаты наблюдались и у растений в полевых условиях опытного полигона ВНИИСПК (г. Орел). При этом общий уровень экспрессии гена снижался по сравнению с тепличными растениями, что отмечалось и другими авторами (Hawkins et al., 2003). Несмотря на годовые колебания, уровень экспрессии у растений груши содержащих интронированный ген был в несколько раз выше. При этом в условиях защищенного грунта присутствие интрона увеличивало уровень экспрессии в 2.5-3,7 раза тогда как в полевых разница была немного ниже 2,2-3,3 раза (рис.3).
Кроме того, у большинства линий, трансформированных геном gus c интроном, экспрессия сохранилась на прежнем уровне, и даже возросла в полевых условиях. Для линий, содержащих ген без интрона, наблюдалась противоположная картина: экспрессия сохранилась или возросла лишь у трети линий, а у остальных - упала в 2-6 раз, а в одном случае даже до уровня контроля. Таким образом, экспрессия генов с интроном оказалась более стабильной, что особенно важно для многолетних листопадных древесных растений Сходная картина наблюдалась и у трансгенных растений земляники.
Гистохимическое окрашивание листовых пластинок с черешками трансгенных растений земляники показало наличие детектируемой GUS-активности у 10 линий из 12, полученных с помощью векторной конструкции pBI121 (Рис.4). Последующий флюориметрический анализ экстрактов из листовой ткани подтвердил присутствие детектируемой активности -глюкуронидазы в тех же 10 линиях из 12. Между независимыми линиями активность -глюкуронидазы в экстрактах существенно варьировала, максимальный (Ф-6-III-3) и минимальный (Ф-6-III-5) уровни различались приблизительно в 2,8 раз (соответственно 3738 и 1330 нМ 4-MU/мин/мг общего белка).
Из трех независимых трансгенных клонов, полученных с помощью конструкции p35SGUSint, GUS-активность детектировалась только в двух. У клона Ф-45-I-2 G вставка гена gus отсутствовала. Уровни детектируемой GUS-активности в экстрактах листовой ткани для линий Ф-45-I-1 и Ф-45-III-1 составили соответственно 13888 и 19656 нМ 4MU/мин/мг общего белка, что превышает максимальную GUS-активность в растениях с геном gus без интрона (Ф-6-III-3) в 3,7 и 5,3 раз соответственно (Рис 2).
Усиление экспрессии гетерологичного гена вызываемое присутствием интрона (Intron-mediated enhancement, IME) известно достаточно давно (Callis et al., 1987).
Потенциальные объяснения включают повышение эффективности транскрипции, стабильности иРНК обусловленное сплайсингом, стабильность в процессе экспорта в и т.
д (Сlancy&Hannah, 2002; для обзора см. Le Hir at al., 2003), однако до конца механизм не ясен до сих пор. IME варьирует от 2-10 раз у двудольных до более чем 100-раз у однодольных (Сlancy&Hannah, 2002). Полученные нами результаты подтверждают данные наблюдения и впервые показывают стабильность данной закономерности на протяжении 6 лет в полевых условиях.
Приведенные результаты показывают, что экспрессия чужеродных генов в плодовых и ягодных культурах может быть достаточно постоянной на протяжении нескольких лет, как в тепличных, так и полевых условиях и значительно усиливается в случае использования интрон-содержащих конструкций. Растения при этом не показали каких-либо отличий от нетрансгенного контроля в течение всех лет испытаний.
25020015010050Рис 2. Флюориметрический анализ активности -глюкуронидазы в трансгенных растениях земляники in vitro, полученных с помощью векторных конструкций pBI121 и p35SGUSint.
(нМ 4-MU/мин/мг общего белка).
1800,350,А 1600,Б 300,1400,1200,0 250,1000,200,gus gus gus-intron 800,0 gus-intron 150,600,100,400,50,200,0,0 0,1999 2000 2002 2003 2005 2001 2003 20Рис.3 Активность -глюкуронидазы в листовой ткани трансгенных клонов груши в теплице (А) и полевых условиях (Б). среднее значение для групп содержащей ген gus без интрона и с интроном (нМ 4-MU/мин/мг сырого веса).
GUS-активность нМ 4-MU/мин/мг общего белка Ф-6-I-Ф-6-I-Ф-6-I-Ф-6-I-Ф-6-II-Ф-6-II-Ф-45-I-Ф-45-I-Ф-6-III-Ф-6-III-Ф-6-III-Ф-6-III-Ф-6-III-Контроль Контроль Ф-6-III-Ф-45-III-А В Г Б Д Рис 4. Гистохимический анализ GUS-активности в листьях и плодах трансгенных растений земляники садовой:
А - лист с линии Ф-6-III-10; Б - спелый плод с растения линии Ф-6-III-10; В - листья с линии Ф-45-III-1; Г - спелый плод с растения линии Ф-45-III-1; Д - сравнительный анализ GUS-активности в плодах с растений, содержащих безинтронный (вверху, линия Ф-6-II-1) и интронсодержащий гены gus (внизу, Ф-45-III-1).
Влияние компартментализации на уровень экспрессии маркерного гена gfp в трансгенных растениях сливы. В данном исследовании использовали различные сигнальные пептиды. Вектор pBin35SmGFP5-ER содержал ген gfp c сигнальными последовательностями, кодирующими N-концевой сигнальный пептид и C-концевой тетрапептид HDEL из хитиназы арабидопсиса для локализации продукта экспрессии в эндоплазматическом ретикулуме (ретикулярная форма GFP). Вектор pGAGFP-AFVY содержал ген gfp c аналогичной последовательностью, кодирующей N-концевой сигнальный пептид из хитиназы арабидопсиса и сигнальную последовательность, кодирующую С-концевой сигнальный пептид AFVY из фазеолина фасоли, определяющий накопление белка в вакуолях (вакуолярная форма GFP). Для сравнения использовали трансгенные линии, полученные при трансформации вектором pNovGFP в котором ген gfp не содержал никаких лидерных последовательностей (цитозольная форма GFP). Во всех использованных бинарных векторах ген gfp находился под контролем одинарного CaMV35S промотора. Вектора созданы на станции Биотрон А.С.Пушиным.
Полученные результаты продемонстрировали возможность использования лидерных последовательностей из генетически отдаленных видов растений для компартментализации продуктов экспрессии гетерологичных генов в сливе. Так, при сравнении различных трансгенных линий сливы был обнаружен различный характер экспрессии маркерного гена (рис.5). Также предварительные результаты показали визуально детектируемые различия в уровне экспрессии гена gfp. Линии с ретикулярной формой GFP имели значительно более высокий уровень экспрессии по сравнению с линиями с вакуолярной и цитозольной формами GFP.
Однако было отмечено, что уровень экспрессии GFP сильно варьировал в зависимости от возраста наблюдаемого растительного материала, что заставляет крайне осторожно подходить к оценке уровня экспрессии.
pNovGFP А В Рис. 5. Влияние лидерных последовательностей на характер экспрессии маркерного гена gfp в листьях трансгенных растений. pBin35GFP5-ER-эндоплазматический ретикулум;
pGAGFP-AFVY - вакуоль; pNovGFP - цитозоль.
A 450-490 nm excitation filter 510 nm FT dichromatic mirror LP 520 nm barrier filter B 450-490 nm excitation filter 510 nm FT dichromatic mirror BP 515-565 nm barrier filter 3.Трансформация садовых растений генами хозяйственно-ценных признаков.
Агротехнические признаки Влияние гена rol C на некоторые морфологические и физиологические показатели трансгенных растений. Возможность изменения формы растения методами генетической инженерии имеет колоссальное значение для цветочной индустрии.
Определение и изучение генов ответственных за рост, развитие и форму растения имеет кроме фундаментального и широкое прикладное значение. Идеальное горшечное растение - это плотная шапка цветов, прикрывающая зеленую часть растения (Mol и др.,1995).
Использование гена rolC вполне возможно в коммерческих целях для получения горшечных форм растений. Роль и воздейстивие rol генов из A.rhizogenes недостаточно ясна, тем не менее, вызываемые фенотипические изменения более значительны, чем генами из A.tumefaciens: уменьшение апикального доминирования, мужская стерильность, усиление корнеобразования и увеличение синтеза ароматических масел (Shmulling и др.,1988; Fladung и др., 1990; Pellegrinschi и др., 1994 van der Salm и др.,1997) все это может найти применение в практическом цветоводстве.
Для экспрессии гена rolC использовали сорт хризантемы УWhite SnowdonФ, листовые экспланты которого отобранные с укорененных in vitro растений регенерировали на среде Мурасиге-Скуга, обогащенной 2 мг/л БАП и 0,5мг/л ИУК, с частотой более 90%. После трансформации 38 листовых дисков обезоруженным агробактериальным штаммом GV3101, несущим плазмиду pPCV002 c геном rolC под контролем 35S промотором РНК вируса мозаики цветной капусты были получены 2 линии трансгенных растений. Растения этих линий успешно размножались и укоренялись на среде с высоким содержанием селективного антибиотика канамицина (50 и 10 мг/л соответственно). Частота трансформации составляла приблизительно 3%.
Таблица 7. Морфологические изменения трансгенных растений хризантем экспрессирующих ген rolC из A.rhizogenes Характеристика растения контроль Линия 1 Линия Высота растения (мм) 558,3 24,0 545,0 18,2 441,4 21,Длина междоузлия (мм) 27,1 1,0 30,0 6,4 15,9 0,Кол-во боковых побегов (шт.) 11,7 1,2 12,5 3,4 22,7 3,Диаметр соцветия (мм) 77,3 9,6 76,2 4,6 48,1 5,Количество бутонов (шт) 28,3 3,7 20,6 0,9 128,0 12,Как видно из таблицы 7 и рис. 6, растения одного из трансгенных клонов морфологически резко отличалась от контроля и демонстрировали ярко выраженный rolовый фенотип, признаки которого проявлялись уже на ранних стадиях развития при перенесении растений в теплицу. У растений этой линии наблюдалось 20% снижение высоты с 55 до 44 см, и двукратное укорочение междоузлий с 27-30 до 16 мм по сравнению с контрольными растениями. У трансгенов также происходило подавление апикального доминирования и множественное развитие боковых побегов, количество которых возрастало, в среднем, примерно вдвое с 12-13 до 23 на растение. Наибольшие различия наблюдались по количеству бутонов. Число закладываемых бутонов на трансгенных растениях линии 2 в 4-5 раз превосходило таковое, как у контрольных, так и у фенотипически не измененных растений линии 1 (табл.7) достигая 130 штук на растение при 20-30 на контрольных. Наблюдалась корреляция между увеличением количества бутонов и уменьшением их диаметра (48 мм по сравнения с 77 мм у контрольного растения). Помимо этого произошли изменения боковых язычковых цветов в соцветиях - соотношения ширины к длине. Они стали более широкими, чем контрольные. Листовые пластины трансгенных растений наоборот имели более удлиненную и изрезанную форму.
В период цветения растения этой линии покрывались сплошной плотной шапкой цветов, идеально соответствуя требованиям, предъявляемым к горшечным формам (Mol и др.,1995) (рис. 6А).
В целях подтверждения произошедшей трансформации была проведена полимеразная цепная реакция в присутствии праймеров, специфичных к внутреннему фрагменту гена rolC, однако амплификация фрагмента ожидаемой длины в 514 п.н.
происходило как в трансгенных растениях, так и в контрольных (рис.6В). Подобные результаты описаны для Nicotiana sp. в работе Furner и др., (1986). Он показал присутствие в некоторых видах табака последовательностей, гомологичных rol генам.
Проведенный в дальнейшем ПЦР анализ некоторых других сортов хризантем показал амплификацию внутреннего фрагмента гена rolC во всех исследованных растениях. Для определения встроившегося в нашем эксперименте гена был синтезирован праймер для участка 35S промотора под контролем, которого находилась переносимая нами последовательность. Его добавляли в первую смесь вместе с правым праймером для rolC гена. В этом случае происходил синтез фрагмента размером в 700 пн только на ДНК трансгенных линий (рис.6В).
Б А 1 В.
Рис. 6. А - Растения в теплице: слева - нетрансгенное, справа - растение линии 2;
Б - Скульптура поверхности пыльцевых зерен. Фотографии выполнены на сканирующем электронном микроскопе:
1 - пыльцевые зерна нетрансгенных растений;2 - пыльцевые зерна линии 2.
В- ПЦР- анализ растений хризантемы сорта White Snowdon на присутствие гена rolC A.rhizogenes: Амплификация последовательности с праймерами на внутренний участок rolC гена (514 п.н.) - 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 дорожки. Амплификация последовательности с праймерами на rolC и 35S промотор (700 п.н.) - 2, 3, 4, 7, 8, 9 дорожки.
1 - молекулярный маркер pGEM2/AluI: фрагменты 679, 666, 521; 2,3,4, - нетрансгенные хризантемы (Bornholm, White Hurricane, Parliament; 5 - нетрансгенные растения сорта White Snowdon; 7,8 - трансгенные растения (линия1, линия2), 9 - плазмида pPCV002 rolC-35S.
Морфологические показатели полученных нами rolC-растений актинидии также существенно отличались от соответствующих показателей контрольных нетрансформированных растений (табл.8). Это, в первую очередь, ослабление роста надземной части и формирование кустовидного габитуса. Средняя высота трансгенных растений была меньше, чем контрольных. RolC-трансформанты уступали контрольным растениям и по суммарной длине ветвей. Среднее количество разветвлений на 1 м суммарной длины ветвей в различных трансгенных линиях актинидии было достоверно больше чем в контроле. Ослабление роста надземной части у трансгенных растений сопровождалось укорачиванием междоузлий, средняя длина междоузлий на ветвях первого порядка у rolC-трансформантов была в 2-8 раз меньше, чем у контрольных растений. На rolC-трансформантах актинидии формировались удлиненные листья с увеличенным отношением длины к ширине. Листья трансгенных растений отличались, также, более бледной окраской по сравнению с контрольными. Отмечено запаздывание в наступлении фенофаз у rolC- трансформантов по сравнению с контрольными растениями.
Изучение стерильности пыльцы контрольных и трансформированных растений выявило значительное различие между ними. Так, доля стерильной пыльцы у растений линии 2 (с успешной интеграцией гена rolС в геном), составляет 98,8 %, в то время как у растений линии 1 (не имеющих фенотипического проявления активности этого гена), - 29,1% и 39,1% - у контрольных. Возможно, повышенные показатели стерильности пыльцы у трансгенных растений обусловлены изменением гормонального статуса под действием продуктов гена rolC.
На рис. 6Б представлена пыльца контрольных растений хризантемы: пыльцевые зерна 3-бороздно-оровые, сфероидальные; в очертании с полюса 3-лопастные, с экватора округлые или широкоэлиптические; полярная ось 40 мкм, экваториальный диаметр мкм. Борозды длинные, глубокопогруженные, узкие. Оры выпуклые, округлые, 7 мкм в диаметре. Шипы длиной 6-8 мкм, в основании ширококонические, на вершине заостренные, расстояние между верхушками шипов 10-12 мкм. В основании шипов отчетливо видны крупные перфорации. Многие пыльцевые зерна густо облеплены пыльцевым клеем.
Пыльца трансгенных растений имела различную степень нарушений. Нормальная пыльца: пыльцевые зерна линии 1 отличаются элипсоидной формой, сглаженностью шипов или их недоразвитием.
Стерильная пыльца со сглаженной скульптурой поверхности: пыльца растений линии 2 бороздно-оровая, в очертаниях сфероидальная, диаметром 30 мкм. Борозды неглубокие, некоторые не выражены, нередко на месте борозд сохраняется только выпуклая ора, 3,5 мкм. диаметром. Скульптура сглажено-шиповатая, высота шипов 3 мкм, они соединены невысокими гребнями, расстояние между шипами 10 мкм, перфорации не просматриваются.
С целью изучения возможного механизма действия гена rolC нами было определено содержание некоторых фитогормонов в трансгенных растениях актинидии..
В условиях in vitro наблюдалось значительное увеличение содержания фитогормонов в молодых листьях трансгенных растений линии R2 по сравнению с контролем. Особенно резко возросла концентрация ИУК - почти в 10 раз. Содержание активных форм цитокининов (зеатина и зеатин-рибозида) и абсцизовой кислоты в листьях rolC-трансформантов увеличилось соответственно в 5,0 и 7,0 раз по сравнению с контрольными растениями. Однако, несмотря на такие большие различия в содержании эндогенных регуляторов роста, трансгенные растения существенно не отличались по своим морфологическим показателям от контрольных.
Среднее Среднее Суммар Средняя Средняя Средняя длина количество количество ная длина Габитус высота междоузлий на разветвлений разветвлений 3-длина ветвей 3-4 надземной Линия растений,с ветвях 1 на 1 м порядков на 1 м ветвей, порядков,с части м порядка, см суммарной суммарной см м длины ветвей длины ветвей 104,3 392,3 2,4 8,4 5,2 1,Контроль лиановидный R1 55,0 251,6 1,4 16,3 9,9 0,кустовидный R2 56,5 302,0 1,2 10,9 6,8 1,кустовидный R3 24,0 73,5 0,6 26,0 15,0 0,кустовидный R6 24,0 53,1 0,6 24,5 13,2 0,кустовидный R7 30,0 173,4 0,7 10,7 5,2 0,древовидный R9 41,7 133,6 1,7 13,1 9,7 0,кустовидный R10 54,9 179,2 1,3 13,9 8,8 0,кустовидный Растения актинидии трансформированные геном rolC R101 8,5 27,2 0,3 43,7 23,9 0,древовидный Слева клон R101; справа контроль Табл. 8. Морфологические особенности растений актинидии коломикты, трансформированных геном rolC.
Таблица 9. Содержание эндогенных фитогормонов в апикальных побегах контрольных и трансгенных растениях хризантемы сорта White Snowdon.
иния Содержание фитогормонов (нг/г) Зеатин+ Индолилуксусная Абсцизовая кислота зеатинрибозид кислота Закладка бутонов Контроль 3 0,4 306,0 35,0 1,1 0,Клон 150,0 10,0 71,0 6,9 4,1 0,Клон 250,0 30,2 58,0 7,1 4,0 0,Цветение Контроль Измерения не Измерения не 0,25 0,Клон 1 проводили проводили 10,0 0,Клон 100,0 1,Увядание Контроль Измерения не Измерения не 14,9 1,Клон 1 проводили проводили 51,9 7,Клон 101,3 12,Некоторые фенотипические особенности rolC-трансформантов напоминают определенные гормональные эффекты, в частности, увеличение соотношения цитокининов к ауксинам (Schmulling et. al., 1988, Spena et.al., 1989). Nilsson et. al. (1993), напротив, считают, что для растений, экспрессирующих ген rolC, характерна тенденция к снижению концентрации активных цитокининов и их предшественников, а не к их увеличению. Наши данные показали уменьшение активных форм цитокининов в трансгенных растениях актинидии коломикты, растущих in vivo. Наблюдавшееся нами резкое возрастание содержания ИУК в апексах может быть обусловлено вторичными эффектами гена rolC и быть связанным с особенностями гормональной регуляции в растениях актинидии коломикты.
Табл. 10. Содержание и соотношение эндогенных фитогормонов в апексах побегов контрольных растений актинидии коломикты и rol C- трансформантов.
Содержание Соотношение фитогормонов, нг/г концентраций Линия фитогормонов Фенотипические изменения З+ЗР ИУК АБК З+ЗР/ИУК З+ЗР/АБ К Контроль 49,6 13,0 27,6 3,8 1,8 - R2 248,0 134,0 196,1 1,9 1,3 нет Одним из объяснений механизма апикального доминирования является предположение об ингибировании прорастания латеральных почек ауксином, базипетально транспортирующимся из апексов побегов (Bangerth, 1989; Cline, 1991, 1994).
Возможно, что увеличение содержания ИУК в трансформантах является ответом растения на усиление ветвления побегов, вызванное геном rolC. В ранее опубликованных работах разными исследователями приводились противоречивые данные по влиянию трансформации растений геном rolC на их гормональный баланс. Возможно, это происходило оттого, что делались попытки сравнивать результаты исследований, проведнных на разных видах растений, или находящихся на разных фазах онтогенеза.
Поэтому мы провели исследования на одном виде растения, на разных фазах развития. Из полученных нами результатов видно, какое сильное влияние оказывает трансформация растений хризантемы указанной генетической конструкциией на их гормональный баланс в сравнении с исходной формой. При этом бросаются в глаза зависимость в уровне каждого отдельного класса исследованных фитогормонов, соотношения фитогормонов разных классов от фазы развития, а также различий между трансформированными и исходной формами на разных стадиях онтогенеза.
Таким образом, нашими исследованиями показано стабильное изменение гормонального статуса rolC-трансформантов актинидии по сравнению с нетрансформированными растениями. Показана потенциальная возможность изменения габитуса надземной части древесных и декоративных цветочных растений посредством переноса в их геном гена rolC из A. rhizogenes.
Устойчивость к абиотическим факторам внешней среды - гербицидам. Перенос генов устойчивости к гербицидам в плодовые или орехоплодные деревья может оказаться особенно полезным для получения качественного посадочного материала, на что влияет, в частности, наличие сорняков. В питомниках же борьба с сорняками затруднена, так как плодовые растения в молодом возрасте особенно чувствительные к гербицидам, а другие способы трудоемки и недостаточно эффективны. Кроме того, в настоящее время в мире лучшим способом содержания почвы в садах считается сочетание задернения в междурядьях и гербицидного пара в приствольной полосе. Поэтому подвои, устойчивые к гербицидам, идеально подходят для такой системы содержания почвы.
C целью получения трансгенных растений подвоев яблони и груши, обладающих устойчивостью к гербициду четвертого поколения УBastaФ, содержащего в качестве действующего вещества фосфинотрицин, и другим аналогичным гербицидам, мы провели несколько экспериментов по переносу гена устойчивости к этому веществу bar в клоновые подвои груши ГП № 217 и яблони 57-545. Агробактериальную трансформацию листовых дисков и черешков подвоев проводили вектором рВIBar в супервирулентном штамме СВЕ21. Образование каллуса у трансформированных эксплантов наблюдалось уже на десятый день культивирования, а регенерация побегов происходила преимущественно на втором месяце культивирования.
После первой трансформации удалось получить 30 регенерантов подвоя яблони и 309 груши (табл.11). Но только одно растение яблони и 17 груши активно росли и укоренялись в присутствии селективного агента. ПЦР анализ подтвердил наличие вставки гена bar в геномы этих 18 регенерантов. Усиление регенерационной способности и образование большого количества лэскейпов являлось следствием селекции на РРТ, о чем ранее уже отмечали Hebert-Soule et al. (1995). Более эффективным оказалось сочетание селективных агентов или длительное (6 месяцев) пассирование на среде с высоким содержанием (5.0 мг/л) фосфинотрицина (табл.11).
Дальнейшее размножение и укоренение полученных линий мы проводили на средах с различными концентрациями РРТ для определения предельной концентрации селективного агента не вызывающей повреждения или гибель трансгенных растений.
Большинство линий клоновых подвоев без каких-либо повреждений успешно пролиферировали на среде, содержащей до 100мг/л РРТ (табл.12), тогда как контрольные растения погибали при 2-3 мг/л. фосфинотрицина. Трансгенные растения этих линий образовывали корни на среде с содержанием РРТ до 15 мг/л, в то время как контроль также погибал на 2 мг/л. Растения отдельных линий продолжали успешно размножаться при 300 мг/л РРТ в среде, что более чем в сто раз превышает летальную дозу.
Таблица 11. Результаты трансформации подвоев яблони и груши агробактериальным штаммом СВЕ21, +несущим вектор pBIBar Селекция Эксплант Число Общее число Транс Частота Вид мг/л(число In vitro эксплантов регенерантов гены трансформ пассажей/длител ации,% ьность Яблоня 2.0 РТТ (6х4нед) листья 78 30 1 1.57-5Груша 2.0 РТТ (3х4нед) листья 256 14 0 ГП217 черешки 258 48 0 2.0 РТТ (3х4нед) листья 109 59 1 0,25.0 Км(7х4нед) черешки 98 41 5 5,2.0 РТТ (3х4нед) листья 123 19 0 5.0 РРТ (6х4нед) черешки 175 73 5 2,листья 166 30 0 черешки 240 136 6 2,Таблица 12. Устойчивость трансгенных линий подвоев яблони и груши к фосфинотрицину в условиях in vitro.
Клон Концентрация фосфинотрицина,мг/л 0 100 200 300 500 750 100 15контроль + D P-BK + +/- +/- +/- -- D P-BK2 + + +/- -- D P-BU + +/- -- D P-BU2 + + +/- -- D P-BW + + + -- -- D P-BX + + + -- -- -- -- D T-AP + + -- -- D T-BO + + +/- -- -- D T-BT + + -- -- -- -- D T-CD + + -- D T-CF + -- D T2- AF + + -- D T2- BF + + + +/- -- -- -- D T2- BR + + +/- -- -- -- -- D T2- BS + + + + -- D T2-DE + +/- +/- -- D T2-ES + +/- +/- +/- -- -- -- D +- размножение без поражения; +/--отсутствие размножения без поражения; -- -различная степень некроза;
D - гибель растений Трансгенные линии яблони и груши, размноженные в условиях in vitro, были успешно адаптированы к условиям защищенного грунта. Молодые растения яблони и груши были подвергнуты обработке гербицидом Баста в различных концентрациях.
Растения трансгенных линий подвоя яблони №57-545 показали высокую степень устойчивости к действию гербицида Баста. Доза гербицида, рекомендованная производителем, составляет 6 л/га. Однако большинство анализируемых трансгенных линий, за исключением линии груши T-CF, выдерживало дозу, двукратно превышающую рекомендуемую, и только при обработке дозой, четырехкратно превышающей рекомендуемую, у трансгенных линий наблюдались незначительные признаки повреждения листовой поверхности (Таблица 13).
иния T-CF проявила слабую устойчивость к действию гербицида Баста, что может быть связано со встраиванием гетерологичных генов в слабо транскрибируемую область генома, либо с повреждением регуляторных элементов генетических конструкций. У трансгенных линий подвоя груши также не было обнаружено признаков действия гербицида даже в очень высоких дозах, в то время как контрольные растения полностью погибали через 12 дней после обработки даже при обработке низкими концентрациями гербицида (Рис. 7).
Таблица 13. Анализ трансгенных линий подвоев яблони и груши на устойчивость к действию гербицида Баста в условиях защищенного грунта.
Культура Линия Доза гербицида в пересчете на полевую дозу 3 л/га 6 л/га 12 л/га 24 л/га Яблоня Контроль П П П П P9 ++ ++ ++ + Груша Контроль П П П П P-BK ++ ++ ++ н/а P-BK2 ++ + + н/а P-BU2 ++ ++ + + P-BW ++ ++ ++ + P-BX ++ ++ ++ + T-CD + + +/- - T-CF +/- - - н/а T2-AF ++ ++ + + T2-BF ++ ++ + +/- T2-BR ++ + - - T2-BS ++ ++ +/- +/- T2-DE ++ ++ + - T2-ES ++ ++ ++ н/а + - степень устойчивости, П - растения погибли, н/а - не анализировали При обработке растений груши и яблони гербицидом Либерти наблюдалась схожая картина.
Поскольку условия открытого и закрытого грунта сильно отличаются, уровень экспрессии гетерологичных генов в оптимальных и стрессовых условиях также может сильно отличаться. Поэтому проведение полевых испытаний является важным этапом необходимым для отбора наиболее перспективных форм трансгенных растений.
Часть клонально размноженных и адаптированных растений подвоев яблони и груши были вовлечены в полевые испытания, которые проводились в 2002-2009 годах на сертифицированном полигоне, созданным на базе карантинного питомника ВНИИСПК, г.
Орла (Рис.7). Целью полевых испытаний была проверка эффективность экспрессии гена bar в условиях открытого грунта. Обработку растений груши и яблони гербицидами Баста и Либерти проводили параллельно экспериментам по изучению устойчивости трансгенных линий яблони и груши к действию гербицида в условиях защищенного грунта. Концентрация и расход гербицида Баста соответствовали рекомендуемой производителем полевой норме (4 - 6 л/га).
В целом трансгенные линии подвоев яблони и груши показали высокую степень устойчивости к действию гербицида Баста в полевых условиях, в то время как нетрансгенные контрольные растения полностью погибали (Таблица 14).
Результаты анализа устойчивости трансгенных линий подвоев яблони и груши к действию гербицида показали, что уровень экспрессии гена bar в полевых условиях был сравним с уровнем экспрессии в условиях закрытого грунта. Были отобраны линии груши (P-BW и T2-BS) с высокой степенью устойчивости к действию гербицида. (Рис.8).
Таблица 14. Результаты полевых испытаний трансгенных линий подвоев яблони и груши на устойчивость к действию гербицида Баста.
Культура Линия поражение Контроль D Яблоня P9 ++ Контроль D P-BK + P-BK2 + P-BU + P-BU2 + P-BW ++ Груша P-BX + T-CD + T2-AF + T2-BF + T2-BR + T2-BS ++ T2-DE + + - степень устойчивости, D - растения погибли, В результате выполненной работы нами получено 17 трансгенных линий подвоя груши ГП №217, и одна линия подвоя яблони №57-545. Наличие в геноме последовательности гена bar подтверждено ПЦР-анализом, а его экспрессия подтверждается устойчивостью полученных растений к высоким концентрациям действующего вещества гербицида Баста. Таким образом, показана возможность получения клоновых подвоев семечковых культур (яблони и груши) с признаками устойчивости к гербицидам, что создает предпосылки для использования трансгенных растений в садоводстве и расширения генетической базы для создания новых сортов.
а б а б г г в в д д е е Рис. 7. А, пролиферация растений клонового подвоя яблони №57-545 на среде с 5 мг/л РРТ (слева контроль, справа - трансгенные растения); б, укоренение растений подвоев груши на среде с РРТ (слева направо: 1 - контроль на 2 мг/л РРТ, трансгенные растения на 5, 10, и 15 мг/л РРТ); в, растения подвоя яблони №57-545 в теплице после обработки 0.2% раствором гербицида Баста (слева - контроль, справа - трансгенное растение с геном bar); г, растения подвоя ГП№217 в теплице после обработки 0.2% раствором гербицида Баста (слева - трансгенные растения с геном bar, справаЦ контроль); д, маточник трансгенных подвоев яблони №57-545; е, полевые испытания подвоев груши (слева - трансгенные растения с геном bar, справаЦ контроль, обработка 0.2% раствором гербицида Баста) Экспрессия гена -эндотоксина в растениях хризантем для повышения устойчивости к вредителям. Одним из направлений, где успешно применяется генетическая инженерия стало решение проблемы устойчивости к насекомым вредителям. В настоящее время в этой области достигнут значительный прогресс. Гены, отвечающие за устойчивость к болезням и вредителям, клонированы, охарактеризованы и уже получены трансгенные растения. Одним из первых в растения был перенесен ген Bt-токсина Bacillus thuringiensis, широко применяющегося с 60-х годов инсектицида биологического происхождения. Этот инсектицид обладает узконаправленной токсичностью к насекомым и является безвредным по отношению к животным и человеку. Тот факт, что гипервариабельные Сконцевые фрагменты -эндотоксинов включают сайты связывания с мембранами и определяют специфичность токсического действия подтверждается на сегодняшний день значительным количеством исследований. Анализ возможных пространственных структур элементов полипептидной цепи -токсинов указывает на то, что сайты связывания с гликопротеинами мембран вероятнее всего расположены в области между 385-ым и 792ым АК-позициями в гипервариабельной области. Роль гипервариабельных С-концевые фрагментов включающих сайты связывания с мембранами в определении специфичности токсического действия -токсинов подтверждается на сегодняшний день значительным количеством исследований. Так, например, замена короткого участка с 307-ого по 382-ой АК-остатки белка Cry11B на такой же из Сry11A придавала первому инсектицидные свойства по отношению к двукрылым A.aegypti, которыми интактный Cry11B не обладал (Whiteley et al.,1986).
Ранее В.В. Шматченко с соавторами (1990) были получены укороченные варианты гена Cry1Ab1. Трансгенный табак экспрессирующий укороченный вариант гена под контролем полуиндуцибельного 1TR промотора маннопин синтазы демонстрировал высокую устойчивость к личинкам непарного шелкопряда (Porthetria dispar) - стандартного объекта детекции активности -эндотоксинов.
Экспрессия одного из вариантов генной конструкции под контролем сильного конституитивного 35S промотора ВМЦК в растениях табака показала существенное изменение спектра активности полученного белка (Рукавцова Е.Б., 1994). Особенно интересным оказалась возросшая устойчивость полученных растений к новому классу организмов - паутинным клещам, которые являются одним из основных вредителей цветочных культур защищенного грунта. К сожалению, проведенные тесты не позволили достоверно детектировать эту активность и обнаружить с помощью радиоиммунологического анализа присутствие энтомотоксина в тканях трансгенных растений.
Укороченный вариант гена Cry1Ab1 (Шматченко и др., 1990) под контролем 35S промотора в составе бинарного вектора pBTP41 с маркером устойчивости к канамицину была использована нами для экспрессии в хризантемах с целью изучения возможности повышения их устойчивости к паутинному клещу.
Агробактериальная трансформация растений хризантем геном -токсина B.
thuringiensis. Так как во время проведения трансформаций (1992-93 гг) в нашем распоряжении не было обезоруженных супервирулентных агробактериальных штаммов, плазмида pBTP41 была перенесена методом трехродительского скрещивания в дикий штамм А281 с необезоруженной супервирулентной плазмидой рТiВо542. Таким образом, в используемой для трансформации конструкции содержалось три участка ограниченных краевыми повторами и способными переносится в растительный геном. На плазмиде pTiBo542 расположены левая область (TL) Т-ДНК с генами синтеза ауксинов, обуславливающих гормононезависимый рост трансформированных растительных клеток, и правая область (TR) Т-ДНК с генами синтеза опинов, в данном случае преимущественно агропина, разделенные непереносимой последовательностью. Кроме того в клетках агробактерий присутствовал бинарный вектор pBTP41, поддерживаемый селекцией на тетрациклине и содержащий в своей области Т-ДНК гены устойчивости растительных тканей к канамицину и синтеза укороченной активной формы -токсина Cry1Ab1.
Полученная конструкция использовалась для трансформации сорта White Hurricane, продемонстрировавшего высокую регенерационную способность в предыдущих экспериментах. На среде МС с добавлением 2,0 мг/л БА и 0,5 мг/л НУК, регенерировало 55% листовых эксплантов этого сорта, на одном регенерирующем экспланте образовывалось, в среднем, 2,8 адвентивных побега. В экспериментах по генетической трансформации были использованы листья, полученные с укорененных in vitro растений.
В результате проведенной трансформации 37 листовых дисков наблюдалось образование каллуса на 100% эксплантов. Полученный каллус успешно пролиферировал на среде с 50мг/л Км. Проведенный анализ экспрессии гена nptII показал высокую активность кодируемого им фермента неомицинфосфотрансферазы в большинстве протестированных каллусных линий, что свидетельствует об успешном переносе последовательностей, ограниченных краевыми повторами, с бинарной векторной плазмиды VIR аппаратом дикого супервирулентного штамма А281.
В результате длительного культивирования полученных каллусных клонов на среде с 50 мг/л канамицина регенерировало две линии растений и одна тератомоподобная структура. Частота трансформации, таким образом, составила около 4%. Полученные растения обеих линий успешно мультиплицировались и укоренялись на средах с высоким содержанием селективного антибиотика (50мг/л и 10мг/л соответственно), полностью подавлявших рост и корнеобразование контрольных растений. Укоренить побеги с тератомы не удалось, что, по-видимому, обуславливалось присутствием в ее геноме достаточно протяженного фрагмента генов синтеза фитогормонов, способного экспрессировать активный цитокинин.
Трудности трансформации хризантем в начале 90-х годов отмечались многими исследователями. Только у 4 из 14 исследованных Van Wordragen M.et al., (1991, 1992) сортов была выявлена восприимчивость к агробактериальной инфекции (штаммы С58 и Ach5). В дальнейших экспериментах с использованием супервирулентных агробактериальных штаммов авторы сравнивали чувствительность 7 сортов хризантем.
Обнаружены большие различия среди сортов, но штамм А281 был наиболее эффективным (в 4-5 раз) для всех сортов, чем Ach5, а для сорта Retical даже более чем в 20 раз.
Получить трансгенные побеги, несущие разоруженную Т-ДНК, можно, по мнению Lowe J.
et al., (1993), используя для инокуляции совместно дикий и обезоруженный штаммы.
В наших экспериментах были получены трансгенные растения хризантем путем трансформации эксплантов неразоруженным диким штаммом агробактерий, несущим бинарный вектор. Длительное культивирование каллусных линий на среде с селективным антибиотиком привело к регенерации двух трансгенных растений, одно из которых было трансформировано только экспрессионной кассетой из вектора pBTP41. Таким образом, несомненно, что при увеличении масштабов эксперимента возможно получение большего количества трансгенных растений, достаточного для подробной оценки их устойчивости к клещу.
Биохимический и молекулярно-биологический анализ трансгенных растений хризантем. Высокое содержание пигментов и фенольных соединений не позволили провести анализ NPTII активности в растительных тканях. Анализ экстрактов на колонках дал положительный результат у всех трех клонов (данные не приводятся). Синтез агропина, кодируемый TR-ДНК областью плазмиды pTiBo542 наблюдался во всех каллусных клонах, тератомной структуре и в одном клоне, что свидетельствует о независимом переносе TR и TL участков плазмиды pTiBo542 а также pBTPограниченных краевыми повторами.
Присутствие последовательности гена -токсина Cry1Ab1 в обоих полученных трансгенных линиях подтверждалось блот-гибридизацией по Саузерну. В качестве зонда для гибридизации использовали ДНК плазмиды pRTBt 90 содержащую ген bt-токсина (рис. 8А). Проведенное иммунохимическое определение присутствия белка Cry1Abметодом иммуноферментного анализа с поликлональными кроличьими антителами показало его активный синтез и накопление в листовых тканях обеих линий на уровне сотых долей процента от общего белка растений (рис. 8Б).
Анализ устойчивости трансгенных растений хризантем к паутинному клещу Tetranychus urticae и сподоптере Spodoptera exigua в условиях теплицы. Полученные растения хризантем трансгенных линий были успешно размножены в условиях in vitro и адаптированы к почвенным условиям в теплице станции Биотрон. При выращивании в условиях отсутствия обработок пестицидами наблюдалось явное снижение поражения растений вредителями, в первую очередь, паутинным клещом (рис. 8В.). Однако, получить статистически достоверные данные по изменению устойчивости не удалось как от исследователей ГНИЦПМ (Оболенск) так и ВНИИФ РАСХН (Голицыно). Только проведенные при поддержке гранта ВАС ЮНЕСКО (SC/RP 206.634.6) в лаборатории доктора J. De Jong (CPRO-DLO, Wageningen) исследования, позволили достоверно установить существенную устойчивость трансгенных линий как к типичному представителю отряда Lepidoptera сподоптере (Spodoptera exigua), так и к паутинному клещу (Tetranychus urticae Koch.), являющегося членом класса акарид (Arthropoda) (Feitelson J. 1992). Данные приведены на рисунках 8Г,Д.
Вес гусениц Spodoptera exigua питавшихся листьями трансгенных растений был в 3-6 раз ниже, чем на листьях контрольных растений (рис. 8Г). Учитывая, что сподоптера является типичным объектом тестирования активности -эндотоксинов, полученные результаты свидетельствуют о достаточно высоком, для немодифицированной последовательности, уровне экспрессии перенесенного гена.
Наиболее интересной, по нашему мнению, является достоверно установленная существенная устойчивость тестируемых линий к паутинному клещу. Количество клещей на листьях трансгенных растений инокулированных тремя взрослыми особями, после недельного размножения было меньше в 4-12 раз по сравнению с контролем (рис. 6Д).
Особенно сильное подавление наблюдалось на верхушечных листьях, что, по-видимому, связано с более высоким содержанием токсина в активно растущих тканях. Так на молодых листьях растений Клона 2 происходило полное подавление размножение паразита - в течение пяти недельного срока на листьях оставалось по три клеща, тогда как на контрольных растениях происходило более чем десятикратное увеличение их численности (в среднем до 37 особей). Несколько меньший эффект наблюдался на средних и нижних листьях этого же клона где наблюдалось утроение численности клещей, в то время как на соответствующих листьях контрольных растений их число превысило четыре десятка.
В результате впервые получены достоверные свидетельства активности эндотоксинов Bacillus thuringiensis на представителей другого класса членистоногих Акарид. Предыдущие сообщения о наличии подобной активности, как правило, были лишены достоверных экспериментальных свидетельств ее проявления (Feitelson et al., 1992). Специфическая токсичность продукта укороченного гена -эндотоксина могла быть обусловлена по нашему мнению, как модификацией гипервариабельного участка токсина, что придало ему способность активно связываться с рецепторами кишечного тракта нового типа организмов, так и присутствием активной формы токсина в клеточном соке растений обеспечив, тем самым его попадание в организм сосущего паразита, крайне затрудненное при поверхностном нанесении препарата.
б б а в а в 94кД 94кД 94кД 94кД Cry1AbCry1AbCry1Ab67кД 67кД 67кД 67кД 43кД 43кД 43кД 43кД 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1010г д г д 9988700 контроль 700 контроль контроль контроль 6630 клон30 клон500 клон500 клонклонклон44клонклон3322110 верхний средний нижний 0 верхний средний нижний 1 2 3 4 5 6 Тест на устойчивость к паутинному клещу 1 2 3 4 5 6 Тест на устойчивость к паутинному клещу (Tetranychus urticae Koch.) (Tetranychus urticae Koch.) Тест на устойчивость к Spodoptera exigua Тест на устойчивость к Spodoptera exigua Рис. 8. А - Анализ присутствия последовательности гена -эндотоксина в трансгенных клонах хризантемы методом блот-гибридизации по Саузерну. ДНК обрабатывали BamH1 рестриктазой.1 - Клон 1; 2 - нетрансгенное растение; 3 - Клон 2; 4 - плазмида pRTbtБ - Иммунологический тест на присутствие -эндотоксина в трансгенных растениях хризантем: 1 - молекулярные маркеры; 2 - Клон 1;
3 - Клон 2; 4 - нетрансгенное растение.
В. Повреждение растений в теплице паутинным клещем: Слева - трансгенное растение Клона 1, справа контрольное растение;
количество особей количество особей вес личинки (мг) вес личинки (мг) Генетическая трансформация садовых растений геном суперсладкого белка. Тауматин обнаружили в тропическом растении Thaumatococcus danielli Benth, плоды которого имеют студенистый ариллус (присемянник) с очень сладким вкусом (Higginbotham, 1979) и было показано, что этот сладкий вкус придает семейство белков, названных тауматинами (van der Wel and Loeve, 1972). Позднее тауматин-подобные (ТL) белки были найдены в ряде других растений, например, в хурме (Diospyros texana; Vu and Huynh, 1994). Зеаматин и зеаматин-подобные белки, имеющие гомологию с тауматином, выделили из семян кукурузы и нескольких других растений (Roberts and Selitrennikoff, 1990; Vigers et al., 1991). Белки, составляющую основную часть растворимых белков в созревающих плодах черешни (Fils-Lycaon et al., 1996) и винограда (Tattersall et al., 1997), также обладали гомологией с тауматином.
TL-белки, выделенные из семян, показали активность против ряда грибов (Roberts and Selitrennikoff, 1990). Сверхэкспрессия TL-белка, продукта гена Zlp кукурузы, показала фунгицидную активность в трансгенных растениях табака (Malehorn et al., 1994).
Осмотин (TL белок табака), перенесенный в картофель, привел к задержке в проявлении симптомов болезни, вызываемой Phytophtora infestans (Liu et al., 1994), а в томат - повысил устойчивость к Ph.infestans, Oidium lycopersica, но не влиял на Botrytis cinerea (Veronese et al., 1998). Ген tlp-D34, кодирующий TL белок риса, перенесли в рис, который повысил устойчивость к Rhizoctonia solani (Datta et al., 1999). Механизм фунгицидного действия TL-белков связан, вероятно, с пермеабилизацией мембраны (Vigers et al., 1992).
Tattersall et al. (1997) предположили, что накопление PR белков в размягченных и интенсивно сладких ягодах винограда является результатом атаки патогена и играет антигрибную роль, так как ранее отмечалось, что настоящая мучнистая роса (Uncinula necator) никогда не наблюдается на зрелых ягодах винограда со степенью зрелости 7-Brix, что коррелирует со стадией высокой экспрессии тауматин-подобного гена VVTL(Tattersall et al., 1997).
Тауматин, так же как и некоторые другие растительные белки - монеллин, миракулин, вызывает ощущение сладкого вкуса, воздействуя на соответствующие вкусовые рецепторы ротовой полости (Винецкий, 1987). Его сладкий вкус чувствуется уже при концентрации 10-8 М (Higginbotham, 1979). Одна из наиболее распространенных форм белка, тауматин II, примерно в 4000 раз слаще сахарозы. Кроме того, тауматин усиливает многие виды других вкусовых ощущений (Higginbotham et al., 1981). Жители Восточной Африки издавна используют плоды Thaumatococcus danielli для подслащивания различных пищевых продуктов (Винецкий, 1987). Тауматины широко проверялись в течении cеми лет и их признали безопасными для потребления человеком (Higginbotham et al., 1983). В настоящее время тауматин входит в состав различных подсластителей - УTalinФ (Великобритания), УSun-Sweet T1Ф (Япония) (Винецкий, 1987).
кДНК гена thaumatin II выделили и секвенировали уже достаточно давно (Edens et al., 1982). Ген thaumatin II перенесли в картофель с помощью A.rhizogenes и экспрессия белка легко определялась по сладкому вкусу, для чего было достаточно 0.1 г растительной ткани (Witty and Harvey, 1990). Ген thaumatin II также перенесли в огурец (Szwacka et al., 1996, 1998). В последнем случае сообщалось об улучшении вкуса плодов и о начале тестировки на устойчивость к Pseudoperonospora cubensis.
Таким образом, перенос и экспрессия гена тауматина в растениях может применяться для следующих целей: 1) повышения устойчивости к грибам, 2) придания сладкого вкуса, 3) изменения природного вкуса (Dolgov et al., 1999b).
Для изучения возможности использования тауматина в практической селекции садовых растений был создан экспрессионный вектор pBIThau35 (Таран С.А.,ФИБХ РАН). Источником служила любезно предоставленная доктором А. Ледебоером (Unilever) плазмида pUR528 содержащая кДНК препротауматина II под лактозным промотором.
EcoRI-HindIII фрагмент содержащий полную последовательность кДНК препротауматина II была клонирована в полилинкер плазмиды pBB. В дальнейшем последовательность гена GUS плазмиды pBI121 была заменена XbaI-BamHI фрагментом плазмиды pBBThau с геном препротауматина II между 35S промотором вируса мозаики цветной капусты и терминатором гена нопалинсинтазы. Получившаяся плазмида pBIThau35 была перенесена в обезоруженный супервирулентный штамм CBE21 любезно предоставленные Е.Ревенковой (Центр Биоинженерия РАН) и успешно использовался для трансформации различных растений.
Табл. 15. Использование тауматина II для трансформации сельскохозяйственных растений.
Культура Кол- Изменение Повышение Институт во вкуса устойчивости линий яблоня 2 + ФИБХ РАН груша 3 +++ ФИБХ РАН земляника 32 ++ Botrytis cinerea ФИБХ РАН морковь 8 + Fusarium avenaceum, ФИБХ РАН, ВНИИССОК Alternaria radicina. РАСХН томат 15 +++ Phytophthora infestans, ФИБХ РАН, ВНИИСБ Xanthomonas vesicatoria. РАСХН гиацинт 5 Botrytis cinerea, ФИБХ РАН, ЦБС НАН Fusarium culmorum Белоруссии картофель 28 Phytophtora infestans Центр Биоинженерия РАН Несмотря на неудачное расположение смыслового гена (слева от селективного маркера), у большинства трансгенных по nptII гену садовых растений присутствовал и ген тауматина (табл.15). Только у моркови из 15 трансгенных по селективному гену растений ген тауматина амплифицировался у 8.
Яблоня и груша. C целью получения трансгенных растений груши и яблони, обладающих повышенной устойчивостью к грибам - возбудителям заболеваний растений, а также обладающих модифицированным вкусом, мы провели несколько экспериментов по переносу гена суперсладкого белка thaumatin II в сорт груши Бураковка и гибрида яблони селекции ВНИИГиСПР Всего мы получили четыре линии сорта Бураковка и столько же яблони, обладающих устойчивостью к канамицину. Частота трансформации составила 1.19 и 1.53% для груши и 4,0 и 9,1% для яблони. Анализ ДНК полученных растений, обладающих устойчивостью к канамицину, методом ПЦР показал присутствие фрагмента гена nptII у всех линий, тогда как фрагмент гена thaumatin II амплифицировался только у растений трех линий груши из четырех (рис.9А). Из четырех линий яблони удалось акклиматизировать к условиям грунта только две. Остальные при переносе в почвенные условия погибали от заражения. В дальнейших экспериментах подобные клоны получались и при трансформации данного гибрида другими конструкциями, в частности с геном АСС оксидазы, что свидетельствует скорей о сомаклональной изменчивости как причине данного феномена и не связано с экспрессией перенесенного гена тауматина.
Растения трансгенных линий, адаптированные к тепличным условиям (в среднем с частотой 50%), не имели фенотипических отклонений от исходного сорта.
Анализ экспрессии cуперсладкого белка, проведенный методом Вестерн-блоттинга, показал, что белок присутствовал в растениях трех трансгенных линий груши содержащих вставку смыслового гена и обеих линиях яблони (рис. 9Б). При этом наибольшее количество белка детектировалось в листьях груши линии T-A2 (до 5.1 мкг/мг общ.
белка), тогда как у двух других линий груши и яблони оно не превышало 1-2 мкг/мг общ.
белка.
Органолептический анализ листовой ткани тепличных растений с геном thaumatin II выявил изменение вкуса. Листья контрольных растений груши имели горький вяжущий вкус, а трансгенных - травянисто-пресный.
M P Wt T-A2 T-Z T-B2 T-C А Б 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 В Рис.9. А. ПЦР-анализ трансгенных растений груши, трансформированных вектором pBIThau35. (размер фрагмента 708 п.н.). М - маркер; Р - плазмида pBIThau35; WTЦ нетрансформированное растение; - трансгенные линии.
Вестерн-блоттинг общего белка яблони груши на наличие белка thaumatin II: Б в листьях.
К Цконтрольное растение; 1 -4- трансгенные линии груши (3); 5,6 контрольные растения груши и яблони; 7,8 линии яблони; 9,10 - thaumatin II, 10 и 20ng соответственно;
В в плодах WT Цнетрансформированный контроль; Th- Thaumatin 40ng; PA Цплоды линии груши T-A2; M Цмолекулярный маркер.
Для проведения полевых экспериментов трансгенные линии яблони были привиты на карликовый подвой №62-396 и трансгенный подвой №57-545 с геном bar и высажены на сертифицированном полигоне ВНИИСПК г.Орел в 2003-04гг. Были высажены как корнесобственные, так и привитые трансгенные растения груши всех четырех линий.
Привитые на карликовый подвой растения яблони начали плодоносить в 2005 году, тогда как корнесобственные трансгенные растениея груши впервые заплодоносило только в 2009 году (рис.10), что обусловлено помимо физиологических особенностей также недостаточной зимостойкостью сорта в условиях континентального климата Орловской области, что приводило к регулярному подмерзанию цветочных почек.
Рис. 10. Плодоношение трансгенных растений яблони и груши на сертифицированном полигоне ВНИИСПК РАСХН г.Орел В плодах обеих трансгенных линий яблони тауматин детектировался на низком уровне. Его содержание было даже ниже чем в листьях, что с одной стороны может быть связано с низким уровне экспрессии 35 промотора в тканях мезокарпа, так и разрушением синтезируемого белка в кислотами и ароматическими веществами яблока. Вкусовые изменения также были незначительны и в основном обуславливали модификацию собственного вкуса плодов и усиления аромата.
В отличие от яблони уже первое плодоношение линии груши T-A2 с наибольшей экспрессией тауматина в листьях продемонстрировало высокий уровень его накопления в тканях плода и радикальное изменение вкусовых качеств. По сравнению с пресным вкусом плодов контрольных растений трансгенные плоды приобрели сладкий с привкусом тропических фруктов вкус и произошло усиление аромата плодов (рис. 9В).
Земляника. Для интродукции гена суперсладкого белка thaumatin II в растения земляники использовались сорта Фейерверк и Selekta.
В четырех поставленных трансформационных экспериментах получено трансгенные линии сорта Фейерверк (табл. 16). В трех экспериментах в качестве регулятора роста использовался 6-бензиламинопурин. Эффективность трансформации в этом случае не превышала 1,1 % (0,6; 1 и 1,1 %). В четвертом эксперименте в регенерационной среде 6-бензиламинопурин был заменен тидиазуроном. Данная модификация повысила эффективность трансформации на порядок (11,2%). Все независимые трансгенные линии получены при поэтапной селекции на канамицине при концентрации 50 и 25 мг/л соответственно в первом и последующих пассажах. В результате проведенного трансформационного эксперимента растений сорта Selekta получено 15 канамицин-устойчивых линий. В качестве регулятора роста использовался тидиазурон. В отличие от ранее проводимых экспериментов, где использовали 6бензиламинопурин, эффективность трансформации составила 13,0%, что в 5-7 раз превышает ранее достигнутые результаты. В последующем полученные регенеранты укоренялись на среде с 25 мг/л канамицина. ПЦР-анализ образцов тотальной ДНК на предмет присутствия гена nptII показал, что все линии содержат геномную вставку изучаемой последовательности, поскольку во всех образцах амплифицировался фрагмент ожидаемого размера (742 п.о.). Результаты ПЦР-анализа видны на Рис Анализ тех же образцов тотальной ДНК с использованием пары праймеров к последовательности гена thauII выявил, что не все nptII-положительные линии содержат вставку гена тауматина II. ПЦР-анализ показал, что амплифицируемый фрагмент ожидаемого размера (878 п.о.) присутствовал в 18 из 23 анализируемых образцов.
Трансгенные линии сорта Фейерверк Ф-40-I-8, Ф-40-I-9, Ф-40-I-10, Ф-40-I-14 и Ф-40-I-15, несмотря на присутствие функционирующей вставки гена nptII не содержали последовательность тауматина II. В 14 из 15 проанализированных образцов ДНК земляники сорта Selekta присутствовала последовательность 35S-thauII.
Функциональность интродуцированной экспрессирующей кассеты 35S-thaumatin3Тnos анализировалась методом Western-блоттинга (рис.12) Иммунодетекция белка в вегетативных тканях (листьях) показала, что экспрессирующая кассета функционирует и белок синтезируется в 15 из 18 thauII-положительных независимых трансгенных линий сорта Фейерверк и во всех 14 thauII-положительных независимых трансгенных линиях сорта Selekta. В трансгенных линиях Ф-40-I-1, Ф-40-I-3 и Ф-40-I-13 тауматин не экспрессируется. Причиной, объясняющей этот факт, может быть дефектная вставка кассеты 35S-thaumatin-3Тnos или эндогенная супрессия гомологичными последовательностями. В листьях нетрансгенных растений, также как и в линиях без вставки 35S-thaumatin-3Тnos Ф-40-I-8, Ф-40-I-9, Ф-40-I-10, Ф-40-I-14 и Ф-40-I-присутствие тауматина II не обнаружено. Иммунологический анализ экспрессии тауматина в плодах трансгенных линий также подтвердил присутствие белка (рис 12).
Данные коррелируют с экспрессией тауматина в листьях.
Уровень экспрессии тауматина между клонами существенно варьировал, также как и уровень детектируемой GUS-активности в растениях полученных с помощью векторных конструкций pBI121 и p35SGUSint. Так, содержание тауматина в листьях трансгенных растений колебалось от 0,2 (Ф-40-I-2) до 1,5 мкг/мг общего белка (Ф-40-I-4, Ф-40-I-7, Ф40-VII-1, Ф-40-VII-2), а в плодах от 0,1 (Ф-40-VII-1) до 3 (Ф-40-I-7) мкг/мг общего белка.
Данные о количественном содержании тауматина в вегетативных и генеративных тканях трансгенных растений земляники приводятся в сводной Таблице 17.
Таблица 16. Результаты агробактериальной трансформации листовых эксплантов земляники садовой супервирулентным штаммом Agrobacterium tumefaciens CBE21/pBIThauЭксперимент Количе Число Число ПЦР- ПЦР- Western- Эффектив N ство регенеран kanR анализ, анализ, блоттинг, ность экспла тов трансфор nptII + thauII тауматинII трансфор нтов мантов + мации, % листья плоды Ф-40-(I-1) 90 1 1 1 1 1 1 1,Ф-40-I* 170 21 19 19 14 11 11,Ф-40-II 156 3 1 1 1 1 0,Ф-40-VII 200 2 2 2 2 2 1,S-40-I 115 15 15 14 14 13,*- В данном эксперименте для регенерации и селекции трансформантов использовалась среда со следующим гормональным составом: 5 мг/л ТДЗ + 0,3 мг/л ИМК. В остальных случаях - 5 мг/л БАП + 0,3 мг/л ИМК А Б Рис 11. А. ПЦР-анализ трансгенных линий земляники садовой, полученных с помощью бинарного вектора pBIThau35, на присутствие селективного гена nptII. Размер ожидаемого амплифицируемого фрагмента 741 п.н. Маркер - Молекулярный маркер pUC19/TaqI (1444, 736 и 476 п.н.).
Б. ПЦР-анализ трансгенных линий земляники садовой, полученных с помощью бинарного вектора pBIThau35, на присутствие гена суперсладкого белка thaumatinII. Размер ожидаемого амплифицируемого фрагмента 878 п.н. Маркер - Молекулярный маркер pUC19/TaqI (1444, 736 и 476 п.н.).
Рис 12. Иммунологический анализ экспрессии тауматина в плодах трансгенных растениях земляники садовой. Маркер - стандартный белковый молекулярный маркер: 20 и 30 кДа В таблице приводятся только те трансгенные линии, которые по результатам ПЦРанализа имеют в геноме полную вставку Т-ДНК, и содержат гены nptII и thauII. Более того, для 6 линий из 15 не приводятся данные анализа плодов, по причине их отсутствия на момент подготовки и проведения анализа. Из приведенных в таблице данных видно, что из 9 линий, для которых определялось содержание тауматина и в листьях и в плодах, в 4 (Ф-40-(I-1)-1, Ф-40-I-2, Ф-40-I-7, Ф-40-II-3) наблюдается повышение экспрессии белка в генеративных тканях в сравнении с вегетативными. Также в четырех линиях (Ф-40-I-5, Ф40-I-18, Ф-40-I-19, Ф-40-I-20) отмечено более низкое содержание тауматина в плодах по сравнению с листьями. В линии Ф-40-I-12 не обнаружено различий в количественном содержании тауматина в тканях плодов и листьев. Таким образом, нами не обнаружено тенденции к тканевой специфичности экспрессии тауматина в генеративных тканях (плодах) земляники или в вегетативных (листьях). Однако требуются дальнейшие исследования для корректного сравнения трансгенных линий по уровню экспрессии тауматина особенно в полевых условиях.
Маркер Ф -40-(I-1)-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-II-Ф -40-VII-Ф -40-VII-Фейерверк Вода PBIThauМаркер Ф -40-I-Ф -40-(I1)-Ф -40-II-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Ф -40-I-Фейервер к Маркер Таблица 17. Результаты количественного анализа содержания тауматина II в вегетативных (листьях) и генеративных (плодах, урожай 2001 г.) тканях трансгенных растений земляники садовой.
Количество тауматина II, Клон мкг/мг общего белка листья плоды 0,5 Ф-40- (I-1)-Ф-40- I-2 0,2 0,Ф-40- I-4 1,5 н/а Ф-40- I-5 1 0,Ф-40- I-7 1,5 Ф-40- I-11 0,5 н/а Ф-40- I-12 0,5 0,Ф-40- I-16 0,7 н/а Ф-40- I-17 0,6 н/а Ф-40- I-18 1 0,Ф-40- I-19 1 0,Ф-40- I-20 0,6 0,Ф-40- II-3 0,2 Ф-40- VII-1 1,5 н/а Ф-40- VII-2 1,5 н/а Фейерверк 0 Н/а Цсодержание тауматина количественно не оценивалось по причине отсутствия плодов на момент проведения анализа Органолептический анализ плодов земляники садовой. Вкусовые качества с/х продукции являются наиболее важным критерием оценки с точки зрения потребителя, а для селекционеров и производителей этот критерий наиболее сложный и трудно характеризуемый. В большинстве случаев дегустации на ягодных культурах проводятся с оценкой трех характеристик: вкус, запах (аромат) и физические качества (Daubeny, 1996).
В последние годы методология органолептического анализа претерпела существенные усовершенствования (Paterson и др., 1993; Brennan и др., 1997; Morel и др., 1999). Однако до сих пор имеющаяся методология не позволяет проводить анализы со статистической точностью или сравнивать большое количество образцов, зачастую слабо отличающихся друг от друга.
В нашей работе вкусовые качества плодов трансгенных растений, а именно сладость мякоти оценивалась по разработанной нами методике с учетом опыта известных научных школ (Daubeny, 1996; Paterson и др., 1993; Brennan и др., 1997; Morel и др., 1999).
В связи с тем, что тауматин помимо суперсладкого вкуса характеризуется еще и специфическим свойством послевкусия, для корректного сравнения трансгенных линий необходимо было чередовать опытные образцы с контрольными. В качестве отрицательного контроля выступали не только плоды нетрансгенных растений, но и растений без экспрессии тауматина. Более того, чтобы исключить влияние степени спелости плода на результат анализа, для каждой линии выбиралось по четыре плода.
Затем отдельно оценивался вкус каждого плода, после чего выводилась средняя оценка сладости для данного трансгенного клона.
Дегустации проводились на урожаях земляники садовой 2001-го и 2002-го годов с полигона испытаний генетически модифицированных растений (ВНИИСПК, г. Орел).
Результаты дегустаций 2001-го года приведены в Таблице 18.
Ограниченное количество ягод урожая первого года не позволило провести органолептический анализ статистически достоверно, однако средние баллы оценивающие сладость плодов, подтверждают изменение вкусовых качеств плодов у ряда трансгенных линий. Сладость мякоти оценивалась по пятибалльной системе, исходя из сортовой характеристики Фейерверка, согласно которой вкус среднеспелых плодов первого сбора оценивается в среднем на 4 балла. Попарное сравнение сладости ягод с экспрессией тауматина с контрольными плодами показало, что во всех случаях оценки опытные образцы либо превышают контрольные (6 из 9 пар), либо равны им (3 из 9 пар).
Урожай 2002-го года оказался более обильным и позволил провести статистически достоверный органолептический анализ плодов. Данные приводятся на рис.Обе дегустации 2002 года показали достоверное отличие пяти линий с экспрессией тауматина из шести выбранных от контрольных нетрансгенных растений и линий без экспрессии тауматина, за исключением пары Ф-40-I-2/Ф-40-I-13. Оценки дегустации 20года в среднем на 0,2 балла превышают таковые дегустации 2001 года. Это может быть обусловлено более благоприятными погодными условиями, способствующими накоплению сахаров.
Таблица 18. Органолептический анализ влияния экспрессии тауматина II в плодах земляники садовой на их вкусовые качества (2002 г.).
Дегустация 1 Дегустация Средний Линия Линия Средний балл балл** Ф-40-I-2 4 0,03 Ф-40-I-18 4,2 0,4 0,09 4,1 0,Ф-40-I-13 Фейерверк Ф-40-(I-1)-1 4,5 0,03 Ф-40-VII-1 4,4 0,Фейерверк Ф-40-I-4,1 0,04 4,2 0,Ф-40-I-7 4,3 0,09 Ф-40-II-3 4,3 0,Ф-40-I-9 4 0,12 Ф-40-I-9 4,1 0,* - серым цветом выделены линии с экспрессией тауматина ** - средний балл по пятибальной системе характеризует сладость плодов.
Анализ влияния экспрессии тауматина II на устойчивость земляники садовой к Botrytis. Для проведения биотестирования листовой ткани произвольно были отобраны пять линий: S-40-I-14, S-40-I-15, S-40-I-17, S-40-I-18, S-40-I-19. В качестве отрицательного контроля использовались листья с растений дикого типа и линии без гена тауматина (S40-I-4).
Предварительные эксперименты показали, что на результаты анализов сильное влияние оказывают не только возраст растительной ткани и состояние инокулюма Botrytis cinerea, а также условия, в которых инкубируются зараженные листовые диски. В роли ключевого фактора в данном случае выступает влажность камеры и фильтровальных подложек. Этот фактор оказывал влияние не столько на характер инфекции, сколько на скорость колонизации листовых дисков. Визуальная оценка развития патогена 4,4,А Б * * 4,* 3,4,* 4,* 2,4,4,1,3,0,3,Рисунок 13. Органолептический анализ плодов ГМ линий земляники садовой сорта Selekta (А) и Фейерверк (Б). Данные анализа приводятся по пятибалльной шкале сладости.
Данные приводятся со стандартной ошибкой среднего значения. Звездочками отмечены линии с достоверным отличием от контрольных растений.
проводилась через определенные промежутки времени, по этой причине влажность оказывала решающее влияние на результаты сравнения. Внесенное изменение в методику G.Peng и J.C. Sutton (1991), а именно способ попарного сравнения, позволило нивелировать влияние влажности. В этом случае трансгенные линии с экспрессией тауматина сравнивались с одним из отрицательных контролей в пределах одной камеры на общей фильтровальной подложке (в чашке Петри). Визуальная оценка некроза, проводимая на 14-ый день после инокуляции, дала следующие результаты: наименьшее некротическое поражение наблюдалось у трех линий - для линии S-40-I-14 она составляла 47,3 22,1 %, для линии S-40-I-17Ц 64,8 0,8 % и для линии S-40-I-19- 57,15 12,9 %, тогда как на дисках нетрансгенного контроля средняя площадь поражения составляла 89,5 %.
11Selekta S-40-I-S-40-I-* * S-40-I-40 * 40 S-40-I-30 S-40-I-20 S-40-I-10 1 7 10 12 14 17 21 Дни после инокуляции Рисунок 14. А. Анализ некротического поражения листовых дисков ГМ линий земляники садовой сорта Selekta к возбудителю серой гнили Botrytis cinerea. Степень поражения выражена как доля поверхности с некротическим поражением от общей площади листового диска. Данные приводятся со стандартной ошибкой среднего. Звездочками отмечены линии с достоверным отличием от контрольных растений.
Б. Динамика развития симптомов поражения листовых дисков трансгенных линий земляники садовой сорта Selekta возбудителем серой гнили Botrytis cinerea.
Sweetness rating Некротическое поражение, % Некротическое поражение, % a I kt I I I I I e l e S S S S S S S Развитие симптомов поражения анализировалось с течением времени, причем данные снимались через 1, 7, 10, 12, 14, 17, 21 и 26 дней после инокуляции. Данные 14-го дня приведены на Рисунке 14А, а динамика развития на Рисунке 14Б. Анализ динамики процесса позволяет сделать вывод, что у трансгенных линий повышенная устойчивость проявляется в замедленном развитии симптомов поражения.
На 26-ой день все листовые диски как трансгенных, так и контрольных растений оказались полностью пораженными. Можно предположить, что на целых растениях в условиях приближенных к естественным будут наблюдаться те же тенденции. Однако возможно, что линии с замедленным развитием инфекции в естественных условиях будут поражаться данным фитопатогеном с меньшей частотой и с минимальными повреждениями.
Разработка способов трансформации косточковых культур. Потребительский спрос на косточковые культуры в последнее время часто оказывается неудовлетворенным по ряду причин, в том числе из-за снижения урожайности в связи с распространением ряда опасных вирусных болезней. Помимо прямого неблагоприятного воздействия на растение, инвазия вируса приводит к снижению иммунитета растения и повышению чувствительности растения к неблагоприятным факторам внешней среды и атакам других фитопатогенов. На сегодняшний день существуют только превентивные меры борьбы с вирусами: уничтожение растительных остатков, пораженных вирусом, подготовка безвирусного посадочного материала, выведение новых сортов с повышенной устойчивостью к вирусам и круглогодичный мониторинг садов.
В последние годы вирус оспы сливы (PPV) стал главной угрозой для выращивания косточковых плодовых растений. Этот вирус нанес огромный экономический ущерб и вызвал значительное уменьшение производственных площадей в странах Восточной Европы и Средиземноморья. Вирус оспы сливы распространился по всему миру и классифицирован карантинными службами растений как наиболее опасный патоген для абрикосов, слив и персиков (Scorza, 1991). К сожалению, в настоящее время отсутствуют действенные способы лечения вирусных заболеваний растений, а уничтожение зараженных деревьев остается единственным способом сдерживания распространения вирусов.
Придание устойчивости к вирусным заболеваниям методами генной инженерии достигается тремя основными путями: 1) придание устойчивости к вирусу за счет экспрессии в растении генов самого вируса в прямой или обратной ориентации; 2) придание устойчивости к вирусу за счет экспрессии растительных генов, включая PR (protein resistance) и R-генов и 3) придание устойчивости к вирусу за счет экспрессии антител и противовирусных белков нерастительного происхождения (Lomonossoff 1995;
Sanford и Johnston, 1985; Schillberg et al., 2001; Goldbach et al., 2003).
Наибольшее развитие среди этих стратегий получило использование гена белка оболочки вируса для придания устойчивости (Beachy et al., 1990; Gadani et al., 1990), хотя в ряде работ были использованы и другие вирусные гены, например, ген NIb, кодирующий вирусную репликазу (Sivamani et al., 2000). Наиболее успешно данная стратегия применяется для придания устойчивости растений к одноцепочечным РНК-вирусам.
Однако недостатком данного метода является узкая специфичность устойчивости растения к вирусу, из которого ген был взят (Sivamani et al., 2002). В тоже время, данная стратегия может обеспечить высокую устойчивость к большому числу штаммов вируса, относящихся к одному виду (Ravelonando et al., 1998). Так, используя данную стратегию, была получена линия трансгенной сливы C-5, содержащая вставку гена белка оболочки вируса оспы сливы в прямой ориентации. Данная линия отличалась от других трансгенных линий пониженным уровнем РНК-транскрипта, и экспрессия белка оболочки в растительной ткани не детектировалась Вестерн-анализом. Однако результаты полевых испытаний показали, что только эта линия имела повышенную устойчивость к различным штаммам вируса оспы сливы (Ravelonando et al., 1998). Механизм устойчивости такого типа получил название гомологичное замалчивание гена (PTGS, post-transcriptional gene silencing) (Dougherty и Parks, 1995; Wassenegger и Pelissier 1998).
Однако большинство работ по трансформации косточковых плодовых культур выполнено с использованием ювенильного материала зиготического происхождения или с использованием соматических тканей подвойных форм и межвидовых гибридов, имеющих более высокий по сравнению с сортами морфогенетический потенциал.
Получение трансгенных сортов косточковых плодовых растений тормозится отсутствием надежных методик, способных обеспечить достаточно высокую частоту регенерации побегов из соматических тканей. Так, до сих пор нет никаких сообщений об успешной генетической трансформации соматических тканей сливы и персика, и лишь недавно группа испанских ученых сообщила о трансформации коммерческого сорта абрикоса маркерными генами gfp и gus (Petri et al., 2005а, 2005б). Эти и другие причины вызывают необходимость разработки эффективной генотип-независимой системы регенерации и трансформации коммерческих сортов косточковых культур.
Генетическая трансформация листовых эксплантов вишне-черешневого гибрида.
Во всех трансформационных экспериментах в которых NPTII использовался в качестве селективного маркера нам не удалось получить трансгенные растения вишне-черешневого гибрида. В дальнейшей работе использовались векторные системы с селективным геном, кодирующим гигромицин фосфотрансферазу (HPT). В экспериментах по трансформации с использованием вектора pVec35GUSint в штамме ЕНА105 листовые диски культивировали около 3 недель на среде без селективных антибиотиков, с последующей селекцией на среде с гигромицином (5 мг/л), что заметно увеличивало число образованных регенерантов (73 на 70 листовых дисков). Тем не менее, только 5 линий активно пролиферировали на среде с гигромицином (10 мг/л) и GUS-активность обнаруживалась в листьях 3 линий (табл.19). Встраивание гена hpt в растительный геном детектировалось с помощью ПЦР-анализа как в GUS-положительных, так и в GUSотрицательных клонах. В дальнейшей работе использовались векторные системы с селективным геном, кодирующим гигромицин фосфотрансферазу (HPT).
Генетическая трансформация листовых эксплантов сливы с использованием гена nptII. Для экспериментов были использованы бинарные вектора pBin35Sm-GFP5-ER и pGAGFP-AFVY, содержащие маркерный ген gfp под 35S промотором с различными лидерными последовательностями. В обоих векторах селективный ген nptII находится под nos промотором и терминатором. Мы получили только одну трансгенную линию сливы при использовании вектора pBin35SmGFP5-ER и 4 линии при использовании вектора pGAGFP-AFVY. В обоих случаях использовались схемы отсроченной селекции, а частота трансформации составила 0,23-0,5% (Табл.19). В случае использования схемы ранней селекции трансгенные растения получить не удалось. Растения всех трансгенных линий нормально размножались и укоренялись на средах с 30 мг/л канамицина.
Нам не удалось получить ни одной трансгенной линии сливы при использовании селекции на генетицине или сочетаний генетицина с канамицином. Высокий уровень некроза и блокирование каллусообразования, вызываемые генетицином, значительно затрудняют селекцию на данном антибиотике, по крайней мере, для сортов, характеризующихся регенерацией побегов через каллус.
Низкая эффективность использования канамицина при трансформации как вишнечерешневого гибрида, так и сливы обусловила необходимость создания векторных систем для трансформации косточковых культур на основе гена hpt, обуславливающего устойчивость к гигромицину.
Генетическая трансформация листовых эксплантов сливы с использованием селекции на гигромицине. Для отработки системы трансформации был использован бинарный вектор pCam35SGFP содержащий репортерный ген hpt под 35S промотором, ген bar под управлением 35S промотора, и репортерный ген gfp, кодирующий ретикулярную форму GFP под 35S промотором вируса мозаики цветной капусты.
При использовании схемы ранней селекции была получена только одна трансгенная линия (Табл.19). Частота трансформации составила 0,25%. Тогда как, при использовании схемы отсроченной селекции частота трансформации достигла 2,2%.
Таким образом, при селекции на гигромицине всего было получено 10 независимых трансгенных линий сливы, прошедших селективный отбор в течение 4 месяцев при селективном давлении 8 мг/л гигромицина (табл. 19). Амплификация с праймерами комплементарными гену bar, показала присутствие гена фосфинотрицинацетил трансферазы в 8 линиях (рис. 15А), которые демонстрировали экспрессию гена gfp (рис 15Б) и устойчивость к обработке гербицидом (рис. 16).
Рис. 15 А Амплификация фрагмента гена bar Б Экспрессия гена gfp в растениях 310 bp. М-молекулярный маркер; 13 Н2О, 12 - сливы слева трансген; справа контроль слива Стартовая; 1-10- pCamGFP трансгены Создание трансгенных растений сливы устойчивых к вирусу Шарки. Для получения трансгенных растений с повышенной устойчивостью к вирусу оспы сливы на первом этапе исследований был сконструирован бинарный вектор pCamPPVcp. Вектор содержит ген белка оболочки PPV в прямой ориентации под управлением двойного 35S промотора и селективный ген hpt под 35S промотором, как наиболее подходящий для селекции трансгенных тканей сливы. Были получены 7 независимых трансгенных линий сливы и ПЦР-анализ подтвердил вставку целевого гена во всех линиях. Частота трансформации составила 1,8%.
Табл.19. Эффективность трансформации косточковых культур при использовании различных селективных маркеров.
вектор Селект. селекция Кол-во Трансгены GFP/GUS ген Экспл. (%) положит Вишне-черешневый гибрид pVec35GUSint hpt/35S Гигромицин/ 70 5 (7,0) 3+ задерж Слива сорта Стартовая Гигромицин/ 1+ hpt/35S 377 1 (0,26) Ранняя pCam35SGFP hpt/35S Гигромицин/ 416 10 (2,2) 9+;1- задерж pNov35S-GFP pmi/CMPS Манноза/ 1128 1 (0,08) 1+ Ранняя pNov35S-GFP pmi/CMPS манноза/ 560 8 (1,4) 8+ задерж pGAGFP-AFVY nptII/nos Канамицин/ 804 4 (0,5) 4+ задержан pBin35S-mGFP-ER nptII/nos Канамицин/ 434 1 (0,23) 1+ задержан pGAGFP-AFVY nptII/nos Генетицин/ 547 0(0) задержан Control Control Рис. 16. Трансгенные растения сливы Стартовая до и после обработки гербицидом Либерти В дальнейшем для использования феномена РНК интерференции и генерирования siRNA комплементарных гену белка оболочки вируса Шарки был создан вектор pCamPPVRNAi содержащий фрагменты гена белка оболочки вируса оспы сливы в обратной и прямой ориентациях, разделенных pdk - интроном (из вектора pHANNIBAL), под контролем конститутивного двойного CaMV35S промотора и октопинсинтазного терминатора Tocs. Т-ДНК в данном векторе также несет репортерный ген gus, cо встроенным в него интроном гена ST-LS1 картофеля. Ген находится под контролем CaMV35S промотора и нопалинсинтазного терминатора (Tnos). В качестве селективного маркера использован ген hpt. Ген находится под контролем CaMV35S промотора и PA35S терминатора. Вектор был создан О.А. Шульгой в лаборатории генной инженерии растений ГНУ ВНИИСБ. Схема конструирования векторных систем представлена на рисунке 17.
PPV-CP (Full, 951 bp) pCamPPVcp CaMV35S 35SDE Tnos pA35S Fragment (697 bp) hpt PPV-CP LB RB pdk-intron 2220 bp pCamPPVRNAi CaMV35S pA35S hp-PPV-CP Tnos GUSint CaMV35S 35SDE Tocs hpt pdk-intron LB RB Рис. 17. Схема конструирования кассет экспрессии в растениях сливы фрагментов генома вируса Шарки Таблица 20. Результаты ПЦР-анализа растений сливы сорта УСтартоваяФ, полученных с помощью конструкций pCamPPVRNAcp и pCamPPVRNAi.
ПЦР Бинарный Целевой ген/ Число Реп.ген/пр-р вектор промотор линий ppv-cp/ gus hpt hpppv-cp pСam ppv-cp/35SDE - 7 - 7+ 7+ PPVcp pCam hpppv- gus/35S 6 5+ 6+ 6+ PPVRNAi cp/35SDE В результате трансформации было получено 13 регенерантов успешно пролиферирующих на среде с высоким содержанием гигромицина. ПЦР-анализ подтвердил трансгенный статус семи независимых трансгенных линиях, полученных с помощью вектора pCamPPVcp и шести линий сливы, трансформированных конструкцией pCamPPVRNAi. Обобщенные результаты ПЦР-анализа линий сливы сорта УСтартоваяФ приведены в таблице 20.
В результате окрашивания растительных тканей продуктом реакции гидролиза XGLUC при участии -глюкуронидазы, была показана экспрессия гена gus в линиях RNAi №№1, 2, 5 и 6 (Рис. 18). Отсутствие GUS активности в тканях растений линии RNAi№согласуется с данными, полученными при проведении ПЦР-анализа. Однако, вставка репортерного гена в тканях линии RNAi№3 была подтверждена полимеразной цепной реакцией, но активность -глюкуронидазы в анализируемом образце отсутствовала.
Учитывая большую длину области Т-ДНК и расположение гена gus вблизи ее левой границы, наиболее вероятной причиной отрицательных результатов гистохимического анализа GUS-активности в тканях растений линии RNAi№ 3 может являться разрыв ДНК в области последовательности nos терминатора или в районе 5-нуклеотидной последовательности гена gus (Рис.18).
Рис. 18. Гистохимический анализ экспрессии гена gus в тканях растений сливы сорта УСтартоваяФ.
А- листья линий (1-6) растений сливы, полученных с помощью конструкции pCamPPVRNAi и лист нетрансформированного растения (WT);
Б - целое растение RNAi№1 и нетрансформированное растение (WT).
Анализ устойчивости растений сливы линий PPVcp и RNAi к заболеванию Шарка.
Осенью 2008 года нами проводился эксперимент по инфицированию полученных линий сливы посредством прививки на них почек зараженных растений. В мае-июне 2009 года при проявлении симптомов заболевания на некоторых тестируемых растениях (хлоротические пятна на листьях, укороченные междоузлия, деформация листьев) проводился ОТ-ПЦР-анализ пяти растений сливы сорта УСтартоваяФ, четырех линий RNAi и семи линий PPVcp на присутствие вируса оспы сливы (рис 20,21,22).
ОТ-ПЦР-анализ зараженных растений сливы, полученных с помощью конструкции pCamPPVcp Наличие 3 нетранслируемой последовательности и гена протезы НС-Pro вируса оспы сливы было показано в листьях растений линий PPVcp №№1, 2, 3, 4, 5 и 6.
Отрицательные результаты были получены в одной из двух повторностей 3 и 5 линий, а также во всех трех повторностях линии PPVcp №7 (рис 22, 23).
ОТ-ПЦР-анализ зараженных растений сливы, полученных с помощью конструкции pCamPPVRNAi. В феврале 2010 года мы провели второй эксперимент по инфицированию четырех линий сливы RNAi при помощи прививки на них почек зараженных растений сорта УСтартоваяФ, отобранных в первом эксперименте. В качестве контроля заражали нетрансформированные растения сливы сорта УСтартоваяФ. При проявлении симптомов заболевания (см. рис 20) проводился ОТ-ПЦР-анализ четырех линий RNAi и двух нетрансгенных растений сливы. В качестве позитивного контроля использовали препарат тотальной РНК привоя, зараженного PPV, посредством прививки которого и проводилось инфицирование тестируемых растений.
Рис 19. Визуальное определение заражение вирусом оспы тестируемых растений сливы А - проявление симптомов на нетрансгенных растениях сливы (хлоротические пятна) Б - отсутствие симптомов на трансгенных растениях сливы трансформированных вектором pCamPPVRNAi.
Рис 20. ОТ-ПЦР анализ препаратов тотальной РНК зараженных растений СтpCamPPVcp на присутствие 3 нетранслируемой последовательности (3UTR) (245 п.н.) PPV.
М - молекулярный маркер (1 т.н. СибЭнзим); 1-7 Цтрансгенные линии в двух-трех повторностях; WT - нетрансгенное растение; K+ - нетрансгенное растение, зараженное PPV; W- вода.
Рис 21. ОТ-ПЦР анализ препаратов тотальной РНК зараженных растений Ст-pCamPPVcp на присутствие гена протеазы НС-Pro (412 п.н.) PPV.
М - молекулярный маркер (1 т.н. СибЭнзим); 1-7 Цтрансгенные линии в двух-трех повторностях; WT - нетрансгенное растение; K+ - нетрансгенное растение, зараженное PPV; W- вода.
Рис 22. ОТ-ПЦР анализ препаратов тотальной РНК зараженных растений СтpCamPPVRNAi на присутствие: А - 3 нетранслируемой последовательности (3UTR) (2п.н.) и Б - гена протеазы НС-Pro (412 п.н.) PPV.
М - молекулярный маркер (1 т.н. СибЭнзим); 1-4 Цтрансгенные линии в двух повторностях; WT - незараженное растение сливы сорта УСтартоваяФ; K+ - привой, зараженный PPV; W- вода.
Рис. 23. Анализ растений сливы сорта Стартовая зараженных вирусом Шарки сливы методом Вестерн блоттинга с поликлональными антителами против белка (Loewe).
А A - нетрансгенные растения 1-6;
Б - растения трансформированные геном белка оболочки в прямой ориентации 1-7;
В - растения трансформированные шпилечной конструкцией 1-6, Kздоровое растениеЦ 7, K+ Б инфицированное растение, М маркер молекулярного веса.
В ОТ-ПЦР-анализ четырех линий Ст-pCamPPVRNAi, проводимый после повторения инфицирования растений сливы, также показал отсутствие последовательностей вируса оспы в тестируемых образцах (рис. 22).
Таким образом, по результатам ОТ-ПЦР анализа препаратов тотальной РНК зараженных растений сливы на присутствие 3 нетранслируемой последовательности (3UTR) и гена протеазы (НС-Pro) PPV было показано отсутствие вируса оспы сливы в линии PPVcp№7 и в четырех линиях RNAi (рис 20, 21, 22). Результаты ОТ-ПЦР согласуются с данными, полученными с помощью вестерн-блот анализа (рис 23) Полученные результаты показывают, что использование феномена РНК интерференции в сочетании с разработанными оригинальными методиками трансформации косточковых культур открывает возможности получения трансгенных линий культурных сортов косточковых культур, в частности сливы, устойчивых к вирусу Шарки (PPV), что недостижимо приемам традиционной селекции.
ВЫВОДЫ В результате проведенных исследований разработана научно-обоснованная система применения методов биотехнологии и генетической инженерии в целях совершенствования сортимента садовых растений и получены следующие результаты:
1. Разработана методика эффективной адвентивной регенерации побегов из соматических тканей декоративных, ягодных и плодовых культур путем оптимизации состава питательных сред, источников эксплантов и условий культивирования, эффективность, которой, в частности для косточковых культур, значительно превосходит результаты, достигнутые другими исследователями.
2. Разработаны схемы негативной селекции по степени устойчивости к антибиотикам (канамицин, гигромицин, генетицин) и позитивной селекции на маннозе, в том числе впервые для косточковых культур (вишни и культурного сорта сливы), что позволило получить трансгенные растения плодовых ягодных и декоративных культур.
Проведенный сравнительный анализ эффективности селекции трансформантов с различными селективными маркерными генами: nptII, hpt и pmi показал, что для успешной трансформации соматических тканей древесных растений и получения трансгенных растений необходим индивидуальный подбор селективного агента и схемы селекции.
3. Установлено, что присутствие растительного интрона PIV2 в конструкции гетерологичного гена оказывает положительное влияние на уровень и стабильность его экспрессии в вегетативных и генеративных тканях земляники, яблони и груши.
4. Использование различных лидерных последовательностей из травянистых видов растений, кодирующих сигнальные пептиды открывает возможность для эффективной клеточной компартментализации продуктов экспрессии гетерологичных генов в трансгенных растениях древесных культур, в том числе на примере сливы.
5. Установлено, что экспрессия гена rolC стабильно изменяет гормональный статус трансформантов актинидии и хризантемы по сравнению с нетрансформированными растениями, что открывает возможность изменения габитуса надземной части растений посредством переноса в их геном гена rolC A. rhizogenes, а также его использования в практическом цветоводстве для получения горшечных и декоративных форм у вегетативно размножающихся культур.
6. В геноме ряда сортов хризантем при изучении изменений, вызванных экспрессией в растениях гетерологичного гена rolC из A.rhizogenes обнаружены гомологичных гену rolC последовательности.
7. Установлено, что изменение гипервариабельной области гена -эндотоксина Cry1Ab1. изменяет спектр токсичности белка синтезируемого в трансгенных растениях хризантемы, в том числе делает его токсичным для нового класса членистоногих - акарид.
8. Показано, что трансформация клоновых подвоев яблони и груши геном bar позволяет получать формы устойчивые к высоким дозам коммерческих препаратов гербицидов в полевых условиях.
9. Установлено, что экспрессия гена thaumatin II улучшает вкус плодов у трансгенных линий земляники садовой, яблони и груши и повышает устойчивость к ряду фитопатогенов, в частности земляники к серой гнили, вызываемой грибком Botrytis cinerea.
10. На основе использования феномена РНК интерференции в сочетании с разработанными оригинальными методиками трансформации косточковых культур получены трансгенные линии косточковых культур, в частности сливы, устойчивые к вирусу Шарки (PPV), что недостижимо приемам традиционной селекции.
11. Достоверное изменение агрономических характеристик полученных форм трансгенных растений, обусловленных экспрессией гетерологичных генов подтверждено проведением испытаний в полевых условиях, что показывает возможность как их дальнейшего внедрения в с/х производство, так и использования в качестве исходного материала в традиционных селекционных программах.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Mitiouchkina T.Yu., Dolgov S.V. (1995) Regeneration from leaf disks of Chrysanthemum morifolium Ramat. Acta Horticulturae, 420: 112-114.
2. Dolgov S.V., Mitiouchkina T.Yu., Rukavtsova E.B., Buryanov Ya. (1995) Production of transgenic plants of Chrysanthemum morifolium Ramat. with the gene of Bac.thuringiensis endotoxin. Acta Horticulturae, 420: 46-47.
3. Firsov A.P., Dolgov S.V. (1997) Agrobacterial transformation of Actinidia kolomicta. Acta Horticulturae, 447: 323-327.
4. Mitiouchkina T.Yu., Dolgov S.V., Skryabin K.G. (1997) Agrobacterial transformation of Chrysanthemum. Acta Horticulturae, 447: 329-334.
5. Merkulov S.M., Bartish I.V., Dolgov S.V., Pasternak T.P., McHugen A. (1998) The genetic transformation of the pear Pyrus communis L. mediated by Agrobacterium tumefaciens. Russ. J.
Genetics, 34(3): 289-293.
6. Dolgov S.V., Shushkova T.V., Firsov A.P. (1998) Pineapple regeneration from leaf explants.
Acta Horticulturae, 461: 439-444.
7. МирошниченкоД.Н., Долгов С.В. (1999) Влияние типа экспланта на эффективность агробактериальной трансформации гвоздики ремонтантной (Dianthus caryophyllus L.) при селекции на гигромицине Б. Генетика, 35(9): 1208-1213.
8. Dolgov S.V., Firsov A.P. (1999) Regeneration and agrobacterial transformation of sour cherry leaf disks. Acta Horticulture, 484: 577-580.
9. Firsov A.P., Dolgov S.V. (1999) Agrobacterial transformation and transfer of the antifreeze protein gene of winter flounder to the strawberry. Acta Horticulture, 484: 581-586.
10. Dolgov S.V., Lebedev V.G., Anisimova S.S., Lavrova N., Serdobinskiy L.A., Tjukavin G.B., Shadenkov S.A., Lunin V.G. (1999) Phytopathogene resistance improvement of horticultural crops by plant-defensin gene introduction. In: Developments in plant breeding. "Genetics and Breeding for Crop Quality and Resistance". Ed. S. Mugnozza, E. Porceddu and M. Pagnotta.
Kluwer Ac. Publ. Dordrecht, Boston, London, 6: 111-118.
11. Dolgov S.V., Lebedev V.G., Firsov A.P., Taran S.A., Tjukavin G.B. (1999) Expression of thaumatinII gene in horticultural crops. In: Developments in plant breeding. "Genetics and Breeding for Crop Quality and Resistance". Ed. S. Mugnozza, E. Porceddu and M. Pagnotta.
Kluwer Ac. Publ. Dordrecht, Boston, London, 6: 165-172.
12. Dolgov S.V., (2000) Genetic transformation of sour cherry (Cerasus vulgaris Mill.). In:
Biotechnology in agriculture and forestry. "Transgenic trees". Ed. Y.P.S. Bajaj, Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 44: 28-39.
13. Dolgov S.V., Miroshnichenko D.N., Schestibratov K.A. (2000) Agrobacterial transformation of apple cultivar and rootstock. Acta Horticulturae, 538: 619-624.
14. Miroshnichenko D.N., Dolgov S.V. (2000) Production of transgenic hygromycin resistant carnation (Dianthus caryophyllus L.) plants after cocultivation with Agrobacterium thumefaciens. Acta Horticulturae, 508: 255-258.
15. Лебедев В.Г., Долгов С.В. (2000) Влияние селективного агента и растительного интрона на эффективность трансформации и экспрессию гетерологичных генов в растениях груши (Pyrus communis L.). Генетика, 36(6): 792-798.
16. Mitiouchkina T.Yu., Dolgov S.V. (2000) Modification of chrysanthemum plant and flower architecture by rolC gene from Agrobacterium rhizogenes introduction. Acta Horticulturae, 508:163-169.
17. Mitiouchkina T.Yu., Ivanova E.P., Taran S.A., Dolgov S.V. (2000) Chalcone synthase gene from Antirrhinum majus in antisense orientation successfully suppressed the petals pigmentaion of chrysanthemum. Acta Horticulturae, 508: 215-217.
18. Dolgov S.V., Lebedev V.G., Miroshnichenko D.N., Mitiouchkina T.Yu., Schestibratov K.A., Schmatchenko V. (2002) Molecular breeding of fruit crops. Bulletin of the state Nikitsky botanical garden, 85: 56-58.
19. Lebedev V.G., Dolgov S.V. (2002) Influence of various factors on adventitious shoot formation from pear leaf explants. Acta Horticulturae, 596: 469-472.
20. Lebedev V.G., Lavrova N., Lunin V.G., Naroditski B.S., Dolgov S.V. (2002) Plant-defensin genes introduction for improvement of pear phytopathogene resistance. Acta Horticulturae, 596:
167-172.
21. Lebedev V.G., Skryabin K.G., Dolgov S.V. (2002) Transgenic pear clonal rootstocks resistant to herbicide УBastaФ. Acta Horticulturae, 596: 193-197.
22. Lebedev V.G., Taran S.A., Shmatchenko V.V., Dolgov S.V. (2002) Pear transformation with the gene for supersweet protein thaumatin II. Acta Horticulturae, 596: 199-202.
23. Lebedev V.G., Taran S.A., Shmatchenko V.V., Lunin V.G., Skryabin K.G., Dolgov S.V. (2002) Molecular breeding of pear. Acta Horticulturae, 587: 217-223.
24. Schestibratov K.A., Mikhailov R.V., Dolgov S.V. (2003) Plantlet regeneration from subculturable nodular callus of Pinus radiata. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 72: 139-146.
25. Филиппов М.В., Мирошниченко Д.Н., Славохотова А.А., Долгов С.В. (2004) Разработка системы трансформации и получение форм пшеницы (Triticum aestivum L.) устойчивых к гербициду. Достижения науки и техники АПК, 1: 10-12.
26. Dolgov S.V., Schestibratov K.A. and Mikhailov R.V. (2004) Apple transformation with the gene of supersweet protein thaumatin II. Acta Horticulturae, 663: 507-510.
27. Dolgov S.V., Skryabin K.G., (2004) Transgenic apple clonal rootstock resistant to Basta herbicide. Acta Horticulturae, 663: 499-502.
28. Korneeva I., Firsov A., Lebedev V., Schestibratov K., Pushin A., Shulga O., Dolgov S. (2005) Expression and subcellular localization of a PR-5 protein with different signal sequences in transgenic tomato and tobacco plants. Revue de Cytologie et Biologie Vgtales-Le Botaniste, 28: 260-267.
29. Schestibratov K.A., Dolgov S.V. (2005) Transgenic strawberry plants expressing a thaumatin II gene demonstrate enhanced resistance to Botrytis cinerea. Scienta Horticulture, 106(2): 177-189.
30. Филиппов М.В., Мирошниченко Д.Н., Верниковская Д.И., Долгов С.В. (2006) Подбор оптимальных параметров баллистической трансформации генома мягкой пшеницы.
Сельскохозяйственная биология, 1: 67-73.
31. Skachkova T., Mitiouchkina T., Taran S., Dolgov S. (2006) Molecular biology approach for improving chrysanthemum resistance to virus B. Acta Horticulturae, 714: 185-192.
32. Schestibratov K.A., Dolgov S.V. (2006) Genetic engineering of strawberry cv. Firework and cv.
Selekta for taste improvement and enhanced disease resistance by introduction of thauII gene.
Acta Horticulturae, 708: 475-482.
33. Filippov M., Miroshnichenko D., Vernikovskaya D., Dolgov S. (2006) The effect of auxins, time exposure to auxin and genotypes on somatic embryogenesis from mature embryos of wheat.
Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 84(2): 192Ц201.
34. Mitiouchkina T.Yu., Zavriev S.K., Dolgov S.V. (2006) Molecular Biology approach for improving chrysanthemum resistance to virus B. Acta Horticulturae, 772: 327-332.
35. Dolgov S.V., Hanke M-V. Transgenic fruit tree rootstocks. (2006) In: Tree Transgenesis. Eds.
M. Fladung, D. Ewald. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 335-350.
36. Mikhailov R.V., Dolgov S.V. (2007) Transgenic plum (Prunus domestica. L.) plants obtained by agrobacterium mediated transfiormation of leaf explants with various selective agents. Acta Horticulturae, 738: 613-623.
37. Mikhailov R.V., Muratova S.A., Dolgov S.V. (2007) Production of transgenic plum plants from vegetative tissues by means of positive selection. Acta Horticulturae, 734: 129-138.
38. Miroshnichenko D., Filippov M., Babakov A., Dolgov S. (2007) Genetic engineering of Russian wheat genotypes for abiotic stress resistance. Developments in Plant Breeding. УWheat Production in Stressed EnvironmentsФ. Eds. H.T.Burk, J.E.Nisi, N.Salomon. Springer, Dordrecht, The Netherlands, 12: 715-721.
39. Miroshnichenko D., Filippov M., Dolgov S. (2007) Genetic transformation of Russian wheat cultivars. Biotechnology&Biotechnology Equipment, 21(4): 399-402.
40. Чернобровкина М.А., Сидоров Е.А., Баранов И.А., Харченко П.Н., Долгов С.В. (2007) Влияние параметров биолистической трансформации ярового ячменя (Hordeum vulgare L.) на уровень транзиентной экспрессии репортерного гена GFP. Изв. РАН. Сер. Биол, 6: 669675.
41. Popowich E. A., Firsov A. P., Mitiouchkina T. Y., Filipenya V. L., Dolgov S.V., Reshetnikov V.
N. (2007) Agrobacterium mediated transformation of Hyacinthus orientalis with thaumatin II gene to control fungal diseases. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 90(3): 237-244.
42. Song G.,.Lang G, Dolgov S., Sink K. (2008) "Cherry" in A Compendium of Transgenic Crop Plants: Temperate Fruits and Nuts. Eds. C.Kole and T.Hall, Blackwell Publishing. 5: 161-188.
43. Пушин А.С., Овчинникова Е.В.,.Шульга О.А,.Фирсов А.П, Долгов С.В. (2008) Аккумуляция рекомбинантного суперсладкого белка тауматина в апопласте трансгенных растений табака. Биотехнология, 6: 31-40.
44. Malnoy M., Chevreau E., Bell R., Dolgov S., Aldwinckle H. (2008) "Pears" in A Compendium of Transgenic Crop Plants: Temperate Fruits and Nuts. Eds. C.Kole and T.Hall, Blackwell Publishing. 5: 53-78.
45. Lebedev V.G., Dolgov S.V. (2008) Stability of gus and bar gene expression in transgenic pear clonal rootstock plants during several years. Acta Horticulturae, 800: 373-381.
46. Тимербаев В.Р., Шестибратов К.А., Долгов С.В. (2008) Клонирование и функциональный анализ трех форм промотора полигалактуроназы томата. Биотехнология, 6: 23-30.
47. Korneeva I.V., Shestibratov K.A., Lavrova N.V.,.Firsov A.P, Lebedev V.G., Kharchenko P.N., Dolgov S.V. (2008) Expression of PR-5 protein thaumatinII for improving disease resistance and fruit quality of tomato. Acta Horticulturae, 789: 151-158.
48. Михайлов Р.В., Долгов С.В. (2009) Разработка эффективной схемы селекции с использованием селективных маркерных генов для агробактериальной генетической трансформации листовых эксплантов сливы сорта Стартовая. Биотехнология, 1: 45-52.
49. Miroshnichenko D., Filippov M., Dolgov S. (2009) Effects of daminozide on somatic embryogenesis from immature and mature embryos of wheat. Australian Journal of Crop Science, 3(2): 83-94.
50. Shulga O.A., Mitiouchkina T.Yu., Shchennikova A.V., Skryabin K.G., Dolgov S.V. (2009) Early flowering transgenic chrysanthemum plants. Acta Horticulturae, 836: 241-246.
51. Тимербаев В.Р., Долгов С.В. (2009) Использование механизма РНК-интерференции для ингибирования экспрессии гена АЦК-оксидазы томата с целью увеличения лежкости плодов. Биотехнология, 1: 11-22.
52. Скрипников А.Ю., Поляков Н.Б., Толчева Е.В., Великодворская В.В, Долгов С.В.,.
Демина И.А., Рогова М.А, Говорун В.М. (2009) Протеомный анализ мха Physcomitrella patens. Биохимия, 74(5): 593-606.
53. Сидоров Е.А., Чернобровкина М.А., Николаева А.Н., Харченко П.Н., Долгов С.В. (2009) Индуцированный морфогенез и регенерация in vitro растений ячменя отечественных сортов. С-х. биология. Сер. Биол. раст. 3: 73-78.
54. Халилуев М.Р., Харченко П.Н., Долгов С.В. (2010) Разработка системы регенерации и изучение трансформационного потенциала томата промышленного сорта. Доклады РАСХН, 3: 22-26.
55. Халилуев М.Р., Харченко П.Н., Долгов С.В. (2010) Генетическая трансформация томата генами защитных хитинсвязывающих белков и антимикробных пептидов. Известия ТСХА, 6: 75-83.
56. Мирошниченко Д.Н., Порошин Г.Н., Долгов С.В. (2010) Генетическая трансформация пшеницы с использованием тканей зрелых семян. Биотехнология, 6: 34-41.
57. Dolgov S.V., Mikhaylov R.V., Serova T.A., Shulga O.A., Firsov A.P. (2010) Pathogen-derived methods for improving resistance of transgenic plums (Prunus domestica L.) for Plum pox virus infection. Julius-Kuhn-Archiv, 427: 133-140.
58. Тимербаев В.Р., Шестибратов К.А., Лебедев В.Г., Корнеева И.В., Харченко П.Н., Долгов С.В. (2008) Использование механизма ПТИГ для модификации созревания плодов.
Молчание генов. Ред. Данилкович А.В. Пущино. 253-269.
59. Долгов С.В, Мирошниченко Д.Н, Шалойко Л.А. (2005) Экстракт из растительных соматических зародышей, полученных в условиях искусственного культивирования in vitro, для бесклеточных систем трансляции и или сопряженной траскрипции-транcляции.
Патент РФ № 2261278, 27 сентября 2005 г.
60. Шестибратов К.А., Долгов С.В. (2002) Способ получения трансгенных растений с повышенной устойчивостью к фитопатогенам. Патент РФ № 2002128414, приоритет от октября 2002 г.
61. Shestibratov K.A. Dolgov S.V. Method for producing a transgenic plant with the aid of Agrobacterium tumefaciens. Australian AU 2003277759 B2. 21 января 2010 г.
62. Заявка на патент с положительным решением. Shestibratov K.A. Dolgov S.V. Method for producing a transgenic plant with the aid of Agrobacterium tumefaciens. US 2007/0124805.312007, от 31 мая 2007 г.