Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

  На правах рукописи

Романова Ирина Владимировна

РОЛЬ CART И AGRP В МОДУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ МОЗГА

03.03.01 Ц Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург

2012

Работа выполнена в лаборатории сравнительной сомнологии и нейроэндокринологии Федерального государственного бюджетного  учреждения науки Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук

Официальные оппоненты:  доктор медицинских наук,

  чл.- корр. РАМН,  профессор 

  Отеллин Владимир Александрович 

 

  доктор биологических наук, профессор

  Краснощекова Елена Ивановна,

  доктор биологических  наук

  Журавин Игорь  Александрович 

Научный консультант  - доктор медицинских наук

  Оганесян Генрих Амазаспович        

Ведущее учреждение Ц  Федеральное государственное  бюджетного учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения  РАН.

Защита диссертации состоится л  декабря  2012 года в 11 часов на заседании диссертационного совета (Д.002.127.01) при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук  по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, пр.  Мориса Тореза, 44

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

  (194223, г. Санкт-Петербург, пр.  Мориса Тореза, 44).

Автореферат разослан л____ _____________ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор                                М.Н. Маслова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одной из актуальных проблем физиологии и медицины является изучение механизмов взаимосвязи пищевого поведения и  цикла бодрствование-сон у человека и животных.  С древнейших времен обращалось внимание на связь межу этими функциями организма, на чем во многом основывались и основываются гигиена питания и гигиена сна.  Несмотря на то, что в исследованиях взаимосвязи пищевого поведения и сна  достигнуты определенные успехи (Koban, et al., 2006, 2008),  центральные  механизмы  взаимосвязи этих функций организма до сих пор остаются во многом не выясненными.

       Открытие в мозге новых пептидов, участвующих в регуляции пищевого поведения и локализованных в  дофаминергических структурах или областях дофаминергической иннервации, ставит  вопрос о выяснении  их роли в регуляции различных функций организма, в том числе пищевого поведения и цикла  бодрствование-сон.

       Такими относительно УновымиФ пептидами  являются CART-  пептид (cocaine- and amphetamine-regulated transcript,  Douglas, et. al., 1995) и AGRP (Agouti related peptide, Ollmann, et al., 1997).  В литературе функциональная роль этих пептидов обсуждается в связи с регуляцией пищевого поведения как факторов, которые  тормозят и активируют аппетит, а также участвуют в регуляции энергетического баланса организма  (Kristensen, et al., 1998; Stanley, et al., 2001; Schwartz, Mortin,  2002). Однако на основании данных, которые появились  в литературе за последние годы и собственных наблюдений, мы полагаем, что функциональная роль этих пептидов может быть значительно шире.  Нейроны, экспрессирующие  CART,  выявлены во многих областях мозга: этот пептид широко  распространен в  гипоталамусе, а также в мезолимбической системе (Couceyro, et al., 1997; Koylu, et  al., 1997,  1998;  Vicentic, Jones, 2007). Экспрессия AGRP выявлена только в нейронах аркуатного ядра гипоталамуса (Bagnol, et al., 1999), показано его функциональное значение как эндогенного антагониста меланокортиновых рецепторов. CART- и AGRP-иммунореактивные нейроны или их отростки присутствуют в областях мозга, где локализованы либо сами дофаминергические нейроны, либо их мишени.  В частности показано, что  черная  субстанция  и вентральная тегментарная область - самые крупные дофаминергические  формации мозга,  получают иннервацию  от CARTергических нейронов прилежащего ядра (Dallvechia-Adams, et al., 2002) и от AGRP-экспрессирующих нейронов аркуатного ядра (Bagnol, et al., 1999).  В  самом аркуатном ядре гипоталамуса кроме CART- и  AGRPергических нейронов, локализованы нейроны других эргичностей, в частности  и дофаминергические нейроны.  В нейросекреторных центрах - паравентрикулярном  и супраоптическом ядрах гипоталамуса, которые получают мощную дофаминергическую иннервацию (Buijs,  et al., 1984; Wagner,  et al., 1995; Cheung, et al., 1998; Угрюмов, 1999),  выявлена экспрессия CART и обильная иннервация AGRP (Koylu, et  al., 1997; 1998; Broberger, et al.,  1998; Haskell-Luevano, et al., 1999). Данные  о локализации CART и AGRP являются предпосылкой  для изучения функциональных связей этих пептидов с  дофаминергическими нейронами,  как элементов  функционального модуля, обеспечивающих координирование работы дофаминергической системы мозга в норме и при патологиях.

Функциональная активность CART- и AGRPергических  нейронов аркуатного ядра гипоталамуса контролируется  различными метаболическими факторами, поступающих из  крови. На них выявлены рецепторы к лептину, инсулину, грелину и др. (Stanley, et al., 2001; Schwartz,  Mortin,  2002; Charbonneau, et al.,  2004). В связи с этим нейроны аркуатного ядра гипоталамуса могут выполнять роль функционального посредника между периферическими тканями  и  дофаминергическими нейронами мозга в частности. 

Цель настоящей работы:  исследовать морфо-функциональные взаимодействия CART и AGRP с дофаминергическими  нейронами мозга.

Задачи:

1) Оценить характер распространения CART и AGRP в дофаминергических структурах мозга.

2) Оценить морфо-функциональное состояние CART- и AGRPергических нейронов на фоне изменений функциональной  активности дофаминергических нейронов.

3) Оценить функциональную активность дофаминергических нейронов мозга на фоне  воздействия  CART и AGRP.

4) Оценить функциональную активность CARTергических нейронов при нарушениях  интегративных  взаимодействий в стриатонигральных проекциях и баланса AGRP в мозге.

5) Проследить становление структурных и функциональных взаимосвязей CART- и AGRPергических нейронов  в связи с развитием дофаминергических нейронов в пренатальном и постнатальном развитии.

Научная новизна

       Впервые выявлено взаимодействие  CART-пептида и AGRP в модуляции функциональной активности дофаминергических нейронов мозга.  Выявлено  активирующее влияние CART-пептида и тормозное влияние AGRP на дофаминергические нейроны мозга.  Показано, что в дофаминергических нейронах мозга иммунореактивность тирозингидроксилазы, ключевого фермента синтеза дофамина, в различных формах поведения изменяется однонаправленно с уровнем иммунореактивности CART-пептида  и противоположно с уровнем AGRP, что демонстрирует роль CART-пептида и  AGRP как функциональных антагонистов.

       Впервые показано, что  на фоне  6-часовой  депривации сна уменьшение активности тирозингидроксилазы в  дофаминергических нейронах сопровождается уменьшением уровня CART-пептида и увеличением уровня AGRP. В стриатуме на фоне уменьшения активности тирозингидроксилазы выявлено увеличение иммунореактивности Д1 рецепторов, а  в крупноклеточных ядрах гипоталамуса - уменьшение, что, очевидно, обусловлено различными функциями дофамина в этих системах и необходимо для  обеспечения  интеграции телэнцефало-диэнцефального  взаимодействия при изменении функциональных состояний организма. На фоне постдепривационного сна в стриатуме и в гипоталамусе выявлено восстановление уровня тирозингидроксилазы и увеличение иммунореактивности Д2 рецепторов дофамина.

Полученные данные демонстрируют участие одних и тех же нейрохимических механизмов (CART и AGRP) в регуляции функций организма, связанных с работой дофаминергической системы мозга (в частности пищевое поведение, стресс,  сон), что объясняет многофакторный характер нарушений  при дисфункции какой-либо из этих систем.

Показано, что структурные взаимосвязи между CART- и дофаминергическими нейронами формируются в ходе пренатального развития организма, тогда как созревание  AGRPергической  системы и установление ее взаимосвязей с дофаминергической системой происходит в раннем постнатальном периоде развития. Впервые показано, что формирование механизма влияния CART-пептида  на дофаминергические нейроны среднего мозга наблюдается  у представителей низших tetrapoda (амфибии, рептилии). Активация CART-пептида в стриатонигральных проекциях на фоне гибели дофаминергических нейронов черной субстанции может носить компенсаторный характер. 

Положения, выносимые на защиту:

1. Формирование взаимосвязей нейронов, вырабатывающих CART и дофамин,  происходит  в пренатальном периоде,  когда формируются функциональные системы организма.
2. Формирование взаимосвязей нейронов, вырабатывающих AGRP и дофамин,  происходит  в постнатальном периоде, когда происходят процессы дифференцировки функциональных систем организма, включая фазы и стадии цикла бодрствование-сон.
3. CART- и AGRPергические  системы оказывают модулирующее

разнонаправленное  действие на дофаминергические нейроны мозга млекопитающих.

4. Доминирующим компонентом в функциональном взаимодействии CART- и AGRP- с дофаминергической  системой  является  более поздно созревающая  AGRPергическая система.

5. Активация CARTергических нейронов при нарушении интегративных взаимосвязей в  нигростриатной системе носит компенсаторный характер.

Теоретическая и практическая значимость

       Исследование имеет фундаментальное значение для  понимания нейрохимических механизмов взаимосвязи пищевого поведения с циклом бодрствование-сон.  Полученные данные демонстрируют  существование общих нейрохимических механизмов  регуляции  различных форм поведения организма  (как, например,  двигательная активность - пищевое поведение-цикл бодрствование-сон), что объясняет возникновение многофакторных нарушений  в этих системах при патологиях. 

Полученные результаты демонстрируют роль пептидергических факторов в  функционировании дофаминергической системы в норме и при патологии и  могут быть использованы для разработки новых методов диагностики  дисфункций дофаминергической системы, а так же  фармацевтических стратегий при их лечении.

       Полученные результаты важны для понимания нейробиологических основ метаболической хирургии: уменьшение аппетита и потребления пищи после уменьшения объема желудка связано с изменением баланса орексигенных и анорексигенных пептидов в аркуатном ядре гипоталамуса. В работе показано, что сроки развития канцер-анорексии  зависят от  нутритивных факторов и функциональной активности нейронов аркуатного ядра гипоталамуса. 

       Полученные данные могут быть использованы в курсах лекций и практических занятий  для студентов биологических и  медицинских факультетов университетов и медицинских институтов.

       Полученные данные могут быть использованы в курсах лекций и практических занятий  для студентов биологических и  медицинских факультетов университетов и медицинских институтов.

Апробация работы

Результаты исследования были представлены и обсуждены на Конгрессе  ACS (Chicago, Illinois, USA, 2003), на международной конференции  Brain control of feeding behavior (Stockholm, Sweden, 2004), на XX и ХХI съездах физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва,  2007; Калуга, 2010),  на VII международном конгрессе Neurohypophyseal  hormones (Regensburg, Germany, 2007), на  конференции с международным  участием УНейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозгаФ (Санкт-Петербург-Колтуши, 2008), на VI Всероссийской конференции  с международным участием УМеханизмы функционирования висцеральных системФ, посвященной 50-летию открытия А.М. Уголевым мембранного  пищеварения (Санкт-Петербург, 2008), на конференции УМеханизмы нервных и нейроэндокринных регуляцийФ, посвященной 90-летию со дня рождения академика Т.М. Турпаева (Москва,  2008), на II Съезде физиологов СНГ  (Кишинев, Молдова, 2008),  на VI, VII Всероссийских конференциях с международным  участием  УАктуальные проблемы сомнологии У (Санкт-Петербург, 2008; Москва 2010), на BSA  annual meeting (Edinburg,  UK, 2009), на VII Всероссийской  конференции  с международным  участием  УМеханизмы функционирования висцеральных систем У (Санкт-Петербург, Россия, 2009), на VII и VIII Всероссийских  конференциях  Нейроэндокринология  (Санкт-Петербург, 2005, 2010),  на 14-й  и 15-й  международных конференциях УStress and BehaviorФ (Санкт-Петербург, 2010, 2011), на Всероссийской конференции с международным участием Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе адаптации к условиям среды (Санкт-Петербург, 2010), на ХIV Международном совещании и VII школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2011), на 10-м Симпозиуме Catecholamines and other  neurotransmitters in  stress  (Smolenice Castle, Slovakia, 2011), на III съезде физиологов СНГ (Ялта, Украина, 2011).

Финансовая поддержка работы.  Работа выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук, Российского фонда фундаментальных исследований №№ 07-04-01258, 10-04-00624, 12-04-01543, гранта  ОБН РАН.

ичный вклад автора. Результаты работы получены лично автором, под его руководством и при его непосредственном участии в проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. 

Публикации.  По теме диссертации опубликовано  44 работы, 18 из которых -  статьи  в рецензируемых журналах, 26 - тезисы и статьи в других печатных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация  состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего  отечественных  и зарубежных источников.  Работа изложена на  страницах машинописного текста, иллюстрирована таблицами  и  рисунками. 

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные

       В работе представлены результаты исследований, которые проведены на крысах, на мышах линии С57BL/6J  нормального  генотипа а/а и Ay/a (Agouti yellow), который характеризуется доминантной (спонтанной) мутацией гена агути и развитием ожирения.  Так же проведены исследования на болотных черепахах (Emys Orbicularis) и травяных лягушках  (Rana temporaria).

Были использованы следующие экспериментальные модели

Модели in vitro

Животных декапитировали,  немедленно извлекали мозг и  в стерильных условиях вырезали необходимую область мозга. Сначала проводили преинкубацию срезов в течение 30 минут, а затем инкубацию в  питательной среде (DMEM с  50 мкг/мл  пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 20%  инактивированной нормальной сыворотки крови лошади)  в инкубаторе,  поддерживающем температуру 37 С и концентрацию газов О2 95% и СО2 5%.

Инкубация нигроаккумбальных переживающих срезов мозга крысы в среде с блокатором синтеза дофамина  альфа-метил-паратирозином (аМПТ). 

У самцов крысы Вистар массой 180-200 г  горизонтально был вырезан  участок  мозга таким образом, что в нем  содержалась  substantia nigra и  nucleus accumbens, а так же были сохранены структурные связи между ними. Контрольные эксплантаты (n=5) помещали в питательную среду с добавлением 200 мкл дистллированной воды, а опытные (n=5)  Ц  в среду со  100 мкM  аМПТ.  Инкубацию проводили в течение 4 часов.

Инкубация переживающих срезов substantia nigra крысы в среде с CART-пептидом.

Фронтальные срезы мозга самцов крысы Вистар (180-200 г.) толщиной 300-400 мкм (n=10)  из области substantia nigra инкубировали 1 час в питательной среде с добавлением 100 нM CART-пептида (СART 55-102, Phoenix Pharmaceuticals Inc., USA, специфичный для крысы), разведенного на фосфатно-солевом буфере (PBS).  Контролем служили срезы (n=10), инкубированные 1 ч в чистой среде с добавлением 1мкл PBS.

 

Инкубация переживающих срезов мозга с ventral tegmental area мозга мыши в среде с AGRP.

Фронтальные срезы мозга самок мышей C57BL/6J (вес 22-24 г.)  инкубировали в течение 3 ч.  в среде с  200 нM AGRP (AGRP 83-132, Phoenix Pharmaceuticals Inc., USA, специфичный для мыши), разведенного на PBS (n=13). Контролем служили срезы, инкубированные  в течение 3 ч.  в питательной  среде с 1мк  PBS на 2 мл питательной среды (n=13).

Во всех сериях экспериментов по окончании инкубации  образцы, предназначенные для иммуногистохимии, погружали в свежеприготовленный на PBS охлажденный 4% раствор параформальдегида  и  фиксировали при + 4o C 24 ч.  Экспланты, предназначенные для Вестерн блоттинга, подмораживали на сухом льде, вырезали необходимую область  и замораживали при -80oС для последующего приготовления проб.

Модели in vivo

Депривация сна

Депривация (лишение) сна - широко распространенный и общепризнанный  подход в сомнологии при изучении организации цикла бодрствование-сон и его патологии. Электрофизиологически показано, что после  6-ти часовой мягкой тактильной депривации сна за вибрисы у крыс происходит  подавление как медленноволновой, так и быстроволновой фаз сна, а  в двух-часовом постдепривационном сне развивается медленноволновая фаза сна  (Оганесян,  и др., 2002, 2007). В эксперименте использованы  самцы  крысы  Вистар массой 200-220 г. В период активного бодрствования (9.00-10.00) был фиксирован мозг  контрольных крыс, в  15.00 -  мозг  крыс после 6- часовой депривации  сна, а в 17 ч.  - крыс после 2 ч постдепривационного сна.  После легкого  эфирного наркоза фиксация материала мозга производилась либо посредством транскардиальной перфузии и последующей обработки для иммуногистохимических исследований, либо животных декапитировали и вырезали структуры мозга для приготовления проб для Вестерн блоттинга.  Во всех сериях эксперимента в каждой группе было по 5-6 животных.

Иммобилизационный стресс

Самцы крыс линии Вистар (200-220 г) были подвергнуты жесткой иммобилизации - фиксации  за конечности  на спине в течение 30 минут  (n=5).  Контролем служили крысы без воздействия (n=5).  Мозг погружали в фиксатор при +4о С. 

Канюлирование животных

Самцам крысы Вистар (массой 250 г) за 7 дней до эксперимента с помощью стериотаксического аппарата билатерально были вживлены направляющие  канюли из нержавеющей стали в области мозга над серединой дорзальной поверхности компактной части substantia nigra по координатам AP= -5 мм, L=2.0 мм, V=8,5 мм относительно Брегмы, в соответствии со стереотаксическим атласом (Paxinos, Watson,1998). Крысам контрольных групп через канюли вводили PBS.  Канюлированные животные были использованы в трех экспериментах. В первом  экспериментальным крысам через канюли вводили CART-пептид (1 мкл с 1 мкг белка, растворенного на PBS) и через 2 ч (после эфирного наркоза) животных перфузировали транскардиально  с последующей обработкой мозга для морфологических исследований.  Во втором эксперименте через 3 часа после введения 1 мкл CART-пептида (1 мкг)  крыс декапитировали, извлекали мозг и фиксировали в 4% параформальдегиде.

Третий эксперимент был проведен сотрудниками лаборатории сравнительной термофизиологии  ИЭФБ РАН  для выявления тирозингидроксилазы в мозге (Пастухов, и др., 2010)  после  двукратного введения  через каждую канюлю либо 1 мкл  лактацистина - ингибитора протеасом, растворенного на PBS  (n=5), либо 1 мкл PBS  (n=5).  Нами были  использованы срезы  мозга этих  же крыс*. 

*Автор выражает глубокую благодарность заведующему лаборатории д.б.н. Пастухову Ю.Ф. за возможность использовать этот материал.

Модель ожирения использована для выяснения баланса AGRP/CART.  Для  эксперимента использованы  самки мышей C57/6J  генотипа а/a и Ay/a, характеризуемый доминантной (спонтанной) мутацией гена агути и развитием ожирения. Использованы мыши одинакового возраста весом  22-24 г (а/а) и 36-40 г (Ay/a).

Мозг лактирующих самок  (на 10-21 день лактации) был использован для исследования, так как при  лактации не наблюдается разницы в весе  и аппетите между  а/а  и Ay/a мышами. Для контроля использован мозг виргильных  а/а и Ay/a мышей (вес составлял соответственно 22 и 35 г).

Исследования мозга у эмбрионов и крысят

       Беременных самок крысы Вистар наркотизировали и декапитировали на 20-й день беременности. После транскардиальной перфузии 4%  параформальдегидом  у эмбрионов обрезали верх черепа и погружали мозг в при  +4 о С в фиксатор для постфиксации. Крысят на

5-й день после рождения подвергали эфирному наркозу и транскардиальной перфузии 4% параформальдегидом, после чего мозг дофиксировали  в том же фиксаторе  при  +4 о С.

       

Особи болотной черепахи  (пол не определяли, n=4) и самцы травяной лягушки (n=5) были перфузированы транскардиально после наркоза.

Обработка материала

       

       Транскардиальную перфузию проводили с помощью перфузионного насоса сначала 0,1М фосфатным буфером (РB), а потом 4% параформальдегидом, разведенном на 0,2М РВ, после чего мозг оставляли в том же фиксаторе при +4о С в течение 12 ч. В таком  же растворе фиксировали мозг из экспериментов in vitro в течение суток, а после погружения - в течение  трех  суток. Затем материал промывали в холодном 0,02М PBS и помещали в 30% раствор сахарозы. Материал замораживали в изопентане, охлажденном на сухом льду или жидком

азоте до температуры  - 42о С и хранили при - 86о С. Мозг эмбрионов и

ягушек замораживали на сухом льду в криогеле  Tissue-Tek (Sakura Finetek, NL). На криостате (Leica, Германия) изготавливали либо фронтальные свободно плавающие срезы мозга толщиной 20 мкм, либо срезы толщиной 12-16 мкм монтировали на  стекла  super frost/plus.  Чередующиеся серии срезов  изучаемой зоны накапливали в холодном PBS (+4 С), каждый десятый срез окрашивали 1% раствором толлуидинового  синего для контроля уровня структуры  согласно атласам мозга (Paxinos, Watson, 1998; Paxinos, Franklin, 2001). Срезы, монтированные на стекла,  хранили при -25 С. Накануне проведения иммуногистохимической реакции стекла высушивали при комнатной температуре в течение ночи.

Иммуногистохимический метод

Иммуногистохимический метод с использованием немеченых антител и иммуногистохимические реакции проводили по стандартной методике. После предварительной промывки в PBS и  PBS с 0,1% Tween-20 (PBST) проведена 30 мин блокировка эндогенной пероксидазы 0,3 % раствором перекиси водорода  на 50% метаноле, растворенном на PBST. После нескольких промывок в PBST была проведена блокировка неспецифического связывания 1 час при комнатной температуре в 4% блокирующем раствором, содержащем 1% бычий сывороточный альбумин и 3% нормальную сыворотку козы, разведенные на PBST. Затем при + 4 С  в течение  48 часов были проведены инкубации с первичными антителами: кроличьими к CART-пептиду (Phoenix Inc., США) - 1:5000, кроличьими к AGRP (Phoenix Inc., США) - 1:1000, мышиными к Д1-рецепторам дофамина (Chemicon, США) - 1:200, кроличьими к Д2-рецепторам  дофамина (Chemicon, США) - 1: 200, кроличьими (Abcam, США) или мышиными (Sigma, США) к тирозингидроксилазы - 1:2000,  кроличьими к фосфорилированной  (Ser31) тирозингидроксилазе (Millipore, США) - 1:1000, овцы к с-Fos (Abcam, Великобритания) - 1:300, кроличьими к вазопрессину (Abcam, Великобритания) - 1:200, кроличьими к окситоцину (Sigma, США) - 1:200, кроличьи к NMDA(R1-субъединица; Abcam, Великобритания, 1:500) и кроличьи к AMPA (2/3 субъединица; Abcam, Великобритания, 1:400) рецепторам  глутамата. Все первичные антитела разводили на 1% блокирующем растворе. После инкубации и тщательной промывки в PBST срезы инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа в соответствующих вторичных антителах, конъюгированные с биотином: либо против кролика (VectorLab., Великобритания) - 1:300, либо против мыши (VectorLab., Великобритания) - 1:300, либо против козы (Sigma, США) - 1:300. После промывки в PBS  срезы на  1 час так же при комнатной температуре помещали либо в раствор стрептовидин-пероксидаза (VectorLab., Великобритания), либо в  стрептовидин-пероксидазу (Sigma, США), разведенную на PBS 1:500. В эксперименте с инкубацией substantia nigra с CART-пептидом, меченным биотином, так же проводили блокировку эндогенной пероксидазы  0,3% перекисью водорода и  после промывки в PBS инкубировали  со стрептовидин-пероксидазой (1:700) и тщательно промывали. Во всех случаях для визуализации пероксидазы использовали 0,05% раствор диаминобензидина с 0,03 %  перекисью водорода на PBS. После тщательной промывки в PBS свободноплавающие срезы  натягивали на стекла super frost (Menzel, Germany), предварительно покрытые 0,1% - м желатином и высушивали. Стекла из эксперимента с биотинилированным CART-пептидом подкрашивали гематоксилином Эрлиха. Далее стекла подвергали стандартной гистологической обработке и заключали в прозрачную среду Bio-Mount (Bio-Optica, Италия).

Двойное флуоресцентное иммуномечение

       Для исследования распределения двух веществ одновременно в структурах мозга  мы использовали общепринятый метод  коктейля:  после промывки в PBST  и блокировки в 5% блокирующем растворе инкубацию  проводили одновременно в растворе  двух  антител,  произведенных от  разных животных, которые разводили на 1% блокирующем растворе: кролика  к  CART-пептиду (1:3000) и мыши  к  тирозингидроксилазе  (1:1000)  или мышиные против глутаматдекарбоксилазой-67 (1:500);  кролика  к  AGRP (1:500) и мыши  к тирозингидроксилазе  (1:1000),  овцы к c-Fos (1:200) и кролика к  тирозингидроксилазе (Ser31), кролика к  NMDA (1:300) и кролика  к  AMPA (1:300)  рецепторам  глутамата. Инкубацию проводили при + 4 C 48-72 ч. После тщательной промывки в PBS в течение 1 ч. проводили инкубацию в коктейле соответствующих вторичных  антител, так же произведенных в разных животных  (козы против кролика, осла против мыши и цыпленка против овцы), конъюгированных с различными флуорохромами: Alexa-488 (Invitrogen) или  Alexa-568 (Invitrogen) или Alexa-546 (Invitrogen) или CY3 (Jackson Imm.Res.Lab.). Инкубацию со вторыми антителами и последующие процедуры проводили в затемненной комнате при комнатной температуре. После тщательной промывки в PBS свободноплавающие срезы натягивали на стекла, слегка подсушивали и заключали в  мовиол  под покровное стекло и хранили при + 4 C. Анализ препаратов  проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss (Германия) и лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica ХР-5 (Германия) и пакетов программ Zeiss LSM Image Browser и Leica LAS AF Lite. Последовательное сканирование проводили с помощью иммерсионных  объективов х40, х63.

Вестерн блоттинг

Образцы  ткани мозга размораживали, взвешивали и гомогенизировали в десятикратном  растворе лизирующего буфера (0,02М TRIS (hydroxymethylami-nomethane), 0,15М NaCl, 0,001М EDTA, 1% Triton X-100, ингибитор протеаз в разведении 1:100, pH 7,5 (Sigma, США). После центрифугирования количество белка в лизате  определяли по методу Бредфорд. Белки в пробах разделяли с помощью электрофореза в 10% бис-АА акриламидном  геле  по Лэммли (SDS-PAGE).  Гель с белковыми фракциями переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Amersham, Великобритания). Были использованы те же антитела, что и при иммуногистохимическом методе и соответствующие вторые антитела, конъюгированные с пероксидазой.

Визуализацию сигнала проводили с помощью хемилюминисцентной системы ECL (Amersham, Великобритания) и чувствительной  рентгеновской  пленки (Amersham, Великобритания), которую проявляли стандартным фотонабором (Реактив-фото, Россия). Денситометрический анализ проводили с помощью программы Photo-M. Уровень белков интереса был скорректирован  по сигналу GAPDH, выявляемый для определения количества общего белка в пробах.

Морфофункциональный анализ материала

       Изображения изучаемых структур мозга крысы были получены с помощью микроскопа Leika (Germany),  Zeiss (Germany)  со встроенной  видиокамерой Imager 4.1, программного обеспечения  для захвата изображения в .jpg и .bmp и .tiff форматах - AxioVision- 4.7.2. Были использованы объективы Plan-Neo х10, х20.

На полученных снимках проводили количественную оценку оптической плотности иммунореактивного вещества в программе Scion Image Analysis (4.0b, NIH) или Photo-М (Черниговский, При анализе учитывалась  либо область структуры с иммунореактивными отростками и нейронами, либо все  иммунореактивные нейроны  (35-300) на  снимке (стандартная площадь). По каждому животному  в каждой структуре анализировали 8-30 снимков. Результат выражали в условных единицах оптической плотности на мкм2.  Визуально оценивали характер  распределение иммунореактивного вещества в структурах.

Статистический анализ результатов

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью критерия Стьюдента (парного двухвыборочный t-критерий для независимых выборок или непарного t-критерия) с помощью коммерческой программы Microsoft Excel 2003. При сравнении двух животных (контроль-опыт)  за n было принято количество срезов. Достоверными считались отличия  при уровне значимости p<0,05. Результаты представлены в условных единицах и как процент изменения по сравнению с контрольным (100%) уровнем среднего  арифметического  по  каждой группе животных средняя квадратическая погрешность оптической плотности.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологические  взаимосвязи  CART-,  AGRP-  и дофаминергических структур  в мозге млекопитающих

         

О возможности морфофункционального взаимодействия CART- и AGRP- с дофаминергическими структурами свидетельствует характер их распространения в мозге млекопитающих  (Koylu, et  al., 1997,  1998;  Vicentic, Jones,  2007;  Bagnol,  et al., 1999). С помощью непрямого мечения (ДАБ-метод)  на последовательных срезах мозга были выявлены тирозингидроксилаза, CART-пептид и AGRP, что свидетельствует о присутствии всех трех веществ  в одной и той же зоне мозга. С помощью двойного флуоресцентного иммуномечения мы показали наличие CART- или AGRP-иммунореактивных отростков вокруг тел и отростков дофаминергических нейронов (аркуатное,  перивентрикулярное ядра гипоталамуса,  zona incerta, substantia nigra, ventral tegmental area,  околоводопроводное серое вещество), что свидетельствует о наличии структурных связей между ними.  Таким образом, данные о наличии тесных структурных взаимосвязей между CART-/дофамин-  и AGRP-/дофаминергическими структурами ставит вопрос об их функциональных взаимосвязях в мозге.

Влияние воздействия CART-пептида на дофаминергические нейроны 

Эксперименты in vitro были проведены для того, чтобы  исключить афферентные влияния и определить характер прямого воздействия белка на дофаминергические нейроны.  На свободноплавающих фронтальных  срезах эксплантов мозга  иммуногистохимически  выявлено  увеличение оптической плотности тирозингидроксилазы  в нейронах компактной части substantia nigra после инкубации в среде с  CART-пептидом  на 51% по сравнению с контролем (p<0,05), что демонстрирует рисунок 1. На срезах, инкубированных с биотинилированным CART-пептидом, с помощью стрептавидин-пероксидазы,  ДАБ-реакции (с подкраской гематоксилином для визуализации тел нейронов) выявлено, что  биотинилированный белок в основном локализован вокруг тел компактной части substantia nigra, что, по-видимому, может  свидетельствовать  о связывании белка со своим лигандом. Механизмы воздействия CART на клетки связывают с существованием одного или даже нескольких типов метаботропных рецепторов, которые пока не удается  идентифицировать (Vicentic, et al., 2006).

Рис. 1. Иммуногистохимическая реакция на тирозингидроксилазу  в substsntia nigra compacta (SNc) крысы после 1 ч инкубации эксплантатов в среде с CART-пептидом  (эксперимент). Масштаб 100 мкм.

Влияние воздействия AGRP на дофаминергические нейроны 

В опытах in vitro после 3 ч инкубации в среде с AGRP с помощью вестерн блоттинга  выявлено уменьшение иммунореактивности  тирозингидроксилазы (на 45%, р<0,05)  по сравнению с  уровнем контроля (Рис. 2).

 

Рис. 2. Вестерн блоттинг тирозингидроксилазы ventral tegmental area  мыши после 3 ч инкубации с AGRP. Для  контроля количества белка в пробах использовали GAPDH. 

       Физиологическое действие AGRP  в мозге связывают с  их ролью, как блокаторов  рецепторов  меланокортина 3-го и 4-го типов (МК3 и МК4).  В  области  substantia nigra и VTA выявлены только МК3 рецепторы  (Roselli-Rehfuss, et al., 1993). Однако в литературе обсуждается возможность влияния AGRP  и через другие, пока не известные, рецепторы (Pritchard, White, 2005;  Creemers, 2006).

       Таким образом, полученные нами  данные свидетельствуют об активирующем влиянии CART-пептида и тормозном влиянии AGRP на функциональную активность  дофаминергических нейронов, что свидетельствует  об их  роли как функциональных антагонистах.

Влияние блокады синтеза дофамина на количество иммунореактивного  CART-пептида

Показано, что внутрибрюшинные введения крысам аМПТ - блокатора  синтеза тирозингидроксилазы, приводит к уменьшению синтеза  дофамина в мозге (Watanabe, et al., 2005). Нейроны nucleus accumbens посылают CARTергические проекции в substantia nigra (Dallvechia-Adams, et al., 2002).  Поэтому нами был проведен эксперимент in vitro с инкубацией нигростриатных отделов. 

После четырех часов инкубации с аМПТ группе выявлено уменьшение  оптической плотности  тирозингидроксилазы в телах нейронов компактной части substantia nigra (на 26 %, р<0,05) по сравнению с контрольными образцами, которые инкубировали в чистой среде.  При этом в  нигроаккумбальных эксплантатах прослеживается увеличение иммунореактивности CART-пептида в нейронах nucleus accumbens  (на  44 %, p<0,05), а также и ва отростках, которые выявляются в substantia nigra (на 87%, p<0,05).  Таким образом, на фоне торможения  в нейронах substantia nigra синтеза тирозингидроксилазы и, как мы полагаем, уменьшения уровня синтеза дофамина,  мы наблюдаем активацию CARTергических нейронов  в  nucleus accumbens.        
       Известно, что CART-иммунореактивные нейроны nucleus accumbens экспрессируют Д2 и Д3 рецепторы дофамина  (Hunter, et al., 2006), что так же может свидетельствовать о тормозном характере влияния дофамина на них.  Так же известно, что  в нейронах nucleus accumbens CART-пептид колокализован с ГАМК, активность которых тормозится агонистами Д3 рецепторов (Dallvechia-Adams, et al., 2002).  Эти данные указывают на то, что конечный результат изменения дофаминергической иннервации в nucleus accumbens может зависеть и от функциональных взаимосвязей CART с другими нейротрансмиттерами: активация ГАМК (главного тормозного нейротрансмиттера) в nucleus accumbens, вероятно,  может приводить к торможению ГАМКергических нейронов в ретикулярной части substantia nigra. Это  в свою очередь может повлиять и на функционирование  дофаминергических нейронов компактной части substantia nigra, имеющих синаптические связи с последними.

После введения агониста Д3 рецепторов выявлено уменьшению мРНК CART в nucleus accumbens (Hunter, et al., 2006), что так же свидетельствует о тормозном характере влияния дофамина. Показано, что Д1 рецепторы присутствуют на 25% CART-иммунореактивных нейронов, однако введение антагонистов и агонистов Д1 рецепторов не вызывало  изменения уровня мРНК CART-пептида, аналогичные данные получены относительно Д2 рецепторов  (Hubert, et al., 2006).

Таким образом, полученные нами в эксперименте in vitro данные демонстрируют тормозный характер влияния дофамина на CARTергические нейроны nucleus accumbens.

Влияние  CART-пептида на содержание и активность  тирозингидроксилазы  в нейронах substantia nigra

       Возможность и характер влияния CART-пептида на дофаминергические нейроны были  исследованы иммуногистохимически (ДАБ-метод) после введения 1 мкл (0,2 нМ) CART-пептида крысам  Вистар  через заранее вживленные билатерально канюли в область substantia nigra.  Через 1,5 ч после воздействия в нейронах substantia nigra выявлено  увеличение  оптической плотности тирозингидроксилазы  как  к общей форме, так и  активной фосфорилированной (по Ser31) форме (Рис. 3).

Через 1,5 ч после введения CART-пептида  в нейронах substantia nigra выявлено достоверное увеличение иммунореактивности с-Fos протеина по сравнению с контролем (введение фосфатного буфера), а с помощью тройного  флуоресцентного иммуномечения выявлено присутствие c-Fos (Alexa-546) как в цитоплазме дофаминергических нейронов (меченных фосфорилированной по Ser31тирозингидроксилазой, Alexa-488), так и в их ядрах (DAPI), о чем свидетельствует картина колокализация этих маркеров.

       Через 3 ч после введения CART-пептида в нейронах substantia nigra выявлено увеличение оптической плотности тирозингидроксилазы

(на 15%, р<0,05) по сравнению с контролем. Увеличение с-Fos, а так же  фосфорилированной формы  тирозингидроксилазы после введения CART-пептида демонстрируют его участие в активации функциональной активности дофаминергических нейронов и влияние на  активность  фермента синтеза дофамина (Grattan,  Kokay, 2008). C другой стороны,  увеличение  фосфорилирования  (по серину 31) тирозингидроксилазы указывает на то, что эффект CART-пептида опосредуется  ERK1/2 киназами, которые, как известно, влияют на активность транскрипционных факторов и, в частности, CREB (Lakatos, et al., 2005).  Введение CART-пептида в VTA вызывало  повышенную  двигательную  активность у крыс, которая блокировалась на фоне введения  галоперидола (Kimmel, et al., 2000), что свидетельствует о действии CART через модуляцию дофаминергических нейронов.

  Полученные данные демонстрируют активирующее влияние CART-пептида на функциональную активность дофаминергических нейронов.

Исследование  CART-пептида  в нигростриатных проекциях на фоне гибели дофаминергических нейронов

Известно, что при нейродегенеративных заболеваниях, в частности при паркинсонизме,  в течение многих лет происходит постепенная гибель дофаминергических нейронов substantia nigra. Однако на ранних стадиях заболевания отсутствуют какими-либо моторные симптомы  (доклиническая стадия;  Угрюмов, 2010).  Нарушения двигательной активности появляются  только тогда, когда погибает более 70%  нейронов substantia nigra (клиническая стадия). В связи с этим встает вопрос о существовании  в ЦНС механизмов, которые компенсируют функцию погибших и  поддерживают  активность еще функционирующих дофаминергических нейронов.  Было  проведено иммуногистохимическое исследование CART-пептида на срезах мозга из области  nucleus accumbens и substantia nigra в модели протеасомной дисфункции, вызванной  лактацистином (Пастухов, и др., 2010). В этой модели  в substantia nigra на фоне гибели 30% нейронов substantia nigra  не было выявлено  уменьшения  оптической плотности  тирозингидроксилазы как в телах выживших  70% нейронов substantia nigra, так и в отростках, иннервирующий стриатум  (оптическая плотность тирозингидроксилазы, напротив, несколько  возрастала).  Мы показали, что при этом происходит увеличение оптической плотности CART-пептида в nucleus accumbens,  в  substantia nigra (Рис. 4), а так же в нейронах дорзального стриатума.

       Таким образом, учитывая возможность активирующего влияния CART-пептида на дофаминергические нейроны в экспериментах in vitro и in vivo, мы полагаем,  что на фоне гибели нейронов в черной субстанции увеличение иммунореактивности  CART-пептида в стриатонигральных проекциях  можно рассматривать как компенсаторный механизм, направленный не поддержание баланса дофамина.

Исследование баланса  AGRP, CART и тирозингидроксилазы при изменении пищевого поведения и развитии  ожирения

В гипоталамусе  взаимодействие орексигенных (нейропептид-Y/AGRP) и анорексигенных (POMC/CART) пептидов обеспечивает регуляцию пищевого поведения (Schwartz,  Morton, 2002;  Druce, Bloom, 2003). Показано, что активация нейронов аркуатного ядра гипоталамуса, экспрессирующих  нейропептид-Y и AGRP, вызывает увеличение аппетита и, соответственно, вызывает увеличение  потребления пищи  и увеличение массы тела. Активация же нейронов, которые экспрессируют  POMC (и его производные, в частности -MSH) и CART-пептид  приводит к  снижению аппетита.

У мышей Agouti yellow (Ay/a) начиная с 6-недельного возраста отмечено увеличение потребления пищи по сравнению с мышами C57BL/6J  (a/a), что приводило  к увеличению массы тела и  развитию ожирения (Бажан, и др., 2007).  У Ay/a мышей  на фоне активации аппетита выявлено снижение экспрессии AGRP в мозге (Makarova, et al., 2010). С помощью иммуногистохимии и денситометрии мы показали, что на фоне уменьшения уровня AGRP и, соответственно,  иннервации AGRP  различных ядер  гипоталамуса (Рис. 5А), происходит  увеличение иммунореактивности CART-пептида (Рис. 5Б). При этом выявлено  увеличение  иммунореактивности тирозингидроксилазы в нейронах различных дофаминергических структур: в аркуатном ядре на 30% (p<0,05), в  медиальной части zona incerta  на 52% (p<0,05), в вентральном тегментуме на 76% (p<0,05), а так же в перивентрикулярном ядре  по сравнению с а/а мышами.

Рис. 5.  Анализ  оптической плотности иммунореактивного вещества AGRP- (А) и CART- (Б) у а/а  и Ау/а мышей в аркуатном (АРК), паравентрикулярном (ПВЯ), супраоптическом  (СОЯ) и  супрахиазматическом (СХЯ) ядрах гипоталамуса.

По оси ординат: оптическая плотность выражена в условных единицах на мкм2;  обозначения: * - достоверность отличия  (p<0,05) Ау/а  от а/а.

  Известно, что дофаминергические нейроны аркуатного  ядра иннервируют,  в частности, супраоптическое ядро гипоталамуса (Buijs, et al., 1984),  zona incerta и перивентрикулярного ядра  - паравентрикулярное ядро (Moore,  Lookingland, 2000), вентральный тегментум - ядра амигдалы. Таким образом, увеличение  дофаминергической иннервации при ожирении может влиять на изменение различных функций организма.        Известно, что                Известно, что

Полученные данные свидетельствуют о том, что на фоне уменьшения иммунореактивности AGRP наблюдается увеличение иммунореактивности  CART и тирозингидроксилазы в исследованных структурах мозга, что свидетельствует  об однонаправленных изменениях CART и тирозингидроксилазы и противоположных изменениях  AGRP и CART.

Исследование  баланса  AGRP/CART у мышей Ay/a на фоне лактации

Во время  беременности и лактации  у а/а и Ay/a мышей выявлено увеличение экспрессии AGRP в мозге, a у Ay/a мышей отмечено уменьшение  уровня инсулина, лептина и глюкозы в крови (Makarova, et al., 2010). Кроме того известно, что уровень дофамина, как фактора, тормозящего секрецию пролактина,  в аркуатном ядре гипоталамуса во время беременности и лактации  уменьшается, что приводит к  активации секреции пролактина (Ben-Jonathan, et al., 1980, 1991).  Поэтому мы использовали  лактирующих мышей как модель, для исследования баланса CART  и тирозингидроксилазы на фоне  увеличения уровня AGRP в мозге.

Рис. 6 . Анализ  оптической плотности иммунореактивного вещества AGRP  (А) и тирозингидроксилазы (Б) в аркуатном ядре гипоталамуса  у виргильных и лактирующих мышей а/а  и Ау/а.

По оси ординат: оптическая плотность выражена в условных единицах на  мкм2;  обозначения: * - достоверность отличия  (p<0,05) Ау/а  от а/а.

На фоне  лактации увеличении иммунореактивности AGRP в нейронах аркуатного ядра гипоталамуса (Рис.  6А) и иннервации AGRP других структур мозга сопровождалось уменьшением тирозингидроксилазы (Рис.  6Б) и иммунореактивности CART-пептида  у а/а и  у Ay/a мышей  (р<0,05) по сравнению с виргильными мышами  (Рис. 7). 

Приведенные  данные демонстрируют, что активация AGRPергических нейронов сопровождается  уменьшением иммунореактивности  тирозингидроксилазы и CART-пептида и демонстрируют однонаправленные морфофункциональные изменения дофамин- и CARTергических нейронов, а так же роль CART и AGRP как функциональных антагонистов. 

Рис. 7. Анализ иммунореактивности CART-пептида в аркуатном ядре гипоталамуса (А) и  в латеральном гипоталамусе (Б) у  виргильных и лактирующих а/а  и Ау/а мышей.

По оси ординат: оптическая плотность выражена в условных единицах на мкм2;  обозначения: достоверность отличия  (p<0,05):  * - Ау/а  от а/а, # - лактирующих от виргильных.

Исследование морфофункциональных взаимодействий  дофаминергической системы  с  CART и AGRP в цикле бодрствование-сон.

       Депривация сна сопровождается  изменением пищевого поведения:  при хронической  депривации  парадоксального сна отмечено активация аппетита и трехкратное увеличение потребления пищи, что, однако, сопровождалось уменьшением массы тела вследствие усиления энергетического обмена (Koban, et al., 2006, 2008). На фоне  депривации сна выявлено увеличение экспрессии нейропептид-Y  и уменьшение РОМС, что соответствует их роли как орексигенного и анорексигенного факторов.

Известно, что дофамин функционирует как нейротрансмиттер  и как нейрогормон.  Дофаминергические нейроны substantia nigra посылают отростки в стриатум, где дофамин, как хорошо известно,  участвует  в регуляции двигательной активности. Нейросекреторные дофаминергические нейроны гипоталамуса участвуют в регуляции различных функций организма, в частности стрессорных реакций.  Так как выявлены структурные взаимосвязи CART- и AGRPергических элементов с дофаминергическими нейронами среднего мозга и гипоталамуса, нами было проведено изучение  динамики их изменений  в  нигростриатной системе  и гипоталамусе  в цикле бодрствование-сон, так как  в этом цикле двигательная  активность меняется наиболее ярко и происходит смена функциональных  состояний организма (активность-покой).

       В нигростриатной системе мы показали, что на фоне изменения оптической плотности тирозингидроксилазы в нейронах substantia nigra (Рис. 8А)  в дорзальном стриатуме изменяется  иммунореактивность общей и фосфорилированной (по серину31) тирозингидроксилазы (Рис. 8Б).

Рис. 8. Иммунореактивность тирозингидроксилазы (ТН) в нейронах substantia nigra (А)  и фосфорилированной ТН по серину 31 (Ser31) в дорзальном стриатуме  крысы (Б) после  6 ч депривации сна (ДС) и 2 ч  постдепривационного сна (ПДС).

По оси ординат:  оптическая плотность, выраженная в условных единицах ( усл. ед.)  на мкм2.  Достоверность отличия ( р<0,05) по сравнению с соответствующим уровнем: * - контроля, #  - ДС.

Изменение  функциональной активности дофаминергических нейронов  сопровождалось изменением оптической плотности  CART-пептида: в нейронах nucleus accumbens (Рис. 9) и в их отростках в substantia nigra (Рис. 10) выявлено уменьшение уровня CART после депривации сна и увеличение на фоне постдепривационного сна.

Рис. 9. Иммунореактивность CART-пептида и AGRP в nucleus accumbens  крысы после 6 ч депривации сна (ДС) и 2 ч постдепривационного сна (ПДС).

По оси ординат - оптическая плотность в условных единицах на мкм2.

Достоверность отличий при p<0,05:  * - по сравнению с соответствующим контролем, # - по сравнению с уровнем ДС.

При этом оптическая плотность AGRP в  nucleus accumbens  менялась противоположным образом: возрастала после депривации сна и уменьшалась в постдепривационеный период (Рис. 9).

Аналогичные изменения тирозингидроксилазы, CART-пептида и AGRP выявлены и в нейронах аркуатного ядра гипоталамуса (Рис. 11).

       Таким образом, уменьшение  функциональной активности дофаминергических нейронов сопровождались уменьшением уровня иммунореактивности CART-пептида  и увеличением уровня AGRP.

Повышение функциональной активности дофаминергических нейронов  сопровождалось снижением иммунореактивности AGRP и повышением уровня CART. Таким образом, полученные результаты демонстрируют как в нигростриатной системе, так и в  гипоталамусе  однонаправленные изменения  иммунореактивности тирозингидроксилазы и CART-пептида, а с другой - противоположный с ними характер реакции AGRP  аналогично тому, что было выявлено при изменении пищевого поведения.

Полученные данные свидетельствуют о возможности модулирующего действия  AGRP и  CART на дофаминергические нейроны, а также  AGRP и на CARTергические нейроны в различных формах поведения организма, в которых задействована дофаминергическая система.

Рис. 11. Иммунореактивность тирозингидроксилазы (ТН), CART-пептида и AGRP в нейронах аркуатного ядра крысы  на фоне 6 ч депривации сна (ДС) и 2 ч постдепривационного сна (ПДС).

По оси ординат:  оптическая плотность в условных единицах (усл. ед.) на мкм2. Достоверность отличия (p<0,05): * - по сравнению с соответствующим контролем, # - по сравнению с соответствующим уровнем  ДС.

Влияние иммобилизационного стресса на функциональную активность CART-, AGRP- и дофаминергических нейронов в гипоталамусе. 

Этот эксперимент был проведен для того, чтобы проверить специфичность реакции CART-/AGRPергических нейронов  гипоталамуса на длительное стрессорное воздействие и увеличение двигательной активности.  Биохимический анализ выявил достоверное увеличение концентрации АКТГ крови, что подтверждает участие  гипоталамо-гипофизарной системы в реализации  стрессорного  ответа.  После  иммобилизации в нейронах аркуатного ядра  выявлено увеличение оптической плотности тирозингидроксилазы  (от 0,230,01 до 0,310,02, р<0,05), а так же  CART-пептида (от 0,260,01 до 0,320,01, р<0,05). При этом достоверных изменений оптической плотности AGRP не было обнаружено. Приведенные данные, по-видимому, свидетельствуют о том, что 6-часовая депривация сна  является длительным  стрессорным воздействием, которое приводит к истощению CARTергической и дофаминергической систем и свидетельствует в пользу предположения о модулирующем активирующем влиянии CART-пептида на дофаминергические нейроны мозга.

Взаимодействия дофамина с другими нейротрансмиттерными системами в цикле бодрствование-сон

Высокая плотность Д1 и Д2 рецепторов дофамина выявлена в дорзальном стриатуме (Mansour,  et al., 1990). Факт повышения после депривации сна  Д1 рецепторов  (Рис. 12), которые влияют на  увеличение уровня  внутриклеточной цAMP (Girault,  Greengard, 2004; Kebabian, Calne, 1979), по-видимому, является результатом стрессорного воздействия и активации гипоталамо-гипофизарно-адреналовой  системы. Депривация сна является сильным стрессором, который приводит к  повышению уровня гормонов стресса  и прежде всего кортикостерона (Andersen, 2005). Повышение оптической плотности Д1 рецепторов на фоне депривации сна можно рассматривать и как компенсаторную реакцию, вызванную снижением синтеза дофамина, что, очевидно, направлено на усиление чувствительности нейронов при падении уровня дофамина. Биохимическое значение Д2  рецепторов дофамина  связывают с торможением  цAMP  (Bunzow, et al.,  1988, Kebabian, Calne, 1979;  Piazz, 1994),  и их экспрессия не зависит от воздействия кортикостерона (Czyrak, et al., 1999).

При  лотдаче сна, наблюдается  уменьшение оптической плотности Д1-  и увеличение плотности Д2-рецепторов, которые  так же могут оказывать ауторецепторные эффекты, т.е.  модулируют синтез и/или выведение дофамина  (Deutch, 1993; Eaton, et al., 1996).

С помощью Вестерн блоттинга в дорзальном стриатуме на фоне изменения уровня  рецепторов дофамина (Рис. 12) показана  динамика изменения рецепторов глутамата (AMPA и NMDA) (Рис. 13). Наши данные свидетельствуют об однонаправленных изменениях  Д1/AMPA  и Д2/NMDA рецепторов.

Рис. 12. Иммунореактивность Д1 и Д2 рецепторов дофамина в дорзальном стриатуме крысы  на фоне 6 ч депривации сна (ДС) и 2 ч постдепривационного  сна (ПДС). По оси ординат:  оптическая плотность в условных единицах (усл. ед.) на мкм2. 

Достоверность отличия (р0.05) по сравнению с соответствующим уровнем: * - контроля , # - ДС.

Рис. 13. Иммунореактивность AMPA(Glu2/3)  и NMDA(R1)  рецепторов глутамата в дорзальном стриатуме крысы после  6 ч депривации сна (ДС) и 2 ч постдепривационного сна (ПДС) (Вестерн блоттинг анализ).

По оси ординат:  оптическая плотность, выраженная в условных единицах (усл. ед.) на мкм2.  Достоверность отличия (p<0,05) от соответствующего уровня:  * - контроля, # - ДС.

В гипоталамусе показано обильная дофаминергическая иннервация нейросекреторных центров, в которых присутствуют все типы рецепторов дофамина (Czyrak, et al., 2000; Baskerville, Douglas, 2008).  На фоне изменения оптической плотности  тирозингидроксилазы в дофаминергических структурах  (в медиальной  части zona incerta, перивентрикулярном и  аркуатном  ядрах),  которые иннервируют нейросекреторные  центры, иммуногистохимически было показано уменьшение  оптической плотности Д1 и Д2 рецепторов дофамина при депривации  сна и  увеличение, особенно уровня Д2 рецепторов, на фоне постдепривационного сна  (Рис. 14).

Рис. 14. Иммунореактивность Д1 и Д2 рецепторов дофамина  в нейросекреторных  паравентрикулярном  (ПВЯ) и супраоптическом (СОЯ) ядрах гипоталамуса крысы после  6 ч депривации сна (ДС) и 2 ч постдепривационного сна (ПДС).

По оси ординат:  оптическая плотность, выраженная в условных единицах (усл. ед.) на мкм2.  Достоверность отличия (p<0,05) от соответствующего уровня:  * - контроля, # - ДС.

Таким образом, наши данные демонстрируют различные тенденции изменения уровня Д1 рецепторов дофамина в телэнцефальных и диэнцефальных отделах мозга после 6 ч депривации сна: в стриатуме - увеличение, а в нейросекреторных ядрах гипоталамуса - уменьшение, что, очевидно, связано с различной функциональной ролью дофамина в этих отделах мозга. Первое, по-видимому, связано с увеличением чувствительности нейронов-мишеней при недостатке дофамина, а второе - с активацией при стрессе синтеза и выведения нейросекреторными клетками  нонапептидных нейрогормонов, которые  участвуют в поддержании гомеостатического равновесия и стрессорных реакций в организме.  В нейронах паравентрикулярного ядра при  депривации сна содержание  иммунореактивного вазопрессина достоверно возрастало (Рис. 15), а на фоне постдепривационного сна - снижалось, что  свидетельствует об его участии в стрессорной реакции.  В супраоптическом ядре в телах и отростках нейросекреторных клеток выявлено уменьшение иммунореактивного вазопрессина при депривации сна, а  на фоне постдепривационного сна, напротив, увеличение. При этом анализ срединного возвышения косвенно свидетельствует об активном выведении вазопрессина. В супраоптическом ядре  отмечено активное выведение  иммунореактивного окситоцина из тел нейросекреторных клеток в отростки при депривации сна и его накоплении в телах  нейросекреторных клеток на фоне постдепривационного  сна. 

Рис. 15. Содержание иммунореактивного вазопрессина в нейросекреторных клетках  паравентрикулярного (ПВЯ) и супраоптического (СОЯ) ядер гипоталамуса  крысы после  6 ч депривации сна (ДС) и 2 ч постдепривационного сна (ПДС).

По оси ординат:  оптическая плотность, выраженная в условных единицах (усл. ед.) на мкм2.  Достоверность отличия (p<0,05) от соответствующего уровня:  * - контроля, # - ДС.

Полученные нами результаты  демонстрируют тесные морфофункциональные взаимосвязи  дофаминергической системы с другими активирующими системами (в частности  глутаматергической,  вазопрессин-  и окситоцинергической). Таким образом,  модулирующее  действия  CART-пептида  и AGRP на дофаминергические нейроны также  может определять  их взаимодействие с другими нейротрансмиттерными и  нейросекреторными  системами  мозга.

Исследование локализации  CART,  AGRP и дофаминергических нейронов в пренатальном  (Е20) и раннем постнатальном (Р5) развитии крысы.

Использование онтогенетического подхода позволяет проследить становление структурных взаимосвязей различных систем организма в ходе его индивидуального развития. У 20-дневных эмбрионов в аркуатном ядре не выявлено AGRP-иммунореактивных структур. При этом CART-иммунопозитивные нейроны  отростчатой формы у эмбрионов хорошо выявлялись в различных отделах мозга: в аркуатном, паравентрикулярном, супраоптическом ядрах гипоталамуса, в дофаминергических областях -  substantia nigra и ventral tegmental area, в области околоводопроводного серого вещества, а также в конечном мозге в обеих частях nucleus ассumbens, в областях коры больших полушарий и др.  При этом отростчатые нейроны, иммунопозитивные  к тирозингидроксилазе,  также хорошо выявлялись как в дофаминергических структурах  (zona incerta, substantia nigra и ventral tegmental area), так и в структурах гипоталамуса, в частности в крупноклеточной части паравентрикулярного ядра.

У 5-дневных крысят тела AGRP-иммунопозитивных нейронов выявляются в  аркуатном ядре.  Более интенсивная иммуногистохимическая реакция отмечается в  их  отростках, что, по-видимому, свидетельствует о высокой скорости выведения AGRP из тел нейронов.  По сравнению со взрослыми особями количество AGRP-иммунопозитивных отростков у 5-дневных крысят небольшое. Лишь отдельные отростки отчетливо выявляются в аркуатном ядре, в перивентрикулярной зоне, в паравентрикулярном ядре; наибольшее количество отростков выявлено в преоптической области гипоталамуса.  В областях среднего  мозге у 5-дневных крысят  не выявлено AGRP-иммунопозитивных структур.

У 5-дневных крысят CART-иммунопозитивные нейроны и отростки отчетливо выявляются в гипоталамусе:  в аркуатном, паравентрикулярном, супраоптическом ядрах, в перивентрикулярной области вдоль 3-го желудочка мозга, в перифорникальной области латерального  гипоталамуса, в zona incerta. В среднем мозге отдельные нейроны выявляются  в substantia nigra и ventral tegmental area. В конечном мозге - в нейронах nucleus accumbens, где  отмечается четкая дифференцированность на две части: более плотную  shell  и рыхлую core, в которой отмечена  более интенсивная реакция. CART-иммунопозитивные нейроны выявлены в дорзальном стриатуме, в отдельных слоях префронтальной  и перифорникальной  областей коры больших полушарий.

Экспрессия тирозингидроксилазы у 5-дневных крысят отмечена в нейронах всех дофаминергических  формаций.

Приведенные данные свидетельствуют о  том, что  морфогенез и формирование структурно-функционального взаимодействия CART- и дофаминергических нейронов  наблюдается уже  в ходе эмбрионального развития, так как  CART присутствует во всех дофаминергических областях мозга,  и продолжается в постнатальном развитии. Развитие же AGRPергической системы и формирование ее структурных и функциональных  связей наблюдается постнатально.

       В исследованиях динамики развития эмбрионального мозга у крысы показано, что CART-продуцирующие нейроны одними из первых идентифицируются в ЦНС уже на стадии E10, еще до появления дофаминергических нейронов (Brischoux,  et  al., 2002). В среднем мозге на стадии Е13 количество CART-продуцирующих нейронов возрастает перед тем, как начинают идентифицироваться нейроны, экспрессирующие тирозингидроксилазу.  Таким образом, развитие дофаминергических нейронов в различных дофаминергических формациях мозга происходит на фоне присутствия CART, который, по мнению авторов, обладает морфогенетическим действием (Brischoux, et. al.,  2002; Abraham, et al., 2007).  Методом ПЦР (в реальном времени) показано, что в мозге  эмбрионов крысы мРНК AGRP определяется уже на стадии E13, однако ее уровень стремительно уменьшался  и  уже вообще не определялся на стадии Е18 (Beloosesky, et al., 2006).  Наши результаты  иммуногистохимического анализа  подтверждают  отсутствие AGRP на стадии Е20 и его экспрессию в постнатальном развитии крысы.

Приведенные данные демонстрируют, что  падение уровня мРНК AGRP совпадает с периодом дифференцировки  в частности дофаминергических нейронов в гипоталамусе и в среднем мозге, которые развиваются на фоне функционирования CARTергических нейронов. Учитывая тормозный характер влияния AGRP на дофаминергические нейроны мы полагаем, что ведущим компонентом при становлении  функциональных взаимодействий этих двух систем является  более поздно созревающая  AGRPергическая система.

Исследование локализации  CART-пептида  в связи с локализацией  дофаминергических нейронов у представителей низших позвоночных

Использование сравнительно-морфологического подхода дает понимание формирования  структурных взаимосвязей при развитии и совершенствования функций организма в ходе его эволюционного развития. Поэтому для нас представляло интерес рассмотреть взаимосвязь  CARTергических структур с  дофаминергическими нейронами  у представителей более низко организованных  позвоночных  -  амфибий и рептилий, так как в эволюционном ряду Тetrapoda показано прогрессивное развитие дофаминергических элементов среднего мозга и усиление их морфофункциональных взаимодействий со структурами конечного мозга прежде всего в связи с совершенствованием  двигательной активности (Alexander,  Crutcher, 1990;  DeLong, 1990; Heimer, et al. 1995; Smeets, et al., 2000).

У травяной лягушки и болотной черепахи в ростральной части телэнцефалона вдоль  вентромедиальной стенки латерального желудочка мозга выявляются небольшие  группы  CART-иммунореактивных нейронов. Их локализация соответствует областям  nucleus accumbens у этих животных (Smeets, et al., 2000). В среднем мозге у обоих видов CART-иммунореактивные отростки выявлены в областях, где расположены  дофаминергические нейроны,  и непосредственно вокруг тел дофаминергических нейронов.

Присутствие CART-иммунореактивных нейронов в гипоталамусе низших позвоночных  (в частности  в преоптическом ядре у лягушки, в супраоптическом и паравентрикулярном ядрах у черепахи), может свидетельствовать об их участии в регуляции  тех же функций, что и у  для млекопитающих (Volkoff,  Peter, 2001; Lazar, et al., 2004).

Представленные данные свидетельствуют о том, что развитие дофаминергической системы в эволюционном ряду tetrapoda происходило в связи с развитием CARTергических структур. Морфофункциональные взаимодействия между CART-  и  дофаминергическими  нейронами устанавливаются на ранних этапах эволюционного развития, а CARTергические влияния на дофаминергические нейроны  является эволюционно древним механизмом.

Заключение

Как уже отмечалось, проблема центральных механизмов взаимосвязи  пищевого поведения  с циклом бодрствование-сон и функциональными состояниями организма, где активную роль играет дофаминергическая система, во многом остается невыясненной. Гипоталамус является высшим центром, контролирующий различные  вегетативные функции организма. Регуляция  периферических эндокринных желез, вводно-солевого обмена, тонуса мускулатуры, стрессорных реакций, процессов размножения,  лактации и др. осуществляются нейронами различных эргичностей, локализованных в гипоталамусе. В контроле пищевого поведения  важную  роль играют нейроны аркуатного ядра гипоталамуса. При активации аппетита и потребления пищи наблюдается  увеличением нейропептида-Y и AGRP, а при уменьшении  аппетита и потребления пищи - увеличение  уровня CART- и POMC  в аркуатном ядре (Kristensen, et al., 1998; Stanley, et al., 2001; Schwartz,  Mortin,  2002).  Таким образом, баланс орексигенных (активирующих аппетит) и анорексигенных (тормозящих аппетит) пептидов гипоталамуса определяет  функциональное состояние системы организма, контролирующей  пищевое поведение.

В аркуатном же ядре отмечается изменение экспрессии белков при депривации сна, что приводит к изменению пищевого поведения  (Koban, et al., 2006, 2008).  Нарушение пищевого поведения проявлялось в значительном увеличении потребления пищи,  потере массы тела и истощении жировой ткани,  что сопровождалось увеличением экспрессии нейропептида-Y и уменьшением РОМС, что соответствует их роли как орексигенного и анорексигенного факторов.

В настоящей работе выявлена тесная структурная и функциональная взаимосвязь белков пищевого поведения CART и AGRP с дофаминергической системой мезэнцефальных, диэнцефальных и телэнцефальных уровней головного мозга,  что позволяет рассматривать ее как основу функционального взаимодействия центральных механизмов пищевого поведения с различными функциональными состояниями организма, включая цикл бодрствование-сон.

Результаты, представленные в настоящей работе, впервые демонстрируют различный характер реакции CART-,  AGRP и дофаминергических нейронов в зависимости от стрессорного воздействия. Если при кратковременном иммобилизационном стрессе в аркуатном ядре наблюдается активация  CART- и дофаминергических нейронов при отсутствии изменений в AGRPергических нейронах, то на фоне 6-ти часовой депривации сна увеличение иммунореактивности AGRP сопровождалось  уменьшением  иммунореактивности CART-пептида  и активности тирозингидроксилазы, что свидетельствует о возможности тормозного влияния AGRP на другие нейроны и, в частности,  на дофаминергические.

Исследования механизмов, регулирующих функциональную активность дофаминергических нейронов мозга, являются чрезвычайно актуальными в связи с  их участием  в различных физиологических процессах. В настоящем исследовании впервые продемонстрировано, что  такие белки как CART и AGRP оказывают  модулирующее влияние на дофаминергические нейроны  как функциональные антагонисты. Показана их роль  в регуляции  функций организма,  связанных с  работой дофаминергической системы (пищевого поведения, стрессорных реакций, двигательной  активности и  цикла бодрствование-сон). В исследованиях  in vitro выявлено прямое активирующее влияние CART-пептида и тормозное влияние AGRP на функциональную активность дофаминергических нейронов, что  подтверждается в различных поведенческих моделях на уровне целостного  организма.

Показанное нами выраженное увеличение иммунореактивности CART-пептида в постдепривационном периоде, а также  увеличение в этом периоде иммунореактивности Д2 рецепторов дофамина свидетельствуют о тесной связи указанных систем в стрессорных реакциях организма, особенно выраженных по мере созревания функциональных систем организма человека и животных.

Данные нами данные о том, что CART-пептид присутствует  в стриатонигральных проекциях в эволюционном ряду  Tetrapoda  (у представителей амфибий, рептилий, млекопитающих) свидетельствуют о том, что CARTергические влияния являются эволюционно древним механизмом, который развивается по мере становления стриатонигральных взаимодействий. 

Учитывая активирующий характер воздействия CART-пептида на дофаминергические нейроны, увеличение  его иммунореактивности в стриатонигральных проекциях на фоне  гибели  нейронов черной субстанции  можно рассматривать как  компенсаторный механизм при развитии патологических процессов в ЦНС, который направлен на поддержание активности дофаминергических нейронов.

Показано, что при развитии дофаминергических нейронов их морфофункциональные взаимосвязи с  CARTергическими структурами формируются в пренатальном периоде развития, а с AGRPергическими  - в  раннем постнатальном периоде.  Полученные нами данные о нарастании в постнатальном периоде развития организма взаимосвязей AGRP- и дофаминергической систем, свидетельствуют об увеличении  влияний AGRPергической системы в постнатальном периоде, что коррелирует с созреванием и дифференцировкой  различных систем организма,  включая гипоталамо-гипофизарную  нейросекреторную  систему, регулирующую стрессорный ответ,  и организацию фаз  цикла бодрствование-сон. Так как нейроны,  экспрессирующие AGRP, локализованы только в аркуатном ядре гипоталамуса (Ollman, et al., 1997; Bagnol, et al., 1999), то прогрессивное  нарастание связей AGRP с другими отделами мозга в ходе постнатального развития  коррелирует  с развитием и с усилением  интегративной,  координирующей  роли гипоталамуса в целом.

Изестно, что функциональная активность CART- и AGRPергических  нейронов аркуатного ядра гипоталамуса модулируется  периферическими тканями,  так как на них присутствуют рецепторы к инсулину, лептину, грелину и другим факторам (Stanley, et al., 2001; Schwartz, Mortin,  2002; Charbonneau, et al.,  2004). Поэтому CART-пептид  и AGRP можно рассматривать  как функциональные  посредники между периферическими тканями и различными структурами мозга, в частности дофаминергическими.

       Проведенное нами исследование демонстрирует  роль CART- и AGRPергических структур  в интегративных взаимодействиях,  которые обуславливают и координируют работу дофаминергической системы, и определяющую  роль  AGRP в  этом взаимодействии, как тормозного фактора, функциональное значение которого нарастает в ходе постнатального развития организма и формирования его систем.

       Полученные нами данные свидетельствуют о возможности модулирующего влияния  CART- и AGRP на взаимодействия дофаминергической системы с другими нейротрансмиттерными и нейросекреторными  системами (в частности  ГАМК-, глутамат-  и вазопрессинергической)  как  в регуляции цикла бодрствование-сон,  стрессорного ответа, пищевого поведения, а также же и в других  функциональных состояниях организма, в регуляции которых  принимает участие дофаминергическая система мозга.

ВЫВОДЫ:

1. Морфо-функциональной основой взаимосвязи пищевого поведения с циклом бодрствование-сон является  структурная конвергенция и функциональное взаимодействие CART- и AGRPергических нейронов с дофаминергическими нейронами мозга.
2. Нами показано, что функциональные взаимосвязи CART-пептида и AGRP имеют реципроктный характер, о чем свидетельствует активирующее влияние CART-пептида  и тормозное влияние AGRP на функциональную активность дофаминергических нейронов.
3. CART-ергические влияния на дофаминергические нейроны среднего мозга являются эволюционно древним механизмом, о чем свидетельствует присутствие CART-пептида  в стриатонигральных проекциях во всем эволюционном ряду четвероногих (Tetrapoda): у представителей амфибий, рептилий, млекопитающих
4. CART-пептид участвует в компенсаторных механизмах мозга, обеспечивающих поддержание функциональной активности дофаминергической системы, о чем свидетельствуют результаты, полученные нами в экспериментах in vivo и in vitro.
5. Становление взаимосвязей дофаминергической системы с CART-ергической происходит в эмбриональном периоде развития, когда формируются функциональные системы организма.
6. Формирование взаимосвязей дофаминергической системы с AGRP происходит в постнатальном периоде развития, когда происходят процессы дифференцировки функциональных систем организма, включая фазы и стадии цикла бодрствование-сон.
7. CART-  и AGRPергические системы участвуют в регуляции различных  функциональных состояний организма  и различных форм поведения млекопитающих, в которых дофаминергическая система  играет активную роль, за счет  изменения баланса  этих пептидов. 

СПИСОК  РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оганесян Г.А., Аристакесян Е.А., Элиава М.И., Красновская И.А., Кузик В.В., Романова И.В., Таранухин А.Г.  Морфофункциональный анализ действия кратковременной депривации сна на цикл бодрствование-сон молодых и  взрослых крыс // Ж. эвол. биохим. и физиол. - 2002. - Т. 38. - N3. - С. 232-239.
2. Ramos EJ, Xu Y, Romanova I, Middleton F, Chen C, Quinn R, Inui A, Das U, Meguid MM.  Is obesity an inflammatory disease? // Surgery. 2003. 134(2). P. 329-35.
3. Xu Y, Ramos EJ, Middleton F, Romanova I, Quinn R, Chen C, Das U, Inui A, Meguid MM. Gene expression profiles post Roux-en-Y gastric bypass //  Surgery. - 2004. - V.136. - N2. - P. 246-252.
4. Romanova IV, Ramos EJ, Xu Y, Quinn R, Chen C, George ZM, Inui A, Das U, Meguid MM.  Neurobiologic changes in the hypothalamus associated with weight loss after gastric // J Am Coll Surg. - 2004. - V. 199. N6. - P. 887-895.
5. Ramos EJ, Middleton FA, Laviano A, Sato T, Romanova IV, Das UN, Chen C, Qi Y, Meguid MM.  // J Am Coll Surg. - 2004. - V.199. - N5. - P. 716-723.
6. Ramos EJ, Romanova IV, Suzuki S, Chen C, Ugrumov MV, Sato T, Goncalves CG, Meguid MM Effects of omega-3 fatty acids on orexigenic and anorexigenic  modulators at the onset of anorexia // Brain Res. - 2005. - V. 1046. - N1-2. - P. 157-164.
7. Goncalves CG, Ramos EJ, Romanova IV, Suzuki S, Chen C, Meguid MM. Omega-3 fatty acids improve appetite in cancer anorexia, but tumor resecting restores it // Surgery. - 2006. - V. 139. - N2.  - P. 202-208.
8. Оганесян Г.А., Аристакесян Е.А.,  Белова В.А., Артамохина И.В., Романова И.В.  Дофаминергическая нигростриатная система в условиях депривации сна  у крыс //  Рос. физиол. журн.  им. И.М. Сеченова.  - 2007. -  Т.93. - N12. -  С.1344-1354.
9. Оганесян Г.А., Романова И.В., Аристакесян Е.А., Кузик В.В., Макина  Д.М.,  Морина И.Ю., аХраменкова А.Э., Артамохина И.В., аБелова В.А. Диэнцефало- телэнцефальные изменения  активности тирозингидроксилазы  у крыс и травяных  лягушек при депривации сна //  Журн. эволюц. биохим. и физиол. - 2008. - Т. 44. - N3. - C. 250-257.
10. Оганесян Г.А., Романова И.В., Аристакесян Е.А., Кузик В.В., Макина  Д.М.,  Морина И.Ю., аХраменкова А.Э., Артамохина И.В., аБелова В.А.  Дофаминергическая  система телэнцефало-диэнцефальных отделов  головного мозга позвоночных в  организации цикла бодрствование-сон // Рос. физиол. журн им. И.М.Сеченова.  - 2008. - Т.94. - N9. - С.1071-1091.
11. Пастухов Ю.Ф., Чеснокова А.Ю., Якимчук А.А., Екимова И.В., Романова  И.В., Худик К.А. Изменение сна при дегенерации нейронов черной субстанции, вызванной ингибитором протеасом  лактацистином,  у крыс  // Рос. физиол. журн. им И.М. Сеченова.  - 2010. - Т. 96. - N12. - С. 1190-1202.
12. Оганесян Г.А., Романова И.В., Аристакесян Е.А. Участие активирующих систем переднего мозга в организации цикла бодрствование-сон у позвоночных // Ж. эвол. биохим. и физиол. - 2011. - Т. 47. - N3. - C.193-204.
13. Оганесян Г.А., Романова И.В., Аристакесян Е.А., Ватаев С.И. Эволюция цикла бодрствование-сон и телэнцефало-диэнцефальное взаимодействие в ряду позвоночных // Рос. физиол. журнал им. И.М. Сеченова. - 2011. - Т. 97. - N4. - C. 337-350.
14. Артамохина И.В., Белова В.А., Романова И.В.  Иммуногистохимическое исследование  белков Bcl-2 и p53 в гипоталамусе крысы после депривации сна //  Журн. эволюц. биохим. и физиол.  - 2011. - Т. 47. - N5. - С. 391-395.
15. Оганесян Г.А., Аристакесян Е.А., Романова И.В., Ватаев С.И., Кузик В.В., Камбарова Д.К. Вопросы эволюции цикла бодрствование-сон. Часть 1: нейрофизиологические аспекты // Биосфера. - 2011.  - Т. 3. - N4. - C. 514-527.
16. Романова И.В., Чеснокова А.Ю., Михрина А.Л. Иммуногистохимическое исследование CART-пептида  в стриатонигральных проекциях при  дефиците дофамина //  Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2012. - Т. 98. - Т8. С. 980-989.
17. Чернышева М.П., Романова И.В., Михрина А.Л. Влияние ретинола на  взаимодействие белка РERIOD1, окситоцина и ГАМК в пренатальный период формирования циркадианного clock-механизма у крыс // Журн. эволюц. биохим. и физиол. - 2012. - Т. 48. - N5. - C. 481-486.
18. Романова И.В. Морфофункциональное взаимодействие CART-пептида  и дофаминергических нейронов мозга // Журн. эволюц. биохим. и физиол.  - 2013. - T. 49. - в печати.

Всего опубликовано  30 статей в рецензируемых журналах

Список публикаций в других печатных изданиях

1. Romanova IV, Ramos EJB, Ugrumov M, Chen C, Quinn R, Das Un, Inui A, Meguid MM.  The Neurobiological Basis of Weight Loss After Gastric Bypass // Conference of Society of University surgeons. Huston, USA.  -2003. -  P. 86. 
2. Romanova IV, Chen Ch , Ugrumov M, Inui A, Meguid MM. The balance between hypothalamic  orexigenic and anorexigenic modulators after gastric bypass // Fundamental surgical Problems. Chicago, Illinois, USA. - J.ACS. 2003. - S43.
3. Romanova IV, Suzuki S, Ramos EJB, Middleton F, Chen C, Meguid MM. Restoration of hypothalamic orexigenic/anorexigenic peptides balance after gastric bypass contributes to sustained weight loss // 43-rd Karolinsca Institute Nobel Conference УBrain control of feeding behaviourФ. Stockholm, Sweden. - 2004. - P.51.
4. Романова И.В., Белова В.А., Артамохина И.В.,  Аристакесян Е.А., Оганесян Г.А.  Баланс CART, AGRP и дофамина в мозге крыс после депривации сна // XX Съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова. - Москва. -  2007. -  С.79.
5. Romanova IV., Belova VA., Artamochina IV. CART-immunoreactivity in rat hypothalamus after sleep deprivation // VII World Congress on  neurohypophyseal hormones, Regensburg, Germany. -  2007. - P. 118.
6. Романова И.В., Глазова М.В., Артамохина И.В., Белова В.А., Оганесян Г.А. Баланс рецепторов дофамина и  глутамата в хвостатом ядре крысы в цикле бодрствование-сон // Конференция с международным  участием УНейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозгаФ. Санкт-Петербург-Колтуши. -  2008. - С. 113-114.
7. Артамохина И.В., Белова В.А., Романова И.В. Изменение тирозингидроксилазы  ва гипоталамусе крысы после депривации сна. УНейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозгаФ// Конференция с международным  участием, Санкт-Петербург-Колтуши. -  2008. - С. 10-11.
8. Романова И.В., Михрина А.Л., Белова В.А., Артамохина И.В. Изменение баланса CART, AGRP и дофамина в мозге на фоне развития ожирения.  УМеханизмы функционирования висцеральных системФ // VI Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 50-летию открытия А.М. Уголевым мембранного  пищеварения. Санкт-Петербург. -  2008. - С. 176.
9. Михрина А.Л., Белова В.А., Артамохина И.В., Романова И.В. Изменение активности вазопрессинергической системы гипоталамуса на фоне генетически обусловленного ожирения // VI Всероссийская конференция с международным  участием УМеханизмы функционирования висцеральных системФ, посвященная 50-летию открытия А.М. Уголевым мембранного пищеварения. Санкт-Петербург. -  2008. - С. 144-145.
10. Романова И.В., Михрина А.Л., Белова В.А., Артамохина И.В. Роль CART и AGRP как модуляторов дофаминергических нейронов мозга  // Всероссийская конференция  с международным участием  УМеханизмы нервных и нейроэндокринных регуляцийФ, посвященная 90-летию со дня рождения академика Т.М. Турпаева. Москва. -  2008. - С. 93.
11. Романова И.В., Михрина А.Л., Белова В.А., Артамохина И.В. КАРТ-пептид как возможный модулятор эффектов дофамина в амигдале // Научные труды  II Съезда физиологов СНГ УФизиология и здоровье человекаУ (посвященного памяти академика О.Г. Газенко).  Кишинев, Молдова. -  2008. - С. 147-148.
12. Оганесян Г.А., Романова И.В., Глазова М.В., Артамохина И.В., Белова В.А. Участие кортико-стриатной глутаматергической системы в организации цикла бодрствование-сон у позвоночных //  Всероссийская конференция. Научное наследие академика Л.А. Орбели. Структурные и функциональные основы эволюции функций, физиология экстремальных состояний. Санкт-Петербург. -  2008. - С. 119-120.
13. Романова И.В., Белова В.А., Артамохина И.В., Михрина А.Л. CART-пептид как модулятор дофамина и ГАМК // VI Всероссийская конференция с международным  участием  УАктуальные проблемы сомнологии У. Посвящается памяти профессора И.Г. Кармановой и академика А.М. Вейна. Санкт-Петербург. -  2008. - С. 80.
14. Оганесян Г.А., Романова И.В., Аристакесян Е.А., Кузик В.В., Макина Д.М.,  Храменкова И.Э., Морина И.Ю., Артамохина И.В., Белова В.А. Нейротрансмиттерная и нейросекреторная функции дофамина в цикле бодрствование-сон позвоночных // VI Всероссийская конференция с международным участием  УАктуальные проблемы сомнологии У. Санкт-Петербург. -  2008. -  С.66.
15. Artamokhina IV, Belova VA, Romanova IV.  Immunohistochemical study interactions of CART- and  dopaminergic brain neurons in dopamine deficit  // BSA annual meeting. Edinburg, UK. -  2009. -  P. 45.
16. Romanova IV,  Mikhrina AL, Belova VA, Artamokhina IV. Investigation of AGRP/CART balance in hypothalamus of obese Agouti yellow mice // BSA annual meeting.  Edinburg, UK. -  2009. - P.45.
17. Артамохина И.В., Белова В.А., Романова И.В. Влияние КАРТ-пептида на дофаминергических нейронов черной субстанции мозга крысы // VII Всероссийская  конференция  с международным участием, посвященная 160-летию со дня рождения И.П. Павлова УМеханизмы функционирования висцеральных систем У. Санкт-Петербург, Россия. -  2009. - С.33-34.
18. Романова И.В., Артамохина И.В., Белова В.А., Михрина  А.Л. Роль КАРТ-пептида как модулятора функциональной активности дофаминергических нейронов мозга // Актуальные проблемы интегративной  деятельности и пластичности нервной системы. УГитутюнФ НАН РА. Ереван. -  2009. - С.246-250.
19. Оганесян Г.А., Романова И.В., Глазова М.В., Артамохина И.В., Белова В.А. О механизмах участия возбуждающих нейротрансмиттерных систем переднего мозга в регуляции двигательной активности позвоночных // Актуальные проблемы интегративной деятельности и пластичности нервной системы. УГитутюнФ НАН РА. Ереван. -  2009. - С.231-235.
20. Романова И.В., Михрина А.Л. Взаимодействие CART и AGRP в модуляции функций гипоталамуса // VIII Всероссийская конференция УНейроэндокринология-2010У. Санкт-Петербург. -  2010.  - С. 122.
21. Романова И.В., Михрина А.Л. Роль CART и AGRP в модуляции  функциональной активности дофаминергических нейронов мозга  // ХХI съезд физиологического общества им. И.П. Павлова, Калуга. -  2010. - С.521.
22. Романова И.В., Михрина А.Л. Роль CART-пептида в компенсаторных механизмах мозга при дефиците дофамина // Всероссийская конференция с международным участием Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе адаптации к условиям среды, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Санкт-Петербург. -  2010. -  С. 243-244.
23. Romanova IV.,  Chesnokova AYu., Mikhrina  AL. Immunohistochemical investigation of  CART-peptide in striato-nigral projections at  dopamine loss // ISBS 15-th Multidisciplinary International Conference on  Neuroscience  and  Biological  Psychiatry УStress  and  BehaviorФ. St-Petersburg, Russia. - 2011. - Р.38-39.
24. Романова И.В., Михрина А.Л. Взаимодействие CART  и AGRP  как модуляторов функциональной активности  дофаминергических нейронов мозга // ХIV Международное совещание и VII школа по эволюционной физиологии. Санкт-Петербург. -  2011. -  С. 163.
25. Romanova IV, Mikhrina AL.  A role of  CART  and  AGRP  as  a modulators of functional activity of the brain dopamine neurons. Endocrine regulation. V.45 (2) // 10-th Symposium УCatecholamines and other  neurotransmitters in  stressФ.  Smolenice Castle, Slovakia. - 2011. - А35.
26. Оганесян Г.А., Романова И.В., Аристакесян Е.А., Ватаев С.И. Участие глутамат-  и дофаминергических систем переднего мозга в организации цикла сон-бодрствование у позвоночных // Научные труды III съезда физиологов СНГ. Ялта, Украина. - 2011. - С.223.

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии