Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ОБУХОВА Лариса Михайловна
РОЛЬ ПРОТЕИНОВ В ФОРМИРОВАНИИ СТРУКТУРНОГО МАКРОПОРТРЕТА ПЛАЗМЫ КРОВИ ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ ОРГАНИЗМА
03.01.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Нижний Новгород 2010
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Нижегородской государственной медицинской академии Министерства здравоохранения и социального развития
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Конторщикова Клавдия Николаевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Копытова Татьяна Викторовна доктор биологических наук, профессор Корягин Александр Сергеевич доктор медицинских наук, профессор Бояринов Геннадий Андреевич
Ведущая организация: ФГУ Российский научно-клинический центр геронтологии Министерства здравоохранения и социального развития
Защита состоится л 11 февраля 2010 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д.212.166.15 Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, д. 23, корп. 1, биологический факультет Факс: (8312) 65-82-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского.
Автореферат разослан л 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент C.В. Копылова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Интоксикация- нарушение жизнедеятельности, вызванное токсическими веществами, проникшими в организм извне (экзогенная интоксикация) или образовавшимися в нем (эндогенная интоксикация). Проявления интоксикации зависят от характера токсического вещества, его физико-химических свойств, сродства к определенным органам, физиологическим системам, тканям, субклеточным структурам, рецепторам, ферментам и т.д. Эндогенная интоксикация сопровождает развитие различных патологических состояний, существенно отягчая их течение (Добротина Н.А., Копытова Т.В., 2005). Нарушение гомеостаза при данном синдроме обуславливает такие феномены, как блокада ферментных систем биоэнергетики с гистотоксическими последствиями, разбалансировка работы иммунных систем, апоптоз и цитолиз (Щекотов В.В., 2005). В связи с этим, исследование процессов интоксикации как неспецифического синдрома, возникающего под влиянием различных токсических веществ, имеет важное значение. Одним из факторов, определяющих развитие интоксикации независимо от причины последней, является активация свободнорадикальных процессов (Alam K,, Moinuddin W., Jabeen S., 2007).
Белки благодаря особенности своего строения, являются ловушкой активных форм кислорода (Halliwel B., 1992; Caraceni P. et al, 1997). В силу этого изменение структурной организации белковых молекул можно считать одним из ранних индикаторов повреждения ткани при интоксикации любого генеза. Однако до сих пор отсутствуют методические подходы для скрининга этиологии интоксикации, отличающиеся достоверностью, интегральной оценкой и простотой исполнения.
Метод клиновидной дегидратации биологических жидкостей (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 1996) дает возможность получать объективные данные, позволяющие выявлять патологические отклонения на ранних этапах и контролировать даже незначительные изменения в динамике заболевания.
Принцип метода заключается в анализе системной организации биожидкости после перевода ее в твердую фазу при испарении воды. Такая трансформация предоставляет качественно новые сведения о состоянии системы в целом или ее составляющих. На данный момент выявлены некоторые особенности структурного макропортрета сыворотки крови при терминальных стадиях интоксикации (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 2001).
В то же время при меньших степенях ее выраженности описание параметров структурного макропортрета сыворотки (плазмы) крови отсутствует.
Несмотря на то, что формирование структур в дегидратированных каплях многокомпонентных жидкостей привлекает пристальное внимание специалистов (Clint J., Fletcher P., Todorov I., 1999; Deegan R., 2000; Wang J., Evans J., 2006), вопрос о роли конформации протеинов в образовании структурного макропортрета (дегидратированной структурированной пленки капли биологической жидкости, полученной с помощью метода клиновидной дегидратации) плазмы крови в целом и при интоксикации, в частности, остается открытым. Уточнение этих сторон патогенеза может быть основой совершенствования контроля за течением заболевания и повышения эффективности терапии.
Одним из биологически активных агентов, способных снижать степень эндотоксемии, является озон (Бояринов Г.А. и др., 1979). Биологический эффект озона реализуется посредством влияния на клеточные мембраны и заключается в нормализации уровня редокс-потенциала организма (Конторщикова К.Н., Перетягин С.П., 2007). Детоксикационный эффект озона связан с оптимизацией микросомальной системы гепатоцитов и усилением почечной фильтрации (Перетягин С.П., 1991). В то же время влияние озона на состояние белков плазмы крови при эндогенной интоксикации практически не исследовано. В связи с этим проблема изучения параметров протеинов плазмы крови при интоксикации и ее коррекции остается актуальной.
Целью настоящего исследования является изучение роли белков в формировании структурного макропортрета плазмы крови при интоксикации, разработка на этой основе критериев оценки тяжести, этиологии, прогноза заболевания и обоснования коррекции данного состояния низкими терапевтическими дозами озона.
Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Определить локализацию белковых фракций сыворотки крови в ее структурном макропортрете.
2. Установить взаимосвязь характеристик макромолекул протеина и важнейших биохимических показателей плазмы крови с формированием микротрещин в структурном макропортрете.
3. Провести сравнительное исследование структурного макропортрета сыворотки крови позвоночных животных различных таксономических групп.
4. Исследовать воздействие модельных соединений разной степени токсичности на параметры структурного макропортрета раствора сывороточного альбумина.
5. Изучить взаимосвязь содержания веществ низкой и средней молекулярной массы, олигопептидов, окисленно модифицированных белков, интенсивности свободнорадикальных процессов и процессов перекисного окисления липидов с формированием аномальных особенностей структурного макропортрета плазмы крови при эндогенной интоксикации различной степени тяжести и этиологии; обосновать объем признаков структурного макропортрета плазмы крови, значимых при интоксикации.
6. Проанализировать особенности влияния экзогенных токсикантов (наркотических веществ и этанола) на состояние протеинов плазмы крови.
7. Оценить дозозависимый эффект озона на белки плазмы крови in vitro и in vivo при коррекции эндогенной интоксикации.
Научная новизна. Впервые выявлены новые закономерности становления биохимических механизмов формирования фации, обусловленные параметрами протеинов плазмы крови: установлены зоны локализации белков различных фракций; доказана взаимосвязь структуры молекул протеинов с характером формирования трещин в макропортрете. Впервые показано, что характер микротрещин фации сыворотки крови позвоночных животных тем более различен, чем более далеки организмы в филогенетическом отношении.
Впервые сформулирована концепция, согласно которой развитие процессов интоксикации обусловлено стереотипными реакциями организма на воздействие токсиканта, приводящими к активации процессов свободнорадикального окисления при детоксикации и окислительной модификации белков плазмы крови. Впервые показано, что при терминальной стадии эндогенной интоксикации определяющими являются процессы фрагментации протеинов, сопровождаемые увеличением содержания олигопептидов в плазме крови и появлением в фации патологических структур типа морщин и языковых полей; при менее тяжелых стадиях ЭИ преобладающими в деструктивных процессах белкового обмена является образование карбонильных производных в результате окислительной модификации белков, при этом характер нарушений в молекулах протеинов определяется особенностями субстратов интоксикации.
Впервые установлено, что развитие интоксикации при наркотическом отравлении происходит при вкладе в пул веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ) продуктов окислительной деградации иммуноглобулинов при появлении в морфологической картине сыворотки крови штриховых трещин в центральной зоне, и развитии ацидоза.
Впервые установлено, что механизмы воздействия озона на белки обусловлены их окислительной модификацией при свободнорадикальном окислении, что сопровождается изменениями в структурном макропортрете плазмы крови; при этом эффект определяется как концентрацией О3, так и исходным состоянием протеина.
Теоретическая и практическая значимость работы. Работа является фундаментальным теоретическим исследованием с перспективным практическим выходом. Проведенные исследования углубляют существующие представления о роли протеинов в формировании морфологической структуры плазмы крови в норме и о молекулярнобиохимических механизмах нарушения их конформации при интоксикации.
По результатам исследования внедрены критерии для оценки пространственной структуры молекул протеинов, которые могут быть использованы для определения класса опасности водных отходов (патент на изобретение № 2369867 от 10.10.09г.), диагностики эндогенной интоксикации (патентная заявка №2007139372 от 25.10.07г., положительное решение от 11.08.09 г.) и наркотического отравления (патент на изобретение N2332666 от 27.09.08г.). Последний способ исследования рекомендован к применению в работе судебно-медицинских экспертов (Информационнометодическое письмо от 15.09.08 г.) и награжден дипломом III степени на IIIем конкурсе объектов интеллектуальной собственности Нижегородской области им. И.П. Кулибина в номинации Медицина 2008 г.
Основополагающее значение в применении метода клиновидной дегидратации в клинической и исследовательской практике имеет выявленное месторасположение белков в фации сыворотки крови с помощью разработанной модификации с применением красителей (патентная заявка № 2008111262 от 24.03.08г., положительное решение от 01.06.09 г.).
Установленный химический состав включений в краевой зоне фации плазмы крови, обусловленный фракциями билирубина, позволяет применять метод клиновидной дегидратации для диагностики билирубинопатий.
Результаты исследования воздействия озона на пространственную структуру белковых молекул плазмы крови научно обосновывают применение метода клиновидной дегидратации для подбора дозы О3 при озонотерапии.
Полученные результаты диссертационной работы внедрены в практику Государственного учреждения здравоохранения Нижегородское областное бюро судебно-медицинской экспертизы, а также используются в лекциях и семинарах на кафедре клинической лабораторной диагностики ГУЗ Нижегородской государственной медицинской академии.
Положения, выносимые на защиту:
1. Локализация белковых фракций в структурном макропортрете сыворотки крови складывается следующим образом: альбумины- краевая зона; и -глобулины- промежуточная зона, -глобулины- центральная зона.
2. Особенности строения молекул белка определяет характер трещин фации его раствора.
3. Отличие в форме трещин структурного макропортрета сыворотки крови у животных различных таксономических групп обусловлены разным составом и пространственной структурой ее белков, причем отличия тем более выражены, чем более далеки друг от друга организмы в филогенетическом отношении.
4. Воздействие солей металлов и соединений различных классов опасности на сывороточный альбумин приводит к формированию аномальных особенностей в структурном макропортрете его раствора.
5. Неспецифическим механизмом развития интоксикации является нарушение структуры белков, вызванное их окислительной модификацией при активации свободнорадикальных процессов, что обуславливает появление в структурном макропортрете плазмы крови аномальных особенностей.
6.Воздействие озона на белки плазмы крови заключается в их окислительной модификации, направление и степень которой определяются как используемой концентрацией озона, так и структурными особенностями белковых молекул. Низкие дозы озона способны снижать уровень окислительной модификации белков плазмы крови больных.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены на Областной конференции судебно-медицинских экспертов (Нижний Новгород, 2007), Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 90-летию член-корр. АМН СССР, профессора Н.Ю. Беленкова (Нижний Новгород, 2007), V Украинско-Русской научно-практической конференции с международным участием Озон в биологии и медицине (Украина, Ялта, 2008), V Международной конференции и дискуссионном научном клубе Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (Украина, Гурзуф, 2008), Всероссийском научноприкладном семинаре Озон и другие экологически чистые окислители.
Наука и технологии (МГУ, Москва, 2008), V Международной научной конференции Кинетика и механизм кристаллизации. Кристаллизация для нанотехнологий, техники и медицины (Иваново, 2008), международной конференции Высокоинтенсивные физические факторы в медицине, биологии, экологии и сельском хозяйстве (Саров, 2008), Всероссийской конференции молодых ученых и школе Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты имени ак. Н.М. Эммануэля (Москва, 2008), 19th World Congress & Exhibition International Ozone Association (Tokyo, Japan, 2009), V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием Озон, активные формы кислорода и методы интенсивной терапии в медицине (Н.Новгород, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 37 работ, из них 11Ц в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК МО РФ; 1Ц учебно-методическое пособие; получены 2 патента РФ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 258 страницах машинописного текста; состоит из введения; обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов; выводов, списка литературы, включающего 4источников, из которых 261- отечественных и 143 иностранных, приложения;
содержит 50 таблиц и 73 рисунка.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования проведены на базе кафедры клинической лабораторной диагностики и Центральной научно-исследовательской лаборатории Научноисследовательского института прикладной и фундаментальной медицины Нижегородской государственной медицинской академии, лаборатории промышленной и экологической токсикологии НИИ химии Нижегородского государственного университета, Института химии высокочистых веществ Российской академии наук, Института прикладной физики Российской академии наук, Научного центра волоконной оптики Российской академии наук. Работа состоит из экспериментальной и клинической части, общий объем исследований приведен в табл.1.
Проведено исследование плазмы и эритроцитов крови, мочи, полученных от 343 больных при интоксикации различного генеза. По характеру интоксикации обследованные составили две группы: 1 - больные с эндогенной интоксикацией; 2 - больные с наркотическим и алкогольным отравлениями. В исследование вошли 142 мужчин и 201 женщин, в возрасте от 16 до 72 лет, при этом старше 60 лет было 14%.
Таблица Биологические материалы, использованные в работе №п/п Вид биологического материала Методика исследования Кол-во исследов аний 1 лягушек Метод клиновидной дегидратации. 2 домашних уток 3 белых беспородных 1лабораторных мышей 4 белых беспородных 1лабораторных крыс 5 домашних свиней 6 коров 47 Плазма крови человека Общеклинические биохимические 20цитратная методы; определение ВНСММ;
олигопептидов; окисленно модифицированных белков;
интенсивности свободнорадикальных процессов методом индуцированной хемилюминесценции;
уровня диеновых, триеновых коньюгатов и оснований Шиффа;
вязкости; ИК-Фурье спектроскопия;
метод клиновидной дегидратации.
8 Сыворотка крови человека Метод клиновидной дегидратации; 52определение динамики акустомеханического импеданса;
определение общего белка и белковые фракции сыворотки крови.
9 10% раствор сывороточного Метод клиновидной дегидратации, 17альбумина окислено модифицированных белков; интенсивности свободнорадикальных процессов методом индуцированной хемилюминесценции; определение вязкости.
10 Водорастворимые токсиканты Метод клиновидной дегидратации; 5различной химической природы биотестирование с использованием Ceriodaphnia affinis.
11 Деионизированная вода и 0,9% УФ-спектроскопия; ионная 5водный раствор хлорида натрия хроматография; методы аналитической химии.
Всего 11005 анализов.
Сыворотка крови Обследованные контрольной группы (25 мужчин и 31 женщины) были сопоставимы по возрасту и полу с больными. Критерием для включения в эту группу служило отсутствие хронических заболеваний в стадии обострения, ОРВИ и употребления алкоголя в течение десяти дней до исследования, употребления наркотических веществ. Больные 1 группы подразделялись по типу эндогенной интоксикации (Черний В.И. и соавт., 2007): ИБС, вегетососудистая дистония, гипертоническая болезнь (обменный тип ЭИ);
хроническая обструктивная болезнь легких, почечная недостаточность, МКБ (ретенционный тип ЭИ); постинфарктное состояние, СДII, термическая травма (резорбционный тип ЭИ); ОРВИ (инфекционный тип ЭИ).
Коррекция эндогенной интоксикации осуществлялась малыми дозами озона на базе Нижегородского Медицинского Центра озонотерапии. Курс лечения состоял из внутривенного введения озонированного физиологического раствора с концентрацией озона 300- 400 мкг/л (6-процедур через день). Группу сравнения составили больные, проходившие лечение в Клинической городской больнице №5, включающее комплекс препаратов, влияющих на уровень липидного обмена, глюкозы и положительно воздействующих на вазодилатацию.
Обследованные 2 группы подразделялись по характеру токсического воздействия: этиловый и метиловый алкоголь, наркотические и сильнодействующие вещества: алколоиды опия, производные фенилалкиламина, 1,4-бензодиазепина и фенотиазина, угарный газ. Часть из них находилась на лечении в Наркологическом центре г. Нижнего Новгорода, часть поступила для обследования в Нижегородское бюро судебно-медицинской экспертизы. Диагноз ставился на основании общепринятых клинических критериев, секционной картины, результатов химических анализов и гистологического исследования.
Исследовались общеклинические показатели: СОЭ, содержание гемоглобина, лейкоцитов, фибриногена, С-реактивного белка. Оценка степени нарушений гомеостаза проводилась согласно уровню белкового (общий белок и белковые фракции сыворотки крови; остаточный азот- мочевина и креатинин); липидного (триглицеридов (ТГ), общего холестерина (Хс), Хс-ЛПНП, Хс-ЛПОНП, Хс-ЛПВП); пигментного (билирубин и его фракции); углеводного (глюкоза); минерального (Na, K, Ca, P) обменов и активности ферментов: аспартатаминотрансферазы (АсАт), аланинаминотрансферазы (ААт), щелочной фосфатазы (ЩФ), амилазы, глутамилтранспептидазы (ГГТП).
Оценка фации биологических жидкостей проводилась методом клиновидной дегидратации (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 1996), который позволяет делать видимой надмолекулярную организацию жидкостей путем перевода ее на макроуровень. Это осуществляется при высыхании капли биологической жидкости на твердой подложке. Для перевода признаков фации в цифровую форму разработана таблица (табл.2) (центральная зона описывается так же).
Таблица Цифровые обозначения кристаллооптических параметров фации плазмы крови Краевая зона Промежуточная зона Трещи Конкрец Особенност Трещин Конкре Кристаллы Особенно ны ии и ы ции сти 0-нет; 0-нет; 1- 0-нет; 1- 0-нет; 0-нет; 0-нет; 1- 0-нет; 11- единичн единичны; 1- 1- единичны; 2- единичны единич ы; 2- 2-мало; 3- единичн единичн мало; 3- ; 2-мало;
ны; 2- мало; 3- среднее ы; 2- ы; 2- среднее 3- мало; среднее количество; мало; 3- мало; 3- количество; 4- среднее 3- количес 4-много среднее среднее много количест средне тво; 4- количес количес во; 4е много тво; 4- тво; 4- много количе много много ство; 4много 1- 1-ближе 1-ближе к 1- 1-ближе 1-ближе к радиал к краю; краю; 2- радиаль к краю; краю; 2- ьные; 2- дальше от ные; 2- 2- дальше 2- дальше края; паралле дальше от края;
паралл от края; 3-по всей льные от края; 3-по всей ельные 3-по зоне краю; 3- 3-по зоне краю; всей под всей 3-под зоне углом зоне углом 1- 1- 1-языков. 1- 1- 1-зерна; 1-языков.
аркооб круглая; поля; 2- аркообр круглая; 2-иголки; 3- поля; 2разные 2- морщины; азные; 2- завитки; морщины ; 2- овальн. трещины:3-// 2- овальна 4-концентрич. ;
прямы // краю; ;4-штрих. ; прямые; я // завитки.; 5- трещины:
е; 3- 3- 5-круглые; 3-сеть; краю; 3- звездчатые; 6- 3-// ;4сеть; 4- овальн. 6-черая сеть; 4- овальна дендриты; 7- штрих. ;
обрывк радиаль 7-рыбья обрывк я колосовидн..; 5и сети; н.; 4- чешуя; 8- и сети; радиаль 8-массивы круглые;
5- неправи концентр.; 9- 5- ная; 4- дендритов; 6-черая округл. л. многолуч округл. неправи 9-массивы сеть; 7формы льной аморфн.; 10- рыбья формы морфн. чешуя; 8концентр.
; 9многолуч 1- 1- 1-малый; 2- 1- 1- 1-малый; 2- 1-малый;
малая; малый; средний; 3- малый; малый; средний; 3- 22- 2-средн.; большой 2- 2- большой средний;
средн.; 3- средн.; средний 3- 3- большой 3- ; 3- большой больша большо большо я й й Ширинар.
Прозррач.
Количество Расположение 0-нет; 1-есть Форма Размер 1-узкий; 2-средний; 3-широкий 1-прозрачная; 2-полупрозрачная; 3- непрозрачная Количество аномальных особенностей (маркеров) фации (рис.1) подсчитывалось в баллах (по десятибалльной системе), исходя из их количества, размера и площади, ими занимаемой.
Рис.1. Аномальные особенности фации биологической жидкости (50) Эндогенную интоксикацию изучали по уровню ВНСММ (по М.Я.
Малаховой, в модификации Т.В. Копытовой, 2007). При развитии патологии выявлялись стадии эндогенной интоксикации. Первая характеризовалась элиминацией токсинов за счет их переноса и частичной детоксикации эритроцитами. Вторая - фаза накопления токсичных продуктов, связана с насыщением эритроцитов и появлением эндотоксинов в плазме. В третьей стадии, фазе полного насыщения, наблюдалась максимальная концентрация патологических веществ в эритроцитах при повышении уровня токсических веществ в плазме. В четвертой стадии (фаза необратимой декомпенсации) количество токсинов в плазме продолжало нарастать, а в эритроцитах, потерявших транспортный и детоксикационный потенциал, падало.
Количество олигопептидов в плазме и эритроцитах после осаждения 12% хлорной кислотой белков с молекулярной массой более 5000 Да в составе МСМ определялись колориметрическим методом Лоури.
Редокс-потенциал организма оценивали согласно данным индуцированной хемилюминесценции (Кузьмина Е.И., 1983), перекисного окисления липидов (Волчегорский И.А.,1989), окислительной модификации белков (Дубинина Е.Е., 1995).
Экспериментальная часть работы включала:
1) Разработку модификации метода клиновидной дегидратации для определения локализации белков в фации сыворотки крови с использованием 0,5% р-ра гексапептида, 10% р-ра альбумина, сыворотки крови теленка, человека при добавлении спиртовых и водных растворов красителей.
2) Изучение фации сыворотки крови человека при липидемии с добавлением красителя амидочерный 10В до и после осаждения липопротеинов.
3)Исследование вязкости и параметров структурного макропортрета 10% раствора сывороточного человеческого альбумина при:
- различном сроке годности;
- денатурации (добавление 8М раствора мочевины);
- изменении кислотности раствора.
4) Анализ видовых особенностей фации сыворотки крови позвоночных животных: земноводных (лягушки- Rana lessonae); птиц (утки -Anas platyrhynchos); млекопитающих- мыши (Mus musculus), крысы (Rattus norvegicus), коровы (Bos taurus taurus), свиньи (Sus scrofa domesticus).
5) Разработку модификации методики клиновидной дегидратации для определения токсичности водных сред с использованием 10% раствора альбумина при добавлении культивационной воды (контроль) и высокотоксичных водных растворов в различных объемных соотношениях.
6) Сравнение результатов оценки токсичности водных растворы различных концентраций Fe2SO4, Cu SO4, KCr2O7, водных токсикантов разных классов опасности биотестированием с использованием дафний Ceriodaphnia affinis и методом клиновидной дегидратации.
7) УФ-спектроскопическое исследование кинетики распада озона, растворенного в воде и физиологическом растворе: нативного и при добавлении плазмы крови.
8) Определение содержания Н202, хлорсодержащих ионов, нитрат-ионов, массовой концентрации нитритов, аммиака и ионов аммония в озонированных жидкостях методами аналитической химии и ионной хроматографии.
9) Оценка влияния озона на состояние сывороточного человеческого альбумина in vitro методами клиновидной дегидратации, индуцированной биохемилюминесценции и окислительной модификации белков.
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ Microsoft Excel, Biostat 4.3, Statistica 6.0, и включала, кроме критерия Стьюдента, Критерий Кейсла-Ньюмана для проведения множественных сравнений, дискриминантный, линейный, регрессионный и кусочко-линейный регрессионный анализ. При оценке статистической достоверности различий для малых выборок и выборок с ненормальным распределением применялись непараметрические критерии Крускал-Уоллиса, Фридмана, Холмогорова-Смирнова. Для оценки достоверности взаимосвязи между различными параметрами использовали коэффициенты корреляции по Пирсону и Спирмену.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Обоснование некоторых параметров структурного макропортрета плазмы крови Интерпретация результатов анализа биологических жидкостей, проведенного методом клиновидной дегидратации, возможна только при известном местоположении различных фракций белков в фации. С помощью разработанной нами модификации данного метода с добавлением красителей, используемых в биохимии и гистологии для выявления белков, получено два типа картин сыворотки крови.
Применение альцианового голубого, селективного к кислым гликопротеинам (Селиванов Е.В., 2003), показало, что наиболее интенсивная окраска имеет место в центре капли. Добавление остальных красителей создавало изображение с различным количеством концентрических зон окраски. Выявлены достоверные корреляционные взаимосвязи содержания альбуминов с шириной краевой зоны; и -глобулинов- промежуточной зоны; -глобулинов- с шириной центральной зоны фации (табл.3). При увеличении уровня -глобулинов структурный макропортрет сыворотки крови отличался более широкой центральной зоной по сравнению с таковым практически здорового человека (рис. 2). При липидемии наблюдалось увеличение промежуточной зоны. Осаждение липопротеинов добавлением хлороформа с последующим центрифугированием при 11 тыс. об/мин (Скоупс Р., 1985) вызывало исчезновение промежуточной зоны фации.
Таблица Взаимосвязь ширины концентрических зон в фации сыворотки крови при добавлении красителей амидочерный 10В (1) и толуидиновый синий (2) с величинами концентраций ее белковых фракций Белковые Коэффициент корреляции фракции альбумины - - глобулины глобулины глобулины Ширина зон Краевая зона 0,495* -0,317 0,342 -0,571* 0,362 0,072 0,312 -0,516* 1-я промежуточная -0,129 0,475* -0,211 0,1зона (ближе к краю -0,575* 0,459* -0,238 0,3капли) 2-я промежуточная 0,245 -0,418* 0,552* -0,442* зона -0,094 -0,428* 0,443* -0,(ближе к центру капли) Центральная зона -0,441* 0,311 -0,326 0,603* -0,110 0,192 -0,528* 0,3*- статистически достоверный коэффициент корреляции (r0,4, уровень значимости p0,05) События, происходящие в капле сыворотки крови при высыхании, по своей природе ближе всего к процессу высаливания. При испарении влаги с поверхности капли концентрация растворенных в ней веществ повышается и при достижении предельной растворимости вещество выпадает в осадок.
Альбумины отличаются от глобулинов более высокой растворимостью в воде и солевых растворах. Но их содержание в сыворотке крови выше (около 60 % всего белка), чем глобулинов (Тиц Н.У., 1997). Вследствие этого, часть альбуминов, находящихся в краевой зоне, где концентрация соли выше, чем в центре, выпадает в осадок раньше иных белковых составляющих сыворотки.
Рис.2. Структурный макропортрет сыворотки крови практически здорового человека с добавлением толуидинового синего (20) Помимо этого, если в начале процесса дегидратации градиент температур и плотности по радиусу и высоте капли, обуславливающий возникновение центростремительных потоков (Deegan R., 2000) максимален, то, с течением времени происходит его снижение и интенсивность движения токов жидкости к краю капли уменьшается. Она способствует переносу небольших частиц (альбумины), но уже не обеспечивает передвижения крупных глобул. Благодаря этому после определенного момента глобулины не переносятся с током жидкости из центральной зоны и локализуются там.
Таким образом, учитывая вышесказанное, а также тот факт, что в состав - и -глобулиновых фракций входят липопротеины, складывается следующая картина расположения групп белков в фации сыворотки крови:
альбумины- краевая зона; и -глобулины (ЛПВП и ЛПНП)- промежуточная зона, -глобулины (иммуноглобулины)- центральная зона.
Одним из важнейших параметров структурного макропортрета биологической жидкости являются микротрещины, образующиеся при испарении рыхлосвязанной воды в процессе растяжения и сжатия полимерной пленки в результате свертывания молекул белка.
Денатурация белка (8М р-ром мочевины) приводит к разрушению нековалентных связей и развертыванию его глобулы, что, вероятно, обуславливает исчезновение трещин в фации раствора альбумина.
Наблюдающийся при этом скачок вязкости белкового раствора является подтверждением произошедшей глубокой денатурации белка.
Старение раствора альбумина (по истечении срока годности) также сопровождается ростом вязкости и изменением количества и характера трещин. В настоящее время считается (Скулачев В.П., 1997; Ozawa T., 1997) что данный процесс обусловлен образованием АФК. Активация свободнорадикального окисления приводит к изменению пространственной структуры макромолекулы протеина (Дубовая Т.К. и др., 2000).
Следовательно, наблюдаемое снижение количества трещин, нарушение их формы и расположения обусловлены именно активаций свободнорадикального окисления, происходящего при длительном хранении препарата и приводящего к нарушению конформации белковых молекул.
При различных значениях кислотности среды происходят неоднозначные изменения вязкости, увеличиваясь при рН больше или меньших физиологических и близких к изоэлектрической точке этого белка, что сопровождается параллельным снижением количества трещин в структурном макропортрете (рис.3).
А Б Рис.3. Количество трещин фации (А), вязкость (Б) раствора сывороточного человеческого альбумина при буферных растворов различных рН - достоверные отличия по сравнению с добавлением воды (р<0,05) В интервале рН от 4,5 до 3,5 для молекулы альбумина характерны конформационые переходы от N в F-форму, которые возникают в результате кооперативного протонирования карбоксильных групп и нарушения внутримолекулярных междоменных связей, при этом количество -спиралей уменьшается с 52% до 44%. Методами кругового дихроизма и флюоресценции показано, что реорганизация в значительной мере затрагивает домен молекулы белка (Dockal M., Carter D., Ruker F., 2000).
В щелочной области процесс изменения конформации имеет двухступенчатый характер: N-B переход ( рН 7,5-9,0) и B-U переход (рН11,013,5) (Ahmad B., Kamal M., Khan R., 2004). Щелочной N-B переход не вызывает таких изменений в структуре белка как кислотный- в В-форме количество -спиралей снижается всего на 3% (Era S., Iton K., Sogami M. et al, 1990). Видимо, этим объясняется большее число выявленных достоверных изменений количества трещин и значений вязкости при кислых значениях рН по сравнению со щелочными, причем большая часть последних приходится на рН выше 9, при которых происходит существенная потеря вторичной структуры.
При изучении структурного макропортрета плазмы крови практически здоровых людей показано, что он характеризуется наличием прозрачной краевой зоны средней ширины, радиальными аркообразными трещинами, полным отсутствием аномальных особенностей (рис.4).
Рис.4. Структурный макропортрет плазмы крови практически здорового человека (50) Выявлено, что параметры трещин в различных зонах фации зависели от разных показателей. Так, в краевой зоне определяющими явилось значительное число достоверных корреляционных взаимосвязей с содержанием непрямого билирубина (с количеством трещин r=-0,963; с формой r=-0,699). Непрямой билирубин, транспортируется в печень для детоксикации, связываясь с молекулой альбумина, изменяя ее состояние. В промежуточной зоне расположение трещин связано прямой корреляционной взаимосвязью с содержанием глобулинов(r=0,514), триглицеридов (r=0,519), холестерином ЛПОНП(r=0,633), то есть веществ, входящих в состав липопротеинов. В центральной зоне размер трещин определяется содержанием глобулинов(r=0,476) и триглицеридов (r=0,578). Взаимосвязь образования маркеров фации плазмы крови с уровнем билирубина, как и появление при старении раствора альбумина морщин, опосредуется через свободнорадикальные процессы. Индукция ферментативной активности цитохрома Р4501А1 (основного источника АФК в организме) является результатом лиганд-зависимого усиления транскрипционной активности соответствующего гена CYP1A1 (Nelson D. et al., 1996). Повышение уровня билирубина способно повышать ферментативную активность цитохрома (De Matties F. et al, 1991), так как билирубин является лигандом Ah рецептора и вызывает AhR-зависимую индукцию CYP1A1 (Phelan D. et al, 1998).
Вышеуказанная взаимосвязь появления аномальных особенностей с концентрацией высокотоксичного билирубина и остальные выявленные корреляции свидетельствуют о зависимости формирования особенностей фации от интоксикации организма. Обратная зависимость между параметрами аномальных особенностей и содержанием альбумина (-0,410), обусловлена тем, что связывающая способность альбумина рассматривается как индикатор токсичности (Грызунов Ю.А., 1998). Прямая взаимосвязь количества аномальных особенностей с такими показателями липидного обмена как холестерин (0,943), холестерин ЛПНП (0,990); и обратная с уровнем триглицеридов (-0,446) связана с зависимостью степени эндогенной интоксикации от уровня триглицеридов, холестерина и холестерина ЛПНП (Ведунова М.И., Конторщикова К.Н., Добротина Н.А., 2008). Обратная зависимость появления аномальных особенностей от уровня холестерина ЛПВП(-0,992) также закономерна, если учесть известную эндотоксинсвязывающую способность этих липопротеинов. Характерно, что параметры аномальных особенностей связаны с активностью АсАт (r=0,757), ААт(r=0,817), щелочной фосфатазы (r=-0,31) и ГГТП (r=0,691), поскольку повышение активности этих ферментов считают одним из наиболее чувствительных тестов токсического поражения печени. Подтверждением взаимосвязи количества аномальных особенностей в фации плазмы крови с интоксикацией организма является факт их появления после восстановления сердечного ритма высокотоксичным алкалоидом- хинидином.
Для дальнейшего подтверждения гипотезы взаимосвязи трещин фации с особенностями строения макромолекул протеинов, проведен сравнительный анализ сыворотки крови различных классов позвоночных животных (рис.4).
Показано сходство характера трещин краевой зоны фации сыворотки крови птиц и земноводных, при значительных отличиях этого параметра по сравнению с млекопитающими, причем в рамках данного класса различий не выявлено. Анализ баз данных UniProtKB и Protein Data Bank показал значительное сходство пространственной структуры альбуминов у млекопитающих, при выраженных отличиях с птицами и земноводными, чем, вероятно, и обусловлены полученные результаты. Обнаружена гетерогенность трещин в центральной части фации сыворотки крови у млекопитающих. Вероятно, данный факт обусловлен более низкой скорость эволюции альбуминов по сравнению с остальными белками сыворотки крови, в частности иммуноглобулинами (Шварц С.С., 1980), при дегидратации локализующимися в центральной зоне фации. Еще более выражены различия в характере трещин центральной зоны при сравнении сыворотки крови вышеупомянутых животных с птицами и амфибиями, что, скорее всего, связано с различием имеющихся классов иммуноглобулинов:
G, M, E, D, A у млекопитающих и G, M, A классов у птиц и рептилий.
Лягушка Утка Мышь Крыса Свинья Корова Рис.5. Структурный макропортет сыворотки крови различных видов позвоночных животных (50) *** Таким образом, выявлена следующая картина расположения групп белков в фации сыворотки крови: альбумины- краевая зона; и -глобулины (ЛПВП и ЛПНП)- промежуточная зона, -глобулины (иммуноглобулины)- центральная зона. Показано, что параметры трещин фации плазмы или сыворотки крови обусловлены структурными особенностями составляющих ее белковых молекул. Подтверждением вышеизложенному, явился обнаруженный факт, что, чем более далеки друг от друга организмы в филогенетическом отношении, тем больше различий имеет место в фации их сыворотки крови. Выявленные корреляционные взаимоотношения биохимических параметров сыворотки крови с параметрами ее фации позволяют предположить связь аномальных особенностей с процессами интоксикации. Решению этого вопроса посвящена следующая глава работы.
Параметры структурного макропортрета содержащих белки растворов при воздействии токсичных веществ Одним из ранних индикаторов нарушения гомеостаза организма при интоксикации любого генеза является изменение структурной организации белковых молекул (Лопухин Ю.М., Добрецов Г.Е., Грызунов Ю.А., 2000). В связи с этим, проведено изучение механизмов воздействия токсических веществ экзогенного и эндогенного происхождения на протеины плазмы крови.
В качестве упрощенной модели плазмы крови был использован 10% раствор альбумина. Для анализа параметров фации его растворов при воздействии водорастворимого токсиканта проведено исследование с использованием модельных веществ, применяющихся при оценке класса опасности водных отходов: CuSO4, K2Cr2O7 (ФР. 1.39.2001.00282.). Известно (Филенко О.Ф., 1989; Жмур Н.С., 1997), что степень токсичности соединений возрастает в ряду FeSO4 K2Cr2O7 CuSO4.
В ходе исследований обнаружена высокая степени зависимости общего количества аномальных особенностей в фации раствора альбумина от концентрации в нем растворённого вещества. При одинаковых концентрациях растворенного вещества (1мг/л) наиболее токсичное вызывало самое большее количество аномальных особенностей в структурном макропортрете раствора альбумина (рис.6).
Параллельно проводили биологическое тестирование с использованием дафний Ceriodaphnia affinis. Коэффициент корреляции по Пирсону между результатами двух методов, а именно биотестирования (процент гибели) и количеством особенностей в структурном макропортрете альбумина с добавлением водных сред, составил 0,33 при вероятности р = 0,048, что свидетельствует о достоверной связи между двумя этими показателями.
Сравнение результатов клиновидной дегидратации и биотестирования показало, что коэффициент аппроксимации для результатов биотестирования существенно ниже, чем при клиновидной дегидратации, что свидетельствует о более высокой чувствительности последнего метода. Далее была проведена оценка параметров структурного макропортрета раствора альбумина при воздействии токсикантов соответственно классам опасности (приказ МПР России от 15 июня 2001 года №511; Критерии отнесения опасных отходов к классу опасности для окружающей природной среды). Класс отходов определялся по результатам биотестирования с определением БКР и ЛКР.
* * * Рис.6. Количество особенностей в фации 10% р-ра альбумина. с добавлением -H2O (контроль); - р-ра сульфата железа 1 мг/л; - р-ра бихромата калия мг/л; - р-ра сульфата меди 1 мг/л.
*- различия между пробами достоверны (р<0,05) (критерий Ньюмана-Кейсла) Выявлено, что количество аномальных особенностей в фации раствора альбумина при воздействии водных отходов различных классов опасности отличаются достоверно, причем обнаружен линейный характер этой зависимости (рис.7).
Рис.7. Графическое выражение линейной зависимости количества особенностей в фации 10 % р-ра альбумина от класса опасности токсикантов Линейная зависимость выявлена между возникновением патологических особенностей фации плазмы крови и уровнем эндогенных токсинов организма. По мере роста содержания ВНСММ и степени ЭИ увеличивается количество маркеров в структурном макропортрете плазмы крови (табл.4).
Методом кусочно-линейной регрессии выявлена достоверная взаимосвязь между числом аномальных особенностей и уровнем ВНСММ, стадией интоксикации (линейная зависимость описывает 67,22% всех фактических значений наблюдаемых в эксперименте). Для правильной интерпретации вышеуказанной взаимосвязи необходимо учитывать обнаруженную интенсификацию свободнорадикальных процессов и снижение антиоксидантной активности (р<0,05) в крови больных при эндогенной интоксикации (рис.8).
Таблица Показатели фации и ВНСММ в норме и при ЭИ (Mm) норма Стадия ЭИ n=I II III IV n=29 n=32 n=10 n=Общее кол-во особенностей в 1,57 3,79 5,84 7,4 8,66 фации плазмы крови (по 10-ти 1,22* 0,83* 0,52* 0,48* 1,03* бальной шкале) ВНСММ плазмы, усл. ед. 10,85 12,99 18,20 25,17 26,56 0,1* 0,27* 0,25* 0,60* 1,ВНСММ эритроцитов, усл. ед 21,41 27,85 31,73 34,52 32,18 2,19* 0,96* 1,66* 1,23* 2,*-различия между показатели достоверны (р<0,05) Рис.8. Показатели биохемилюминограммы в норме и при разных стадиях эндогенной интоксикации (показатель S, представлен в масштабе 1:10): - Imax; - S; - tg(-2).
Кроме того, имеются достоверные отличия между уровнем этих показателей при разных стадиях эндогенной интоксикации. Анализ на основе кусочно-линейной регрессии выявил достоверную связь между параметрами Imax, tg(-2a), S и возникновением аномальных особенностей в структурном макропортрете плазмы крови.
Интенсификация свободнорадикального окисления при эндогенной интоксикации приводила к значительному увеличению как первичных (диеновые и триеновые конъюгаты), так и конечных продуктов перекисного окисления липидов (основания Шиффа) в плазме (табл.5). При этом выявлена достоверная зависимость количества особенностей от уровня диеновых, триеновых конъюгатов и оснований Шиффа.
Помимо этого, активация свободнорадикальных процессов при ЭИ обусловила окислительную модификацию белков плазмы крови, что проявилось в их фрагментации и увеличении уровня олигопептидов (табл.6).
Таблица Содержание продуктов перекисного окисления липидов плазмы крови в норме и при эндогенной интоксикации (Mm) Норма, Стадия ЭИ n=I II III IV n=29 n=32 n=10 n=ДК, усл.ед. 0,165 0,207 0,186 0,185 0,190,00,005* 0,010* 0,008* 0,0ТК, усл.ед 0,089 0,105 0,108 0,112 0,1060,00,004* 0,005* 0,005 0,0ОШ, усл.ед. 6,360, 32,64 37,13 48,46 49,983,67* 3,56 4,06 6,*-различия между показатели достоверны (р<0,05) Таблица Уровень олигопептидов в норме и при эндогенной интоксикации (Mm) Норма, Стадия ЭИ n=I II III IV n=29 n=32 n=10 n=Олигопептиды 112,2+ 117,54 125,67 148,33 150,775,24* плазмы, мг/л 4,97 3,05 4,79* 6,13* Олигопептиды 24,33+ 46,24 50,32 54,43 52,182,43* эритроцитов, мг/л 2,23 1,84* 2,56* 1,27* *-различия между показатели достоверны (р<0,05) Методом кусочно-линейной регрессии выявлена достоверная связь между уровнем олигопептидов в плазме и эритроцитах крови и вероятностью формирования аномальных особенностей в фации, их количеством в краевой, промежуточной и центральной зонах.
Диагностическое значение имеет как спонтанная ОМБ, так и металлиндуцированная ОМБ. По результатам проведенных измерений определено значительное повышение спонтанной ОМБ (указывающей на количество модифицированных аминокислот): при длинах волн 356 нм, 3нм и 370 нм в среднем в 2,21 раза, а при 430 нм и 530 нм в 3,23 и 3,90 раза, соответственно (рис.8).
Рис. 9. Уровень продуктов спонтанной окислительной модификации белков в норме- и при эндогенной интоксикации- *- достоверные отличия в сравнении с нормой (р<0,05) Обнаружено также увеличение индуцированной ОМБ (рис.10).
Рис. 10. Уровень продуктов индуцированной окислительной модификации белков в норме- и при эндогенной интоксикации-.
*- достоверные отличия в сравнении с нормой (р<0,05) Так как интоксикация организма может усугубляться активацией свободнорадикальных процессов, а именно белки, по современным представлениям (Дубинина Е.Е., 2007), первыми подвергаются окислительной деструкции, суммарная величина ОМБ может служить одним из интегральных показателей деградации биоструктур (табл. 4).
С повышением стадии ЭИ наблюдается рост уровня и спонтанного и индуцированного окисления белков. Наибольшие отличия имеет четвертая стадия, в которой увеличение ОМБ максимально, что связано с полным истощением антиоксидантной и детоксицирующих систем организма и активацией ОМБ не только под действием АФК, но и за счет промежуточных продуктов ПОЛ.
Таблица Суммарный уровень спонтанной и индуцированной окислительной модификации белка (Mm) Стадия Суммарный уровень Суммарный уровень спонтанной ОМБ индуцированной ОМБ Норма, n=20 134,6816,63 667,3249,I стадия, n=29 343,9522,37 1149,9125,II стадия, n=32 347,7625,28 848,53127,III стадия, n=10 304,0821,65 1010,5178,1IV стадия, n=6 378,1419,87 1251,29109,Помимо фрагментации ОМБ может приводить к образованию карбонильных производных, что не связано с распадом белковой молекулы, но сопровождается значительным изменением ее структурной организации (Дубинина Е.Е., 2006). Именно такой тип изменений рассматривают как возможный пусковой механизм многих патологических процессов (Лопухин Ю.М., Добрецов Г.Е., Грызунов Ю.А., 2000).
Обращает на себя внимание существование двух типов аномальных особенностей фации биологической жидкости: на базе трещин и связанные с изменениями структуры полимерной пленки (рис.1). К первому типу относятся штриховые трещины, закругленные, круглые, концентрические, многолучевые трещины, трещин черная сеть и рыбья чешуя. Ко второму- морщины и языковые поля. Характерно, что морщины и языковые поля появляются только при терминальной стадии ЭИ. Напротив, появление маркеров на основе трещин не связано со степенью интоксикации.
Обнаружена взаимосвязь формы таких особенностей макропортрета плазмы крови с различными патологическими состояниями (рис.11).
Так, нарушение липидного обмена у больных при ишемической болезни сердца проявляется наличием особенностей в виде рыбьей чешуи в промежуточной зоне. Методом кусочно-линейной регрессии выявлена достоверная связь (R=0,8923) между уровнем олигопептидов в плазме и эритроцитах крови и вероятностью формирования маркеров в структурном макропортрете, причем обнаружена прямая зависимость появления особенностей типа черная сеть и рыбья чешуя от содержания окисленномодифицированных белков. Отсюда, появление маркеров на базе трещин обусловлено продуктами фрагментации протеинов и олигопептидами.
Использование дискриминантного анализа позволило математически описать зависимость возникновения трещин типа рыбья чешуя от концентрации триглицеридов (TГ), общего холестерина (Хс) и ЛПНП:
1. у=-18,8089+6,9163TГ+6,4976Хс-2,0075ЛПНП 2. y=-11,7727+4,3483TГ+4,3584Хс-1,8182ЛПНП Рис. 11. Различные типы патологических особенностей в фации плазмы крови при эндогенной интоксикации различного генеза (50) В случае превышения результата по первому уравнению над вторым существует вероятность присутствия закруглённых трещин, в обратном случае их отсутствие. В соответствии с данными правилами с вероятностью 94,44% подтверждается наличие трещин типа рыбья чешуя и с вероятностью 50,00% их отсутствие.
Для воспалительных заболеваний характерно наличие в центральной зоне высохшей капли плазмы крови закругленных и круглых трещин (рис.
10). Зависимость появления закруглённых трещин от величины скорости оседания эритроцитов (СОЭ) и лейкоцитов (Lе) методом дискриминантного анализа: 1. у=-13,3277+0,2331СОЭ+2,5745Lе 2. y=-8,2492+0,4562СОЭ+1,3966Lе подтверждает наличие закруглённых трещин с вероятностью 77,78% и с вероятностью 83,33% их отсутствие. Появление такого типа особенностей при ишемической болезни сердца, вероятно, связано с полиэтиологическим характером данного заболевания.
Патологические особенности в виде черной сети в центральной зоне высохшей капле плазмы крови были выявлены при сахарном диабете, инфаркте миокарда и термической травме (рис.11), то есть при процессах деструкции тканей.
При почечной недостаточности и мочекаменной болезни повышение уровня мочевины и креатинина приводило к появлению многолучевых трещин в центральной зоне фации плазмы крови (рис.11).
Вероятно, образование особенностей на базе трещин связано с изменением структурных особенностей белков плазмы крови, вызванной их окислительной модификацией под воздействием различных субстратов ЭИ.
Зависимость структурных изменений молекул белков плазмы крови от вида токсического вещества исследована на примере экзогенной интоксикации - отравлении наркотическими и сильнодействующими веществами и этиловым алкоголем. При этом установлена достоверная связь между наличием интоксикации, выявленной гистохимическим методом, с обнаружением аномальных особенностей в фации сыворотки крови при отравлении различными веществами (r=0,81 при вероятности р = 0,048).
Показано, что у лиц, погибших от наркотического отравления, в центре фации сыворотки крови имеются штриховые трещины. Установлена достоверная взаимосвязь этого показателя и с обнаружением наркотиков, и со следами инъекций, и с заключением эксперта о смерти от отравления наркотическим веществом (табл.8). Обнаружено, что рН в случае смерти от отравления наркотическими веществами существенно ниже (6,650,15), чем в контрольной группе (7,210,22), а также отличается от таковой при алкогольном отравлении (6,980,20). Выявлена обратная зависимость величины рН сыворотки крови от каждого из трех вышеприведенных параметров (табл.8).
Изучение динамики изменения АМИ капли сыворотки в процессе высыхания выявило при наркотическом отравлении такой феномен как растрескивание (рис. 12), который практически не встречался в других исследованных группах. Данные изменения происходят при испарении остатков рыхлосвязанной воды.
Таблица Связь характеристик фации сыворотки крови и ее рН с фактами, подтверждающими смерть от наркотического отравления Коэффициент корреляции с наличием с наличием с заключением наркотических следов эксперта веществ инъекций рН сыворотки крови - 0,63 - 0,62 -0,Наличие особенностей 0,70 0,59 -0,в центре фации Форма особенностей в 0,70 0,59 -0,центре фации Размер особенностей в 0,58 0,64 -0,центре фации Рис. 12. Экспериментальные кривые отображения динамики АМИ в процессе высыхания капель сыворотки крови (сверху вниз: наркотическая интоксикация, алкогольная интоксикация, контроль,. Х - Время (мин), Y- АМИ (усл. ед.).
Учитывая вышеприведенные данные, появление штриховых трещин в центральной зоне структурного макропортрета сыворотки крови при наркотическом отравлении может быть истолковано как окислительная модификация иммуноглобулинов при данном виде интоксикации.
Нарушения иммунитета при наркотическом отравлении характеризуются гипоглобулинемией класса А и более чем двукратным увеличением общего количества циркулирующих иммунокомплексов, в основном за счет роста фракций малых и средних размеров (Гамалея Н.Б., 2000; Лужников Е.А. и др., 2002). Поскольку имеются данные об активации свободнорадикальных процессов при отравлении наркотическими веществами (Медведева С.А. и др., 2007) можно предположить, что благодаря этому происходит нарушение структуры иммуноглобулинов, вплоть до их фрагментации. Подтверждением тому служит проведенный анализ спектрограмм ВНСММ сыворотки крови, при котором был обнаружен максимум, соответствующий поглощению дисульфидных связей (длина волны 250-270 нм) (Кантор Ч., Шиммель П., 1984), которые в большом количестве представлены в молекулах иммуноглобулинов (рис.13).
Рис.13. ВНСММ-спектрограммы плазмы крови: Ряд1- наркотическое отравление; Ряд2- алкогольное отравление; Ряд3- контрольная группа Процессы токсикокинетики опиатов укладываются в классическую схему детоксикации: окислительно-гидролитические превращения в системе микросомальных монооксигеназ, вступление образовавшихся ионизированных метаболитов в реакции конъюгации с последующей экскрецией (Головко А.И. и др., 1993). Помимо специфических воздействий, эти вещества при попадании в организм провоцируют многочисленные неспецифические реакции, протекающие при избыточном накоплении АФК (Плетнева Т.В., 2005; Перегуд Д.И. и др., 2006). Процессы катаболизма алкоголя также приводят к интенсификации свободнорадикальных процессов, что является одной из причин вызываемых алкоголем повреждений. Основными биохимическими признакам хронической алкогольной интоксикации являются превышение активности АсАт над ААт в 1,5-2 раза и повышение активности -глутамилтранспептидазы (ГГТП). Поскольку одной из основных причин интоксикации при хроническом алкоголизме является нарушение функций печени, нами изучены содержание фракций билирубина, уровня ВНСММ и структурного макропортета плазмы крови. У больных с хроническим алкогольным отравлением и при неалкогольных поражениях печени выявлено существенное повышение активности трансфераз и глутамилтранспептидазы (табл.9).
При хроническом алкогольном отравлении содержание ВНСММ в плазме крови возрастало более, чем в 2 раза, при практически неизменном соотношении ВНСММ в эритроцитах (по сравнению с практически здоровыми людьми) (табл. 9).
Таблица Уровни биохимических показателей при хронической алкогольной интоксикации и поражениях печени неалкогольного генеза (Мm) Показатели Практическ Хроническо Поражение и здоровые е печени люди алкогольное неалкогольн (группа 3) отравление ого генеза (группа 1) (группа 2) ВНСММ плазмы, усл.ед 8,55 2,921,86 3,53 30,35 4,49 ВНСММ эритроцитов, усл.ед 21,66 6,870 26,06 3,36,71 5,88 Билирубин общий, мкмоль/л 11,42 2,17,74 2,57 22,677,52 Билирубин связанный, мкмоль/л 2,97 0,8,79 3,03 8,83,34 Билирубин свободный, мкмоль/л 8,45 1,58 6,27 2,38 13,874,Аспартатаминотансфераза, ед/л 24,52 6,60 64,75 186,5056,11,03 8 Аланинаминотрансфераза, ед/л 15,2 4,36,75 9,25 285,573,15 19,841,-глутамилтранспептидаза, ед/л 127,823,47 71,6818,25 *- достоверные отличия в сравнении с контрольной группой (р<0,05) У больных исследуемой группы (хронический алкоголизм) диагностирована втораяЦ четвертая степень эндогенной интоксикации. При изучении структурного макропортрета плазмы крови обнаружено повышение общего количества особенностей при хроническом алкогольном отравлении (7,371,75) и поражениях печени неалкогольного генеза (8,6 0,71) по сравнению с контролем (1,57 1,22). Причем количество маркеров фации плазмы крови при алкоголизме возрастало по мере увеличения уровня ВНСММ. При алкогольной интоксикации преобладающими типами маркеров были круглые трещины и трещины типа черная сеть в центральной зоне. У пациентов с хронической алкогольной интоксикацией уровни общего и связанного билирубина были достоверно выше, чем в контрольной группе (табл.9). При нормальных значениях фракций билирубина кристаллы в краевой зоне фации имели геометрическую форму:
пирамиды, шестиугольники, удлиненные иголки (рис. 14).
При значениях общего билирубина больше 17,2 мкмоль/л включения приобретали неправильную форму и больший размер. Обработкой фотографий с помощью добавленной метки 10 мкм определяли средний размер включений и перемножали на их число в поле зрения. Полученный показатель отражал занятость поверхности краевой зоны фации данными включениями. Корреляционные взаимосвязи между биохимическими и кристаллооптическими параметрами представлены в таблице 10.
Для выяснения состава включений была проведена их ИК-Фурье спектроскопия (рис.15).
А Б В Г Д Е Рис. 14. Включения в краевой зоне высохшей капли плазмы крови (ув.250): А- кристалл в форме пирамиды (билирубин общ.=10,56 мкмоль/л- группа сравнения); Б- кристалл в форме пирамиды (билирубин общ.=14,мкмоль/л- хроническая алкогольная интоксикация); В- кристалл шестиугольной формы (билирубин общ.=8,95 мкмоль/л- хроническая алкогольная интоксикация); Г- игольчатые кристаллы (билирубин общ.=11,мкмоль/л- хроническая алкогольная интоксикация); Д- включение неправильной формы (билирубин общ.=17,2 мкмоль/л- хроническая алкогольная интоксикация); Е- включение неправильной формы (билирубин общ.=27,7 мкмоль/л- фиброз печени) Таблица Связь уровня билирубина с кристаллооптическими показателями высохшей капли плазмы крови (корреляционная матрица по Пирсону) Кристаллооптические Коэффициент корреляции показатели Показатель Наличие площади включений Биохимические показатели Билирубин общий 0,784* 0,713* -0,084 -0,268 -0,4Билирубин 0,721* 0,557* 0,006 -0,093 -0,0свободный Билирубин 0,439* 0,434* -0,085 -0,216 -0,3связанный Достоверность корреляционной связи при вероятности p<0,05(*) Рис.15. ИК-спектр пропускания кристаллов краевой зоны фации плазмы крови при алкогольном отравлении (1) и при фиброзе печени (2) В спектрах кристаллов, находящихся в краевой зоне плазмы крови, как при хроническом алкогольном отравлении, так и при поражениях печени иной этиологии, имели место два выраженных пика на длинах волн 320 и 4нм, характерных для спектра поглощения билирубина.
*** Таким образом, под влиянием водных растворов различных классов опасности формируется достоверно различающееся количество аномальных особенностей в фации раствора альбумина: чем более токсична исследуемая проба, тем выше наблюдаемое количество особенностей. Усугубление формы формы кристаллов кристаллов кристаллов Включений игольчатых неправильной пирамидальной шестиугольных тяжести состояния организма при эндогенной интоксикации также сопровождается повышением числа маркеров в структурном макропортрете плазмы крови, появление которых обусловлено окислительной модификацией протеинов. Помимо фрагментации и образования олигопептидов, формирующих морщины и языковые поля в фации, окислительная модификация может приводить к образованию карбонильных производных, что не связано с распадом белковой молекулы, но сопровождается изменением ее структурных особенностей и появлением маркеров на базе трещин, форма которых определяется субстратом интоксикации. При наркотической и алкогольной интоксикации количество маркеров фации плазмы крови также коррелировало со степенью нарушения гомеостаза протеинов. Одним из проявлений интоксикации при наркотическом отравлении является окислительная деструкция иммуноглобулинов, что приводит к появлению штриховых трещин в центральной зоне фации крови. Характер интоксикации при хроническом алкогольном отравлении обусловлен неспецифическим нарушением детоксицирующей функции печени, проявляющейся повышением активности трансаминаз и нарушением пигментного обмена, приводящих к появлению в фации кристаллических включений билирубина, круглых трещин и трещин типа черная сеть.
Сравнительный анализ воздействия озона на белки плазмы крови Озон является биологически активным агентом, способным снижать степень эндотоксемии. В связи с этим было проведено исследование его действия на белки плазмы крови. Наиболее часто используемая в клинике методика озонотерапии заключается во внутривенном введении озонированного физиологического раствора (Перетягин С.П., 1991). В связи с этим основополагающее значение приобретает вопрос о снижении концентрации озона в растворе с течением времени и побочных продуктах, образующихся в ходе разложения О3 растворе 0,9 % NaCl. Согласно литературным данным, к таковым относятся перекись водорода (Schultze H., Schultze-Frohlinde J., 1975), гипохлорит (КудрявцевВ.А., Галкин А.А., 2007), NО2 и NО3 (Puckorius P., Hess R., 1993).
Для исследования процессов распада озона в физиологическом растворе были изучены его спектральные характеристики, поскольку О3 имеет сильную полосу поглощения в УФ диапазоне электромагнитного спектра с максимумом около 256 нм. Кинетика распада озона в полулогарифмических координатах описывается прямыми линиями, что свидетельствует о механизме распада первого порядка относительно содержания озона и для воды и для 0,9 % раствора NaCl, не меняющемся во времени с накоплением продуктов распада. Период полураспада О3 по полученным данным составляет 10 - 20 минут. После насыщения и воды, и физиологического раствора озоном значительно уменьшается их прозрачность в коротковолновой области до 200 нм. Данный факт свидетельствует о том, что озонирование водных растворов приводит к образованию новых объектов, поглощающих в УФ диапазоне. Сходная форма кривой выявляется и при концентрации перекиси водорода ~ 2*10-4 %.
При всех режимах озонирования в пробах 0,9 % раствора NaCl и деионизированной воды концентрации перекиси водорода, определяемые методами аналитической химии, очень низки (порядка 0,0004%).
В озонированном 0,9% растворе NaCl (0,55 мг/л О3) обнаружено содержание в среднем 0,004 мМ/л хлорсодержащих ионов; при содержании озона 0,66 мг/л- 0,012 мМ/л. Для сравнения были исследованы пробы озонированной деионизированной воды (содержание озона- 0,67 мг/л).
Выявлено содержание хлорсодержащих ионов в концентрации около 0,0мМ/л (различия с показателями озонированного физиологического раствора с первоначальной концентрацией озона 0,66 мг/л не достоверны (р>0,05)).
Поскольку в определяемую данным методом величину концентрации гипохлорита и других хлорсодержащих ионов включены все окислители, обесцвечивающие метилоранж в солянокислой среде (то есть окисляющие Cl- до Cl2), а присутствие в деионизированной воде хлорсодержащих ионов невозможно, нами высказано предположение о наличии в пробе иного вещества, способного интенсивно окислять метилоранж.
Вопрос о присутствии в физиологическом растворе после озонирования хлорсодержащих ионов является спорным. По мнению U. von Gunten (2003) хлорид-ион не окисляется озоном. В работах А.В. Леванова и соавторов (2008) показано, что реакция с хлорид-ионом происходит, и изучена ее кинетика в кислых и щелочных растворах с образованием молекулярного хлора и иона Cl3 или хлорат-иона ClO3. Однако, к используемым для воздействия на биологические объекты растворам, результаты вышеуказанных исследований не могут быть применимы. В нашей работе значения рН деионизированной воды и физиологического раствора были нейтральными (в деионизированной воде= 6,60,3; у физиологического раствора= 7,30,2) и анализируемые концентрации озона были существенно ниже.
Обнаружено отсутствие ионов NО3 и отсутствие достоверных различий с контролем в суммарной концентрации нитритов в пробах после озонирования, а также достоверное увеличение суммарной концентрации аммиака и ионов аммония в деионизированной воде при концентрации О3=0,67 мг/л - 0,080,02 мг/дм3, при содержании в контроле 0,05 мг/дм(табл. 11). Однако обнаруженный уровень в 25 раз ниже предельно допустимых значений (ГОСТ Р 51232-98).
Следовательно, оценивая воздействие озона на протеины плазмы крови, помимо непосредственного его действия, следует учитывать влияние АФК, образующихся при распаде О3: Н2О2 и радикалов, наиболее активным из которых считается гидроксил-радикал.
При исследовании влияния озона на плазму крови было обнаружено исчезновение в ее спектре полосы поглощения с максимумом ~ 278 нм, причем обработка плазмы раствором, насыщенным чистым кислородом такого эффекта не давала. Выявленная спектральная полоса соответствует аминокислоте триптофану в составе белковой молекулы. Известно (Дубинина Е.Е., Шугалей И.В., 1993), что триптофан в силу своей структуры наиболее подвержен окислительному влиянию активных форм кислорода.
Вероятно, примененная высокая концентрация озона (0,8 мг/л) вызвала процесс фрагментации белковой молекулы.
Таблица Концентрация нитритов, аммиака и ионов аммония в деионизированной воде и 0,9 % растворе NaCl после озонирования Объекты Аммиак и Нитриты, мг/дмNО3, ионы мас.% аммония, мг/дмконтроль 0,05 0,0050,002 110-первоначальная О3= 0,05 0,0080,003 110-0,59 мг/л первоначальная О3= 0,080,02 * 0,0040,002 110-0,67 мг/л первоначальная О3= 0,05 00060,002 110-0,59 мг/л (через часа) контроль 0,05 0,0040,002 110-первоначальная О3= 0,05 0,0060,002 110-0,55 мг/л первоначальная О3= 0,070,02 0,0050,002 110-0,66 мг/л первоначальная О3= 0,05 0,0040,002 110-0,55 мг/л (через часа) *- достоверные отличия в сравнении с контролем (р<0,05) С течением времени под воздействием озона в модельных опытах на 10% растворе сывороточного человеческого альбумина, менялось количество особенностей и массивов в фации данного протеина (рис.16). При оценке появления особенностей и массивов тест Крускал-Уоллиса показал наличие достоверных различий между всеми группами. Максимальная интенсивность изменений имела место после 30 минут инкубации.
Дальнейшие исследования осуществляли в этом временном интервале.
Добавление озонированного физиологического раствора в начале снижает интенсивность массивообразования в высохшей капле, но после 30-минутной инкубации количество массивов значительно возрастало.
Деионизированная вода 0,9% раствор NaCl Альбумин+р-р Na Cl (2:1) Альбумин+р-р Na Cl (9:1) Альбумин+озонир. р-р Na Альбумин+озонир. р-р Na Cl (2:1) сразу Cl (9:1) сразу Альбумин+озонир. р-р Na Альбумин+озонир. р-р Na Cl (9:1) через 30 минут Cl (2:1) через 30 минут Рис.16. Структурный макропортрет 10% раствора сывороточного человеческого альбумина 2005 г.в. (50) при добавлении различных объемных соотношений нативного и озонированного физиологического раствора (содержание озона-0,55мг/л): 1-массивы; 2- штриховые трещины; 3- круглые трещины Наличие массивов в фации биологической жидкости связывают с наличием измененных белков (Яхно Т.А. и др., 2004). При определенной концентрации NaCl молекулы альбумина теряют сольватную оболочку, что приводит к частичной агрегации белковых молекул. Следовательно, изменение количества массивов в высохшей капле альбумина при добавлении озонированного физиологического раствора можно объяснить тем, что первоначально окислительное воздействие озона вызывало разрушение крупных белковых агрегатов, но затем их количество еще более возрастало.
Установлено, что соотношение ширины краевой зоны к радиусу фации раствора альбумина с добавлением 0,9 % раствора хлорида натрия и характер кристаллов в центре не менялся как с течением времени, так и при воздействии озона во всех сериях опытов (различия не достоверны- (р>0,05)).
Поскольку ширина краевой зоны фации определяется количеством белка в пробе, а вид кристаллов зависит от концентрации и типа солей (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 2001), можно считать установленным, что озонирование не влияет на количество белка и неорганических солей в пробе.
В экспериментах с раствором альбумина было исследовано влияние физиологического раствора с различной концентрацией озона: 0,55 и 0,мг/л при одинаковых объемных соотношениях. Был установлен дозозависимый эффект воздействия озона: при применении его высоких концентраций происходило увеличение общего числа особенностей в структурном макропортрете белка. Воздействие небольших концентраций озона (при объемном соотношении раствора хлорида натрия 1:9 при концентрации озона 0,57 мг/л) оказывало противоположное действие.
Учитывая, что появление маркеров в макропортрете биожидкости обусловлено окислительной модификацией белков, можно утверждать, что изменение их количества в фации раствора альбумина под воздействием озона обусловлено разнонаправленными дозозависимыми изменениями структурных особенностей молекулы данного протеина.
Дальнейшие опыты проводили со свежеприготовленным (2007 г.в.) и после хранения в течении двух лет (2005г.в.) растворами альбумина.
Концентрации озона в 0,9 % растворе Na Cl составляла 0,11; 0,26 и 0,57 мг/л.
Снижение количества особенностей для фаций растворов альбумина происходило при различных концентрациях озона: для альбумина 2007 года выпуска- при концентрации озона 0,11 мг/л (на 12%); для альбумина 20года выпуска- при концентрации озона 0,57 мг/л (на 13%) (рис.18). Анализ количества маркеров в структурном макропортрете раствора альбумина в зависимости от концентрации озона в пробе, показал наличие достоверной корреляции по Спирмену R=0,764 (P=0,00009) для альбумина 2007 г.в. и отсутствие таковой- R=0,139 (P=0,558) для альбумина 2005 г.в. Данный факт обусловлен снижением количества маркеров в фации раствора альбумина 2005 года при 30-ти минутной инкубации с озонированным физиологическим раствором с концентрацией O3= 0,57 мг/л.
Динамика изменений количества маркеров в структурном макропортрете и свободнорадикальной активности раствора альбумина с добавлением озонированного физиологического раствора имела сходный характер (рис.16). Рост интенсивности свободнорадикального окисления при добавлении озонированного физиологического раствора (на 10% - альбумин 2005 года выпуска при концентрации озона 0,11 мг/л и альбумин 2007 года выпуска- при 0,57 мг/л) сопровождался увеличением количества особенностей в структурном макропортрете (рис.17).
Рис.17. Количество особенностей в структурном макропортрете (А) и уровень свободнорадикальной активности (Б) 10% р-ра сывороточного человеческого альбумина (2007г.в.- ; 2005г.в.- ) при добавлении: 1- нативного 0,9% р-ра Na Cl (100%); 2- 0,9% р-ра Na Cl, концентрация О3 0,мг/л; 3- 0,9% р-ра Na Cl, концентрация О3 0,26 мг/л; 4- 0,9% р-ра Na Cl, концентрация 0,57 О3 мг/л *- достоверные отличия в сравнении с добавлением нативного 0,9% р-ра Na Cl (р<0,05) Анализ количества маркеров в фации раствора альбумина в зависимости от концентрации озона в пробе, показал наличие достоверной корреляции по Спирмену R=0,764 (P=0,00009) (рис.18).
Рис. 18. Зависимость количества маркеров в фации 10% р-ра сывороточного человеческого альбумина 2007 г.в. от концентрации озона в пробе Уровень спонтанно окисленно модифицированных белков альбумина 2007 г.в. возрастал при увеличении концентрации О3 незначительно (рис.19).
А Б * Рис.19. Содержание спонтанно окислительно модифицированных белков (А) и индуцировано окислительно модифицированных белков (Б) в 10% р-ре человеческого альбумина (2007 г.в.) при добавлении 1- 0,9% раствора Na Cl (100%); 2- 0,9% раствора Na Cl, концентрация озона 0,11 мг/л; 3- 0,9% раствора Na Cl, концентрация озона 0,26 мг/л; 4- 0,9% раствора Na Cl, концентрация озона 0,57 мг/л - 356 нм; - 363 нм; - 370 нм; -430 нм; -530 нм *- достоверные отличия в сравнении с добавлением нативного 0,9% р-ра Na Cl (р<0,05) Однако наблюдался резкий рост (в 2 раза) продуктов индуцированного окисления белков- алифатических альдегиддинитрофенилгидразонов основного характера, определяемых на длине волны 530 нм, при используемой концентрации озона 0,57 мг/л. Для альбумина 2005 г. в.
статистически достоверным было увеличение продуктов индуцированного ОМБ, определяемых на той же длине волны, при концентрации озона 0,11мг/мл. Снижение уровня продуктов спонтанной окислительной модификации белков, определяемых при длине волны 530 нм, при содержании озона 0,11 и 0,26 мг/л в растворе альбумина 2005 г. в.
сопровождалось ростом количества маркеров. При воздействии на альбумин 2007 г. в. используемые дозы озона практически не вызывают увеличения количества карбонильных производных, однако при концентрации озона 0,мг/л происходит изменение индуцированной ОМБ. Для альбумина 2005 г. в.
добавление озонированного физиологического раствора той же концентрации провоцирует изменение уровня как индуцированной так и спонтанной ОМБ.
Терапия с использованием низких доз озона приводила к снижению количества маркеров в фации плазмы крови у 72% больных. У 56% больных зафиксированно уменьшение количества маркеров как в краевой так и центральной зоне (рис.20).
1а 2а 1б 2б Рис. 20. Фация плазмы крови больных при эндогенной интоксикации до и после коррекции: 1- лечение низкими терапевтическими дозами; 2- лечение общепринятой терапией (а- до лечения, б - после лечения) Применение низких терапевтических доз озона снижает свободнорадикальную активность плазмы у 67% больных, при этом у 34% пациентов показатели биохемилюминограммы нормализуются. Кроме того, обнаружено снижение количества олигопептидов после курса озонотерапии.
У 72% больных выявлено снижение олигопептидов плазматической фракции более, чем на 20%, а эритроцитарный пул ОП при этом уменьшился на 18%.
У 57% больных после лечения малыми дозами озона обнаружено уменьшение продуктов спонтанного окисления белков. В 43% случаев показатели спонтанной и индуцированной ОМБ не изменялись или незначительно увеличивались. Наибольшее снижение показателей спонтанной ОМБ наблюдалось при 530 нм (в среднем на 19% (р<0,05), причем у 18% больных группы снижение уровня алифатических кетондинитрофенилгидразонов основного характера (430 и 530 нм) составило 4048% от исходных показателей.
При озонотерапии в организм вводятся озон, кислород и активные формы кислорода. Известно (Дубинина Е.Е., 2006), что окислительное воздействие активных форм кислорода на белки вызывает изменение их физико-химических свойств: фрагментацию или агрегацию. Характер окислительной модификации белка зависит от типа активных форм кислорода. Гидроксильный радикал чаще вызывает агрегацию белковых молекул, а при совместном действии с супероксидным анион-радикалом или Х свободным кислородом - фрагментацию. Совместное действие OH + Оприводит к изменению первичной, вторичной, третичной структуры молекул.
Кроме того, специфика окислительной модификации белков определяется особенностью аминокислотного состава и структурной организацией биомолекул.
*** Таким образом, из всех возможных побочных продуктов разложения Овыявлено присутствие в воде и физиологическом растворе только перекиси водорода в незначительном количестве. Применение низких терапевтических доз озона снижает количество окисленно модифицированных белков и параллельно- общее количество особенностей в фации плазме крови.
Характерно, что, как и при изучении 10% раствора альбумина, наиболее достоверные изменения под влиянием озона наблюдались при длине волны 530 нм. Это определяется аминокислотным составом модифицированных белков, а содержание альбуминов в плазме крови наибольшее.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Установлен ряд принципиально новых фактов о биохимических механизмах влияния токсинов при эндогенной и некоторых видах экзогенной (наркотической, алкогольной) интоксикации организма на протеины плазмы крови. Эти данные позволили сделать заключение, что нарушение гомеостаза организма при интоксикации во многом определяется структурной модификацией белков, вызванной окислением АКФ. Выявлены особенности структурного макропортрета плазмы крови, позволяющие судить об интенсивности и этиологии процессов интоксикации, что не только формирует теоретическую основу применению метода клиновидной дегидратации, но и позволяет оптимизировать диагностику различных заболеваний, сопровождающихся развитием эндогенной интоксикации.
Изменение структурной конформации молекул белков плазмы крови сопровождает как экзогенную, так и эндогенную интоксикацию и обусловлено такой неспецифической реакцией организма на воздействие токсиканта как активация свободнорадикальных процессов (рис.20).
Механизм превращения чужеродных веществ, в сущности, аналогичен ферментативной модификации эндогенных субстратов.
Как можно видеть из представленной схемы (рис.21), работа детоксицирующих систем организма сопровождается продукцией активных форм кислорода.
Рис.21. Вклад белков в формирование пула веществ низкой и средней молекулярной массы при интоксикации организма Выявленная взаимосвязь эндогенной интоксикации, окислительного стресса с образованием аномальных особенностей фации плазмы крови, обусловленных процессами окислительной модификации белков, стала одним из важнейших результатов исследования.
Анализ биохимических показателей позволил утверждать, что озон оказывает соизмеримый со стандартной терапией эффект снижения уровня олигопептидов, окислено модифицированных белков, при этом изучение редокс-потенциала организма свидетельствует, что применяемые дозы озона не способствуют активации свободнорадикальных процессов.
Следовательно, использование озона адекватно стандартной терапии, однако озонотерапия обладает более выраженным детоксицирующим эффектом, проявляющимся в значительном снижении уровня ВНСММ. Таким образом, лечение с использованием озона может быть как основным, так и дополнительным методом коррекции эндогенной интоксикации, при этом метод клиновидной дегидратации может быть использован для мониторинга состояния организма. Воздействие озона на белки плазмы крови заключается в их окислительной модификации, направление и степень которой определяются как используемой концентрацией озона, так и структурными особенностями белковых молекул. Низкие дозы озона способны снижать уровень окислительной модификации белков плазмы крови больных.
ВЫВОДЫ 1. Раскрыты новые закономерности становления биохимических механизмов формирования фации, обусловленные параметрами протеинов плазмы крови:
а) выявлен порядок расположения протеинов в структурном макропортрете сыворотки крови: альбумины- краевая зона; и -глобулины- промежуточная зона, -глобулины- центральная зона;
б) показана взаимосвязь структурных особенностей сывороточного альбумина (при денатурации, изменении кислотности и старении) с количеством, формой и расположением микротрещин макропортрета его раствора;
в) установлена взаимосвязь биохимических показателей плазмы крови с параметрами трещин высохшей капли:
- содержание непрямого (свободного) билирубина плазмы крови определяет параметры трещин краевой зоны ее структурного макропортрета, поскольку присоединение данного пигмента меняет пространственную структуру молекул альбуминов, локализованных в данной зоне;
- уровень глобулинов, триглицеридов, холестерина ЛПОНП обуславливает расположение трещин в промежуточной зоне, так как данные соединения, входят в состав липопротеинов, расположенных в данной зоне;
- в центральной зоне размер трещин определяется содержанием глобулинов и триглицеридов.
2. Чем более далеки в филогенетическом отношении классы животных (млекопитающие с одной стороны, птицы и пресмыкающиеся с другой), тем более выражены различия в характере микротрещин структурного макропортрета сыворотки крови. Внутри класса млекопитающих (мыши, крысы, свиньи, коровы) выявлено отсутствие выраженных отличий в характере трещин краевой зоны фации сыворотки крови при разнообразии данного параметра в ее центральной зоне, что свидетельствует о консервативности структуры альбуминов и значительной гетерогенности конформации иммуноглобулинов.
3. Действие токсических веществ на сывороточный альбумин вызывает появление в структурном макропортрете аномальных особенностей, количество которых пропорционально интенсивности воздействия. При увеличении концентрации вещества в растворе растет число особенностей в структурном макропортрете раствора альбумина. При одинаковых концентрациях растворенного вещества большее количество аномальных особенностей альбумина вызывает наиболее токсичное вещество.
Обнаружена линейная зависимость числа аномальных особенностей в структурном макропортрете белка от класса опасности воздействующих на него соединений.
4. Активация свободнорадикальных процессов, приводящая к окислительной модификации белков, является неспецифическим механизмом развития интоксикации и обуславливает процессы фрагментации протеинов (о чем свидетельствует корреляционная взаимосвязь уровня олигопептидов плазмы крови и стадии развития эндогенной интоксикации (r=0,449), а также ВНСММ (r=0,730)) или образование карбонильных производных, что сопровождается изменением структурных особенностей молекул белка (корреляционная взаимосвязь индуцированной ОМБ со стадией интоксикации= -0,477).
5. Обнаружена достоверная (р<0,05) взаимосвязь количества маркеров структурного макропортрета плазмы крови с уровнем ВНСММ и стадией эндогенной интоксикации. Характер маркеров, возникающих на базе трещин, обусловлен видом эндотоксина и не зависит от тяжести интоксикации.
Появление таких патологических структур как морщины и языковые поля характерно для терминальной стадии эндогенной интоксикации.
6. При экзогенной интоксикации наркотическими веществами также выявлена достоверная (р<0,05) связь между наличием интоксикации, выявленная гистохимическим методом, с обнаружением аномальных особенностей в структурном макропортрете сыворотки крови (r=0,81).
Одним из проявлений эндогенной интоксикации при наркотическом отравлении является окислительная деструкция иммуноглобулинов и ацидоз.
7. Интоксикация при хроническом алкогольном отравлении носит неспецифический характер и обусловлена нарушением детоксицирующих функций печени, проявляющихся повышением активности трансаминаз (АсАт=64,7511,03 ед/л; ААт=36,759,25 ед/л), -глутамилтранспептидазы (127,823,47 ед/л) и паталогией пигментного обмена (билирубин общий=17,74 2,57 мкмоль/л; билирубин связанный= 8,79 3,03 мкмоль/л).
При этом в структурном макропортрете плазмы крови наблюдаются кристаллические включения билирубина; круглые трещины и трещины типа черная сеть, появление которых свидетельствует о воспалительных и некротических процессах.
8. В эксперименте in vitro установлены механизмы воздействия озона на белки плазмы крови на примере альбумина, заключающиеся в их окислительной модификации активными формами кислорода, продуцируемыми озоном. Направление и степень влияния определяются как используемой концентрацией озона, так и исходными структурными особенностями белковых молекул.
9. Терапевтические дозы озона оказывают значительное детоксицирующее воздействие на организм, проявляющееся в большем, чем при стандартной терапии, снижении уровня ВНСММ, олигопептидов, окислительно модифицированных белков, и, соответственно, аномальных особенностей в структурном макропортрете плазмы крови.
Список работ Обуховой (Беловой) Л.М., опубликованных по теме диссертации Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК 1. Обухова, Л.М. Применение метода клиновидной дегидратации при судебно-медицинской экспертизе смертельных отравлений наркотическими веществами/ Эделев Н.С., Конов А.С., Обухова Л.М.//Судебно-медицинская экспертиза. 2008. №5. С.78-80.
2. Обухова, Л.М. Возможные механизмы воздействия озона на белки плазмы крови// Обухова Л.М., Ведунова М.В., Конторщикова К.Н// Вестник новых медицинских технологий. 2008.Т.15, №4. С.29-30.
3. Обухова, Л.М. Воздействие озона на некоторые параметры сывороточного человеческого альбумина/ Обухова Л.М., Ведунова М.В., Конторщикова К.Н.// Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. 2009.№1. С. 11-13.
4. Обухова, Л.М. Морфологическое исследование плазмы крови при хроническом алкогольном отравлении/ Обухова Л.М., Ведунова М.В., Конторщикова К.Н., Крюкова Е.Б. // Вестник новых медицинских технологий 2009. Т.16, №2. С.219-221.
5. Обухова, Л.М. Оценка токсичности отходов методом клиновидной дегидратации/Обухова Л.М., Безруков М.Е.// Токсикологический вестник. 2009. №3. С.30-34.
6. Обухова, Л.М. О механизмах формирования структурного макропортрета сыворотки крови при смертельных отравлениях наркотическими сильнодействующими веществами//Эделев Н.С., Обухова Л.М., Конов А.С.// Судебно-медицинская экспертиза 2009.№6С.75-79.
7. Обухова, Л.М. Структурная организация белков плазмы крови при интоксикации организма/Обухова Л.М., Которщикова К.Н.// Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки 2009. №6 С. 73-78.
Изобретения 8. Орлов, Б.Н. Способ определения качества альбумина/Орлов Б.Н., Асафова Н.Н., Белова Л.М., Вдовина Н.В., Потехина Ю.П//№ 2002108808/15. - Приоритет изобретения 05.04.2002 г. - Бюлл. Изобретения.
Полез. модели. 2003.- №31, часть .- С.267.
9. Эделев, Н.С. Способ диагностики отравления наркотическими и/или сильнодействующими веществами/Эделев Н.С., Конов А.С., Обухова Л.М.
//Роспатент Российской Федерации №2332666. Приоритет изобретения 16.04. 2007 г. - Бюлл. Изобретения. Полез. модели.- 2008. - №24, часть IV.- С.763.
10. Обухова, Л.М. Способ диагностики эндогенной интоксикации организма, способ определения степени тяжести эндогенной интоксикации организма и способ определения этиологии эндогенной интоксикации организма/Обухова Л.М., Ведунова М.В., Конторщикова К.Н., Эделев Н.С., Конов А.С.// №2007139372/14. - Приоритет изобретения от 25.10.2007 г. - Бюлл. Изобретения. Полез. модели. 2009.- №12, часть I.- С.36-37.
11. Обухова, Л.М. Способ определения токсичности водных сред/Обухова Л.М., Безруков М.Е. Роспатент Российской Федерации №2369867. Приоритет изобретения 16.06. 2008 г. - Бюлл. Изобретения.
Полез. модели.- 2009. - №28, часть I.- С.53.
Статьи в региональных изданиях и материалы конференций 12. Белова, Л.М. Кристалографическое исследование плазмы крови при атерогенных дислипопротеидемиях/ Белова Л.М., Потехина Ю.П., Мотылев И.М.// Тезисы докладов VI Нижегородской сессии молодых ученых. - Нижний Новгород, 2001. - С. 178-179.
13. Белова, Л.М. Кристаллографический скрининг-метод в диагностике и лечении больных с мерцательной аритмией/ Зубеева Г.Н., Мотылев И.М., Потехина Ю.П., Белова Л.М. //Тезисы научно-практического симпозиума Принципы и способы лабораторного обеспечения внебольничной помощи и актуальные проблемы лабораторной медицины, Москва, Клиническая лабораторная диагностика, 2001.- №10.- С. 10.
14. Белова, Л.М. Кристаллографические параметры плазмы крови у больных ИБС, осложненной мерцательной аритмией/ Зубеева Г.Н., Мотылев И.М., Зубеев П.С., Белова Л.М., Потехина Ю.П. //Материалы ежегодной конференции ДиаМА Актуальные проблемы деятельности диагностических центров в современных условиях, Иркутск,19-21 сентября 2001 г.- С.35.
15. Белова, Л.М. Кристаллографическое исследование плазмы крови у больных с мерцательной аритмией/ Зубеева Г.Н., Мотылев И.М., Белова Л.М., Потехина Ю.П. //Тезисы V Международного славянского конгресса по электростимуляции и клинической электрофизиологии сердца. VII Всероссийская конференция по электростимуляции и клинической электорофизиологии сердца, Санкт- Петербург, Вестник аритмологии, 2002.- № 25.- С.21.
16. Белова, Л.М. О возможных механизмах влияния маточного молочка на белки плазмы крови/Белова Л.М.// Материалы 3 Международной научнопрактической конференции Интермед-2002, 5 сентября 2002 г. - Москва, 2002. - С.194-196.
17. Белова, Л.М. Изменение некоторых параметров человеческого альбумина под действием озонированного или оксигенированного раствора /Белова Л.М., Конторщикова К.Н., Потехина Ю.П.//Нижегородский медицинский журнал (Приложение Озонотерапия), 2003.- С. 45-46.
18. Белова, Л.М. Исследование конформационных изменений молекулы альбумина в различных условиях методом клиновидной дегидратации/Белова Л.М., Потехина Ю.П.//Нижегородский медицинский журнал, 2003.- № 3-4.- C. 86-90.
19. Белова, Л.М. Место метода клиновидной дегидратации в диагностическом комплексе/ Потехина Ю.П., Зубеев П.С., Коновалов В.А., Белова Л.М. // Материалы ежегодной конф. ДиаМА. Актуальные проблемы деятельности диагностических центров в современных условияхЦ Екатеринбург, Изд-во АМБ, 2003. С. 82.
20. Обухова, Л.М. Морфофизиологический анализ плазмы крови при эндогенной интоксикации /Обухова Л.М., Ведунова М.В., Конторщикова К.Н., Добротина Н.А.//Вестник Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского, 2007.- №. 6. С. 104-107.
21. Обухова, Л.М. Сравнительный анализ применения красителей для выявления белков при исследовании биологических жидкостей методом клиновидной дегидратации/Обухова Л.М.// Вестник Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского, 2008. № 2. С.103106.
22. Обухова, Л.М. Выявление локализации белков в структурном макропортрете сыворотки крови./Обухова Л.М., Конторщикова К.Н.// Вестник Нижегородского государственного университета им. Н.И.
обачевского, 2008. №3. С.116-119.
23. Обухова, Л.М. Воздействие озона на некоторые параметры сывороточного человеческого альбумина./ Обухова Л.М., Ведунова М.В., Конторщикова К.Н. //Материалы V Украинско-Русской научнопрактической конференции с международным участием Озон в биологии и медицине - Украина, Ялта, Вестник физиотерапии и курортологии, 2008.Т.13, №5. С.7-8.
24. Обухова, Л.М. Химия озона /Мухина И.В., Обухова Л.М., Евдокимова О., Сибиркин А.А.// Материалы V Украинско-Русской научнопрактической конференции с международным участием Озон в биологии и медицине - Украина, Ялта, Вестник физиотерапии и курортологии, 2008.Т.13, №5. С.8-9.
25. Обухова, Л.М. Влияние озона на состояние сывороточного человеческого альбумина in vitro. /Обухова Л.М., Конторщикова К.Н.//Труды V Международной конференции и дискуссионного научного клуба Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии - Украина, Гурзуф, 2008.- С. 374-375.
26. Обухова, Л.М. Влияние озона на некоторые параметры раствора сывороточного человеческого альбумина./ Обухова Л.М., Ведунова М.В., Конторщикова К.Н.// Всероссийский научно-прикладной семинар Озон и другие экологически чистые окислители. Наука и технологии - Москва, МГУ, 2008.- С. 53-54.
27. Обухова, Л.М. Применение метода клиновидной дегидратации для диагностики отравлений наркотическими веществами/ Эделев Н.С., Конов А.С., Обухова Л.М.// Нижегородский медицинский журнал, 2008. № 3. С.150-151.
28. Обухова, Л.М. Возможные механизмы воздействия озона на белки плазмы крови/Обухова Л.М., Ведунова М.В., Конторщикова К.Н.// материалы Всероссийской конференции молодых ученых и школе Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты имени ак. Н.М.
ЭммануэляЦ Москва, 2008. С.91.
29. Обухова, Л.М. Некоторые параметры сыворотки крови при отравлении наркотическими веществами/Обухова Л.М, Эделев Н.С., Конов А.С., Яхно Т.А., Шапошникова О.Б.//тезисы докладов V Международной научной конференция Кинетика и механизм кристаллизации.
Кристаллизация для нанотехнологий, техники и медицины - Иваново, Издво Иваново, 2008.- С.230.
30. Обухова, Л.М. Определение токсичности водных сред методом клиновидной дегидратации// Обухова Л.М., Безруков М.Е., Петченко А.С.// тезисы докладов V Международной научной конференция Кинетика и механизм кристаллизации. Кристаллизация для нанотехнологий, техники и медицины - Иваново, Изд-во Иваново, 2008.- С.231.
31. Обухова, Л.М., Ведунова М.В., Конторщикова К.Н. //Материалы международной конференции Высокоинтенсивные физические факторы в медицине, биологии, экологии и сельском хозяйствеЦ Саров, 2008.- С. 5657.
32. Крылов В.Н. Пчелиный яд в геронтологии/Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Антипенко Е.А., Обухова Л.М.//Материалы координационного совещания и 9-й научно-практической конференции Интермед Москва, 2009.- С.223- 229.
33. Kontorschikova C.N. Changes In Biochemical Characteristics In Correction Of Metabolic Misbalance With Low Doses Of Ozone/ Kontorschikova C.N., Efremenko J.R., Vedunova M.V., Koroleva E.F., Maslennikov O.V., Obukhova L.M., Sibirkin A.A., Gribkova I.A., Radaeva M.V.// Materials of 19th World Congress & Exhibition International Ozone Association.- Tokyo, Japan, 2009.- P.115-116.
34. Обухова, Л.М. Влияние озона на белки плазмы крови/Обухова Л.М., Ведунова М.В., Конторщикова К.Н.//Revista de ozonoterapia, 2009.Vol. 3, №1. P.47-48.
35. Обухова, Л.М. Разложение озона в водных средах: кинетика и побочные продукты/ Обухова Л.М., Конторщикова К.Н., Мухина И.В., Сибиркин А.А., Гусовский Д.И., Чернова О.Ю. //Revista de ozonoterapia, 2009.Vol. 3, №1. P.49-50.
36. Обухова, Л.М. Состояние белков плазмы крови как отражение окислительного стресса при эндогенной интоксикации организма/ Обухова Л.М., Ведунова М.В., Конторщикова К.Н. //Revista de ozonoterapia, 2009.Vol.
3, №1. P.158-159.
37. Обухова, Л.М. Информационно-методическое письмо Предварительная диагностика отравлений наркотическими и (или) сильнодействующими веществами методом клиновидной дегидратации/ Эделев Н.С., Конов А.С., Обухова Л.М.- 5 с.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АМИ акустомеханический импеданс ААт аланинаминотрансфераза АсАт аспартатаминотрансфераз АФК активные формы кислорода БКР безвредная кратность разведения БХЛ биохемилюминесценция ГГТП -глутамилтранспептидаза ДК диеновые коньюгаты ИБС ишемическая болезнь сердца ЛКР летальная кратность разведения ЛПВП липопротеиды высокой плотности ЛПНП липопротеиды низкой плотности ЛПОНП липопротеиды очень низкой плотности МКБ мочекаменная болезнь МСМ молекулы средней массы ОМБ окислительная модификация белка ОРВИ острая респираторная вирусная инфекция ОШ основания Шиффа ПОЛ перекисное окисление липидов СОЭ скорость оседания эритроцитов СД II сахарный диабет второго типа ТГ триглицериды ТК триеновые коньюгаты Хс общий холестерин Хс- ЛПНП холестерин липопротеинов низкой плотности Хс-ЛПОНП холестерин липопротеинов очень низкой плотности Хс-ЛПВП холестерин липопротеинов высокой плотности ЩФ щелочная фосфатаза ЭИ эндогенная интоксикация Le лейкоциты
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии