Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Быстрова Марина Федоровна
СИГНАЛЬНЫЕ БЕЛКИ ХЕМОСЕНСОРНЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ
03.01.02 - биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Пущино - 2011
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биофизики клетки РАН, Пущино.
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Колесников Станислав Сергеевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Озолинь Ольга Николаевна доктор биологических наук, профессор Авдонин Павел Владимирович доктор биологических наук Плеснева Светлана Александровна
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН
Защита состоится " 18 " января 2012 г. в 15 ч. 30 мин.
на заседании совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.
Автореферат разослан________________________
Ученый секретарь диссертационного совета к.ф.-м. н. Н.Ф. Ланина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Вкус и обоняние наряду со зрением, осязанием и слухом составляют пять основных чувств, которые обеспечивают позвоночным жизненно важную информацию об окружающем мире. Обонятельная система животных способна детектировать тысячи запахов в широчайшем диапазоне концентраций с чувствительностью, предполагающей, что связывание одиночных молекул пахучего вещества на поверхности обонятельных цилий вызывает физиологически значимые ответы. Способность обонятельной системы распознавать широчайшее многообразие стимулов в значительной степени является следствием большого количества рецепторов запахов. Достаточно сказать, что гены этих рецепторов составляют самое большое семейство в геномах позвоночных. С молекулярной точки зрения вкусовая система кажется намного проще. Имеются всего пять базовых модальностей вкуса - горький, сладкий, соленый, кислый и умами, и вкусовые вещества распознаются весьма небольшим количеством молекулярных рецепторов: к настоящему моменту идентифицированы порядка 30 относительно специализированных рецепторов горького, один универсальный рецептор сладкого и один универсальный рецептор аминокислот. Несколько ионных каналов рассматриваются как рецепторы соленых и кислых стимулов. Тем не менее, по сравнению с обонятельной системой, механизмы детекции вкусовых стимулов, а главное принципы кодирования вкусовой информации изучены гораздо слабее. Распознавание химического стимула - молекулы запаха или вкусового вещества - сенсорными системами животных представляет собой сложнейший процесс, который начинается со связывания молекулы вещества на поверхности специализированных хемосенсорных клеток, вовлекает внутриклеточные системы усиления сигнала и кодирования сенсорной информации в виде электрического импульса и заканчивается анализом информации в мозге. Определяющими в этой цепочке являются разнообразные рецепторные, сигнальные и канальные белки, исследованию которых посвящена данная диссертация. В последние годы, с выявлением роли пероксида водорода как вторичного посредника, запускающего редокс-чувствительные процессы фосфорилирования-дефосфорилирования в клетке, все более актуальной становится задача исследования белков, вовлеченных в процесс редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации, и выявления их роли в функционировании хемосенсорных клеток. Это тем более важно, что процессы дифференцировки хемосенсорных клеток контролируются разнообразными факторами роста, в развитии эффектов которых ключевую роль играет редокс-сигнализация.
Объектом исследования данной работы были обонятельные сенсорные нейроны главного обонятельного эпителия и вкусовые клетки, входящие в состав вкусовых почек желобоватого, листовидного и грибовидного сосочков языка.
Анализ физиологических процессов в периферических сенсорных органах затруднен тем, что исследователь сталкивается с гетерогенной клеточной популяцией. Вкусовая ткань организована в виде гетерогенных включений в эпителиальную и мышечную ткани, так что выделение функциональных вкусовых клеток - весьма тонкая и трудно воспроизводимая процедура. Выделение обонятельных нейронов из ткани обонятельного эпителия, в котором присутствуют опорные и базальные клетки, также достаточно сложная задача.
Между тем многие детали вкусовой и обонятельной трансдукции требуют анализа на уровне индивидуальных хемосенсорных клеток. Работы по исследованию сигнальных белков, вовлеченных в трансдукцию вкусовых и обонятельных стимулов, ведутся, как правило, на ткани, группе клеток, клеточной культуре.
Однако сложно получить представление об индивидуальной клетке, оценивая клеточную популяцию, поскольку в результате мы получаем усредненную информацию о вероятном состоянии среднестатистической клетки, а поведение единичных клеток может совершенно отличаться от популяционного большинства. Поэтому актуальной является задача разработки подходов, которые позволили бы исследовать сигнальные системы на уровне одиночных хемосенсорных клеток.
Цель работы состояла в молекулярной идентификации белков, вовлеченных в сигнальные процессы в хемосенсорных клетках. В процессе выполнения работы решались следующие задачи:
1. Идентифицировать на уровне транскриптов (ОТ-ПЦР) и на уровне белков (иммуногистохимия и иммуноцитохимия) некоторые рецепторные (P2Y, CASR, GPRC6A, T1R), сигнальные (гастдуцин, фосфолипазы) и канальные (TRPM5, Cav1, коннексины, паннексин 1) белки, вовлеченные в сигнальные процессы во вкусовых клетках.
2. Отработать методологические подходы для анализа одиночных хемосенсорных клеток, которые позволили бы изучить профиль транскриптов, присутствующих в функционально-идентифицированных вкусовых клетках и обонятельных нейронах. Как дополнение электрофизиологического портрета клетки необходимо было создать ее молекулярный портрет.
3. Исследовать белок-белковые взаимодействия в обонятельном эпителии крысы с использованием в качестве наживки белка из семейства пероксиредоксинов, вовлеченных в процессы редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации.
4. Провести исследования по локализации обонятельного маркерного белка в тканях с эктопической экспрессией генов обонятельных рецепторов.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Данная работа посвящена идентификации сигнальных молекул в хемосенсорных клетках путем экспрессионного анализа и исследования белокбелковых взаимодействий. Впервые показано, что во вкусовых клетках функционируют множественные метаботропные пуринорецепторы, включая P2Y1, P2Y2, P2Y4 и P2Y6. Впервые во вкусовых клетках типа II обнаружены транскрипты канальных белков коннексинов 26, 30.3, 31.1, 33, 36, 43 и паннексина 1. Впервые специфический маркер зрелых обонятельных нейронов OMP обнаружен во вкусовых клетках желобоватого вкусового сосочка языка.
Установлены новые потенциальные партнеры по взаимодействию с пероксиредоксином 6 в обонятельном эпителии крысы. Все они оказались редоксчувствительными белками. Относительно функционального характера многочисленности белок-белковых взаимодействий пероксиредоксина 6 была высказана гипотеза, которая разрешает существующую неопределенность относительно природы нативного восстанавливающего субстрата этого фермента.
Впервые в обонятельном эпителии крысы обнаружен пероксиредоксин 1.
Впервые проведен анализ ко-локализации транскриптов всех шести генов семейства пероксиредоксинов на уровне одиночной клетки.
Разработана методология исследования профиля экспрессии генов в одиночных хемосенсорных клетках, основанная на глобальной амплификации мРНК. Сформирована стратегия экспрессионного анализа генов, имеющих процессированные псевдогены или не содержащих интроны, на уровне одиночной клетки. Впервые обнаружены многочисленные вариации в репертуаре транскриптов генов сигнальных белков в хемосенсорных клетках. Показано, что результаты, полученные на клеточной популяции и на одиночных клетках, требуют различной интерпретации. В частности, получены доказательства, что усредненные измерения, сделанные на группе клеток, могут не отражать поведения популяционного большинства.
В работе решались вопросы, связанные с такой фундаментальной проблемой, как проявление флуктуаций в биологических системах. Исследование одиночных клеток позволило получить данные, подтверждающие концепцию стохастической экспрессии генов. Для объяснения обнаруженной гетерогенности популяции обонятельных нейронов выдвинуто предположение, что индивидуальные клетки имеют вероятностный фенотип.
Теоретические и практические результаты работы могут иметь приложение к изучению процесса экспрессии генов в клетках млекопитающих. Проведенные исследования углубляют наши знания о молекулярных и клеточных механизмах функционирования обонятельной и вкусовой систем. Новые подходы и модификации известных процедур, предложенные в работе, могут быть использованы в различных молекулярно-биологических и биофизических исследованиях.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на ежегодных конференциях ИБК РАН, на конференциях Рецепция и внутриклеточная сигнализация (Пущино, 2009) и Биологическая подвижность (Пущино, 2008), 4 съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), симпозиумах От экспериментальной биологии к превентативной и интегративной медицине (Украина, 2007, 2008), на III симпозиуме Белки и пептиды (Пущино, 2007), IV Европейском биофизическом конгрессе (Испания, 2003), международной конференции The 1st Pacific-Rim International Conference on Protein Science (Япония, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 28 работ, из них статьи опубликованы в изданиях, рекомендованных ВАК, 3 обзорных публикации и 5 статей в сборниках.
ичный вклад автора. Экспериментальный материал получен лично автором или совместно с аспирантами ИБК РАН под руководством автора. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Структура работы. Диссертация изложена на 230 страницах, включает в себя стандартные разделы и иллюстрирована 6 таблицами и 82 рисунками Библиография включает 432 названия.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
.
1. Исследование сигнальных белков вкусовых клеток на уровне ткани.
1.1.Пуринергическая сигнальная система.
Исследование физиологии периферического вкусового анализатора показывает, что клетки вкусовой почки коммуницируют между собой. Какие молекулярные механизмы лежат в основе этих коммуникаций? Какие сигнальные системы вовлечены в эти процессы? В настоящее время считается установленным, что АТФ является афферентным нейротрансмиттером и ключевой сигнальной молекулой в паракринных регуляциях во вкусовой почке.
Это делает актуальной задачу выяснения рецепторных механизмов детекции экстраклеточного АТФ во вкусовой почке и механизмов секреции АТФ.
Рис. 1. ОТ-ПЦР анализ экспрессии во вкусовой ткани генов рецепторов семейства P2Y. (А-В) Детекция P2Y1/2/4/6/-транскриптов в препаратах РНК, выделенной из одиночных листовидного (А) и желобоватого (Б) сосочков и эпителия языка, не содержащего вкусовой ткани (В), с помощью ОТ-ПЦР. Выявлены ампликоны P2Y1 (288 п.н.), P2Y2 (280 п.н.), P2Y4 (2п.н.) и P2Y6 (163 п.н.). Фрагмент P2Y(411 п.н.) не выявлен в препаратах РНК вкусовой ткани и эпителия, но детектируется в препарате РНК, выделенной из тромбоцитов (Г).
Представлены типичные результаты одного из 5-7 независимых экспериментов.
К моменту выполнения данной работы было известно, что вкусовые клетки млекопитающих отвечают на внеклеточный ATФ и другие нуклеотиды мобилизацией внутриклеточного кальция. Ряд физиологических фактов свидетельствовал о том, что чувствительность вкусовых клеток к нуклеотидам обусловлена метаботропными пуринорецепторами P2Y типа, сопряженнными с фосфоинозитидным каскадом, в то время как вклад ионотропных P2X рецепторов пренебрежительно мал (Kim et al., 2000, Baryshnikov et al., 2003). С помощью экспрессионного анализа мы выявили во вкусовой ткани транскрипты генов рецепторов P2Y1, P2Y2, P2Y4 и P2Y6 (Рис.1А, Б). Однако та же самая композиция транскриптов была обнаружена и в эпителии языка (Рис. 1В).
Рис. 2. Специфическая иммунофлуоресценция, детектируемая во вкусовых почках и в эпителии при обработке среза желобоватого вкусового сосочка языка мыши антителами к P2Yи вторичными антителами, меченными AlexaFluor-488 (левая панель). Для сравнения при использовании антител к фосфолипазе С2 (маркеру клеток типа II) флуоресценция на срезе локализована в отдельных вкусовых клетках (правая панель).
Рис. 3. Специфическая иммунофлуоресценция вкусовых клеток и почек, при обработке антителами к рецептору P2Y2 и вторичными антителами, меченными AlexaFluor-488, кроме клетки в (А, б). (А) Отдельные вкусовые клетки, выделенные из желобоватого (а, б) и листовидного (в) сосочков. В (а) и (б) слева представлено изображение клетки в проходящем свете, а справа - ее флуоресцентное изображение. (б) Контрольная клетка, не обработанная вторичными антителами, интенсивность возбуждения вдвое выше, чем в остальных случаях. (Б) Конфокальное изображение отдельных вкусовых почек, выделенных из желобоватого (а) и листовидного (б) сосочков.
Заметим, что ни один из существующих методов не позволяет выделить вкусовую ткань без примесей эпителиальной и соединительной тканей, которые в принципе также могут быть источником РНК в препарате вкусовой ткани. Тем не менее, присутствие именно этих рецепторов во вкусовых клетках вполне объясняет их чувствительность к AТФ, УTФ, AДФ и УДФ. Чувствительность вкусовых клеток была практически одинакова и максимальна к ATФ, УTФ и BzATФ в физиологических экспериментах с использованием микрофотометрии, что могло быть только в случае, если доминантными являются рецепторы типа P2Y2 и P2Y4. Поэтому мы провели иммуногистохимические исследования различных препаратов вкусовой ткани с использованием антител к этим пуринорецепторам. Иммунохимические эксперименты, проведенные на срезах языка, показали, что иммунофлуоресценция вкусовой ткани плохо различима на фоне эпителиальной, соседствующей с ней (Рис. 2). Поэтому мы отработали методику иммунохимического окрашивания отдельных вкусовых почек и клеток (Рис. 3, 4).
Рис. 4. Специфическая иммунофлуоресценция, полученная при использовании антител к рецептору P2Y4 и вторичных антител, меченных AlexaFluor-488. (А) Конфокальное изображение отдельных вкусовых почек (а, б) и флуоресцентное изображение вкусовых клеток (в, г), выделенных из желобоватого (а, в) и листовидного (б, г) сосочков. (Б) Препарат диссоциированных вкусовых сосочков. Процент одиночных вкусовых клеток, показывающих иммунореактивность с антителами к P2Y2 либо к P2Y4, n означает число индивидуальных клеток, анализировавшихся в каждом случае.
Вкусовые почки и клетки выделялись из сосочков двух типов - желобоватого и листовидного. Клетки, обработанные антителами к P2Y2, демонстрировали высокий уровень флуоресценции, возбуждаемой при 48010 нм и регистрируемой в области 52015 нм (Рис.3Аа,в), в то время как в контроле необработанные клетки показывали едва различимую автофлуоресценцию (Рис.
3Аб). Как показал подсчет одиночных клеток, демонстрирующих специфическую иммунофлуоресценцию, в препарате диссоциированных вкусовых сосочков не менее половины клеток содержат P2Y2 и/или P2Y4 рецепторы (Рис. 4 Б).
Следующим этапом работы была молекулярная идентификация АТФпроницаемых ионных каналов, функционирующих во вкусовой ткани.
Предпосылкой для этих исследований были физиологические данные, показывающие, что вкусовые клетки типа II высвобождают афферентный нейротрансмиттер АТФ в ответ на их стимуляцию (Romanov et al., 2007; 2008;
Huang et al., 2007). Целый ряд фактов свидетельствовал против везикулярного механизма выброса АТФ, но в пользу ионных каналов. Известно, что клетки млекопитающих могут выбрасывать АТФ через полупоры, образованные белками щелевых контактов коннексинами (Cx) и паннексином 1 (Px1) (Stout et al., 2002;
Tran Van Nhieu et al., 2003; D'hondt et al., 2011). С помощью метода ОТ-ПЦР мы обнаружили в препаратах желобоватых вкусовых сосочков языка мыши транскрипты Cx26, 30.3, 31.1, 33, 36, 43 и Px1. На срезах желобоватого сосочка языка с использованием метода двойной иммунофлуоресценции была показана ко-локолизация паннексина 1 и специфических маркеров клеток типа II - фосфолипазы С2 и канального белка TRPM5. В заключительной части работы приведены доказательства ко-локализации всех идентифицированных молекул в одиночных вкусовых клетках типа II (Рис. 16).
1.2. Анализ экспрессии во вкусовой ткани генов, кодирующих 1субъединицу Са2+-каналов L-типа.
Характерной особенностью вкусовых клеток типа III является то, что во вкусовой почке только они образуют классические химические синапсы с окончаниями афферентного вкусового нерва и используют экзоцитозный механизм освобождения нейротрансмиттера. Классический экзоцитоз запускается при активации потенциал-зависимых (ПЗ) кальциевых каналов с последующим входом в клетку наружного кальция в ответ на деполяризацию пресинаптической мембраны. Это делает актуальной задачу идентификации ПЗ кальциевых каналов, оперирующих во вкусовых клетках. К моменту проведения данной работы было известно, что ПЗ Ca2+-токи присутствуют только во вкусовых клетках типа III и переносятся преимущественно Ca2+-каналами L-типа (Romanov, Kolesnikov, 2006).
В структурном отношении ПЗ Са2+-канал представляет собой гетероолигомер, образованный пятью субъединицами: 1, 2/, и, из которых только 1субъединица формирует трансмембранную водную пору, а остальные субъединицы - регуляторные (Miller, 2001). У млекопитающих 1-субъединицы кодируются 10 генами. Из них четыре гена (1S,1C,1D и 1F) кодируют 1субъединицы, формирующие Са2+-каналы L-типа (Саv1.1-Саv1.4) (Dooley et al, 2007), которые несут сайты связывания дигидропиридинов (Felix, 2005).
Электрофизиологические эксперименты однозначно свидетельствовали о том, что во вкусовых клетках функционируют медленно инактивирующиеся ПЗ Са2+каналы с низкой чувствительностью к нифедипину (Romanov, Kolesnikov, 2006).
Впервые такие каналы были функционально идентифицированы в фоторецепторных и биполярных клетках сетчатки. Показано, что в этих клетках 1-субъединица кодируется геном 1F (Taylor & Morgans, 1998; Wilkinson & Barnes, 1996; Berntson et al., 2003; Koschak et al., 2003). В связи с этим мы первоначально предположили, что именно 1F должен быть экспрессирован во вкусовых клетках мыши. Учитывая возможность альтернативного сплайсинга (Kotturi & Jefferies, 2005), для анализа экспрессии 1F методом ОТ-ПЦР мы сконструировали три пары праймеров, фланкирующих различные участки этого гена. Фрагменты ожидаемого размера были получены при использовании в качестве матрицы РНК, выделенной из сетчатки. Однако во вкусовой ткани транскрипты 1F обнаружены не были (Рис. 5). Эти результаты свидетельствовали о том, Са2+-канал L-типа во вкусовых клетках может формироваться при участии одной или нескольких 1-субъединиц (Саv1.1- Саv1.3), кодируемых соответственно тремя другими генами: 1S, 1C или 1D.
Рисунок 5. ОТ-ПЦР анализ экспрессии 1F в сетчатке (дорожки 1, 3, 5) и желобоватом сосочке языка (дорожки 2, 4, 6) с использованием ген-специфических праймеров, фланкирующих различные участки последовательности 1F (левая панель). ОТ-ПЦР анализ экспрессии во вкусовой ткани 1C (дорожка 1), 1D (дорожка 2) и 1S (дорожка 3) (правая панель). Электрофореграмма разделения продуктов ОТ-ПЦР в 1% агарозном геле. Представлены типичные результаты одного из 5 независимых экспериментов.
В результате мы обнаружили, что во вкусовой ткани мыши экспрессированы только 1C и 1D (Рис. 5), причем ампликон 1C (дорожка 1, ожидаемый размер фрагмента 485 п.н.) был гораздо интенсивнее по сравнению с ампликоном a1D (дорожка 2, ожидаемый размер фрагмента 332 п.н.). Поэтому представлялось интересным оценить на количественном уровне относительное содержание транскриптов 1C и 1D во вкусовой ткани мыши. Для этого был использован подход альтернативный методу ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Этот подход заключается в конструировании клонотеки комплементарных ДНК, изолированных из вкусовой ткани с использованием ОТПЦР и вырожденных праймеров, способных узнавать все три последовательности: 1S, 1С и 1D, с последующей идентификацией индивидуальных клонов методом рестрикционного анализа. Учитывая, что во вкусовой ткани экспрессированы гены двух белков, полученный с помощью вырожденных праймеров продукт ОТ-ПЦР теоретически должен содержать смесь ампликонов 1С (927 п.н) и 1D (933 п.н.). Фрагменты, полученные в результате ОТ-ПЦР с вырожденными праймерами, были лигированы в плазмиду pGEMT/easy, и лигазной смесью трансформированы клетки E. coli штамм Top 10.
Рекомбинантные плазмиды, выделенные из 50 колоний, были подвергнуты рестрикционному анализу с использованием эндонуклеаз BstXI и NcoI, который показал наличие вставки, соответствующей a1C во всех плазмидах.
Рисунок 6. Клонирование фрагмента ОТ-ПЦР, амплифицированного с помощью вырожденных праймеров в плазмиду pGEM-T easy.
Дорожка 1 - рекомбинантная плазмида pGEMT/Саv до рестрикции; дорожка 2 - рестрикция рекомбинантной плазмиды pGEM-T/Саv эндонуклеазой EcoRI показывает наличие вставки ожидаемого размера приблизительно 1000 п.н.
Что если вырожденные праймеры, теоретически узнающие последовательности 1С и 1D, на практике не позволяли амплифицировать последовательность 1D? Для проверки такой возможности мы провели обратную транскрипцию с использованием ген-специфического обратного праймера для Сконцевого участка 1D, а затем первую цепь кДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР с вырожденными праймерами. В итоге был амплифицирован ПЦР-фрагмент ожидаемого размера приблизительно 933 п.н., хотя и слабой интенсивности. Таким образом, можно сделать вывод о существенно более высоком содержании во вкусовой ткани транскриптов 1С по сравнению с 1D.
1.3. Идентификация во вкусовой ткани гептаспиральных рецепторов аминокислот.
Большой вклад в понимание процесса вкусовой трансдукции внесли физиологические исследования на трансгенных и нокаутных животных, которые показали, что вкусовые рецепторы семейства T1R ответственны за восприятие сладких стимулов и аминокислот, а рецепторы T2R детектируют горькие вещества. Между тем, генетический нокаут T1R1/T1R3, образующих гетеродимерный рецептор аминокислот, не приводит к полной потери чувствительности этой модальности. Тоже самое характерно для T1R2/T1R3 - cладкочувствующего рецептора. Это делает актуальным исследование альтернативных механизмов восприятия периферической вкусовой системой стимулов указанных модальностей. Вкусовые рецепторы типа T1R являются представителями класса С суперсемейства гептаспиральных рецепторов, сопряженных с G-белками. Из рецепторов класса С эволюционно к вкусовым рецепторам наиболее близки мультимодальный рецептор экстраклеточного кальция (CASR) и рецептор GPRC6A, которые могут претендовать на роль рецепторов аминокислот, разумеется, при условии, что они локализованы во вкусовых клетках. С помощью ОТ-ПЦР анализа мы выявили транскрипты CASR исключительно во вкусовых сосочках, в то время как транскрипты GPRC6A были обнаружены не только во вкусовой ткани, но и в окружающем ее эпителии языка.
Рис. 7. ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов, кодирующих рецепторы CASR (А) и GPRC6A (Б), в препаратах эпителиальной ткани языка и желобоватого, листовидного и грибовидного вкусовых сосочков.
В заключительной части диссертации показаны результаты молекулярной идентификации этих рецепторов в одиночных вкусовых клетках (Рис. 17).
2. Выявление обонятельного маркерного белка (ОМР) в тканях с эктопической экспрессией генов обонятельных рецепторов.
Обонятельные нейроны называют ОМР - содержащими клетками по имени их специфического маркера. Обонятельный маркерный белок ОМР - мажорный цитозольный белок с относительной молекулярной массой 19 кДа, который синтезируется в зрелых обонятельных нейронах и путем аксонального транспорта попадает в обонятельную луковицу (Farbman, Margolis, 1980). Этот белок локализован во всех частях обонятельного нейрона, в цилиях, в соме, в аксоне, и по количеству мРНК транскриптов в этих клетках ОМР лидирует. ОМР был впервые выделен и охарактеризован биохимически более тридцати лет назад Франком Марголисом, однако его физиологическая роль в обонятельной системе до сих пор остается загадкой. Предполагается, что ОМР модулирует процесс трансдукции обонятельного сигнала (Buiakova et al., 1996; Youngentob et al., 2001).
Кроме того, существует гипотиза, что ОМР вовлечен в контроль нейрогенеза обонятельных нейронов (Farbman et al., 1998). В периферической обонятельной системе позвоночных ОМР был найден только в хеморецепторных клетках, содержащих рецепторы запахов или феромонов. Интересно, что транскрипты генов обонятельных рецепторов, были также обнаружены в различных тканях, не связанных с обонятельной функцией (Feldmesser et al., 2006). Этот феномен является ярким примером эктопической экспрессии генов (Rodriguez-Trelles, 2005). Экспрессия генов в многоклеточном организме находится под строгим контролем, определяющим соответствие профиля транскриптов в клетке ее функциональному профилю. Термин лэктопическая определяет экспрессию гена в тех клетках, где белковый продукт этого гена не может выполнять известную для него специфическую функцию.
Первоначально эктопическая экспрессия генов обонятельных рецепторов была обнаружена в ткани семенников и мужских половых клетках млекопитающих, рыб и птиц (Parmentier et al., 1992; Vanderhaeghen, 1993;
Vanderhaeghen et al., 1997), а также во вкусовой ткани языка (Gaudin et al., 2001;
Durzynski et al., 2005). Более поздние исследования с применением технологии микроматриц показали присутствие транскриптов этих генов в некоторых других тканях человека и мыши (Feldmesser et al., 2006). Заметим, что феномен эктопической экспрессии был продемонстрирован только на уровне транскриптов, но не белка. Причина состоит в трудностях, связанных с получением антител к рецепторам запахов, а также в их исключительном многообразии (примерно 1200 генов рецепторов у мыши, 1400 у крысы).
Поскольку ОМР является маркером клеток, содержащих функциональные обонятельные рецепторы, в данной работе мы поставили цель проверить наличие этого белка в тканях, для которых показана эктопическая экспрессия генов обонятельных рецепторов и клетки которых имеют хемосенсорную функцию, а именно в семенниках и во вкусовой ткани. Предполагается, что обонятельные рецепторы являются медиаторами хемотаксиса сперматозоидов (Spehr et al, 2003;
Fukuda et al., 2004), а также вовлечены в процессы хеморецепции во вкусовой ткани (Gaudin et al., 2001; Durzynski et al., 2005).
Рекомбинантный ОМР, содержащий N-концевой полигистидиновый кластер, был получен путем экспрессии в E. сoli, очищен до электрофоретической гомогенности (Рис. 8А) и использован для иммунизации кролика. На Вестернблоте тотальных белков ткани обонятельного эпителия крысы (Рис. 8 Б) антисыворотка проявляла иммунореактивность к единственному полипептиду, который мигрировал на денатурирующем ПААГ с Ds-Na как полоса с молекулярной массой приблизительно 19 кДа, что соответствует белковому продукту гена оmp.
Важно отметить, что ранее в обонятельном эпителии мыши и в ОМРтрансфецированных клетках кроме мономера была обнаружена необычная димерная форма ОМР (Koo et al., 2004). Необычность заключается в том, что ни тепловая денатурация, ни обработка Ds-Na не приводили к распаду димера ОМР на мономеры. Поскольку полипептидная цепь ОМР не содержит остатков цистеина, димер не мог образоваться за счет необычайно устойчивых дисульфидных связей. Мы останавливаемся на этом факте, поскольку димерной форме Koo et al. (2004) придавали особое функциональное значение. Авторы выдвинули гипотезу, что в цепи трансдукции обонятельного сигнала принимает участие именно димерная форма ОMP. Однако мы не обнаружили димера ОМР на Вестерн-блотах белков обонятельного эпителия крысы, разделенных электрофорезом в денатурирующих условиях, двухмерным электрофорезом, а также электрофорезом в нативных условиях (Рис.8).
Рис. 8 А. Ds-Na-ПААГ электрофорез препарата очищенного рекомбинантного ОМР, использованного для иммунизации кролика. 1- белкимаркеры; 2- рекомбинантный ОМР. Окраска геля Кумасси R250. B-D. Результаты Вестернблоттинга белков обонятельного эпителия крысы с антисывороткой против рекомбинантного ОМР. B.
Тотальные белки обонятельного эпителия (60 мкг/трек) разделялись электрофорезом на 12,5%-ном Ds-Na-ПААГ. Слева показано положение белковстандартов. С. Водорастворитые белки (60 мкг/трек) разделялись электрофорезом на градиентном 415%-ном ПААГ в нативных условиях. D. Тотальные белки (1мкг) разделялись двухмерным электрофорезом.
В наших экспериментах антитела к рекомбинантному ОМР узнавали среди белков обонятельного эпителия крысы единственный полипептид, соответствующий по молекулярной массе (19 кДа) и изоэлектрической точке (5.0) белковому продукту гена оmр. Такое разногласие с данными Koo et al. (2004), полученными ранее для ОМР мыши, возможно, указывает на видо-специфические различия в биохимических свойствах этого белка среди млекопитающих.
Для подтверждения специфичности полученной антисыворотки, мы использовали ее для иммунногистохимического окрашивания срезов обонятельного эпителия крысы (Рис. 9Б). Среди трех типов клеток, составляющих обонятельный эпителий (обонятельные нейроны, опорные клетки и базальные клетки), иммунореактивность выявлялась исключительно в биполярных обонятельных нейронах (Рис. 9Б,1), а также в нервных волокнах, образованных аксонами обонятельных нейронов (Рис.9Б, 2), что соответствует классической локализации ОМР в этой ткани. На срезах семенников иммунореактивности не было обнаружено. На срезах вкусовой ткани специфически окрашивались вкусовые почки желобоватых вкусовых сосочков языка (Рис. 10Б).
Специфичность окрашивания подтверждается отсутствием иммунореактивности на срезах, которые были инкубированы с пре-иммунной сывороткой (Рис 9А, 10А).
Рис.9. Иммуногистохимическая локализация ОМР на срезах обонятельного эпителия крысы с использованием антисывороткой к ОМР (Б) или преиммунной сыворотки (А).
Рисунок 10. Иммуногистохимическая локализация ОМР на срезах желобоватого вкусового сосочка языка крысы с использованием антисыворотки к ОМР (Б) или преиммунной сыворотки (А).1, 2 - вкусовые почки.
Итак, мы получили доказательства локализации специфического маркера обонятельных нейронов во вкусовых почках языка крысы. Этот факт свидетельствует о том, что ОМР может играть роль не только в трансдукции обонятельного сигнала, но и каким-то образом участвовать в восприятии вкусовых стимулов. Учитывая распространенную гипотезу об участии ОМР в контроле нейрогенеза в обонятельном эпителии (Farbman et al., 1998), можно также предположить, что этот белок каким-то образом вовлечен в процесс обновления вкусовых клеток во вкусовой почке. Отметим, что в отличие от генов обонятельных рецепторов, экспрессия гена ОМР во вкусовой ткани не может считаться эктопической, поскольку специфическая функция этого белка до сих пор не доказана с определенностью.
3. Белок-белковые взаимодействия пероксиредоксинов.
Пероксиредоксины - это семейство тиол-зависимых пероксидаз, которое у млекопитающих представлено шестью белками (Prdx1-Prdx6). Пероксиредоксины обладают антиоксидантными свойствами, а также участвуют в редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации. Редокс-сигнализацией называется процесс трансдукции сигнала, при котором передача информации осуществляется за счет окислительно-восстановительной модификации хотя бы одного из участников сигнального каскада путем химической реакции с активными формами кислорода (АФК), играющими при этом роль вторичных посредников. В настоящее время считается доказанным, что Н2О2 удовлетворяет критериям вторичного посредника (Rhee et al., 2005). Всплеск содержания Н2О2 в цитоплазме действительно наблюдается в ответ на стимуляцию мембранных рецепторов различными агонистами, в том числе пептидными факторами роста, цитокинами, инсулином.
Одним из основных механизмов трансдукции сигнала с поверхности клетки в ядро является цепь реакций фосфорилирования-дефосфорилирования белков по боковым цепям остатков тирозина и в меньшей степени серина и треонина. Н2Орегулирует активность ключевых сигнальных белков тирозиновых протеинкиназ и фосфатаз через их обратимую окислительную модификацию. Мишенями Н2Оявляются ионизованные тиоловые группы остатков цистеина, входящие в состав активных центров этих ферментов.
Каково место пероксиредоксинов в редокс-сигнализации? Распространенная теория о сигнальной функции белков-антиоксидантов, встречаемая в многочисленных публикациях, такова: Антиоксиданты уменьшают в клетке концентрацию АФК - вторичных посредников и тем самым принимают участие в сигнальных процессах. Следует отметить, что эти представления устарели.
Действительно пероксиредоксины обладают пероксидазной активностью и, следовательно, контролируют уровень Н2О2 в клетке. Во многих клетках содержатся как минимум несколько типов пероксиредоксинов, а иногда и все шесть, причем в очень высоких концентрациях. Высказываются предположения, что пероксиредоксины доминируют на 90% в восстановлении Н2О2 в митохондриях (Cox et al., 2010) и почти на 100% в цитоплазме некоторых клеток (Winterbourn., 2008). Мощность этой пероксидазной системы является преградой для распространения Н2О2 сигнала в цитоплазме. В целом, в отсутствие экзогенных источников уровень Н2О2 в клетках не превышает 700 нМ за счет высокой концентрации пероксидаз. А для того, чтобы стать сигналом, концентрация Н2О2 должна быстро подняться и продержаться какое-то время над порогом в 10 - 100 мкM (Stone, Yang, 2006) необходимым для окисления SHгрупп эффекторных молекул. Получается, что антиоксидантные системы являются препятствием для редокс-сигнализации. Каким образом могут быть достигнуты сигнальные концентрации Н2О2 в клетке? Совсем недавно было показано, что это достигается (1) за счет локального характера вспышек концентрации Н2О2 (Mishina et al., 2011) и (2) за счет кратковременной локальной инактивации активности пероксиредоксинов (Woo et al., 2010) по механизму потери функции. Инактивация пероксидазной активности, достигаемая за счет пост-трансляционных модификаций пероксиредоксинов, дает возможность аккумуляции и распространению Н2О2-сигнала в клетке.
В лаборатории механизмов рецепции ИБК РАН Prdx6 был впервые обнаружен в обонятельном эпителии крысы именно благодаря его исключительно высокому содержанию - 1-2% фракции водорастворимых белков (Пешенко с соавт., 1996). Какова бы ни была функция этого белка, сигнальная или антиоксидантная, ее реализация в клетке, возможно, происходит за счет белокбелковых взаимодействий.
Для поиска партнеров Prdx6 в обонятельном эпителии крысы мы использовали метод аффинной хроматографии (Pull-down assay), аффинный иммуноблотинг (Far-Western blot), ко-иммунопреципитацию и метод белковых ковалентных крос-сшивок. Мы получили рекомбинантный аналог Prdx6, содержащий полигистидиновый кластер, и моно-специфичные антитела кролика к этому белку. Кроме того был получен мутантный белок с точечной заменой цистеина на серин. Были созданы несколько твердофазных аффинных носителей:
(1) путем иммобилизации рекомбинантного белка на кобальтовой агарозе за счет полигистидинового кластера; (2) путем имммобилизации белка на BrCNактивированной агарозе; (3) путем иммобилизации мутантного белка на BrCNактивированной агарозе; (4) путем иммобилизации антител к Prdx6 на сефарозе CL-6B. Схема экспериментов была такова. Экстракт водорастворимых белков обонятельного эпителия крысы инкубировался с аффинным матриксом, связавшиеся белки элюировали с колонки, осаждали, разделяли с помощью денатурирующего электрофореза, белковые полосы предполагаемых партнеров по взаимодействию с Prdx6 были вырезаны из геля и идентифицированы с помощью масс-спектрометрии и последующего сопоставления полученных данных с базами NCBI (коммерческий анализ MALDI TOF/TOF проведен в ЗАО ПИННИ на базе Института физико-химической медицины РАМН).
При использовании аффинного носителя на основе кобальтовой агарозы на электрофореграмме белков элюата выявляются несколько полипептидных полос (Рис.11), идентифицированных как -актин, белок теплового шока Hsp70, Prdx1 и укороченная форма Prdx6.
Рис.11 Аффинная хроматография лизата ткани обонятельного эпителия на His-Prdx6/Со2+агарозе. (А) Дорожка 1 - белки-маркеры, дорожка 2, 3-фракции промывки колонки, 4- белки, элюированные с His-Prdx6/Со2+-агарозы. (Б) 2белки, элюированные с контрольной Со2+агарозы. Окраска гелей Кумасси R-250. Типичные результаты одного из 5 экспериментов.
На рис. 12 представлены результаты электрофоретического разделения белков, схваченных из лизата обонятельного эпителия крысы аффинными носителями на основе BrCN-активированной агарозы. Полипептиды с молекулярным весом приблизительно 70, 54, 45, 38, 28, и 23 кДа по результатам MALDI-TOF были идентифицированы как белок теплового шока Hsp70, тубулин, -актин, GAPDH, Prx6 и Prx1, соответственно. Как видно на рисунке 12, мутация C/S приводила к нарушению способности белка образовывать комплексы. Интересно, что полосы 20-kDa и 28-kDa были идентифицированы как Prdx6. Укороченные формы Prdx6, образуются за счет протеолитической деградации белка в процессе инкубации лизата в условиях in vitro, поскольку они не детектировалась в обонятельном эпителии (Рис. 13A). На всех гелях присутствует интенсивная полоса размером 28 кДа, в которой был идентифицирован нативный Prdx6, что соответствует полученным ранее другими авторами данным о способности молекул Prx6 к само-ассоциации за счет нековалентных связей (Choi et al., 1998; Wu et al., 2006).
Рис. 12 Аффинная хроматография лизата ткани обонятельного эпителия на контрольной заблокированной BrCNсефарозе (дорожка 4); Prdx6/BrCNсефарозе (3); Prdx6/mut/BrCN-сефарозе (2); белки-маркеры (1). Окраска гелей Кумасси R-250. Типичные результаты одного из 5 экспериментов.
Поликлональные антитела к рекомбинантному Prx6 были использованы для ко-иммунопреципитации белков, способных образовывать стабильные комплексы с нативным Prx6 в лизате обонятельного эпителия крысы. Заметим, что используемые антитела узнавали на иммуноблоте белков, разделенных двухмерным электрофорезом единственное пятно, соответствующее по молекулярной массе и изоэлектрической точке нативному Prdx6 (Рис. 13А). Среди белков экстракта, связавшихся на аффинном матриксе с иммобилизованными антителами к Prdx6, самая интенсивная полоса с молекулярной массой 28 кДа, отсутствующая в контрольных экспериментах, соответствовала нативному Prdx6.
Полосы белков, иммунопреципитированных вместе с Prdx6, имели размеры 23, 38, 45, 54 и 70 kDa, и были идентифицированы масс-спектрометрией как Prdx1, GAPDH, -актин, -тубулин и Hsp70, соответственно (Рис. 13, дорожка 3).
При применении аффинного имммуноблотинга (Far-Western blot) были выявлены полипептидные полосы, молекулярный вес которых соответствовал обнаруженным в предыдущих экспериментах GAPDH, -актину и Hsp70.
Рисунок 13. (А) Проверка специфичности антител к Prdx6. Результаты Вестерн-блотинга белков обонятельного эпителия крысы, разделенных двухмерным электрофорезом, с антителами к Prdx6.
(Б) Иммуноаффинная хроматография экстракта водорастворимых белков обонятельного эпителия крысы. 12,5% Ds-Na-ПААГ (1) тотальных белков экстракта; (3) белков, элюированных с CL-6B сефарозы с пришитыми антителами к Prdx6, (4) белков, элюированных с контрольной CL-6B сефарозы. Окраска гелей Кумасси R-250. Типичные результаты одного из 5 экспериментов.
Рис. 14. Крос-сшивка рекомбинантного Prdx6 с водорастворимыми белками обонятельного эпителия крысы агентом Sulfo-SBED. (А) А - белки, иммобилизованные на авидин-сефарозе за счет биотиновой метки, были элюированы (2) SDSбуфером для электрофореза (3) 5 мМ биотином. (Б) контроль - элюция белков с авидин-сефарозы, инкубированной с экстрактом обонятельного эпителия без процедуры кросс-сшивки и переноса метки. Отмеченные стрелками полипептидные полосы были идентифицированы MALDI TOF.
Окраска гелей Кумасси R-250. Типичные результаты одного из 5 экспериментов.
Кроме аффинной хроматографии мы также использовали метод ковалентной крос-сшивки белковых комплексов биотионилированным агентом Sulfo-SBED (Pierce). После крос-сшивки, активируемой ультрафиолетом, все компоненты белковых комплексов пероксиредоксина оказывались биотинилированными, поэтому мы изолировали их из лизата обонятельного эпителия с помощью аффинной хроматографии на сефарозе с иммобилизованным мономерным авидином. В результате были выделены полипептиды с относительной молекулярной массой приблизительно 23, 38, 45, 56, 70 и 90 кДа, идентифицированные масс-спектрометрией как Prdx1, GAPDH, -actin, димер Prdx6, Hsp70 и Hsp90, соответственно. Особые условия проведения экспериментов по крос-сшивке и переносу метки, в частности облучение образца ультрафиолетом, приводили к появлению устойчивого димера Prdx6, что еще раз подтверждает способность молекул этого белка к ассоциации (Choi et al., 1998;
Wu et al., 2006).
Мы также использовали молекулярно-генетический подход для поиска белков, взаимодействующих с Prdx6 в дрожжевой двухгибридной системе. Для этого кДНК пероксиредоксина 6 была клонирована в одной рамке считывания с ДНК-связывающим доменом LexA и использована в качестве наживки для скрининга коммерческой кДНК клонотеки УHybrid HunterФ ткани семенников (Invitrogen), клонированной в одной рамке считывания с активационным доменом транскрипционного фактора В42. В результате двухгибридного скрининга отбирались дрожжевые колонии положительные по активации двух репортерных генов lacZ и HIS3, которые послужили источниками кДНК белков, предположительно взаимодействующих с Prdx6. Была определена нуклеотидная последовательность полученных клонов и проведен поиск гомологичных структур в базе данных GenBank. В результате были идентифицированы три наиболее вероятных партнера по взаимодействию с Prdx6: Hsp90, калпаин (кальций-зависимая нелизосомная эндопептидаза, широко распространенная в клетках млекопитающих) и Sec14-подобный белок p50RhoGAP. Hsp90 был также идентифицирован нами как партнер Prdx6 при биохимическом анализе. Что касается двух остальных партнеров, то результаты других авторов свидетельствуют о способности пероксиредоксинов взаимодействовать с этими белками (Schroder E. et al., 1998; Seo M.S. et al., 1999; Cha M.K. et al., 2003;
Mukhopadhyay S.S. et al., 2006).
Многочисленность белок-белковых взаимодействий Prdx6 позволяет предположить многофункциональность этого белка. Результаты биохимических исследований показывают, что несколько мажорных цитозольных белков обонятельного эпителия крысы, вовлеченных в различные внутриклеточные процессы, образуют комплексы с Prdx6. Это белки теплового шока Hsp70 и 90, гликолитический фермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH), цитоскелетные белки -актин и -тубулин, и тиол-зависимая пероксидаза Prdx1.
Наиболее интересным нам представляется взаимодействие Prdx6 и Prdx1, поскольку ранее в семействе пероксиредоксинов было выявлено взаимодействие между Prdx1 и Prdx4 (Jin D.Y. et al., 1997). Кроме того, мы впервые обнаружили, что в обонятельном эпителии функционирует не только Prdx6, но и Prdx1. Долгое время считалось, что Prdx6 является основным антиоксидантом этой ткани (Novoselov et al., 1999). Обратим внимание на данные литературы, указывающие на способность актина связывать GAPDH (Poglazov B.F., Livanova N.V., 1986;
Mitsuwa et al., 2005; Ouporov et al., 2001), Hsp70 (Margulis, Welsh, 1991) и Hsp(Nishida et al., 1986; Ji et al., 2007), которые были идентифицированы как возможные партнеры по взаимодействию с Prx6 и в нашей работе. Можно предположить, что за счет связывания с актином происходит ассоциация Prdx6 с Hsp70, Hsp90 и GAPDH в мультибелковых комплексах. В клетке актиновый цитоскелет играет роль матрицы, на которой собираются взаимодействующие между собой сигнальные молекулы и ферментные комплексы, и эта ассоциация способствует увеличению эффективности ферментативных процессов или специфичности сигнальных каскадов.
Редокс-чувствительность является общим свойством всех обнаруженных партнеров по взаимодействию с пероксиредоксином 6 в обонятельном эпителии. Функциональная активность этих белков напрямую зависит от редокс-состояния тиоловых групп консервативных остатков цистеина в составе их молекул, подверженных обратимым окислительно-восстановительным модификациям (Cumming et al., 2004; Papp et al., 2003; Landino et al., 2004;
Hancock et al., 2005; Lassing et al., 2007).
Многочисленность белок-белковых взаимодействий, в которых участвует Prx6, может также иметь непосредственное отношение к реализации его ферментативной активности в клетке. Пероксиредоксины - двухсубстратные ферменты. В процессе каталитического цикла тиоловая группа редокс-активного цистеина прыгает между окисленным (SОH) и восстановленным (SH) состояниями, которые достигаются за счет ее взаимодействия с окисляющим или восстанавливающим субстратами, соответственно. Интересно, что Prdx6 - единственный пероксиредоксин млекопитающих, для которого не установлен c определенностью нативный восстанавливающий субстрат. Поскольку в клетке существуют две глобальных системы для метаболизма H2O2: системы глутатиона и тиоредоксина, теоретически два низкомолекулярных тиоловых компонента клетки подходят на эту роль: тиоредоксин и глутатион. Для пероксиредоксинов млекопитающих глобальным восстанавливающим субстратом является тиоредоксин. Что касается Prdx6, положение редокс-активного Cys на дне каталитического кармана (Choi H.J. et al., 1998) делает его недоступным для взаимодействия с глутатионом и тиоредоксином, по крайней мере, в условиях in vitro, в силу стехиометрии их молекул (Peshenko, Shichi, 2001). В этой связи важно отметить, что белок-белковые взаимодействия могут индуцировать существенные изменения в конформации белка. Так, взаимодействие гептаспирального рецептора с гетеротримерным G-белком инициируют обмен ГДФ на ГТФ в нуклеотид-связывающем центре -субъединицы G-белка с последующей диссоциацией последнего на -субъединицу и -комплекс.
Известны случаи, когда конформационная подвижность молекулы фермента определяет доступность субстрата и/или освобождение продукта (Winn et al., 2002). На конформационную подвижность молекулы Prdx6 указывает тот факт, что точечная замена цистеина (запрятанного в белковой глобуле) на серин приводит к драматическому снижению его способности к связыванию с другими белками (Рис. 12). В белок-белковые и лиганд-белковые взаимодействия может быть вовлечена небольшая группа амино-кислотных остатков, однако эффекты связывания могут передаваться другим остаткам, не участвующим во взаимодействии (McCallum et al., 2000).
Мы полагаем в качестве гипотезы, что множественные белок-белковые взаимодействия в условиях in vivo обеспечивают базис для конформационных перестроек в молекуле Prdx6, которые делают каталитический Cys-OH доступным для восстановления низкомолекулярными тиоловыми компонентами клетки - глутатионом или тиоредоксином.
4. Исследование одиночных хемосенсорных клеток.
Молекулярная идентификация рецепторных, сигнальных и канальных белков во вкусовых клетках методом экспрессионного анализа первоначально проводилась нами с использованием изолированных препаратов желобоватых, листовидных и грибовидных сосочков языка. Уже первые эксперименты показали, что результаты анализа, проведенного на тотальных препаратах вкусовой ткани, трудно интерпретировать (Bystrova et al., 2006). Дело в том, что вкусовую ткань невозможно выделить без примеси эпителиальной ткани, а спектры транскриптов в препаратах вкусовой ткани и в контрольной эпителиальной ткани часто перекрывались. Поэтому вопрос о том, являются ли вкусовые клетки исключительным источником транскрипта, найденного в препарате вкусовой ткани, a priori не имел однозначного ответа. При использовании иммуногистохимического анализа, также невозможно было однозначно идентифицировать источник сигнала в гетерогенной популяции вкусовых клеток с примесью эпителиальных (Рис. 2).
При специфических обстоятельствах однозначность обеспечивалась физиологическими данными. Например, в случае идентификации 1-субъединицы ПЗ Са2+ канала L-типа из физиологических экспериментов было известно, что эти ионные каналы функциональны только во вкусовых клетках типа III (Romanov, Kolesnikov, 2006). В силу этого, транскрипты 1-субъединицы, обнаруженные в тотальных препаратах, можно было однозначно приписать клеткам типа III.
Похожие проблемы неизбежно должны сопровождать изучение на интегральном уровне любой гетерогенной клеточной системы.
В связи с этим, были отработаны методы экспрессионного анализа применительно к одиночным клеткам, которые позволили установить не только ко-локализацию в клетке нескольких компонентов определенного сигнального каскада, но и присутствие в ней специфических маркеров определенных клеточных типов.
Исследование одиночной клетки с помощью электрофизиологических методов дает возможность нарисовать ее функциональный портрет.
Экспрессионный анализ индивидуальной клетки позволяет получить ее молекулярный портрет. Экспрессионный анализ индивидуальной хемосенсорной клетки, предварительно охарактеризованной электрофизиологически, позволяет установить корреляцию между ее электрофизиологическим и молекулярным портретами.
Почему анализ мРНК транскриптов на уровне одиночной клетки представляется проблематичным? Ограничивающим фактором при проведении такого рода исследований является чрезвычайно малое количество мРНК.
Считается, что клетка содержит в среднем примерно 10-30 пг тотальной РНК, в которой мРНК составляет 1-5%. По количеству копий на клетку мРНК транскрипты можно разделить на 3 группы: высокой, средней и низкой представленности. Последняя группа (1-15 копий на клетку) составляет примерно 90% всех транскриптов мРНК в клетке (Alberts et al., 1994). Работ на реальных живых клетках, содержащих пикограммовые количества тотальной РНК и фемтограммы транскриптов мРНК индивидуальных генов, в мире единицы (Eberwine et al., 1992; Noe, Breer, 1998; Bengtsson et al., 2005; Tizzano et al., 2008;
Roberts et al., 2009). В целом ряде исследований, где описаны протоколы, обладающие чувствительностью, необходимой для анализа одиночной клетки, реально представлены эксперименты не с мРНК, выделенной из одиночной клетки, а с разведениями мРНК (выделенной из ткани, клеточной популяции или клеточной культуры) до уровня одиночной клетки (Subkhankulova, Livesey, 2006).Задачу получения профиля транскриптов генов сигнальных белков на уровне одиночной хемосенсорной клетки (Рис. 17, 20) было затруднительно выполнить с помощью классического ОТ-ПЦР. С помощью этого метода мы смогли оценить наличие в одиночной клетке транскриптов лишь одного гена, что делало невозможным контроль ложноотрицательных результатов. Проведение экспрессионного анализа в пробах, содержащих незначительные количества мРНК, возможно с использованием технологии линейной амплификации аРНК (Van-Gelder et al., 1990) или экспоненциальной амплификации кДНК (Brady et al., 1990). С развитием технологии микроматриц на рынке появились коммерческие наборы для глобальной амплификации РНК, но их чувствительность не позволяет исследовать одиночные клетки, они не всегда доступны на российском рынке и дорогостоящи. Поэтому для амплификации мРНК одиночных клеток необходимо подбирать особые условия, температурный режим, оптимальный объем ферментативных реакций и их длительность на всех стадиях процесса амплификации. Для стандартизации реакций после электрофизиологической идентификации клетка немедленно замораживалась, а затем параллельно проводились реакции обратной транскрипции и последующей глобальной амплификации сразу нескольких полученных образцов. Реакция ОТ проводилась с использованием клеточного лизата, без предварительного выделения РНК, что позволило избежать потерь одиночных мРНК транскриптов неизбежных в ходе любого выделения. Исходный образец не обрабатывался ДНКазой I, поскольку эта обработка (1) может привести к повреждению редких мРНК транскриптов и (2) неизбежно увеличивает объем исходного образца в реакции ОТ. Вместо этого, мы использовали интрон-пересекающие ген-специфические праймеры, узнающие кДНК, но не геномную ДНК.
4.1. Применение стратегии линейной амплификации РНК для анализа экспрессии генов в одиночных вкусовых клетках типа II.
Рис. 15. Изолированная вкусовая почка и диссоциированные вкусовые клетки (а, б, в) с веретенообразной морфологией.
Для анализа экспрессии в одиночных клетках типа II генов, кодирующих коннексины и паннексин 1, была применена линейная амплификация антисмысловой РНК (аРНК) (Eberwine et al., 1992). Суть метода состоит в следующем. Для обратной транскрипции мРНК матрицы используется модифицированный олиго(дТ) праймер, содержащий на 5Т- конце последовательность промотора РНК полимеразы фага Т7. Соответственно, синтезированная двухцепочечная кДНК также несет эту последовательность и, следовательно, может быть использована в качестве матрицы для линейной амплификации аРНК с помощью Т7 РНК полимеразы. Амплифицированная аРНК обрабатывается ДНКазой I и затем используется в качестве матрицы для проведения реакции обратной транскрипции. Полученная одноцепочечная кДНК затем используется как матрица в ПЦР с ген-специфическими праймерами.
Рис.16. Линейная амплификация аРНК и последующий анализ экспрессии генов в препарате одиночных клеток типа II. Фрагменты ожидаемых размеров были получены для Cx26, Cx30.3, Cx31.1, Cx33, Cx36, Cx43, Px1, TRPM5, and PLC2. Маркеры молекулярного веса (М) Gene Ruler 1-kb ladder (Fermentas).
В ходе эксперимента клетка, идентифицированная как принадлежащая к типу II методом patch clamp, засасывалась в регистрирующий электрод, затем клеточный материал помещался в пробирку с реакционной смесью и немедленно замораживался. Клеточный лизис достигался нагреванием при 65С. Для обратной транскрипции и последующей амплификации был использован образец, содержащий 10 индивидуально идентифицированных клеток. Всего была выполнена серия из трех экспериментов, и репрезентативные результаты одного их них отражены на Рис. 16, где представлены продукты амплификации с праймерами, специфичными для генов исследовавшихся коннексинов и паннексина 1.
Принадлежность выделенных клеток к типу II была подтверждена анализом специфических маркеров этих клеток (PLC2 и TRPM5) в образце. Как и ожидалось, нам удалось зарегистрировать сигналы для PLC2 и TRPM5, а также показать наличие в этих клетках транскриптов, кодирующих Cx26, Cx30.3, Cx31.1, Cx33, Cx36, Cx43 и Px1.
4.2. Применение стратегии экспоненциальной амплификации кДНК для анализа одиночных вкусовых клеток трех типов.
Методика линейной амплификации аРНК состоит из последовательной череды ферментативных реакций, наиболее сложной из которых является синтез второй цепи кДНК. Чтобы избежать потерь, мы не очищали продукты реакций вплоть до стадии амплификации. Каждая последующая реакция проводилась во все большем объеме. Тем не менее, в реакции транскрипции in vitro использовалась неочищенная кДНК, и это снижало эффективность процесса.
Кроме того, протокол был достаточно трудоемким и занимал не меньше двух дней.
Поэтому для оптимизации работы с одиночными клетками мы далее применили стратегию экспоненциальной амплификации кДНК, в которой при синтезе первой цепи кДНК используется SMART-механизм переключения матрицы на 5Т-конце мРНК (Matz et al., 1999). Обратную транскрипцию проводят с применением транскриптазы MMLV, модифицированного праймера олиго(дТ) и олиго(дG) праймера для переключения матрицы. Оба праймера содержат на 5Тконцах некую последовательность адаптера. После обратной транскрипции все молекулы синтезированной одноцепочечной кДНК содержат на 5Т-конце последовательность адаптера, а на 3Т-конце последовательность, комплементарную адаптеру, и могут быть глобально амплифицированы в последующем ПЦР с применением праймера-адаптера. Мы использовали праймеры и некоторые реагенты набора Минт (Евроген) для синтеза и амплификации кДНК. Чувствительность этого набора не превышает 0,25 g исходной РНК, что потребовало оптимизации протокола применительно к одиночным вкусовым клеткам. Оказалось, что по сравнению с линейной амплификацией метод SMART-PCR имел преимущества в простоте, надежности, продолжительности, сведению к минимуму потерь, а главное в стоимости затрат на одну клетку.
Мы применили метод экспоненциальной SMART-PCR амплификации кДНК для анализа ко-экспрессии в одиночных вкусовых клетках генов, кодирующих гептаспиральные рецепторы CASR и GPRC6 и специфические клеточные маркеры. Гетерогенная популяция клеток вкусовой почки включает морфологически и функционально различающиеся клетки трех групп (I-III).
Поэтому для экспрессионного анализа были использованы клетки после их предварительной электрофизиологической идентификации. Кроме CASR и GPRC6A, в одиночных клетках анализировалось наличие транскриптов определенных клеточных маркеров, характерных для каждого клеточного типа.
Специфическими клеточными маркерами для клеток типа I считаются нуклеотидтрифосфат-дифосфогидролаза 2 (NTPDase2) (Lawton et al., 2000; Bartel et al., 2006;
Vandenbeuch et al., 2008). Практически все клетки типа II содержат фосфолипазу С2 и канал TRPM5 (Clapp et al., 2001; Perez et al., 2002). В желобоватом сосочке специфический G-белок вкусовых клеток гастдуцин локализован в отдельной субпопуляции клеток типа II (Kim et al., 2003; Shindo et al., 2008). Маркерами клеток типа III считаются белок, ассоциированный с синаптосомами SNAP-25, и канальная субъединица PKD2L1 (Yee et al., 2001; Clapp et al., 2006; DeFazio et al., 2006; Kataoka et al., 2008). Каждая клетка, изолированная из почек желобоватого вкусового сосочка, была сначала идентифицирована на принадлежность к определенному типу методом patch-clamp на основе регистрации потенциалзависимых интегральных токов (Romanov and Kolesnikov, 2006; Romanov et al., 2007), затем неоднократно промыта для сведения к минимуму возможного загрязнения РНК из разрушенных клеток в экстраклеточном растворе. Клетка засасывалась в стеклянный микроэлектрод, помещалась в ПЦР пробирку с раствором олиго-дТ праймера и праймера для переключения матрицы и немедленно замораживалась. Лизис клетки достигался за счет нагревания. Затем проводилась процедура обратной транскрипции и SMART-PCR амплификации кДНК. Амплифицированная кДНК использовалась в качестве матрицы для ПЦР с ген-специфическими праймерами.
Всего мы исследовали 27 одиночных, индивидуально идентифицированных электрофизиологически клеток из желобоватого вкусового сосочка. Транскрипты CASR были обнаружены в клетках типа I и III, а транскрипты GPRC6A - исключительно в клетках типа II. Несмотря на небольшое количество исследованных клеток (27), наша методология была оправдана тем, что транскрипты маркеров были обнаружены только в соответствующих им клеточных типах: NTPDase2 в клетках типа I; гастдуцин, T1R3 и TRPM5 - в клетках типа II, а PKD2L1 - в клетках типа III (Рис. 17, 18). В соответствии с иммуногистохимическими исследованиями (Kim et al., 2003; Shindo et al., 2008) транскрипты T1R3 отсутствовали в гастдуцин-положительных клетках.
Единственный неожиданный результат касался SNAP-25, который считается маркером клеток типа III. Мы обнаружили транскрипты SNAP-25 не только в клетках типа III, но и в типе I. Поскольку еще один маркер клеток типа III - PKD2L1- не был детектирован ни в одной клетке типа I, можно сделать вывод, что это не технический артефакт, а новый результат. Попробуем объяснить его физиологическое значение. Клетки типа I рассматриваются как глиа-подобные, имеющие опорную функцию во вкусовой ткани (Roper, 2006; Sugita, 2006).
Однако электронная микроскопия показывает наличие в них плотных гранул, связанных с апикальным участком клеточной мембраны (Murray, 1973;
Lindemann, 1996), что указывает на возможную секреторную функцию. Поэтому наличие в этих клетках транскриптов SNAP-25, относящихся к семейству белков, вовлеченных в процесс слияния внутриклеточных везикул с плазматической мембраной (Sudhof and Rothman, 2009), может быть физиологически оправданным.
Рис.17. Профиль транскриптов, кодирующих CASR, GPRC6A и шесть специфических клеточных маркера в идентифицированных электрофизиологически одиночных клетках желобоватого вкусового сосочка. В качестве матрицы в ПЦР с ген-специфическими праймерами использовалась кДНК одиночной клетки, глобально амплифицированная методом SMART-ПЦР. (A) Клетки типа I содержат транскрипты CASR, GPRC6A, NTPDи SNAP-25 (254, 245, 217 и 228 п.о., соответственно), транскрипты гастдуцина, T1R3, TRPM5 и PKD2L1 не были обнаружены. (B) В клетках типа II детектировались только транскрипты гастдуцина, T1R3 и TRPM5 (228, 566 и 441 п.о., соответственно). (В) В клетках типа III обнаружены транскрипты CASR, SNAP-25 и PKD2L1 (254, 228 и 609 п.о., сответственно). В каждой из 27 одиночных вкусовых клеток исследовался профиль экспрессии всех восьми генов. Маркеры, (М, дорожка 1), GeneRuler 1 kb DNA Ladder, Ферментас.
Рис.18. Распределение транскриптов генов CASR, GPRC6A и маркерных белков в трех типах вкусовых клеток. В каждой из 27 одиночных вкусовых клеток исследовался профиль экспрессии генов всех восьми указанных белков.
Таблица 1. Транскрипты, обнаруженные в одиночных вкусовых клетках трех типов.
Маркер Тип GPRC6 ГастдуCASR NTPD2 SNAP25 TIR3 TRPM5 PKD2L№ A цин клетки клетки 1 + ++ ++ + - - - - 2 - + + - - - - - 3 + ++ +++ - - - - - 4 - - + - - - - - Тип I 5 ++ + + +++ - - - - 6 + + ++ +++ - - - - 7 - - +++ + - - - - 8 +++ - - + - - - - 9 + ++ + + - - - - 1 - - - - ++ - +++ - 2 - - - - - ++ - - 3 - - - - +++ - +++ - 4 - - - - +++ - +++ - Тип II 5 - - - - - ++ - - 6 - - - - ++ - +++ - 7 - - - - +++ - ++ - 8 - - - - ++ - +++ - 9 - - - - - ++ +++ - 1 + - - - - - - - 2 ++ - - + - - - - 3 + - - - - - - - 4 - - - +++ - - - - Тип III 5 - - - - - - - ++ 6 ++ - - ++ - - - - 7 ++ - - + - - - ++ 8 - - - ++ - - - - 9 + - - ++ - - - ++ Недетектируемый, относительно низкий, средний и высокий уровни обозначены как (Ц), (+), (++) и (+++), соответственно.
Еще более интересным представляется тот факт, что специфические клеточные маркеры были детектированы не во всех клетках соответствующих типов (Таблица 1). Кроме того, на количественном уровне, интенсивность сигналов всех изучаемых молекул сильно отличалась от клетки к клетке (Рис. 17, Таблица 1). Надо сказать, что анализ экспрессии генов на уровне одиночных клеток представляется нам в какой-то степени количественным, поскольку каждая реакция отражает то количество специфических транскриптов мРНК, которое присутствует в одиночной клетке, а клетки исследуются в одинаковых экспериментальных условиях по одному протоколу. Поэтому профиль экспрессии генов в какой-то мере являются молекулярным портретом клетки, и как показали наши результаты, эти портреты очень сильно отличаются у клеток одного типа, с одинаковыми электрофизиологическими характеристиками. В попытке осмыслить эти экспериментальные факты мы впервые столкнулись с концепцией стохастической экспрессии генов, которая может иметь непосредственное отношение к интерпретации наших результатов.
4.2. Анализ экспрессии генов в одиночных обонятельных нейронах.
Обонятельный эпителий содержит три основных типа клеток: обонятельные нейроны, опорные клетки и базальные клетки. Базальные клетки имеют небольшой размер и неопределенную форму. Что касается нейронов и опорных клеток, то они сохраняют свойственные им морфологические признаки даже после процедуры диссоциации (Рис. 19). Обонятельный нейрон имеет морфологию биполярной вытянутой клетки с дендритом, на конце которого можно видеть под микроскопом обонятельную булаву и несколько длинных цилий. На противоположном полюсе клетки видны остатки тонкого аксона.
Нейрон легко отличить от опорной клетки, несущей щетку микровилл на апикальном конце (Рис.19В).
Рис. 19. Одиночные обонятельный нейрон и опорная клетка, выделенные из диссоциированного обонятельного эпителия.
(A) Нейрон с характерной биполярной морфологией, длинным дендритом, заканчивающимся обонятельной булавой с несколькими длинными цилиями. (B) Опорная клетка с щеткой микровилл.
Обонятельный эпителий - единственная часть нервной системы, напрямую контактирующая с окружающей средой и находящаяся под постоянным воздействием экзогенных АФК. Ранее Reed с соавторами (2003) показали, что в обонятельном эпителии каталаза и глутатион пероксидаза в основном локализованы в опорных клетках и Боумановых железах. Поэтому пероксиредоксины, по-видимому, играют особую роль в метаболизме H2O2 в обонятельных нейронах. Кроме того, пероксиредоксины должны играть особую роль в редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации в этих клетках.
Обонятельные нейроны обновляются в течение всей жизни животного за счет популяции базальных прогениторных клеток (Graziadei, Graziadei, 1979; Carr et al., 1998). В нейрогенез вовлечены факторы роста, вторичным посредником в трансдукции сигналов которых является Н2О2 (Woo et al., 2010). Для анализа экспрессии генов семейства пероксиредоксинов в одиночных обонятельных нейронах мы применили комбинацию методов линейной и экспоненциальной амплификации мРНК. Важно отметить, что на уровне одиночной клетки ни для одного клеточного типа ко-локализация всех шести пероксиредоксинов ранее не исследовалась.
Оптимизация экспрессионного анализа на уровне одиночных клеток для исследования генов, имеющих процессированные псевдогены-ортологи.
Протокол линейной амплификации включает ступень обработки ДНКазой уже амплифицированной аРНК. При экспоненциальной амплификации в нашем протоколе такой ступени нет. Напомним еще раз, что мы не выделяли РНК из одиночной клетки, а проводили экспрессионный анализ, используя клеточный лизат. Поэтому наш протокол экспоненциальной амплификации не содержал ступени обработки РНК ДНКазой. Обычно применение линтрон-пересекающих праймеров позволяет сделать различие между геномным или кДНК происхождением матрицы в последующей реакции ПЦР с ген-специфическими праймерами. Однако следует принять во внимание, что семейство пероксиредоксинов содержит в геноме процессированные псевдогены - нефункциональные гены без интронов и элементов контроля транскрипции.
Соответственно, методика экспоненциальной амплификации, примененная нами для анализа экспрессии CASR и GPCR6 во вкусовых клетках, в случае пероксиредоксинов не может быть использована из-за теоретически существующего риска детектировать процессированный псевдоген, не содержащий интронов, в составе геномной ДНК. Как в этом случае можно отличить кДНК происхождением матрицы от геномного? Чтобы решить возникшую проблему, мы применили комбинацию методов экспоненциальной и линейной амплификации. Этот подход может быть использован для экспрессионного анализа на уровне одиночной клетки генов, последовательности которых не содержат интроны, или генов, имеющих процессированные псевдогены-ортологи. Он включает следующие ступени: (1) синтез первой цепи кДНК с использованием T7-oligo-dT праймера и эффекта переключения матрицы для присоединения адаптерной последовательности на 3Т- конец кДНК; (2) первый цикл амплификации кДНК одиночной клетки методом SMART- ПЦР с праймером, содержащим последовательность T7 РНК полимеразы и праймеромадаптером; (3) очистка полученной амплифицированной двухцепочечной кДНК;
(4) второй цикл амплификации с использованием T7 RNA полимеразы, продуктом которой является аРНК; (5) этап обработки ДНКазой I и последующая очистка амплифицированной РНК из ферментативных реакций на колонках MinElute (Кайген); (6) обратная транскрипция аРНК; (7) ПЦР с ген-специфическими праймерами. Таким образом, этот подход включает в себя ступень обработки ДНКазой уже амплифицированного образца и простой метод синтеза второй цепи кДНК. Отметим, что именно синтез второй цепи кДНК является самой сложной ступенью методики линейной амплификации.
Следуя этой стратегии, мы изучили профиль экспрессии генов в обонятельном нейроне. На уровне популяции транскрипты всех шести prdx присутствуют в обонятельных нейронах. Однако на уровне одиночных клеток мы обнаружили многочисленные вариации в композициях присутствующих транскриптов (Рис. 20). Мы обнаружили в 20 клетках транскрипты prdx 1, в 15 - prdx 2, в 7 - prxd 3, в 6 - prdx 4, в 8 - prdx 5 и в 18 - prdx6. Таким образом, индивидуальные обонятельные нейроны содержат всевозможные композиции транскриптов prxds (Табл. 2). Это указывает на существование гетерогенности в популяции морфологически одинаковых клеток.
4.3. Анализ обнаруженной клеточной гетерогенности.
Что может быть источником обнаруженных клеточных вариаций? С точки зрения содержания транскриптов пероксиредоксинов различных типов, популяция нейронов обонятельного эпителия исключительно гетерогенна.
Отсутствие транскриптов гена в образце означает, что этот ген в исследуемом материале не экспрессирован. Однозначно такой должна быть интерпретация наших результатов, если бы мы исследовали не одиночную клетку, а группу клеток, клеточную популяцию или ткань. Однако при интерпретации результатов анализа одиночных клеток необходимо принимать во внимание существование шума в экспрессии генов. Несмотря на существование четких регуляторных механизмов, в процессе экспрессии генов неизбежно присутствуют элементы случайных флуктуаций (Raser, OТShea, 2004, 2005; Samoilov et al., 2006). Согласно концепции стохастической экспрессии генов фундаментальной основой таких флуктуаций является случайный характер биохимических реакций, протекающих в клетке (van Kampen et al., 1992). Химические реакции протекают в предсказуемой манере при условии, если в них принимает участие большое количество молекул. Однако если клетка содержит всего несколько молекул специфического типа, стохастические эффекты становятся неизбежными. Тот факт, что индивидуальные гены присутствуют в клетке обычно в виде одной или нескольких копий, означает, что эти флуктуации не сглаживаются, а наоборот являются источником различий в индивидуальных клетках.
Рис. 20. Композиции транскриптов рrdx1- рrdx6 в одиночных обонятельных нейронах.
Таблица 2. Композиция транскриптов рrdx1- рrdx6 в одиночных обонятельных нейронах Клетка prdx 1 prdx 2 prdx 3 prdx 4 prdx 5 prdx 1 + - + - + + 2 + - - + + + 3 - + - - - + 4 + + - - + + 5 + + - - - + 6 + - + - + + 7 + + - - + + 8 + + + - + + 9 + + - + - + 10 + + + - - + 11 + + - - + - 12 + + - - - - 13 + - - + - + 14 + - - - - + 15 + + + + - + 16 + + + - - + 17 + + - - + + 18 + + - - - + 19 + + - + - - 20 + - - + - + 21 + + + - - + В соответствии с гипотезой двух состояний система экспрессии генов является бистабильной. Основой бистабильности является то, что транскрипционный статус гена определяется двумя альтернативными состояниями - активным или неактивным. Переходы между активным и неактивным состояниями спонтанны. Эти переходы могут возникать в результате нечастых событий изменения в нуклеосомной укладке на промоторных участках ДНК (Becskei et al., 2005; Raj et al., 2006; Raser and OТShea, 2004), в результате связывания (или диссоциации) с промотором регуляторных молекул, вовлеченных в транскрипцию (Blake et al, 2003; Razer, OТShea, 2004;
Goldin et al., 2005), или из-за пауз, сопутствующих работе РНК полимеразы (Voliotis et al., 2008). Стохастический характер переходов определяет наличие так называемых транскрипционных вспышек, которые имеют случайный характер (Raj et al., 2006, Shahrezaei, Swain 2008). Наличие факторов транскрипции, их уровень может отражаться лишь на амплитуде вспышек, но не на их частоте, поскольку стохастичность является внутренним свойством системы. Флуктуации в состояниях активности индивидуальных генов, а также высокая скорость деградации мРНК определяют динамику уровня специфических мРНК транскриптов в клетке, который может быть либо высоким (что соответствует активному состоянию соответствующего гена), либо низким (во время неактивного состояния гена). Если интервал между двумя вспышками продукции мРНК превышает время жизни мРНК, синтезированной во время предыдущей вспышки, то можно ожидать, что в определенные моменты клетка вообще не будет содержать этих транскриптов.
Заметим, что на уровне одиночной клетки отсутствие транскриптов гена вовсе не означает отсутствие белковых продуктов этого гена, поскольку время жизни белков в несколько раз превышает время жизни мРНК. Этим обусловлено сглаживание размаха флуктуаций в динамике уровня белка в клетке, по сравнению с соответствующей динамикой уровня мРНК (Shahrezaei et al., 2008).
На уровне клеточной популяции, клеточной культуры или ткани, наличие белкового продукта диктует присутствие в образце кодирующей его мРНК. Это следует из центральной догмы молекулярной биологии. Однако на уровне одиночной клетки дискретный характер передачи информации в системе экспрессии генов обусловливает существование моментов, когда в клетке присутствуют молекулы белка, но отсутствует кодирующая его мРНК.
Поскольку переходы между активным и неактивным состояниями индивидуального гена не могут быть синхронизированы в отдельных клетках популяции, неизбежны межклеточные вариации. Учитывая выше сказанное, можно предположить, что на уровне одиночных клеток мы как раз обнаруживаем фенотипические последствия шума в экспрессии генов, проявлением которого являются вариации в репертуаре молекул пероксиредоксинов в различных обонятельных нейронах.
Существует, однако, возможность, что обнаруженные вариации могут быть последствием шума технического. Для проверки такой возможности мы провели амплификацию РНК, выделенной из обонятельного эпителия мыши и разбавленной до 20 пикограмм, что соответствует приблизительному уровню тотальной РНК одиночной клетки. Исследования велись по тому же протоколу, который был применен при анализе одиночных клеток. Амплифицированная мРНК использовалась в качестве матрицы в ПЦР с ген-специфическими праймерами. На рисунке 21 приведены результаты этого эксперимента, показывающие, что транскрипты всех шести prdxs представлены в образце, исключая, тем самым, технический шум как источник обнаруженных вариаций в композиции prdxs в одиночных клетках.
Рис. 21. Анализ экспрессии шести рrdx. В качестве матрицы использовались 20 пг тотальной РНК обонятельного эпителия мыши, амплифицированной с помощью комбинации методов линейной и экспоненциальной амплификации.
Наши результаты показывают, что измерения, сделанные на группе клеток, дают представления о среднестатистической клетке, что неизбежно маскирует поведение индивидуальных клеток в системе. Ни в одной из исследованных клеток профиль экспрессии генов (Рис. 20) не соответствует усредненному измерению (Рис. 21).
Предположим, что источником экспериментально обнаруженных вариаций в фенотипе обонятельных нейронов являются флуктуации транскрипционных фаз различных генов, происходящих в популяции клеток асинхронно. В этом случае, индивидуальная клетка должна транскрибировать в различные моменты времени различные комбинации prdxs, т.е. она имеет вероятностный фенотип.
Иными словами, каждый обонятельный нейрон экспрессирует все шесть prdxs, но фазы транскрипции индивидуальных генов не синхронизованы.
Косвенной поддержкой нашего предположения являются результаты исследований профиля транскрипции ряда генов (-актина, инсулина I и II, каналов SUR1 и Kir6.2) в одиночных клетках островков Лангерганса поджелудочной железы с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени (Bengtsson et al., 2005). В исследованных клетках была найдена корреляция только для уровня чрезвычайно высоко представленных транскриптов инсулина I и II (несколько тысяч копий на клетку). Для остальных транскриптов была обнаружена обширная вариабельность содержания в индивидуальных клетках.
При этом 96% образцов содержали транскрипты, как минимум, одного гена, во многих клетках отсутствовали транскрипты, как минимум, одного гена, и самое интересное, что только 83% клеток содержали транскрипты гена домашнего хозяйства, кодирующего -актин. Авторы никак не прокомментировали возможных причин отсутствия транскриптов гена актина в клетке (ведь белковый продукт этого гена точно присутствует!), однако исключили в качестве возможной причины технические артефакты (Bengtsson et al., 2005).
Каково физиологическое значение обнаруженных межклеточных вариаций в экспрессии prdxs? По крайней мере, одно из них очевидно: чем больше вариабельных компонентов содержит система, независимо от молекулярных механизмов, обусловливающих эти вариации, тем выше уровень ее приспособляемости к изменениям окружающей среды. Гетерогенность является способом увеличения размаха ответов на изменяющие условия. С момента открытия пероксиредоксинов в 90-х годах прошлого века возник вопрос: каково функциональное значение их избыточности (redundancy)? Зачем клеткам нужны сразу несколько или все из шести белков, обладающих высоким уровнем структурной гомологии, выполняющих одинаковую функцию и, как правило, являющихся мажорными белками. Дополняют ли пероксиредоксины друг друга функционально или действуют индивидуально в обеспечении антиоксидантной защиты и редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации? Ответы на эти вопросы до сих пор являются предметами дискуссий. Можно предположить, что избыточность близких в функциональном отношении генов в геноме гарантирует, что в любой момент времени в клетке присутствуют транскрипты хотя бы одного из них, несмотря на наличие флуктуаций в процессе их экспрессии.
Нельзя исключить, что дифференциальный паттерн экспрессии отражает истинную клеточную гетерогенность, т.е. каждый нейрон независимо выбирает, какие гены из репертуара шести пероксиредоксинов ему экспрессировать, и имеет стабильный фенотип. В этом случае, в обонятельном эпителии должны присутствовать многочисленные субпопуляции нейронов, которые отличаются по композициям содержащихся в них пероксиредоксинов.
Если отбросить в сторону концепцию стохастической экспрессии генов, то найденные в данной работе межклеточные вариации в композиции пероксиредоксинов могут свидетельствовать о том, что каждый из шести пероксиредоксинов функционирует индивидуально, а отсутствие любого из них в клетке компенсируется наличием нескольких других. В этом может состоять значение избыточности наличия в клетке этих чрезвычайно важных в функциональном отношении белков.
Заключение.
Цикл работ, представленных в диссертации, посвящен исследованию белков, вовлеченных в сигнальные процессы во вкусовых клетках и обонятельных нейронах. Особое внимание мы уделили тиол-зависимым пероксидазам, пероксиредоксинам, участвующим в редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации. Для обонятельных нейронов этот вид сигнализации имеет особое значение, поскольку постоянное обновление этих клеток происходит под влиянием многочисленных факторов роста, в трансдукции сигналов которых перекиси водорода отводится роль вторичного посредника.
Пероксиредоксины выполняют две функции - пероксидазную и сигнальную, реализация которых в клетке может происходить за счет белок-белковых взаимодействий. Мы выявили новые потенциальные партнеры по взаимодействию с пероксиредоксином 6 в обонятельном эпителии крысы.
Интересно, что все они оказались редокс-чувствительными белками. Мы предложили механизм, посредством которого белок-белковые взаимодействия могут затрагивать функциональную активность пероксиредоксина 6 in vivo.
Сигнальные белки в данной работе изучались на уровне ткани, группы клеток, одинаковых по своим электрофизиологическим характеристикам, и, наконец, нам удалось добиться разрешения на уровне одиночной клетки. В ходе работы была разработана методология анализа экспрессии генов в одиночных хемосенсорных клетках, основанная на глобальной амплификации мРНК.
Сравнительный анализ методов экспоненциальной и линейной амплификации применительно к исследованию одиночных хемосенсорных клеток показал, что экспоненциальная амплификация имеет преимущества в чувствительности и методологической простоте.
Целесообразность проведения исследований по экспрессионному анализу, прежде всего, диктовалась результатами электрофизиологического анализа одиночных клеток. В результате мы дополнили электрофизиологический портрет хемосенсорной клетки ее молекулярным портретом. Анализ экспрессии генов в одиночных клетках позволяет получить их молекулярный портрет, и мы представили убедительные доказательства, что на уровне популяции эти портреты чрезвычайно отличаются.
Проведение исследований одновременно на группе клеток и на одиночных клетках позволило сделать вывод о том, что результаты анализа одиночных клеток нуждаются в особой интерпретации. Например, согласно центральной догме молекулярной биологии направление передачи информации ген - мРНК - белок диктует, что если в образце есть белок, то должна быть и кодирующая его мРНК. Это условие непременно выполняется на уровне клеточной популяции, ткани или группы клеток. Однако является ли оно безусловным применительно к измерениям, сделанным на уровне одиночных клеток? Дискретный характер передачи информации в системе экспрессии генов, отличающейся бистабильностью, а также продолжительность жизни белков, намного превышающая время жизни мРНК, определяют такие моменты в клеточном цикле, когда при наличии в клетке белка кодирующая его мРНК может отсутствовать. При попытке объяснить обнаруженные клеточные вариации в паттернах экспрессии мы обратились к концепции стохастической экспрессии генов. Базируясь на этой концепции, мы выдвинули предположение, что индивидуальная клетка имеет вероятностный фенотип в том смысле, что в различные моменты времени она содержит различные комбинации транскриптов, ко-экспрессия которых детектируется в контрольных экспериментах на уровне популяции или группы клеток. Хотя в работе исследовались исключительно вкусовые клетки и обонятельные нейроны, ее результаты позволили увидеть проявление феномена общебиологического характера, а именно клеточную гетерогенность. Гетерогенность является фундаментальным свойством биологических систем. Но какие основания есть для этого утверждения применительно к клеткам, тем более у исследователей, работающих с клеточной популяцией, культурой, тканью? Усредненные измерения, сделанные на группе клеток, могут отражать признаки большинства клеток этой группы, но при этом теряются признаки, свойственные единичным клеткам, которые как раз могут иметь особое функциональное значение. Кроме того, при усредненных измерениях неизбежно теряется информация, которая может быть зашифрована в самой гетерогенности. Результаты диссертации ставят интересную задачу ее интерпретации.
Выводы.
1. Во вкусовой почке мыши пуринергическая сигнализация происходит при участии множественных метаботропных пуринорецепторов, включая P2Y1, P2Y2, P2Y4 и P2Y6.
2. Анализ экспрессии во вкусовой ткани генов, кодирующих 1-субъединицу Са2+-каналов L-типа выявил транскрипты 1С и 1D при существенно более высоком уровне экспрессии 1С.
3. Разработана методология анализа экспрессии генов в одиночных хемосенсорных клетках, основанная на глобальной амплификации мРНК.
Сформирована стратегия экспрессионного анализа генов, имеющих процессированные псевдогены или не содержащих интроны, на уровне одиночных клеток.
4. На уровне одиночных вкусовых клеток получены профили ко-экспрессии генов, кодирующих ряд рецепторных (CASR, GPRC6A, T1R3), сигнальных (гастдуцин, PLC2), канальных (TRPM5, PKD2L1, коннексины, паннексин 1) и маркерных белков (NTPD2, SNAP-25). Показано, что транскрипты рецептора CASR локализованы в клетках типа I и III, транскрипты рецептора GPRC6A присутствуют исключительно в клетках типа I, а клетки типа II не содержат транскриптов этих рецепторов.
5. Получены прямые доказательства соответствия электрофизиологического и молекулярного портретов одиночных вкусовых клеток.
6. На уровне одиночных обонятельных нейронов выявлены многочисленные вариации в репертуаре транскриптов, кодирующих белки семейства пероксиредоксинов.
7. Предложено объяснение обнаруженной клеточной гетерогенности в контексте концепции стохастической экспрессии генов.
8. Специфический маркер зрелых обонятельных нейронов, обонятельный маркерный белок, обнаружен в клетках вкусовых почек желобоватого сосочка языка.
9. Выявлены новые потенциальные партнеры по взаимодействию с пероксиредоксином 6; все они оказались редокс-чувствительными белками.
Публикации.
Обзорные публикации.
1. Romanov R.A., Rogachevskaja O.A., Bystrova M.F., Kolesnikov S.S. Afferent output in mammalian taste cells. A role of electrical excitability in mediating transmitter release. В книге: Action Potential: Biophysical and Cellular Context, Initiation and Phases and Propagation. Ed. Columbus F. Nova Science Publishers, Inc., New York.
2010, p.133-157.
2. Быстрова М.Ф., Буданова Е.Н. Перекись водорода и пероксиредоксины в редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации. Биологические мембраны.
2007, т.24, с.115-125.
3. Колесников С.С., Быстрова М.Ф. Термочувствительные ионные каналы.
Биологические мембраны. 2006, т.23, с.119-128.
Статьи 4. Budanova E.N., Bystrova M.F. Peroxiredoxin-6-interacting proteins in rat olfactory epithelium. Биологические мембраны, 2011, т.28(4), с.254Ц261.
5. Романов Р.А., Быстрова М.Ф., Рогачевская О.А., Колесников С.С. Канальная активность рекомбинантного паннексина 1. Биологические мембраны, 2011, т.(5), 114-120.
6. Романов Р.А., Быстрова М.Ф., Рогачевская О.А., Колесников С.С.
Идентификация ионных каналов TRPM5 во вкусовых клетках II типа.
Нейрофизиология/Neurophysiology. 2011, т.43(3), с.
7. Bystrova M.F., Romanov R.A., Rogachevskaja O.A., Churbanov G.D., Kolesnikov S.S. Functional expression of the extracellular calcium-sensing receptor in mouse taste cells. Journal of Cell Sciences, 2010, v.123, p.972-982.
8. Рогачевская О.А., Кабанова Н.В., Быстрова М.Ф., Романов Р.А., Королькова Ю.В., Гришин Е.В., Колесников С.С. Исследование Р2Х2 и Р2Х3 рецепторов в гетерологической системе. Сборник статей Рецепция и внутриклеточная сигнализация. Пущино. 2011, т.1, с.246-251.
9. Буданова Е.Н., Быстрова М.Ф. Выявление обонятельного маркерного белка в тканях с эктопической экспрессией генов обонятельных рецепторов.
Биологические мембраны, 2010, т.27(1), с.138-142.
10. Романов Р.А., Яценко Ю.Е., Кабанова Н.В., Быстрова М.Ф., Колесников С.С.
Потенциал-зависимые Са2+ каналы вкусовых клеток типа III. Биологические мембраны, 2009, т.26(4), с.258-264.
11. Буданова Е.Н., Быстрова М.Ф. Выявление обонятельного маркерного белка в тканях, экспрессирующих обонятельные рецепторы. Статья в сборнике Рецепция и внутриклеточная сигнализация, Пущино, 2009, с.247-249.
12. Буданова Е.Н., Быстрова М.Ф. Поиск белок-белковых взаимодействий пероксиредоксина 6 с применением метода дрожжевой двухгибридной системы.
Генетика, 2008, т. 44(2), с.170-176.
13. Романов Р.А., Рогачевская О.А., Быстрова М.Ф., Хохлов А.А., Колесников С.С. Механизм афферентной трансмиссии во вкусовых рецепторных клетках II типа. Статья в сборнике Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем. 2008, Минск. Издательский центр БГУ. с. 260261.
14. Вystrova M.F., Budanova E.N., Fesenko E.E. An interaction between redoxsensitive proteins beta-actin and peroxiredoxin in rat olfactory epithelium. Статья в сборнике Biological motility. Achievements and perspectives, 2008, v.2, р.210-212.
15. Romanov R.A., Rogachevskaja O.A., Bystrova M.F., Jiang P., Margolskee R.F., Kolesnikov S.S. Afferent neurotransmission mediated by hemichannels in mammalian taste cells. EMBO J. 2007, v.26, p.657-616. Bystrova M.F., Yatzenko Y.E., Fedorov I.V., Rogachevskaja O.A., Kolesnikov S.S. P2Y isoforms operative in mouse taste cells. Cell Tissue Research, 2006, v.323, p.377Ц317. Романов Р.А., Хохлов А.А., Быстрова М.Ф. Яценко Ю.Е., Рогачевская О.А., Колесников С.С. Мониторинг выброса АТР из одиночных клеток. Метод биосенсора. Биологические мембраны, 2007, т.24, 3с.16-321.
18. Быстрова М.Ф., Буданова Е.Н., Новоселов В.И., Фесенко Е.Е. Исследование четвертичной структуры пероксиредоксина 6. Биофизика, 2007, т.52(3), с.436-419. Романов Р.А., Рогачевская О.А., Быстрова М.Ф., Колесников С.С.
Функциональный анализ вкусовых рецепторных клеток типа II. Статья в сборнике Рецепция и внутриклеточная сигнализация. Пущино, 2007.
20. Novoselov S.V., Peshenko I.V., Popov V.V., Novoselov V.I., Bystrova M.F., Evdokimov V.A., Kamzalov S.S., Merkulova M.I., Shuvaeva T.M., Lipkin V.M., Fesenko E.E. Localization of the 28-kDa peroxiredoxin in rat epithelial tissues and its antioxidant properties. Cell and Tissue Research, 1999, v.298, p.471-480.
21. Merkulova M.I., Andreeva S.G., M.I., Shuvaeva T.M., Novoselov V.I., Peshenko I.V., Bystrova M.F., Novoselov S.V., Fesenko E.E., Lipkin V.M. A novel 45 kDa secretory protein from rat olfactory epithelium: primary structure and localization.
FEBS Lett. 1999, v.450, p.126-130.
22. Новоселов В.И., Пешенко И.В., Новоселов С.В., Камзалов С.С., Быстрова М.Ф., Евдокимов В.А., Николаев Ю.В., Фесенко Е.Е. Протекторная активность 1-Cys пероксиредоксина определяется его пероксидазной активностью.
Биофизика, 1999, т.44, с.568-570.
23. Новоселов В.И., Пешенко И.В., Евдокимов В.А., Камзалов С.С., Новоселов С.В., Быстрова М.Ф., Николаев Ю.В., Фесенко Е.Е. Свойства каталитического центра секреторного 28 кДа (1-Cys пероксиредоксина) из обонятельного эпителия крысы. Биофизика, 1998, т.43, с.610-616.
24. Николаев Ю.В., Евдокимов В.А., Попов В.И., Быстрова М.Ф.
Надмолекулярная организация обонятельного рецепторного аппарата крысы:
окализация рецепторных элементов и ГТФ-связывающий белков, ассоциированных с рецептором. Сенсорные системы, 1992, т.6(3), с.128-130.
25. Fesenko E.E., Novoselov V.I., Bystrova M.F. Properties of odorbinding glycoproteins from rat olfactory epithelium. Biochim. Biophys. Acta, 1988, v.937, p.369- 378.
26. Philippova T., Novoselov V., Bystrova M., Alexeev S. Microwave effect on camphor binding to rat olfactory epithelium. Bioelectromagnetics, 1988, v.9, p.347-327. Novoselov V.I., Bystrova M.F., Fesenko E.E. The subunits of odor-binding glycoproteins from rat olfactory epithelium. FEBS Lett. 1987 v.219, p.224- 226.
28. Новоселов В.И., Быстрова М.Ф., Фесенко Е.Е. Свойства рецепторных элементов из обонятельного эпителия крысы. Сенсорные системы, 1987, т.1(1), с. 7-13.