Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Зырина Надежда Витальевна
СИНТЕЗ ДНК ab initio, СТИМУЛИРУЕМЫЙ НИКУЮЩЕЙ ЭНДОНУКЛЕАЗОЙ Nt.BspD6I
Специальность 03.01.03 - молекулярная биология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Пущино - 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН и в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте белка РАН.
Научный консультант: доктор биологических наук Железная Людмила Алексеевна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Озолинь Ольга Николаевна, зав. лаборатории Функциональной геномики и клеточного стресса Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биофизики клетки РАН кандидат биологических наук Ушакова Татьяна Евгеньевна, ведущий научный сотрудник лаборатории Радиационной молекулярной биологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН
Защита состоится 29 марта 2012 г. в 1400 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, д.3.
С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН, г. Пущино.
Автореферат разослан 27 февраля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Т.И. Смолихина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. При использовании различных методов амплификации ДНК часто возникает проблема появления неспецифических продуктов, особенно, если в реакции используется сложная матрица (геномная ДНК или ДНК, способная формировать вторичные структуры) и/или очень низкое количество матричной ДНК.
Одним из источников образования неспецифических продуктов во многих случаях может быть способность ДНК-полимераз синтезировать ДНК в присутствии только dNTP. Впервые синтез ДНК термофильными ДНКполимеразами в отсутствие матричной ДНК и праймера был убедительно продемонстрирован в работах Огата и Миура (Ogata and Miura, 1997;
1998). Авторы назвали наблюдаемый синтез синтезом ДНК ab initio.
Продуктами синтеза ab initio были высокомолекулярные ДНК длиной от 0.1 до 50 т.п.о., состоящие из повторов длиной 8-10 п.о., состав которых зависел от условий реакции. На основании того, что подобные последовательности широко распространены как в сателлитной ДНК, так и в кодирующих участках генома эукариотов, Огата и Миура выдвинули предположение, что такие тандемные повторы были синтезированы ДНКполимеразой на определенной стадии эволюции генома и что генетическая информация потенциально может создаваться непосредственно белком. Скорость синтеза ДНК ab initio значительно увеличивается при добавлении эндонуклеаз рестрикции (Liang et al., 2004). ДНК, синтезируемая в этом случае, состоит из палиндромных повторов, содержащих один или два сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции, участвующей в реакции. Несмотря на то, что в работах, в которых изучается синтез ДНК ab initio, реагенты, участвующие в реакции, подвергаются тщательной очистке, тем не менее, это не исключает полностью присутствия следовых количеств ДНК, связанной с ферментами. В связи с этим, в англоязычной литературе этот синтез также называют синтезом, независимым от матрицы и праймера (template/primer-independent DNA synthesis).
Нами обнаружено, что синтез ДНК ab initio эффективно стимулируется никующими эндонуклеазами. Никующие эндонуклеазы узнают в двухцепочечной ДНК короткую специфическую последовательность и вносят разрыв (nick) только в одну, предопределенную цепь ДНК в фиксированном положении относительно узнаваемой последовательности. Несмотря на то, что никующие эндонуклеазы открыты сравнительно недавно (Абдурашитов и др., 1996), они уже нашли применение в разработке различных методов, в том числе методов, предназначенных для медицинской диагностики. Среди последних методов - изотермическая амплификация олигонуклеотидов (Van Ness et al., 2003), амплификация случайных последовательностей геномной ДНК(Chan S-h., et al., 2004), реакция экспоненциальной амплификации ДНК (Tan E., et al., 2007), картирование ДНК (Xiao M., et al., 2007), мечение уникальной последовательности в ДНК (Kuhn H., et al., 2008).
Однако использование никующих эндонуклеаз в сочетании с ДНК-полимеразами, как показано в данной работе, приводит к синтезу неспецифических продуктов, с которым столкнулись и другие исследователи. В связи с этим в настоящее время остро стоит проблема избавления от продуктов неспецифического синтеза ДНК в присутствии никующих эндонуклеаз. Изучение возможности ингибирования неспецифического синтеза ДНК ab initio проведено в данной работе.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении синтеза ДНК ab initio ДНК-полимеразой Bst, стимулируемого никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I.
В ходе исследования решались следующие задачи:
- изучить влияние различных никующих эндонуклеаз на синтез ДНК ab initio;
- изучить зависимость синтеза ДНК ab initio от времени и количества никующей эндонуклеазы;
- установить структуру ДНК, синтезируемой в присутствии Nt.BspD6I;
- определить нуклеотидную последовательность продуктов синтеза ДНК ab initio;
- изучить влияние белков, связывающихся с оцДНК (белки SSB - singlestranded DNA binding,) на синтез ДНК ab initio.
Научная новизна и практическая ценность работы:
Обнаружено, что синтез ДНК ab initio ДНК-полимеразой Bst стимулируется различными никующими эндонуклеазами.
Установлено, что ДНК, синтезированная в присутствии Nt.BspD6I, имеет необычную макромолекулярную структуру, которая представлена двухцепочечной ДНК, содержащей разветвленные участки.
Нуклеотидная последовательность ДНК, синтезированной в присутствии Nt.BspD6I, состоит из непалиндромных тандемных повторов сайта узнавания никазы в прямой или обратной ориентации с одним дополнительным dA или dT. Эта последовательность отличается от последовательностей, синтезируемых в присутствии только ДНКполимеразы (Ogata and Miura, 1997) или полимеразы и эндонуклеаз рестрикции (Liang et al.,2004).
Предложен механизм синтеза ДНК ab initio в присутствии никующих эндонуклеаз.
Предложен ингибитор неспецифического синтеза ДНК ab initio - белок gp32 бактериофага T4.
Апробация работы Материалы диссертации были представлены на международных конференциях Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 2005), 40th Anniversary of the Institute of Protein Research Russian Academy of Sciences International Conference on УProtein Biosynthesis, Structure and FunctionФ (Pushchino, 2007), 10-ой Пущинской школеконференции молодых учёных (Пущино, 2006), XIII-ой международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных ЛОМОНОСОВ2006 (Москва, 2006).
Публикации По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах.
Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, обсуждения результатов, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы и 48 рисунков. Список литературы содержит 138 ссылок.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Стимулирование синтеза ДНК ab initio никующими эндонуклеазами В настоящей работе впервые показано, что синтез ДНК ab initio эффективно стимулируется никующими эндонуклеазами. Никующие эндонуклеазы (никазы) - группа ферментов, которые узнают в двухцепочечной ДНК короткую специфическую последовательность (сайт) и вносят разрыв (ник - nick) в одну из цепей ДНК в фиксированном положении относительно этой последовательности. Никующие эндонуклеазы обозначаются символом N перед сокращенным названием рода бактерии. В зависимости от того, какую цепь - верхнюю (top) или нижнюю (bottom) расщепляет никующая эндонуклеаза, она обозначается символом Nt или Nb, соответственно. В работе была использована никаза Nt.BspD6I, найденная в нашей лаборатории в штамме Bacillus species D6. Этот белок (70.8 кДа) узнает в ДНК последовательность 5-GAGTC-3/5-GACTC-3 и расщепляет только цепь, содержащую последовательность GAGTC на расстоянии 4 нт от сайта узнавания в сторону 3-конца. Максимальную активность никаза проявляет при 550С. По температурному режиму с никазой Nt.BspD6I совместима ДНК-полимераза Bst (650С). В работе использован большой фрагмент ДНК-полимеразы Bst (как коммерческий препарат, так и рекомбинантный белок, полученный в рамках данной работы).
Интенсивный синтез ДНК (около 5 мкг ДНК в течение одного часа) был обнаружен в контрольной пробе в присутствии никазы, ДНКполимеразы и dNTP, но в отсутствие привнесенной ДНК (Рис.1). Синтез ДНК не наблюдался при инактивации никазы прогреванием. Отсутствие синтеза при инактивации никазы свидетельствовало о том, что интенсивный синтез обусловлен именно никазой, а не возможными примесями ДНК. Поэтому реагенты, участвующие в реакции, не подвергались дополнительной очистке. Реакцию синтеза проводили в объеме 20 мкл, содержащем 2 единицы активности ДНК-полимеразы Bst и 0.2 мМ dNTP. Количество никазы и время инкубации (при 550С) варьировали.
Количество и длина синтезируемой ДНК зависят от количества никазы в реакционной смеси. Из рисунка 1А видно, что по мере увеличения количества никазы (0.1 - 1 ед. акт.) увеличивается и количество синтезированной ДНК. При этом преобладает высокомолекулярная ДНК. При дальнейшем увеличении количества никазы картина меняется: наблюдается широкий спектр низкомолекулярных продуктов ДНК. При анализе продуктов реакции электрофорезом более высокого разрешения (ПААГ) видно, что низкомолекулярные продукты представлены набором гомогенных полос (Рис. 1Б). Наличие низкомолекулярных продуктов свидетельствует о том, что синтез ДНК сопровождается гидролизом ДНК. По-видимому, и высокомолекулярная ДНК представлена гомогенными продуктами, однако при использовании традиционного электрофореза в агарозном геле они не разрешаются. При высоких количествах никазы продуктов синтеза не детектировали.
Рис. 1. Синтез ДНК, стимулируемый никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I (инкубция 1 ч). (А) Разделение продуктов реакции в 1% агарозном геле.
(Б) Электрофорез тех же продуктов в 12% ПААГ. Продукты реакции: 0 - инкубирование в присутствии только ДНК-полимеразы; К - в присутствии ДНК-полимеразы и 1 ед. акт. инактивированной нагреванием Nt.BspD6I, К1 - инкубирование без полимеразы в присутствии 1 ед. акт.
Nt.BspD6I;. далее - активности Nt.BspD6I. Справа показаны размеры маркера ДНК в п.о.
Для характеристики зависимости синтеза от времени и оценки количества синтезированной ДНК был проведен анализ продуктов реакции с использованием [32P]dАТP (Рис. 2). Анализ продуктов реакции показал, что ДНК-полимераза Bst ведет синтез ab initio в отсутствие никазы (Рис. 2А). Однако количество включенной радиоактивной метки детектируется лишь к 18 часам, тогда как при добавлении никазы интенсивный синтез начинается уже через 1 час и достигает максимума к 1.5 часам. За это время более 70-80% радиоактивной метки включается в кислотонерастворимую фракцию ДНК.
Рис. 2. Зависимость от времени синтеза ДНК ab initio полимеразой Bst, cтимулированного никазой Nt.BspD6I. (А) Скорость включения радиоактивного [32P]dАТP в кислотонерастворимую фракцию в присутствии различных количеств никазы Nt.BspD6I: 1 - 0.1 ед. акт.;
2 - 1.0 ед. акт.; 3 - 10 ед. акт.; 4 - 100 ед. акт.; 5 - без Nt.BspD6I.
(Б) Радиоавтограф продуктов реакции в присутствии 10 ед. никазы в 20% денатурирующем ПААГ. Справа указаны размеры маркера ДНК в нт.
Последующее уменьшение количества включенного [32P]dАТP объясняется фрагментацией ДНК никазой при дальнейшей инкубации.
Процесс фрагментации иллюстрируется радиоавтографом (Рис. 2Б).
Синтез высокомолекулярной ДНК (более 200 п.н.) обнаруживается после 1 часа инкубации. При дальнейшем увеличении времени инкубации все большее количество синтезированной ДНК представлено низкомолекулярными фрагментами длиной до 200 нуклеотидов, с четко различимыми отдельными полосами. В то время как общая радиоактивность при инкубации в течение 2, 4 и 18 ч остается примерно одинаковой, значительно увеличивается фракция фрагментов ДНК длиной менее 100 нуклеотидов. Низкомолекулярные фрагменты не осаждаются 10% ТХУ, что объясняет уменьшение детектируемой радиоактивности. Таким образом, гидролиз высокомолекулярной ДНК происходит не только при увеличении количества никазы, но и при увеличении времени инкубации. Продолжительный лаг период синтеза в отсутствии никазы подтверждает ее необходимость для стимулирования синтеза ab initio.
Для того чтобы проверить, могут ли другие никующие эндонуклеазы стимулировать синтез ДНК ab initio, был проведен синтез в присутствии никаз Nt.AlwI, Nb.BbvCI и Nb.BsmI. Было обнаружено, что стимулирование синтеза ДНК ab initio характерно не только для никазы Nt.BstD6I, но и для других никаз (Рис. 3, 4). В экспериментах с инактивированными прогреванием никазами синтез не отмечался даже после 4 часов инкубации реакционной смеси. Cинтез ДНК ab initio в присутствии никующих эндонуклеаз Nt.AlwI, Nb.BbvCI и Nb.BsmI также показал зависимый от концентрации характер: при небольших количествах никазы синтезируются высокомолекулярные продукты, при высоких количествах появляются низкомолекулярные гомогенные полосы.
Рис. 3. Синтез ДНК ab initio, стимулируемый никующими эндонуклеазами Nt.AlwI, Nb.BbvCI и Nt.BsmI после 1 часа инкубации. Разделение продуктов реакции в 1% агарозном геле. Продукты реакции: 0 - инкубирование в присутствии только ДНК-полимеразы; К - инкубирование в присутствии никаз Nt.AlwI, Nb.BbvCI (4.7 ед.акт.), Nb.BsmI (16 ед.акт.), инактивированных нагреванием; К1 - инкубация без ДНК-полимеразы Bst в присутствии Nt.AlwI и Nb.BbvCI, Nb.BsmI; далее - активности никаз. Справа показаны размеры маркера ДНК в п.о.
Рис. 4. Синтез ДНК ab initio, стимулируемый никазами Nt.AlwI, Nb.BbvCI и Nb.BsmI после 1 ч инкубации. Разделение продуктов реакции в 12% ПААГ. Продукты реакции: 0 - инкубирование в присутствии только ДНКполимеразы; К - инкубирование в присутствии никаз Nt.AlwI, Nb.BbvCI (4.7 ед.акт.), Nb.BsmI (16 ед.акт.), инактивированных нагреванием; К1 - инкубация без ДНК-полимеразы в присутствии Nt.AlwI и Nb.BbvCI, Nb.BsmI; далее - активности никаз. Справа показаны размеры маркера ДНК в п.о.
2. Анализ структуры ДНК, синтезированной в присутствии Nt.BspD6I Для первоначального анализа структуры синтезированной ДНК была проведена обработка полученных продуктов различными нуклеазами (Рис. 5).
Рис. 5. Гидролиз продуктов синтеза ДНК ab initio различными нуклеазами. (А) Расщепление ДНКазойI, (Б) эндонуклеазой рестрикции HinfI. (В) нуклеазой Mung Bean. Справа показаны размеры маркера длин ДНК в п.о.
При обработке ДНКазойI продукты синтеза ДНК полностью расщеплялись до низкомолекулярных фрагментов (Рис. 5А).
Эндонуклеаза рестрикции HinfI, которая узнает сайт G/ANTC, перекрывающийся с сайтом узнавания никазы (GAGTC), гидролизовала продукт синтеза до низкомолекулярных фрагментов длиной 50-200 п.о.
(Рис. 5Б). Другие эндонуклеазы рестрикции - HaeIII (GG/CC), HpaII (C/CGG) не меняли размер синтезированной ДНК (данные не представлены). Полученные результаты свидетельствуют о том, что синтезированная ДНК, является двухцепочечной и содержит большое количество сайтов, узнаваемых никазой. Обработка ДНК нуклеазой золотистой фасоли (Mung вean), специфичной к одноцепочечной ДНК, уменьшала длину молекул препарата в 2-3 раза (Рис. 5В). Нуклеаза золотистой фасоли может расщеплять ДНК в разветвленных структурах ДНК, которые содержат одноцепочечные участки. На этом основании было сделано предположение, что в нативных условиях некоторая часть продуктов может существовать в разветвленной форме. Чтобы проверить это предположение был проведен анализ продуктов реакции с использованием электронной микроскопии (Рис. 6).
Рис. 6. Электронная микроскопия продуктов реакции синтеза ДНК ab initio, стимулированного Nt.BstD6I.
Действительно, часть молекул ДНК имела разветвленные участки. Таким образом, было установлено, что синтезированная ДНК имеет необычную структуру.
3. Определение нуклеотидной последовательности ДНК Для определения нуклеотидной последовательности продуктов синтеза ДНК ab initio была поставлена задача клонировать ДНК в плазмидном векторе pUC18. Задача осложнялась тем, что большие вставки, содержащие большое количество повторяющихся последовательностей ДНК, не поддерживаются при клонировании. В таких вставках часто происходят делеции. Фрагментация высокомолекулярной ДНК в присутствии большого количества никазы и указывала на то, что синтезированная ДНК содержит сайты узнавания никазы GAGTC на достаточно близком расстоянии друг от друга (Рис.
1Б). Для получения вставки небольшого размера синтезированную ДНК расщепляли эндонуклеазой рестрикции HinfI, которая узнает сайт G/ANTC, перекрывающийся с сайтом никазы. ДНК гидролизовали до среднего размера 100 п.о. (Рис. 7А). После гидролиза рестриктазой HinfI продукт ДНК клонировали в плазмидном векторе pUC18 по уникальному сайту SmaI с использованием стандартных методик (Рис. 7Б).
Были клонированы также продукты синтеза ДНК в присутствии только полимеразы Bst. Для получения вставки небольшого размера синтезированную ДНК обрабатывали ДНКазойI. После гидролиза продукт ДНК клонировали в плазмидном векторе pUC18 по схеме, представленной на рисунке 7Б.
Рис.7. Ферментативная обработка продуктов синтеза ДНК ab initio для клонирования. (А) Расщепление продуктов синтеза ab initio эндонуклеазой рестрикции HinfI, 1% агарозный гель. М - маркеры длин фрагментов ДНК, размеры в п.о. показаны слева. (Б) Последовательность этапов ферментативной обработки продуктов расщепления рестриктазой HinfI.
Анализ последовательностей ДНК, синтезированной в присутствии никазы, показал, что большинство продуктов состоит из повторов в прямой или обратной ориентации последовательности сайта, узнаваемого никазой, с одним дополнительным нуклеотидом A или T (Рис. 8). Встречались также повторы сайта узнавания никазы без вставки дополнительного нуклеотида. На рисунке 8 представлены последовательности 7 клонов. Остальные 13 клонов содержали вставки, подобные E12, с числом повторов от 7 до 13. Последовательности ДНК, синтезированной в присутствии только полимеразы (4 клона) оказались представленными dAT сополимерами (Рис. 8, клон N2).
Рис. 8. Нуклеотидные последовательности продуктов синтеза ДНК ab initio. Обозначения: E7 - E45 - последовательности ДНК, синтезированные Bst полимеразой в присутствии Nt.BspD6I, N2 - одной Bst полимеразой. Направление стрелки указывает ориентацию мотива, число под стрелкой - количество повторов, - делеция, - вставка.
Таким образом, оказалось, что в присутствии никазы продукт синтеза ab initio четко отличается от продуктов, синтезированных только полимеразой и полимеразой в присутствие рестриктаз. В случае эндонуклеаз рестрикции, сайты узнавания разделены достаточно большой последовательностью, тогда как в случае никующей эндонуклеазы только одним нуклеотидом.
4. Модель элонгации ДНК при синтезе ДНК ab initio в присутствии никазы В настоящее время в работах, посвященных синтезу ДНК ab initio, механизмы синтеза одной полимеразой (Ogata and Miura, 1997) или в присутствии рестриктазы (Liang et al., 2004) не рассматриваются начальные стадии синтеза, а только с того момента, когда уже синтезировано несколько повторов. В данной работе рассмотрение механизма элонгации ДНК также начинается с небольшой молекулы дцДНК с несколькими тандемными повторами сайта никазы (Рис. 9). При наличии такой последовательности никаза расщепляет только одну цепь ДНК (Рис. 9, этап 1). Полимераза использует 3-OH конец ника и ведет синтез ДНК с вытеснением исходной родительской цепи ДНК (полимераза Bst обладает способностью к вытеснению цепи). После завершения синтеза она присоединяет на 3 конец вновь синтезированной нити дополнительные нуклеотиды NN своей нуклеотидилтрансферазной активностью (Рис. 9, этап 2).
Рис. 9. Схематическое представление модели элонгации и ветвления ДНК при синтезе ДНК ab initio, стимулированным никующей эндонуклеазой.
Комплементарные цепи ДНК обозначены черным и серым цветами, элонгируемые цепи - пунктирной линией. Этапы синтеза ДНК объяснены в тексте.
При повторной репликации (Рис. 9, этапы 1 - 3) вытесняется цепь, на 3 конце которой находится последовательность NN, а к вновь синтезированной цепи присоединяется последовательность NN.
Комплементарные последовательности NN и NN гибридизуются и ДНКполимераза использует такую цепь в качестве матрицы для продолжения синтеза (Рис. 9, этап 4). Гидролиз цепи никазой и последующее использование 3-OH конца ника полимеразой для синтеза ДНК с вытеснением исходной родительской цепи повторяется многократно. За счет этого синтез ДНК ab initio ускоряется. Рассмотренный процесс объясняет формирование протяженной двухцепочечной ДНК. Помимо этого рассмотренного процесса может оказаться, что вытесненная цепь образует шпильку. Эта шпилька служит праймером для дальнейшего синтеза ДНК (Рис. 9, этап 5). Поскольку никаза вносит ник в одну цепь, может происходить межмолекулярная гибридизация, в результате чего могут образовываться ветвящиеся молекулы (Рис. 9, этап 6).
Представленная модель синтеза ДНК ab initio объясняет образование той необычной структуры, которая видна в электронном микроскопе.
5. Ингибирование синтеза ДНК ab initio Следующей частью работы было изучение того, как возможно ингибировать синтез ДНК ab initio. Дело в том, что в настоящее время предложен целый ряд диагностических методов, основанных на использовании ДНК-полимераз совместно с никующими эндонуклеазами.
Однако установленный в данной работе факт, что никующие эндонуклеазы сильно стимулируют синтез ДНК ab initio, может служить причиной появления продуктов неспецифического синтеза и быть препятствием для идентификации специфических последовательностей ДНК. В связи с этим была поставлена задача поиска ингибиторов синтеза ДНК ab initio.
В качестве возможных ингибиторов были выбраны белки SSB, связывающиеся с оцДНК (SSB, single-stranded DNA binding). Белки SSB связываются неспецифически с высокой аффинностью с оцДНК, стабилизируют и придают ей регулярную форму, денатурируя побочные вторичные структуры. Наиболее изученными и доступными в качестве коммерческих препаратов являются белок E. coli (Eco SSB) и продукт гена 32 бактериофага T4 (T4 gp32). Поэтому изучали влияние именно этих белков на синтез ДНК ab initio.
В связи с тем, что ДНК-полимераза Bst, способна синтезировать ДНК в отсутствие матричной ДНК и праймера, первоначально было изучено влияние белков SSB на синтез ДНК ab initio, осуществляемый ДНК-полимеразой Bst в отсутствие никующей эндонуклеазы (Рис. 10А). В отсутствие никующей эндонуклеазы и белков SSB незначительный синтез ДНК регистрируется только через 16 часов. Присутствие белка Eco SSB незначительно стимулирует синтез ДНК ab initio: количество ДНК, синтезированной через 24 часа, примерно вдвое больше, чем в его отсутствие. Белок T4 gp32, напротив, практически полностью ингибирует синтез ДНК.
Рис. 10. Влияние белков SSB на синтез ДНК-полимеразой Bst, включение [ P] dATP в кислотонерастворимую фракцию. (А) Синтез ДНК в отсутствие матрицы и праймера (ab initio). (Б) Синтез ДНК в присутствии праймированной кольцевой матрицы (оцДНК фага М13mp19) Влияние белков SSB на синтез ДНК в присутствии матричной и праймерной ДНК противоположно влиянию, наблюдаемому в отсутствие матрицы и праймера (Рис.10Б). Белок Eco SSB практически не оказывал влияния на количество образовавшегося продукта, а добавление T4 gpувеличивал количество продукта примерно вдвое. Таким образом, в отсутствие никующей эндонуклеазы белок Eco SSB стимулирует синтез ДНК ab initio, но не влияет на синтез ДНК на праймированной матрице.
Белок T4 gp32, напротив, ингибирует синтез ДНК ab initio и стимулирует синтез ДНК на праймированной матрице.
Основной задачей было изучение влияния белков SSB на синтез ДНК ab initio в присутствии никующей эндонуклеазы Nt.BspD6I.
Рис. 11. Влияние белков SSB на cинтез ДНК ab initio в присутствии никующей эндонуклеазы Nt.BspD6I. (А) Синтез ДНК в течение часа, включение [ P] dATP в кислотонерастворимую фракцию. (Б) Электрофорез продуктов синтеза (1 час) и гидролиза (14 часов) в 20% денатурирующем ПААГ (радиоавтограф).
Присутствие никующей эндонуклеазы, как уже было показано, сильно стимулирует синтез ДНК ab initio. Белок Eco SSB практически не оказывает влияния на синтез, стимулируемый никующей эндонуклеазой, белок T4 gp32 в сильной степени ингибирует этот синтез.
Как было показано, в реакции одновременно с синтезом идет и гидролиз ДНК никующей эндонуклезой. При длительной инкубации, когда пул dNTP исчерпывается, синтез ДНК прекращается и преобладает процесс гидролиза ДНК. В связи с этим влияние белков SSB на синтез ДНК ab initio в присутствии никующей эндонуклеазы изучали в двух временных режимах - в течение одного часа и 14 ч, когда гидролиз ДНК становится единственным процессом.
Добавление белка T4 gp32 сильно ингибирует синтез в течение часа, но на деградацию ДНК после 14 часов инкубации не влияет. Белок Eco SSB оказывает незначительное влияние как на синтез ДНК в реакции, протекающей в течение одного часа (Рис. 11А), так и на деградацию ДНК после 14 часов инкубации (Рис. 11Б).
Таким образом, было показано, что белок Eco SSB не влияет на синтез ДНК ab initio в присутствии никующей эндонуклеазы, тогда как белок T4 gp32 в значительной степени ингибирует этот синтез. На деградацию ДНК эти белки не влияют.
Наконец, последним этапом этой части работы было выяснение вопроса, как влияют белки SSB на синтез специфического продукта на праймированной матрице в присутствии никазы. Так как Eco SSB не ингибировал синтез ДНК ab initio, синтез на праймированной матрице изучали в присутствие T4 gp32. В качестве матрицы была использована дцДНК, размером 157 п.о., содержащая сайт никазы.
Рис. 12. Влияние белка T4 gp32 на амплификацию специфического продукта на праймированной матрице в присутствии никазы. (А) Схема реакции амплификации. (Б) Радиоавтограф продуктов реакции.
Электрофорез в денатурирующем 20% ПААГ.
Согласно схеме, представленной на рисунке 12, после внесения разрыва никующей эндонуклеазой в верхнюю цепь матричной ДНК появляется свободный 3-OH конец, с которого ДНК-полимераза начинает синтез комплементарной цепи с вытеснением оц фрагмента ДНК размером 42 нт. При дальнейшем синтезе достраивается комплементарная цепь, которую вновь гидролизует никаза. Этот цикл многократно повторяется, приводя к накоплению продукта реакции размером 42 нт.
Радиоавтограф продуктов реакции в 20% ПААГ показал, что такой синтез действительно идет и специфический продукт, размером 42 нт.
нарабатывается. Присутствие белка T4 gp32 оказывает незначительное влияние на синтез специфического продукта в реакции с присутствующей никазой.
Таким образом, показано, что белок gp32 бактериофага Tингибирует синтез ДНК ab initio, но не оказывает значительного влияния на синтез ДНК на прймированной матрице. Следовательно, белок gpбактериофага T4 можно использовать в качестве ингибитора синтеза ДНК ab initio в реакциях амплификации ДНК в присутствии никующих эндонуклеаз.
Диссертационная работа заканчивается Приложением, в котором описаны клонирование фрагментов ДНК, кодирующих большой фрагмент ДНК-полимеразы Bst и белка gр32 бактериофага Т4, а также процедуры очистки белков.
ВЫВОДЫ 1. Впервые установлено, что никующие эндонуклеазы стимулируют высоко эффективный синтез ДНК в отсутствие матрицы и праймера (синтез ДНК ab initio).
2. Установлено, что структура ДНК, синтезированная в присутствии никующей эндонуклеазы Nt.BspD6I, является двухцепочечной, содержащей разветвленные участки.
3. Определена нуклеотидная последовательность ДНК, синтезированной в присутствии Nt.BspD6I, которая состоит из повторов сайта узнавания никазы в прямой или обратной ориентации.
4. Предложен механизм синтеза ДНК ab initio в присутствии Nt.BspD6I.
5. Показано, что белок gp32 бактериофага T4, связывающийся с одноцепочечной ДНК, ингибирует синтез ДНК ab initio, но не влияет на синтез ДНК в присутствии матрицы и праймера. Таким образом, его можно рекомендовать в качестве ингибитора синтеза ДНК ab initio в реакциях амплификации ДНК с участием никующих эндонуклеаз.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Zyrina N.V., Zheleznaya L.A., Dvoretsky E.V., Vasiliev V.D., Chernov A., Matvienko N.I. (2007) N.BspD6I DNA nickase strongly stimulates template independent synthesis of non-palindromic repetitive DNA by Bst DNA polymerase. Biol. Chem., 388, 367Ц372.
2. Зырина Н.В., Железная Л.А., Свадьбина И.В., Матвиенко Н.И. (2011) Новый метод получения высокоочищенного белка p32 бактериофага Тдля биомедицинских исследований. Биомедицинский журнал Medline.ru, 12, 1101-1118.
3. Зырина Н.В., Артюх Р.И., Свадьбина И.В., Железная Л.А., Матвиенко Н.И. (2012) Влияние белков, связывающихся с одноцпочечной ДНК, на безматричный/беспраймерный синтез ДНК в присутствии никующей эндонуклеазы Nt.BspD6I. Биоорганическая химия, 38, N 2, с. 1-7.
4. Зырина Н.В., Железная Л.А., Матвиенко Н.И. Очистка C-концевого фрагмента ДНК полимеразы Bacillus stearothermophillus и его применение в амплификации ДНК по типу катящегося кольца. Биотехнология:
состояние и перспективы развития: материалы Третьего Московского международного конгресса (Москва, 14-18 марта, 2005 г.) М.: ЗАО Экспо-биохим-технологии, РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2005-часть 1, с.68.
5. Дворецкий Е.В., Зырина Н.В., Матвиенко Н.И., Васильев В.Д.
Безматричный синтез Bst ДНК-полимеразой в присутствии никазы.
Сборник тезисов Х Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2006 г 17-21 апреля,.), Т.1, с. 13.
6. Дворецкий Е.В., Зырина Н.В. ДНК никазы N.Bsp D6I, N. AlwI, N.BbvC IA, BsmI стимулируют синтез ДНК ab initio ДНК-полимеразой из Bacillus stearothermophilus. Материалы конференции XIII международной конференции ЛОМОНОСОВ-2006 (Москва, 12Ц15 апреля 2006 г)., с. 7273.
7. Zyrina N.V., Zheleznaya L.A., Dvoretsky E.V., Vasiliev V.D., Chernov A., Matvienko N.I. Template independent DNA synthesis by Bst DNA polymerase in the presence of site-specific DNA nickases. Proceedings of the 40th Anniversary of the Institute of Protein Research Russian Academy of Sciences International Conference on УProtein Biosynthesis, Structure and FunctionФ June 9-13, 2007, Pushchino, Russia. p 35.