Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

на правах рукописи

Устюгова Екатерина Александровна

СИНТЕЗ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ШИРОКОГО СПЕКТРА ДЕЙСТВИЯ ЛАКТОКОККОМ

LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS 194-K

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2012

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Некоторые эксперименты были выполнены в ФГБУ НИИ по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе РАМН и институте биоорганической химии имени Шемякина М. М. и Овчинникова Ю.А. РАН. 

Научный руководитель:  доктор биологических наук

Стоянова Лидия Григорьевна

Научный консультант:  доктор химических наук, профессор  Катруха Генрих Степанович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ушакова Нина Александровна

Федеральное государственное учреждение науки институт

проблем экологии и эволюции имени А.Н.Северцова РАН,

зав. лабораторией инновационных технологий.

кандидат биологических наук

Загустина Наталья Алексеевна

Федеральное государственное учреждение науки

институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН.

старший научный сотрудник.

Ведущая организация: Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности РАСХН.

Защита диссертации состоится 27 ноября 2012 г. в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М-1.

Тел: 8 (495) 939-54-83, эл. почта: npiskunkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат  разослан л__ ___________  2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук                                                        Пискункова Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Молочнокислые бактерии (МКБ) уже более ста лет привлекают внимание исследователей. Исторически в ядро этой группы включены бактерии, относящиеся к родам Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus и Leuconostoc (Albano et al., 2007). Род Lactococcus, тесно ассоциированный с пищевыми продуктами, является одним из самых значимых среди них (Holzapfel et al., 2001), а некоторые виды лактококков относятся к симбионтной микробиоте человека, в связи с чем были удостоены статуса GRAS (Generally Regarded As Safe). 

Исследования последних десятилетий выявили способность МКБ образовывать антимикробные вещества различной природы, которые могут стать альтернативой существующим антибиотикам и консервантам.  Наиболее изученной из них является группа антибактериальных пептидов - бактериоцинов, разнообразных по уровню активности, спектру и механизму действия (Cascales et al., 2007). Бактериоцины легко расщепляются ферментами пищеварительного тракта, и поэтому считается, что они могут заменить традиционные химические консерванты (Nes et al., 2007). Так, бактериоцин низин, образуемый Lactococcus lactis, с успехом используют для увеличения сроков годности продуктов питания в пищевой промышленности многих стран уже более 50 лет (Cleveland et al., 2001). Но применение низина, как и других бактериоцинов, ограничивается относительно узким спектром антимикробного действия, направленным только в отношении грамположительных бактерий, и появлением среди пищевых патогенов устойчивых форм (Kaur et al., 2011).

Особую значимость молочнокислые бактерии приобрели после открытия способности к продукции фунгицидных веществ (Schnrer et al., 2005). Получение новых штаммов МКБ, обладающих антибактериальной и фунгицидной активностью, в перспективе может решить проблему не только  порчи продуктов питания, но и лечения ряда инфекционных заболеваний (Marteau et al., 2003; Rouse et al., 2008). Хорошо изучены фунгицидные вещества, образуемыми бактериями рода Lactobacillus (Yang et al., 2010),  тогда как наличие фунгицидной активности среди бактерий рода Lactococcus является очень редким и малоизученным свойством, а о природе фунгицидных веществ почти ничего не известно (Florianowicz et al., 2001; Стоянова и др., 2007). В этой связи  выделение, изучение свойств и биосинтеза новых антибактериальных и фунгицидных антибиотиков, образуемых лактококками, а также исследование перспективы их применения имеет фундаментальный и практический интерес. Возросший спрос медицинской и пищевой промышленности в новых безопасных антимикробных препаратах с широким спектром действия обуславливает актуальность данного исследования.

В процессе поиска штаммов лактококков, обладающих широким спектром бактерицидного и фунгицидного действия, на кафедре микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова из коровьего молока Бурятии был выделен штамм Lactococcus lactis subsp. lactis 194 (Стоянова и др., 2006). Однако химическая природа активных компонентов, продуцируемых L. lactis subsp. lactis 194, и особенности их биосинтеза  не были изучены. Данная работа посвящена выделению и установлению химической природы антибиотических веществ, образуемых L. lactis subsp. lactis 194,  изучению их синтеза, а также исследованию возможности их практического применения.

Цель и задачи работы.

Цель исследования: изучение синтеза антибиотического комплекса широкого антимикробного спектра действия, образуемого активным вариантом штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K.

Для выполнения поставленной  цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить диссоциацию популяции штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 с целью выделения наиболее активного продуцента.
2. Разработать условия выделения и очистки антибиотических веществ, образуемых активным вариантом штамма  L. lactis subsp. lactis 194-К.
3. Изучить физико-химические и биологические свойства индивидуальных антибиотиков,  установить их химическую природу. 
4. Изучить синтез антибиотического комплекса штаммом L. lactis subsp. lactis 194-К и подобрать оптимальную среду культивирования.
5. Испытать эффективность культуры штамма 194-К in vivo на моделе спонтанного хронического дерматоза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Получен активный вариант штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К, образующий сложный антибиотический комплекс широкого спектра бактерицидного и фунгицидного действия.
2. Разработаны способы выделения и очистки антибиотиков,  образуемых активным вариантом 194-К.
3. Установлен  состав антибиотического комплекса: наряду с известным бактериоцином низином А, обнаружен новый  бактериоцин 194-D, а также два антибиотика гидрофобной природы (194-А и В), которые являются новыми биологически активными веществами.
4. Эксперименты на мышах  линии CBRB-Rb (8.17)1Iem показали эффективность  культуры штамма 194-К  для лечения воспалительных заболеваний кожи.

