Geum.ru
Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине  

На правах рукописи

БУДЗИНСКАЯ Мария Викторовна

Система новых подходов к диагностике и лечению субретинальной неоваскулярной мембраны.

14.01.07 - Глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва

2011 г.

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте глазных болезней РАМН

Научный консультант:

Член-корреспондент Российской академии  медицинских наук, профессор,  доктор медицинских наук АВЕТИСОВ Сергей Эдуардович 

Официальные оппоненты

профессор,  доктор медицинских наук Луцевич Екатерина Эммануиловна

профессор,  доктор медицинских наук Егоров Евгений Алексеевич

профессор,  доктор медицинских наук Юрова Ольга  Валентиновна

Ведущая организация:

Российский университет дружбы народов

Защита состоится л   2011 года в  14:00 часов на заседании диссертационного совета Д.001.040.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института глазных болезней РАМН по адресу: 119021, Москва, ул. Россолимо, д.11, кор.Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ глазных болезней РАМН

Автореферат разослан л_____ __________________ 2011 года.

Ученый секретарь                                

диссертационного совета,

доктор медицинских наук  М.Н. Иванов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В связи с увеличением числа заболеваний, в основе которых лежит развитие новообразованных сосудов, в последние десятилетия возрос интерес к проблеме  ангиогенеза  органа зрения.  Известно более 40  заболеваний глазного дна, которые приводят к развитию субретинальной неоваскуляризации (СНМ), из них наиболее частые: возрастная макулярная дегенерация (ВМД), осложнённая миопия (ОМ), ангиоидные полосы сетчатки (АПС) и хориоретинит [Gass JDM 1997, Lafaut 2000].

Большое значение в диагностике и выборе адекватной терапии СНМ имеют флюоресцентная ангиография глазного дна с различными красителями (флюоресцеин натрия и индоцианин зелёный) и оптическая когерентная томография. Несмотря на большое число опубликованных работ, до сих пор не определены количественные диагностические критерии степени активности заболевания и критерии оценки эффективности проводимого лечения [MPSG 1991]. 

Формирование  СНМ происходит  за счет роста новообразованных сосудов из слоя хориокапилляров  через мембрану Бруха в субретинальное пространство. В основе прорастания сосудов из хориоидеи под нейроэпителий и/или ретинальный пигментный эпителий лежат сложные биохимические и иммунологические механизмы, природа которых до сих пор недостаточно расшифрована [Bressler SB 1992, 2001, DТAmore 1994]. 

Последние гистологические и иммуногистохимические исследования  показали влияние многих факторов ангиогенеза на развитие СНМ. Наибольшее количество работ посвящено фактору роста эндотелия (vascular endothelial growth factor, VEGF), трансформирующемуся фактору роста (transforming growth factor beta, TGF), факторам роста фибробластов a и b (acidic fibroblast growth factor. aFGF and basic fibroblast growth factor, bFGF). В настоящее время продолжается поиск и разработка новых индукторов и ингибиторов интраокулярного ангиогенеза [Amin 1994, Kwak 2000, Schmidt-Erfurth U 2003, Wang X 2005].  Дискутабельным остаётся вопрос о степени влияния VEGF, интерлейкинов (IL) и интерферонов (IFN) на развитии СНМ при ОМ и  после перенесенного хориоретинита.

Последние десятилетия XX века ознаменовались бурным развитием молекулярной генетики, обусловившим прогресс во многих областях медицинской науки, что позволило идентифицировать некоторые гены, мутации которых приводят к развитию наследственных болезней или увеличивают риск многофакторных заболеваний [Парфенова Е.В., 2000]. Среди генетических факторов риска возникновения СНМ при ВМД  выделяются гены фактора роста эндотелия сосудов (ген-VEGF) [Hum Mol Genet, 2006]  и HTRA1 [Science (2006) 314:989-992].  Изучение влияния этих генов на развитие СНМ при других заболеваниях специально не проводилось.  Сведения  о характере и аллельном (гетеро- или гомозиготном) состоянии мутаций могут быть полезными для определения методов лечения больных с СНМ и прогнозирования  клинического течения заболевания. 

Известно, что этапы формирования  субретинальной неоваскулярной мембраны (СНМ) являются звеньями сложных процессов приводящих к потере зрения.  Природа  этих процессов окончательно не выяснена. Необходимо дальнейшее детальное изучение причин и механизмов развития той или иной формы СНМ для разработки  эффективных, патогенетически ориентированных методов лечения.

Прогресс в молекулярной биологии и биотехнологии открывает огромные возможности для разработки новых подходов к лечению больных  с заболеваниями, в основе которых лежит неоангиогенез. Достижения в области генной инженерии моноклональных антител  позволили создать новые перспективные гуманизированные антитела, которые активно изучаются в онкологической и офтальмологической практике. Эти достижения имеют большое значение для разработки новых специфических препаратов для лечения больных с СНМ [Личиницер 2002, Burstein 2002]. 

Таким образом, в развитии субретинальных неоваскулярных мембран наряду со специфическими  факторами, принимают участие  общебиологические механизмы  развития заболеваний, прежде всего, тесно связанные друг с другом иммуноопосредованные процессы ангиогенеза.  Изменения в системе  провоспалительные-противовоспалительные цитокины требуют изучения не только их патогенетической значимости, но и  возможностей их коррекции в зависимости от этиологии.

Сложные патогенетические механизмы делают актуальным изучение клинических, иммунологических и генетических  факторов развития СНМ и поиск эффективных методов лечения, обладающих  комбинированным воздействием.

Цель исследования: изучить  значимость  клинических и  иммуно-генетических  факторов в  патогенезе субретинальной неоваскулярной мембраны различной этиологии и обосновать возможность и целесообразность использования современных диагностических подходов и комбинированных методов лечения. 

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

  1. Изучить клинические проявления субретинальной неоваскулярной мембраны различной этиологии на основании современных высокоинформативных методов диагностики: флуоресцентной ангиографии и  оптической когерентной  томографии.
  2. Провести генетический анализ генов CFH,  HTRA1, IL-8, VEGF у пациентов с субретинальной неоваскулярной мембраной различной этиологии.
  3. Определить иммунологические характеристики СНМ на основании изучения показателей VEGF-А , FGF , TGF-1, TGF-2, TNF- , IFN-, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 в сыворотке крови.
  4. Изучить влияние  уровней антител к IgG ВПГ-1, IgG ВПГ-2, IgG к токсоплазме, микобактерии туберкулеза, IgG к вирусу Эпштейн-Барр в сыворотке крови на течение и развитие СНМ.
  5. Исследовать механизмы воздействия фотодинамической  терапии на новообразованные сосуды глаза в эксперименте. 
  6. Исследовать механизмы воздействия антиангиогенной терапии на новообразованные сосуды глаза в эксперименте. 
  7. Разработать схему  комбинированного  патогенетически обоснованного лечения при субретинальных неоваскулярных мембранах различной этиологии. 
  8. Оценить эффективность разработанной терапии субретинальных неоваскулярных мембран.

Положения, выносимые на защиту

1.  Для определения клинической активности субретинальной неоваскулярной мембраны предложены диагностические критерии на основании данных флуоресцентной ангиографии глазного дна (ФАГД) и оптической когерентной томографии (ОКТ). Диагноз лактивная СНМ можно поставить, если присутствуют 3 из 7 предложенных нами диагностических критериев:

  1. субретинальные кровоизлияния;
  2. наличие очага в области комплекса - РПЭ - мембрана Бруха Цхориокапилляры; 

по данным ОКТ:

  1. увеличение средней толщины  сетчатки  в фовеальной зоне;
  2. увеличение  общего макулярного объема;
  3. увеличение объема сетчатки в фовеальной зоне;
  4. контрастирование сети новообразованных сосудов (симптом кружева) на ранних фазах ФАГД (хориоидальной и ранней артериальной) с последующим экстравазальным выходом флюоресцеина с увеличением  ИФ СНМ над ИФ хориоидеи;
  5. диффузная гиперфлюоресценция в зоне  СНМ на поздних фазах ФАГД с увеличением  ИФ(снм) над ИФ(х) более, чем в 2 раза.

2. Клиническая картина пациентов с гомозиготным полиморфизмом по аллелю 402Н в гене фактора комплемента Н (CFH) отличается повышенной экссудативной реакцией в макулярной зоне.  У пациентов с гомозиготной мутацией (-625)А промоторного участка гена  (HTRA1) сериновой пептидазы развитие СНМ характеризуется быстрым течением (2Ц3 месяца от первых проявлений СНМ до формирования хорио-ретинального рубца), повышенным отложением пигмента и выраженным рубцеванием в зоне СНМ.

3. Доказано, что часто рецидивирующее течение субретинальной неоваскулярной мембраны связано с мутациями 402Н, (-625)А и (-251)А в обеих копиях генов CFH,  HTRA1 и IL-8  соответственно.

4. Пациенты  с частым рецивированием, выраженной лактивностью субретинальной неоваскулярной мембраны с последующим образованием  обширного хорио-ретинального рубца и  низкой остротой зрения (менее 0,05) имели повышенный уровень IL-4, TNF и  значительное снижение IFN на фоне нормальных или повышенных значений IL-2. 

5. Выявлена ассоциация между увеличением титра АТ к  IgGВПГ-2 и вируса Эпштейн-Барр и степенью выраженности экссудативных процессов на глазном дне.

6.  Фотодинамическая терапия, как один из составных элементов комплексной терапии, является необходимым методом для развития  окклюзии субретинальной неоваскуляризации.

7. Антиангиогенная (анти-VEGF) терапия в комплексном применении снижает экссудативные проявления, уменьшает риск рецидивирования, повышает остроту зрения и уменьшает количество необходимых курсов лечения у пациентов с субретинальной неоваскулярной мембраной.

8. Выявлена эффективность комбинированной терапии, которая  способна как вызывать окклюзию новообразованных сосудов любого калибра, так и уменьшать экссудативные проявления, что позволяет существенно повысить качество жизни пациентов с  субретинальной неоваскулярной мембраной.

Научная новизна.

Впервые на основании результатов флуоресцентной ангиографии глазного дна, оптической когерентной томографии  разработаны клинические критерии выявления активности субретинальной неоваскулярной мембраны.

Проведен клинико-генетический анализ генов CFH, HTRA1, IL-8, VEGF и у пациентов с субретинальной неоваскулярной мембраной различной этиологии.  Исследованы полиморфизмы гена CFH, увеличивающие (rs1061170, rs514943 и rs380390) или уменьшающие (rs529825, rs7524776, rs1831281, rs2274700, rs1576340, rs12144939, rs7540032)  риск развития СНМ, а так же влияющие на развитие тех или иных клинических проявлений (экссудация, рубцевание, рецидивирование).

Доказано, что наличие одной копии  гена с аллелем риска А полиморфизма rs11200638 гена HТRA1, Т полиморфизма rs10490924 и del443in54 гена ARMS2 увеличивает риск развития СНМ у пациентов с ВМД.

Показана ассоциация  полиморфизма -251T>A гена IL-8  в глазах с воспалительным фоном с развитием СНМ. Впервые были выявлены две новые мутации в промоторной области гена VEGF, существенно ухудшающие клиническое течение заболевания.

Выявлена патогенетическая значимость цитокинов (VEGF-А, FGF, TGF-1, TGF-2, TNF- , IFN-, IL-1 IL-2, IL-4IL-6, IL-8,). Определено их влияние на динамику активности патологического процесса у больных  с субретинальной неоваскулярной мембраной различной этиологии. Разработан и внедрен в практику новый способ прогнозирования течения заболевания (патент на изобретение Способ прогнозирования течения субретинальной неоваскулярной мембраны RU2350274 С1).

Изучена и описана семиотика  субретинальной неоваскуляризации  и уточнен генез основных клинических проявлений, разработан комплекс диагностических мероприятий, включающий клинико-лабораторное обследование, стандартизированную оценку клинических, ангиографических и томографических  симптомов заболевания. Изучение  вышеперечисленных показателей позволило получить целостное объективное представление о патологическом процессе, его выраженности, степени вовлеченности в него различных физиологических систем и анатомических структур глаза.

  В эксперименте  изучены механизмы влияния фотодинамической терапии, действия ингибиторов VEGF и ангиостатина на новообразованные сосуды. 

Разработано оборудование для проведения фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики глаз (патент на изобретение Устройство и способ диагностики и фотодинамической терапии заболеваний глаз, RU2258452).

Теоретически обоснован, экспериментально доказан, подтвержден клининческими исследованиями и внедрен в широкую практику новый метод фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики с применением отечественного препарата Фотосенс у пациентов с субретинальной неоваскулярной мембраной (патент на изобретение Способ лечения неоваскулярной мембраны RU 2290973).

С учетом выявленных патогенетических особенностей определены современные подходы к комплексной терапии субретинальной неоваскулярной мембраны различной этиологии (патент на изобретение Способ лечения субретинальной неоваскулярной мембраны RU 2376957 от 27.12.09). 

Практическая значимость работы.

В работе представлены данные проведенного комплексного клинического и иммуно-генетического изучения субретинальной неоваскуляризации как самостоятельной нозологической формы.  Для клинической практики  предложены диагностические  критерии активности субретинальной неоваскулярной мембраны.

На основании клинических, иммунологических и  генетических данных  разработан новый способ прогнозирования течения субретинальной неоваскулярной мембраны.

Применение современных, высокоинформативных методов диагностики позволило определить основные  параметры, требующие коррекции; наметились пути комплексной консервативной терапии, что значительно уменьшило частоту  рецидивирования. 

  Обоснован и внедрен в широкую клиническую практику  комбинированный метод лечения субретинальной неоваскулярной мембраны различной этиологии.

Внедрение результатов исследования

Полученные результаты внедрены и применяются в работе  офтальмологических отделений: НИИ глазных болезней РАМН,  офтальмологической клинической больнице г. Москвы,  ГКБ № 61 г. Москвы. Основные положения работы используются в педагогической, научной и клинической деятельности  НИИ глазных болезней РАМН.

Апробация работы.

Диссертационная работа представлена и обсуждена на заседании Ученого совета Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института глазных болезней РАМН.

Основные положения и результаты исследования изложены в центральной печати, доложены и обсуждены: на 10-th (Munich, 2005), 11-th (Shanghai , 2007) World Congress of the International Photodynamic  Association; 16th World Congress of the International Society for Laser Surgery and Medicine. Japan. Tokyo, 2005,  5th International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine 2006. Wuhan, P.R.China, 6th (Kipr, 2006), 7th (Sun City, South Africa, 2008) International Congress of the World Association of Laser Therapy., 7th International Symposium. Photodynamic Therapy and Photodiagnosis in Clinical Practice - Brixen., Italy,  2008, 19th International Congress on Photonics in Europe Munich, Germany 2009, 12th World Congress of the International Photodynamic Association (IPA) Seattle, USA, 2009, 2nd Conference of the European Platform for Photodynamic Medicine (EPPM), Wroclaw, Poland, 2009, на научно-практической конференции Отечественные противоопухолевые препараты, Москва,  2005 год,  IV Евро-азиатской конференции по офтальмохирургии, Екатеринбург,  2006 год, научном форуме Инновационные технологии медицины XXI века Москва, 2007 год, на II (2007) и V (2010) Всероссийской научной конференции молодых учёных,  Москва,  IX Съезде офтальмологов России, Москва,  2010г.

Публикации

Основные положения диссертационной работы отражены в 81 публикации  из них 20 статей и 61 тезис, в том числе, в 13 научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 380 страницах машинописного текста и включает в себя введение, 3 части (каждая из которых состоит из обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований), выводы, практические рекомендации, список литературы. Диссертация иллюстрирована 55 таблицами и 161  рисунком. Список литературы содержит 452 источника, из них 89 отечественных и  363  зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика  материала и методов исследования.

Настоящее исследование было выполнено в 2005-2010 гг. на клинической базе Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института глазных болезней РАМН (директор - член-корреспондент РАМН  профессор, д.м.н., Аветисов С.Э.).  Клинические исследования выполнены у  750-ти человек, из них 280 больных с  субретинальной неоваскулярной мембраной. Возраст пациентов колебался от 25 до 75 лет (средний возраст 49,02 30,1 лет). 

В зависимости от поставленных задач работа выполнялась в три этапа.  В первой части работы (диагностической) был проведен клинический и иммуно-генетический скрининг пациентов с СНМ.

Все пациенты были разделены на следующие группы:

1 - пациенты с возрастной макулярной дегенерацией (ВМД) - 120 человек (240 глаз) и классической СНМ.

1к. - пациенты с  возрастной макулопатией (перераспределение ретинального пигментного эпителия, единичные сухие друзы, без СНМ)  Ц  50 человек (100 глаз).

2.- пациенты с осложнённой миопией (ОМ) и классической СНМ  - 120 человек (240 глаз).

2к.-пациенты с миопией без патологических изменений на глазном дне Ц  50 человек (100 глаз).

3- пациенты с ангиоидными полосами сетчатки (АПС) и классической СНМ  - 20 человек (40 глаз).

4 - пациенты после перенесённого хориоретинита и классической СНМ  - 20 человек (40 глаз).

5 - контрольная группа - 370 здоровых человек, жителей г. Москвы, без очаговой патологии на глазном дне и остротой зрения не ниже 0,9 (проходивших профилактическое медицинское обследование).

В дальнейшем, для проведения иммуно-генетического скрининга все пациенты были  обследованы  терапевтом, отоларингологом,  стоматологом  на предмет наличия  соматической патологии.  Для чистоты исследуемой выборки пациенты с хроническими заболеваниями (бронхиальная астма, сахарный диабет, ревматологические заболевания, гипертоническая болезнь) и онкологическими заболеваниями  в  генетическое, иммунологическое и биохимическое обследование включены не были. Также, данному исследованию не подвергались пациенты 3 группы, поскольку в большинстве случаев АПС развиваются на фоне общих заболеваний.

В соответствии с основным заболеванием все пациенты с СНМ для иммуно-генетического скрининга были разделены на следующие группы:

Скрининг

Группы

Генетический

Иммунологический

Возрастная макулярная дегенерация

69 человек

80 человек

Осложненная миопия

40 человек

65 человек

После перенесенного хориоретинита

17 человек

30 человек

Контроль 

370 человек (случайные жители г. Москвы без  СНМ)

30 человек без СНМ

В ходе проведения работы использовали традиционные офтальмологические методы обследования: визометрию, рефрактометрию, тонометрию, периметрию, метод фокального бокового освещения, биомикроскопию по методике Н.Б. Шульпиной,  офтальмоскопию в условиях максимального мидриаза с 3-х зеркальной линзой Гольдмана. Флуоресцентную ангиографию глазного дна (ФАГД) проводили стандартным методом на фундус-камере Карл Цейс (Германия) с встроенной цифровой камерой. В качестве контрастного вещества применяли 10% флуоресцеин натрия производства фирмы  Новартис. Для  исследования интенсивности флюоресценции на базе Московского института радиотехники, электроники и автоматики под руководством профессора Г.Л. Киселева для обработки ангиографических изображений была разработана программа Picanalis.  Оптическую когерентную томографию (ОКТ) проводили на томографе Stratus Stratus Карл Цейс(Германия) совместно с к.м.н. Э.Э. Казарян, к.м.н. Н.С. Галоян.

Оценивали: характер поражения - одно или двухстороннее развитие СНМ; тип течения - без обострений, нечастые обострения (не более 2-х в год), частые обострения (3 и более в год),  тяжелый тип течения (отсутствие  ремиссии на протяжении 2-х лет); характер экссудации - невыраженная  (толщина средняя  сетчатки  (ТСС) в фовеальной области не более 230 мкм), слабо выраженная (ТСС в фовеальной области не более 300 мкм), выраженная (ТСС в фовеальной области не более 400 мкм), бурная (ТСС в фовеальной области  более 400 мкм); характер рубцевания - легкая степень рубцевания, выраженное рубцевание, гиперрубцевание. 

Генетические исследования проводили на базе Научно- исследовательского института физико-химической медицины совместно с к.б.н. Т.В. Погодой и д.б.н. Э.В. Генерозовым. Изучали гены HTRA (ген сериновой пепетидазы), CFH (ген фактора комплимента Н), ген  IL-8 (ген интерлейкина-8) и  ген VEGFА (ген фактора роста эндотелия сосудов).

Выделение ДНК производили из 5 мл венозной крови с помощью набора Wizardо Genomic DNA Purification Kit (фирма Промега, США) согласно инструкции. Генотипирование полиморфизмов проводили с помощью MALDI-TOF минисеквенирования. Для ПЦР-амплификации фрагментов ДНК, содержащих искомые полиморфизмы, с помощью программных пакетов Vector NTI 9 и Primer Express 2.0 были подобраны и синтезированы пары праймеров. Для записи, обработки и анализа масс-спектров использовали программное обеспечение фирмы Bruker Daltonics (Германия): flexControl 2.4 (Build 38) и flexAnalysis 2.4 (Build 11).

Иммунологические исследования проводили на базе ГУП МНКЦ Интермедбиофизхим совместно с к.б.н. Н.В Балацкой, к.б.н. К.А. Парсунковай,  Н.А. Гольдиной. Определение содержания факторов роста TGF-1, TGF-2 (трансформирующих факторов роста),  VEGF-A (фактора роста эндотелия сосудов) в  образцах сыворотки крови проводили методом  твердофазного ИФА диагностикумами Bender Med Systems (Австрия), Chemicon (Канада) на спектрофотометре  StatFax-2100 (США). Определение уровней цитокинов клеточного и гуморального  типов иммунного ответа IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 IFN- (интерферон), TNF (фактор некроза опухолей), FGFв (фактор роста фибробластов) сыворотке крови выполняли методом твердофазного ИФА наборами Biosource  (Бельгия), Bender Med System (Австрия) на спектрофотометре  StatFax-2100 (США). В сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа  с использованием диагностических тест-систем Вектор-Бест (Россия), Эколаб (Россия-Германия) на фотометре иммуноферментном планшетном ЭФОС 93-05 (Россия, ОАО Московский завод Сапфир) определяли: IgG антитела к вирусу простого герпеса 1 (IgGВПГ-1), IgG антитела к вирусу простого герпеса 2 (IgGВПГ-2),  антитела к IgG к  токсоплазме, антитела к микобактерии туберкулеза (иммуноферментный анализ) , антитела к IgG Вирус Эпштейн-Барр: капсидный белок (G+M)  и IgM Вирус Эпштейн-Барр .

Во второй части работы проведено экспериментальное исследование фотодинамического и антиангиогенного воздействия проводимой терапии на новообразованные сосуды глаза, в частности на эндотелий новообразованных сосудов. Экспериментальная работа была выполнена на 90 кроликах породы Шиншилла (самцы, массой 2-3 кг, 180 глаз). На первом этапе 70 животных  (140 глаз) изучали влияние фотодинамической терапии с применением отечественного фотосенсибилизатора  Фотосенс производства ФГУП ГНУ НИОПИК  (регистрационное удостоверение Р № 000199/02 - 2001 от 25.07.2001) и  антиангиогенной терапии с использованием ангиостатина - крингл 4,5 в дозе 1,8 мг., и Авастина в дозе 1,25 мг - 0,05 мл ( регистрационный номер: ЛС-000533 от 15.07.2005) и комбинированного воздействия  на эндотелий новообразованных сосудов глаза. На втором этапе (20 животных (40 глаз)) изучали распределение препарата Авастин при эндовитреальном введении. Для изучения морфологической картины мы использовали биологическую модель индуцированной неоваскуляризации роговицы кролика. Данная модель позволяет более достоверно изучить архитектонику сосудистого русла, клеточный состав стенки новообразованных сосудов и оценить влияние проводимых воздействий на эндотелиальные клетки новообразованного сосудистого русла. 

Морфологические исследования проводились на базе НИИ ГБ РАМН  к.м.н. А.А. Федоровым и Т.М.  Воеводиной. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилином-эозином и заключали в канадский бальзам. Полученные гистологичекие препараты исследовали и фотографировали на Фотомикроскопе III (фирма Opton, Германия). 

Иммуногистохимический анализ проводили на  криосрезах глаз кроликов (толщиной 10 мкм)  с использованием флуоресцентномеченых антител Goat anti Human IgG (H+L) Alexa 546 (Molecular Probes) в разведении 1:800. Исследования проводили на базе института биологии гена РАН совместно с профессором С.Л. Киселёвым  и к.б.н. М.А. Лагарьковой.

Третья часть работы Ц клиническая, посвящена разработке и оценке эффективности методики лечения СНМ.  На первом этапе 145 пациентов с СНМ  были распределены на  пять групп.

В первой группе, состоящей из 10 пациентов (10 глаз) с длительно (более 5 лет) существующей СНМ различного генеза,  были проведены сеансы ФД и ФДТ  и изучена фармакокинетика тканевого распределения Фотосенса с целью разработки методик и уточнения режимов ФД и ФДТ. 

В дальнейшем проводили апробацию разработанной методики ФДТ на фоне медикаментозного лечения в комбинации с анти-VEGF терапией и  исследование эффективности данного метода по сравнению с курсом консервативной терапии или монотерапией ФДТ.

Оставшиеся  135 пациентов с СНМ различного генеза были разделены на следующие группы:

2а. 14 пациентов (14 глаз) - пациенты  с СНМ  и  ВМД, получавшие курс медикаментозной терапии;

2б. 18 пациентов (18 глаз) - пациенты  с СНМ  и  ВМД, получавшие курс медикаментозной терапии и ФДТ;

2в. 20 пациентов (20 глаз) - пациенты  с СНМ  и  ВМД, получавшие курс медикаментозной терапии,  ФДТ и  Анти-VEGF терапии;

3а. 21 пациент (28 глаз) - пациенты с ОМ и СНМ,  получавшие курс медикаментозной терапии;

3б.  20 пациентов (24 глаза) - пациенты с ОМ и СНМ, получавшие курс медикаментозной терапии и ФДТ;

3в.  24 пациента (30 глаз) - пациенты с ОМ и СНМ,  получавшие курс медикаментозной терапии,  ФДТ и  Анти-VEGF терапии;

4. 18 пациентов  (16 глаз) - пациенты с ангиоидными полосами сетчатки и СНМ, получавшие анти -VEGF терапию;

5. 10 пациентов  (10 глаз) - пациенты с СНМ после перенесенного хориоретинита, получавшие  этиотропную, антиангиогенную терапию.

Все клинические исследования проводили с разрешения Комитета по этике при Федеральном органе контроля качества, Комитета по этике  НИИ ГБ РАМН,  Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Министерства здравоохранения и социального развития РФ, согласно утверждённым протоколам,  разработанным в соответствии с международными требованиями качественной клинической практики (Good Clinical Practice/GCP) и Хельсинкской декларации в адаптации к российскому законодательству. 

  1. Проспективное контролируемое открытое  исследование  эффективности фотодинамической терапии препаратом Фотосенс  субретинальной неоваскулярной мембраны.
  2. Проспективное контролируемое открытое  исследование  эффективности комбинированной фотодинамической терапии препаратом Фотосенс и антиангиогенной терапии с препаратом Авастин субретинальной неоваскулярной мембраны.
  3. Проспективное контролируемое открытое  исследование  эффективности комбинированной фотодинамической терапии препаратом Фотосенс и антиангиогенной терапии с препаратом Луцентис субретинальной неоваскулярной мембраны.

Анализ функциональных результатов эффективности ФДТ проводили по градиенту изменения остроты зрения, который  рассчитывали по формуле: ΔV=V1-V2, где: ΔV - градиент изменения остроты зрения, V1- острота зрения после лечения, V2- острота зрения до лечения.

Стандартную оценку флуоресценции Фотосенса  в тканях глаза осуществляли методом локальной флюоресцентной спектроскопии на  флюоресцентной диагностической установке для флюоресцентной диагностики и контроля за фотодинамической терапией ЛЭСА-01-Биоспек ГОСТ Р 50460-92 (Регистрационное удостоверение МЗ РФ № 29/05020400/0617-00 от 27.07.2000). Регистрировали спектры флюоресценции  ФС на коже руки, веке, коньюнктиве и склере глазного яблока пациента  в динамике  в течение часа, в течение первых суток, ежедневно на протяжении двух недель, через 1, 2, 3, 6, 12  месяцев  после введения  препарата. Концентрацию препарата в тканях определяли, ориентируясь на стандартные тест-образцы:

  с1=1,5 x 10-3 мг/мл  (концентрация  Фотосенса в эталонном образце с1).

  с2=4,0 х 10-4 мг/мл (концентрация Фотосенса в эталонном образце с2)

  с3= 2,0 х 10-5 мг/мл (концентрация Фотосенса в эталонном образце  с3). 

Анализ спектров проводили с помощью компьютерной программы последнего поколения LESA-Soft '9 для  MS Windows '98-2000,  разработанной для этой цели. 

Визуальную оценку флюоресценции Фотосенса на глазном дне, в области СНМ, проводили с использованием флюоресцентной  установки, разработанной для этих целей сотрудниками лаборатории лазерной биоспектроскопии ЦЕНИ ИОФРАН (зав. лаб. проф. В.Б.Лощёнов, разработчик канд. физ.-мат. наук С.А. Шевчик, патент на изобретение  № RU2258452).

Для проведения фотодинамической терапии СНМ использовали лазерную установку для фотодинамической терапии ЛФТ-630/675-01 Биоспек ГОСТ Р 50460-92 (Регистрационное удостоверение  № 29/05020400/0616-00 от 27.07.2000).

  Условия облучения: сеансы проводили на 3-7 сутки после введения препарата согласно пику накопления и максимальному градиенту концентрации лазером с длиной волны 675 нм. Количество сеансов колебалось от 3 до 5 в неделю в зависимости от данных спектроскопического контроля и особенностей СНМ. Суммарная световая доза была в пределах 500 Дж/см2.

Математическая и статистическая обработка полученных в ходе исследований данных  проводилась c использованием стандартных пакетов программ (Excel; SPSS 11.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В первой части работы (диагностической), с использованием программы Picanalis, были проанализированы ангиограммы 280 пациентов с СНМ различной степени лактивности. Относительные величины флюоресценции варьировались в широких пределах (от 5 до 400 у.е), поэтому более информативной являлась оценка графика интенсивности флюоресценции (ИФ) СНМ (таблица 1).

Таблица № 1.Изменение интенсивности флюоресценции СНМ в зависимости от активности процесса

Фазы ФАГД

Активная СНМ

Неактивная СНМ

Артерио-венозная

ИФ(х) = ИФ(снм)

ИФ(х) =ИФ(снм)

Ранняя венозная

ИФ(х) ИФ(снм)

ИФ(х) ИФ(снм)

Средняя венозная

ИФ(х) <х2 ИФ(снм)

ИФ(х)< ИФ(снм)

Поздняя венозная

ИФ(х) <х4 ИФ(снм)

ИФ(х) ИФ(снм)

Сокращения в таблице: ИФ(х) - интенсивность флюоресценции хориоидеи;

  ИФ(снм) Цинтенсивность флюоресценции СНМ; х2 - в два раза

  Таким образом, в работе показаны критерии активности процесса по данным ФАГД. 

В ходе работы  при сопоставлении клинической картины, данных ФАГД и ОКТ  выделены  наиболее значимые признаки:  наличие очага в области комплекса - РПЭ - мембрана Бруха Цхориокапилляры,  средняя толщина  сетчатки в фовеальной зоне, общий макулярный объем, объем сетчатки в фовеальной зоне.  Диагноз лактивная СНМ можно поставить, если присутствуют 3 из 7 диагностических критериев:

  1. Субретинальные кровоизлияния.
  2. Наличие очага в области комплекса - РПЭ - мембрана Бруха Цхориокапилляры по данным ОКТ.
  3. Увеличение средней толщины  сетчатки  в фовеальной зоне по данным ОКТ.
  4. Увеличение  общего макулярного объема по данным ОКТ.
  5. Увеличение объема сетчатки в фовеальной зоне по данным ОКТ.
  6. Контрастирование сети новообразованных сосудов (симптом кружева) на ранних фазах ФАГД (хориоидальной и ранней артериальной) с последующим экстравазальным выходом флюоресцеина с увеличением  ИФ(снм) над ИФ(х) .
  7. Диффузная гиперфлюоресценция в зоне  СНМ на поздних фазах ФАГД с увеличением  ИФ(снм) над ИФ(х) более, чем в 2 раза.

В результате генетического  исследования выявлена статистически достоверная ассоциация полиморфизмов гена CFH с увеличением  (rs1061170, rs514943 и rs380390) или уменьшением (rs529825, rs7524776, rs1831281, rs2274700, rs1576340, rs12144939, rs7540032) риска развития СНМ. Можно предположить, что rs529825 С - rs1061170 С -  плохой - гаплотип гена CFH кодирует вариант, обладающий недостаточной способностью адекватно ингибировать активацию системы комплимента, что будет приводить к высокой концентрации активированных факторов системы комплимента и вследствие этого к повреждению собственных клеток и тканей. Причем, чем сильнее происходит активация системы, тем сильнее выражена недостаточность ингибирования плохими вариантами CFH. У больных с СНМ после перенесенного хореоретинита происходит сильная активация системы комплимента, при которой наличие уже одной копии плохого варианта определяет недостаточное ингибирование активированных факторов комплимента. В отличие от этой группы больных, у больных с ВМД заболевание развивается на протяжении десятков лет бессимптомно, видимо, вследствие  недостаточного ингибирования большого числа случаев активирования системы комплимента.  В таких условиях  недостаточность ингибирования  проявляется у обладателей двух плохих вариантов гена CFH. Клиническая картина  пациентов с ВМД и ОМ,  гомозиготных по мутации 402Н,  характеризовалась наличием выраженной экссудативной реакции  и преобладанием двухстороннего поражения.

Мутация гена IL-8 достоверно  (р = 0,008) чаще встречалась в группе после перенесенного хориоретинита. По всей видимости, наличие полиморфизма -251T>A у пациентов с хориоретинитом увеличивает риск развития СНМ,  способствуя увеличению проангиогенных стимулов в глазах с воспалительным фоном. У пациентов с ВМД и ОМ и мутацией (-251)А промоторного участка  гена  IL-8 в двух хромосомах  клиническая картина имела выраженное сходство с СНМ пациентов с хориоретинитами. Отличительными признаками можно назвать фокальный характер поражения, отсутствие друз и отслоек пигментного эпителия, в основном классический характер СНМ (без присутствия оккультного компонента), хорошо развитую сеть новообразованных сосудов.

В дальнейшем было определено, что наличие одной копии  гена с аллелем риска А полиморфизма rs11200638 гена HТRA1, Т полиморфизма rs10490924 и del443in54 гена ARMS2 увеличивает риск развития СНМ у пациентов с ВМД. Отличительной чертой клинической картины всех пациентов с СНМ и мутацией (-625)А промоторного участка гена  HTRA1 в двух хромосомах было  молниеносное течение заболевания от экссудативных проявлений до процессов выраженного рубцевания с формированием фиброзной ткани не только суб-, но и  интра- и преретинально.

Генетический скрининг показал, что комбинация исследуемых мутаций (402Н, (-625)А и (-251)А в обеих копиях генов CFH,  HTRA1 и IL-8)  приводит к развитию самой тяжелой и быстропрогрессирующей форме заболевания.

Впервые были выявлены две новые мутации в промоторной области гена VEGF: замена G на А  в позиции (-72) нуклеотида от начала транскрипции гена  и замена G на А  в 5Т-нетранслируемой части первого экзона гена в позиции (+31) нуклеотида от начала транскрипции гена. В первом случае именно этот участок определяет как фоновую экспрессию гена VEGFA, так и индуцированную под действием различных факторов, что обуславливает потерю негативной регуляции экспрессии гена VEGFA. Во втором случае в результате мутации  происходит изменение эффективности трансляции, что может быть связано либо с появлением дополнительных сайтов инициации трансляции, либо с изменением вторичной структуры (конформации) мРНК;  в дальнейшем происходит  нарушение её связывания с рибосомальными белками и/или трансляционными факторами. Обнаруженные мутации  приводят к изменению концентрации кодируемого белка. В нашем исследовании концентрация VEGF у пациентов была статистически достоверно (р < 0,001)  повышена не только по отношению к контролю, но и по сравнению с другими пациентами, а заболевание носило быстропрогрессирующий характер  и плохо поддавалось терапии.

  Иммунологическое исследование можно разделить на два этапа: анализ цитокинового статуса и изучение иммунологического ответа на инфицирование вирусами и микроорганизмами. У пациентов с СНМ во всех группах  наблюдали тенденцию к повышению  или определяли нормальный уровень IL-2.  Учитывая, что IL-2 стимулирует клеточное деление и функциональную активацию T лимфоцитов киллеров и хелперов, продукцию и активность NK-клеток, можно утверждать, что такой иммунологический фон может способствовать увеличению уровня провоспалительных цитокинов.  Несмотря на большой разброс и непараметрический характер выборки, при исследовании уровня IFN отмечено статистически достоверное различие не только между исследуемой группой и контролем, но и между  другими группами с СНМ, что заставляет задуматься об истощении резервных возможностей NK-клеток. Таким образом, снижение IFN можно связывать либо с истощением клеток, либо с повышенным его потреблением  в процессе нерезко выраженного лиммунного воспаления, что приводит в дальнейшем к частым воспалительным процессам,  переходу в хроническую форму,  и служит благоприятным фоном для развития ангиогенеза.

Повышенный уровень  IL-4 и TNFa  и  низкий  уровень IFN были характерны для пациентов с  тяжелым  течением  заболевания, без  периодов ремиссии с постоянно прогрессирующей экссудацией и геморрагиями во всех группах с СНМ. Наибольшее количество пациентов с ВМД и ОМ с частыми обострениями и плохим типом течения имели повышение уровня IL-8 и  VEGF. У пациентов с миопией на фоне повышения уровня IL-8 двухстороннее поражение встречалось чаще (статистически достоверное различие было между группой с двухсторонним поражением и контролем (p<0,001)), и имелась тенденция к увеличению частоты обострений. В дальнейшем  была выявлена разница между уровнем  VEGF у пациентов с выраженной степенью экссудации и контрольной группой (p<0,001),  выраженной и невыраженной степенями экссудации (p<0,005).  Коэффициент корреляции  Спирмена  составил  0,551, что свидетельствует об умеренной связи между степенью экссудации и уровнем VEGF (корреляция значима на уровне 0,05 (с двух сторон). На фоне постоянно повышенного в плазме уровня VEGF экссудативные процессы на глазном дне, особенно у пациентов с ОМ,  имеют более выраженный характер и затяжное течение.  Статистический анализ показал умеренную связь между увеличением  степени экссудации и характером поражения (коэф. корреляции Спирмена 0,360, корреляция значима на уровне 0.01 (двусторонняя)),  типом течения и неоваскуляризацией (коэф. корреляции Спирмена 0,438, корреляция значима на уровне 0.01 (двусторонняя)), и высокую связь между типом течения и степенью экссудации (коэф. корреляции Спирмена 0,703, корреляция значима на уровне 0.01 (двусторонняя)). Таким образом, можно сказать, что двусторонняя СНМ у пациентов с ВМД чаще протекает с выраженной экссудацией и характеризуется частыми обострениями. В свою очередь, у пациентов с миопией  можно отметить только умеренную связь между типом течения и степенью экссудации (коэф. корреляции Спирмена 0,676 корреляция значима на уровне 0.01 (двусторонняя)).

  Пациенты с  тяжелым течением заболевания и гиперрубцеванием после перенесенного хориоретинита показали статистически достоверное повышение уровня FGF в плазме.  Вирус Эпштейн-Барра, как и многие другие вирусы, а возможно и инфекционные агенты, способны повышать уровень FGF. Он служит мощным модулятором клеточной дифференцировки, пролиферации и выживаемости. В плане пролиферативного эффекта, кроме активации фибробластов клетками-мишенями, FGF являются эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки сосудов и др.  При этом FGF может проявлять более выраженное митогенное действие, чем VEGF. Кроме того, FGF может стимулировать  продукцию VEGF посредством паракринных и аутокринных механизмов. Повышение уровня IL-8 и  VEGF  в данной группе не только не утяжеляло характер течения заболевания, но в некоторых случаях имело обратную зависимость. На первый план у данной категории пациентов выходили цитокины семейства трансформирующего фактора роста фибробластов: TGF1 и TGF2. Повышение  уровня TGF1 приводило  к ухудшению течения заболевания (частым обострениям, быстрому формированию фиброзной ткани, ), но не к увеличению частоты его развития (нет разницы между исследуемой и контрольной группами без СНМ), или к увеличению экссудативных реакций. Уменьшение уровня  TGF2, как противовоспалительного цитокина, подавляющего только пролиферацию эндотелиальных клеток и стимулирующего фиброз, приводит к ухудшению течения заболевания, так как удлиняет стадию лактивной СНМ и снижает скорость образования и  состоятельность  хорио-ретинального рубца. В дополнение было отмечено, что у пациентов процессы гиперрубцевания происходили на фоне увеличения  уровня TGF1 и снижение TGF2.

Во всех группах провели исследование влияния  уровней IgG ВПГ-1, IgG ВПГ-2, IgG к токсоплазме, антител к микобактерии туберкулеза, IgG антител к вирусу Эпштейн-Барр в сыворотке крови на течение и развитие СНМ. Инфицированность токсоплазмой чаще (р<0,05) встречается у пациентов с СНМ при ВМД и  ОМ, чем в контроле, что может служить фактором,  влияющим на  развитие заболевания у данной категории пациентов.

В работе показано, что  наибольшее влияние инфицированность, перечисленными выше агентами, оказывает на самую пожилую группу пациентов (старше 65 лет) - с возрастной макулярной дегенерацией. У данной категории пациентов увеличение титра АТ к  IgGВПГ-2 (р=0,033)  и вирусу Эпштейн-Барр (р=0,039) достоверно чаще встречается у пациентов с более выраженными экссудативными процессами. Вирус ЭпштейнаЧБарра кодирует аналог IL10, который ингибирует синтез IFN , что мы и наблюдали при оценке цитокинового статуса. Известно, что большинство персистентных вирусных инфекций характеризуется нарушением функционирования цитокиновой сети. В основе патогенеза длительного пребывания патогенов в организме лежат выраженные нарушения  равновесия  Th1- и Th2-путей иммунного ответа и, следовательно, дизрегуляция продукции и взаимодействия секретируемых иммуноцитами цитокинов. В группе с ОМ  иммунологические сдвиги, в ответ на инфицированность,  были полностью противоположны группе с ВМД. Можно предположить, что  у более молодых пациентов с миопией присутствует более бурная иммунная реакция на возбудитель, но в то же время она способна защитить организм от перехода заболевания в более тяжелую, хроническую форму.

Таким образом, генетическая предрасположенность, экзогенные факторы и дисбаланс иммунной системы (как врожденный, так и приобретенный),  которые приводят к разрушению биологических мембран, увеличению  секреции проангиогенных факторов, снижению или изменению защитных механизмов организма, а также повышенная экспрессия VEGF (на местном уровне) способствуют развитию субретинальной неоваскуляризации. 

Учитывая полученные данные, во второй части работы (экспериментальной), на основе экспериментальных исследований,  проводили разработку и изучение механизмов действия  возможных методов лечения СНМ.

После субконьюнктивальной инъекции анти-VEGF препарата Авастин кроликам (с сформированной неоваскуляризацией роговицы)  регистрировали снижение плотности мелких новообразованных сосудов, преимущественно капилляров, в центральной зоне роговицы. При проведении ФАГД  выявили существенное снижение экстравазального выхода флуоресцеина на поздних фазах, что свидетельствует о снижении проницаемости стенки новообразованных сосудов. Так же отмечалось снижение плотности сети сосудистого русла по сравнению с контрольными группами. При гистологическом исследовании  на 7 сутки на фоне распространенного стаза крови и выключения капиллярного кровотока  обнаружили частичную редукцию капиллярного русла с образованием бесклеточных структур, резко суженных или спавшихся  рудиментарных  сосудов.  При этом кровоток в магистральных сосудах сохранялся.  Через 14 дней практически все микрососуды находились в спавшемся состоянии и представляли собой линейно расположенные изолированные эндотелиоциты в стадии частичного распада, существенно уменьшались диаметр и количество проходимых магистральных сосудов. Таким образом, после введения Авастина  на экспериментальной модели, отмечается уменьшение калибра и запустевание мелких новообразованных сосудов, снижение экстравазации и выявляются признаки внутрисосудистого тромбоза мелких артериол. Магистральные сосуды существенно уменьшаются в диаметре лишь к 14 суткам. По данным иммуногистохимического исследования  максимальное накопление препарата Авастин  в хориокапиллярах и ретинальном пигментном эпителии глаз кроликов  происходило  через 48 часов после эндовитреального введения. 

После проведения ФДТ ангиографически отмечали  облитерацию новообразованных сосудов роговицы кролика. При морфологическом исследовании было показано, что  в центральных отделах поверхностных слоев стромы роговицы большинство новообразованных сосудов находились в спавшемся состоянии без форменных элементов крови в просвете. У части из них наблюдалась отшнуровка интрамуральных перицитов в окружающую строму с последующей трансформацией в фибробласты. В некоторых случаях в эти же сроки в периферических отделах роговицы обращало на себя внимание близкое расположение как функционирующих новообразованных сосудов, так и облитерированных в результате тромбоза лоблученных сосудов. Причем у последних,  в ряде случаев, наблюдалось муфтоподобное разрастание базальной мембраны с включениями из эндотелиоцитов, образующих щелевидные пространства.

Подобные морфологические изменения, на наш взгляд,  свидетельствовали о недостаточном терапевтическом эффекте фотодинамической терапии, что привело к частичной реканализации лоблученных  новообразованных сосудов роговицы кролика.

В  группе  с применением ангиостатина клиническая и гистологическая картина  были сходны с аналогичными данными контрольной группой. Новообразованные сосуды образовывали плотную, хорошо сформированную сеть. Никакого терапевтического воздействия на структуры сосудистой стенки отмечено не было.

Комбинированное  использование ФДТ с препаратом Фотосенс  и  препарата Авастин  новообразованных сосудов роговицы кролика позволило добиться оптимального терапевтического эффекта. Происходило запустевание новообразованных  сосудов крупного калибра, запустевание и  частичная  редукция капилляров, снижение экстравазального выхода форменных элементов крови и плазмы через порозную сосудистую стенку. Данные изменения происходят за счет суммирования и совместного воздействия двух вышеперечисленных методов лечения,  поскольку ФДТ, в основном, вызывает тромбоз (как крупных, так и мелких сосудов), а Авастин снижает экстравазацию и вызывает окклюзию сосудов микроциркуляторного русла, что в дальнейшем приводит к снижению возможности реканализации  новообразованных сосудов. 

В третьей части работы (клинической)  разрабатывали методику и оценивали эффективность терапии СНМ. 

В начале  работы была разработана методика ФДТ СНМ.  По данным исследования необходимая концентрация  препарата, достаточная для инициации фотодинамического эффекта, достигается у пациентов на 3-4 сутки после введения препарата. 

С учетом бльшего диаметра СНМ у человека, чем у кролика, определены оптимальное время лазерного воздействия на нейроэпителий глаза человека - не более 100 секунд и возможность дробного облучения (в связи с длительным временем циркуляции препарата). В исследовании отрабатывались две световые дозы: 120 и 200 Дж/см2. С использованием разработанной методики была выполнена ФДТ и оценены её результаты в двух подгруппах больных.

В ходе работы определены оптимальные параметры облучения: световая доза 120 Дж/см2, экспозиция 100 минут и дробный характер облучения. Проведение ФДТ может быть  рекомендовано на 3, 5 и 7 сутки после введения препарата.  На 10 сутки, после повторных сеансов облучения, как в зоне  СНМ, так и в прилегающих здоровых тканях, флюоресценция не регистрируется.

Учитывая фармакодинамику препарата Фотосенс, введённого в дозе 0,05 мг/кг, всем пациентам  было рекомендовано соблюдать световой режим в течение трёх месяцев.

В работе  показано, что высокие дозы  светового облучения приводят к развитию выраженного фиброза, что неприемлемо при рубцово-гипертрофической форме СНМ и при наличии перифокальной разреженности и атрофии РПЭ. Бесперспективным является проведение ФДТ при массивных субретинальных кровоизлияниях, выраженных экссудативно-геморрагических изменениях в центральной зоне глазного дна, при рубцовых стадиях ВМД, а также для лечения СНМ, существующих более 5 лет. Тщательный отбор пациентов обеспечивает избирательность эффектов ФДТ и высокую клиническую эффективность. 

В дальнейшем проводили апробацию разработанной методики ФДТ на фоне медикаментозного лечения в комбинации с анти- VEGF терапией СНМ и  изучение эффективности данного метода по сравнению с курсом консервативной терапии или монотерапией ФДТ.

Курс консервативной терапии у  пациентов  с СНМ  был комплексным, с использованием препаратов  различной патогенетической направленности и  предусматривал применение лекарственных средств, обладающих противоотечным, цитостатическим, антиоксидантным  действием,  а также улучшающих метаболизм.  Согласно исследованиям, проведенным в части I, всем пациентом со сниженным уровнем  IFN и нормальным или повышенным содержанием IL-2 назначался препарат полудан, если содержание  IL-2 было значительно снижено, рекомендовали консультацию иммунолога. Пациентам после перенесенного хориоретинита на фоне выраженного повышения FGF, увеличения уровня TGF1 и снижения TGF2 назначали пульс-терапию с использованием метипреда.

В группе пациентов с ВМД в течение первого месяца наблюдения в группе 2а стабилизация остроты  зрения регистрировалась в 85,7% (12 глаз), повышения остроты зрения не наблюдалось. На фоне ФДТ в группе 2б повышение остроты зрения и уменьшение лактивности СНМ  отмечено в 50% случаев (9 глаз),  стабилизация происходила в 50% (9 глаз), а снижения остроты зрения не наблюдалось ни у одного пациента. Группа 2в имела наибольший процент улучшения зрительных функций - 60% (12 глаз), стабилизация - 40% (8глаз), ухудшения не наблюдалось. В более поздние сроки  в группе 2 а острота зрения увеличилась в  42,9% (6 глаз) к 3-му месяцу, 14,3% (2 глаза) к 12-му месяцу и в 28,6% (4 глаза) к 24-му месяцу.  Однако процент снижения остроты зрения в группе оставался достаточно высоким: 28,6%(4 глаза) к 3-му месяцу, 71,4% (10 глаз) к 12-му месяцу  и в 50% (7 глаз) к 24-му месяцу. В группе 2б уменьшения остроты зрения практически не было: 5,6% (1глаз) - к 3-му месяцу, и 11,1% (2 глаза) к 12-му и 24-му месяцу. Но и процент увеличения остроты зрения был не столь высок к 3-му месяцу - 66,7% (12 глаз), к 12-му месяцу - 55,6% (10 глаз), к 24-му месяцу - 44,4% (8 глаз). Наибольший процент повышения зрительных функций можно отметить во 2в группе 50% (10 глаз) к концу 3-го месяца, 75% (15 глаз) через 12 месяцев, 90% (18 глаз) через 24 месяца.

Оценка функциональных результатов эффективности проведения лечения  у пациентов с ВМД с СНМ проводили с учетом анализа  градиента изменения остроты зрения.

Было установлено, что в течение первого месяца статистически достоверных различий градиента остроты зрения между группами не наблюдалось (р=0.096), однако к 3 и 12 месяцам различия в группах стали более существенными и наглядно демонстрировали улучшение остроты зрения в группе 2б и 2в. Так же необходимо отметить, что на протяжении всего года средние значения градиента изменения остроты зрения в группе 2а имели отрицательные значения. Через 24 месяца тенденция к снижению остроты зрения в группе 2а сохранилась. У пациентов после ФДТ отмечалось снижение остроты зрения, но она была выше первоначальной. В группе 2в регистрировали незначительное повышение остроты зрения. Можно отметить снижение среднего количества повторных курсов терапии в группе 2в по отношению к  группе2б 3,7 к 4,6 соответственно.

У пациентов с ОМ в течение первого месяца наблюдения в группе 3а  повышение остроты  зрения регистрировали в 28,6% (8 глаз), у остальных 20-ти (71,4%) пациентов отмечали стабилизацию остроты зрения. В группе 3б в 91,7 % (22 глаза) было отмечено повышение остроты зрения,  у остальных 2 человек зрительные функции были стабильными. В группе 3в все пациенты отметили улучшение зрительных функций. В более поздние сроки динамика остроты зрения несколько изменилась. В группе 3 а через 3 месяца повышение зрения  регистрировали только в 7% (2 человека), стабилизацию - в 42,9% (12 человек). В дальнейшем данная группа имела достаточно низкие показатели динамики остроты зрения. Через 12 и 24 месяца  повышение остроты зрения зарегистрировали в 14,3% (4 глаза), снижение - в 42,9% (12 человек). В группе 3б динамика остроты зрения была следующей: через 3 месяца  повышение остроты зрения отмечено в 75% (18 глаз) - этот показатель оставался неизменным весь срок наблюдения (24 месяца),  снижение - в 16,7% (4 глаза), через 12 и 14 месяца - в 12,5% (3 глаза). В последней группе 3в через 3 месяца  повышение остроты зрения было в 83,3% (25 глаз),  уменьшения не было. Через 12 месяцев регистрировали  повышение в 90% (27 глаз), стабилизацию в 10% (3 глаза). К концу срока наблюдения улучшение зрительных функций отмечено в 83,3% (25 глаз), стабилизация в 13,3% ( 4 глаза), ухудшение - в 3,3% (1 глаз).

При мониторировании остроты зрения  также  исследован градиент остроты зрения. Вследствие  большой разницы в исходной остроте зрения (от 0,02 до 0,5) как внутри каждой группы, так и между группами (в группе 3а - 0.150.12, 3б - 0,240.18, 3в-0,190.09), наибольшее внимание в оценке изменения зрения следует уделять не абсолютным цифровым значениям, а изменению градиента остроты зрения, который показывает, на сколько изменится острота зрения в определённый промежуток времени.

Градиент изменения остроты зрения в группах 3б и 3в достоверно превышал таковой в группе 3а на протяжении 1 и 3 месяцев наблюдения, хотя последний  имел положительные значения. В свою очередь, в группе 3в градиент остроты зрения существенно превышал аналогичный в группе 3б. К концу года градиент изменения остроты зрения в группе 3в был положительным и достигал наиболее высоких значений (0,31±0,06), при этом  он с высокой достоверностью отличался от аналогичного показателя в группах 3а  (р<0,000) и 3б(р<0,005) . Среднее количество  повторных курсов  терапии в группе 3в было 3,9 , что ниже, чем в группе 3б - 4,4.

Анализ ФАГД и ОКТ  показал, что  у всех пациентов  после проведения комплексной ФДТ и анти-VEGF терапии  регистрируется наиболее выраженное снижение лактивности СНМ.

Как видно из проведенной работы, ФДТ на фоне медикаментозной терапии способствует  стабилизации процесса, ФДТ+анти-VEGF терапия  повышает остроту зрения и  способствует снижению количества повторных вмешательств, в большем проценте случаев активнее, чем курсы консервативной терапии или монотерапия ФДТ .

Для повышения эффективности комбинированного метода лечения в алгоритм обязательного обследования пациентов с СНМ на фоне различных заболеваний помимо высокотехнологических офтальмологических методов (ФАГД, ОКТ) должны входить такие методы обследования как: генетический анализ; исследование цитокинового профиля (IFN, TNF, FGF, IL-4, IL-8, VEGF);  исследование инфицированности вирусами группы герпеса.

Именно комплексный анализ дает возможность прогнозировать течение заболевания, а подбор индивидуальной схемы комбинированной терапии позволяет повысить качество жизни пациента.

Результаты проведённого исследования свидетельствуют о перспективности применения комбинированной ФДТ и анти-VEGF  терапии в офтальмологии. Простота выполнения, низкая травматичность и хорошая переносимость больными разработанных методик делают целесообразным их широкое применение в клинической практике.

Комбинация с анти-VEGF  терапией и коррекцией иммунологического статуса позволяет существенно повысить остроту зрения, снизить количество проводимых процедур и предотвратить рецидивирование.

Перспективы дальнейшего развития и совершенствования методов лечения неоваскуляризации связаны, в первую очередь, с разработкой и синтезом новых, генетически и иммунологически ориентированных препаратов, а также с развитием профилактических мер.

ВЫВОДЫ

  1. На основании  анализа данных  исследования 280 пациентов  (560 глаз) с субретинальной неоваскулярной мембраной  определены критерии ее лактивности. Диагноз лактивная СНМ можно поставить,  при наличии 3 из 7 диагностических критериев: субретинальные кровоизлияния; по данным ОКТ:  наличие очага в области комплекса - РПЭ - мембрана Бруха Цхориокапилляры, увеличение средней толщины  сетчатки  в фовеальной зоне, увеличение  общего макулярного объема, увеличение объема сетчатки в фовеальной зоне; контрастирование сети новообразованных сосудов (симптом кружева) на ранних фазах ФАГД (хориоидальной и ранней артериальной) с последующим экстравазальным выходом флюоресцеина с увеличением  ИФ(снм) над ИФ(х), диффузная гиперфлюоресценция в зоне  СНМ на поздних фазах ФАГД с увеличением  ИФ(снм) над ИФ(х) более, чем в 2 раза.
  2. Статистический анализ  генетических параметров продемонстрировал ассоциацию полиморфизмов гена CFH с  увеличением (rs1061170, rs514943 и rs380390) или уменьшением  (rs529825, rs7524776, rs1831281, rs2274700, rs1576340, rs12144939, rs7540032)  риска развития СНМ, а так же их влияние  на развитие тех или иных клинических проявлений (экссудация, рубцевание, рецидивирование). Анализ полиморфных вариантов генов показал,  что наличие одной копии  гена с аллелем риска А полиморфизма rs11200638 гена HТRA1, Т полиморфизма rs10490924 и del443in54 гена ARMS2 увеличивает риск развития СНМ у пациентов с ВМД. Установлена  ассоциация  полиморфизма -251T>A гена IL-8  в глазах с воспалительным фоном с развитием СНМ. Впервые были выявлены две новые мутации в промоторной области гена VEGF: замена G на А  в позиции (-72) нуклеотида от начала транскрипции гена  и замена G на А  в 5Т-нетранслируемой части первого экзона гена в позиции (+31) нуклеотида от начала транскрипции гена, существенно ухудшающие клиническое течение заболевания.
  3.   Установлено, что частое рецивирование, лактивность субретинальной неоваскулярной мембраны с последующим образованием выраженного хорио-ретинального рубца и  низкой остротой зрения (менее 0,05) статистически достоверно чаще  регистрируется на фоне значительных иммунологических сдвигов: повышения  уровня IL-4, TNF и выраженного снижения IFN на фоне нормальных или повышенных значений IL-2 в плазме. Выявлена умеренная связь (коэффициент корреляции  Спирмена 0,551, р<0,05) между степенью экссудации и уровнем VEGF. На фоне постоянно повышенного в плазме уровня VEGF  экссудативные процессы на глазном дне, особенно у пациентов с ОМ,  имеют более выраженный характер и затяжное течение.  У пациентов с СНМ после перенесенного хориоретинита определяется статистически достоверное повышение уровня FGF в плазме, а ухудшение течения заболевания и развитие гиперрубцевания происходят на фоне увеличения уровня TGF1 и снижения TGF2.
  4. Выявлено, что инфицированность токсоплазмой чаще встречается у пациентов с СНМ при ВМД и  ОМ, чем в контроле (р<0,05). Наибольшее влияние инфицированность вирусами группы герпеса оказывает на группу пациентов  после 70 лет - с возрастной макулярной дегенерацией,  в которой  увеличение титра АТ к  IgGВПГ-2 (р=0,033)  и вирусу Эпштейн-Барр (р=0,039) достоверно чаще встречается у пациентов с более выраженными экссудативными процессами.
  5. Показано, что основным действием фотодинамической  терапии на новообразованные сосуды глаза в эксперименте (на модели  неоваскуляризации роговицы) является развитие избирательного фототромбоза новообразованных сосудов  различного калибра. 
  6. По данным иммуногистохимического исследования глаз кроликов максимальное накопление препарата Авастин  в хориокапиллярах и ретинальном пигментном эпителии происходит  через 48 часов после эндовитреального введения. Основным действием данного препарата на неоваскуляризацию роговицы является  снижение  экстравазального выхода плазмы  и  окклюзия сосудов микроциркуляторного русла.
  7. Определено, что комбинированная фотодинамическая и анти-VEGF терапия приводит к окклюзии новообразованных сосудов любого калибра и уменьшению экссудативных проявлений. С учетом динамики накопления в тканях глаза препаратов Фотосенс и Авастин обоснован алгоритм проведения комплексной терапии. Оптимальными параметрами лазерного облучения для проведения фотодинамической терапии субретинальных неоваскулярных мембран являются световая доза 120Дж/см 2, экспозиция 100 секунд.  Оптимальные сроки проведения облучения - 3, 5 и 7 сутки после введения препарата.
  8. Эффективность  разработанной нами  комбинированной терапии  пациентов с субретинальными неоваскулярными мембранами различного генеза подтверждена результатами  функциональных исследований, критериями которых явились:

- стабилизация или  повышение остроты зрения;

- выявление офтальмоскопических признаков стабилизации или регресса заболевания;

- стабилизация или уменьшение выраженности ангиографических признаков лактивности субретинальной  неоваскулярной мембраны;

- отсутствие рецидивов заболевания.

  1. На основании проведенных исследований сформулированы основные принципы практического применения комбинированной фотодинамической и анти-VEGF терапии  в комплексном лечении субретинальных неоваскулярных мембран.

Практические рекомендации.

  1. Диагноз лактивная СНМ можно поставить, если присутствуют 3 из 7 предложенных нами диагностических критериев:

по данным ОКТ:

  1. субретинальные кровоизлияния;
  2. наличие очага в области комплекса - РПЭ - мембрана Бруха Цхориокапилляры; 
  3. увеличение средней толщины  сетчатки  в фовеальной зоне;
  4. увеличение  общего макулярного объема;
  5. увеличение объема сетчатки в фовеальной зоне;

по данным ФАГД:

  1. контрастирование сети новообразованных сосудов (симптом кружева) на ранних фазах ФАГД (хориоидальной и ранней артериальной) с последующим экстравазальным выходом флюоресцеина с увеличением  ИФ СНМ над ИФ хориоидеи;
  2. диффузная гиперфлюоресценция в зоне  СНМ на поздних фазах ФАГД с увеличением  ИФ(снм) над ИФ(х) более, чем в 2 раза.
  1. Для ориентировочного прогноза течения заболевания и определения тактики ведения пациентов с СНМ необходимо  учитывать следующие генетические факторы:
  1. Наличие полиморфизмов гена CFH rs529825, rs7524776, rs1831281, rs2274700, rs1576340, rs12144939, rs7540032 , благоприятно влияют на развитие СНМ, в то время как полиморфизмы rs1061170, rs514943 и rs380390 оказывают отрицательное воздействие.
  2. У пациентов с  СНМ после перенесенного хореоретинита наличие в геноме хотя бы 1-ой копии гаплотипа rs529825 С - rs1061170 С гена CFH  или  присутствие полиморфизма -251T>A гена IL-8  значительно увеличивает риск развития СНМ.
  3. Для пациентов с СНМ  гомозиготных по мутации 402Н  гена CFH характерна клиническая картина с наличием выраженной экссудативной реакции с большим количеством липидов,  и преобладанием двухстороннего поражения.
  4.   Мутация (-251)А промоторного участка  гена  IL-8 в двух хромосомах, приводит к развитию СНМ в основном классического характера (без присутствия оккультного компонента),  с отсутствием сливных друз и отслоек пигментного эпителия  у пациентов с ВМД.
  5. Мутация (-625)А промоторного участка гена  HTRA1 в двух хромосомах  у пациентов с СНМ приводит к  молниеносному течению заболевания (2-3 месяца) от экссудативных проявлений до процессов выраженного рубцевания с формированием фиброзной ткани не только суб- но и  интра-, и преретинально. 
  6. Мутации 402Н, (-625)А и (-251)А в обеих копиях генов CFH,  HTRA1 и IL-8  соответственно приводят к двустороннему развитию СНМ, быстрому течению, с выраженным снижением остроты зрения  (до 0,01-0,02 за 10-15 месяцев).
  7. Мутации в промоторной области гена VEGF: замена G на А  в позиции (-72) нуклеотида от начала транскрипции гена  и замена G на А  в 5Т-нетранслируемой части первого экзона гена в позиции (+31) нуклеотида от начала транскрипции гена приводят к повышению VEGF в плазме, быстрому развитию СНМ ригидной к проводимой терапии.
  1. При подборе схем лечения следует учитывать данные цитокинового статуса. Так увеличение уровня  FGF,  TNF,  IL-2  и  уменьшение  INF приводит к повышенному риску развития СНМ у пациентов с ВМД, ОМ и после перенесенных хориоретинитов.
  2. С целью повышения эффективности пациентов с СНМ рекомендовано использовать комбинированную терапию включающую в себя: комплексную медикаментозную терапию (антиоксиданты, противоотечные, противовоспалительные  и иммуномодулирующие препараты),  фотодинамическую терапию с препаратом Фотосенс и анти-VEGF терапию  (эндовитреальное введение препарата Луцентис).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Аветисов С.Э., Будзинская М.В., Лихванцева. В.Г. Фотодинамическая терапия и перспективы ее применения в офтальмологии.// Вестник офтальмологии - 2005. - №5. - C. 3.
  2. Аветисов С.Э., Будзинская М.В., Лихванцева В.Г., Гурова И.В., Лощенов В.Б.,  Шевчик С.А, Кузьмин С.Г.,. Ворожцов Г.Н. Результаты II-а фазы клинических исследований фотодинамической терапии с препаратом Фотосенс субретинальных неовскулярных мембран.// Вестник офтальмологии. - 2005. - №5. - C 6.
  3. Шевчик С.А.,  Лощенов М.В., Меерович Г.А., Будзинская М.В., Ермакова Н.А., Харнас С.С., Лощенов В.Б. Устройство для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии заболеваний глаз с использованием препарата Фотосенс. //Вестник офтальмологии  -  2005. -№5.- C. 26.
  4. Будзинская М.В,. Благодатских Д.П., Киселев Г.Л., Лихванцева В.Г. Нормирование цветных изображений картины глазного дна.// Вестник офтальмологии. - 2006.- №2. - C. 11.
  5. Будзинская М.В., Гурова И.В.. Субретинальная неоваскулярная мембрана при возрастной макулярной дегенерации.// Вестник офтальмологии.- 2006. - №4 - C. 49-54.
  6. Аветисов С.Э., Будзинская М.В., Казарян Э.Э., Гурова И.В. Диагностическое значение прижизненной морфометрии сетчатки у пациентов с субретинальной неоваскуляризацией.// Вестник офтальмологии. - 2007 - №1 - C.3-7.
  7. Будзинская М.В., Благодатских Д.П., Киселев Г.Л., Лихванцева В.Г., Прививкова Е.А.. Колориметрическое послойное  сканирование цветного изображения глазного дна в анализе ангиоархитектоники хориоидеи.// Вестник офтальмологии. - 2006 .-  №5. -  C.7-9.
  8. Аветисов С.Э., Будзинская М.В.,  Киселёва Т. Н., Казарян Э.Э., Гурова И.В., Смирнова Т.В., Щёголева И.В., Лощенов В.Б., Шевчик С.А., Кузьмин С.Г., Ворожцов Г.Н.. Результаты фотодинамической терапии субретинальных неоваскулярных мембран. Сообщение 1: Возрастная макулярная дегенерация. // Вестник офтальмологии. -  2007. - №6. -  С.3-8.
  9. Аветисов С.Э., Будзинская М.В.,  Киселёва Т. Н., Казарян Э.Э., Гурова И.В., Смирнова Т.В., Щёголева И.В., Прививкова Е.А., Лощенов В.Б., Шевчик С.А., Кузьмин С.Г., Ворожцов Г.Н.. Результаты фотодинамической терапии субретинальных неоваскулярных мембран. Сообщение 2: Осложнённая миопия.//  Вестник офтальмологии.- 2007.- №6. - C. 8-11.
  10. Будзинская М.В.,  Шевчик С.А,  Киселева Т.Н.,  Лощёнов В.Б., Гурова И.В., Щеголева И.В., Кузьмин С.Г, Ворожцов Г.Н. Роль флуоресцентной диагностики с  использованием Фотосенса у пациентов с субретинальной неоваскулярной мембраной. // Вестник офтальмологии - 2007. - №6. - C. 11-17.
  11. Аветисов С.Э., Будзинская М.В., Киселева Т.Н.,  Казарян Э.Э., Гурова И.В., Лощенов В.Б., Шевчик С.А., Кузьмин С.Г., Ворожцов Г.Н.Фотодинамическая терапия в лечении субретинальной неоваскуляризации.// Вестник РАМН. - 2007. - №8. - C.45-48
  12. Сафарли Н. Н., Щёголева И.В.,  Будзинская М.В, Киселёва Т.Н., Киселев Г.Л.. Метод количественной оценки интенсивности флюоресценции в определении активности хориоидальной неоваскуляризации.// Успехи современного ествествознания.-  2007.- № 6  - C.101-102.
  13. Балацкая Н.В., Фролков В.К., Будзинская М.В, Киселева Т.Н., Краснова Л.Б., Гандурина И.А., Гольдина Н.А.. Состояние системы антиоксидантной защиты у пациентов с неоваскулярной формой возрастной макулярной дегенерации при проведении фотодинамической терапии. // Вестник восстановительной медицины. - 2008 - № 6. - С. 92 - 95.
  14. Балацкая Н.В., Фролков В.К., Будзинская М.В., Киселева Т.Н., Краснова Л.Б., Гандурина И.А., Гольдина Н.А. Состояние системы антиоксидантной защиты у пациентов с неоваскулярной формой возрастной макулярной дегенерации при проведении фотодинамической терапии .// Вестник восстановительной медицины. - 2008 - № 6. - С. 92 - 95.
  15. Budzinskaya M., Likhvantseva V., Shevchik S., Loschenov V., Kuzmin S., Vorozhtsov G Treatment of choroidal neovascularization in age-related macular degeneration with photodynamic therapy. // 10 th World Congress of the International Photodynamic  Association. Munich, 22-25 June 2005. - P.127.
  16. Budzinskaya M., Likhvantseva V., Gurova I., Shevchik S., Loschenov V., Kuzmin S., Vorozhtsov G. Photodynamic therapy for the treatment of choroidal neovascularisation. // 16th World Congres of the International Society for Laser Surgery and Medicine. Japan. Tokyo. 7-10 September, 2005. P.43.
  17. Shevchik S.A., Budzinskaya M.V., Meerovich G.A., Kuzmin S.G., Loschenov V.B. Device for fluorescent control and photodynamic therapy of age-related macular degeneration. //  The 5th International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine. September 2-3, 2006. Wuhan, P.R. China. P.63.
  18. Avetisov S., Budzinskaya M., Kasarian E., Shevchik S., Loschenov V., Kuzmin S., Vorozhtsov G. Photodynamic therapy effectiveness in the treatment of Age-related macular degeneration. // The 6th International Congres of the World Association of Laser Therapy. Kipr 2006. P.130.
  19. Budzinskaya M ., Kiseleva T., Shevchik S., Loschenov V., Kuzmin S., Vorozhtsov G. Photodynamic therapy using Photosens for the treatment of choroidal neovascularization. // Joint Congress of SOA./ААО Vienna, Austria. 9-12 June 2007.P.63.
  20. Avetisov S., Budzinskaya M., Kiseleva T., Balatskaya N., Gurova I., Loschenov V., Shevchik S., Kuzmin S., Vorozhtsov G.  Photodynamic therapy  for treatment  subretinal  neovascularization. // Therapeutic Laser Applications and Laser-Tissue Interactions III663212.  Proceedings of SPIE.Ц2007.-Vol.6632.- N3.- Р.169.
  21. Avetisov S., Kiseleva T., Budzinskaya M ., Kravchuk E.A., Loschenov V., Shevchik S., Kuzmin S., Vorozhtsov G.  Modern Ultrasound methods for patients with choroidal neovascularization  after photodynamic  therapy// Therapeutic Laser Applications and Laser-Tissue Interactions III663212.  Proceedings of SPIE.Ц2007.-Vol.6632. - N3 - P.170.
  22. Budzinskaya M ., Kiseleva T., Shevchik S., Loschenov V., Kuzmin S., Vorozhtsov G. Photodynamic therapy using  Photosens for the treatment of choroidal neovascularization. // 11th World Congress of the International Photodynamic Association. March 28-31, 2007 Shanghai, China S13-P6,

P. 169.

  1. Kiseleva T., Budzinskaya M.,  Kravchuk E., Shevchik S., Loschenov V., Kuzmin S., Vorozhtsov G. Modern ultrasound methods for patients with choroidal neovascularization after photodynamic therapy. // The 11th World Congress of the International Photodynamic Association. March 28-31, 2007 Shanghai, China S13-P8 P.170. 
  2. Avetisov S., Budzinskaya M., Stolyarenko G., Schegoleva I., Gurova I.,. Kazarian E, Kuzmin S., Vorozhtsov G. Combination Therapy for Choroidal Neovascularisation 7th International Symposium. // Photodynamic Therapy and Photodiagnosis in Clinical Practice - October 7-11, 2008. Brixen., Italy. Р 158.
  3. Kiseleva T. N., Budzinskaya M.V., Kravchuk E. A . Ultrasound 3-dimentional criterias in the predictions of central choroidal neovascularisation development.// The 7th International Symposium.Photodynamic Therapy and Photodiagnosis in Clinical Practice - October 7-11, Brixen., Italy. 2008 Р16.
  4. Kiseleva T. N., Budzinskaya M.V., Kravchuk E. Changes in Ultrasound Doppler  Blood Flow in Central Choroidal Neovascularization Treatment. // The  7th International Congress of the World Association for laser therapy, 19-22 October 2008, Sun City, South Africa P39/173.
  5. Avetisov S., Budzinskaya M ., Stolyarenko G., Schegoleva I., Gurova I., Kazarian E., Kuzmin S., Vorozhtsov G. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in combination with Photosens photodynamic therapy for choroidal neovascularization. // The 7th International Congress of the World Association for laser therapy, 19-22 October 2008, Sun City, South Africa,  P46/100.
  6. Avetisov S., Budzinskaya M., Kiseleva T., Shevchik S., Loschenov V., Kuzmin S., Vorozhtsov G. Photodynamic therapy with Photosens for>
  7. Kiseleva T., Budzinskaya M., Kravchuk E., Shevchik S., Kuzmin S. The effectiveness of photodynamic therapy in the treatment of exudative age-related macular degeneration.// Photodiagnosis and Photodynamic Therapy N1 (5), 2008, P.76.
  8. Kiseleva T., Budzinskaya M., Kravchuk E., Krasnova L., Balatskaya N., Kuzmin S., Loschenov V. Immunologic and ultrasound criteria in exudative form of age-related macular degeneration.// Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. N1 (5), 2008, P76.
  9. Avetisov S., Budzinskaya M., Schegoleva I.,  Kiseleva T., Shevchik S., Loschenov V., KuzminS., Vorozhtsov G. Photodynamic therapy and choroidal neovascularization in Russia.// Book of Abstacts Fifth International Conference on Porphyrins and Phtalocyanines (ICPP-5), July 6-11 2008, Moscow, Russia, P.222.
  10. Budzinskaya M ., Gurova I., Schegoleva I., Kazarian E., Privivkova E., Kuzmin S., Vorozhtsov  G. Therapeutic effect of Intravitreal bevacizumab (Avastin) in combination with Photosens photodynamic therapy in the treatment  of  choroidal neovascularization.// The 19th International Congress on Photonics in Europe, June 14-18 2009, Munich, Germany.P.73.
  11. Kuzmin S., Budzinskaya M., Voevodina T.,  Fedorov A., Vorozhtsov G . Bevacizumab (Avastin) in combination with photosens photodynamic therapy for experimental corneal neovascularization. // The 12th World Congress of the International Photodynamic Association (IPA) Seattle, USA, 11-15 June 2009.Paper 7380-134,  P.46.
  12. Mamikonian V.R., Budzinskaya M.V., Balayan М., Fedorov A.A., VoevodinaТ., Kuznecov A.  Kuzmin S., Vorozhtsov G. Photosens photodynamic therapy in combination with Bevacizumab for experimental corneal neovascularization. // The 13th Congress of the European Society for Photobiology n conjunction  with the 2nd Conference of the European Platform for Photodynamic Medicine (EPPM), Wroclaw, Poland, September 5/10, 2009 OC604 P.123-124.
  13. Budzinskaya M ., Gurova I., Schegoleva I., Kazarian E., Privivkova E., Kuzmin S., Vorozhtsov G. Therapeutic effect of Intravitreal Lucentis  in combination with Photosens photodynamic therapy in the treatment  of  choroidal neovascularization.// The 13th Congress of the European Society for Photobiology n conjunction  with the 2nd Conference of the European Platform for Photodynamic Medicine (EPPM), Wroclaw, Poland, September 5/10, 2009 poster748, P150.
  14. Budzinskaya M., Gurova I., Schegoleva I., Kazarian E., Kuzmin S., Vorozhtsov G. Two-years results for Photosens photodynamic therapy in combination with Bevacizumab for choroidal neovascularization. // The 8th International Symposium on Photodynamic Therapy and Photodiagnosis in Clinical Practice. Italy.  Brixen/Bressanone.  October 6-9, 2010. P. 132.
  15. Ворожцов Г.Н., Кузьмин С.Г., Ермакова Н.А., Будзинская М.В., Лощёнов В.Б., Шевчик С.А. Использование Фотосенса и лазерно-спектроскопического комплекса для диагностики и фотодинамической терапии субретинальных мембран.// VIII Съезд офтальмологов России, - Москва. -  2005. -  C.384.
  16. Аветисов C.Э, Лихванцева В.Г, Будзинская М.В., Гурова И.В., Крупнов Р.Н., Шевчик С.А., Лощёнов В.Б., Кузьмин С.Г., Ворожцов Г.Н.  Первый клинический опыт применения фотодинамической терапии с применением отечественного фотосенсибилизатора Фотосенс в лечении субретинальных неоваскулярных мембран.// IV всероссийская научно-практическая конференция Отечественные противоопухолевые препараты Москва 16-18 марта 2005 год.  Российский биотерапевтический журнал 2005г. - № 1. - C. 31.
  17. Аветисов С.Э. Будзинская М.В., Лихванцева В.Г., Шевчик С.А,  Лощёнов В.Б.,. Кузьмин С.Г, Ворожцов Г.Н. Фотодинамическая терапия с препаратом Фотосенс в лечении субретинальной неоваскулярной мембраны у пациентов с миопией.//  Научно-практическая конференция с международным участием посвящённая 130- лет со дня рождения академика В.П. Филатова. Г. Одесса 13 мая, 2005 года, C. 152.
  18. Будзинская М.В.,  Киселёва Т.Н., Гурова И. В., Шевчик С.А. Лощёнов В.Б., Кузьмин С.Г., Ворожцов Г.Н.. Значение флюоресцентной ангиографии в оценке эффективности фотодинамической терапии. // Материалы IV Евро-азиатской конференции по офтальмохирургии. Екатеринбург 25-27 апреля 2006 г.  C. 192.
  19. Киселёва Т.Н., Будзинская М.В., Кравчук Е.А..  Современные ультразвуковые исследования в оценке патологических изменений центральной зоны сетчатки.// Материалы IV Евро-азиатской конференции по офтальмохирургии. Екатеринбург 25-27 апреля 2006 г. стр. 196.
  20. Балацкая Н.В. Краснова Л.Б. Парсункова К.А. Гандурина И.А. Гольдина Н.А. Будзинская М.В. Кузьмин С.Г. Ворожцов Г.Н. Динамика уровня цитокинов и антиоксидантного статуса в сыворотке крови пациентов с субретинальной неоваскулярной мембраной в процессе фотодинамической терапии с препаратом Фотосенс. // Материалы всероссийского научного форума Инновационные технологии медицины XXI века Москва 23-26 мая 2006 года. С. 20.
  21. Аветисов С.Э., Будзинская М.В., Киселёва Т.Н., Гурова И. В., Шевчик С.А,  Лощёнов В.Б., Кузьмин С.Г., Ворожцов Г.Н. Возможности фотодинамической терапии в лечении хориоидальной неоваскуляризации различной этиологии.// Материалы всероссийского научного форума Инновационные технологии медицины XXI века Москва 23-26 мая 2006 года.  Стр.36.
  22. Будзинская М.В. Шевчик С.А. Фотодинамическая терапия в лечении хориоидальной неоваскуляризации.// Всероссийская научная конференция молодых учёных Актуальные проблемы офтальмологии Москва 2006. 1 июня. Стр. 341.
  23. Аветисов С.Э., Будзинская М.В.,  Киселёва Т.Н., Кравчук Е. А., Гурова И. В., Шевчик С.А,  Лощёнов В.Б., Кузьмин С.Г., Ворожцов Г.Н.. Роль современных ультразвуковых методов исследования в оценке эффективности фотодинамической терапии субретинальной неоваскуляризации. // Сб.научн. трудов, посвещённый 80-летию Уфимского НИИ глазных болезней Проблемы современной офтальмологии. - Уфа, 2006. с.112-113.
  24. Харлап С.И. Лихванцева В.Г. Маркосян А.Г. Будзинская М.В. Филоненко И.В. Ручко Т.А. Щеголева И.В. Методика пространственного ультразвукового анализа изменений центральной области глазного дна. // II Всероссийский семинар."МАКУЛА 2006" Ростов-на-Дону. Стр. 66-70.
  25. Будзинская М. В., Казарян Э.Э., Гурова И.В. Роль ретинального анализатора толщины сетчатки в оценке изменения нейроэпителия при фотодинамической терапии субретинальной неоваскуляризации. // II Всероссийский семинар. "МАКУЛА 2006" Ростов-на-Дону. Стр 300-301.
  26. Киселева Т.Н. Будзинская М.В. Кравчук Е.А. Новые возможности ультразвука в оценке состояния центральной зоны сетчатки при субретинальных неоваскулярных мембранах.// II Всероссийский семинар. "МАКУЛА 2006" Ростов-на-Дону. Стр 332-333.
  27. Будзинская М.В.,  Киселёва Т. Н.,  Казарян Э.Э., Гурова И.В., Щёголева И.В.,. Лощенов В.Б, Шевчик С.А., Кузьмин С.Г., Ворожцов Г.Н.. Фотодинамическая терапия и перспективы её применения в лечении хориоидальной неоваскуляризации. // Сборник тезисов по материалам научно-практической конференции  Актуальные проблемы офтальмологии.  Москва, 2006. с.14-17.
  28. Будзинская М.В., Балацкая Н.В., Киселева Т.Н., Краснова Л.Б., Сафарли Н.Н., Гурова И.В. Влияние фактора роста эндотелия сосудов и трансформирующего фактора роста на развитие субретинальной неоваскулярной мембраны. // Вопросы офтальмологии выпуск пятый. Материалы научно-практической конференции Омск 2007 с. 66-67.
  29. Будзинская М.В., Балацкая Н.В., Киселева Т.Н., Краснова Л.Б., Сафарли Н.Н., Гурова И.В. Роль основных ангиогенных факторов в развитии субретинальной неоваскуляризации. // Актуальные проблемы офтальмологии II Всероссийская научная конференция молодых учёных. 2007. Москва. Стр249-251.
  30. Балацкая Н.В., Будзинская М.В., Краснова Л.Б., Гандурина И.А., Гольдина Н.А., Кузьмин С.Г., Ворожцов Г. Состояние антиоксидантного статуса, спектра цитокинов и факторов роста при оценке эффективности фотодинамической терапии препаратом Фотосенс у больных с субретинальной неоваскулярной мембраной.// Российский биотерапевтический журнал Материалы Всероссийской научно-практической конференции Отечественные противоопухолевые препараты Москва 2007. 24-26 марта. C. 9.
  31. Будзинская М.В., Воробьева М.В., Киселева Т.Н., Лагутина Ю.М., Полунин Г.С. Современные подходы к лечению и профилактике возрастной макулярной дегенерации. Русский медицинский журнал 2007 г, том 8, № 2 стр 78-83.
  32. Будзинская М.В, Балацкая Н.В, Киселева Т.Н., Краснова Л.Б, Сафарли Н.Н, Халаим А.В. Роль фактора роста эндотелия в развитии субретинальной неоваскуляризации различного генеза. Материалы научно-практической конференции лофтальмоиммунология Москва 22-23 ноября 2007г. Стр 70-73.
  33. Будзинская М.В, Балацкая Н.В, Киселева Т.Н., Краснова Л.Б, Сафарли Н.Н, Изменение трансформирующего фактора роста у пациентов с субретинальной неоваскулярной мембраной.  Материалы научно-практической конференции лофтальмоиммунология Москва 22-23 ноября 2007г. Стр 74-76.
  34. Будзинская М.В., Киселева Т.Н., Гурова И.В., Шевчик С.А., Лощенов В.Б., Кузьмин С.Г.,Ворожцов Г.Н. Роль флюоресцентной ангиографии в оценке эффективности фотодинамической терапии субретинальной неоваскуляризации//Труды Всероссийской конференции, посвященной 105-летию со дня рождения Т.И.Ерошевского Ерошевские чтения/ Под ред. Г.П.Котельникова, Г.И.Гусаровой, В.М.Малова. - Самара, 2007. - С.316-318.
  35. Балацкая Н.В., Будзинская М.В., Киселева Т.Н., Краснова Л.Б., Гандурина И.А., Гольдина Н.А., Кузьмин С.Г., Ворожцов Г.Н. Окислительный гомеостаз у пациентов с субретинальной неоваскулярной мембраной на фоне фотодинамической терапии// Труды конф. АСВОМЕД-2007. - Москва,2007. - С.30-31.
  36. Будзинская М.В., Киселева Т.Н.., Балацкая Н.В., Краснова Л.Б.,  Гурова И.В. Роль основных ангиогенных факторов в развитии субретинальной неоваскуляризации// Сб.трудов II Всероссийской научной конференции молодых учёных Актуальные проблемы офтальмологии.-  Москва,2007 -  С.249-251.
  37. Киселева Т.Н., Полунин Г.С., Будзинская М.В. Возрастная макулярная дегенерация// Для тех, кто лечит/ Приложение к журналу Здоровье. - №3,июнь 2007. ЦС.34-63.
  38. Будзинская М.В., Воробьева М.В., Киселева Т.Н., Лагутина Ю.М., Полунин Г.С.Современные подходы к лечению и профилактике возрастной макулярной дегенерации// Клиническая офтальмология. - 2007. - Т.8,№2. - С.78-82.
  39. Н.В. Балацкая, Л.Б. Краснова, М.В. Будзинская, Т.Н. Киселева, И.А. Гандурина, Н.А. Гольдина, С.Г. Кузьмин, Г.Н. Ворожцов (Москва) Влияние фотодинамической терапии (ФДТ) препаратом фотосенс на состояние системы внутриклеточных ферментов антиоксидантной защиты у больных с  неоваскулярной формой возрастной макулярной дегенерации (ВМД).// Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием Отечественные противоопухолевые препараты Москва 17-18 марта. Российский биотерапевтический журнал №1(7) 2008 г. стр.11-12.
  40. Колягина Н.А., Шевчик С.А., Меерович Г.А, Линьков К.Г., Кузьмин С.Г., Будзинская М.В., Лощенов В.Б.. Аппаратура для проведения фотодинамической терапии заболеваний органа зрения.// Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием Отечественные противоопухолевые препараты Москва 17-18 марта Российский биотерапевтический журнал №1(7) 2008 г. стр.17.
  41. Саакян А.В., Аветисов С.Э., Столяренко Г.Е., Федоров А.А., Будзинская М.В.
    Изучение влияния препарата бевацизумаб на внутриглазные структуры при интравитреальном введении в эксперименте.// Сборник научных статей по материалам научно-практической конференции л Современные технологии лечения витреоретинальной патологии. Москва. 20-21 марта 2008 года стр.158-160.
  42. Большунов А.В., Мирзабекова К.А.,  Будзинская М.В.. Первый опыт сочетанного применения фотодинамической терапии с препаратом фотосенс и транспупиллярной термотерапии в лечении экссудативной стадии возрастной макулярной дистрофии.// III Всероссийский семинар Ч МАКУЛА-2008 15-18 мая 2008 года г. Ростов-на-Дону стр 349.
  43. Аветисов С.Э., Будзинская  М.В., Столяренко Г.Е., Щеголева И.В., Гурова И.В., Саакян А.В. Кузмин С.Г., Ворожцов Г.Н. Первые результаты проспективного контролируемого открытого  исследования  эффективности комбинированной фотодинамической терапии препаратом Фотосенс и антиангиогенной терапии с препаратом Авастин субретинальных неоваскулярных мембран. //III Всероссийский семинар Ч МАКУЛА-2008 15-18 мая 2008 года г. Ростов-на-Дону стр.337.
  44. Киселева Т.Н., Будзинская М.В., Кравчук Е.А.Современные диагностические возможности оценки состояния центральной зоны сетчатки при экссудативных формах возрастной макулярной дегенерации // Материалы Международной научно-практической конференции Новые технологии в офтальмологии 7-8 февраля 2008. - Казань, 2008. - С.120-123
  45. Балацкая Н.В., Фролков В.К., Киселева Т.Н., Краснова Л.Б., Будзинская М.В., Гандурина И.А., Гольдина Н.А., Кузьмин С.Г., Ворожцов Г.Н. Биохимические эффекты фотодинамической терапии субретинальной неоваскуляризации у пациентов с возрастной макулярной дегенерацией // Всероссийский научный форум по восстановительной медицине, лечебной физкультуре, курортологии, спортивной медицине и физиотерапии РеаСпоМед: Тезисы докладов. - М., 2008. - С.19-20.
  46. Балацкая Н.В., Фролков В.К., Будзинская М.В., Киселева Т.Н., Краснова Л.Б.,. Гандурина И.А, Гольдина Н.А., Кузьмин С.Г., Ворожцов Г.Н. Влияние фотодинамической терапии (ФДТ) на активность антиоксидантной системы (АОС) и процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) больных неоваскулярной формой возрастной макулярной дегенерации (ВМД) // X Международная конференция АСВОМЕДСовременные технологии восстановительной медицины: Тезисы докладов. - Сочи, 2008. - С. 39-41.
  47. Мамиконян В.Р., Будзинская М.В., Воеводина Т.М., Федоров А.А., Труфанов С. В., Балаян М.Л., Кузнецов А.В., Кузмин С.Г., Ворожцов Г.Н.  Результаты фотодинамического и антиангиогенного воздействий на новообразованные сосуды роговицы в эксперименте. // Научно-практическая конференция Лазеры в офтальмологии: вчера, сегодня, завтра Москва 24-25 сентября 2009 года. стр 380-382.
  48. Будзинская  М.В., Гурова И.В., Щеголева И.В., Кузмин С.Г., Ворожцов Г.Н. Первые результаты  комбинированной фотодинамической терапии препаратом Фотосенс и антиангиогенной терапии с препаратом Луцентис субретинальных неоваскулярных мембран.// Научно-практическая конференция Лазеры в офтальмологии: вчера, сегодня, завтра Москва 24-25 сентября 2009 года. стр 159-160.
  49. Мамиконян В.Р., Будзинская М.В., Воеводина Т.М., Федоров А.А., Труфанов С.В., Балаян М.Л., Кузнецов А.В., Кузмин С.Г., Ворожцов Г.Н. Эффект сочетанного фотодинамического и медикаментозного антиангиогенного воздействия на васкуляризацию роговицы в эксперименте. // II Всероссийская научная конференция с международным участием "Роль и место фармакотерапии в современной офтальмологической практике" 16-17 октября 2009 года. Санкт-Петербург стр. 131-133.
  50. Мамиконян B.Р., Будзинская М.В., Воеводина Т.М., Федоров А.А., Труфанов С.B., Балаян М.Л., Кузнецов А.В., Кузмин С.Г., Ворожцов Г.Н.. Влияние антиангиогеной терапи на новобразованные сосуды роговицы в эксперименте. //  Саратовский научно-медицинский журнал. Материалы Всероссийского VI съезда анатомов, гистологов и эмбриологов. 2010. Том 6. 1.с.214.
  51. Мамиконян В.Р., Будзинская М.В., Воеводина Т.М., Федоров А.А., Труфанов С.В., Балаян М.Л., Кузнецов А.В., Кузмин С.Г., Ворожцов Г.Н. Фотодинамический тромбоз новообразованых сосудов роговицы в эксперименте. // Саратовский научно-медицинский журнал. Материалы Всероссийского VI съезда анатомов, гистологов и эмбриологов. 2010. Том 6. 1.с.214
  52. Воеводина Т.М., Мамиконян В.Р., Фёдоров А.А., Будзинская М.В., Балаян М.Л., Кузнецов А.В., Саакян А.В., Киселёв С.Л., Лагарькова М.А. Иммуногистохимическое исследование фармакодинамики "Авастина" при субконъюнктивальном и эндовитреальном введении. //Актуальные проблемы офтальмологии: V Всерос. науч. конф. молодых ученых: Сб. науч. Работ / Под ред. Х.П.Тахчиди. - М.: Изд-во "Офтальмология", 2010. - с. 53-54.
  53. Чикун Е.А., Будзинская М.В., Погода Т.В., Генерозов Э.В., Щеголева И.В. Изучение мутаций генов CFH, HTRA и IL-8 у пациентов с субретинальной неоваскулярной мембраной. // Актуальные проблемы офтальмологии: V Всерос. науч. конф. молодых ученых: Сб. науч. Работ / Под ред. Х.П.Тахчиди. - М.: Изд-во "Офтальмология", 2010. - с. 228-229.
  54. Будзинская М.В. Гурова И.В. Сдобникова С.В. Сургуч В.К. Троицкая Н.А. Щеголева И.В. Антиангиогенная терапия в комплексном лечении неоваскулярных и экссудативных состояний заднего отдела глаза . // IX Съезд офтальмологов России.Москва 16-18 июня 2010г. Стр 259.
  55. Балаян М.Л. Будзинская М.В. Кузнецов А.В., Федоров А.А., Воеводина Т.М. Антиангиогенное и фотодинамическое воздействие на новообразованные сосуды при патологии переднего отрезка глаза.//  IX Съезд офтальмологов России.Москва 16-18 июня 2010г. Стр 518.
  56. Будзинская М.В., Ворожцов Г.Н. Ермакова Н.А., Кузьмин С.Г., Лощёнов В.Б., Лужков Ю.М., Шевчик С.А. Патент на изобретение Устройство и способ диагностики и фотодинамической терапии заболеваний глаз. RU2258452. Бюллетень Изобретения, полезные модели 2006. - №23.- С.429.
  57. Аветисов С.Э., Будзинская М.В., Ворожцов Г.Н., Кузьмин С.Г., Лихванцева В.Г., Лощенов В.Б., Лужков Ю.М., Шевчик С.А., Гурова И.В. Патент на изобретение Способ лечения неоваскулярной мембраны. RU 2290973. // Бюллетень Изобретения, полезные модели. -  2007. -№1-  C. 197.
  58. Краснова Л.Б., Балацкая Н.Л., Будзинская М.В.,Киселева Т.Н., Кравчук Е.А.,Сафарин Н.Н., Кузмин С.Г. Патент на изобретение Способ прогнозирования течения субретинальной неоваскулярной мембраны RU2350274 С1.// Бюллетень Изобретения, полезные модели. - 2009. - №9 ЦC..679.
  59. Аветисов С.Э., Будзинская М.В., Столяренко Г.Е..,Гурова И.В..,Щеголева И.В..,Саакян А.В.,Балацкая Н.В.,Кузьмин С.Г.., Ворожцов Г.Н Патент на изобретение Способ лечения субретинальной неоваскулярной мембраны. RU 2376957.// Бюллетень Изобретения, полезные модели. -  2009. - .№36. - C.827.

Список сокращений 

А  аденин

АПС  ангиоидные полосы сетчатки

АТ  антитела

ВМД  возрастная макулярная

дегенерация

ВПГ вирус простого герпеса

Г гуанин 

ИФ интенсивность флюоресценции

ИФА  иммуноферментный анализ

ОКТ оптическая когерентная

томография

ОМ осложненная миопия

ПЦР  полимеразная цепная реакция

РПЭ  ретинальный пигментный

  эпителий

СНМ субретинальная

  неоваскулярная мембрана

Т  тимин

ТСС толщина средняя сетчатки

У  урацил

ФД -  флюоресцентная диагностика

ФДТ -  фотодинамическая терапия

ФАГД -  флюоресцентная ангиография 

ФС - фотосенсибилизатор

Х  хориоидея 

ген CFH  ген фактора комплимента Н

ген HTRA1 ген сериновой пептидазы

С  цитозин

DNA  (ДНК)

  дезоксирибонуклеиновая кислота

FGF фактор роста фибробластов

IFN  интерферон

IgG  иммуноглобулин G

IL  интерлейкин

NK натуральные (нормальные)

киллеры

TGF  трансформирующийся фактор

роста

Th T-хелперы

Th1-путь клеточный путь

Th2-путь  гуморальный путь

TNF  фактор некроза опухолей

VEGF  фактор роста эндотелия сосудов
Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине