Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ФАДЕЕВ РОМАН СЕРГЕЕВИЧ
РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К TRAIL-ИНДУЦИРОВАННОМУ АПОПТОЗУ В КОНФЛЮЕНТНЫХ КУЛЬТУРАХ
Специальность 03.01.02 - Биофизика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Пущино 2012
Работа выполнена в Лаборатории тканевой инженерии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино.
Научные руководители: доктор физико-математических наук, профессор Акатов Владимир Семенович кандидат биологических наук Чеканов Алексей Владимирович Официальные доктор биологических наук оппоненты: Корыстов Юрий Николаевич (зав. лаб. окислительного стресса ИТЭБ РАН) доктор биологических наук, профессор Новоселов Владимир Иванович (ИБК РАН)
Ведущая организация: Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Москва)
Защита диссертации состоится л_______________________2012 г.
в _______ на заседании совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук, созданном на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу:
142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3.
Автореферат разослан л_____ _________________ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физ.-мат. наук Ланина Н. Ф.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Онкологические заболевания занимают второе место в мире по смертности после сердечноЦсосудистых патологий.
Недостаточная эффективность лечения онкологических заболеваний обусловлена в первую очередь отсутствием избирательного действия существующих противоопухолевых препаратов, недостаточно эффективным проникновением противоопухолевых субстанций в опухолевую ткань и возникновением, при определенных условиях, резистентности опухолевых клеток к повреждающим воздействиям.
Возникновение резистентности опухолевых клеток к действию химиотерапевтических препаратов связывают, в основном, с внутриклеточными механизмами активации и/или повышенной экспрессии белков-транспортеров суперсемейства ABC (P-гликопротеина (Pgp), MRP1MRP-5, BCRP и LPR), осуществляющих выведение ксенобиотиков различного происхождения из клетки (Gottesman et al., 2002). С другой стороны, известно повышение резистентности опухолевых клеток к различным повреждающим воздействиям в двумерных (конфлюентные монослойные культуры распластанных клеток) и трехмерных (сфероиды) многоклеточных образованиях в условиях in vitro, отражающее резистентность клеток в опухолевой паренхиме к действию химиотерапевтических препаратов (Chitcholtan et al., 2012), окислительного стресса (Акатов и др., 2000), гипертермии (Khoei et al., 2004), радиации (Zou et al., 2010). Это говорит об общности механизмов повышения резистентности опухолевых клеток к различным повреждающим воздействиям в плотных многоклеточных образованиях. Механизм такой резистентности до сих пор остается не выясненным.
В настоящее время одним из наиболее перспективных подходов противоопухолевой терапии является потенциальное применение рекомбинантных белков, созданных на основе цитокина TRAIL (TNF alpha Related Apoptosis Inducing Ligand). Цитокин TRAIL является интегральным мембранным белком, относящимся к семейству фактора некроза опухолей, который обнаруживается у NK-клеток, а также части дендритных клеток (Ashkenazi et al., 2008). Уникальной особенностью цитокина TRAIL является его способность избирательно индуцировать апоптоз в опухолевых клетках, связываясь со специфическими рецепторами клеточной гибели (DR4, DR5) на внешней поверхности цитоплазматической мембраны, и при этом не повреждать нормальные клетки организма (Gonzalvez et al., 2010). В то же время известно, что не все опухолевые клетки чувствительны к TRAIL-индуцированному апоптозу. В литературе указывается, что около 50% исследованных линий опухолевых клеток обладают конститутивной резистентностью к действию цитокина TRAIL, подобно нормальным клеткам. Это связывают как с изменением структуры рецепторов DR4, DR5 или с повышенной экспрессией рецепторов ловушек (DcR1 и DcR2), так и с конститутивной активностью внутриклеточных сигнальных путей ответственных за выживание клеток (Johnstone et al., 2008). Однако, до сих пор, остается неизвестным, способны ли чувствительные к действию TRAIL опухолевые клетки приобретать резистентность к TRAIL-индуцированному апоптозу в зависимости от условий околоклеточного микроокружения, в частности, в плотных многоклеточных структурах, таких как конфлюентные культуры. Ответ на этот вопрос имеет большое теоретической значение для биологии клетки, а также принципиально важен для создания на основе рекомбинантных белков TRAIL эффективных препаратов для противоопухолевой терапии.
Целью работы является изучение резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Изучение резистентности опухолевых клеток к TRAILиндуцированному апоптозу в зависимости от плотности клеточных культур;
2. Исследование резистентности опухолевых клеток к TRAILиндуцированному апоптозу в зависимости от пролиферативной активности клеток;
3. Изучение резистентности опухолевых клеток к TRAILиндуцированному апоптозу в зависимости от адгезии клеток и параметров околоклеточной среды;
4. Выяснение механизма резистентности опухолевых клеток к TRAILиндуцированному апоптозу и оценка возможности ее подавления.
Новизна работы. В работе впервые показано, что в условиях конфлюентной культуры опухолевые клетки способны приобретать резистентность к TRAIL-индуцированному апоптозу. Формирование приобретенной TRAIL-резистентности показано не только для конфлюентных культур зависимых от прикрепления опухолевых клеток эпителиального и мезенхимального происхождения, но и для независимых от прикрепления (суспензионных) клеток лейкоцитарного происхождения в многоклеточных агрегатах. Обнаружено, что повышение резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах осуществляется на фоне снижения пролиферативной активности клеток, однако значительная часть резистентных клеток может оставаться в клеточном цикле.
Установлено, что механизмы конфлюентной резистентности опухолевых клеток различного происхождения могут отличаться.
Конфлюентная TRAILЦрезистентность опухолевых клеток может осуществляться с привлечением тирозин-киназных рецепторов некоторых ростовых факторов (IGF и EGF, но не PDGF) и реализоваться через внутриклеточные сигнальные пути, связанные с протеинкиназами PI3K, Akt (PKB).
Установлена возможность подавления конфлюентной TRAILЦ резистентности путем нетоксичного воздействия на внутриклеточные молекулярные мишени.
Практическая значимость. Показана возможность подавления резистентности опухолевых клеток к TRAIL- индуцированному апоптозу в плотных многоклеточных структурах при использовании в нетоксичных концентрациях таргетных противоопухолевых препаратов, действующих на мишени внутриклеточных сигнальных путей. Это представляет интерес для разработки на основе рекомбинантных белков TRAIL и таргетных ингибиторов приобретенной TRAIL-резистентности новых противоопухолевых препаратов, вызывающих гибель опухолевых клеток, подавляющих их резистентность и при этом нетоксичных для клеток здоровых тканей и организма в целом.
Апробация. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых Биология - наука XXI века (Пущино, 2011), IV Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов, Симбиоз (Воронеж, 2011), Международном молодежном научном форуме ЛОМОНОСОВ (Москва, 2011, 2012), Конференции Экспериментальная и теоретическая биофизика Т10, 11, (Пущино, 2010, 2011, 2012), Международном междисциплинарном конгрессе Нейронауки для медицины и психологии (Судак, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 6 статей в журналах рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из ведения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на _____ страницах, содержит _____ рисунков и _____ таблиц. Список цитируемой литературы включает _____ источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Получение рекомбинантного белка izTRAIL Последовательность синтетического изолейцинового зиппера (IEKKIEA)4 (RMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGE) (Suzuki et al., 1998) была синтезирована de novo. Синтез гена izTRAIL проводили, как описано в (Ganten et al., 2006). Полученный ген был клонирован в плазмидный вектор pET101 (Novagen, USA). Штамм E. coli BL21(DE3) трансформировали полученным экспрессирующим вектором pET101/izTRAIL. Экспрессия белка проводилась в среде TB в течение часов при 18C. Экстракцию белка из клеточной биомассы, ренатурацию белка, хроматографическую очистку белка выполняли так, как описано в работе (Фадеев и др., 2012). Чистоту полученного белка определяли с использованием SDS-PAGE и окрашиванием Coomassie blue.
Культура клеток В работе использовали клетки эпидермоидной карциномы гортани человека (линия НЕр-2), эпидермоидной карциномы кожи человека (линия A431), немелкоклеточного рака легкого человека (линия А549), карциномы яичника человека (линия OVCAR-3), карциномы шейки матки человека (линия HeLa), карциномы молочной железы человека (линия MCF-7), миелобластного лейкоза человека (линия K562), моноцитарного лейкоза человека (линия THP-1). Клетки были получены из Всероссийской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, СанктПетербург). Нормальные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека (МККМ) предоставлены фирмой Биолот (Санкт-Петербург).
Культуру нормальных диплоидных фибробластов человека (HF) получали из участков кожи внутренней поверхности предплечья методом эксплантов (Фадеев и др., 2012). Время удвоения числа клеток в используемых растущих культурах составлял около 20 ч. Рост числа клеток в культурах начинался через 18-20 часов после посева.
Оценка цитотоксичности Для анализа цитотоксичности клетки из растущих культур высевали в 96-луночные культуральные планшеты. Цитотоксичность оценивали по отношению количества живых клеток в опытных и контрольных (необработанных токсическими агентами) культурах через 24 ч после добавления агентов. Для определения количества живых клеток культуры окрашивали кристаллическим фиолетовым с последующим фотометрированием (Nomizu et al., 1995). Жизнеспособность клеток оценивали также по окраске трипановым синим.
Морфологический флуоресцентный метод определения апоптотических клеток Наличие аберрантного распределения хроматина, указывающего на апоптотический тип гибели клеток, оценивали методом флуоресцентной микроскопии, одновременно окрашивая клетки флуоресцентными зондами Hoechst 33342 и этидиум бромидом (Акатов и др., 2000).
Анализ митотической активности в клеточных культурах Число митотических клеток в культурах определяли с помощью флуоресцентной микроскопии, используя прижизненное окрашивание флуоресцентным ядерными красителем Hoechst 33342 (Акатов и др., 2000).
Митотические клетки выявляли по распределению хроматина, характерному для метафазы, анафазы, телофазы и цитокинеза.
Ki67p-GFP репортерная система Для выявления пролиферирующих клеток, находящихся в клеточном цикле (вне фазы покоя), использовали Ki67p-GFP репортерную систему, любезно предоставленную доктором А. Замбон (Департамент фармакологии, Университет Калифорнии, США) (Zambon, 2010).
Трансфекция клеток Для трансфекции клеток линии А431 плазмидным вектором Ki67pGFP, был использован Lipofectamin 2000, следуя рекомендациям производителя. Селекцию клеток проводили на среде содержащей 10 мкг/мл бластицидина. Отбор GFP-позитивных клонов осуществляли, используя флуоресцентный микроскопа Leica DM 6000 (Германия).
Проточная цитофлуориметрия Для анализа распределения клеток по содержанию ДНК использовали проточный цитометр (PARTEC III, Германия). Распределение клеток A431/Ki67p-GFP по интенсивности флуоресценции GFP определяли прижизненно после открепления и суспендирования клеток, используя канал FL 1 (510-530нм) проточного цитометра PARTEC III.
Анализ содержания кислорода в среде культивирования клеток Концентрацию кислорода в среде культивирования измеряли, используя электрод Кларка закрытого типа.
Статистический анализ Результаты исследований представлены в виде среднего m, где m - стандартная ошибка среднего. Достоверность отличия выборок экспериментальных данных, а также средних значений оценивали с помощью критерия Уилкоксона для выборок с попарно-связанными вариантами, либо критерия Уитни-Манна для независимых выборок. Все эксперименты проводились не менее чем в трех повторах (n 3).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Избирательность апоптоз-индуцирующего действия рекомбинантного белка izTRAIL на опухолевые клетки.
Исследовали токсическое действие рекомбинантного белка izTRAIL на растущие опухолевые и нормальные клетки человека in vitro.
Добавление izTRAIL в концентрации до 20 мкг/мл в культуру мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (МККМ) и диплоидных фибробластов человека через 24 часа после посева плотностью 5х1клеток/см2 и 8х103 клеток/см2 соответственно не вызывало гибели клеток (рис.1).
Рис. 1.
Рекомбинантный белок izTRAIL избирательно оказывает токсическое действие на клетки опухолевого происхождения (НЕр-2, А549, HeLa, MCF-7 и OVCAR-3), не повреждая нормальные (фибробласты, МККМ). По оси абсцисс - концентрация izTRAIL, нг/мл;
по оси ординат - отношение числа живых клеток в опытных и контрольных (без добавок) культурах через часа после добавления izTRAIL, %.
Количество клеток в опытных культурах составляло 985% в сравнении с контролем. Добавление белка izTRAIL в концентрации до 1,5 мкг/мл в культуры опухолевых клеток линий НЕр-2, А549, HELA, MCF7 и OVCAR-3 через 24 часа после посева 1,5х104 клеток/см2 уменьшало количество живых клеток относительно контроля до 102%, 113%, 134%, 53%, 0% соответственно (рис.1). Через 2 ч после добавления izTRAIL в большинстве клеток (70-80%) наблюдалось аберрантное распределение хроматина, указывающее на апоптотический тип гибели (Рис.2). Эти результаты свидетельствуют об избирательном апоптоз-индуцирующем действии использованного в работе рекомбинантного белка izTRAIL на опухолевые клетки.
Необходимо отметить, что активность разработанного нами рекомбинантного белка izTRAIL находится на уровне лучших коммерчески доступных зарубежных аналогов, таких как izTRAIL и superkiller TRAIL фирмы Amgen, и значительно (более чем в 200 раз) превосходит эти аналоги по растворимости. Сочетание высокой активности и растворимости принципиально важно для потенциального применения белков TRAIL в противоопухолевой терапии.
Следует также подчеркнуть, что используемый в работе рекомбинантный белок izTRAIL значительно (в 200 и более раз для разных линий клеток) активнее рекомбинантного белка rhApo2L/TRAIL, созданного на основе внеклеточного домена цитокина TRAIL (аа 114-281) без дополнительной стабилизации его тримерной формы посредством применения зипперов и/или других модификаций. Согласно нашим данным, izTRAIL вызывает гибель 50% клеток НЕр-2 при 8 нг/мл, а белок rhApo2L/TRAIL, вызывает гибель 60% клеток при 1,6 мкг/мл.
Рис. 2. Микрофотографии клеток HEp2 через 24 часа после посева плотностью 3х104. клеток/см2 до добавления рекомбинантного белка izTRAIL (а) и через 4 ч после добавления 100 нг/мл izTRAIL (б). Окраска клеток ядерными красителями Hoechst 33342 (проникает в живые клетки) и этидиум бромидом (не проникает в живые клетки). Аберрантное распределение хроматина (показано стрелками) указывает на апоптоз. X 2Таким образом, используемый в представленной работе рекомбинантный белок izTRAIL индуцирует апоптотическую гибель опухолевых клеток при концентрациях 1-10 нг/мл и не вызывает гибель нормальных клеток человека даже при концентрациях 20 мкг/мл.
2. Повышение резистентности опухолевых клеток к TRAILиндуцированному апоптозу в конфлюентных культурах.
В результате выполненной работы было установлено значительное повышение резистентности опухолевых клеток к действию рекомбинантного белка izTRAIL по мере увеличения плотности клеточной культуры. На рис. 3 представлены результаты изучения цитотоксического действия izTRAIL при его добавлении к клеткам НЕр-2 сразу после посева плотностью 3х104 клеток/см2, а также через 24 и 72 ч после посева. При добавлении белка izTRAIL сразу после посева клеток (0 ч) величина IC(концентрация белка при которой количество клеток в опыте уменьшалось до 50 процентов в сравнении с контролем) составляло 41 нг/ мл izTRAIL, а при концентрации белка 50-100 нг/мл и более наблюдалась гибель всех клеток. При добавлении izTRAIL через 24 часа после посева обнаружено, что часть клеток культуры была нечувствительна к апоптозиндуцирующему действию белка. Это выражается в том, что 12% клеток оставались живыми независимо от повышения концентрации izTRAIL от нг/мл до 1,5 мкг/мл (плато на рис.3а, 24 ч). При этом величина IC50 белка izTRAIL для клеток, сохранивших чувствительность к izTRAIL (определяется по уменьшению количества живых клеток от 100% до плато), составляет 91 нг/мл. При добавлении белка izTRAIL через 72 ч после посева, когда культура имела вид монослоя прилегающих друг к другу клеток (лслившийся монослой, конфлюент), обнаружено, что процент клеток нечувствительных к izTRAIL (плато при 200 нг/мл белка и больше, рис.3а) составляет 504%, а величина IC50 белка izTRAIL для субпопуляции чувствительных к нему клеток увеличилась до 305 нг/мл.
Рис. 3. Увеличение резистентности опухолевых клеток НЕр-2 по ходу роста культуры, посеянной плотностью 3х104 клеток/см2 (а) и при увеличении плотности посева этих клеток (белок добавляли через 24 часа после посева) (б).
0 ч - сразу после посева суспензии клеток, 24 ч - культура низкой плотности клеток, 72 ч - конфлюентный монослой (культура высокой плотности клеток).
Отличия величины IC50 и доли клеток чувствительных к апоптозу, между культурами клеток НЕр-2 сразу после посева (0 ч), через 24 ч и 72 ч достоверны (р<0,05). Таким образом, в конфлюентной культуре клеток линии НЕр-2 около 50% всех клеток становятся резистентными к действию izTRAIL вплоть до концентрации 1,5 мкг/мл.
Дополнительным подтверждением зависимости TRAILрезистентности опухолевых клеток от плотности клеточных культур являются данные о гибели клеток НЕр-2 при добавлении рекомбинантного белка izTRAIL через 24 ч после посева клеток с различной плотностью (рис.3б). Из представленных на рис. 3б результатов видно, что процент клеток, резистентных к белку izTRAIL при высоких концентрациях белка (плато при 50-200 нг/мл белка и более), при высокой плотности посева культур (6х104 и 1,2х105клеток/см2) составлял 252%, а при более низкой (1,5х104, 3х104, клеток/см2) - 123%. Указанные проценты резистентных к izTRAIL клеток при низких и высоких плотностях культур достоверно отличались (р<0.05). При плотности посева 105 и 2х105 клеток/см2 после 24 часов культивирования формировался конфлюентный монослой распластанных клеток. Из рис. 3б видно, что при возрастании плотности посева также происходит увеличение IC50 белка для той части популяции, которая оставалась чувствительной к белку izTRAIL. На рис. 4 представлен вид культур клеток НЕр 2 через сутки после посева различной плотностью и после 72 ч культивирования.
Рис. 4.
Микрофотографии культуры клеток НЕр-2 через 24 ч после их посева в концентрации 1,5х104 (а), 3х104 (б), 1,2х105 (в) клеток/см2, и через 72 ч посева плотностью 3х104 клеток/см(г). Увеличение 200.
Наибольший эффект повышения резистентности в конфлюентных культурах обнаружен для опухолевых клеток линии А431. На рис. представлены данные о цитотоксическом действия белка izTRAIL при его добавлении в культуру клеток А431 сразу после посева плотностью 3х1клеток/см2, а также через 24 и 96 ч после посева. При добавлении белка izTRAIL сразу после посева клеток (0 ч) величина IC50 белка составляла 62 нг/мл, а при концентрации белка 50-200 нг/мл и более, 95% клеток были погибшими. Через 24 часа после посева 20% клеток приобретали резистентность к действию izTRAIL (появление плато на рис.5 при высоких концентрациях белка), а величина IC50 белка izTRAIL для клеток, сохранивших чувствительность к izTRAIL, увеличилась до 153 нг/мл. В конфлюентной культуре через 96 часов после посева все клетки становились резистентными к рекомбинантному белку izTRAIL вплоть до концентрации белка 1,5 мкг/мл (рис.5).
Рис. 5. Зависимость гибели клеток А431 от концентрации рекомбинантного белка izTRAIL по ходу роста культуры и увеличения ее плотности. 0 ч - сразу после посева суспензии клеток, 24 ч - разреженная культура распластанных клеток, 96 ч - конфлюентный монослой.
Значительное увеличение резистентности к апоптоз-индуцирующему действию белка izTRAIL было обнаружено для всех использованных в работе зависимых от прикрепления опухолевых клеток, включая клеточные линии, полученные из карцином человека (А549, OVCAR-3, HeLa), а также из фибросаркомы человека (НТ-1080).
Наряду с повышением резистентности опухолевых клеток в конфлюентной культуре к апоптоз-индуцирующему действию белка izTRAIL, выявлено сходное повышение резистентности к токсическому действию неспецифического индуктора окислительного стресса пероксида водорода и химиотерпевтического препарата дихлордиаминоплатины, что показано на рис.6 на примере клеток НЕр-2.
Рис. 6. Повышение резистентности опухолевых клеток НЕр-2 в конфлюентных культурах (72 ч) к действию перекиси водорода (а) и дихлордиаминоплатины (б). Клетки высевали плотностью 50 тысяч клеток /см2.
Через 24 ч клетки начинали расти, а через 72 ч культура имела вид конфлюентного монослоя.
Величина IC50 для пероксида водорода в культурах с низкой плотностью (через 24 ч после посева 3х104 клеток/см2) составляла 10020 мкМ, а в конфлюентных культурах (через 72 ч после посева 3х1клеток/см2) IC50 равнялась 920130 мкМ (возрастание резистентности в 10 раз, рис.6а). Величина IC50 для дихлородиаминплатины в культурах низкой плотности (24 ч) и в конфлюентных культурах (72 ч) составляла 31 мкМ и 608 мкМ соответственно (возрастание резистентности в 20 раз, рис.6б).
Полученные результаты указывают на общность феномена конфлюентной резистентности опухолевых клеток для различных воздействий, включая неспецифические противоопухолевые препараты, окислительный стресс и рецептор-опосредованная индукция апоптоза.
Рис. 7. Увеличение резистентности опухолевых клеток THP-1 при увеличении их концентрации (А), и отсутствие подобного эффекта в культуре опухолевых клеток К 562 (Б). Белок izTRAIL добавляли через 24 часа после посева клеток в различной плотности.
Выясняли, способны ли приобретать резистентность к белку izTRAIL опухолевые клетки, которые растут в культуре, не распластываясь на внеклеточном матриксе. Обнаружили, что по мере увеличения концентрации клеток моноцитарного лейкоза человека THP-1, которые формируют агрегаты не прикрепляясь и не распластываясь на внеклеточном матриксе, резистентность клеток значительно возрастает (рис.7А). В отличие от этого, при увеличении концентрации клеток миелобластного лейкоза человека (линия K562), которые не распластываются на внеклеточном матриксе и не образуют агрегатов, не обнаружено достоверного увеличения резистентности клеток к TRAILиндуцированному апоптозу.
Таким образом, обнаружена способность клеток лейкоза человека приобретать резистентность к TRAIL-индуцированному апоптозу в суспензионных культурах, содержащих многоклеточные агрегаты.
3. Выяснение связи TRAIL- резистентности опухолевых клеток в конфлюентных культурах с пролиферацией клеток В научной литературе существует представление о том, что опухолевые клетки становятся резистентными к повреждающим воздействиям в результате торможения пролиферации, перехода клеток в непролиферативное состояние (G0) (Jedema I et al., 2004). В работе выясняли, связь конфлюентной резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу с торможением или подавлением клеточной пролиферации. Для этого оценивали распределение клеток НЕр2 и A431 по фазам клеточного цикла и митотичеcкую активноcть через 24 часа после посева и в резистентных конфлюентных культурах. Кроме этого косвенно оценивали активность гена Ki67, маркера пролиферирующих клеток (Zambon, 2010), в конфлюентных и не конфлюентных культурах, используя для этого репортерную систему Ki67p-GFP в клетках А431.
Количество клеток НЕр-2 в S фазе клеточного цикла после 24 ч культивирования составляло 22,01,8 % (рис.8а), а в резистентных конфлюентных культурах клеток линии НЕр-2 через 72 ч после посева уменьшалось до 10,12,0% (рис.8б).
Рис. 8. Распределение клеток НЕр-2 (а,б) и А431 (в,г) по ДНК через часа после посева (а,в) и в конфлюентных культура через 72 ч (б) и 96 ч (г) после посева.
Процент митотических клеток НЕр-2 через 24 часа культивирования составлял 7,31,1%, а через 72 ч - 4,50,7% (отличие достоверно, р<0.05).
Таким образом, повышение резистентности клеток к TRAILиндуцированному апоптозу в конфлюентных культурах НЕр-2 коррелирует со снижением пролиферативной активности клеток.
Количество клеток А431 в S фазе клеточного цикла после 24 ч культивирования составляло 30,41,2% (рис.8в), а в резистентных конфлюентных культурах клеток А431 через 96 ч после посева уменьшалось до 25,41,0%. (рис.8г). Процент митотических клеток А4после 24 часов культивирования составлял 8,71,5%, а после 96 ч он уменьшился до 0,250,1% (pазличие доcтовеpно, p<0,05). Таким образом, повышение резистентности клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах А431 с одной стороны коррелирует со снижением пролиферативной активности (уменьшение % митотических клеток), однако значительная часть TRAIL-резистентных клеток остается в S-фазе клеточного цикла. Тот факт, что значительная часть клеток А431 в резистентной к izTRAIL конфлюентной культуре находится в клеточном цикле, подтверждается данными, полученными с применением репортерной системы Ki67p-GFP. Такая система позволяет выявлять пролиферирующие клетки, находящиеся в G1/S/G2/M-фазах клеточного цикла по экспрессии pепоpтеpного белка GFP, находящейся под контролем проксимального пpомотеpа гена Ki-67. При этом уменьшение интенсивности флуоресценции GFP указывает на понижение активности проксимального промотера гена Ki-67 и, соответственно, на снижение пролиферативной активности клеток (Zambon, 2010). Клетки A431/Ki67pGFP имели такую же чувствительность к izTRAIL в редкой культуре (через 24 ч после посева) и резистентность в конфлюентной культуре, как и клетки А431 дикого типа (не трансфецированные репортерным вектором). На рис. 9 представлены гистограммы распределения клеток A431/Ki67p-GFP по интенсивности флуоресценции GFP через 24 и 96 ч после посева.
На гистограммах видны две субпопуляции клеток, интенсивность флуоресценции GFP в которых отличается в среднем в десять раз. Согласно полученным данным доля клеток c низкой интенсивностью флуоресценции GFP (не пролиферирующие клетки) через 24 ч после посева составляла 12,00,5%, а в конфлюентных культурах - 31,01,5% (рис. 9). Эти результаты также указывают с одной стороны на корреляцию повышения резистентности клеток в конфлюентных культурах с подавлением пролиферативной активности, а с другой стороны на то, что опухолевые клетки способны приобретать TRAIL-резистентность, находясь в клеточном цикле.
Рис. 9. Распределение клеток A431/Ki67p-GFP по флюоресценции белка GFP через 24 часа после посева (а) и в конфлюентных культура через 96 ч после посева (б).
Обнаруженное сочетание подавления митотической активности (с 8,до 0,25%) с нахождением значительной части (около 70 %) клеток А431 в фазах G1, S и G2 клеточного цикла, в условиях конфлюентной культуры, вызывает вопрос, что это за состояние клеток, и для ответа на него требуется отдельное исследование.
Таким образом, установлено, что в TRAIL-резистентных конфлюентных культурах происходит снижение пролиферативной активности клеток, но в тоже время значительная часть клеток остается в клеточном цикле.
4. Роль адгезии опухолевых клеток и околоклеточного микроокружения в формировании резистентности к TRAILиндуцированному апоптозу Основными причинами конфлюентной резистентности клеток к повреждающим воздействиям в литературе рассматриваются либо межклеточные контакты, либо неблагоприятное для клеток изменение околоклеточной среды (ацидоз, гипоксия и др.), возникающее в плотных культурах вследствие диффузионных ограничений массопереноса (Mazurov et al., 2003).
Выясняли роль межклеточной адгезии и адгезии клеток к внеклеточному матриксу в повышении резистентности клеток к TRAILопосредованному апоптозу.
Открепление клеток НЕр-2 конфлюентных культур от подложки в течение 10 мин посредством трипсина и ЭДТА с последующим суспендированием полностью подавляет их резистентность к действию izTRAIL (0 часов на рис. 10). Аналогичное изменение обнаружено и для клеток А431.
Через 6 часов от момента посева все клетки НЕр-2 были распластанными, но повышения резистентности клеток к действию izTRAIL не выявлялось (отсутствие субпопуляции резистентных клеток) (рис.10). Субпопуляция резистентных клеток появляется только через 24 часа от момента посева (12%2%), а величина IC50 для нерезистентной субпопуляции в это время составляет 91 нг/мл.
Рисунок 10. Кинетика изменения чувствительности опухолевых клеток НЕр-2 к рекомбинантному белку izTRAIL в первые сутки после посева плотностью тысячи клеток/см2.
Известно, что в конфлюентных культурах околоклеточная среда может значительно отличаться (ацидоз, гипоксия и др.) от среды вдали от клеток вследствие диффузионных ограничений массопереноса (Akatov et al., 1984), что может индуцировать резистентность клеток как адаптивный ответ на ухудшение условий околоклеточного микроокружения. В связи с этим выясняли, насколько условия околоклеточной среды опухолевых клеток в конфлюентных культурах могут влиять на возникновение у них резистентности к TRAIL-индуцированному апоптозу. Для этого сравнивали действие izTRAIL на клетки А431 в культурах низкой и высокой плотности, без перемешивания и с перемешиванием культуральной среды на шейкере.
Обнаружили, что независимо от перемешивания, клетки были чувствительны к действию izTRAIL через 24 часа после посева плотностью 3,3х104/см2, и их резистентность к TRAIL- индуцированному апоптозу значительно возрастала в конфлюентных культурах (рис.11).
Рис. 11. Клетки А4приобретают резистентность к действию рекобинантного белка izTRAIL в условиях перемешивания среды также как и без перемешивания. На графике представлена выживаемость клеток через 24 часа после добавления 100 нг/мл izTRAIL. В качестве контроля использовали культуры без добавления izTRAIL.
В условиях перемешивания значение рН среды и концентрация кислорода составляли 7.08 и 150 мкМ О2,соответственно, и, таким образом, в этих условиях не наблюдалось ацидоза и гипоксии в среде около клеток.
Это указывает на то, что резистентность клеток к TRAILиндуцированному апоптозу в конфлюентных культурах может осуществляться при физиологических условиях околоклеточной среды.
Таким образом, нарушение межклеточных контактов, а также контакта с подложкой при откреплении клеток конфлюентных культур в течение 510 мин подавляет резистентность клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу. Распластывание клеток и формирование фокальных контактов клеток с подложкой недостаточны для повышения резистентности клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу. Конфлюентная резистентность может приобретаться опухолевыми клетками в благоприятной для роста околоклеточной среде. В совокупности эти результаты указывают на то, что причиной резистентности опухолевых клеток в конфлюэнтных культурах к TRAIL-индуцированному апоптозу являются межклеточные контакты.
5. Роль внутриклеточных сигнальных путей в формировании TRAIL-резистентности опухолевых клеток в конфлюентных культурах Выясняли роль различных внутриклеточных сигнальных путей в формировании конфлюентной TRAIL - резистентности опухолевых клеток.
С этой целью изучали влияние на конфлюентную резистентность ингибиторов протеинкиназ, принимающих участие в основных внутриклеточных сигнальных путях выживания клеток, включая фосфотидилинозитол-3-киназу (PI3K), протеинкиназу B (Akt), протеинкиназу Raf, янус-киназу (Jak), протеинкиназу А (PkA), протеинкиназу C(PkC), киназу фокальной адгезии (FAK).
Обнаружено, что добавление ингибитора PI3K (Wortmannin) в конфлюентную культуру клеток НЕр-2 уменьшает число резистентных к действию izTRAIL клеток в 2 раза с 504% до 253%, но не вызывает существенного изменение величины IC50 белка для субпопуляции клеток чувствительных к izTRAIL (рис.12а). Сходные результаты получены при использовании ингибитора известного фактора выживаемости клеток киназы Akt/PKB (Akt 1,2 inhibitor), который также уменьшал число резистентных к действию izTRAIL клеток, без изменения IC50 белка для субпопуляции чувствительных к izTRAIL клеток (рис.12б). Ингибитор протеинкиназы Raf (Raf Kinase Inhibitor V) менее эффективно, чем ингибиторы PI3K и Akt, снижает число резистентных к действию izTRAIL клеток (до 343%), как и ингибитор PkA (KT 5720) (до 395%), без изменения IC50 белка для субпопуляции чувствительных к izTRAIL клеток (рис.12а,б). Комбинация ингибиторов PI3K и протеинкиназы Raf практические полностью подавляла конфлюентную TRAIL-резистентность клеток НЕр-2 (снижение резистентной субпопуляции клеток до 71%) без изменения величины IC50 белка для субпопуляции клеток чувствительных к izTRAIL (рис.12а). Ингибиторы киназы фокальной адгезии FAK (Focal adhesion kinase inhibitor II), а также киназ Jak (AG 490), PkC (Calphostin C) не подавляли конфлюентную TRAIL-резистентность клеток НЕр-2.
Для клеток А431, в отличие от клеток НЕр-2, все указанные выше ингибиторы не уменьшали конфлюентную TRAILЦрезистентность.
Рис. 12. Влияние ингибиторов различных протеинкиназ внутриклеточных сигнальных путей на конфлюентную резистентность клеток НЕр-2.
Оценивали также вклад рецепторов ростовых факторов в формировании резистентности опухолевых клеток к действию izTRAIL в конфлюентных культурах. Для этого конфлюентную культуру клеток НЕр2 инкубировали в среде без сыворотки с 10 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина БСА (контроль без сыворотки), с добавлением 50 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 50 нг/мл тромбоцитарного фактора роста (PDGF), 50 нг/мл фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и 10 мкг/мл инсулина.
В конфлюентных культурах клетки линии HEp2 в бессывороточной среде становятся чувствительными к действию izTRAIL, о чем свидетельствует уменьшение доли резистентной субпопуляции клеток от 505%, до 52%, без существенного изменения величины IC50 для izTRAIL (рис.13а), а добавление сыворотки немедленно (минуты) восстанавливает резистентность. Добавление в бессывороточную среду по отдельности эпидермального фактора роста (EGF) и инсулина в концентрации 10 мкг/мл, при которой он инициирует сигнальный каскад через рецепторы инсулино-подобных факторов роста IGF1 и IGF2, приводит к увеличению субпопуляции TRAIL-резистентных клеток до 255% и 154%, соответственно, без изменения IC50. Добавление комбинации инсулина и EGF в бессывороточную среду увеличивает количество TRAILрезистентных клеток до 415% (рис.13б), и также без изменения IC50 белка izTRAIL. Применение инсулина в бессывороточной среде в физиологических концентрациях (10-100нг/мл) не увеличивало TRAILрезистентность конфлюентных культур клеток HEp-2.
Рис. 13. Подавление конфлюентной TRAIL-резистентности клеток НЕр-в среде без сыворотки (а), восстановление конфлюентной резистентности клеток НЕр-2 в бессывороточной среде ростовым фактором EGF и инсулином (б), и отсутствие такого эффекта при добавлении ростовых факторов PDGF и VEGF.
Тромбоцитарный фактор роста (PDGF BB) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) также не увеличивали долю резистентных клеток в бессывороточной среде.
Для клеток А431, в отличие от клеток НЕр-2, удаление сыворотки из среды культивирования не уменьшало конфлюентную TRAILЦ резистентность.
Полученные результаты указывают на то, что механизм конфлюентной резистентности в опухолевых клетках разного происхождения может быть различным. В частности, повышение TRAILЦ резистентности клеток карциномы гортани человека, линия НЕр-2, в конфлюентных культурах осуществляется с привлечением некоторых тирозин-киназных рецепторов ростовых факторов (IGF и EGF, но не PDGF) и реализуется через внутриклеточные сигнальные пути, связанные с киназами PI3K, Akt (PKB), в меньшей степени с киназами Raf, PKA, и совсем не связано с киназой фокальной адгезии (FAK), а также с киназами Jak и PKC. В отличие от этого механизм конфлюентной резистентности клеток карциномы кожи, линия А431, согласно полученным данным не связан ни с указанными киназами, ни с тирозинкиназными рецепторами ростовых факторов.
6. Подавление конфлюентной резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу мультикиназным ингибитором сорафенибом и ингибитором гистондеацетилазы SAHA.
В работе выясняли возможность подавления конфлюентной TRAILрезистентности опухолевых клеток различного происхождения посредством мультикиназного ингибитора сорафениба (препарат Нексавар) и ингибитора гистондеацетилазы субероиланилидом гидроксамовой кислоты (SAHA, препарат Вориностат).
Ингибитор гистондеацетилазы SAHA и мультикиназный ингибитор сорафениб в нетоксичной концентрации (до 10 мкМ) эффективно, дозозависимым образом, подавляли конфлюентную резистентность опухолевых клеток. Для конфлюентных культур клеток А431 величина IC50 белка izTRAIL в сочетании с 5 мкМ SAHA составляла 2,00,5 нг/мл, а в сочетании с 5 мкМ сорафениба - 82 нг/мл (pиc. 14а). Для этих клеток SAHA более эффективно подавлял конфлюентную TRAIL-резистентность, чем сорафениб, и клетки становились более чувствительными к izTRAIL, чем суспендированные клетки без добавления SAHA (рис.5). В культуре клеток НЕр-2 SAHA и сорафениб в равной степени эффективно подавляли конфлюентную TRAILЦрезистентность (рис.14б), и величина ICсоставляла 10,4 нг/мл и 20,4 нг/мл соответственно (отличие недостоверно).
Рис. 14. Подавление конфлюентной TRAIL-резистентности клеток А 4(а) и НЕр-2 (б) при добавлении 5 мкМ мультикиназного ингибитора сорафениб и 5 мкМ ингибитора гистондеацетилазы SAHA.
Аналогичные результаты были получены для других линий опухолевых клеток, в том числе для клеток фибросаркомы НТ-1080.
Таким образом, применение cоpафениба и SAHA, которые в настоящее время используются как таргетные препараты в противоопухолевой терапии, способно эффективно подавлять конфлюентную pезиcтентноcть опухолевых клеток к TRAILЦ индуциpованному апоптозу. Это создает основу для повышения эффективности потенциального применения рекомбинантных белков TRAIL путем их сочетания с таргетными препаратами в нетоксичной концентрации, позволяя сохранять нетоксичность бинарной комбинации izTRAIL + ингибитор конфлюентной TRAILЦрезистентности в целом.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные результаты указывают на общность явления конфлюентной резистентности клеток к различным повреждающим воздействиям, включая не только ксенобиотики (химиотерапевтические препараты), окислительный стресс, о чем свидетельствуют данные литературы, но и обнаруженную в ходе выполнения работы конфлюентную резистентность к TRAILЦиндуцированному апоптозу. Резистентность опухолевых клеток к инициации апоптоза через рецепторы лиганда TRAIL указывает на то, что такая резистентность связана не с белками, выводящими ксенобиотики из клеток (белки множественной лекарственной устойчивости Pgp, MRP1-MRP5 и др.), а с внутриклеточными сигнальными путями, ответственными за выживаемость клеток. Существенным моментом является также то, что TRAILЦрезистентность могут приобретать и клетки лейкоза человека в многоклеточных агрегатах. Эти результаты представляют интерес не только с научной точки зрения для понимания молекулярных механизмов резистентного состояния клеток в патологии, но и для лечения злокачественных заболеваний.
В настоящее время нет ясного понимания причины возникновения резистентности опухолевых клеток в конфлюентных культурах.
Основными предположениями можно назвать участие межклеточных контактов, либо специфических факторов околоклеточного микроокружения, таких как ацидоз и гипоксия, возникающих непосредственно около клеток вследствие диффузионного ограничения массопереноса в конфлюентных культурах. В ответ на эти факторы можно ожидать адаптивное неспецифическое повышение резистентности опухолевых клеток. Однако в наших исследованиях было установлено, что конфлюентная TRAIL-резистентность может возникать в условиях благоприятной для роста клеток околоклеточной среды. Совокупность полученных в работе результатов указывает, что причиной резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу являются межклеточные контакты. Вопрос о том, какие межклеточные контакты индуцируют резистентность опухолевых клеток к повреждающим воздействиям, и каким образом это осуществляется, остается открытым и требует дальнейших исследований.
Другой важный вопрос, рассмотренный в диссертации, состоит в том, связана ли конфлюентная резистентность опухолевых клеток с подавлением клеточной пролиферации. Представленные в работе результаты указывают на связь конфлюентной TRAIL-резистентности с угнетением пролиферации клеток. Однако, согласно полученным данным, опухолевые клетки могут приобретать резистентность, оставаясь в клеточном цикле, в частности в S и G1 фазах. Вопрос о том, что это за состояние опухолевых клеток, при котором митотическая активность подавлена, а клетки остаются в цикле, остается открытым, и для ответа на него требуются дополнительные исследования.
Выполненный в работе анализ роли в конфлюентной TRAILрезистентности опухолевых клеток основных, ответственных за выживание протеинкиназ внутриклеточных сигнальных путей показал, что механизмы резистентности клеток разного происхождения могут быть различными, что может отражать специфику трансформации клеток в опухолях. Например, в клетках карциномы гортани человека механизм конфлюентной TRAILЦ резистентности реализуется с участием тирозинкиназных рецепторов, внутриклеточных протеинкиназ PI3K, Akt, Raf, PKA (рис. 15), которые указывают на реализацию механизма через ингибирование Bad, супрессора антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-xL, и проапоптотического белка Bax, олигомеризация которого в комплексе с рядом других белков во внешней мембране митохондрий обеспечивает выход в цитозоль проапоптотических белков SMAC, CytC и др., что необходимо для активации эффекторных каспаз 3, 6, 7 и запуска апоптоза.
Рис. 15. Роль сигнальных протеинкиназ в механизме конфлюентной TRAIL-резистентности опухолевых клеток НЕр2. Светлые фигуры - проапоптотические белки, темные - антиапоптотические белки, маленькие круги на темных фигурах - использованные в работе ингибиторы, прерывистые стрелки - неактивированные, и сплошные стрелки - активированные сигнальные пути конфлюентной TRAIL-резистентности клеток НЕр-В то же время в работе обнаружено, что в клетках карциномы кожи человека, линия А431, механизм конфлюентной TRAIL-резистентности не связан с указанными протеинкиназами. Это указывает на необходимость учитывать специфику опухолей при разработке методов подавления конфлюентной резистентности опухолевых клеток.
Подавление конфлюентной резистентности опухолевых клеток НЕр-к TRAIL-индуцированному апоптозу путем применения ингибиторов внутриклеточных сигнальных протеинкиназ в нетоксичных концентрациях, свидетельствует о возможности создания комплексных субстанций, которые способны подавлять резистентность опухолевых клеток и избирательно вызывать их гибель, не оказывая токсичного действия на клетки здоровых тканей.
ВЫВОДЫ 1. Опухолевые клетки человека эпителиального и мезенхимального происхождения способны приобретать резистентность к TRAILЦ индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах. Клетки лейкоза человека способны приобретать резистентность к TRAIL-индуцированному апоптозу в многоклеточных агрегатах.
2. Резистентность опухолевых клеток к TRAILЦиндуцированному апоптозу в конфлюентных культурах возникает на фоне подавления пролиферативной активности, и при этом значительная часть резистентных клеток может оставаться в клеточном цикле.
3. Полученные результаты указывают на то, что причиной резистентности опухолевых клеток к TRAILЦиндуцированному апоптозу в конфлюентных культурах являются межклеточные контакты.
4. Механизмы резистентности опухолевых клеток разного происхождения к TRAILЦиндуцированному апоптозу в конфлюентных культурах могут значительно отличаться и включать активацию рецепторов ростовых факторов и протеинкиназ внутриклеточных сигнальных путей, таких как PI3K, Akt (PKB), Raf, PKA.
5. Резистентность опухолевых клеток к TRAILЦиндуцированному апоптозу в конфлюентных культурах может подавляться путем нетоксичного воздействия на внутриклеточные молекулярные мишени.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:
1. P.C. Фадеев, А.В. Чеканов, Н.В. Долгиx, В.C. Акатов. Повышение pезиcтентноcти опуxолевыx клеток линии A431 к TRAIL-индуциpованному апоптозу в конфлюентныx культуpаx // Биофизика, 2012, том 57, вып. 4, c.
649-654.
2. P.C. Фадеев, А.В. Чеканов, Н.В. Долгиx, В.C. Акатов.
Мультикиназный ингибитоp cоpафениб и ингибитоp гиcтондеацетилазы cубеpоиланилидгидpокcамовая киcлота подавляют конфлюентную pезиcтентноcть опуxолевыx клеток к pекомбинантному белку izTRAIL // Биофизика, 2012, Том 57, Вып. 4, c. 655-661.
3. P.C. Фадеев, А.В. Чеканов, Н.В. Долгиx, В.C. Акатов.
Резистентность опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах // Биологические мембраны, 2012, Том 29, Вып.
6, c. 433-441.
4. Н.В. Долгих, Р.С. Фадеев, А.В. Чеканов, В.С. Акатов.
Сравнительное изучение цитотоксического действия противоопухолевого белка TRAIL и его модифицированной формы in vitro // Вестник ВГУ, серия: Химия. Биология. Фармация, 2012, № 1, с. 84-89.
5. Knyazeva EL, Grishchenko VM, Fadeev RS, Akatov VS, Permyakov SE, Permyakov EA. Who is Mr. HAMLET? Interaction of human alphalactalbumin with monomeric oleic acid. // Biochemistry, 2008, V. 47(49), p.
13127-37.
6. Permyakov SE, Knyazeva EL, Khasanova LM, Fadeev RS, Zhadan AP, Roche-Hakansson H, Hkansson AP, Akatov VS, Permyakov EA. Oleic acid is a key cytotoxic component of HAMLET-like complexes. // Biol. Chem., 2012, V.
393(1-2), p. 85-92.
Тезисы:
1. Фадеев Р.С., Чеканов А.В., Акатов В.С. Изучение зависимой от клеточной адгезии резистентности опухолевых клеток к повреждающему действию цитокина TRAIL in vitro // Экспериментальная и теоретическая биофизика Т10. Труды конференции / Под ред. Г.Р. Иваницкого. - Пущино:
Фотон-век, 2010. - 36с.
2. Фадеев Р.С., Чеканов А.В., Акатов В.С. Изучение резистентности опухолевых клеток к действию цитокина TRAIL // Сборник тезисов международной Пущинской школы-конференции молодых ученых Биология - наука XXI века. - 2011, стр. 207.
3. Фадеев Р.С., Чеканов А.В., Фадеева И.С., Акатов В.С. Перспективы применения высокоселективного человеческого противоопухолевого цитокина TRAIL для лечения злокачественных новообразований мозга // Материалы Седьмого Международного Междисциплинарного Конгресса Нейронаука для медицины и психологии, Судак, Крым, Украина, 3-июня 2011 года.
4. Долгих Н.В., Фадеев Р.С., Чеканов А.В. Специфичность сенситизации опухолевых клеток различного происхождения к повреждающему действию противоракового рекомбинантного белка m TRAIL // Материалы Международного молодежного научного форума ЛОМОНОСОВ-2011, М.: МАКС Пресс, 2011. - ISBN 978-5-317-03634-5. Долгих Н.В., Фадеев Р.С., Чеканов А.В., Акатов В.С. Изучение цитотоксического действия противоракового цитокина TRAIL и его модифицированной формы in vitro // Сборник тезисов 15 международной Пущинской школы-конференции молодых ученых Биология - наука XXI века. - 2011, стр. 191.
6. Долгих Н.В., Фадеев Р.С., Чеканов А.В.Сравнительное изучение противоопухолевого действия рекомбинантного цитокина TRAIL/Apo2L и его модифицированной формы на линиях опухолевых клеток // Материалы IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов, Воронеж, 23-27 мая 2011 г. : в 2 т. Воронежский государственный университет, Всероссийская биологическая ассоциация Симбиоз Россия. - Воронеж: Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета, 2011.
7. Долгих Н.В., Фадеев Р.С., Чеканов А.В., Акатов В.С.
Cпецифичность сенситизации опухолевых клеток различного происхождения к цитотоксическому действию противоопухолевого рекомбинантного белка m-TRAIL // Экспериментальная и теоретическая биофизика Т11. Труды конференции / Под ред. Г.Р. Иваницкого. - Пущино:
Фотон-век, 2011. - 24с. - ил.
8. Долгих Н.В., Фадеев Р.С., Чеканов А.В., Акатов В.С.
Резистентность опухолевых клеток к повреждающему действию рекомбинантного белка izTRAIL в плотных конфлюентных культурах // Материалы Международного молодежного научного форума ЛОМОНОСОВ-2012 / Отв. ред. А.И. Андреев, А.В. Андриянов, Е.А.
Антипов, К.К. Андреев, М.В. Чистякова. М.: МАКС Пресс, 2012.
9. Долгих Н.В., Фадеев Р.С., Чеканов А.В., Акатов В.С. Подавление резистентности опухолевых клеток к противораковому рекомбинантному белку mTRAIL таргетными препаратами в нетоксичных концентрациях // Сборник тезисов 16 международной Пущинской школы-конференции молодых ученых Биология - наука XXI века. - 2012, стр. 411.
Работа выполнена при финансовой поддержке Миниcтеpcтва обpазования и науки PФ в pамкаx ФЦП Иccледования и pазpаботки по пpиоpитетным напpавлениям pазвития научно-теxнологичеcкого комплекcа Pоccии на 2007-2013 годы (Гоcконтpакт № 16.512.11.2261) и ВП Pазвитие научного потенциала выcшей школы 2012-2014 гг. (Пpоект № 4.3887.2011) c иcпользованием пpибоpов ЦКП ИТЭБ PАН и ЦКП ИБК PАН.