Научная новизна и практическая значимость работы.

1. Изучена диссоциация штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 и выделен активный вариант 194-К, продуцирующий антибиотический комплекс с широким спектром антибактериального и фунгицидного действия. 
2. Разработана схема выделения и очистки антибиотического комплекса и его отдельных антибиотиков, относящихся к разным классам органических соединений.
3. Впервые показано, что штамм L. lactis subsp. lactis 194-К наряду с низином образует новый  бактериоцин 194-D, а также два антибиотика гидрофобной природы (194-А, В), не имеющие аналогов в базе данных природных биологически активных веществ (BNPD).
4. Изучено влияние оптимизированных ферментационных сред различного состава на синтез фунгицидного антибиотика 194-А и нового бактериоцина 194-D. Подобрана оптимальная для их продукции среда.
5. Показана эффективность культуры штамма 194-К для уменьшения степени выраженности симптомов хронического дерматоза у мышей линии CBRB-Rb (8.17)1Iem.

Практическая значимость работы заключается в получении активного варианта штамма  L. lactis subsp. lactis 194-К, разработке схемы выделения новых антибиотиков, перспективных для использования в пищевой промышленности и медицине. Доказана эффективность перорального применения культуры штамма 194-К для лечения воспалительных заболеваний кожи. 

Апробация работы и публикации.

Результаты диссертационной работы были представлены на международных  конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2009, Ломоносов-2012 (Россия, Москва 2009, 2012); симпозиуме Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов (Россия, Москва, 2009); III-й научно-практической конференции Перспективы развития инноваций в биологии (Россия, Москва, 2009); III-й Международной конференции International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (Португалия, Лиссабон, 2009); VII-й Международной конференции Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии (Беларуссия, Минск, 2010); VI-м Московском международном конгрессе  Биотехнология, ее состояние и перспективам развития (Россия, Москва, 2011);  Международной научно-практической конференции Фармацевтическая и медицинская биотехнология (Россия, Москва, 2012); ежегодном международном конгрессе Инфекционные заболевания (Россия, Москва, 2012).

Диссертация апробирована на заседании кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова  18 сентября 2012 г. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, среди которых 6 статей в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

       Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 32 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 258 отечественных и зарубежных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы представлены сведения об антимикробных метаболитах молочнокислых бактерий. Особое внимание уделено рассмотрению многообразия бактериоцинов и фунгицидных веществ, их спектру и механизму антимикробного действия. В отдельных главах рассмотрены перспективы применения молочнокислых бактерий и их метаболитов в пищевой и медицинской промышленности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали штамм Lactococcus lactis subsp. lactis 194, выделенный из коровьего молока Бурятии (Стоянова и др., 2006). Штамм был лиофилизирован и хранился в условиях бытового холодильника. Культуру восстанавливали в обрате в стационарных условиях при 28С. Из обрата бактерии пересевали в посевную среду, приготовленную на водопроводной воде с дрожжевым экстрактом (20 г/л) и глюкозой (10 г/л), рН среды устанавливали 6,8-7,0. Затем посевной материал вносили в ферментационную среду, содержащую в (г/л): сахароза -  20,0; KH2PO4 - 20,0; NaCl  - 2,0; MgSO4 - 0,2; дрожжевой экстракт- 20,0; рН=6,8-7,0 (Стоянова и др., 2006). На данной ферментационной среде изучали диссоциацию штамма 194 с целью выделения активного варианта; антимикробный спектр действия выделенного варианта штамма 194-К, динамику его роста и накопления антибиотической активности. Разрабатывали схему выделения и очистки отдельных антибиотиков для изучения их биологических и физико-химических свойств. Изучали влияние ферментационных сред различного состава на биосинтетическую способность штамма 194-К. 

Антибиотическую активность определяли методом диффузии в агар с измерением зоны подавления роста тест-культуры Bacillus coagulans в мм (Егоров, 2004).

Диссоциацию культуры L. lactis subsp. lactis 194  изучали на твердой ферментационной среде с добавлением 2% агара. Отбор наиболее активных по уровню антибиотической активности клонов лактококков проводили методом рассева бактериальной суспензии с последующим отбором колоний разной морфологии (Милько и др., 1991).

Спектр антимикробного действия L. lactis subsp. lactis 194-К определяли на разные группы микроорганизмов, используя в качестве стандартов низин, левомицетин и нистатин. В качестве тест-культур использовали микроорганизмы музея кафедры микробиологии МГУ имени М.В. Ломоносова и НИИ по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе РАМН. 

Экстракцию антибиотиков и фракционирование культуральной жидкости штамма 194-К проводили по схеме, представленной на рис.7. Культуральную жидкость экстрагировали смесью ацетон - уксусная кислота - культура (4:1:5) при 55С в течение 1.5 ч. Полученный экстракт упаривали в вакууме, к оставшемуся водному концентрату  добавляли избыток метанола для осаждения части антибиотиков (рис. 7); осадок отделяли от маточного раствора и получали фракцию I (осадок, порошок-сырец) и фракцию II - водный остаток (Стоянова и др., 2007).  Извлечение гидрофобных антибиотиков (194-А и В) из фракции II проводили  экстракцией н-бутанолом. Разделение антибиотиков 194-А и В, содержащихся в бутанольном экстракте, проводили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (лMerck, Германия); элюцию осуществляли органическими растворителями в следующей последовательности:  хлороформ, хлороформ-метанол (1:1), метанол.

Выделение антимикробных пептидов проводили из порошка-сырца (рис. 7) методом препаративного изоэлектрофокусирования (ИЭФ; Sova, 1990). Напряжение в приборе для ИЭФ изменяли следующим образом: 1 ч - 200 В, 4 ч - 400 В, следующие 19 ч - 250 В. По окончании процесса содержимое ячеек собирали и упаривали на роторном испарителе Rotavapor-R Bchi (Швейцария). Сухой остаток растворяли в 0.1 % растворе трифторуксусной кислоты (ТФУ).

Все фракции (спиртовые концентраты, маточники, осадок) на каждой стадии выделения анализировали на присутствие антибиотических веществ, используя тест-культуры Bacillus subtilis и Аspergillus niger,  а также с помощью ТСХ и электрофореза с последующей биоавтографией. Очистку антибиотиков (194-А и 194-D) от примесей проводили с помощью ОФ-ВЭЖХ на микроколоночом хроматографе  Милихрм А-02 (ЗАО Эконова, Россия). Антибиотик 194-В был очищен с помощью картриджей Диапак-С8 (ЗАО БиоХимМак СТ, Россия). Полученные индивидуальные антибиотики 194-А, 194-В, 194-D анализировали с помощью ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии, а также устанавливали спектр их антимикробного действия.

Электрофорез проводили на бумаге Filtrak F-14 на  V-образном приборе Durruma при 550 В  в течение 150 мин в 30% уксусной кислоте с рН 1.7. 

ТСХ проводили на пластинках DC Alufoilien Kieselgel-60  (УMerckФ, Германия) размером 15х15 см в системе растворителей хлороформ-бензол-метанол (30:20:7).

Биоавтографию выделенных антибиотиков проводили по методике с использованием в качестве тест-организма  B. subtilis АТСС 6633 (Haese, Keller, 1989). 

ОФ-ВЭЖХ анализ проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе Милихром А-02 (ЗАО Эконова, Россия), термостатируемом при 35С с колонками из нержавеющей стали размером 2.0x75.0 мм, заполненных сорбентом Prontosil 120-5C18AQ или Nucleosil 300-5C4  (лMacherey-Nagel, Германия). В работе использовали линейный градиент подвижной фазы, создаваемый элюентом А (0.1%-ный раствор ТФУ в воде) и элюентом В (0.1%-ный раствор ТФУ в ацетонитриле) при скорости потока 100 мкл/мин. Реагенты готовили с применением воды высшей степени очистки (18.1 Мом/см), полученную на установке Milli-QоPlus (лMillipore, Франция). Детектирование разделяемых веществ осуществляли при нескольких длинах волн 214, 250 и 270 нм в градиенте концентрации элюента В (от 0 до 80-100%); время анализа составляло 20-25 мин для каждой пробы. Контрольным образцом был низин А, растворенный в 0.1%-ной ТФУ с концентрацией 1 мг/мл. Объем вводимых проб составлял 10-15 мкл. Полученные в ходе ОФ-ВЭЖХ анализа фракции, соответствующие отдельным пикам, были собраны. Антибиотически активные фракции анализировали с помощью физико-химических и биологических методов. Спектр антимикробного действия веществ, содержащихся во фракциях, определяли дисковым методом.

UV-VIS-спектры снимали на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 PC UV-Visible Spectrophotometer (Japan). 

Масс-спектры антибиотиков получены на приборе Ultraflex II MALDI ToF/ToF УBruker DaltoniсsФ (Германия), оснащенном УФ лазером 355 нм (Nd) в режиме получения положительных ионов с использованием рефлектрона. Точность измеренных масс составляла 0.001 %. 

ИК-спектры выделенных антибиотиков получали на приборе ИК-Фурье спектрометре Nicolet-iS10 (Thermo Fisher Scientific, США) с использованием детектора DTGS, светоделителя KBr, и приставки Smart Performer, оснащенной ZnSe кристаллом. Измерение проводили при разрешении 4 см-1; зона спектра 3000-650 см-1. Спектры обрабатывали с использованием программы OMNIC -7.0.

Аминокислотный состав антимикробных пептидов, полученных в ходе ОФ-ВЭЖХ анализа, определяли методом ионо-обменной хроматографии  на аминокислотном анализаторе Hitachi L-8800 (Япония) после полного кислотного гидролиза при следующих условиях: НСlконц.:ТФУ (2:1) с добавлением 0.01%-ного раствора -меркаптоэтанола в течение 1 ч при 155С. Объем вводимой пробы на колонку - 95 мкл (Spackman et al., 1958).

Изучение влияния ферментационных сред на биосинтез антибиотического комплекса, образуемого штаммом L. lactis subsp. lactis 194-К, проводили с использованием сред различного состава: среда №1 (г/л): глюкоза - 20,0; гидролизат казеина - 20,0; дрожжевой экстракт - 10,0; КН2РО4 - 30; MgSO4 - 0,2 (Tagg et al., 1976). №2 (г/л): меласса - 20,0; дрожжевой экстракт - 20,0; NH4Н2РО4- 20,0; K2SO4 - 10,0 (Кудряшов и др., 1995).  №3 (г/л): меласса - 20,0; дрожжевой экстракт - 20,0; КН2РО4 - 20,0 (Егоров и др., 1986). №4 (г/л): пептон - 4,5; сахароза - 10,0; дрожжевой экстракт - 10,0; КН2РО4 - 28,4; MgSO4 - 0,2; NaCl - 2,0 (Li et al., 2002).  №5 (г/л): глюкоза - 25,0; пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 10,0; ацетат натрия - 15,0; цитрат Na  - 15,0; K2HPO4 - 5,0; Na2 SO4 - 10,0 (Hirsh, 1981).  №6 (г/л):  сахароза -  20,0; дрожжевой экстракт - 20,0; KH2PO4 - 10,0; NaCl - 2,0; MgSO4 - 0,2 (Стоянова и др., 2006). №7 (г/л):  сахароза - 20,0; гидролизат казеина - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; K2HPO4 - 2,0; ацетат натрия - 5,0; MgSO4 - 0,2; MnSO4 - 0,5 (de Mann et al., 1960). №8 (г/л): сахароза - 26,8; триптон Ц5,0; дрожжевой экстракт - 10,0; твин-80 - 3,0; MgSO4 - 0,2; NaCl - 8,1; K2HPO4 Ц1,91 (Zhou et al., 2008).  Культивировали в стационарных условиях при 28С,  рН во всех  средах устанавливался на уровне 6.5-6.8. Ферментационная среда №6 являлась контрольной. 

Количественное содержание бактериоцина 194-D определяли с помощью ОФ-ВЭЖХ анализа по высоте соответствующего ему пика и выражали в оптических единицах в мл культуральной жидкости. Количественное содержание антибиотика 194-А определяли по фунгицидной активности в отношении A. niger в спиртовых концентратах бутанольных экстрактов и выражали в единицах активности по нистатину в мл КЖ.

Изучение влияния культуры штамма L. lactis subsp. lactis 194-К на проявление симптомов дерматоза проводили на самцах мышей линии CBRB-Rb (8.17)1Iem  (Моисеева и др., 2009)  в возрасте 23,01,3 недели, являющихся адекватной моделью спонтанных хронических заболеваний кожи - дерматозов, типа импетиго, эктимы, синдрома ошпаренной кожи. Мыши содержались в стандартных условиях вивария (вне SPF-specific pathogen free барьера). Животных кормили полнорационными гранулированными кормами. В качестве стандартной подкормки использовали зерновые каши (5 г  на мышь в день) с добавлением подсолнечного масла и витаминов А, Е, D, F; воду предоставляли без ограничений. Самцам опытной группы (n=17) ежедневно в течение четырех недель добавляли к подкормке культуру штамма 194-К  по 300 мкл на мышь в день. Оценку проявления симптомов дерматоза проводили двойным слепым методом раз в неделю у всех мышей индивидуально. Регистрировали следующие параметры: 1) вес животного, г; 2) степень изъязвления кожи на спине по 7-ми бальной шкале; 3) степень проявления алопеции на спине по 7-бальной шкале; 4) площадь пораженного участка спины, в мм2.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью программы Excel. Данные представляли как среднее стандартная ошибка среднего; статистическую значимость различий определяли по общепринятой методике с использованием t- критерия Стьюдента. Достоверность различий соответствовала p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение диссоциации популяции штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 и отбор наиболее активного диссоцианта

При рассеве на чашки Петри штамма  194 были отобраны несколько колоний с уровнем антибиотической активности от 2600 до 4100 МЕ/мл (табл.1). Наиболее активным диссоциантом была популяция, полученная из колонии №14, далее обозначенная как  вариант штамма L.  lactis subsp. lactis 194-К. Штамм 194-К обладал широким спектром антимикробного действия, эффективно подавлял рост грамположительных (Bacillus subtilis,  B. coagulans B. mycoides,  Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus), грамотрицательных бактерий (E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Comamonas terrigena) и обладал фунгицидной активностью в отношении грибов Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum  и дрожжей Candida tropicales, Rhodotorula aurantiaca, что является редким малоизвестным биологическим свойством для L. lactis subsp. lactis. Общая антибиотическая активность штамма 194-К в отношении грамположительных бактерий составляла 4100132  МЕ/мл (по низину), что было на 57% больше по сравнению с популяцией, полученной из колонии № 17 (рис. 1), в отношении грамотрицательных бактерий - 1630115 ед/мл (по левомицетину),  фунгицидная активность - 175193 ед/мл (по нистатину).

Выделение, очистка и идентификация антибиотических веществ, продуцируемых культурой Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К

В процессе нашего исследования была разработана схема выделения антибиотического комплекса, а также разделения и очистки отдельных антибиотиков (рис. 7).

  Табл. 1

Рост и антибиотическая активность разных колоний

штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 за 20 ч инкубирования

№ колонии	Морфология	рН	ОП540	Антибиотическая активность, МЕ/мл
10	короткие цепочки кокков (до четырех)	4,3	1,0	3000180
14	отдельные клетки  и цепочки кокков	4,5	1,15	4100132
17	отдельные клетки и цепочки из 4-8 кокков	4,5	1,05	2600155
18	короткие цепочки кокков и отдельные кокки	4,3	0,85	2700137
19	отдельные кокки и цепочки из 6-10 клеток	4,6	0.89	3600175
20	отдельные кокки  и цепочки разной длины	4,2	0,83	3100144
21	отдельные кокки и цепочки разной длины	4,4	1,0	3000100

В связи с тем, что часть антибиотиков всегда связана с клетками продуцента (Hurst, 1981; Yang et al., 1992) мы провели обработку культуры ацетон-уксусной смесью, цель которой заключалась в десорбции антибиотиков из клеток. После осаждения метанолом с последующим отделением осадка культуральная жидкость штамма 194-К была разделена на две фракции.

Биологический анализ фракций I и II (рис. 2) показал, что обе фракции содержали вещества, активные в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, а фракция II обладала  фунгицидной активностью. В результате хроматографического исследования полученных фракций было установлено, что фракция I содержала два полярных вещества, одно из которых мигрировало к аноду и имело пептидную природу (рис. 2б). Во фракции II содержались два электронейтральных вещества, одно из них с Rf=0.55-0.6 обладало выраженными гидрофобными свойствами (рис. 2а). Таким образом, в маточном растворе от осаждения (фракция II) содержались гидрофобные антибиотики, в осадке Цантибиотики пептидной природы (фракция I).

       

       

Рис. 2а        2б

Рис. 2. Биоавтография компонентов антибиотического комплекса, образуемого L. lactis subsp. lactis 194-К (тест-организм B. subtilis).

а) ТСХ в системе хлороформ-бензол-метанол 30:20:7; б) электрофорез.

Используя экстракцию н-бутанолом, нам удалось избавиться от минорного компонента 194-Е фракции II с Rf=0.15-2.0. С помощью колоночной хроматографии на силикагеле основной компонент этой фракции с Rf=0.55-0.6 был разделен на два гидрофобных антибиотика 194-А и 194-В. Их выделение и очистка до  индивидуальных веществ была проведена с помощью ОФ-ВЭЖХ, либо методом твердофазной экстракции (рис. 3).

Установлено, что антибиотик 194-А обладает фунгицидной активностью и слабой активностью в отношении грамположительных бактерий, а 194-В был активен в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий (табл. 2). Анализ фунгицидного антибиотика 194-А показал, что его молекулярная масса составила 290 Да.  В ИКЦспектре (рис. 4; табл. 2)  присутствовали следующие характеристические полосы поглощения (max, см-1): 3412 (альдегидная группа), 2958 (-CH3), 2923(-CH3), 2853 (-СН2-), 1738 (предельный алифатический альдегид), 1631 (альдегидная группа при двойной связи), 1466 (алкильный радикал в алкилбензоле), 1378 (метильная группа в алифатическом углеводороде), 1266 (альдегид), 1166 (-С(СН3)2), 1100 (CH-OH), 1073 (-C-OH), 949 (C-O-C), 721 (СНR1= CHR2).

Рис. 4. ИК-спектр фунгицидного антибиотика 194-А, образуемого L. lactis subsp. lactis 194-К.

Наличие перечисленных характеристических полос указывало, что данное вещество относится к альдегид-содержащим органическим соединениям алкил-фенильного ряда. Минимальная ингибирующая концентрация антибиотика 194-А в водном растворе в отношении таких микроорганизмов, как A. niger, A. repens, P. chrysogenum, C. tropicales составляла 0,25 мг/мл (рис. 5а, б).

 

Рис. 5а          5б

Рис. 5. Минимальная ингибирующая концентрация антибиотика 194-А в отношении микроскопических грибов: A. repens (а), P. chrysogenum (б).

Антибиотик 194-В представлял собой более высокомолекулярное вещество с молекулярной массой 879 Да в его инфракрасном спектре присутствововали характеристические полосы поглощения,  указывающие на ароматическую природу и непредельный храктер этого соединения (рис. 6; табл. 2).

Рис. 6. ИК-спектр антибиотика 194-В, образуемого L. lactis subsp. lactis 194-К.

Из литературы известно, что бактерии рода Lactococcus являются продуцентами практически важных антимикробных пептидов - бактериоцинов, имеющих относительно узкий спектр действия (Zendo et al., 2010). В немногочисленных работах, посвященных поиску штаммов лактококков, обладающих фунгицидной активностью (Batish et al., 1989; Florianowicz, 2001; Lertcanawanichakul, 2005) отсутствуют сведения о природе фунгицидных веществ. В нашей работе было показано, что природный штамм лактококка L. lactis subsp. lactis 194-К  продуцирует два гидрофобных антибиотика, один из которых обладает фунгицидной активностью.  Впервые с помощью ИК-спектроскопии была установлена природа фунгицидного антибиотика и показано, что он является альдегид-содержащим органическим соединениям алкил-фенильного ряда.

Выделение и изучение физико-химических свойств антимикробных пептидов (194-D  и низина А), продуцируемых культурой Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К.

Согласно данным литературы общие методы выделения бактериоцинов из культуральной жидкости  сводятся к осаждению пептидов и нескольких этапов  очистки с помощью катионо-обменной, гель-проникающей, обращенно-фазовой хроматографии (Carolissen-Mackay et al., 1997; Yamamoto et al., 2003; Yamazaki et al., 2005). Также могут использоваться различные стратегии для их выделения из сложных сред, основанные на использовании катионных характеристик (Venema et al., 1997; Cheigh et al., 2004).

Табл. 2

Физико-химические и биологичемские свойства антибиотиков 194-А и В

Физико-химические свойства	Компонент 194-А	Компонент 194-В
UV спектр (EtOH), max, нм	Нет	271
MALDI-MS (m/z) (M+H)+	290	879
ТСХ (Kieselgel-60), Rf в системе хлороформ-бензол- метанол (30:20:7)	0.63	0.57
ИК-спектр ( max, см-1)	3412сл, 2958, 2923, 2853, 1738, 1631сл, 1466, 1378, 1266сл, 1166, 1100, 1073, 949сл, 721сл	1667сл, 1454, 1143, 847сл, 801, 726, 669сл.
Антибактериальный спектр действия	Грамположительные бактерии: B. subtilis Микроскопические грибы: A. niger A. repens P. chrysogenum C. tropicales	Грамположительные бактерии: B. subtilis B. coagulans M. luteus S. aureus Грамотрицательные бактерии: E. coli C. terrigena
Растворимость	растворим в хлороформе, ацетонитриле, этилацетате; нерастворим в воде, водном этаноле	растворим в н-бутаноле, этилацетате, водном ацетонитриле; нерастворим в этаноле, воде

образуемых Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К

В нашем исследовании антибиотики пептидной природы, содержащиеся во фракции I (рис. 2б), выделяли с помощью препаративного изоэлектрофокусирования (ИЭФ), в котором разделение основано на разнице в электрических зарядах пептидных молекул. Примененный метод позволил нам выделить  два бактериоцина, поэтому его можно рекомендовать для выделения бактериоцинов из их смесей.

Рис. 7. Схема выделения и очистки компонентов антибиотического комплекса из культуры штамма  Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К.

В ходе работы было установлено, что L. lactis subsp. lactis 194-К образует два биологически активных вещества пептидной природы. Одно из них по времени выхода на ОФ-ВЭЖХ (рис. 8а; 16.2 мин)  и молекулярной массе (3353 Да) совпадало с аналогичными характеристиками (пик 1, рис. 8б) бактериоцина низина А (Zendo et al., 2010) и поэтому это вещество было нами идентифицировано как известный бактериоцин низин А.

Рис. 8а          Рис. 8б

Рис. 8. ОФ-ВЭЖХ анализ: а) фракция I после ИЭФ, содержащая антибиотик, образуемый Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К; б) антибиотик - стандарт низин А.

Другое антимикробное вещество, обозначенное как 194-D, содержалось в пике 2 (рис. 9а); его молекулярная масса составляла 2589 Да (рис. 9б). Для подтверждения пептидной природы антибиотика, содержащегося в пике 2 (рис. 9а) был проведен аминокислотный анализ этого соединения, который  показал, что в состав полипептида 194-D входят следующие аминокислоты: Асп, Тре, Сер, Глу, Про, Гли, Ала, Вал, Иле, Лей, Фен, Лиз, Трп в количественном соотношении 2:1:2:4:2:2:1:1:1:1:1:1:1. Отсутствие лантионина и относительно низкая молекулярная масса бактериоцина 194-D позволяет предположить, что он относится ко второму классу бактериоцинов.

Для идентификации выделенных антибиотиков по имеющимся физико-химическим характеристикам был проведен поиск аналогов по компьютерной базе данных (BNPD) природных биологически активных веществ (Berdy, 1994). По результатам анализа было сделано заключение, что компоненты 194-А, 194-В и D не имеют известных аналогов и являются новыми природными биологически активными веществами.

Полипептид 194-D,  в отличие от низина А, действующего только на грамположительные бактерии (Hurst, 1981), подавлял развитие как грамположительных (B. subtilis, B. coagulans, B. mycoides, Micrococcus luteus), так и грамотрицательных бактерий  (E. coli, Comamonas terrigena), что является редким и ценным свойством для антимикробных пептидов, синтезируемых бактериями подвида  L. lactis subsp. lactis.

Рис. 9а

Рис. 9. ОФ-ВЭЖХ анализ фракции, содержащей антимикробный полипептид 194-D (пик 2), образуемый Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К (а); б) масс-спектр пептида 194-D (б).

Имеются данные (Morgan et al., 1995) о способности штаммом L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis DPC938 образовывать несколько близкородственных бактериоцинов - лактококцинов A, B и М. В нашем исследовании впервые было показано, что штамм L. lactis subsp. lactis 194-К способен одновременно с лантибиотиком низином продуцировать еще другой тип бактериоцина.  Благодаря продукции двух разных бактериоцинов и двух гидрофобных антибиотиков, один из которых обладал фунгицидной активностью, штамм L. lactis subsp. lactis 194-К является уникальным. В связи с возможностью практического применения фунгицидного антибиотика 194-А и бактериоцина 194-D в дальнейшем было проведено исследование по изучению влияния состава ферментационных сред на их продукцию.

Изучение влияния ферментационных сред на биосинтез фунгицидного антибиотика 194-А и бактериоцина 194-D, образуемых Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К

актококки чрезвычайно требовательны к составу питательных сред, поэтому для их культивирования применяют комплексные среды, содержащие избыток белков и пептидов  (De Mann et al., 1960; Tagg et al., 1976). Из литературы были отобраны ряд оптимизированных сред, поддерживающие рост продуцента на оптимальном уровне и содержащие в качестве источника углерода либо очищенные сахара (сахароза, глюкоза), либо смесь сахаров в виде мелассы, а в качестве источников аминного азота в разных средах присутствовал дрожжевой экстракт, гидролизат казеина, пептон, соли аммония.

Культивирование штамма L. lactis subsp. lactis 194-К показало, что на всех отобранных средах поддерживался высокий уровень роста продуцента и накопления антибиотиков. Наибольшая общая антибиотическая активность к 23 ч роста культуры была зафиксирована на средах № 1, 2, 4, 7, 8 и составляла от 4375 до 4700 МЕ/мл по низину. Этот факт говорит о том, что биосинтетическая активность штамма поддерживается как при росте на богатых средах  № 1, 4, 6, 7, 8, содержащих комбинации дрожжевого экстракта с пептоном, триптоном, либо гидролизатом казеина, так и на относительно бедных средах (среда №2, №3) с мелассой и дрожжевым экстрактом. Наибольшая фунгицидная активность, которая составляла 2434 ед/мл, была зафиксирована на среде №1, содержащей глюкозу, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина и фосфат калия (табл. 3).

В ходе исследования было установлено, что оптимальной для образования бактериоцина 194-D также являлась среда №1,  на которой его количество в культуре штамма 194-К превышало содержание низина А в 1123 раза и составляло 1683 ОЕ/мл (табл. 3). Это говорит о том, что низин А является минорным компонентом в антибиотическом комплексе штамма 194-К. Было замечено, что оба бактериоцина в разном соотношении присутствовали на всех средах только в клеточных экстрактах (табл. 4).  В нативном растворе культуральной жидкости был обнаружен только новый бактериоцин 194-D.

Содержание бактериоцина 194-D на среде №1 было больше в 3,7 раз, а фунгицидная активность была выше на 39% по сравнению с контрольной средой №6. Возможно, это объясняется присутствием гидролизата казеина, олигопептиды которого являются основным источником азота для лактококков  (Juillard et al., 1995), и повышенного содержания фосфата калия, необходимого для многих внутриклеточных биосинтетических процессов.

Табл. 3

Влияние среды культивирования на фунгицидную активность штамма

Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К  (тест-организм Aspergillus niger)

Среда культивирования	Рост, ОП540	Фунгицидная активность по нистатину, ед/мл
№1	1,390,23	2434254
№2	1,120,08	9012
№3	1,500,18	0
№4	1,430,12	1565133
№5	1,100,13	66785
№6	1,410,18	175193
№7	1,250,14	184555
№8	1,480,10	119099

Табл. 4

Влияние среды культивирования на количественное содержание бактериоцинов

(194-D и низина А) в культуральной жидкости  Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К  (в клетках и нативном растворе)

Среда культивирования	Количественное содержание бактериоцинов, ОЕ/мл*
	Нативный раствор		Клетки
	194-D,	Низин А	194-D1	Низин А
№1	1683117	-	2.20.05	1.50.05
№2	543103	-	2.60.05	2.00.24
№3	46549	-	1.20.14	1.900.09
№4	68765	-	1.60.05	1.70.09
№5	81375	-	2.10.19	1.20.05
№6	456 39	-	-	1.20.03
№7	93334	-	1.3	0.930.02
№8	75819	-	2.40.09	1.20.09

Результаты исследований по культивированию штамма 194-К на оптимальной среде  № 1 в течение 30 ч показали, что синтез бактериоцина 194-D осуществлялся параллельно росту штамма, а синтез фунгицидного антибиотика 194-А начинался после 3-х ч инкубирования. Максимальное накопление обоих антибиотиков достигалось к 20 ч роста культуры (рис. 10).

Рис. 10.  Динамика образования бактериоцина 194-D и фунгицидного антибиотика 194-А при росте Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К на среде 1 c  гидролизатом казеина, дрожжевым экстрактом  и глюкозой.

Изучение влияния культуры штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К на проявление симптомов спонтанного хронического дерматоза мышей

Возможным практическим применением культуры штамма L. lactis subsp. lactis 194-К, содержащей несколько новых антимикробных веществ, является создание на ее основе  метаболитного пробиотика - препарата, содержащего антимикробные вещества, образуемые симбионтными бактериями. Известно, что такие препараты положительно влияют как на физиологические функции, так и на биохимические реакции макроорганизма (Бондаренко, 2005). Значительное преимущество метаболитных пробиотиков заключается в возможности их применения вместе с антибактериальными препаратами у больных, нуждающихся в повторных курсах антибиотикотерапии. Действие метаболитных пробиотиков реализуется не только как восстанавливающее по отношению к нарушенному микробиоценозу, но и как профилактическое, препятствуя усиленному размножению условно-патогенной флоры кишечника, которое наблюдается при наличие хронических заболеваний.  В настоящее время лекарственные препараты, содержащие метаболиты и микробные фракции, используются для терапии и профилактики дисфункций пищеварительного тракта, при нарушении липидного обмена, болезнях кожи (Молохова и др., 2010). В связи с этим было проведено изучение свойств культуры штамма 194-К в опытах in vivo.

В нашем исследовании в качестве экспериментальных животных были выбраны мыши линии CBRB-Rb (8.17)1Iem , являющиеся адекватной моделью хронических воспалительных заболеваний кожи - дерматозов (Моисеева и др., 2009). Дерматозы - это комплексные  заболевания, в развитии которых участвуют генетические (чувствительность к аллергенам, дефектная функция кожного барьера, нарушение иммунологических реакций) и инфекционные факторы (Leung et al., 2004). Важным свойством данной модели животных являлась ее наглядность, которая позволяла легко фиксировать изменения, происходящие с животными в процессе приема препарата. Мы предположили, что антимикробные вещества, входящие в состав культуры штамма 194-К, за счет улучшения микроэкологического состояния кишечника могут  привезти к улучшению состояния кожных покровов животных.

В результате проведенного исследования было показано, что ежедневное употребление мышами культуры L. lactis subsp. lactis 194-К per os уже через одну неделю привело к улучшению состояния кожи спины: изъязвления на спине у опытных животных были выражены в среднем на 80% меньше (рис. 11а; р=0,001); по сравнению с контрольными животными улучшилось и состояние шерстного покрова (рис. 11б, р=0,02); площадь пораженного участка спины в среднем была меньше, чем у контрольных животных на 24% (рис. 11в; р=0,01). Наименьшая степень проявления алопеции в опытной группе наблюдалась через две недели применения культуры штамма, когда уменьшение по сравнению с началом эксперимента составило 18% (рис. 11б, р=0,04). Опираясь на полученные результаты, мы можем говорить о том, что культура штамма 194-К может быть использована для лечения воспалительных заболеваний кожи.

ВЫВОДЫ

ВЫВОДЫ:

1. Изучена диссоциация  штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 и выделен активный вариант 194-К, обладающий широким спектром антибактериального и фунгицидного действия с антибиотической активностью порядка 4000 МЕ/мл по низину и 1750 ед/мл по нистатину. 
2. Разработана схема выделения  и очистки двух бактериоцинов (низина А и 194-D) и антибиотиков гидрофобной природы (194-А и В), изучены их физико-химические и биологические свойства,  позволяющие  заключить, что антибиотики 194-А, В и D являются новыми и не имеют известных аналогов в компьютерной базе данных биологически активных веществ (BNPD).
3. Установлено, что активный вариант 194-К синтезирует  новый  бактериоцин 194-D

(М= 2589 Да),  который в отличие от низина А подавляет рост как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий.

4. Фунгицидный антибиотик 194-А является альдегид-содержащим органическим соединениям алкил-фенильного ряда с молекулярной массой 290 Да. 
5. Антибиотик 194-В с молекулярной массой 879 Да активен в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и по химической природе является ароматическим соединением непредельного характера.
6. Показано, что оптимальной для образования фунгицидного антибиотика 194-А и нового бактериоцина 194-D является среда, содержащая гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, глюкозу и фосфат калия, которая способствует увеличению фунгицидной активности на 39%, а продукции нового бактериоцина 194-D в 3,7 раз.
7. Показана эффективность культуры штамма 194-К для лечения хронического дерматоза у мышей  линии CBRB-Rb (8.17)1Iem.

Список работ, опубликованных  в рецензируемых журналах, рекомендуемых  ВАК РФ

1. Тренина М. А., Складнев Д. А.,  Бронников С. В.,  Стоянова Л. Г., Устюгова Е.А. 2009. Развитие популяций бактерий Lactococcus lactis ssp. lactis на агаризованных средах // Экология и промышленность России. №5. C. 42-46.
2. Stoyanova L.G., Ustyugova E.A., Sultimova T.D., Bilanenko E.N., Fedorova G.B., Katrukha G.S., Netrusov A.I. 2010. New antifungal bacteriocin-synthesizing strains of Lactococcus lactis ssp. lactis as the perspective biopreservatives for protection of raw smoked sausages  // Am. J. Agricult. Biol. Sci. V. 5. No4. P. 477-485.
3. Устюгова Е. А., Федорова Г. Б.,  Катруха Г. С., Стоянова Л. Г.  2011.  Изучение антибиотического комплекса, образуемого Lactococcus lactis subsp. lactis 194  вариант-К // Микробиология. Т. 80. №5. С. 644-650.
4. Стоянова Л. Г., Устюгова Е. А., Нетрусов А. И. Антимикробные метаболиты молочнокислых бактерий: разнообразие и свойства (обзор) // Прикл. Биохим. Микробиол. 2012. Т. 48. №3. С. 259-275.
5. Устюгова Е. А., Тимофеева А.В., Стоянова Л.Г., Нетрусов А.И., Катруха Г.С. Характеристика и идентификация бактериоцинов, образуемых Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K // Прикл. Биохим. Микробиол. 2012. Т. 48. №6. С. 618-625.
6. Моисеева Е.В., Устюгова Е.А., Семушина С.Г., Аронов Д.А., Стоянова Л.Г. 2012. Влияние культуры Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K на проявление симптомов спонтанного хронического дерматоза // Фундаментальные исследования, №6. С. 333-337.

Тезисы докладов

1. Устюгова Е.А. (2009). Новый антибиотический комплекс, синтезируемый природным штаммом Lactococcus lactis ssp. lactis194. Тезисы докладов международной  конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2009, Москва. C. 173.
2. Устюгова Е.А., Федорова Г.Б., Катруха Г.С., Стоянова Л.Г. (2009). Lactococcus lactis ssp. lactis194- продуцент антибиотика широкого спектра действия. Тезисы докладов Всероссийского симпозиума Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов, Москва. С. 184.
3. Устюгова Е.А. Стоянова Л.Г. (2009). Новый фунгицидный биоконсервант, продуцируемый Lactococcus lactis ssp. lactis 194. Тезисы III научно-практической конференции Перспективы развития инноваций в биологии, Москва. С. 164.
4. Stoyanova L.G., Ustyugova E.A.,  Sultimova T.D., Netrusov A.I. (2009). New antifungal bacteriocin synthesizing strains of Lactococcus  lactis ssp. lactis as the perspective biopreservatives for protection of raw smoked sausages. Abstract of the III Int. Conf.  Environ, Indust. and Appl. Microbiol,  Portugal, Lisboan. Р. 326.
5. Устюгова Е.А., Федорова Г.Б., Катруха Г.С., Стоянова Л.Г. (2010). Синтез антибиотика широкого спектра действия Lactococcus  lactis ssp. lactis. Тезисы VII международной конференции Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии, Минск. С. 168-170.
6. Устюгова Е.А., Федорова Г.Б., Стоянова Л.Г., Катруха Г.С., Сультимова Т.Д. (2011). Исследование наиболее перспективных для пищевой промышленности антибиотиков, образуемых природным штаммом Lactococcus lactis ssp. lactis194. Материалы VI московского международного конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития, Москва. С. 137.
7. Устюгова Е.А., Тимофеева А.В., Стоянова Л.Г., Федорова Г.Б., Катруха Г.С. (2012) Бактериоцины, образуемые Lactococcus lactis ssp. lactis 194-К с широким спектром антимикробного действия. Материалы Московской международной научно-практической конференции Фармацевтические и медицинские биотехнологии, Москва. С. 147.
8. Моисеева Е.В.,  Устюгова Е.А.,  Семушина С.Г.,  Аронов Д.А., Стоянова Л.Г. (2012). Влияние культуры Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К на проявление симптомов хронического дерматита у самцов мышей линии CBRB. Материалы ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням, Москва. С. 61.

Автор приносит благодарность Федоровой Г.Б. (НИИ по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе РАМН) за  помощь в выделении и идентификации антибиотических веществ, Тимофеевой А.В. и Ксенофонтову А.Л. (НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского) за проведение ОФ-ВЭЖХ и анализа аминокислотного состава пептидов, а также Хряповой Е.В. (НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН) за масс-спектрометрический анализ выделенных антибиотиков. 

 

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии