Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по разное  

На правах рукописи

Пулина Наталья Алексеевна

Синтез соединений на основе химических превращений

производныха-оксокарбоновых кислот

И ИХ БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора фармацевтических наук

Пермь 2009

Работа выполнена в ГОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая

академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научные консультанты:			доктор химических наук, профессор Залесов Владимир Васильевич , доктор медицинских наук, профессор Юшков Владимир Викторович
Официальные  оппоненты:			доктор фармацевтических наук, профессор Михалев Александр Иванович, ГОУ ВПО Пермскаяагосударственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию доктор фармацевтических наук, профессор Марданова Людмила Геннадьевна, ГОУ ВПО Пермский государственный университет доктор химических наук, профессор Насакин Олег Евгеньевич, ГОУ ВПО Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова
	Ведущая организация:	ГОУ ВПО Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита состоится л21 апреля 2009 г. в 13.00 на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Ленина, 48.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: 614070, г. Пермь, ул.аКрупской, 46.

Автореферат разослан л___ _________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук, доцент

И.А. Липатникова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Создание высокоэффективных и малотоксичных лекарственных средств является основной проблемой фармацевтической науки и для ее решения одним из приоритетных направлений служит синтез и поиск биологически активных веществ (БАВ). Ранее было установлено, что соединения, полученные на основе химических превращений 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеновых (ароилпировиноградных) кислот (АрПК) и их -лактонной формы - 5-арил-2,3-дигидрофуран-2,3-дионов (5-АФД), обладают различной фармакологической активностью при низкой токсичности, что и привлекает к ним значительное внимание. Наименее изученными производными этого класса соединений являются N-гетериламиды и N2-замещенные гидразиды АрПК. Они представляют практический интерес, благодаря наличию нескольких реакционных центров 1,3-дикетонного, гетероциклического и гидразидного фрагментов, что позволяет использовать их для создания разнообразных ациклических и гетероциклических соединений. Известные методы синтеза нуждаются в доработке и требуют их дальнейшего исследования для расширения структурных возможностей целевых продуктов и введения в молекулу соединений биологически активных группировок. Среди важных в препаративном отношении реакций АрПК и их производных, имеющих теоретическое и практическое значение, особое место занимают нуклеофильные превращения (с гетероциклическими аминами, замещенными гидразинами, трифенилфосфоранилиденгидразонами (трифенилфосфазинами диазосоединений - фосфазинами), гидразонами кетонов, диазосоединениями), ранее не изученные или же проведенные на единичных примерах.

Интересным объектом для сравнительного изучения химического поведения гетероциклических аминов, фосфазинов и гидразонов кетонов с 2,3-диоксогетероциклами является 2,3-дигидробензо[b]фуран-2,3-дион (кумарандион - КД). Образованные на его основе N-гетериламиды и N2-замещенные гидразиды 2-(2-гидроксифенил)-2-оксоэтановой (о-гидроксифенилглиоксалевой) кислоты (о-ГФГК) могут обладать значительными синтетическими возможностями для получения БАВ, в том числе, растворимых в воде. Кроме того, представляет интерес исследование дальнейших химических превращений N-замещенных 2-метиленгидразоно-2,3-дигидро-3-бензо[b]фуранонов с целью поиска новых биологически активных производных о-ГФГК. Принимая во внимание, что химическая модификация соединений путем комплексообразования с металлами может привести к значительному усилению биологического действия и появлению новых фармакологических свойств лигандов, несомненно, перспективными являются ранее не изученные реакции N-гетериламидов и  N2-замещенных гидразидов АрПК и о-ГФГК с галогенидами переходных металлов. Таким образом, изучение синтеза, химических свойств, биологической активности и зависимости структура-активность в ряду производных -оксокарбоновых кислот является актуальным.

Цель работы. Целью настоящего исследования является поиск и разработка новых методов синтеза высокоэффективных, малотоксичных БАВ на основе химических превращений -оксокарбоновых кислот, а также установление зависимости их строения с биологическим действием.

Задачи исследования:

1. Осуществить синтез и изучить особенности строения N-гетериламидов АрПК и о-ГФГК, содержащих в своем составе фармакофорный гетероциклический фрагмент с одним, двумя или тремя гетероатомами, а также N2-замещенных гидразидов -оксокарбоновых кислот, несущих биологически активные группировки.
2. Изучить химические свойства АрПК и их производных в реакциях с гетериаламинами, замещенными гидразинами, фосфазинами, гидразонами кетонов, диазонуклеофилами.
3. Изучить взаимодействие о-ГФГК и ее N-гетериламидов с гетериламинами, гидразонами кетонов, фосфазинами, в сравнении с АрПК и их N-гетериламидами, а также получить на их основе водорастворимые соединения.
4. Провести сравнительное изучение химического поведения N-гетериламидов и N2-замещенных гидразидов -оксокарбоновых кислот в реакциях комплексообразования с дихлоридами меди, цинка, кадмия.
5. Осуществить поиск БАВ среди продуктов синтеза, изучить зависимость их строения с фармакологическим действием, выявить перспективные соединения для проведения доклинических исследований в качестве потенциальных лекарственных средств.

Научная новизна. Разработаны, усовершенствованы препаративные методы синтеза новых биологически активных N2-замещенных гидразидов и N-гетериламидов АрПК и о-ГФГК с различным характером заместителей в амидном и гидразидном фрагментах, а также 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноатов и 2-(2-гидроксифенил)-2-оксоэтаноатов гетериламмония. Показано наличие тион-тиольной и амино-иминной прототропной таутомерии в растворе производных АрПК и о-ГФГК, содержащих 5-R-1,3,4-тиадиазол. Выявлено, что дециклизация 5-АФД под действием этилового эфира гидразинэтановой кислоты приводит к этоксикарбонилметилгидразидам АрПК и их кольчатым изомерам, количественный состав которых зависит от характера заместителя.

Установлено, что направление реакции гетериламинов, гидразонов кетонов и фосфазинов с КД не меняется, по сравнению с 5-АФД, в результате чего выделены, соответственно, N-гетериламиды, N2-замещенные гидразиды о-ГФГК и N-замещенные 2-метиленгидразоно-2,3-дигидро-3-бензо[b]фураноны. При изучении химических свойств 3-бензо[b]фуранонов найдены способы синтеза производных о-ГФГК и АрПК, содержащие в своем составе сохраненный биологически активный фурановый и бензо[b]фурановый цикл.

Установлено влияние заместителей в гетерильной части N-[5(6)-R-2-пиридил]амидов и N-(5-R-2-тиазолил)амидов АрПК, а также степени нуклеофильности исходного диазосоединения на состав и строение продуктов реакции. Показано, что взаимодействие бензоилметиленгидразидов АрПК с диазометаном региоселективно и приводит к продуктам -О-алкилирования.

Изучены реакции АрПК и их амидов с фосфазинами и гидразонами кетонов, приводящие к соответствующим 2-метиленгидразинопроизводным, существующим в растворах в трех таутомерных формах. В то же время установлено, что взаимодействие N-гетериламидов АрПК с этиловым эфиром гидразинэтановой кислоты приводит к замыканию цикла с образованием производных 5-арил-1-этоксикарбонил-1Н-пиразол-3-карбоновых кислот.

Осуществлен синтез комплексных соединений на основе  N-гетериламидов и N2-замещенных гидразидов -оксокарбоновых кислот с дихлоридами меди, цинка, кадмия и подтверждено, что исходные реагенты координируются металлами как бидентатные О-О лиганды. Получены водорастворимые 2-[2-(N-гетериламино)-2-оксоацетил]феноляты натрия.

Исследована биологическая активность синтезированных соединений и выяснены некоторые закономерности связи строения с активностью. Новизна исследования подтверждена 1 патентом и 1 решением о выдаче патента РФ на изобретение.

Практическая значимость. В ходе исследования разработаны или усовершенствованы удобные препаративные методы синтеза более 40 типов ранее неизвестных или труднодоступных производных -оксокарбоновых кислот. Определенную ценность имеет синтез 3 типов водорастворимых соединений, поскольку это позволяет увеличить их биологическую доступность и расширить спектр возможных биологических испытаний.

Получено 289 неописанных ранее соединений, при этом более 250 прошли фармакологический скрининг. Среди них выявлены вещества, обладающие противовоспалительной, анальгетической, жаропонижающей, антигипоксической, гипогликемической, противомикробной активностью, которая находится на уровне или превосходит действие препаратов, применяющихся в медицинской практике. Большинство изученных соединений относятся к малотоксичным или практически нетоксичным веществам. Выявлена связь между структурой испытанных соединений и их биологической активностью, используемая в целенаправленном поиске БАВ среди производных -оксокарбоновых кислот и продуктов их химических превращений.

Проводятся доклинические исследования высокоэффективных N-[2-(5-этил-1,3,4-тиадиазолил)]амида 2-(2-гидроксифенил)-2-оксоэтановой кислоты и 2-(1,2-дифенил-2-оксоэтилиденгидразино)-4-(4-метоксифенил)-4-оксо-2-бутеновой кислоты, обладающих противовоспалительным, анальгетическим и жаропонижающим действием. Для углубленных фармакологических исследований также предложены: 2-гидрокси-4-оксо-4-фенил-2-бутеноат 5-метил-1,3,4-тиадиазолиламмония и бис{3-(4-хлорфенил)-1-[N-(5-бром-2-пиридил)]карбоксамидо-1,3-пропандионато}цинк, проявляющие высокую гипогликемическую активность и низкую токсичность.

Результаты научных исследований внедрены в научно-исследовательский и учебный процесс кафедр фармацевтической химии о/ф, фармакологии, клинической фармакологии ГОУ ВПО ПГФА Россздрава, кафедры природных и биологически активных соединений ГОУ ВПО ПерГУ, а также лаборатории БАВ ЕНИ ПерГУ.

Апробация работы. Результаты работы доложены на итоговых научных конференциях профессорско-преподавательского состава ГОУ ВПО ПГФА Россздрава в 1995-2008 гг., на Всесоюзных научных конференциях Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов (Саратов, 1992, 2004, 2008), региональных научных конференциях Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции (Пятигорск, 1993, 2006, 2007), III, XIV Российском национальном конгрессе Человек и лекарство (Москва, 1995, 2007), Международной научно-технической конференции Перспективы развития химии и практического применения алициклических соединений (Самара, 2004), II Всероссийском съезде фармацевтических работников (Сочи, 2005), Международных конгрессах Здоровье и образование в XXI веке (Москва, 2005-2007), Российской научно-практической конференции Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (Ростов-на-Дону, 2006), Российско-Китайской и Китайско-Российской научных конференциях по фармакологии (Пермь, 2006; Харбин, 2008), 3-й Всероссийской научно-методической конференции Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ (Воронеж, 2007), Международных конференциях Техническая химия. От теории к практике (Пермь, 2006, 2008), Всероссийском симпозиуме Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств (Москва, 2008) и других совещаниях и конференциях.

Публикации. Основное содержание работы представлено в 53 публикациях, из них: 12 статей в изданиях, рекомендуемых ВАК, глава в монографии, 38 статей и тезисов докладов в сборниках и материалах научных конференций различного уровня, получены 1 патент и 1 решение о выдаче патента РФ на изобретение.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Россздрава (№ государственной регистрации 01.9.50 007419).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа общим объемом 328 страниц машинописного текста состоит из введения, литературного обзора по синтезу, строению, химическим свойствам и биологической активности N2-замещенных гидразидов ацилпировиноградных кислот (глава 1), обсуждения результатов собственных исследований (главы 2, 3), экспериментальной части (глава 4), изучения результатов биологической активности производных -оксокарбоновых кислот и продуктов их химических превращений (глава 5), выводов, литературы, приложения. В главе 2 приводятся сведения по синтезу и строению N-гетериламидов и N2-замещенных гидразидов -оксокарбоновых кислот. Глава 3 посвящена изучению химических свойств производных -оксокарбоновых кислот и их -лактонных форм. Список литературы включает 299 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа содержит 62 таблицы, 12 рисунков.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Синтез новых N-гетериламидов и N2-замещенных гидразидов -оксокарбоновых кислот, содержащих биологически активные группировки, и изучение особенностей их строения.

2. Результаты исследования нуклеофильных превращений производных 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеновых и 2-(2-гидроксифенил)-2-оксоэтановой кислот с гетероциклическим аминами, замещенными гидразинами, трифенилфосфоранилиденгидразонами, гидразонами кетонов, диазосоединениями.

3. Результаты сравнительного изучения реакции комплексообразования N-гетериламидов и N2-замещенных гидразидов -оксокарбоновых кислот с дихлоридами меди, цинка, кадмия.

4. Установленные взаимосвязи строения и фармакологической активности синтезированных соединений, а также выбор перспективных веществ для углубленных биологических испытаний.

Основное содержание работы

1. Синтез и строение N-гетериламидов -оксокарбоновых кислот

1.1. Синтез N-гетериламидов 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеновых кислот

Для решения поставленных задач и синтеза исходных N-гетериламидов 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеновых кислот (2а-аи) была использована известная реакция 5-АФД 1 с различными гетероциклическими аминами в среде инертного растворителя при эквимолярном соотношении реагентов. С целью введения в структуру амидов биологически активных фрагментов и получения неописанных ранее соединений 2ц-аи в качестве гетериламинов нами взяты 2-амино-5-нитротиазол, 2-амино-5-циклопропилтиазол, 2-амино-1,3,4-тиадиазол, 2-амино-5-R-1,3,4-тиадиазолы, 2-аминобензимидазол (метод А). Установлено, что оптимальным растворителем для данной реакции служит безводный хлороформ.

1: Ar=Ph(а), 4-СН3C6H4(б), 2,4-(СН3)2C6H3(в), 4-СН3OC6H4(г), 4-С2Н5OC6H4(д), 4-СlC6H4(е), 4-BrC6H4(ж) 2: Ht=2-С5Н4N (2-пиридил), С6Н6N [2-(6-метилпиридил)], С5Н3BrN[2-(5-бромпиридил)], 3-С5Н4N (3-пиридил), С11Н11N2О (1,5-диметил-3-оксо-2-фенил-2,3-дигидро-1Н-пиразол-4-ил), С3Н2NS (2-тиазолил), С3Н1N2О2S [2-(5-нитротиазолил)], С6Н6NS [2-(5-циклопропилтиазолил)], С2Н1N2S [2-(1,3,4-тиадиазолил)], С3Н3N2S [2-(5-метил-1,3,4-тиадиазолил)], С4Н5N2S[2-(5-этил-1,3,4-тиадиазолил)], С2Н1N2S2 [2-(5-меркапто-1,3,4-тиадиазолил)], С4Н5N2S2 [2-(5-этилтио-1,3,4-тиадиазолил)], С7Н5N2 (2-бензимидазолил)

Нами проведен встречный синтез N-[2-(5-R-1,3,4-тиадиазолил)]амидов 2 в результате реакции метиловых эфиров АрПК 3 с соответствующими аминами (метод Б). Однако выход амидов 2 оказался значительно ниже, чем в методе А, и в дальнейшем для синтеза целевых продуктов метод Б не использовался.

Спектральные характеристики новых гетериламидов 2ц-аи свидетельствуют о существовании соединений в кристаллическом состоянии в форме производных 2-бутеновых кислот с прочной внутримолекулярной водородной связью (ВВС) Н-хелатного типа между атомом водорода енольного гидроксила в положении 2 и атомом кислорода кетонного карбонила, что хорошо согласуется с литературными данными для родственных структур. По данным их спектров ЯМР1Н в растворе ДМСО-d6 наблюдается прототропная кето-енольная таутомерия и содержание дикетоформы Б составляет 0-11%. Отмечена полная енолизация N-бензимидазолиламидов и N-[2-(5-этил-1,3,4-тиадиазолил)]амидов 2, не зависимо от характера заместителя в ароильном фрагменте. В случае N-[2-(5-тиоксо-4,5-дигидро-1,3,4-тиадиазолил)]амида 2аг возможна реализация еще двух типов прототропной таутомерии: амино-иминной, за счет миграции протона от амидной группы на атом азота в положении 3 гетероцикла, с последующим его вовлечением во ВВС Н-хелатного типа с амидной карбонильной группой; тион-тиольной таутомерии, за счет миграции протона от сульфгидрильной группы к атому азота в положении 4 гетероцикла. Как показывают наши исследования, в растворе ДМСО-d6 реализуется таутомерное равновесие соответствующих форм В и Г гетериламида 2аг с соотношениема75%а:а25%. Спектральные характеристики 2-(5-этилтио-1,3,4-тиадиазолил)амидов 2ад,ае также свидетельствуют о наличии амино-иминной таутомерии и в растворе ДМСО-d6 фиксируются 2 таутомера - енольный и дикетонный их соответствующей иминоформы с содержанием 88-90% : 10-12%.

1.2. Синтез N-гетериламидов 2-(2-гидроксифенил)-2-оксоэтановой кислоты

Циклическим производным 2-(2-гидроксифенил)-2-оксоэтановой кислоты (о-ГФГК) является кумарандион 5. Ранее выполненные квантово-химические расчеты КД 5 и 5-АФД 1показали, что гетероциклы являются близкими по своим геометрическим характеристикам и распределению в них зарядов. В продолжение изучения химического поведения 2,3-диоксогетероциклов в реакции с гетериламинами, нами впервые исследовано взаимодействие КД 5 с гетериламинами различного строения в условиях, аналогичных образованию соединений 2, в результате чего выделены N-гетериламиды 2-(2-гидроксифенил)-2-оксоэтановой кислоты (6а-з):

6: Ht=С5Н3BrN, 3-С5Н4N, 4-С5Н4N, С3Н2NS, С2Н1N2S, С3Н3N2S, С4Н5N2S, С7Н5N2

Продуктов реакции по кетонной карбонильной группе соединения 5 не обнаружено, что свидетельствует о региоселективности протекающего процесса.

Низкочастотное положение полосы поглощения кетонной карбонильной группы в ИК-спектрах гетериламидов 6, а также слабопольное положение сигнала протона ОН-группы в спектрах ЯМР1Н, вероятно, свидетельствует об их существовании в кристаллическом состоянии и в растворе в форме с ВВС Н-хелатного типа между протоном гидроксильной группы и атомом кислорода группы С2=О. Кроме того, в спектре ЯМР1Н N-[2-(5-этил-1,3,4-тиадиазолил)]амида 6ж присутствует уширенный синглет протона NН-группы при 12.85 м.д., положение которого указывает на миграцию протона от амидной группы на атом N3 в гетероцикле, подобно гетериламидам АрПК 2аг-ае, и существование соединения 6ж в растворе ДМСО-d6 в иминоформе со 100% содержанием.

По-видимому, образование соединений 6 происходит в результате нуклеофильной атаки аминогруппы исходного гетериламина на электронодефицитный атом углерода С2 КД 5 с последующим раскрытием лактонного кольца через интермедиат И1 до производного о-ГФГК 6. Подтверждением этому служит тот факт, что при использовании в данной реакции 2-амино-5-хлорбензоксазола, образующийся И1 является достаточно стабильным и выделяется из реакционной смеси в виде 2-гидрокси-2-[(5-хлор-1,3-бензоксазол-2-ил)амино]-1-бензофуран-3(2Н)-она (7) c выходом 65%.

2. Синтез и строение N2-замещенных гидразидов -оксокарбоновых кислот

2.1. Поиск методов синтеза N2-замещенных гидразидов 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеновых кислот

Нами установлено, что при взаимодействии 5-АФД 1 с этиловым эфиром гидразинэтановой кислоты образуются N2-этоксикарбонилметилгидразиды 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеновых кислот (8) и 3-арил-3,5-дигидрокси-2-этоксикарбонилметил-6-оксо-1,2,3,6-тетрагидропиридазины (9). Реакция протекает при эквимолярном соотношении реагентов при температуре 20-25 С в среде диоксана:

Строение конечных продуктов реакции определяется характером заместителя в арильном фрагменте 5-АФД. Так, при введении электроноакцепторного заместителя  равновесие двух форм сдвигается в сторону большего содержания линейных гидразидов 8а,б, в то время как, их кольчатая форма - пиридазиноны 9в,г выделяются из реакционной смеси с невысоким выходом. При введении электронодонорного заместителя гидразидов цепного строения не получено, а в качестве единственных термодинамически устойчивых соединений выделены пиридазиноны 9а,б.

Ранее двухстадийным методом синтеза был получен небольшой ряд N2-замещенных метиленгидразидов АрПК и изучен их кислотный гидролиз. Однако биологическая активность исходных соединений и продуктов их гидролиза ранее не исследована. Представляло интерес расширить набор вводимых в реакцию с 5-АФД 1 фосфазинов для введения в структуру гидразидов биологически активных синтонов, изучить биологическую активность известных и не описанных ранее соединений, а также исследовать оптимальные условия проведения препаративного метода синтеза. Для этого первоначально реакцией Штаудингера при взаимодействии 5-АФД 1 с фосфазинами, полученными на основе бензоилдиазометана, дифенилдиазоацетона, адамантаноилдиазометана и этоксикарбонилдиазометана, синтезированы  замещенные 2-метиленгидразоно-3-фураноны (10а-и). Их дальнейший кислотный гидролиз проводили при температуре 20-25С в среде водного ацетонитрила при добавлении каталитических количеств 10% кислоты хлороводородной. В случае 3-фуранонов 10а-д реакция завершается образованием соответствующих N2-замещенных метиленгидразидов 11а-д (метод А). Соединения 11 г,д получены впервые. Замена диоксана на ацетонитрил при изучаемом гидролизе привела к значительному увеличению выхода целевых гидразидов.

10: R1=H, R2=C6H5CO, (C6H5)2СНСО, C10H15CO, C2H5CO

11: R1=H, R2=C6H5CO, (C6H5)2СНСО, С10Н15СО

Однако гидролиз 5-арил-2-этоксикарбонилметиленгидразоно-2,3-дигидро-3-фуранонов (10е-и) в аналогичных условиях останавливается на стадии присоединения воды с образованием 3-фуранонов 12а-г. Попытки выделить целевые метиленгидразиды 11 путем изменения условий эксперимента не увенчались успехом, что связано, по-видимому, с сильным электроноакцепторным влиянием этоксикарбонильной группы. В результате получены лишь известные 5-арил-2-гидразоно-2,3-дигидро-3-фураноны (13) и 3-арил-5-гидрокси-1,6-дигидро-6-пиридазиноны (14).

Установлено, что при взаимодействии 5-АФД 1 с фосфазинами, полученными на основе 1-R-3-диазо-2-оксоиндолов, направление реакции не меняется, в результате чего образуются соответствующие фураноны 10 и трифенилфосфиноксид (ТФО). Однако, по-видимому, вследствие их лабильности, в процессе выделения и очистки на первой стадии удается получить уже гидролизованные продукты - 1-R-2-оксо-3-индолинилиденгидразиды 11е-к. Вследствие этого, для оптимизации процесса гидролиза и сокращения времени при получение гидразидов 11е-к по методу А, нами предложен вариант без выделения промежуточных фуранонов 10. Гидразиды 11е-к получены также реакцией 5-АФД 1 с 3-гидразоно-1-R-2-оксоиндолами (метод Б). Двухстадийный метод синтеза В гидразидов 11 служит дополнительным химическим доказательством структуры гидразонов 13 и позволяет выделять азины 10, которые, зачастую, являются лишь интермедиатами в методе А, однако он является более трудоемким.

Важно отметить, что при получении некоторых метиленгидразидов 11 использование соответствующих фосфазинов является единственно возможным препаративным методом синтеза, в виду отсутствия или нестабильности исходных гидразонов.

В литературе описан пример синтеза замещенного метиленгидразида АрПК на основе реакции 5-АФД с поликарбонильным диазосоединением в присутствии трифенилфосфина, позволяющий сочетать в молекуле два биологически активных ароилпирувоильных фрагмента. С целью синтеза таких гидразидов первоначально необходимо было получить исходные вещества реакцией ароилацетилирования диазокарбонильных соединений ароилкетенами (И2), полученными в результате термического декарбонилирования 5-АФД 1. Некоторые ароилдиазометаны и фталимидо--диазокетоны введены в реакцию впервые, в результате чего выделены новые 1,5-дизамещенные 2-диазо-1,3,5-пентантрионы (15и-о,р-у,ч-я):

15: R=OC2H5, C6H5, 4-NO2C6H4, 4-BrC6H4, 4-СН3C6H4, 2-СlC6H4, С10Н15, PhtCH2, PhtCH(СН3), PhtCH(С2Н5), Pht(CH2)2, Pht(CH2)3

Согласно данным спектров ЯМР1Н, в растворах ДМСО-d6, ДМСО-d6/CCl4 (1:3) соединений 15 присутствует как енольная форма Д (характеризуется уширенным сигналом протона енольного гидроксила при 15.32-15.62 м.д. и синглетом винильного протона при 6.91-7.19 м.д.), так и -дикетонная форма Е (имеет синглет протонов метиленовой группы при 4.43-4.62 м.д.). Содержание последней составляет 21%-47% и зависит от характера заместителя R. Наличие двух форм в растворах диазопентантрионов 15 обуславливает особенности их химического поведения и определяет их дальнейшие химические превращения. Выходы соединений 15 и состав продуктов реакции зависят от характера заместителей как в ароматическом кольце ароилкетена, так и при диазокарбонильном фрагменте -диазокетона, и колеблются от 16%-74%. Выявлено, что введение электронодонорных заместителей уменьшает содержание побочного продукта димеризации ароилкетена. Кроме того, при недостаточной нуклеофильности диазосоединений образующиеся производные 15 в условиях реакции ограниченно стабильны и могут претерпевать различные превращения.

16: R=OC2H5, C6H5, 4-NO2C6H4, 4-BrC6H4, 4-NO2C6H4, 4-CH3C6H4, 2-ClC6H4, C10H15, PhtCH(CH3), Pht(CH2)2, Pht(CH2)3

Нами установлено, что при взаимодействии 5-АФД 1с трифенилфосфином и диазопентантрионами 15, вопреки ожидаемым гидразидам АрПК, из реакционной смеси выделяются 3-замещенные 6-арил-4-гидроксипиридазины (16) и ТФО (метод А). Очевидно, процесс внутримолекулярной циклизации промежуточно образующегося фосфазина протекает быстрее, чем его взаимодействие с 5-АФД, что препятствует выделению фуранонов или гидразидов из реакционной смеси. Для наработки на биологические испытания пиридазины 16 были также получены прямым взаимодействием соединений по методу Б.

2.2. Синтез N2-замещенных метиленгидразидов 2-(2-гидроксифенил)-2-оксоэтановой кислоты

Нами впервые разработан двухстадийный метод синтеза N2-замещенных метиленгидразидов 2-(2-гидроксифенил)-2-оксоэтановой кислоты (18) через реакцию Штаудингера и последующий кислотный гидролиз образующихся 3-бензо[b]фуранонов 17 (метод А), позволяющий получать ранее недоступные соединения. Условия проведения реакций аналогичны получению производных АрПК 11. При наличии соответствующих гидразонов синтез гидразидов 18 может быть также одностадийным (метод Б). Также, как и гетериламиды 6, гидразиды 18, согласно спектральным характеристикам, существуют в кристаллическом состоянии и в растворе в форме с ВВС Н-хелатного типа.

17: R1=R2=C6H5; СR1R2=C13H8 (9-флуоренилиден); R1=Н, R2=C6H5СО, C10H15СО; СR1R2=C9H7NO(1-метил-2-оксо-3-индонилиден). 18: R1=H, R2=C6H5CO, C10H15CO; CR1R2=C9H7NO

Механизм образования соединений 17, вероятно, аналогичен механизму взаимодействия фосфоранов с карбонильными соединениями и протекает, как и реакция Виттига, через четырехцентровое переходное состояние (И3). При этом полярность связи Р=N фосфазина в данной реакции играет определяющее значение.

3. Изучение химических свойств производных -оксокарбоновых кислот и их -лактонных форм

3.1. Синтезы на основе производных 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеновых кислот

Ранее было показано, что при синтезе некоторых гетериламидов АрПК 2 на основе 5-АФД, в зависимости от строения гетероцикла и присутствия воды в реакционной смеси, в качестве сопутствующих соединений образуются соли АрПК. С целью получения биологически активных водорастворимых соединений нами изучено прямое взаимодействие АрПК 19 с гетериламинами различного строения, в результате чего выделены 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеноаты гетериламмония (20а-аг). Реакция протекает в безводном хлороформе при эквимолярном соотношении реагентов при температуре 20-25С.

19: Ar=Ph(а), 4-СН3С6Н4(б), 4-СН3ОС6Н4(в), 4-С2Н5ОС6Н4(г), 4-СlС6Н4(д), 4-BrС6Н4(е). 20: Ht=3-C5H4N, 4-C5H4N, C5H3BrN, C3H2NS, C5H5N2 (4-метил-2-пиримидил), C2H1N2S, C3H3N2S, C4H5N2S, С2Н1N2S2, C7H5N2.

Как и у гетериламидов 2, во всех спектрах ЯМР1Н солей 20 присутствует синглет протонов метиленовой группы слабой интенсивности при 4.32-4.54 м.д., что свидетельствует о их существовании в растворе ДМСО-d6 в виде таутомерных форм Ж и З с преобладанием кетоенольной формы Ж (92-96%). Кроме того, подобно N-[2-(5-тиоксо-4,5-дигидро-1,3,4-тиадиазолил)]амиду АрПК 2аг, у бутеноатов 20я,аа в данном случае реализуется кето-енольная прототропная таутомерия тионной формы соединений, образующейся при миграции протона от сульфгидрильной группы к атому азота в положении 4 гетероцикла.

В продолжение изучения реакций АрПК с нуклефилами установлено, что этиловый эфир диазоэтановой кислоты взаимодействует с кислотами 19а-е региоселективно с образованием этоксикарбонилметиловых эфиров 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеновых кислот (21а-е). Реакция медленно протекает в среде спирта этилового при эквимолярном соотношении реагентов, при температуре 20-25С и может быть полностью завершена при кипячении.

Согласно полученным спектральным характеристикам, соединения 21 енолизованы полностью, как АрПК 19 и их метиловые эфиры 3.

Нами исследовано взаимодействие N-[5-(6)-R-2-пиридил]амидов 2 с диазонуклеофилами различного строения. Установлено влияние заместителей гетерильной части этих амидов и степени нуклеофильности диазосоединения на состав и строение конечных продуктов реакции. Так, при введении в 5 положение атома брома исходных амидов в качестве основных продуктов реакции с диазометаном и диазоэтаном при соотношении реагентов 1:4 образуются -О-алкильные производные 24б-ж, а арилдиазометаны и 9-диазофлуорен с ними не взаимодействуют. Введение в 6 положение гетероцикла метильной группы приводит к образованию сложной смеси соединений в реакции с диазометаном, среди которых выделены продукты гетероциклизации (соответствующие 2-оксоимидазо[1.2-а]пиридины 22а,б) и -О-алкилирования (соединение 24а).

22: R1=СН3, R2=R3=H, Ar=Ph (а), 4-CIC6H4 (б); R1=H, R2=R3=Ph, Ar=Ph (в), 4-СН3C6H4 (г), 4-BrC6H4 (д), R1=СН3, Ar=4-СН3C6H4 (е); R1=H, R2=Ph, R3=4-BrC6H4, Ar=Ph (ж), 4-СН3C6H4 (з), R1=СН3, Ar=4-СН3C6H4 (и); R1=H, R2+R3=C12H8, Ar=Ph (л), 4-СН3OC6H4 (м). 24: R1=6-СН3, R2=R3=H, Ar=2,4-(СН3)2C6H3 (а); R1=5-Br, R2=R3=H, Ar=Ph (б), 4-СН3OC6H4 (в), 4-ClC6H4 (г), 4-BrC6H4 (д); R1=5-Br, R2=H, R3=СН3, Ar=Ph (е), 4-СН3OC6H4 (ж). 25: Ar=Ph (а), 4-С2Н5OC6H4 (б)

Кроме того, из реакционной смеси гетериламида 2е с диазометаном, наряду с соединением 22а, был получен N-(6-метил-2-пиридил)амид 3-бензоил-4-гидрокси-4,5-дигидропиразол-4-карбоновой кислоты (23). Образование пиразола 23 происходит в результате реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения диазометана по кратной связи С2=С3 исходного пиридиламида.

При взаимодействии N-(6-метил-2-пиридил)амидов 2 с диазоэтаном основным процессом является 1,3-диполярное циклоприсоединение диазонуклеофила, в результате чего выделены соединения 25а,б, а в случае с диарилдиазометанами - гетероциклизация в соответствующие производные имидазо[1.2-а]пиридинов 22в-и. В реакции амида 2е с дифенилдиазометаном было получено также производное 22к, у которого, в отличие от соединений 22а-и, карбонильная группа бензоильного заместителя енолизована нацело, о чем свидетельствуют его характеристики.

При использовании диазофлуорена в реакции с N-(2-пиридил)амидами 2а,в основным процессом является гетероциклизация в соединения 22л,м, однако для этого требуются более жесткие условия эксперимента.

Образование имидазо[1,2-а]пиридинов 22 начинается, по-видимому, с протонирования диазонуклеофила атомом водорода енольного гидроксила и перегруппировки 2-пиридиламидного фрагмента в пиридоимидный с образованием интермедиата И4. Создание имидазольного цикла сопровождается внедрением диазокарбокатиона по кратной связи С2=С3, элиминированием азота и миграцией атома водорода к атому С3:

Попытка синтеза водорастворимых гидрохлоридов на основе имидазопиридинов 22в,к не удалась, поскольку исходные соединения дециклизуются с образованием соответствующих гидрохлоридов N-[6-R-(2-пиридил)]амидов 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеновых кислот (26а,б).

Установлено, что N-(5-R-2-тиазолил)амиды 2 внутримолекулярно циклизуются в производные имидазо[2,1-b]тиазолов 27,28 только под действием диазометана и диазоэтана. При взаимодействии N-(2-тиазолил)амида 2у с диазоэтаном был также выделен N-(2-тиазолил)амид 4-оксо-4-фенил-2-этокси-2-бутеновой кислоты (29). При проведении реакции N-(2-тиазолил)амида 2ф с диазоэтаном в аналогичных условиях получен продукт 1,3-диполярного циклоприсоединения - N-(2-тиазолил)амид 3-(4-хлорбензоил)-5-метилпиразол-4-карбоновой кислоты (30).

Взаимодействие эквимолярных количеств гетериламида 2у с дифенилдиазометаном при кипячении реакционной смеси приводит к образованию продукта -С-алкилирования исходного амида - соединению 31, что вероятно, можно объяснить [1,3]-сигматропной перегруппировкой первоначально образующихся продуктов С2-О-дифенилметилирования исходного амида в реакционных условиях (110оС), вследствие большей термодинамической устойчивости соединения 31:

27: R1=H, Ar=C6H5 (а), 4-ClC6H4 (б); R1=NO2, Ar=C6H5 (в)

Реакция бензоилметиленгидразидов АрПК 11 с диазометаном региоселективна и приводит к -О-метильным производным 32а,б. Их спектральные характеристики хорошо согласуются с данными аналогичных производных N-гетериламидов 24, 29.

32: Ar=4-СH3C6H4 (а), Ar=4-СlC6H4 (б)

В продолжение исследования реакции Штаудингера, позволяющей вводить в карбонильный субстрат потенциально биологически активные азофрагменты, нами изучены реакции АрПК 19, метилового эфира АрПК 3 и анилидов АрПК 33 с трифенилфосфазинами различного строения. Установлено, что вне зависимости от структуры карбонильного соединения, образуются продукты по -карбонильной группе его дикетоформы - соответственно замещенные 2-метиленгидразино-4-арил-4-оксо-2-бутеновые кислоты (34а-з), анилиды 34о-с и метиловый эфир 34т (метод А). Производные 34и-н получены методом Б - реакцией кислот 19 с моногидразоном бензила. Полученные спектральные характеристики соединений 34 свидетельствуют о существовании их в кристаллическом состоянии и в растворе ДМСО-d6 в енгидразинной форме с ВВС Н-хелатного типа с локализацией атома водорода при атоме азота, т.е. в форме Z-изомера.

3: Х=СН3О, R1=Br (в). 33: Х=NHC6H5, R1=H (а), CH3 (б), Cl (в)

34: Х=ОН, R2=R3=C6H5; R2=H, R3=C6H5СО; R2=C6H5, R3=C6H5СО; Х=NHC6H5, R2=R3=H; R2=Н, R3=C6H5СО; Х=CH3О, R2=R3= C6H5

При проведении реакции кислоты 19а, эфира 3а и анилида 33а с трифенилфосфазином, полученным на основе этоксикарбонилдиазометана, в аналогичных условиях из реакционной смеси удается выделить лишь ТФО и известные производные 3-фенил-5-пиразолкарбоновой кислоты (35а-в).

Нами установлено, что N-гетериламиды АрПК 2 взаимодействуют с гидразонами бензофенона, фенил(4-бромфенил)кетона и 9-флуоренона с образованием соответственно N-гетериламидов 4-арил-2-диарилметиленгидразино- и 4-арил-2-флуоренилиденгидразино-4-оксо-2-бутеновых кислот (36,37):

R=Н, Br. 36: Ht=2-С5Н4N, С6Н6N, 3-С5Н4N, С3Н2NS, С2Н1N2S, С3Н3N2S, С4Н5N2S, С11Н11N2O, С7Н5N2.

37: Ht=2-С5Н4N, 3-С5Н4N, С3Н2NS, С2Н1N2S, С3Н3N2S, С4Н5N2S, С11Н11N2O.

Изучение спектров ЯМР1Н соединений 36 и 37, снятых в ДМСО-d6 и CDCl3, показало наличие Z-кетоенгидразинной (Z-KEГ), Е-кетоенгидразинной (Е-КЕГ) и β-кетогидразонной (β-КГ) форм в растворе этих соединений. Нами установлено, что состав таутомерных форм в растворе определяется, в первую очередь, природой растворителя, а также строением гетероциклического и гидразинного фрагментов. Так, в растворе ДМСО-d6 соединений 36,37 форма Z-КЕГ наблюдается у всех изученных веществ, составляет 32-100% для соединений 36 и 15-80% для соединений 37.

Содержание минорной формы Е-КЕГ в растворе ДМСО-d6 составляет 25-48% для производных 36 и 15-28% для производных 37. Она характеризуется сдвигом сигнала протона NH-группы, вовлеченного во ВВС, в более слабое поле до 8.45-11.22 м.д., а также небольшим сдвигом сигналов протонов NH-N= и ЦСН= групп в сильное поле, где они наблюдаются, соответственно, при 9.55-13.35 и 6.12-6.67 м.д..

Для формы -КГ характерен синглет двух протонов метиленовой группы при 4.42-4.62 м.д. и отсутствие сигнала протона ЦNH-N= группы. При этом её содержание для производных 36 составляет 15-50%, а для производных 37 - 50-100%. В целом, форма Е-КЕГ присутствует в таутомерном равновесии трех форм только в растворе ДМСО-d6, а в растворе CDCl3 - только в равновесии с Z-КЕГ со значительным преобладанием последней. Введение электроноакцепторного заместителя в ароильный фрагмент соединений 36,37 приводит к сдвигу таутомерного равновесия в сторону большего содержания формы Z-КЕГ только в растворах ДМСО-d6.

Нами установлено, что при взаимодействии N-гетериламидов АрПК 2 с этиловым эфиром гидразинэтановой кислоты направление реакции не меняется, но осуществляется дальнейшее замыкание в цикл с образованием N-гетериламидов 5-арил-1-этоксикарбонилметил-1Н-пиразол-3-карбоновых кислот (38).

При изучении спектров ЯМР1Н производных N-[2-(5-R-1,3,4-тиадиазолил)]амидов 38б-з в ДМСО-d6 и СDCl3, нами обнаружена прототропная амино-иминная таутомерия - наличие соответствующих таутомерных форм И и К. Таутомерное равновесие этих форм зависит от природы растворителя, а также от характера заместителя в Ar и Ht. Так, при снятии спектров ЯМР1Н соединений 38г,д в разных растворителях установлено, что при введении заместителя в арильный фрагмент наблюдаются обе формы с преобладанием формы К в ДМСО-d6 и формы И в СDCl3, в то время как отсутствие заместителя способствует их 100% содержанию в соответствующем растворителе. При анализе спектров амидов 38в-з, снятых в ДМСО-d6, выявлено, что соединения 38г,е существуют в форме К (100%), в то время как их замещенные аналоги 38в,д,ж,з существуют в виде равновесных форм К:И (43-62% : 38-57%), количественное содержание которых определяется, в свою очередь, строением гетериламидного фрагмента.

38: Ht=3-С5Н4N, С2Н1N2S, С3Н3N2S, С4Н5N2S

Механизм образования соединений 38, по-видимому, включает первоначальную атаку первичной аминогруппы замещенного гидразина на карбонильную группу С2=О субстрата. Образующийся при этом интермедиат И5 элиминирует воду и циклизуется в производное пиразола И6 за счет внутримолекулярной атаки вторичной аминогруппы гидразина на карбонильную группу С4=О субстрата, а последующее отщепление  молекулы воды приводит к соответствующим соединениям 38.

Реакция N-гетериламидов АрПК 2 с катионами переходных металлов ранее не исследована. Эти соединения могут быть использованы в качестве лигандов, благодаря наличию нескольких потенциально активных комплексообразующих групп -дикарбонильного, амидного и гетероциклического фрагментов. Нами установлено, что амиды 2 взаимодействуют с дихлоридами меди, цинка, кадмия в соотношении 2:1, в мягких условиях в среде спирта этилового с образованием бис[3-арил-1-(N-гетерил)карбоксамидо-1,3-пропандионато] меди (39а-о), цинка (40а-л), кадмия (41а-л):

39: Me=Сu, Ht=2-С5Н4N, С5Н3BrN, 3-С5Н4N, С3Н2NS, С2Н1N2S, С3Н3N2S, С4Н5N2S, С11Н11N2О 40: Ме=Zn, Ht=2-С5Н4N, С5Н3BrN, 3-С5Н4N, С3Н2NS, С2Н1N2S, С3Н3N2S, С7Н5N. 41: Ме=Сd, Ht=2-С5Н4N, 3-С5Н4N, С3Н2NS, С3Н3N2S, С4Н5N2S, С7Н5N2

Полученные результаты атомно-абсорбционного анализа комплексных соединений свидетельствуют о том, что металл в составе комплекса связан  с двумя лигандами, а отрицательная проба Бельштейна показывает также отсутствие атомов хлора. По-видимому, хлор элиминируется из зоны реакции в составе молекулы HСl.

На наш взгляд, для соединений 39-41 наиболее вероятными структурами продуктов реакции являются , М, Н. Кроме того, не исключаются структуры с возможными координационными связями с гетероатомами в цикле.

В пользу структуры свидетельствует наличие полос поглощения NH-групп в ИК-спектрах соединений 39-41, а также наличие сигнала протонов NH-групп в спектрах ЯМР1Н. Кроме того, в ИК-спектрах полоса поглощения С4=О смещена в область низших частот на 10-15 см-1, по сравнению с исходными амидами, что свидетельствует об её участии в образовании более прочной координационной связи.

Для подтверждения структуры хелатов нами выполнены квантово-химические расчеты неэмпирическим методом в базисе G6 31* в приближении АМ1 у соединения 40а для четырех комплексов цинка, ковалентно связанного с двумя лигандами через атомы кислорода О2 енолизованных карбонильных групп и имеющего соответствующие координационные связи (структуры О, П, Р, С). Согласно выполненным расчетам и вычисленным значениям теплот образования комплексов (Нf), наиболее стабильной является форма комплекса П. Таким образом, N-гетериламиды 2 в реакции комплексообразования координируются металлами как бидентатные О-О лиганды и образуют с ними продукты со структурой типа П с делокализованными кратными связями в шестичленных хелатных циклах.

Нами установлено, что направление реакции комплексообразования не меняется при использовании в качестве исходных соединений N2-замещенных метиленгидразидов 11а,в и дихлоридов меди, цинка, кадмия при соотношении реагентов 2:1. Взаимодействие протекает в аналогичных вышеописанным условиях с образованием бис {3-арил-1-[N2-(бензоилметилен)карбоксгидразидо]-1,3-пропандионато}меди, цинка, кадмия (42а-д):

42: Me=Cu, R=CH3 (а), Сl (б); Me=Zn, R=Cl (в); Me=Сd, R=CH3 (г), Сl (д)

Спектральные характеристики соединений 42 согласуются с данными, полученными для хелатов 39-41.

3.2. Синтезы на основе производных 2-(2-гидроксифенил)-2-оксоэтановой кислоты

В продолжение изучения химического поведения гетериламинов в реакциях с -оксокислотами и с целью синтеза БАВ нами исследовано взаимодействие 2-(2-гидроксифенил)-2-оксоэтановой кислоты (4) с 2-, 4-аминопиридинами, 2-аминотиазолом и 2-амино-(5-R-1,3,4-тиадиазолом). Реакция протекает в условиях, аналогичных получению бутеноатов 20, с образованием соответствующих 2-(2-гидроксифенил)-2-оксоэтаноатов гетериламмония (43а-д):

43: Ht=2-С5Н4N (а),4-С5Н4N (б),С3Н2NS (в),С2Н1N2S (г),С3Н3N2S (д)

Реакция кислоты 4 с гидразонами бензофенонов и 9-флуоренона в среде безводного толуола и соотношении реагентов 1:1 или 2:1 приводит к 2-(2-гидроксифенил)-2-[(2-гидроксифенил)карбоксиметилен] гидразоноэтановой кислоте (46) (метод А) и азинам 47 а-в.

47: R1=C6H5, R2=C6H5(а), 4-BrC6H4(б); СR1R2=C13H8(в), C9H7NO (г)

Предполагаемый механизм реакции включает, по-видимому, промежуточное образование азинов (интермедиат И7), которые в процессе реакции взаимодействуют со второй молекулой кислоты 4, давая азин 46.

Взаимодействие кислоты 4 с соответствующими фосфазинами также завершается получением азина 46, симметричных азинов 47а-г и ТФО (метод Б). Соединение 46 при нагревании в уксусном ангидриде циклизуется с высоким выходом в 3-(2,3-дигидро-2-оксо-3-бензо[b]фуранилиден)гидразоно-2,3-дигидро-2-оксобензо[b]-фуран (48).

Нами установлено, что взаимодействие гидразонов бензофенона или 9-флуо-ренона с 2-тиазолиламидом 6г протекает по кетонной карбонильной группе последнего с образованием соответственно N-(2-тиазолил)амидов 2-(2-гидроксифенил)-2-дифенилметилен- и 2-флуоренилиденгидразоноэтановой кислоты (49а,б):

R1=R2=C6H5; CR1R2=C13H8

С целью получения водорастворимых БАВ нами изучена реакция N-гетериламидов о-ГФГК 6а,б,д,ж с натрия карбонатом при эквимолярном соотношении реагентов, в результате чего выделены 2-[2-(N-гетериламино)-2-оксоацетил]феноляты натрия (50а-г). При взаимодействии амидов 6г,е-з с дихлоридами цинка и кадмия при соотношении 2:1 в среде спирта этилового, образуются бис{2-[2-(N-гетериламино)-2-оксоацетил]феноляты} цинка и кадмия (51а-д):

50: Ht=С5Н3BrN, 3-С5Н4N, С2Н1N2S, С4Н5N2S

51: Ме=Zn, Ht=С4Н5N2S; Ме=Сd, Ht=С3Н2NS, С3Н3N2S, С4Н5N2S, С7Н5N2

В спектрах ЯМР1Н полученных соединений отсутствует сигнал протона ОН-группы, что свидетельствует о депротонизации лиганда. Кроме того, в ИК-спектрах соединений 51а-д наблюдается сдвиг полос поглощения группы С2=О и С=С, С=N связей в область низших частот, по сравнению с таковыми исходных амидов 6, вследствие образования более прочной координационной связи, что также согласуется с данными для комплексных соединений 39-41.

3.3. Синтезы на основе N-замещенных 2-метиленгидразоно-2,3-дигидро-3-бензо[b]фуранонов

С целью поиска альтернативных путей синтеза производных N2-замещенных гидразидов -оксокарбоновых кислот и введения в структуру исходных соединений биологически активных фрагментов нами изучены превращения бензо[b]фуранонов 17 с ароилкетеном, ариламинами, о-фенилендиамином (о-ФДА).

Установлено, что при взаимодействии эквимолярных количеств 3-бензо[b]фуранона 17в с п-метоксибензоилкетеном, генерируемым при термолизе 2,2-диметил-6-(4-метоксифенил)-1,3-диоксин-4-она, образуется 3'-бензоил-метиленамино-6'-(4-метоксифенил)-спиро[бензо[b]фуран-2(3Н),2'-[2H][1,3]-оксазин] -3,4'-(3'Н)-дион (52):

Спектральные характеристики спиросоединения 52 доказывают его структуру и свидетельствуют о протекании [4+2] циклоприсоединения ароилкетена по С=N связи исходного фуранона 17в, выступающего в роли диенофила. Продуктов циклоприсоединения по карбонильной группе и СН=N связи боковой цепи не выделено, что свидетельствует о региоселективности протекающего процесса.

Реакция бензо[b]фуранона 17в с анилином в среде четыреххлористого углерода при температуре 20-25С приводит к образованию 2-[(2-оксо-2-фенил-1-фениламино)этил]гидразоно-2,3-дигидро-3-бензо[b]фуранона (53). Однако, при взаимодействии соединения 17в с п-анизидином в аналогичных условиях, вместо ожидаемого продукта, нами был выделен 2-гидразоно-2,3-дигидро-3-бензо[b]фуранон (54) (метод А). Очевидно, при взаимодействии бензофуранона 17в и амина с более высокой нуклеофильностью, чем образующийся гидразон 54, реакция не останавливается на стадии присоединения амина по активированной СН=N связи исходного соединения, а происходит вытеснение гидразона 54 более нуклеофильным реагентом с образованием продуктов переиминирования. Соединение 54 было также получено при взаимодействии фуранона 17в с о-ФДА (метод Б):

Необходимо отметить, что неустойчивость бензофуранового цикла препятствует получению его 2-гидразонопроизводного прямым взаимодействием с гидразинами, поэтому взаимодействие фуранонов 17 с о-ФДА или n-анизидином является удобным в препаративном отношении методом синтеза незамещенного гидразона 54.

Для подтверждения структуры соединения 54 проведена его реакция с фурандионом 1б с образованием N2-(3-оксобензо[b]фуран-2-илиден)гидразида 2-гидрокси-4-(4-метилфенил)-4-оксо-2-бутеновой кислоты (55). Таким образом, путем ароилацетилирования гидразона 54 можно получать различные представители нового типа N2-замещенных метиленгидразидов АрПК, содержащие сохраненный биологически активный бензо[b]фурановый цикл.

4. Биологическая активность синтезированных соединений

Производные -оксокарбоновых кислот и продукты их химических превращений были подвергнуты биологическим испытаниям с целью поиска БАВ с противовоспалительной, анальгетической, жаропонижающей, антигипоксической, гипогликемической, антикоагулянтной,  гемостатической и противомикробной активностью. Также изучена острая токсичность отдельных представителей в синтезированных рядах соединений. Испытания проводились в ГОУ ВПО ПГФА Росздрава на кафедрах: фармакологии, клинической фармакологии под руководством зав. каф., проф. В.Э. Коллы и зав. каф., проф. В.В. Юшкова, микробиологии под руководством зав. каф., доц. А.Н. Плаксиной и зав. каф., проф. Т.Ф. Одеговой, физиологии с основами анатомии под руководством зав. каф., проф. Б.Я. Сыропятова, а также в лаборатории Пермского НПО Биомед и в лаборатории БАВ ЕНИ ПерГУ доц. Махмудовым Р.Р. Автор выражает глубокую благодарность за проведенные исследования.

Результаты биологических испытаний обработаны статистически с определением критерия Стьюдента с помощью статистических программ Windows XP (Excel).

Исследование острой токсичности показало, что изученные соединения в рядах 2, 11-14, 17, 20, 27, 36-43, 51, 53 являются малотоксичными веществами по классификации Сидорова К.К., а производные 6ж, 16а,ф, 18в, 21б, 34е,ж,к,л,с относятся к практически нетоксичным соединениям и имеют значительные преимущества перед известными препаратами сравнения. Обнаружено, что соединения 9а и 20 е являются умеренно токсичными.

4.1. Противовоспалительная активность

Противовоспалительную активность (ПВА) изучали на модели острого воспалительного отека, вызванного субплантарным введением 0,1 мл 1% водного раствора каррагенина белым беспородным крысам обоего пола. О выраженности воспалительной реакции в динамике судили по изменению объема стопы, регистрируемой онкометрически. Исследуемые вещества в дозе 50 мг/кг вводили внутрибрюшинно (в/б) или перорально (п/о) в виде взвеси в 2% крахмальном растворе. Препаратом сравнения служил диклофенак в дозе 10 мг/кг, вводимый аналогично.

  Примечание: по сравнению с контролем  **= р<0,01  *** р<0,001

Рис. 1. Сравнительная характеристика наиболее активных соединений и диклофенака, проявивших противовоспалительную активность при внутрибрюшинном введении.

Проведенные исследования показали, что из 60 соединений, вводимых в/б, ПВА оказали 26 веществ, о чем свидетельствует достоверное торможение воспалительного отека на пике воспаления. Среди них 10 соединений тормозили воспалительную реакцию в такой же мере, что и препарат сравнения, однако его значение не превысили. С учетом данных по токсичности, следует выделить 4 активных соединения (пиридазин 16ф, 2-гидразинопроизводные АрПК 34 е,ж,с) (рис. 1).

Изучение ПВА у соединений, вводимых п/о, показало, что более 50 веществ проявили действие с различной степенью выраженности, из них 24 соединения тормозили воспалительный отек у животных во все сроки наблюдения. Сравнительная характеристика 5 наиболее активных изученных веществ (гетериламида 6ж, гидразида 11а, фуранона 12г, 2-гидразинопроизводного 34л и хелата 51б) представлена на рис. 2. Все они значительно превосходили по действию диклофенак на 1 ч. развития воспаления, а на 3 и 5 ч. опыта они действовали в такой же степени, что и препарат сравнения. Однако, с учетом данных по токсичности, более выигрышную позицию здесь занимают соединения 6ж и 34л.

Рис. 2. Сравнительная характеристика наиболее активных соединений и диклофенака, проявивших противовоспалительную активность при пероральном введении.

На рис. 3 дана сравнительная оценка 19 изученных соединений, проявивших ПВА при п/о введении, но уступающих по действию вышеуказанным соединениям.

В целом, полученные данные позволили определить некоторые закономерности структуры веществ с действием в отдельных рядах. Так, в ряду N-[2-(5-R-1,3,4-тиадиазолил)]амидов 2 при увеличении алкильной цепи в 5 положении гетероцикла значительно уменьшается ПВА, вплоть до ее потери. Существенный вклад в изучаемое действие у гетериламидов 2 вносят электронодонорные заместители в ароильном фрагменте. N-Гетериламиды о-ГФГК 6, по сравнению с N-гетериламидами АрПК 2, проявляют более выраженную активность, и в первый 1 ч. воспаления все исследуемые вещества превышают активность диклофенака. У них отмечается прямая зависимость влияния заместителя в 5 положении 1,3,4-тиадиазолила на ПВА, которая увеличивается при увеличении алкильной цепи у соединений 6д-ж, в отличие от аналогичных производных 2ш-ав. Лидирующую позицию занимает гетериламид 6ж, не уступающий на пике воспаления диклофенаку, но в 20 раз менее токсичный. Таким образом, наряду с гетерилом, у производных 6 фармакофором - носителем ПВА является 2-(2-гидроксифенил)-2-оксоэтановый фрагмент.

Рис. 3. Сравнительная характеристика противоспалительной активности некоторых изученных соединений и диклофенака при пероральном введении.

В ряду N2-замещенных гидразидов АрПК 11 высокую активность проявили бензоилметиленгидразиды 11а,в и адамантаноилгидразид 11д. Введение гетероциклического заместителя в гидразидный фрагмент у соединений 11з-к не привело к увеличению ПВА. В целом, в ряду гидразидов 11, не зависимо от строения гидразидного фрагмента, установлен наибольший вклад в ПВА электронодонорных заместителей. В то же время, в рядах гидразонов 13 и пиридазинонов 14 выраженность действия ПВА возрастает при введении электроноакцепторных заместителей.

Установлено, что пентантрионы 15 ПВА не обладают, а их модификация в пиридазины 16 приводит к различной активности. Наиболее существенное значение для ПВА оказывают электронодонорные заместители в арильном кольце в положении 6 гетероцикла. Выявлено, что кислотный гидролиз бензофуранона 17д до гидразида 18в приводит к увеличению его ПВА, а введение в молекулу гидразида 18г фуранового фрагмента также способствует флоголитическому действию. Невысокую активность показали бутеноаты 20. Однако, ввиду их низкой токсичности и водорастворимости, поиск БАВ в этом ряду является целесообразным.

В ряду замещенных 2-метиленгидразинопроизводных АрПК 34 обнаружены высокоактивные соединения. Установлено, что наибольшее действие проявляют производные АрПК, а замена кислотного фрагмента на ариламидную или сложноэфирную группы снижают его. В этом ряду наибольший вклад в ПВА вносят 1,2-дифенил-2-оксоэтилиденгидразиновый фрагмент и электронодонорный заместитель в арильном радикале. Введение в положение 2 исходных N-гетериламидов АрПК дифенилметиленгидразинового фрагмента приводит, как правило, к увеличению ПВА соединений 36. Меньшее влияние на этот вид активности оказывает введение флуоренилиденгидразинового заместителя у соединений 37. У соединений 38 отмечено повышение ПВА с увеличением алкильной цепи в положении 5 фрагмента 1,3,4-тиадиазола.

При переходе от N-гетериламидов 2 и 6 к их комплексным соединениям 39-41, 51 происходит усиление активности, при этом, в большей степени, влияет характер металла и строение гетероцикла.

Таким образом, обобщая результаты проведенных испытаний на противовоспалительное действие и с учетом данных по токсичности,  наиболее перспективными для дальнейших исследований являются ряды соединений 6, 11, 12, 16, 34.

4.2. Анальгетическая активность

Анальгетическую активность (АА) изучали на белых беспородных мышах на моделях термического (лгорячая пластинка) и химического раздражения (луксусные корчи). Исследуемые вещества в дозе 50 мг/кг вводили в/б или п/о в виде взвеси  в 2% крахмальном растворе. Препараты сравнения - метамизол натрия (50 мг/кг) и диклофенак (10 мг/кг). Для анализа связи АА со строением скринингу были подвергнуты около 100 соединений.

Изучение АА у 35 соединений из трех рядов при в/б введении показало, что 15 веществ обладают анальгетическим действием, достоверно увеличивая порог болевой чувствительности у животных при термическом воздействии (рис. 4). Выявлено, что среди них пиридазины 16д,с и бутеноаты 20ж,ч не уступают по активности метамизолу натрия, но действуют слабее диклофенака.

При изучении АА некоторых производных - оксокарбоновых кислот при п/о введении оказалось, что более 30 соединений достоверно проявили обезболивающее действие на модели термического раздражения (рис.5,6). Анализ степени выраженности эффекта показал, что соединения 11б,д,ж; 12а,в,г; 14б,г; 18г, 20я, 34б,г,е,ж,т; 36б,е,о; 37г, 39л, 41в проявили такой же обезболивающий эффект, что и метамизол натрия, но вместе с тем, они уступали диклофенаку. Производное 27а превышает действие метамизола натрия, но также уступает диклофенаку. Соединения 6ж, 11а, 18в, 27б, 36н, 40в проявили такое же действие, что и диклофенак. Производные 34к и 34л по АА превысили действие диклофенака, при этом лидирующую позицию заняло соединение 34л (рис.5).

  Примечание: * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001;1 Цпо сравнению с контролем;

2- по сравнению с метамизолом натрия;  3 - по сравнению с диклофенаком

Рис. 4. Сравнительная характеристика анальгетической активности некоторых изученных соединений по методике горячая пластинка при внутрибрюшинном введении.

При изучении связи действия со строением в ряду амидов 2 установлено, что, как и в случае с ПВА, у N-[2-(5-R-1,3,4-тиадиазолил)] амидов 2 АА уменьшается с увеличением алкильной цепи в 5 положении гетероцикла. Среди N-гетериламидов о-ГФГК 6 наибольшей активностью также обладает соединение 6ж. В ряду гидразидов АрПК 11 наиболее активны, как и при изучении ПВА, бензоилметиленгидразид 11а и адамантаноилгидразид 11д (рис. 5, 6). В ряду фуранонов 12 лидирует соединение 12г, содержащее электроноакцепторный заместитель. В ряду пиридазинонов 14 введение электронодонорных заместителей незначительно увеличивают действие веществ. Среди пиридазинов 16 наибольшая АА отмечается у соединения 16с, содержащего в ароматическом кольце в положении 6 гетероцикла атом брома, а также у 16д, не имеющего заместителя. В ряду бутеноатов 20 наибольшую активность на уровне митамизола натрия проявили соединения с 3-, 4-пиридильным и 5-меркапто-1,3,4-тиадиазолильным заместителем.

Рис. 5. Сравнительная характеристика анальгетической активности некоторых изученных соединений  и диклофенака по методике горячая пластинка при пероральном введении.

Выявлено, что имидазо[2,1-b]тиазолы 27а,б проявляют выраженную АА, однако более активно производное 27б с электроноакцепторным заместителем. В ряду производных АрПК 34 соединение 34л значительно активнее диклофенака, но при этом оно в 20 раз менее токсично, чем препарат сравнения и также обладает высокой ПВА. Введение во второе положение исходных амидов 2 дифенилметиленгидразинового фрагмента, а также наличие электронодонорных заместителей в арильном радикале приводит к увеличению АА. Среди комплексных соединений 39-41 наиболее активен цинковый хелат 40в (рис. 5, 6).

Исследование АА на модели луксусные корчи показало, что из 7 изученных веществ производные 9а, 13в, 14а и 14г тормозили их развитие на уровне метамизола натрия, о чем свидетельствуют достоверные отличия в количестве корчей опытных и контрольных мышей. Установлено, что введение электронодонорных заместителей в структуру производных 13, 14 увеличивает их активность.

  Примечание: 1 - по сравнению с контролем

Рис. 6. Сравнительная характеристика анальгетической активности некоторых изученных соединений  и метамизола натрия по методике горячая пластинка при пероральном введении.

Таким образом, поиск БАВ с анальгетическим действием целесообразно продолжить в рядах соединений 6, 11, 18, 27, 34, 36, 40, а соединения 6ж и 34л требуют дальнейшего изучения, поскольку они обладают также и высокой ПВА.

3. Жаропонижающая активность

Жаропонижающее действие было изучено у соединений 6ж, 34к,л, показавших высокую ПВА и АА, а также бутеноатов 20ю,аг. Лихорадочную реакцию у белых беспородных крыс вызывали внутривенным введением пирогенала. Изменение температуры тела животных регистрировали ректально. Активность веществ оценивали по уменьшению гипотермии через 1 и 2 ч. после введения пирогенала. Изучаемые  соединения в дозе 50 мг/кг вводили п/о в виде взвеси в 2% крахмальном растворе. Препарат сравнения - диклофенак в дозе 10 мг/кг.

Выявлено, что производные 20ю и 34к не проявили достоверного эффекта в исследуемой дозе. Соединения 6ж, 20аг и 34л во все сроки наблюдения оказали жаропонижающую активность, при этом гетериламид 6ж тормозил лихорадочную реакцию у животных  на уровне диклофенака.

В целом, проведенные исследования показали, что соединения 6ж и 34л по выраженности и направленности эффектов относятся к потенциальным НПВС, при этом они превосходят препараты сравнения (табл. 1).

Таблица 1

Сравнительная характеристика наиболее перспективных соединений 6ж и 34л

Соеди-нение	Д50, в/б	Доза от ЛД50	Противово-спалительная активность	Анальгетическая активность	Жаропонижающая активность
					1ч	2ч
6ж	1500	0,03	52,43,8***1	25,01,7***1*2	1,7***1	1,7***1
34л	1500	0,03	52,02,5***1   **2	37,51,4***1   ***2***3	0,7***1	0,9***1
дикло-фенак	74	0,14	56,07,3***1	24,70,4***1	1,7***1	2,0***1
мета- мизол натрия	350	0,14		19,40,8***1

Примечание: = p < 0,05, ** = p< 0,01, *** = p < 0,001

1 по сравнению с контролем; 2 Цпо сравнению метамизолом натрия; 3 - по сравнению с диклофенаком.

4.4. Антигипоксическая активность

Антигипоксическую активность бутеноатов 20 и гидразона 13г изучали на белых беспородных мышах на модели гипоксии с гиперкапнией. Животных поодиночке помещали в герметически закрытый сосуд (емкостью 350 мл, без поглощения СО2). Об устойчивости животных к гипоксии судили по увеличению продолжительности жизни животных, по сравнению с контролем. Исследуемые соединения вводили в дозе 50 мг/кг в/б в виде суспензии в 2% крахмальном растворе.

Установлено, что в ряду солей 20 выраженную активность проявляют вещества, содержащие атом галогена в ароилпирувоильном фрагменте, за исключением соединения 20л. Введение электронодонорных заместителей резко снижает антигипоксический эффект. Выявлено, что гидразон 13г не активен. Наибольшей активностью обладает соединение 20к, увеличившее время жизни животных на 77%.

4.5. Гипогликемическая активность

Гипогликемическую активность изучали на модели аллоксанового диабета в опытах на белых беспородных крысах. Экспериментальную гипергликемию моделировали подкожным введением аллоксана в дозе 170 мг/кг. Соединения вводили п/о в дозе 50 мг/ кг в виде взвеси в 2% крахмальном растворе. Концентрацию глюкозы в крови животных определяли глюкозооксидазным методом до введения соединений, а также через 30 и 120 мин. после него. Препарат сравнения - метформин (50 мг/кг). Из 40 изученных соединений 32 проявили активность в различной степени.

В ряду N-гетериламидов АрПК 2 установлено, что при увеличении алкильной цепи в 5 положении 1,3,4-тиадиазола их активность снижается. Введение заместителя в арильный радикал приводит также к уменьшению действия. Наибольшей активностью обладает гетериламид 2э, не уступающий метформину через 30 мин. после введения.

Выявлено, что перспективной группой соединений являются бутеноаты 20, сочетающие два фармакофорных фрагмента. Все изученные вещества обладают выраженным действием, а соединение 20ч показало наибольшие результаты во все сроки наблюдения. В ряду гидразонопроизводных 36, 37 прослеживается зависимость наибольшего влияния на активность флуоренилиденгидразонового фрагмента. Гипогликемическое действие комплексных соединений 39-41 зависит, в первую очередь, от характера металла и строения гетероциклического фрагмента. Как показали исследования, лидируют по изучаемой активности цинковые комплексы, среди них наиболее активен хелат 40в, имеющий в молекуле 2-(5-бромпиридил).

В таблице 2 приведены сводные данные по наиболее активным изученным соединениям. Для дальнейших углубленных исследований в качестве потенциальных гипогликемических веществ предлагаются бутеноат 20ч и цинковый хелат 40в. Помимо высокой активности и низкой токсичности, достоинством соединения 20ч является его водорастворимость, а соединение 40в обладает также высокой АА и имеет в структуре микроэлемент цинк, как известно, участвующий в функционировании различных ферментов и гормонов, в том числе инсулина поджелудочной железы.

Таблица 2

Потенциальные гипогликемические вещества

Соединениеаа а	Острая токсичность (ЛД50а, мг/кг) а	Доза отаЛД50а
			% торможения гипергликемии
			30 мин	120 мин
20ч	>1500	0,03	54,3***1	63,8***1
20аб	>1500	0,03	39,8***1	63,9***1
40в	>1500	0,03	67,6***1 ***2	70,6***1 ***2
40г	>1500	0,03	55,4***1	63,5***1
41а	2000	0,025	67,0***1 ***2	71,4***1 ***2
41з	3100	0,016	49,4***1	54,4***1
метформин	1266	0,04	43,7***1	54,5***1

Примечание: *** = p < 0,001; 1 по сравнению с контролем; 2 - по сравнению с метформином.

4.6. Антикоагулянтная и гемостатическая активность

Исследования проводили с помощью коагулометра Минилаб 701 с использованием цитратной (3.8 %) крови собаки (9:1). Соединения вводили в концентрации 1 мг/мл. Препараты сравнения - этамзилат (1мг/мл) и раствор гепарина в концентрации 1 ЕД/мл крови. Испытания показали, что изученные водорастворимые соли 20,а43 и натриевые феноляты 50 не оказывают существенного влияния на свертывание крови.

4.7. Противомикробная активность

Противомикробную активность (ПМА) более 250 соединений по отношению к тест-культурам микроорганизмов (м/о) St. aureus АТСС 6538-Р и E. coli АТСС 25922 определяли методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде.

Таблица 3

Противомикробная активность некоторых комплексных соединений по отношению к фармакопейным штаммам микроорганизмов

Соединение	МИК, мкг/мл	Соединение	МИК, мкг/мл
	St. aureus / Е.coli		St. aureus / Е.coli
40а	31,0/3,9	40б	31,0/62,0
41а	2,0/2,0	41б	250/31,0
41в	15,6/62,0	41д	2,0/3,9
41е	1,0/1,0	51а	125/62,0
51в	2,0/3,9	51г	2,0/3,9
51д	2,0/3,9	ZnCl2 CdCl2	250/250 125/125
Хлоргексидин	125/125	Диоксидин	62,0/62,0

Для всех исследуемых соединений определяли минимальные ингибирующие концентрации (МИК) в мкг/мл. Препаратами сравнения служили хлоргексидин и диоксидин. Результаты наиболее активных веществ представлены в таблице 3.

Кроме того, у 7 высокоактивных хелатов определено их действие по отношению к 6 тест-культурам Всероссийского музея патогенных м/о (табл. 4). Эти соединения были  также испытаны на клинических штаммах м/о (табл. 5).

Противотрепонемная активность некоторых N-гетериламидов 2, пиридазинов 16, бутеноатов 20 изучена на взвеси трепонем (патогенном штамме Никольс) по стандартной методике. Выявлено, что выраженной активностью здесь обладают гетериламид 2л и бутеноаты 20 з,л, содержащие в своей структуре атом брома.

Установлено, что большинство изученных соединений показали активность на уровне хлоргексидина или ему уступали по отношению к стандартным тест-культурам м/о. Высокоактивных производных -оксокарбоновых кислот, за исключением хелатов 40, 41, 51, нами не обнаружено. Химическая модификация N-гетериламидов АрПК 2 и о-ГФГК 6 до комплексных соединений приводит к значительному увеличению ПМА, зависящую, в первую очередь, от природы металла и характера гетероцикла (табл. 3). Медные хелаты 39 активны на уровне хлоргексидина. При переходе к цинковым производным 40 получены высокоактивное соединение 40а и среднеактивное 40б, при этом, в структуре хелатов 40 наибольший вклад в ПМА вносит 2-пиридильный заместитель. Прослеживается лидирующая роль кадмия на силу ПМА, по сравнению с медью и цинком в хелатах, что согласуется с данными по активности соответствующих хлоридов металлов. Однако следует отметить значительный рост активности при переходе от хлорида кадмия к хелатам 41 лишь при введении в структуру 2-тиазолила, 2-пиридила и, в меньшей степени, 3-пиридила. При изучении металлокомплексов 51 обнаружено, что наибольшую ПМА проявили кадмиевые хелаты 51б-г, не зависящую от строения гетероцикла и значительно превышающую диоксидин. Таблица 4

Противомикробная активность комплексных соединений по отношению

к музейным штаммам микроорганизмов

№	Штамм м/о	МИК соединения, мкг/мл
		40а	41а	41д	41е	51в	51г	51д
1	St. epidermidis АТСС 14990	62	15.6	15.6	7.8	7.8	7.8	7.8
2	P. aeruginosa АТСС 9027	500	125	250	125	125	62	125
3	C. albicans АТСС 885-653	62	15.6	15.6	7.8	62	62	62
4	B. subtilis АТСС 6633	62	7.8	7.8	3.9	3.9	3.9	3.9
5	B. cereus АТСС 8035	62	7.8	15.6	3.9	3.9	3.9	3.9
6	B. anthracis АТСС 010021	62	15.6	62	3.9	7.8	7.8	7.8

При испытании 7 активных хелатов по отношению к музейным штаммам м/о выявлено, что они обладают широким спектром ПМА, в том числе, противогрибковым действием. Несомненный интерес представляют также данные о высокой активности хелатов в отношении спорообразующих палочек рода Bacillus, т.к. неорганические соли металлов не обладают спороцидным действием.

Таблица 5

Противомикробная активность комплексных соединений по отношению к

клиническим штаммам микроорганизмов

№	Штамм м/о	МИК соединения, мкг/мл
		40а	41а	41д	41е	51в	51г	51д	1% р-р Хлоргек-сидина
1	St. aureus MRSA	1000	62	62	31	62	62	62	125
2	St. aureus MSSA	500	31	31	15.6	31	31	62	-
3	St. haemolyticus MRSH	1000	62	31	31	31	62	62	250
4	St. haemolyticus MSSH	500	15.6	31	31	15.6	31	31	-
5	St. maltophilia VS	500	15.6	15.6	7.8	15.6	15.6	31	>1000
6	St. maltophilia VR	500	15.6	15.6	7.8	15.6	15.6	15.6	-
7	St. penicillinasa	1000	31	31	15.6	15.6	15.6	62	1000
8	St. epidermidis MS	1000	31	15.6	15.6	31	31	62	125
9	P. aeruginosa	1000	1000	500	500	1000	125	1000	1000
10	K. pneumonia	125	62	62	31	62	31	62	>1000
11	K.ozaena	125	31	31	31	62	31	62	>1000
12	P. mirabilis ER	1000	500	500	125	31	31	31	1000

Изучение их ПМА по отношению к некоторым клиническим штаммам м/о показало, что они по силе действия значительно превосходят хлоргексидин, кроме цинкового хелата 40а. При сопоставлении данных по активности, представленных в табл. 3-5, установлено, что наиболее активным веществом является соединение 41е.

В целом, проведенный фармакологический скрининг синтезированных соединений позволяет считать перспективным синтез и поиск БАВ среди производных -оксокарбоновых кислот и продуктов их химических превращений.

Выводы

1. В результате проведенных исследований разработаны препаративные методы синтеза более 40 типов новых соединений, установлены основные закономерности структура-биологическая активность, создана теоретическая и экспериментальная основа получения высокоэффективных, малотоксичных БАВ в ряду производных -оксокарбоновых кислот и продуктов их химических превращений.
2. Реакцией дециклизации КД и 5-АФД под действием N-гетериламинов, гидразинов, гидразонов получены соответствующие N-гетериламиды и N2-замещенные гидразиды, содержащие фармакофорные группировки. Показано наличие тион-тиольной и амино-иминной прототропной таутомерии у производных, содержащих 5-R-1,3,4-тиадиазол. Впервые разработан двухстадийный метод синтеза N2-замещенных гидразидов о-ГФГК через реакцию Штаудингера и последующий кислотный гидролиз, позволяющий получать ранее недоступные соединения.
3. Ароилацетилированием фталимидо--диазокетонов и ароилдиазометанов ароилкетенами получены 1,5-дизамещенные 2-диазо-1,3,5-пентантрионы. Показано, что выходы и состав продуктов зависят от характера заместителя в ароилкетене и нуклеофильности атома углерода при диазогруппе. Установлено, что диазопентантрионы существуют в растворах в енольной и -дикетонной формах, что, в  свою очередь, обуславливает особенности их химического поведения в реакциях внутримолекулярной циклизации.
4. Впервые установлено влияние заместителей в гетерильной части N-[5(6)-R-2-пиридил]амидов и N-(5-R-2-тиазолил)амидов АрПК, а также степени нуклеофильности диазосоединения на состав и строение конечных продуктов реакции. В реакциях N-[5(6)-R-2-пиридил]амидов АрПК с диазометаном, диазоэтаном, арилдиазометанами и 9-диазофлуореном могут быть получены -О-алкильные производные,  продукты 1,3-диполярного циклоприсоединения диазонуклеофила по кратной связи С2=С3 амида и производные имидазо[1,2-a]пиридинов. Гетероциклизация N-(5-R-2-тиазолил)амидов АрПК в производные имидазо[2,1-b]тиазолов осуществляется только под действием диазометана и диазоэтана, а с дифенилдиазометаном образуются продукты -С-алкилирования. Взаимодействие бензоилметиленгидразидов АрПК с диазометаном региоселективно и приводит к -О-метильным производным.
5. Установлено, что АрПК, их эфиры и амиды взаимодействуют с трифенилфосфазинами и гидразонами кетонов по карбонильной группе в положении 2 с образованием соответствующих 2-метиленгидразинопроизводных, существующих в растворах в трех таутомерных формах. В то же время, в реакции N-гетериламидов АрПК с этиловым эфиром гидразинэтановой кислоты осуществляется замыкание цикла с образованием амидов 5-арил-1-этоксикарбонил-1Н-пиразол-3-карбоновых кислот.
6. Предложены способы синтеза водорастворимых БАВ с повышенной биологической доступностью на основе реакции -оксокарбоновых кислот с гетероциклическими аминами, а также взаимодействия N-гетериламидов о-ГФГК с натрия карбонатом.
7. Впервые разработан препаративный метод синтеза комплексных соединений на основе N-гетериламидов и N2-замещенных гидразидов -оксокарбоновых кислот с дихлоридами меди, цинка, кадмия и подтверждено, в том числе, квантово-химическими расчетами, что исходные реагенты координируются металлами как бидентатные О-О лиганды.
8. Проведен широкий фармакологический скрининг более 250 синтезированных соединений. Наиболее важными являются результаты по противовоспалительной, анальгетической, жаропонижающей, противомикробной и гипогликемической активности, позволившие выявить связь действия веществ с их строением и определить фармакофорные фрагменты молекул.
9. Для проведения доклинических исследований предложены высокоэффективные и малотоксичные соединения: N-[2-(5-этил-1,3,4-тиадиазолил)]амид 2-(2-гидроксифенил)-2-оксоэтановой кислоты и 2-(1,2-дифенил-2-оксоэтилиденгидразино)-4-(4-метоксифенил)-4-оксо-2-бутеновая кислота, обладающие противовоспалительным, анальгетическим и жаропонижающим действием, а также 2-гидрокси-4-оксо-4-фенил-2-бутеноат 5-метил-1,3,4-тиадиазолиламмония и бис{3-(4-хлорфенил)-1-[N-(5-бром-2-пиридил)]карбоксамидо-1,3-пропандионато}цинк, проявляющие гипогликемическую активность.

Основное содержание диссертации представлено в работах:

1. Патент 2342364 РФ. Бис{3-фенил-1-[N-(3-пиридил)карбоксамидо]-1,3-пропандионато}кадмий, обладающий противовоспалительной активностью /Н.А. Пулина, В.В. Юшков, П.А. Мокин, В.В. Залесов, К.В. Яценко (РФ).- №2007128301; заявл. 23.07.2007; опубл. 27.12.2008, Бюл. №36.
2. Положительное решение о выдаче патента по заявке №2006144008/04(048056) РФ. МПК С07 С 59/84, А 61Р 29/00. 2-(1,2-Дифенил-2-оксоэтилиденгидразино)-4-(4-метоксифенил)-4-оксобут-2-еновая кислота, обладающая противовоспалительной и анальгетической активностью / Н.А. Пулина, В.В. Залесов, О.А.аБыстрицкая, В.В. Юшков, К.В. Яценко (РФ). - заявлено 11.12.2006.
3. Пулина, Н.А. Присоединение ароилкетенов по С=N несимметричных азинов / Н.А. Пулина, В.В. Залесов, Е.А. Глебова // Химия гетероцикл. соединений.Ц 2002.Ц №10. - С. 1460-1461.
4. 4-Арил-2,4-диоксобутановые кислоты и их производные в реакциях с диазоалканами / В.В.Залесов, С.С.Катаев, Н.А.Пулина [и др.] // Журн. орган. химии. - 2002. - Т. 38, вып. 6. - С. 883-887.
5. Кутковая, Н.А. Химия диазополикарбонильных соединений IX. Синтез 6-арил-3-ацил-4-гидроксипиридазинов гетероциклизацией 1,5-дизамещенных 2-диазо-1,3,5-пентантрионов / Н.В. Кутковая, Н.А. Пулина, В.В. Залесов // Журн. орган. хим. - 2004. - Т. 40, вып. 7. - С.а1078-1080.
6. Пулина, Н.А. Поиск биологически активных соединений среди производных -оксокарбоновых кислот / Н.А. Пулина // Бюллетень Сибирской медицины. - 2006. - Т. 5, прил. 2. - С. 125-127.
7. Пулина, Н.А. Синтез и свойства замещенных 2-метиленгидразоно-2,3-дигидро-3-бензо[b]фуранонов / Н.А. Пулина, В.В. Залесов // Химия гетероциклических соединений. - 2007. - №6. - С. 817-822.
8. Пулина,аН.А. Синтез 3-(2,3-дигидро-2-оксо-3-бензо[b])фуранилиден)гидразоно-2,3-дигидро-2-оксобензо[b]фурана / Н.А. Пулина, В.В. Залесов, С.С. Катаев // Журн. орган. хим.- 2007.- Т.43, вып. 6. - С. 863-865.
9. Пулина, Н.А. Взаимодействие гетериламидов 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеновых кислот с хлоридами двухвалентных металлов / Н.А.аПулина, В.В. Залесов, П.А. Мокин // Баш. хим. журн. - 2007. Ц  Т.а14, №3. - С. 52-56.
10. Поиск биологически активных соединений среди производных о-гидроксифенилглиоксалевой кислоты / Н.А. Пулина, В.В. Юшков, В.В.аЗалесов [и др.] // Фармация. - 2007. - №5. - С. 35-38.
11. Поиск биологически активных соединений в ряду N-гетериламидов замещенных 2-метиленгидразино-4-арил-4-оксо-2-бутеновых кислот / Н.А. Пулина, Ф.В. Собин, П.А. Мокин [и др.] // Вестник Российского университета дружбы народов. Сер. Медицина. - 2007. - №6. - С. 293-297.
12. Синтез и биологическая активность солей гетероциклических аминов и гетериламидов на основе 4-арил-2,4-диоксобутановых кислот / Н.А.аПулина, В.В. Залесов, В.В. Юшков [и др.] // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2008. - №2. - С. 37-40.
13. Гаврилова, Н.Е. N-(2-пиридил)амиды 4-арил-2-гидрокси-4-оксобут-2-еновых кислот в реакциях с диазосоединениями / Н.Е. Гаврилова, В.В.аЗалесов, Н.А. Пулина // Журн. орган. хим. - 2008. - Т. 44, вып. 5. Ц  С.а718-723.
14. Синтез и антимикробная активность комплексных соединений на основе N-гетериламидов 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеновых кислот / Н.А. Пулина, П.А. Мокин, В.В. Юшков и [и др.] // Хим.-фарм. журн. - 2008. - Т.42. - №7. - С. 14-16.
15. Синтез и химические свойства 2,3-дигидробензо[b]фуран-2,3-дионов / В.В. Залесов, Н.А. Пулина // Пятичленные гетероциклы с вицинальными диоксогруппами / Д.Д. Некрасов, А.Н. Масливец, Н.Ю.аЛисовенко [и др.]. - Пермь: Изд-во ПГУ, 2004. - Гл. 3. - С. 71-89.
16. Пулина, Н.А. Синтезы биологически активных соединений на основе 2,3-дигидро-2,3-бензофурандиона / Н.А. Пулина, В.В. Залесов, Ю.С.аАндрейчиков // Науки - здравоохранению: сб. науч. тр. Баш. мед. ин-та. - Уфа: БашМИ, 1992. - С. 38-42.
17. Пулина, Н.А. Синтез биологически активных соединений на основе замещенных метиленгидразонов 2,3-дигидро-2,3-бензофурандиона / Н.А. Пулина // Человек и лекарство: тез. докл. II Росс. нац. конгресса. Ц  М., 1995. - С. 19.
18. Синтез и химические свойства азинов, содержащих адамантан / С.С.аКатаев, Н.А. Пулина, Д.В. Маслов [и др.] // Перспективы развития химии и практического применения каркасных соединений: тез. докл. VII науч.-техн. конф. стран СНГ. - Волгоград: ВТУ, 1995. - С. 17.
19. Пулина, Н.А. Синтезы на основе взаимодействия о-гидроксифенилглиоксалевой кислоты и трифенилфосфазинов / Н.А.аПулина, С.И. Матросова, В.В. Залесов // Актуальные вопросы фармации: тез докл. межвуз. науч. конф. - Пермь, 1995. - С. 28.
20. Трифенилфосфазины в реакциях с -оксокислотами и их производными / Е.А. Глебова, Н.А. Пулина, В.В. Залесов [и др.] // Молодежная научная школа по органической химии: тез. докл. науч. конф. - Екатеринбург, 2000. - С. 199.
21. Пулина, Н.А. Синтез и биологическая активность 3,4,6-тризамещенных пиридазинов / Н.А. Пулина, В.В. Залесов, Н.В.аКовыляева // Азотистые гетероциклы и алкалоиды . - М.: Иридиум-пресс, 2001. - Т. 2. - С. 243.
22. Pulina, N.A. Synthesis and biological activity of 3,4,6-subtituted pyridazines /N.A. Pulina, V.V. Zalesov, N.V. Kovylyaeva // Nitrogen-Containing Heterocycles and Alkaloids. - Moscow, Iridium-Press, 2001. Ц  Vol. 2. - P. 231.
23. Синтез биологически активных соединений на основе превращений о-гидроксифенилглиоксалевой кислоты / А.Е. Рубцов, Н.В. Ковыляева, Н.А. Пулина [и др.] // Перспективы развития естественных наук в высшей школе: сб. тр. Междунар. науч. конф. - Пермь, 2001. - С. 213.
24. Пулина, Н.А. Синтез азотсодержащих биологически активных гетероциклов на основе превращений 2-диазо-1,3,5-пентантрионов / Н.А. Пулина, Н.В. Ковыляева, Р.Р. Махмудов [и др.] // Перспективы развития естественных наук в высшей школе: тр. междунар. науч. конф. - Пермь, ЕНИ при ПГУ, 2001. - Ч.1. - С. 176-178.
25. Пулина,аН.А. Синтез 3-(2,3-дигидро-2-оксо-3-бензо[b])фуранилиден)гидразоно-2,3-дигидро-2-оксобензо[b]фурана / Пулина, В.В. Залесов // Перспективы развития химии и практического применения ациклических соединений: тез. докл. Междунар.научн. техн. конф. - Самара, 2004. - С. 212.
26. Пулина, Н.А. Синтез и свойства замещенных 2-метиленгидразоно-2,3-дигидро-3-бензо[b]фуранонов / Н.А. Пулина, В.В. Залесов // Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов: сб. науч. трудов X Всеросс. науч. конф. - Саратов: СГУ, 2004. - С. 233-235.
27. Пулина, Н.А. Синтез биологически активных соединений на основе превращений замещенных 2-метиленгидразоно-2,3-дигидро-3-бензо[b]фуранонов с нуклеофильными реагентами  / Н.А. Пулина, В.В.аЗалесов // Всеросс. съезд фармацевтических работников: тез. докл. - Сочи, 2005. - С. 128-129.
28. Синтез биологически активных соединений на основе взаимодействия о-гидроксифенилглиоксалевой кислоты с гетериламинами / Н.А.аПулина, П.А. Мокин, А.Е. Рубцов [и др.] // Фармация и здоровье: материалы междунар. науч.-практ. конф. - Пермь, 2005. - С. 81-82.
29. Синтез биологически активных соединений на основе взаимодействия гетериламидов ароилпировиноградных кислот с гидразонами бензофенона и 9-флуоренона / Н.А. Пулина, П.А. Мокин, В.В. Залесов [и др.] // Приоритеты фармацевтической науки и практики: материалы заочн. междунар. конф. - М.: Изд-во РУДН, 2006. - С. 268-270.
30. Синтез биологически активных производных пиразол-3-карбоновой кислоты на основе эфиров и амидов ароилпировиноградных кислот / Н.А. Пулина, В.В. Залесов, П.А. Мокин [и др.] // Здоровье и образование в XXI веке: материалы VI междунар. науч.-практ. конф. - М: Изд-во РУДН, 2005. - С. 415.
31. Синтез биологически активных металлоорганических соединений на основе производных ароилпировиноградных кислот / Н.А. Пулина, В.В. Залесов, П.А. Мокин [и др.] // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пятигор. гос. фарм. акад. - Пятигорск, 2006. - Вып. 61. - С. 282-284.
32. Взаимодействие этилового эфира гидразинэтановой кислоты с 5-арил-2,3-дигидрофуран-2,3-дионами / Н.А. Пулина, В.В. Залесов, Н.В.аКутковая [и др.] // Техническая химия. Достижения и перспективы: сб. науч. тр. Всеросс. конф. - Пермь, 2006. - С. 173-174.
33. Синтез, противовоспалительная, анальгетическая и противомикробная активность замещенных 4-арил-2-метиленгидразино-4-оксобут-2-еновых кислот и их производных / Н.А. Пулина, В.В. Залесов, О.А.аБыстрицкая [и др.] // Техническая химия. Достижения и перспективы: сб. науч. тр. Всеросс. конф. - Пермь, 2006. - С. 189-192.
34. Синтез и поиск биологически активных водорастворимых веществ в ряду производных гетериламидов -оксокислот / Н.А. Пулина, П.А.аМокин., Ф.В. Собин [и др.] // Мед. вестн. Башкортостана. - 2006. Ц  Т.а4, №1. - С.200-202.
35. Pulina, N.A. Synthesis, antiinflammatory and antibacterial activity of a series of novel metal-organic complexes / N.A. Pulina, Р.А. Мокin, К.V.аYасеnkо // 2-nd Russian-Chinese international scientific conference оn pharmacology: Fundamental pharmacology and pharmacy - clinical practice. - Perm, 2006. - Р. 134.
36. Изучение синтеза и фармакологической активности производных гетериламидов о-гидроксифенилглиоксалевой кислоты / Н.А. Пулина, П.А. Мокин, В.В. Залесов [иадр.] // Здоровье образование в XXI веке: материалы VII междунар. науч.-практ. конф. - М: Изд-во Рос. ун-т дружбы народов. - 2006. - С. 408-409.
37. Пулина, Н.А. Биологически активные соединения на основе взаимодействия о-гидроксифенилглиоксалевой кислоты с гетериламинами / Н.А. Пулина, П.А. Мокин // Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация): материалы науч.-практ. конф. - Ростов-н/Д, 2006. - С.а39-40.
38. Биологическая активность гетериламидов ароилпировиноградных кислот и их солей / К.В. Яценко, В.В. Юшков, Н.А. Пулина [и др.] // Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация): материалы науч.-практ. конф. - Ростов-н/Д, 2006. - С. 60-61.
39. Поиск биологически активных солей гетероциклических аминов и гетериламидов на основе 4-арил-2,4-диоксобутановых кислот / Н.А.аПулина, П.А. Мокин, В.В. Залесов [и др.]: ПятГФА // Разработка, исследование и маркетинг новой фарм. продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2007. - вып. 62. - С. 533-534.
40. Изучение антимикробной активности комплексных соединений на основе гетериламидов 4-арил-2,4-диоксобутановых кислот / Н.А.аПулина, В.В. Залесов, П.А. Мокин [и др.] // Человек и лекарство: тез. докл. XIV Рос. нац. конгр.: М., 2007. - С.а868.
41. Гетериламиды 4-арил-2,4-диоксобутановых кислот в синтезе новых биологически активных веществ / Н.А. Пулина, П.А. Мокин, В.В.аЗалесов [и др.] // Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных соединений: материалы 3-й Всеросс. науч.-метод. конф. Ц  Воронеж, 2007. - С. 294-296.
42. Гетериламиды -оксокислот в синтезе биологически активных соединений / Н.А. Пулина, В.В. Залесов, В.В. Юшков [и др.] // Вестник Перм. гос. фарм. акад. - Пермь, 2007. - №2. - С. 89-92.
43. Пулина, Н.А. Синтез, строение и биологическая активность N-гетериламидов 5-арил-1-этоксикарбонилметил-1Н-пиразол-3-карбоновых кислот / Н.А. Пулина, П.А. Мокин, Ф.В. Собин // Альманах современной науки и образования. - Тамбов: Грамота, 2007. - №6: Медицина, химия, биология. - С. 116-119.
44. Синтез и биологическая активность гетериламидов 5-арил-1-этоксикарбонилметил-1Н-пиразол-3-карбоновых кислот / Н.А. Пулина, П.А. Мокин, Ф.В. Собин [и др.] // Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств: материалы Росс. науч.-практ. конф., посв. 70-летию ПГФА. - Пермь, 2007. - С. 94-97.
45. Изучение связи строениеЦпротивомикробная активность новых металлорганических соединений / М.В. Томилов, Т.Ф. Одегова, Н.А.аПулина [и др.] // Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств: материалы Росс. науч.-практ. конф., посв. 70-летию ПГФА. - Пермь, 2007. - С. 384-386.
46. Комплексные соединения на основе N-гетериламидов -оксокислот как перспективные биологически активные субстанции / Н.А. Пулина, П.А.аМокин, Ф.В, Собин [и др.] // Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств: тез. докл. Всеросс. науч. симпозиума. - М., 2008. - С.а164-165.
47. Пулина, Н.А. Изучение биологической активности N Цзамещенных гидразидов 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеновых кислот и продуктов их гидролиза / Н.А. Пулина, Н.В. Кутковая, В.В. Залесов // Фармация из века в век: сб. науч. тр. Часть.V. Синтез биологически активных веществ для создания фармацевтических субстанций. Фармакологические исследования. - С.-Пб: Изд-во СПбХФА, 2008. Ц  С. 139-143.
48. Синтез, строение, свойства тиадиазолиламидов ароилпировиноградных и ароилуксусных кислот / Н.Е. Гаврилова, Н.А. Пулина, В.В. Залесов [иадр.] // Техническая химия: от теории к практике: сб. тр. Междунар. науч. конф. - Пермь, 2008. - С. 320-324.
49. Пулина, Н.А. N-(5-R-2-Тиазолил)амиды 4-арил-2-гидрокси-4-оксо-2-бутеновых кислот в реакциях с диазосоединениями / Н.А. Пулина, Н.Е.аГаврилова, В.В. Залесов // Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов: материалы XI Всеросс. науч. конф. - Саратов: СГУ, 2008. - С. 214-217.
50. Синтез азотсодержащих биологически активных гетероциклов на основе превращений 5-арил-2-диазо-1-R-1,3,5-пентантрионов / В.В.аЗалесов, Н.В. Кутковая, Н.А. Пулина [и др.] // Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов: материалы XI Всеросс. науч. конф. - Саратов: СГУ, 2008. - С. 111-112.
51. Синтез биологически активных соединений на основе реакции N-гетериламидов 2-(2-гидроксифенил)-2-оксоэтановой кислоты с гидразонами кетонов / Н.А. Пулина, П.А. Мокин, В.В. Залесов [и др.] // 35 лет синтеза фурандионов: материалы регион. науч. конф. - Пермь, 2008. - С. 57-58.
52. Hypoglycemic activity at derivatives of 4-aril-2-hydroxy-4-oxo-2-butenoic acids / T.A. Yushkova, N.A. Pulina, V.V. Yushkov [et al.] // Abstracts of papers the 3rd China-Russia international symposium on Pharmacology. Ц  Harbin, 2008. - P. 21-22.
53. Рубцов, А.Е. Синтез замещенных 3-имино и 3-гидразоно-2,3-дигидро-2-оксобензо[b]фуранов / А.Е. Рубцов, Н.А. Пулина, В.В. Залесов // Современное состояние и пути оптимизации лекарственного обеспечения населения: материалы Росс. науч.-практ. конф. ПГФА. - Пермь, 2008. - С.а344-349.

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по разное