Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
БРОВКО ФЕДОР АЛЕКСАНДРОВИЧ
РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ ЦИТОКИНИН-СВЯЗЫВАЮЩИМ БЕЛКОМ 70Кд КУКУРУЗЫ
03.01.05 - ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Пущино - 2011
Работа выполнена в филиале Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Пущино.
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Кулаева Ольга Николаевна
Официальные оппоненты:
академик, доктор биологических наук, профессор Тарчевский Игорь Анатольевич доктор биологических наук Клячко Нелли Леопольдовна доктор биологических наук, профессор Ерохин Юрий Евдокимович
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт физиологии и биохимии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов
Защита состоится л 2011 г. в л часов на заседании Диссертационного совета Д 002.066.01 при Учреждении Российской академии наук Институте фундаментальных проблем биологии РАН, по адресу 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института фундаментальных проблем биологии РАН, Московская обл., г. Пущино.
Автореферат разослан л октября 2011 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук Г.Н. Назарова 1.
Общая характеристика работы
.
1.1.
Актуальность проблемы. Цитокинины, открытые как факторы, регулирующие деление клеток растений [Miller et al 1955], обладают широким спектром активностей, они не только активируют деление клеток, но и регулируют дифференцировку побегов, активируют биогенез хлоропластов, задерживают старение, участвуют в регуляции транспорта веществ по растению и в регуляции азотного метаболизма [Кулаева 1982; Mok and Mok 2001; Nashimura et al 2004; Argueso et al., 2009]. Значительный прогресс в исследовании механизма действия цитокининов достигнут благодаря открытию мембранных рецепторов, являющихся гистидиновыми протеинкиназами [Inoue et al; Ueguchi et al 2001]. Функционирование этой сигнальной системы, обеспечивает передачу гормонального сигнала с рецепторной гистидиновой протеинкиназы в ядро, что, возможно, приводит к включению генов первичного ответа на цитокинины ARR (Arabidopsis Response Regulator) A типа. Система включает переносчики фосфатной группы - AHP (Arabidopsis histidine phosphotransfer proteins) от плазматического мембранного рецептора в ядро на цитокининзависимые трансфакторы ARR-B типа, которые взаимодействуют непосредственно с промоторами генов первичного ответа на цитокинин и обеспечивают их включение [Кулаева и Кузнецов 2002;
To and Keiber 2008]. Белки ARR-A типа являются негативными регуляторами ответа растения на цитокинины. Рассмотренный каскад в восприятии и передаче цитокининового сигнала играет важную роль в реализации многих проявлений регуляторного действия цитокинина в растении [Fereira and Kieber 2005; Sakakibara 2006; To and Keiber 2008; Романов 2009]. Вместе с тем в указанную гипотетическую систему передачи цитокининового сигнала в клетке от мембранных гистидиновых протеинкиназ в ядро могут быть внесены существенные изменения. Так получены данные демонстрирующие, что белки - переносчики фосфата - АНР с мембранного рецептора в ядро не чувствительны к изменению концентрации цитокининов, и их роль в передаче цитокининового сигнала не ясна [Punwani et al 2010]. Более того, исследования тройных мутантов, у которых инактивированы все три рецепторные гистидинкиназы, ответственные за восприятие цитокининового сигнала, показало, что передача цитокининового сигнала может быть еще более сложной, что позволило предполагать наличие и других механизмов участвующих в реализации цитокининового сигнала [Higuchi et al 2004; Nishimura et al 2004].
Рецепторные киназы ориентированы на взаимодействие с внеклеточными цитокининами.
Вместе с тем, цитокинины способны проникать в клетку, используя пуриновые [Burkle et al 2003] и нуклеозидные транспортеры [Hirose et al 2005]. Кроме того, цитокинины обнаружены и в ряде компартментов клетки, включая ядро, цитоплазму и хлоропласты [Hare and Van Staden, 1997;
Benkova et al., 1999; Dewitte et al., 1999], что указывало на вероятность присутствия систем восприятия и реализации цитокининового сигнала в этих компартментах. Действительно, предположение подтверждается тем, что в растениях обнаружены альтернативные пути рецепции и реализации сигнала для других фитогормонов: ауксинов [Simon and Petrek 2011]; абсцизовой кислоты [Hauser et al. 2011; Wang and Albert 2011; Guo et al. 2011] гиббериллинов [Klingler et al.
2010; Lumba et al. 2010; Ueguchi-Tanaka and Matsuoka 2010]. Можно предположить, что существуют не только мембранные рецепторы, а и другие системы восприятия цитокининового сигнала, которые, кооперируясь, реализуют цитокининовый сигнал. Представляется вероятной гипотеза о существовании наряду с мембранными рецепторами внутриклеточных цитокининсвязывающих белков - участников цитокинин-зависимой регуляции транскрипционного процесса.
Один из таких белков цитокинин-связываюший белок с молекулярной массой 67 кД (ЦСБ67) был обнаружен в зеленых листьях ячменя [Kulaeva et al. 1995] и стареющих листьях растения Arabidopsis [Selivankina et al. 2004]. Комплекс этих белков с транс-зеатином активировал элонгацию транскрипции в системе, содержащей хроматин и РНК полимеразу I. Есть четкая корреляция между взаимодействием ЦСБ67 с цитокининами и его участием в регуляции элонгации транскрипции, что позволило предположить возможность участия этих белков в восприятии цитокининов и трансдукции цитокининового сигнала.
На основании изложенного выше мы заключили, что поиск и изучение путей передачи цитокининового сигнала, альтернативных мембранной сигнальной системе, является весьма важной и актуальной проблемой.
1.2. Цель и задачи исследования:
Целью исследования явилось обнаружение в растениях кукурузы внутриклеточных белковых сигнальных систем, способных участвовать в восприятии цитокининового сигнала и его реализации в цитокининзависимой регуляции транскрипции.
Основные задачи
исследования были следующие:
1. Из этиолированных проростков кукурузы выделить цитокинин-связывающий белок 70 кД (ЦСБ70) и изучить специфичность его взаимодействия с цитокининами и их аналогами.
2. С помощью иммунохимических и иммуноцитохимических методов изучить топографию ЦСБ70 в органах, тканях и типах клеток проростков кукурузы для выявления особенностей локализации ЦСБ70 в растении.
3. Изучить специфику внутриклеточной локализации ЦСБ70 в клетках растения кукурузы, включая ядерную и пластидную локализацию.
4. Разработать модельные системы для изучения функциональной активности цитокинин белковых комплексов и изучить с их помощью участие цитокининов и ЦСБ70 в регуляции транскрипции.
5. Изучить присутствие белков, иммунохимически и функционально родственных ЦСБбелков и у других представителей злаков: в ячмене, овсе ржи и пшенице, чтобы выяснить, является ли ЦСБ70 представителем семейства родственных цитокинин-связывающих белков злаков.
6. Для решения поставленных задач разработать: высокоэффективные методы выделения цитокининсвязывающих белков; высокоспецифичные и высокочувствительные иммунохимические и иммуноцитохимические методы анализа локализации ЦСБ70; методы оценки функциональной активности цитокинин - белковых комплексов.
1.3. Научная новизна.
Обнаружено, что в этиолированных проростках кукурузы, для которых характерны активные процессы деления и дифференцировки клеток присутствует цитокинин-связывающий белок 70 кД (ЦСБ70). Разработаны три оригинальные схемы выделения ЦСБ70, позволившие получить функционально активный белок. Разработан высокочувствительный и специфичный иммунохимический метод определения ЦСБ70, на основе представительной панели моноклональных антител к ЦСБ70. Впервые изучена локализация ЦСБ70 в органах и тканях растения, показано его преимущественное содержание в меристематических зонах корня и стебля этиолированного проростка кукурузы. Впервые получены данные о динамике содержания ЦСБпри развитии этиолированного растения кукурузы. Разработаны условия иммуноцитохимического определения ЦСБ70 с помощью световой и электронной микроскопии. Впервые с помощью иммуноцитохимических методов определена внутриклеточная локализация и показано присутствие ЦСБ70 в ядре, ядрышке, цитоплазме, пластидах: этиопластах, амилопластах и хлоропластах. Показана связь между содержанием ЦСБ70 в пластидах и процессами их дифференцировки и, в особенности, образования их внутренних мембранн. Показана и охарактеризована способность ЦСБ70 регулировать цитокинин-зависимо элонгацию транскрипции как в ядерной системе, содержащей хроматин и РНК полимеразу I так и в пластидной. Установлено, что локализация ЦСБ70 в клетках соответствует проявлению им функциональной активности в цитокинин-зависимой регуляции транскрипции. Белки, родственные ЦСБ70 кукурузы, по функциональной активности и иммунохимически, обнаружены в ячмене, ржи пшенице и овсе, что указывает на принадлежность к общему для злаков семейству цитокинин-связывающих белков, обеспечивающих цитокинин-зависимую регуляцию транскрипции. Разработанные методы анализа ЦСБ70 и его локализации в клетках растения могут быть использованы при исследовании других белков растений. Все полученные результаты носят приоритетный характер.
1.4. Научная и практическая значимость исследования.
Проведенные исследования имеют прежде всего фундаментальный характер, так как позволяют более полно представить картину функционирования цитокининов в растительной клетке. Разработанные методы фракционирования белков растений, методы отделения белков от вторичных метаболитов растений могут найти применение в биотехнологии растений при получении препаратов высокоочищенных белков из растений продуцентов. Разработанные методы иммунохимического и иммуноцитохимического анализа белков растений или в растительной клетке могут найти применение в научных исследованиях при изучении локализации или динамики содержания белков, как впрочем и любых других антигенов в процессе роста и развития растений.
Материалы, изложенные в диссертации, могут быть использованы в учебной работе, при обучении студентов и аспирантов и научных сотрудников, специализирующихся в области физиологии, биохимии растений и молекулярной биотехнологии.
1.5. Апробация работы. Материалы работы докладывались на следующих Российских и международных конференциях: Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология, 3-й Съезд общества физиологов растений 1997, Москва, Россия.
International conference Molecular, biochemical Physiological Aspects of Plant Science 1997, Moscow.
IV Съезд общества физиологов растений России 1999, Москва. Иммуноанализ регуляторов роста в решении проблем физиологии растений, растениеводства и биотехнологии. 2000, Уфа, Россия. The 12th Congress of the Federation of Europan Societies of Plant Physiology. Budapesht p.110, 2000. Plant Signaling Systems of Plant Cells 2001 Moscow. Signalling in Plant and animal Systems. 2001, Kyiv, Ukraine. V съезд Общества физиологов растений России, 2003, Пенза, Россия. VI съезд физиологов растений 2007, Сактывкар, Россия.
1.6. Публикации: По теме диссертации опубликовано 35 работ, из них 14 в Российских и международных журналах, списка ВАК.
2. Содержание работы.
2.1. Выделение и характеристика ЦСБ70.
Объект исследований - молодые этиолированные проростки кукурузы, в которых, как известно, происходит активное деление, рост и дифференцировка клеток, процессы, регулируемые цитокининами. В литературе описаны попытки выделения и исследования водорастворимых цитокинин-связывающих белков одно- и двудольных растений с высокой способностью связывать цитокинин [Fox, Erion 1975; Takegami, Yoshida, 1977; Polya, Devis, 1978; Polya, Bowman, 1979;
Harada, 1980; Klambt, 1981; Keim et al., 1981]. Полученные белки значительно вырьируют по молекулярной массе (от 4000Ч5000 дальтон в листьях табака до 180 000 в зародышах пшеницы) и по Кдис для цитокинина (10-5 -10-7 М). Данные о функции этих белков и их роли в регулируемых цитокининами процессах отсутствовали. Только для цитокинин-связывающего белка ЦСБ67, выделенного из первых листьев ячменя, была показана связь с цитокинин-регулируемым процессом - участие в регулируемом гормоном синтезе РНК [Каравайко и сотр. 1995; Kulaeva et al 1995; Селиванкина и сотр. 2001]. Ранее предпринимались попытки выделить ЦСБ из этиолированных проростков кукурузы [Romanov et al., 1988; Romanov et al., 1990; Taran et al., 1992].
Основным параметром, по которому проводился поиск, была способность белка взаимодействовать с гормоном. Авторы показали, что в этиолированных проростках кукурузы присутствует белок с цитокинин-связываюшей активностью, но его участие в проявлении регуляторного действия цитокининов показано не было. Поэтому первая стоявшая перед нами состояла в необходимости разработать метод препаративного выделения ЦСБ. Были разработаны три схемы выделения ЦСБ (табл.1).
Отличительной особенностью разработанных схем выделения ЦСБ70 явилось использование оригинальных способов отделения белков от вторичных метаболитов [Бровко и др. 1994 Бровко и др. 1996a; Brovko and Zagranichnaya 1998] и применение тандемной аффинной хроматографии, состоящей в комбинации хроматографии на иммобилизованном аденозине, который не активен как цитокинин, и зеатин-рибозиде - функционально активном цитокинине [Бровко и др. 1996б;
Brovko et al 2010].
Табл. 1. Схемы выделения ЦСБ из этиолированных проростков кукурузы.
Гомогенизация - экстракция, фильтрация растительного материала А. Выделение с использованием СА. Б. Центрифугирование 10000g А-1. Гидрофобная А-2. Осаждение СА - ПЭГ. Хроматография на колонках хроматография на Sephadex G25 и DEAE Sepharose Toyopearl HWОсаждение активных Хроматография на колонках Концентрирование на мембранах фракций СА. Sephadex G25 и DEAE YM10, гельфильтрация на Sepharose колонке Sephacryl S200 SF Тандемная аффинная хроматография Ado-Toyopearl и Zr-Toyopearl Сокращения: СА - сульфат аммония; Ado - аденозин; Zr - зеатин-рибозид. ПЭГ - полиэтиленгликоль.
В табл. 1 А-1 и А-2 представлены два разработанных способа отделения вторичных метаболитов от белков, один включал хроматографию гидрофобных взаимодействий на инертном носителе Toyopearl HW60, а второй - отделение вторичных метаболитов фракционированием сульфатом аммония в присутствии полиэтиленгликоля [Бровко и др., 1994, Бровко и др., 1996; Brovko and Zagranichnaya 1998]. Методы имеют общее значение и могут быть применены к выделению других белков растений. Методы позволяли перерабатывать от нескольких килограммов растительного материала по методу 1 и десятков килограмм по методу 2, но выход очищенного белка был небольшим, и это потребовало разработать более мягкий метод выделения ЦСБ. В третьем методе при выделении ЦСБ избегали растворов с высокой ионной силой, а для отделения вторичных метаболитов использовали традиционный подход - гельфильтрацию. Ранее было показано, что ЦСБ из этиолированных проростков кукурузы взаимодействует с рибозидом зеатина [Romanov et al., 1990], описано использование зеатинрибозида для аффинной хроматографии ЦСБ [Chen et al., 1980]. На этом было основано использование зеатинрибозида в качестве лиганда на аффинном сорбенте. Носителем был выбран Toyopearl HW65, обладающий низкой неспецифической сорбцией, механической прочностью, химической инертностью.
Цитокинины пуринового ряда являются производными аденина. Растительная клетка ЦСБ содержащие фракции содержит большое количество белков, имеющих сродство к аденину, такие белки было необходимо A 2NH2 CH2OH удалить до хроматографии на зеатин рибозид N H3C NH N Toyopearl (Zr-T). Для этого предварительно N N N N HO проводили аффинную хроматографию на аденозинN N O HO H H O Toyopearl (Ado-T) и затем, выделяли ЦСБ H H H H OH OH H H OH OH ЦСБхроматографией на сорбенте транс-зеатин рибозид Toyopearl (Zr-T). Емкость сорбента Ado-T была в A 2раз выше, чем емкость носителя Zr-T.
Рис. 1. Схема выделения ЦСБ70 тандемной аффинной хроматографией на последовательно соединенных колонках с аденозин Toyopearl (AdoT) и зеатинрибозид Toyopearl (Zr-T). Фракции, содержащие ЦСБ, наносили на колонку с сорбентом Ado-T и далее на колонку с носителем Zr-T.
Анализ ЦСБ после аффинной хроматографии с помощью ПААГ-ДСН показал, что белок содержал основную полипептидную полосу 70кД и минорный компонент 65 кД (рис 3). Для повышения выхода белка в ходе его выделения был разработан метод выделения ЦСБ, в котором для отделения вторичных метаболитов от белков использовали фракционирование сульфатом аммония в присутствии полиэтиленгликоля 6000 [Бровко и др., 1996; Brovko and Zagranichnaya 1998].
Рис. 2. Аффинная хроматография на зеатинрибозид Toyopearl. А. Профиль элюции, поглощение при 280 нм. 1 - несвязавшийся материал, 2 - элюция белков, неспецифически взаимодействующих с Zr- Toyopearl буфером содержащим 500мМ NaCl, 3 - элюция ЦСБ 25 мМ NaOH. Б. Цитокининсвязывающая активность фракций в имп/мин.
Столбики - связывание ЦСБ [3Н]дигидрозеатина. Основная цитокининсвязывающая активность определялась во фракции пика 3 элюата с Zr-T.
Метод позволил перерабатывать практически неограниченное количество растительного материала. Для предотвращения возможного протеолитического расщепления белка использовали набор ингибиторов протеаз, но в элюате после хроматографии на Zr-T также выявлялись полипептиды 70 кД и 65кД.
Рис. 3. ПААГ-ДСН анализ препарата ЦСБ после тандемной аффинной хроматографии на Zr-T. 1- препарат после осаждения 7,5% трихлоруксусной кислотой, 2 - стандарты, цифрами обозначены молекулярные массы белковмаркеров в кД.
Используя первый и второй методы, наработали достаточное количество ЦСБ70 для проведения функциональных исследований и получения моноклональных антител (МА).
В дальнейшем для минимизации деструкции белка, возможного образования олигомеров и других потерь белка на стадиях выделения, предшествующих аффинной хроматографии исключали процедуры, сопряженные с действием высоких концентраций соли (табл. 1-Б) и ввели ионообменную хроматографию, гельфильтрацию и далее аффинную хроматографию на Ado -Т и Zr-T. В результате получен ЦСБ70, по свойствам аналогичный выделенному по А-1 и А-2 табл.1, но выход белка был в 2 - 4 раза выше.
2.2. Цитокинин-связывающая активность ЦСБ70.
Важной характеристикой гормон-связывающих белков является специфичность и обратимость взаимодействия с гормоном. Для определения цитокинин-связывающей активности использовался метод преципитации гормон-рецептороного комплекса сульфатом аммония [Romanov et al. 1990]. Проводили два параллельных измерения связывающей активности при добавлении в среду меченного по тритию активного цитокинина [3Н]-дигидрозеатина или [3Н]транс-зеатина. Разница между тотальным связыванием меченного тритием гормона и взаимодействием белка с меченным гормоном, в присутствии 1000 кратного избытка немеченного гормона (дигидрозеатина или транс-зеатина соответственно) была обусловлена специфической гормон-связывающей активностью. При тестировании образцов с содержанием менее 50 мкг/мл белка в раствор добавляли белок-соосадитель (рис. 4), для него также определяли вклад во взаимодействие с гормоном. Один из обязательных критериев специфичности гормонсвязывающего белка состоит в том, что он взаимодействует с гормоном специфически и обратимо. В наших опытах по связыванию ЦСБ70 [3Н]-дигидрозеатина было установлено, что меченый цитокинин вытеснялся немеченным дигидрозеатином в концентрации 5x107М. Превышение специфического взаимодействия ЦСБ70 с меченным по тритию дигидрозеатином (рис. 4, 1) было больше таковое для опыта с вытеснением метки немеченым гормоном (рис. 4, 2) почти в четыре раза. Вклад белка соосадителя был незначительным, основная цитокинин-связывающая активность ЦСБ70 составляла 87% от общего связывания гормона (рис. 4, 3). Полученные результаты говорят о высокоспецифическом взаимодействии ЦСБ70 с активным цитокинином - дигидрозеатином. Аналогичные результаты были получены и при использовании меченного тритием транс-зеатина.
Рис. 4. Цитокинин-связывающая активность препарата ЦСБ70. 1.
ЦСБ (10 мкг/пробу) + [3Н]-дигидрозеатин + овальбумин (мкг/пробу). 2. ЦСБ + [3Н]-дигидрозеатин + 5х10-7 дигидрозеатин + овальбумин (50 мкг/пробу). 3. овальбумин (50 мкг/пробу) + [Н]-дигидрозеатин.
Мы использовали также антиидиотипические антитела для исследования гормон-рецепторных взаимодействий [Каравайко и сотр., 1995]. Анализ фракций элюата с Zr-T на взаимодействие с анти-идиотипическими антителами к транс-зеатину показал, что кривая данного взаимодействия совпадала с профилем элюции ЦСБ70, а тест на взаимодействие ЦСБ70 с Табл. 2. Вытеснение [3Н] транс-зеатина антиидиотипическими антителами оказался из комплекса с ЦСБ70 другими значительно чувствительней, чем тест по цитокининами, аденином, аденозином, основными классами гормонов растений связыванию ЦСБ70 с [3Н] дигидрозеатином и синтетическими аналогами гормонов.
[Бровко и др. 1996].
Наименование Вытеснение в % Специфичность взаимодействия ЦСБ70 с соединения Зеатин 90 - цитокининами исследовали по вытеснению[3Н] Дигидрозеатин 85 - транс-зеатина из комплекса белка с другими 6-бензиламинопурин 80 - Изопентениладенин 82 - активными цитокининами, аденозином, основными гормонами растений и Кинетин 75 - синтетическими аналогами гормонов. Было Зеатинрибозид 70 - Аденин 12 - обнаружено, что наиболее специфично ЦСБаденозин 7 - взаимодействовал с транс-зеатином, несколько 2,4D 5 - NAA 4 - 7 менее специфично с дегидрозеатином, ABA 3 - бензиламинопурином и изопентенил аденином.
GA3 2 - Кинетин, долгое время рассматривался как синтетический цитокинин, а в последнее время обнаружен в растениях и клетках животных [Levin and Momin 2010; Frbort et. al. 2011]. Он обладал несколько меньшей активностью связывания с ЦСБ70, чем рассмотренные выше соединения, но его уровень взаимодействия с ЦСБ70 оказался сравнимым с таковым для зеатин-рибозида. Важным явилось то, что степень вытеснения трансзеатина, из комплекса с ЦСБ70, аденином и аденозином была крайне низкой. Другие гормоны растений и их синтетические аналоги практически не вытесняли меченый транс-зеатин из его комплекса с ЦСБ70 (табл. 2), это показывает их неспособность конкурировать с цитокининами за место связывания у ЦСБ70. Таким образом, проделанная работа показала высокую специфичность взаимодействия активных цитокининов и ЦСБ70.
2.3. Участие ЦСБ70, выделенного из этиолированных проростков кукурузы, в регуляции транскрипции.
Одной из наиболее важных биологических функций цитокининов является регуляция биосинтеза РНК и белка в растительной клетке. Активность выделенного из этиолированных проростков кукурузы ЦСБ70, в качестве посредника в регуляции цитокинином синтеза РНК была изучена в системе синтеза РНК in vitro, содержащей хроматин и РНК полимеразу из листьев ячменя [Каравайко и др. 1995; Kulaeva el al., 1998]. В результате проведенных исследований было выяснено, что активирующее действие белка кукурузы проявлялось при его добавлении в реакционную среду в концентрации 1,2 мкг и менее и Табл. 3. Влияние ЦСБ70, выделенного из этиолированных проростков кукурузы и транс-зеатина, на синтез РНК в составляло 200-300% от контроля.
системе элонгации транскрипции, содержащей хроматин и ЦСБ70 активировал синтез РНК в РНК полимеразу I из зеленых листьев ячменя.
присутствии транс-зеатина в ЦСБ70 Концентрация [-32P УТФ] включение % (1.2 мкг) транс-зеатина в РНК (имп/мин/50 мкг концентрации от 10-8 до 10-6М, (M) ДНК) что сравнимо с таковыми для - - 19059262 1+ - 20965944 1ЦСБ67, выделенным из - 10-6 18849324 ячменя [Каравайко и др. 1995;
+ 10-8 380661944 2+ 10-7 415771977 2Бровко и др. 1996]. Эти + 10-6 577401728 3результаты являются подтверждением того, что ЦСБ70 из этиолированных проростков кукурузы функционально активен и способен участвовать в комплексе с цитокининами в активации транскрипции. Транскрипционная активность ЦСБ70 в системе синтеза РНК, содержащей хроматин и РНК-полимеразу из листьев ячменя, показывает, что белок функционально похож на ЦСБ67, выделенный из зрелых, закончивших рост листьев ячменя [Каравайко и др., 1995; Kulaeva et al., 1995].
Таким образом, можно сделать первый важный вывод, что в растениях есть ЦСБ, принимающие участие в цитокинин-зависимой регуляции транскрипции и можно предполагать, что они могут быть транскрипционными факторами или белками, регулирующими факторы транскрипции.
Важно, что ЦСБ присутствуют не только в клетках ячменя, закончивших рост [Каравайко и др.
1995; Kulaeva el al., 1998], но и в этиолированных проростках кукурузы, то есть клеточной системе с активным делением, ростом и дифференцировкой клеток [Бровко и др. 1996]. Узнавание ЦСБ70 в системой, содержащей хроматин и РНК- полимеразу из листьев ячменя, подчеркивает отсутствие видовой специфичности данных белков. Эти факты, а также данные [Selivankina et al 2001] о наличии ЦСБ, участвующих факторов цитокинин-зависимой регуляции элонгации транскрипции у двудольных растений, позволяют заключить, что в растениях присутствует класс родственных цитокинин-зависимых факторов элонгации транскрипции или белков, регулирующих эти факторы, которые, подобно рецепторам стероидных гормонов животных, могут участвовать в регуляции транскрипции.
2.4. Исследование специфичности ЦСБ70 по отношению к цитокининам и другим соединениям в тесте регуляции элонгации транскрипции.
Следующей задачей было исследование влияния активных и неактивных цитокининов на функцию ЦСБ70 в регуляции элонгации транскрипции. Полученные результаты (табл. 4) хорошо коррелируют с результатами о конкурентном вытеснении транс-зеатина из его комплекса с ЦСБ(табл.2). Транс-зеатин, изопентенил аденин, 6-бензил-аминопурин и кинетин проявляли высокую удельную активность как по вытеснению меченного транс-зеатина из гормон-рецепторного комплекса (табл.2), так и по активации, в комплексе с ЦСБ70 элонгации транскрипции в системе синтеза РНК in vitro, тогда как добавление соединений, не обладающих цитокининовой активностью: аденина, транс-зеатин О-глюкозида и бензилтиопурина - не оказывало влияния ни на вытеснение транс-зеатина из комплекса с белков ни на реакцию синтеза РНК in vitro.
Полученные результаты позволяют заключить, что связывание функционально активных цитокининов с ЦСБ70 приводит к образованию гормон-белкового комплекса, обладающего функциональной активностью в регуляции транскрипции.
На этом этапе Табл. 4. Влияние ЦСБ70, природных цитокининов, их производных, активных и неактивных аналогов и аденина на синтез РНК в системе исследований элонгации транскрипции, содержащей хроматин-связанную РНК ЦСБ70 был полимеразу из зрелых зеленых листьев ячменя.
охарактеризован Соединение Концентра [-32P УТФ] включение в % ция (M) РНК (имп/мин/50 мкг ДНК) по способности Контроль - 10731397 1специфически Контроль (- - 10301416 ЦСБ70) взаимодействоват Транс-зеатин 10-7 319201309 2ь с цитокининами, Изопентенриладен 10-7 251421055 2ин показана его 6- 10-7 289311128 2высокая бензиламинопурин Кинетин 10-7 22261957 2избирательность Аденин 10-7 - 10-5 Нет эффекта - по отношению к Цис-зеатин-О- 10-7 - 10-5 Нет эффекта - глюкозид транс-зеатину, и Бензилтиопурин 10-7 - 10-5 Нет эффекта - также показано, что он способен цитокинин-зависимо регулировать элонгацию транскрипции в гетерологичной системе.
3. Иммунохимические исследования ЦСБ70.
Для анализа роли ЦСБ в этиолированном проростке кукурузы, установления связи между ЦСБ70 и регулируемыми цитокининами биохимическими процессами, исследования органной и клеточной локализации ЦСБ70 в растении были проведены иммунохимические исследования ЦСБ70.
3.1. Получение моноклональных антител к ЦСБ70.
Попытка получения рекомбинантных миниантител к одному из растительных белков - актину показала возможность такого подхода [Костеша и Табл. 5. Характеристика сотр 2005], но получаемые антитела плохо хранились моноклональных антител к ЦСБи поэтому усилия были сфокусированы на получении Назв Класс/подкл Константа ание МА асс, тип легкой аффинности моноклональных антител (МА). Для выделения МА цепи наращивали гибридомы в перитонеальной полости 14A4 IgG1 1x111B1 IgM 1x1мышей [Baumgarten and Peters 1992]. Очистку МА к 199 IgM 1x1ЦСБ70 проводили фракционированием сульфатом 36 IgM 1x18 IgG1 1x1аммония и ионообменной хроматографией. Выход 15 IgM 1x1МА составлял от 1 до 2 мг из 1мл асцитной 13D3 IgG1 1x1520 IgG1 1x1жидкости. Аффинность МА к ЦСБ-70 определяли по 11B3 IgM 1x1методу Beaty [Beaty 1987]. Характеристика МА 17 IgG1 1x1представлена в табл.5, более половины антител были иммуноглобулинами класса М, они имели высокий уровень аффинности (табл. 5).
Для определения содержания ЦСБ70 в органах этиолированного проростка кукурузы необходимо было разработать высокочувствительный и специфичный способ анализа.
3.2. Эпитопный анализ ЦСБ70.
Эпитопный анализ важен при изучении структуры или центра связывания рецептора с лигандом. Он позволяет получить сведения о том, насколько близко на молекуле расположены эпитопы для различных МА. Это имеет большое значение для работ по созданию тест-системы количественного анализа содержания ЦСБ70 в органах и тканях растения, а также и при иммуноцитохимических исследованиях. Эпитопное картирование проводили методом прямого ИФА. ЦСБ70 сорбировали на планшет, препараты МА попарно смешивали и вносили в лунки с сорбированным ЦСБ70. В другие лунки вносили только по одному из трестируемых МА. Если оба антитела направлены против одного и того же эпитопа или их эпитопы расположены близко друг к другу, то сигнал от смешанных антител был незначительно выше, чем сигнал от индивидуального антитела. В случае, если МА узнавали далеко отстоящие друг от друга эпитопы и не конкурировали за участок взаимодействия, сигнал от смешанных МА был значительно выше.
Для определения возможной конкуренции между МА за место связывания использовали метод, называемый "индексы аддитивности" (A.I.) [Friquet et all. 1983].
Если А.I. меньше 50%, это значит, что антитела конкурируют за один и тот же или близкие центры связывания. Если А.I. больше 50% - МА направлены против разных эпитопов. Из данных табл. 6 видно, что большинство полученных МА распознают близко расположенные эпитопы на молекуле ЦСБ70. Возможно, что Табл. 6. Определение индекса аддитивности некоторые эпитопы расположены моноклональных антител к ЦСБ70. Представлены данные настолько близко (А.I.<10%), усиления сигнала вторым антителом, в процентах к сигналу первого.
например, для пар антител 15 и 17 8 11В3 13Д3 15 11В1 36 520 113Д3, 13Д3 и 11В3, что МА конкурируют за эпитоп. Нами 15 11В3 71 были обнаружены пары МА, не 13Д3 38 0,9 влияющие на взаимодействие 15 41 20 5,6 9,11В1 32 32 3,6 25,4 27,каждого из МА с ЦСБ70.
36 40 47 32,6 47 11,8 Например, пары 11В3 и 17, 199 и 520 5,8 32 24 15 19 6 199 4 17 12,6 33,8 54 39 36 4,15, 15 и 14А4 имеют А.1. > 50%.
14А4 26 20 8,63 25 100 23 14 15 Все остальные МА имели индекс аддитивности, промежуточный между 10 и 50%.
Во многих случаях взаимодействие МА с антигенами зависит от взаимодействия антигена с лигандом. Возможно, что МА, полученные к белку, не содержащему лиганд или гормон не будут реагировать с комплексом гормон-белок (ЦСБ70). Для эффективного использования МА в иммунохимических и иммуноцитохимических тестах предстояло определить, как МА могут влиять на взаимодействие ЦСБ70 с гормоном, и как гормон может влиять на взаимодействие антител с ЦСБ70.
3.3. Анализ влияния транс-зеатина на образование комплекса ЦСБ70 - антитело.
Влияние МА и зеатина на образование комплекса ЦСБ70 - антитело исследовали методом ИФА.
ЦСБ70 сорбировали на планшет, затем добавляли МА, содержащие определенную концентрацию гормона, и далее определяли уровень взаимодействия МА с антигеном. Результаты экспериментов демонстрируют разные типы влияния транс-зеатина на реакцию антиген-МА. МА могут изменять конформацию молекулы, и ее способность связывать гормон может улучшиться, либо ингибировать взаимодействие ЦСБ70 с зеатином. Рис. 5 демонстрирует несколько разных типов влияния транс-зеатина на реакцию антиген - антитело в условиях прямого ИФА. Как пример плавного разрушения транс-зеатином комплекса ЦСБ70 с МА 14А4, 11В1, 8, 520, 199 и 15. А для МА 520 и 8 можно говорить об ингибировании транс-зеатином взаимодействия МА с ЦСБ70. В случае МА 33 зеатин практически не влиял на реакцию антиген-антитело, а в случае МА 13Д3 добавление транс-зеатина, вероятно, приводило к усилению взаимодействий МА с ЦСБ70.
Рис. 5. Влияние транс-зеатина на реакцию МА-ЦСБ70 (МАТ это МА) в условиях прямого ИФА. Квадраты - контроль МА + растворы зеатина. Крестики - только растворы транс-зеатина. Треугольники - ЦСБ70 + транс-зеатин, концентрация транс-зеатина в молях.
Необходимо отметить, что основная часть антител к ЦСБ70 была в этом тесте функционально активна, их взаимодействие с ЦСБ70 завесило от наличия в среде транс-зеатина. Полученные данные также показывают, что взаимодействие ЦСБ70 с транс-зеатином приводит к конформационным изменениям белка, достаточным для ингибирования взаимодействия ЦСБ70 с антителами.
3.4. Создание тест-системы для анализа ЦСБ70 на основе сандвич-ИФА в сочетании с стрептавидин-биотиновой системой.
Учитывая низкое содержание ЦСБ70 в экстрактах этиолированного проростка, необходимо было разработать высокочувствительный и специфичный метод его обнаружения и анализа содержания. Наиболее подходящим методом является сандвич-вариант ИФА. При его проведении на поверхности планшета сорбировали первые МА, затем в лунки вносили анализируемую смесь белков, при этом на МА остаются антигены, узнаваемые первыми МА. Далее в лунки вносили вторые МА - биотинилированные; в результате количество провзаимодействовавших верхних МА соответствует количеству антигена в анализируемой смеси. Условием использования этого метода являлся подбор пары МА к достаточно удаленным друг от друга эпитопам белка и доступность этих эпитопов для МА в условиях естественного окружения антигена другими белками.
Подбор пары МА проводили, анализируя ЦСБ70 во фракциях, полученных при гельфильтрации белков этиолированных проростков кукурузы на Sephacryl S-200. Была найдена пара из МА №8 и 520, которая позволила успешно проводить определение ЦСБ70 в элюате растительных белков с колонки Sephacryl S-2(рис.6, В-1).
Рис. 6. Подбор пары антител для определения ЦСБ70 сандвич вариантом ИФА. А - Профиль элюции белков этиолированных проростков кукурузы с колонки Sephacryl S-200 и Hзеатин-связывающая способность полученных белковых фракций. Сплошная линия - профиль элюции белков с колонки, регистрация при 2нм. Специфическая зеатин-связывающая способность представлена столбиками. Б:
Иммуноблот анализ фракций I, II и III. В - иммуноферментный анализ ЦСБ70 в элюате с колонки Sephacryl S-200. Распределение ЦСБи его фрагментов, выявляемых с помощью СтБС-ИФА во фракциях. a - при удачном выборе пары антител; b - при неудачном выборе пар антител; c - уровень фона.
Анализ кривой 1 (рис.6, В-1) показал, что сэндвич-вариант ИФА в сочетании со стрептавидинбиотиновой системой (СтБС) обнаруживал белки с позитивной реакцией на МА к ЦСБ70 в высокомолекулярной фракции (фракция 1- 200-150 кД), во фракции 2, содержащей белки 70-65 кД и во фракции 3, содержащей низкомолекулярные белки около 30 кД. Белки каждой из этих фракций были проанализированы с помощью имуноблотинга с применением СтБС (рис. 6-Б).
Полученные результаты показали, что в первой фракции (150-200 кД) реакция с МА к ЦСБобнаружила полипептиды 70 и 64 кД. По-видимому, в растительном экстракте они образовывали гомо- или гетеробелковые комплексы. Во второй фракции (65-70 кД) эти же полипептиды присутствовали в мономерной форме, а в третьей фракции МА выявили полипептид с молекулярной массой около 30 кД, который мог быть продуктом частичной деградации ЦСБ70 в клетке или получался в ходе очистки. Анализ соответствия между узнаванием белков МА к ЦСБи их способностью специфически взаимодействовать с Н-зеатином показал (рис.6-В), что основное связывание зеатина происходило во фракции 2, содержащей ЦСБ70 в мономерной форме. Фракция 1 высокомолекулярных белков имела низкую цитокинин-связывающую активность, а фракция 3, содержащая полипептид с мол. м 30 кД, опознаваемый антителами против ЦСБ70, Н-зеатин не связывала. По-видимому, этот белок представляет собой продукт частичной деградации ЦСБ70, потерявший способность связывания гормона, но сохранивший эпитопы, узнаваемые МА. В результате проведенных экспериментов разработан высокочувствительный метод определения ЦСБ70, основанный на использовании сэндвичварианта ИФА в сочетании со стрептавидин-биотиновой системой. Полученные МА к ЦСБбыли специфичны и взаимодействовали в растительном экстракте в сандвич ИФА и иммуноблотинге только с исследуемым белком. Необходимо отметить, что в паре МА 520-8, при анализе аддитивности, второе антитело увеличивало индекс аддитивности почти на треть (табл. 6), на образование комплекса МА-ЦСБ70 влиял транс-зеатин (рис.5), при этом оба антитела по результатам иммуноблотинга были высокоспецифичны и узнавали только три полипептида с молекулярной массой 70, 65 и 30 кД (рис 6-Б).
3.5. Влияние антитела к ЦСБ70 на его способность регулировать элонгацию транскрипции в системе in vitro.
Полученные результаты позволяют предположить, что антитела к ЦСБ70 могут не только регулировать взаимодействие ЦСБ70 с гормоном, но и воздействовать на его влияние на элонгацию транскрипции. Для выяснения этих вопросов Селиванкина С.Ю. любезно согласилась проверить способность различных антител к ЦСБ70 активировать элонгацию транскрипции белком ЦСБ67, выделенным из зеленых листьев ячменя, в транскрипционной системе, содержащей хроматин из зеленых листьев ячменя. Во-первых, было необходимо проверить, взаимодействуют ли антитела, полученные к ЦСБ70, из 4-х дневных этиолированных проростков кукурузы, с ЦСБ67 из зеленых листьев ячменя.
Рис. 7. Анализ взаимодействия ЦСБ70 ячменя моноклональными антителами к ЦСБ70 кукурузы. Линии 1 - 4 проявление ЦСБ67 различными антителами.
Как видно на рис. 7, все проверенные в тесте иммуноблотинга МА к ЦСБ70 узнавали ЦСБ67. Препарат ЦСБ67 был любезно предоставлен Н.Н.
Каравайко ИФР РАН.
В тесте регуляции элонгации транскрипции с помощью ЦСБ67 из зеленых листьев ячменя и транс-зеатина был использован ряд антител к ЦСБ70 кукурузы. В табл.приводятся данные, полученные для пяти МА. МА 14А4 обладало незначительным ингибирующим воздействием на активацию элонгации транскрипции ЦСБ67 в присутствии трансзеатина. Наибольший интерес представляло МА 15, которое, в значительной мере, усиливало элонгацию транскрипции в Табл. 7. Влияние МА к ЦСБ70 и транс-зеатина на присутствии ЦСБ67 и транс-зеатина.
элонгацию транскрипции с помощью ЦСБ67, из Можно предположить, что в зеленых листьев ячменя, в системе, содержащей РНК полимеразу I и хроматин из зеленых листьев случае активации транскрипции роль ячменя.
МА может состоять как в регуляции ЦСБ67 Транс МА к [3H] АМФ % взаимодействия белка с гормоном, зеатин ЦСБ70 включение в РНК (cpm/50мкг РНК) так и в фиксации конформаций - - - 10275780 1ЦСБ67, делающих его более + + - 17515944 1+ + 14A4 7661548 активным в данной системе реакций.
+ + 18 12215641 1Таким образом, показано, что + + 520 11483211 1- - - 9010833 100 полученные к ЦСБ70 МА проявляли + + - 15479922 1активность, непосредственно + + 15 250381987 2связанную с функцией белка:
+ + 13D3 13523689 1регулировали взаимодействие ЦСБ70 с гормоном - транс-зеатином (Рис. 5) и регулировали активацию элонгации транскрипции при использовании в качестве активатора ЦСБ67 из зеленых листьев ячменя и транс-зеатина (табл. 7).
3.6. Исследование локализации ЦСБ70 в меристеме и зоне растяжения корня.
Представляло несомненный интерес выяснить, есть ли соответствие между содержанием ЦСБ70 в органах и тканях растений и активностью происходящих в них регулируемых цитокининами процессов. В качестве растительного материала для анализа локализации ЦСБбыли выбраны 4-х дневные этиолированные проростки кукурузы, для них характерны активные процессы деления клеток и дифференцировки тканей, то есть как раз те процессы, которые и регулируются цитокининами. Одним из процессов, регулируемых цитокининами, является деление клеток.
Рис. 8. Сравнение содержания ЦСБ70 в меристеме и зоне растяжения корней этиолированных проростков кукурузы в возрасте 4-х дней. Представлено относительное содержание ЦСБ70 в расчете на единицу сырого веса. I - меристема, II - зона растяжения корня.
Для проверки возможного участия ЦСБ70 в этом процессе решили сравнить его содержание в зонах растущего кончика корня этиолированного проростка кукурузы. Выбор кончика корня в качестве объекта исследования был обусловлен тем, что в нем зона клеточных делений и зона роста клеток пространственно разграничены. Для анализа у корней 4-х Табл. 8. Число клеток и содержание общего дневных этиолированных проростков отделяли белка в меристеме и зоне растяжения корней этиолированных меристему (до 2 мм от кончика корня) и зону проростков кукурузы в возрасте 4-х дней.
растяжения (от 2 до 7 мм от кончика корня ). В Число клеток, Содержание указанных зонах корня было проанализировано Зона корня млн/г сырого белка, мг/г веса сырого веса относительное содержание ЦСБ70, в пересчете Меристема 110.75.1 261.на единицу сырой массы меристема содержала Зона 16.01.9 9.70.растяжения в 17 раз больше ЦСБ70, чем зона растяжения корня (рис. 8). Для выяснения, не обусловлено ли такое резкое различие всего лишь высокой оводненностью клеток зоны растяжения, существенную часть сырой массы которых составляют вакуоли, указанные зоны корня были охарактеризованы по таким признакам, как число клеток в г сырой массы и суммарное содержание белка в 1 г сырой массы. Из табл. 8 видно, что единица сырой массы зоны растяжения корня содержит существенно меньше клеток, чем меристема, за счет быстрого роста клеток после их выхода из меристемы. На единицу сырой массы зона растяжения содержала меньше белка, чем меристема. Полученные данные позволили сравнить содержание ЦСБ70 в клетках меристемы и зоны растяжения и определить изменение отношения количества ЦСБ70 к суммарному количеству клеточного белка при переходе клеток из зоны деления в зону растяжения (рис. 9).
Рис.9. Сравнение содержания общего белка и ЦСБ70 в меристеме и зоне растяжения корня.
Общий белок в расчете на 106 клеток (А);
ЦСБ-70 в расчете на 106 клеток (Б); ЦСБ-70 в расчете на мг общего белка (В). I - меристема, II - зона растяжения.
Клетка зоны растяжения содержала почти в три раза больше общего белка, чем клетка меристемы (рис. 9-А) и, вместе с тем, она содержала в два раза меньше ЦСБ70 (рис. 9-Б). Расчет содержания ЦСБ70 в меристеме и зоне растяжения корня на единицу общего белка показал, что средняя меристематическая клетка в 6 раз больше насыщена ЦСБ70, чем клетка зоны растяжения (рис. 9-В).
Таким образом анализ распределения ЦСБ70 в меристеме и зоне растяжения убедительно показал, что наибольшее его содержание в зонах клеточных делений - в меристематических тканях корня.
3.7. Исследование локализации ЦСБ70 в этиолированном проростке кукурузы.
Задачей данного этапа работы было определить содержание ЦСБ70 в частях этиолированного проростка кукурузы и проследить возможную связь между содержанием ЦСБ70 и ростовыми и дифференцировочными процессами, происходящими в ткани. Для 4 этого у проростка отделяли мезокотиль, узел, колеоптиль и первый лист, а у корня брали меристему (до 2 мм от кончика корня), зону растяжения (от 2 до 7 мм от кончика корня), зону дифференцировки (10 мм) и зону образования боковых корней (10 мм) и определяли в них содержание ЦСБ-70 (рис. 10).
Рис. 10. Схематическое изображение проростка кукурузы. 1 - зерно, 2 - мезокотиль, 3 - узел, 4 - колеоптиль, 5 - первый лист, заключенный внутри колеоптиля; 6 - корень.
Как видно из рис. 11, максимальное количество ЦСБ70 было обнаружено в меристеме корня. Содержание ЦСБ70 в зоне элонгации корня было в 17 раз меньше, чем в меристематической зоне, а в зоне дифференцировки и зоне формирования боковых корней содержание рецептора было меньше по сравнению с зоной элонгации на 41% и 58% соответственно. В надземных частях проростка максимальным было содержание ЦСБ70 в узле, что соответствует происходящим в нем процессам активных клеточных делений. В листе и колеоптиле, по сравнению с узлом, содержание рецептора было меньше на 57% и 75% соответственно. Для реального представления роли ЦСБ70 в процессах деления и дифференцировки растительных клеток необходимо оценивать его содержание не только в сыром весе ткани, но и знать его содержание в пересчете на клетку и на белок ткани. Табл. 9 показывает, что органы и части растения содержат не одинаковое количество клеток на грамм сырой массы, содержание белка в клетках также различалось. То, что в мезокотиле ЦСБ70 практически отсутствует, подтверждает сделанное ранее предположение о том, что ЦСБ70 имеет отношение к регуляции клеточных делений, а в мезокотиле митотическая активность клеток в 4-х дневном этиолированном проростке практически отсутствовала (рис.11). Высокое содержание ЦСБ70 в зоне растяжения клеток указывает на связь этого процесса с ЦСБ70, в зонах образования боковых корней имеются очаги митотической активности, которые и могут быть местами повышенного содержания ЦСБ70.
Рис.11. Относительное содержание ЦСБ70 в тканях 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы в расчете на 1 г сырого веса. I - меристема, II - зона растяжения корня, III - зона дифференцировки, IV - зона образования боковых корней, V - мезокотиль, VI - узел, VII - колеоптиль, VIII - первый лист.
На рис. 12 представлено распределение ЦСБ70 по проростку в расчете на клетку в сравнении с содержанием в клетках общего белка. Максимальное содержание ЦСБпо этому параметру - в меристеме корня, хотя общее содержание белка в клетках зоны роста корня существенно выше.
Рис. 12. Распределение ЦСБ70 в 4-х дневном этиолированном проростке кукурузы в сравнении с содержанием в клетках общего белка. Темные столбики - содержание ЦСБ70 в условных единицах, в расчете на 106 клеток. Светлые столбики - содержание общего белка в расчете на 106 клеток. I - меристема корня, II - зона растяжения, III - зона дифференцировки, IV - зона образования боковых корней, V - мезокотиль, VI - узел, VII Цколеоптиль, VIII - первый лист.
Информативно отношение количества ЦСБ70 к количеству суммарного белка в клетках, эта величина в узле примерно Табл. 9. Число клеток и содержание белка в частях 4-дневного вдвое больше, чем в этиолированного проростка кукурузы колеоптиле (рис. 12). Это Число клеток, Содержание белка Части проростка млн/г сырой мг/г сырой говорит о более высокой пкг/клетку массы массы концентрации ЦСБ70 в Меристема корня 129,18,4 296,1 2251,Зона растяжения цитоплазме и органеллах 15,92,6 9,70,1 6100,Зона 9,80,9 4,40,3 4484,клеток узла по сравнению с дифференциации клетками колеоптиля.
Зона образования 120,4 5,10,5 42312,боковых корней Именно в узле Мезокотиль 9,81,1 7,00,5 71179,сосредоточены делящиеся Узел 801,9 20,30,6 253Колеоптиль 14,21,8 110,5 816клетки, таким образом, и в Лист 243,75,3 33,22 1362,корне, и в надземной части проростка наибольшая концентрация ЦСБ70 сосредоточена в местах клеточных делений.
Первый лист проростка полностью заключен внутри колеоптиля. Клетка первого листа содержит почти и в два раза меньше белка, чем клетка узла. Содержание ЦСБ70 в первом листе в пересчете на 1 нг клеточного белка примерно на треть ниже, чем в колеоптиле. Данные проведенного анализа, отражают усредненное содержание ЦСБ70 в клетках листа, и на самом деле ЦСБ70 может быть распределен в клетках листа неравномерно.
Б А Рис. 13. Анализ содержания в условных единицах ЦСБ-в 4-х дневном этиолированном проростке кукурузы в расчете на 1 нг суммарного клеточного белка: А, Б - вставка для V - VIII, увеличено в 5 раз от А. I - меристема корня, II - зона растяжения, III - зона дифференцировки, IV - зона образования боковых корней, V - мезокотиль, VI - узел, VII Цколеоптиль, VIII - первый лист.
Таким образом, установлено, что в этиолированном проростке кукурузы клетки с наибольшей концентрацией ЦСБ70 расположены в меристеме корня. В надземной части проростка максимальное содержание ЦСБ70 обнаружено в узле, а минимальное - в мезокотиле. Концентрация ЦСБ70 в клетках тканей хорошо коррелирует с активностью в них клеточных делений.
3.8. Изучение динамики изменения содержания ЦСБ70 в различных органах проростка в процессе его роста.
На следующем этапе исследовали изменение количества ЦСБ70 в различных частях проростка во время развития с 3 по 5 день. В изучаемый период в меристеме корня сохранялось очень высокое содержание ЦСБ70 (рис. 14 и рис. 15), что соответствует поддержанию в меристеме высокого уровня клеточных делений. Наименьшим, на протяжении всего изученного периода, было содержание ЦСБ70 в мезокотиле. В узле проростка количество выявляемого ЦСБуменьшалось. Узел представляет собой наиболее сложный по составу формирующих его клеток орган. Здесь сосредоточено несколько видов меристем. Клетки части узла, прилегающей к мезокотилю, делясь, переходят в состав мезокотиля [Александров 1966; Esau 1977]. К пятому дню рост мезокотиля замедляется вследствие снижения митотической активности клеток соответствующей зоны узла. Это один из факторов, объясняющих наблюдаемое уменьшение уровня ЦСБ70 в узле. Кроме того, узел является местом, от которого начинается рост придаточных корней проростка.
Рис. 14. Анализ изменения содержания ЦСБ70 в этиолированном проросте кукурузы в пересчете на 1 г сырой массы. 1 - меристема корня, 2 - мезокотиль, 3 - узел, 4 - колеоптиль, 5 - первый лист. a, b, c - 3, 4, и 5 день - соответственно.
На этапе третьего дня развития проростка точки роста боковых корней представлены клетками меристематических зон будущих корней, позднее, по мере деления этих клеток, начинают формироваться другие зоны, представленные клетками более крупных размеров и с более низким содержанием ЦСБ70. Таким образом, оценивая среднюю концентрацию ЦСБ70 в клетках узла в ходе роста проростка, обнаружили, что уровень выявляемого ЦСБ70 становится ниже, но и доля клеток с высокой митотической активностью по отношению к общему количеству клеток также уменьшается. В первом листе не было отмечено значительных изменений уровня содержания ЦСБ70.
Рис.15. Анализ изменения содержания ЦСБ70 в этиолированном проростке кукурузы в расчете на 106клеток.
1 - меристема корня, 2 - мезокотиль, 3 - узел, 4 - колеоптиль, 5 - первый лист. a, b, c - 3, 4, и 5 день - соответственно.
Таким образом, на протяжении всего рассмотренного периода меристема корня и мезокотиль характеризуются постоянным уровнем ЦСБ70, что можно объяснить постоянством функций клеток этих тканей проростка. Узел характеризуется уменьшающимся количеством ЦСБ70, что можно объяснить сокращением в нем числа клеточных делений, а также развитием тканей различных типов.
Для более полной характеристики ЦСБ70 и его роли в растении важным было выяснить, как связана его локализация с Табл. 10. Анализ содержания цитокининов в меристеме и зоне растяжения кончика корня.
содержанием активных Содержание Содержание цитокининов в тканях цитокининов, цитокининов, Форма нг/г сырого веса нг/106 клеток растения. (Эту работу нам цитокинина зона зона любезно помогла выполнить меристема растяжен меристема растяжен ия ия Г.Р. Кудоярова ИБ РАН, г.
Зеатин 124.323.4 40.15.3 1.10.2 2.50.УФА).
Зеатин145.738.5 67.411.2 1.30.3 4.20.рибозид Как показано в табл.10, Зеатин104.422.1 63.49.5 0.90.2 4.00.6 меристема содержит, в нуклеотид Зеатин-N9- расчете на единицу сырой 97.313.4 53.67.5 0.90.1 3.40.глюкозид массы, существенно больше всех форм цитокининов, чем зона растяжения, при этом наибольшая разница в содержании, обнаружена для физиологически активного цитокинина - транс-зеатина. Таким образом, концентрация цитокининов в единице объема двух типов клеток меристемы и зоны растяжения была существенно выше в меристеме. При расчете на клетку картина менялась, что связано с увеличением в несколько раз размера клеток в зоне растяжения по сравнению с размерами клеток в меристеме. В клетках, находящихся на разной стадии развития, от стволовых, находящихся в стадии дифференцировки и до стареющих клеток биосинтез белка и его деградация происходят с разной скоростью. Ннельзя исключить, что в них может определяться не только полноразмерный белок ЦСБ70, но и его фрагменты, что может искажать реальную картину. Поэтому, проверку того, что в используемом в работе варианте сандвич ИФА определяли ЦСБ70, а не его фрагменты, проводили с помощью иммуноблотинга. Образцы растительных экстрактов из органов и частей растения для электрофореза в ДСН ПААГе, на основании данных ИФА, готовили так, чтобы они имели одинаковое содержание ЦСБ70.
Рис. 16. Анализ иммуноблотингом содержания ЦСБ70 в органах 4-х дневных этиолированных растений кукурузы.
Цифры - анализируемые органы и ткани: 1- меристема корня; 2 - зона элонгации корня; 3- зона дифференцировки корня; 4 - зона формирования латеральных корней; 5 - первый лист; 6 - узел; 7 - колеоптиль; 8 мезокотиль; 9 - стандарты молекулярных весов; стрелкой показано положение ЦСБ70.
Из результатов анализа (рис.16) следует: во всех тканях ЦСБ70 присутствует в виде белка имеющего молекулярную массу 70 кД, полосы 65 и 30 кД не выявлялись. Существенно, что данные сандвич ИФА отражают реальную картину содержания ЦСБ70 в органах и частях растения. Проведенные исследования показали, что наибольшее количество ЦСБ70 в пересчете на клетку содержится в меристематических тканях кончика корня и узла. При этом сами эти органы растения неоднородны по составу клеток. Так, в кончике корня, наряду с активно делящимися клетками, находятся и клетки покоящегося центра, с очень низклй активностью деления, в узле, как уже отмечалось выше неоднородность клеток очень велика.
Полученные результаты дают общее представление о содержании ЦСБ70 в тканях. Для лучшего понимания роли ЦСБ70 и его участия в программах развития клетки, проходящих под контролем цитокининов, важно знать внутриклеточную локализацию ЦСБ70. Мало знать, что белок участвует в регуляции транскрипции; его внутриклеточная локализация должна соответствовать компартментам клетки, в которых происходят регулируемые процессы. Это обусловило необходимость проведения детальных иммуноцитохимических исследований локализации ЦСБ70 в клетках растения кукурузы.
4. Иммуноцитохимические исследования ЦСБ70.
Иммуноцитохимические исследования активно проводятся при изучении локализации белков и часто служат диагностическими и прогностическими маркерами ряда процессов у животных и человека [Pelletier and Morel 1984].
4.1. Подбор условий для иммуноцитохимического исследования ЦСБ70.
Особенностям исследования растений и, в частности, растения кукурузы с помощью иммуноцитохимических методов, посвящено много руководств и публикаций [Timms 1986; Van Lammeren 1986; Freeling and Walbot 1994; Melan 1994; Roland and Vian 1991]. Тем не менее в каждом отдельном случае необходимо проводить предварительные исследования по подбору условий фиксации, полимеризации смолы, использования метки для визуализации продуктов иммунохимических реакций. Важными являются правильный подбор условий контроля, обеспечивающего оптимальное соотношение сигнал - фон. Другим параметром, определяющим успех метода, является конструирование каскада усиления сигнала путём создания мультимерного комплекса стрептавидина с биотинилированными антителами. Это позволяет при низком уровне неспецифических реакций на контрольных срезах получить хороший сигнал в опыте. При электронной микроскопии чувствительность стрептавидин-биотиновой системы (коньюгата стрептавидина с коллоидным золотом) оказалась достаточной [Васильева и сотр 2008].
4.2. Анализ специфичности и способности антител узнавать ЦСБ70 на срезах.
При исследовании локализации ЦСБ70 использовали МА [Заграничная и др. 1997]. Они имели близкие константы аффинности, но обладали разной специфичностью в активации элонгации транскрипции с участием ЦСБ67 [Kulaeva O.N., 1998]. В наших исследованиях МА по-разному взаимодействовали с ЦСБ70 в присутствии транс-зеатина (рис. 5) и различались по индексам аддитивности (табл. 6). Мы предположили, что и в иммуноцитохимических реакциях антитела могут не одинаково взаимодействовать с ЦСБ70. Кроме того, у функционально близкого ЦСБбыло показано существование аналога с хлоропластной локализацией [Селиванкина и соавт., 1997;
Kulaeva et all., 2000]. Можно было предположить, что и ЦСБ70 может иметь различную внутриклеточную локализацию и важно было проверить, как антитела узнают белок на срезах в разных органеллах клетки. В результате проведенных исследований было установлено, что среди полученных к ЦСБ70 МА есть две группы МА, отличающиеся по их способности узнавать белок в электронной и световой микроскопии на срезах органов проростка. МА первой группы (11В1, 11В3, 13D3, 15) обнаруживали ЦСБ70 в ядрах и цитоплазме, а антитела второй группы (83, 14А4, 523, 36), кроме взаимодействия с ЦСБ70 в ядрах, ядрышке и цитоплазме, эффективно выявляли его в пластидах [Brovko et al 2010].
Различие способности двух групп МА выявлять ЦСБ70 в разных компартментах клетки первого листа и корневого чехлика кукурузы показано на рис. 17. и табл. 11. Контрольная сыворотка, не содержащая МА к ЦСБ70, давала лишь незначительное окрашивание при световой микроскопии и незначительное количество золотых частиц в клетках.
Табл. 11. Распределение золотых частиц на 1 m2 в компартментах клеток листа и клетках чехлика корня 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы. Данные получены иммуноэлектронной микроскопией с использованием антител к ЦСБпервой (11В1) и второй (14А4) группы и коньюгата стрептавидина с золотом.
Орган Тип Нуклеоплазма Ядрышко Цитоплазма Пластиды растения антител Первый 14A4 9.26 3.79 18.92 0.83 5.14 0.33 21.60 5.лист - 0.37 0.06 0.20 0.07 0.32 0.09 0.22 0.11B1 9.61 3.98 20.89 0.97 5.95 0.40 0.35 0.- 0.39 0.08 0.20 0.06 0.55 0.10 0.33 0.Корневой 14A4 9.14 3.93 19.14 0.91 4.20 0.53 27.30 6.чехлик - 0.28 0.08 0.37 0.06 0.30 0.07 0.28 0.11B1 10.96 4.53 21.45 0.84 4.99 0.48 0.51 0.- 0.51 0.09 0.35 0.06 0.50 0.08 0.39 0.Наши результаты, представленные в табл.11, демонстрируют различную способность МА первой и второй групп взаимодействовать с ЦСБ70, локализованным в компартментах клеток апекса 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы. Необходимо отметить, что антитела обеих групп узнавали ЦСБ70 в нуклеоплазме, ядрышке и цитоплазме клеток листа и клеток корневого чехлика. ЦСБ70 в пластидах выявляли только антитела второй группы. Различие способности МА первой и второй групп распознавать ЦСБ70 показано на рис 17, в котором представлены результаты изучения локализации ЦСБ в клетках апекса стебля этиолированного проростка кукурузы. МА первой группы узнавали ЦСБ70 ядерной локализации (рис. 17-А, черная стрелка), но не в пластидах (рис.17-А, белая стрелка). МА второй группы выявляли ЦСБ70 в ядрах (рис. 17-В черная стрелка), но при этом более эффективно определяли ЦСБ70 пластидной локализации (рис. 17-В белая стрелка). Следует отметить, что анализ взаимодействия МА первой и второй групп с препаратами ЦСБ70, выделенными из ядер и пластид, в тесте иммуноблотинга не показал специфичности реакции с ЦСБ70 ядерной и пластидной фракций (рис. 17-С). Можно предположить, что в естественном окружении белков в пластидах часть эпитопов ЦСБоказывается недоступной для антител первой группы, возможно, что ЦСБ70 находится в комплексе с белками, которые препятствуют взаимодействию ЦСБ70 с определенного типа МА.
Другим предположением может быть существование семейства гомологичных белков в ядрах и пластидах различия, в которых позволяет антитела дифференциально взаимодействовать с ними.
Рис. 17. Изучение специфичности двух групп МА к ЦСБ70 по способности распознавать ЦСБ70 на срезах и в иммуноблотинге. А и В - поперечные срезы апекса 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы. А инкубировали с МА первой группы (11B3), а секцию В - с МА второй группы (14A4). Далее обработка срезов биотинилированными антимышиными IgG и коньюгатом стрептавидин - щелочная фосфатаза. А, черной стрелкой отмечена локализация ЦСБ70 в ядре. Белок не обнаруживался в пластидах (черные стрелки), ЦСБопределяется в ядре и не обнаруживается в пластидах (белая стрелка). В - антитела взаимодействуют с ЦСБ70, локализованным в ядрах, черные стрелки. Активное окрашивание обнаружено в пластидах (белые стрелки). Масштаб 25 мкм для А и В. С - выявление иммуноблотингом ЦСБв белках ядерной и пластидной фракции.
Фракции получали, выделяя органеллы из 5-ти дневного этиолированного проростка кукурузы. Линии 1С и 2С - ядерная фракция, обработанная антителами 11B3 и 14A4 соответственно. Линии 3С и 4С - суммарная фракция белков пластид, обработанная антителами к ЦСБ70 11B3 и 14A4, соответственно.
Последнее предположение дополняется и аналогией с семейством цитокининсвязывающих белков зеленых листьев ячменя [Каравайко и соавт. 1990; Селиванкина и соавт., 1997; Кулаева и Кузнецов 2002; Люкевич и соавт. 2002; Kulaeva et all., 1990; Kulaeva et all., 1995; Kulaeva et all., 1998; Kulaeva et all., 2000]. Учитывая, что антитела и первой и второй групп не показывали предпочтения во взаимодействии с ядерными и пластидными белками в иммуноблотинге, более правильным является предположение о специфическом белковом окружении ЦСБ70 в пластидах, отличным от такового в ядрах и цитоплазме.
4.3. Изучение внутриклеточной локализации ЦСБ70 в этиолированных проростках кукурузы иммуноцитохимическими методами.
4.3.1. Анализ локализации ЦСБ70 в клетках с помощью антител первой группы.
Исследование локализации ЦСБ70 в клетках меристемы корня проводили с использованием МА к ЦСБ70 первой группы (11В1). Было обнаружено интенсивное окрашивание ядер меристематических клеток (рис 18 A, C, D) и в цитоплазме меристематических клеток (рис 18 D, белая стрелка). Результаты показывают, что ЦСБ70 локализован практически во всех меристематических клетках. Значительное окрашивание наблюдалось в ядрах клеток корневого чехлика, рис 18-А. Наиболее интенсивное окрашивание характерно для ядер меристематических клеток (рис 18 A, C, D, черные стрелки) и особенно для ядрышек этих клеток (двойные черные стрелки).
Рис. 18. Исследование локализации ЦСБна продольных срезах кончика корня 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы. A, C, D и E обрабатывали МА, антимышиными биотинилированными антителами и коньюгатом стрептавидин - щелочная фосфатаза. Контроли - секции B и F без обработки МА против ЦСБ70.
Секция G - обработка срезов сывороткой неиммунных мышей, секция Н - обработка МА к Myc.
Необходимо, что ЦСБнеравномерно распределен по меристеме кончика корня. Клетки покоящегося центра, в котором локализованы стволовые клетки [Laux 2003], имеют незначительное окрашивание по сравнению с меристематическими клетками, находящимися в стадии активного деления. Клетки, примыкающие к покоящемуся центру, для которых характерны незначительные скорости деления, содержали значительно меньше ЦСБ70 в цитоплазме и ядре, чем более активно делящиеся дочерние клетки, рис 18 A, C. Интенсивное окрашивание наблюдается и в клетках корневого чехлика (рис. 18-A, rc). Продольный срез корня в участке развития сосудистой ткани показывает высокое содержание ЦСБ70 в цитоплазме протодермальных и эпидермальных клеток (рис. 18-D, белая стрелка). В клетках зоны растяжения ЦСБ70 обнаруживается в ядрах (рис. 18-Е черная стрелка) и, особенно, в ядрышках (рис. 18-Е, двойная черная стрелка). ЦСБ70 также виден в цитоплазме клеток зоны растяжения (рис. 18-Е черная стрелка). При этом необходимо подчеркнуть, что в зоне растяжения клеток содержание ЦСБ70 значительно меньше, чем в зоне меристематических клеток.
Поперечные срезы мезокотиля, узла и колеоптиля 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы показывают локализацию ЦСБ70 в клетках надземной части растения. Для клеток мезокотиля характерно весьма низкое содержание ЦСБ70 (рис. 19-В, С черная стрелка). ЦСБопределяется в больших паренхимных клетках (рис. 19-С, черная стрелка), а также в клетках сосудистых тканей колеоптиля (рис. 19-H и -I, черная стрелка), в ядрах прижатых к клеточной стенке вакуолями, а также в ядрах клеток паренхимы.
Рис. 19. Локализация ЦСБ70 в поперечных срезах мезокотиля A, В, C; узла D, E, F;
колеоптиля G, H, I, 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы. B C, D, E, H, I последовательно инкубировали с МА против ЦСБ70; биотинилированными антителами против иммуноглобулинов мыши;
коньюгатом стрептавидин Цщелочная фосфатаза. А, F, G - контроль, инкубация с неиммунной сывороткой мышей, биотинилированными антителами против иммуноглобулинов мыши; коньюгатом стрептавидин - щелочная фосфатаза. B - сосудистый пучок мезокотиля. ЦСБопределяется в ядре (черная стрелка) клеток флоэмы. C - клетки паренхимы мезокотиля.
ЦСБ70 определяется в ядре (черная стрелка) и особенно в ядрышке паренхимальных клеток. D - в клетках апекса узла, плотное окрашивание и содержание ЦСБ70 обнаруживается в активно делящихся клетках граней закладки листа (двойная белая стрелка). E - фрагмент D:
апекса стебля. Цитоплазма и ядра небольших клеток зоны деления клеток хорошо окрашены (белая стрелка). H - поперечный срез паренхимы колеоптиля. ЦСБ70 определяется в ядрах, прижатых к клеточной стенке и в ядрышке (черные стрелки). I - Поперечный срез сосудистой ткани колеоптиля. ЦСБ70 локализован в ядре (черные стрелки), а также в ядрышке (двойная черная стрелка). Масштаб: 50 мкм для секций A, В, C и G, Н, I; 200 мкм для секции D; и 25 мкм для секций E и F.
Изучение локализации ЦСБ70 в тканях узла показало, что общее содержание ЦСБ70 в тканях узла значительно выше, чем в мезокотиле и колеоптиле, при этом в узле наибольшее содержание наблюдается в делящихся клетках апекса проростка и клетках листа (рис. 19-D).
В этих клетках ЦСБ70 локализован в ядре и в ядрышке (рис. 19-Е, черная двойная стрелка), белок также определяется в цитоплазматическом пространстве растущих клеток (рис. 19-Е, черная стрелка). Результаты изучения локализации ЦСБ70 в проростке 4-х дневного растения кукурузы иммуноцитохимическими методами хорошо согласуются с данными о локализации, полученными на основании биохимических исследований [Brovko et al 2007].
4.3.2. Исследование локализации ЦСБ70 в клетках меристемы кончика корня и листа методами электронной микроскопии с помощью антител к ЦСБ70 первой группы и коньюгата стрептавидин-золото.
Внутриклеточную локализацию ЦСБ70 в меристематических клетках исследовали методами электронной микроскопии. В работе использовали МА первой группы (11В1). Аналогично ядерным рецепторам животных, внутри клетки растений могут существовать белки, способные специфически взаимодействовать с цитокининами и участвовать в регулировании цитокининзависимых программ. Мы предположили., что одним из кандидатов на эту роль и является ЦСБ70.
Как было показано [Бровко и соавт 2002; Шепеляковская и соавт 2002; Brovko et al 2007], ЦСБприсутствует в клетках всех органах и тканях этиолированного проростка кукурузы (рис.11-13).
Это подчеркивает его важность для жизни растительных клеток. Высокое содержание ЦСБзонах клеточных делений в корне и надземной части проростка дает основание предполагать участие ЦСБ70 в регуляции деления клеток цитокининами. Связь ЦСБ70 с делением клеток подчеркивается тем обстоятельством, что в кончике корня высокое содержание ЦСБобнаруживается в зоне клеточных делений (рис. 18), тогда как стволовые клетки покоящегося центра, имеющие низкий митотический индекс, окрашиваются незначительно по сравнению с окружающими клетками (рис. 18). ЦСБ70 присутствовал в цитоплазме делящихся меристематических клеток, он также обнаруживался в ядре и, особенно, в ядрышке (рис. 18, 20).
Это соответствует его участию в цитокинин-зависимой регуляции элонгации транскрипции РНК полимеразой I, которая также локализуется в ядрышке. В надземной части проростка, также как и в корне, наибольшее содержание ЦСБ70 обнаруживается в зонах клеточных делений. Для колеоптиля и мезокотиля это развивающаяся сосудистая ткань (рис. 19), данные иммуноцитохимии уточняют результаты определения содержания ЦСБ70 в тканях, полученные иммунохимическими методами (рис. 13, 15-19). В узле, органе с интенсивным делением клеток, высокое содержание ЦСБ70, полученное иммунохимическими методами (рис. 11-13), нашло подтверждение и в результатах иммуноцитохимических исследований (рис. 19).
Рис. 20. Исследование внутриклеточной локализации ЦСБ70 с помощью электронной микроскопии. А, С срезы меристемы кончика корня и B, D срезы клеток листа 4-х дневных этиолированных проростков кукурузы. Срезы обрабатывали: A и В МА к ЦСБ70, а C, D - сывороткой неиммунных мышей, биотинилированными антителами против IgG мыши и коньюгатом стептавидин-коллоидное золото.
ЦСБ70 выявлялся в цитоплазме (черная стрелка), нуклеоплазме (белая стрелка-треугольник) и ядрышке (черная стрелка - треугольник). N - ядро, n ядрышко, m - митохондрии, с - цитоплазма, a Цамилопласт, v - вакуоль, w - клеточная стенка. Масштаб - 1 мкм.
Распределение ЦСБ70 в компартментах клетки неравномерно. Анализ результатов, полученных с помощью Табл. 12. Распределение золотых частиц в клетках меристемы корня и листа 4-х дневного этиолированного проростка электронной микроскопии кукурузы (количество частиц/мкм2).
клеток меристемы кончика Орган Антитела Нуклеоплазма Ядрышко Цитоплазма корня и листа показывает, что растения 11ВЛист + 9.61 3.98 20.89 0.97 5.95 0.наиболее высокий уровень - 0.39 0.08 0.20 0.06 0.53 0.содержания ЦСБ70 в ядрышке Кончик + 10.96 4.53 21.45 0.84 4.99 0.корня - 0.51 0.09 0.35 0.06 0.50 0.(рис. 20А, черная стрелка), далее в ядре и цитоплазме (рис. 20 А, белая стрелка). Необходимо отметить, что данные, полученные с помощью электронной микроскопии, хорошо коррелируют с результатами, полученными при использовании световой микроскопии, что подтверждает правильность выбора условий анализа.
Расчеты содержания белка в нуклеоплазме и ядрышке показывают, что количество его в ядрышке почти в два раза выше, чем в нуклеоплазме, само распределение ЦСБ70 в нуклеоплазме неравномерно, обнаружены участки с его повышенным содержанием. Необходимо также отметить, что содержание ЦСБ70 в цитоплазме было значительно ниже, чем в ядрышке и нуклеоплазме. ЦСБ70 не определялся в области клеточной стенки и вакуоли, рис. 20-А,-В.
Результаты определения ЦСБ70 в ткани находятся в хорошем соответствии с данными по распределению в корнях цитокининов (табл. 10), хорошо согласуются также с литературными данными о распределении цитокининов в зонах корня арабидопсиса [Alloni et al 2005]. Результаты иммуноцитохимического анализа наличия ЦСБ70 в ядре (рис. 20) хорошо коррелируют с данными о содержании цитокининов в ядрах клеток апикальных частей побегов табака [Dewitte et al 1999].
ЦСБ70 определи иммуноцитохимическими методами не только в делящихся клетках, но и в клетках с низким уровнем деления (рис. 18, 19) в клетках зоны элонгации корня, клетках паренхимы колеоптиля и мезокотиля. В этих клетках основное содержание белка обнаруживалось в ядре.
Данные электронной микроскопии клеток меристемы кончика корня и листа показывают, что наиболее высокий уровень содержания ЦСБ70 в ядрышке (рис. 20 А, черная стрелка), далее в ядре и цитоплазме (рис. 20 А, белая стрелка). Подсчет содержания золотых частиц на единицу площади среза показал, что содержание ЦСБ70 в ядрышке в четыре раза выше, чем в цитоплазме, и в два раза выше, чем в нуклеоплазме (табл. 12). При этом белок не обнаруживается в вакуоли или в видимых на рис. 20 фрагментах клеточной стенки. Следует подчеркнуть, что это первые сведения о внутриклеточной локализации ЦСБ70 в растении. Данные по локализации ЦСБ70 в клетках растения кукурузы подтверждают его направленное участие в регуляции транскрипции в ядрышке.
4.4. Изучение локализации ЦСБ70 в пластидах проростков кукурузы иммуноцитохимическими методами, с использованием МА второй группы.
При регуляции цитокининами процессов жизнедеятельности растений, пластиды имеют большое значение не только как органеллы, содержащие цитокинины в качествн возиожного депо [Benkova et. al. 1999], но и как автономные органеллы синтеза цитокининов в нормальном растении [Kasahara et. al. 2004], а также чрезвычайно важны при трансформации растений бактериальной изопентенил трансферазой (IPT) [Sakakibara et. al. 2005]. В свою очередь, цитокинины играют важнейшую роль в биогенезе хлоропластов [Sveshnikova et al. 1965; Stetler and Laetsch 1965; Кулаева 1973; Kuznetsov et al 1994; Zavaleta-Mancera et al 1999]. Цитокинины регулируют дифференцировку хлоропластов из пропластид [Хохлова 1977; Longo et al 1979]. Имея такой инструмент, как специфические МА, дифференциально узнающие локализацию ЦСБ70 в клетке, мы поставили задачу изучить его распределение не только в ядерно-цитоплазматическом компартменте клеток, но и в пластидах кукурузы. О важности этих исследований говорит и то, что для хлоропластов листьев ячменя характерно присутствие ЦСБ (ЦСБхл), отличаличающихся от ЦСБ67 имеющего ядерно-цитоплазматическую локализацию [Kulaeva et al 2000; Lukevich et al 2002].
4.4.1. Изучение локализации ЦСБ70 в амилопластах.
окализацию ЦСБ70 в клетках кончика корня изучали, используя два антитела второй группы: 14А4 и 523. МА принадлежали к разным классам и различались по аффинности (14А4 - IgG1 10-7М и 523 - IgG2b 106М). Оба МА распознавали ЦСБ70 на продольных срезах корневого чехлика в амилопластах колумеллы (рис. 21-А, черная стрелка), при этом ЦСБ70 не выявлялся в калиптрогене, контрольные срезы также не окрашивались (рис. 21-В). Это подчеркивает высокую специфичность используемых для детекции антител. На рис. 21-С при более высоком увеличении хорошо видна локализация ЦСБ70 в амилопласте колумеллы кончика корня.
Иммуноцитохимический анализ локализации с использованием антител против ЦСБ70 второй группы, коньюгата стрептавидин-золото и электронной микроскопии показал, что ЦСБпреимущественно локализован вне крахмальных гранул (рис. 23-А) и незначительное количество ЦСБ70 определялось в цитоплазме.
Хорошо известно, что специализированные амилопласты корневого чехлика - статолиты участвуют в гравитропических реакциях растения [Sievers et al., 1989; Volkmann et al., 1991; Braun et al., 2002]. Участие ЦСБ70 в процессах гравитропизма представляется нам маловероятным, так как ЦСБ70 определяется также и в неседиментирующих краевых амилопластах. Наиболее вероятным является участие ЦСБ70 в цитокинин-зависимых процессах биогенеза амилопластов из пропластид. Подтверждением этого предположения могут быть такие факты, как соответствие обнаруженного нами высокого содержание ЦСБ70 в амилопластах колумеллы кончика корня кукурузы (табл. 13), и данных о высокой концентрации активных цитокининов в колумелле корневого чехлика арабидопсиса [Alloni et al. 2005]. Решающим аргументом в пользу второго предположения является тот факт, что высокая концентрация цитокининов в питательной среде культуры клеток табака приводит к дифференцировке амилопластов из пропластид [Sakai et al.
1992; Miyazawa et al. 2002].
Рис. 21. Изучение локализации ЦСБ70 на продольном срезе кончика корня и поперечном срезе мезокотиля 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы. A, C, D, E, F обработка срезов МА второй группы против ЦСБ70, биотинилированными антимышиными IgG и коньюгатом стрептавидин-щелочная фосфатаза.
В - контроль срезы инкубировали с неиммунной сывороткой мыши. AC доокраска сафронином.
Пунктирная линия - граница между апексом и корневым чехликом.
Вертикальные пунктирные линии - отделяют колумеллу (CL) и калиптроген (CP) от других тканей.
Амилопласты колумеллы содержат ЦСБ70 и интенсивно окрашены (черная стрелка). С - 2.5кратное увеличение А. D, E - ЦСБ70 в пластидах паренхимных клеток мезокотиля, окружающих сосудистые пучки VS (черная стрелка). Масштаб: A - 75m, B,D - 60m, E, - 40m и C - 30m.
Транскрипционный анализ с использованием пластидного генетического аппарата показал, что цитокинин-индуцируемый биогенез пропластид в амилопласты сопровождается перестройкой транскрипционной активности в пластидах [Sakai et al 1992]. Нами показано [Brovko et al 2010] участие ЦСБ70 в цитокинин-зависимой элонгации транскрипции в пластидной транскрипционной системе (табл. 14, 15). Важно, отметить, что мутации в гене, кодирующем хлоропластный фактор элонгации транскрипции (ЕТ) растения кукурузы, блокирует не только развитие хлоропластов, но и амилопластов [da Costa e Silva et al 2004]. Следовательно фактор элонгации транскрипции важен для регуляции биогенеза пластид, включая хлоропласты и амилопласты. Присутствие цитокининсвязывающего белка в амилопластах клеток кончика корня показано впервые в нашей работе.
4.4.2. Анализ локализации ЦСБ70 в этиопластах и хлоропластах помощью антител второй группы. Исследование методами световой микроскопии.
В 4-хдневном этиолированном проростке кукурузы ЦСБ70 выявлялся в этиопластах мезокотиля (рис. 21-D, -E), листьях узла и апексе стебля (рис.22).
окализацию белка в пластидах клеток мезокотиля изучали на поперечных срезах 4-х дневного проростка кукурузы, используя МА второй группы (14А4).
Рис. 22. Изучение локализации ЦСБ70 на поперечном срезе узла 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы. Секции A, C, D инкубировали с МА второй группы, биотинилированными антителами против IgG мыши и коньюгатом стрептавидинщелочная фосфатаза. A, C, D проводили доокраску ядер сафронином. А - пунктирные линии - границы сформировавшихся листьев с 1-го по 4-й. ap - апекс.
Черными стрелками показано выявление ЦСБ70 в клетках второго листа. В других листьях окрашивания не обнаруживается. C - двукратное увеличение А.
Черная стрелка указывает обнаружение ЦСБ70 в пластидах, прилегающих к ядру, белая стрелка указывает пластиды, не окрашенные и не содержащие ЦСБ70. D - увеличенный фрагмент С, стрелкой указаны пластиды, содержащие ЦСБ70. B - выявление ЦСБ70 как и в A, C, D. Большое количество пластид содержащих ЦСБ70, локализованы вокруг ядра. Е - фрагмент стволового апекса, иммуновыявление как в A, C, D, большое количество пластид, содержащих ЦСБ70. В - окрашенные пластиды отсутствуют в зонах клеточных делений, ЦСБ70 в этих зонах выявляется в ядрах и цитоплазме (черная стрелка треугольником). F - контроль, первая стадия - обработка срезов неиммунной сывороткой мыши, а далее как для секций А, В и Е. Масштаб: А - 50 мкм, B, C, E - 25 мкм, F - 100 мкм.
Обнаружено, что ЦСБ70 присутствует в клетках, окружающих сосудистые пучки (рис. 21-D, черная стрелка). ЦСБ70 не выявлялся в клетках эпидермиса и в больших клетках паренхимы (рис.
21-Е). Узел представляет собой сложную систему, в которой присутствуют клетки, находящиеся на разном уровне дифференцировки. Здесь закладываются листья, и происходит удлинение в обе стороны клеток стебля [Александров 1966; Esau 1977]. Известна высокая гетерогенность в структуре и степени дифференцировки популяции этиопластов этиолированных листьев кукурузы [MacKender 1978]. В соответствии с представленными MacKender результатами, в наших исследованиях по изучению содержания ЦСБ70 в этиопластах было обнаружено, что популяции этиопластов в листьях, примыкающих к середине стебля этиолированного проростка, значительно различались по содержанию в них ЦСБ70 (рис 22-А). Различия наблюдались не только между этиопластами разных листьев, но и этиопластами одной клетки (рис 22-D). Второй лист содержал наибольшее количество ЦСБ70 (рис 22-А, -В). В первом листе, также как и в третьем и четвертом, ЦСБ70 не обнаруживался, что позволяет предположить, что содержание ЦСБ70, его количество в органеллах связано со степенью развития этиопластов.
Необходимо отметить, что при изучении локализации ЦСБ70 в органах и частях растения иммунохимическими методами было установлено, что на второй и третий день роста растения содержание ЦСБ70 в узле сравнимо с его содержанием в меристеме кончика корня (данные не представлены), а в последующие дни роста содержание ЦСБ70 в узле уменьшалось.
4.4.3. Исследование локализации ЦСБ70 в этиопластах и хлоропластах с помощью антител второй группы методами электронной микроскопии.
Для выяснения вопроса связи содержания в этиопластах и хлоропластах ЦСБ70 и степенью их дифференцировки изучали локализацию ЦСБ70 иммуноцитохимичкскими методами, используя антитела второй группы, коньюгат стрептавидин-золото и детектируя метку с помощью электронной микроскопии. Видно, что уровень содержания ЦСБ70 в органеллах связан с развитием в них внутренних мембран (табл. 13).
Рис.23. Анализ локализация ЦСБ70 в амилопластах чехлика корня и в этиопластах второго листа узла с помощью электронной микроскопии. А - срезы чехольчика корня и C, D, E второго листа 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы. Срезы обрабатывали МА к ЦСБ70 второй группы (14A4), контрольные срезы B, F сывороткой неиммунных мышей, биотинилированными антителами против IgG мыши и коньюгатом стрептавидинЦ золото. Большая плотность ЦСБ70 выявлялась вне крахмальных гранул в амилопластах корневого чехлика (черные стрелки), и в незначительном количестве ЦСБ70 выявлялся в цитоплазме, белая стрелка. Контроль, секция В, золотые частицы не наблюдались. Небольшое количество золотых частиц у этиопластов с плохо развитой мембранной системой (секция С, черная стрелка). Высокая плотность ЦСБ70 в пластиде с активно развивающейся внутренней мембранной системамой (секция D, черная стрелка). ЦСБдетектировался в нуклеоплазме, стрелка черным треугольником. Очень низкое содержание золотой метки в этиопластах с сформировавшимися проламилярными телами - Е. Контроль - F.
Обозначения: am - амилопласт; s - крахмальные гранулы; pb - проламилярные тела. Масштаб - мкм.
Небольшое количество ЦСБ70 определяется в этиопластах на начальных стадиях развития внутренних мембран (рис 23-С). Количество ЦСБ70 значительно возрастало с увеличением развития внутренних мембран (рис. 23-D) и значительно уменьшалось в этиопластах с развитыми проламелларными телами (табл. 13; рис 23 ЦC, -D, -E). Приведенные результаты показывают разные уровни содержания ЦСБ70 в этиопластах, в зависимости от степени их дифференцировки.
Это, а также тот факт, что дифференцировка пластид регулируется цитокининами [Хохлова и др.
1978], позволяют предположить, что ЦСБ70 может являться участником процессов биогенеза этиопластов.
4.4.4. Изучение локализации ЦСБ70 в хлоропластах зеленых листьев кукурузы.
Для дальнейшего изучения роли ЦСБ70 в биогенезе пластид исследовали содержание ЦСБв хлоропластах зеленых листьев кукурузы. Брали участок средней части (10 см от основания) 3-го листа 20 дневных растений кукурузы. Функциональное значение ЦСБ70 для пластид было подтверждено обнаружением его в хлоропластах 3-х недельных зеленых растений кукурузы.
Рис. 24. Локализация ЦСБ70 в хлоропластах обкладки сосудистых пучков зеленых листьев кукурузы при исследовании световой и электронной микроскопией. A, B - поперечные срезы средней части третьего листа 20 дневного растения кукурузы. А - срезы инкубировали с МА против ЦСБ70, второй группы, В - контролные срезы обрабатывали сывороткой неиммунных мышей. Далее инкубировали все срезы биотинилированными антителами к IgG мыши и коньюгатом стептавидин - щелочная фосфатаза. С и D - определение ЦСБ70 в хлоропластах клеток сосудистых пучков электронной микроскопией. С - первая инкубация с МА ЦСБ70, второй группы. D - контроль - первая инкубация с сывороткой неиммунных мышей. Последующие обработки секций С и D биотинилированными антителами к IgG мыши и коньюгатом стрептавидин - золото. Видно присутствие CBP70 в хлоропластах обкладки сосудистых пучков, с противоположной от сосудов стороны (А - черная стрелка). Пластиды в других клетках не окрашены. ЦСБ70 локализован в хлоропластах, черная стрелка, и не обнаруживается в крахмальных гранулах. Обозначения; bsc - клетки обкладки; chl - хлоропласты; N - ядро; S - крахмальные граны; Vs-сосудистые пучки.
Масштаб 30 m для A и B и 1 m для C и D.
Наличие ЦСБ70 в хлоропластах обкладки сосудистого пучка, типичной для С4 растений [Romanowska and Drozak 2006] изучали иммуноцитохимически с помощью световой и электронной микроскопии (рис. 24). Необходимо заметить, что анализ методами протеомики выявил явные различия полипептидного состава для этиопластов и хлоропластов [Zychlinski et al 2005] и показал, что в хлоропластах присутствуют те белки этиопластов, которые важны для функционирования хлоропластов [Blomqvist et al 2008].
Табл. 13. Концентрация золотых частиц в амилопластах и этиопластах 4-х дневного этиолированного проростка кукурузы и хлоропластах зеленого листа кукурузы определяемая с помощью электронной микроскопии, антител второй группы (14А4) и коньюгата стрептавидин-золото. I - этиопласт на начальной стадии развития внутренних мембран; II - этиопласт с развитыми внутренними мембранами; III - этиопласт с дифференцированными проламилярными телами.
Пластиды Число золотых частиц на 1 mАмилопласт 40.0 2.Этиопласты - I 3.4 0.Этиопласты - II 26.6 1.Этиопласты - III 1.8 0.Хлоропласт 14.1 1.Следовательно, присутствие ЦСБ70 в зрелых хлоропластах позволяет предположить его функциональную важность для хлоропластов.
5. ЦСБ70 как регулятор элонгации транскрипции в пластидах.
Нами установлена способность ЦСБ70, выделенного из этиолированных проростков кукурузы, регулировать элонгацию транскрипции in vitro в модельной системе, содержащей ассоциированную с хроматином РНК полимеразу I, выделенную из зеленых листьев ячменя (табл.
3 и 4). В этой системе новые транскрипты не инициируются, система только поддерживает элонгацию уже инициированных транскриптов in vivo. Антитела ингибировали способность ЦСБ70 регулировать цитокинин-зависимую элонгацию транскрипции, это подчеркивает, что выделен функционально активный белок (табл. 7). Важным также было и то, что на регуляцию транскрипционной активности ЦСБ70 влияли активные цитокинины, а аденин и функционально неактивные природные и синтетические аналоги цитокининов не оказывали влияния (табл. 4).
Вставал вопрос о функциональной роли ЦСБ70 пластид. Локализация ЦСБ70 в пластидах на разных этапах их дифференцировки, связь между содержанием ЦСБ70 в пластидах и биосинтезом внутренних мембран позволяют выдвинуть вопрос о функциональной роли пластидного ЦСБ70, в частности о возможном его участии в процессах регуляции транскрипции в этиопластах. К настоящему времени только один цитокинин-связывающий белок (ЗСБхл) был выделен из хлоропластов ячменя. Он в комплексе с транс-зеатином активировал синтез хлоропластной РНК в хлоропластном же лизате. Вместе с тем ЗСБхл не влиял на синтез РНК в изолированных ядрах РНК-полимеразами I или II [Селиванкина и соавт., 1997; Kulaeva et all., 2000]. Было установлено, что свойства ЗСБхл как регулятора транскрипции изменяются с возрастом ткани листа [Люкевич и соавт., 2002]. При этом совместное действие ЗСБхл и транс-зеатина на синтез РНК в лизатах хлоропластов из ячменя в зависимости от возраста листа изменялось с активирующего на ингибирующее [Люкевич и соавт., 2002]. Все это представляло целесообразным исследовать способность ЦСБ70 этиопластов участвовать в цитокинин-зависимой регуляции транскрипции в этих органеллах.
5.2. Активация с помощью ЦСБ70 этиопластов элонгации транскрипции в лизатах хлоропластов и этиопластов.
Для выделения ЦСБ70 этиопластов использовали первый лист 5-ти дневных этиолированных растений кукурузы. Проводили выделение этиопластов, характеризовали их качественно и далее выделяли ЦСБ70 [Brovko et. al. 2010]. Для элюции использовали 6М гуанидин гидрохлорид и была введена процедура рефолдинга. Подбор условий рефолдинга показал, что при рефолдинге с помощью диализа или разбавлением значительная часть белка агрегировала и теряла цитокининсвязывающую активность. Была разработана процедура рефолдинга со сменой буфера в автоматическом режиме на ячейке 8МС (Amicon USA). Элюат с аффинной колонки концентрировали на мембране YM10 (Millipore USA) до 100 мкл, далее в резервную камеру добавляли раствор буфера для рефолдинга, содержащий растворимое комплексное соединение цинка и меркаптоэтанола [Colvard and Wilson 1984]. Полученный таким образом препарат ЦСБ70 использовали для иммунохимических и функциональных исследований.
Рис. 25. Иммуноблот-анализ препарата ЦСБ70, выделенного из этиопластов тандемной аффинной хроматографией на аденозин и транс-зеатин рибозид Toyopearl. Линия 1 - для анализа наносили 1мкг тотального белка этиопластов. Линия 2 - для анализа использовали 2 мкг препарата, выделенного аффинной хроматографией и рефолдированного ЦСБ70. Использовали МА второй группы (14А4).
Цифрами обозначены маркеры молекулярных масс.
Рис 25 демонстрирует эффективность Табл. 14. Цитокинин-зависимая активация элонгации транскрипции в лизате этиопластов процедуры выделения ЦСБ70 Оба препаратом ЦСБ70 выделенным из этиопластов анализируемых образца, как выделенный, так 4-дневных этиолированных проростков кукурузы.
и в составе этиопластов содержали небольшое ЦСБ70 Транс- Включение [3H]UMP в РНК количество продуктов с молекулярной массой (нг/100 зеатин Имп/мин/10 g ДНК % меньше 70 кД, имели электрофоретическую 10-7M l) 0 - 38682 1802 1подвижность, аналогичную подвижности 0 + 35204 2201 ЦСБ70, выделенному из этиолированных 48 - 31196 2464 16 + 47627 3810 1проростков кукурузы. ЦСБ70 этиопластов 32 + 78595 6951 2проверяли на способность цитокинин48 + 115614 6127 2зависимо регулировать элонгацию транскрипции в лизате этиопластов, который содержал все компоненты, необходимые для транскрипции. В присутствии транс-зеатина ЦСБ70 активировал синтез РНК. Активация отсутствовала при добавлении в систему только ЦСБ70 или только трансзеатина (табл. 14). Это показало, что ЦСБ70 способен активировать цитокинин-зависимую элонгацию транскрипции в системе, из которой он и был выделен - из этиопластов проростков кукурузы. В присутствии транс-зеатина ЦСБ70, выделенный из этиопластов, активировал включение метки в РНК пропорционально количеству белка, вносимого в реакцию (табл. 14).
В присутствии транс-зеатина ЦСБ70, выделенный из этиопластов кукурузы, также активировал элонгацию транскрипции в лизате хлоропластов, выделенных из зеленых листьев ячменя (табл. 15).
Табл. 15. Цитокинин-зависимая активация элонгации транскрипции в лизате хлоропластов из зеленых листьев ячменя, в присутствии ЦСБ70, выделенного из этиопластов этиолированных проростков кукурузы. Концентрация транс-зеатина в реакционной смеси составляла 10-7 M, ЦСБ70-32 нг/100l реакционной среды.
Добавляемые в реакционную Включение 3H-УМФ в РНК смесь компоненты Имп/мин/10 g ДНК % от контроля Контроль 27106 1221 1Транс-зеатин 26292 1314 ЦСБ7070, этиопластов 33875 2371 1Транс-зеатин + ЦСБ70, 76984 5388 2этиопластов Таким образом, ЦСБ70, выделенный из этиопластов 5-ти дневных проростков кукурузы и содержащийся также в хлоропластах зеленых листьев кукурузы, показывал способность цитокинин-зависимо регулировать элонгацию транскрипции и в хлоропластной транскрипционной системе. Из полученных данных можно сделать несколько важных выводов.
Во-первых, ЦСБ этиопластов сохраняет функциональную активность в хлоропластах.
Во-вторых, белок не проявлял видовой специфичности в своей функциональной активности.
ЦБ70, выделенный из кукурузы, был активен в транскрипционной системе, полученной из ячменя.
Эти данные, а также обнаружение ЦСБ с близкими молекулярными массами в листьях ржи, ячменя, пшеницы и овса, для двух из которых показано не только специфическое взаимодействие с цитокининами, но и участие в цитокинин-зависимой регуляции элонгации транскрипции, позволяют говорить о наличии в растениях семейства цитокинин-связывающих белков - участников цитокинин регулируемых транскрипционных процессов.
Различие между этиопластами и хлоропластами не только в полипептидном составе, их транскрипционные системы также значительно различаются [Zuchlinski et al. 2005]. Несмотря на структурную похожесть РНК полимераза бактериального типа и сигма подобный транскрипционный фактор (SLF) этиопластов и хлоропластов различаются функционально, это выражается в использовании различных промоторов и в различной длине транскриптов [Tiller and Link 1993]. Учитывая, что выделенный из этиопластов ЦСБ70 проявлял в присутствии трансзеатина способность активировать элонгацию транскрипции как в лизате этиопластов кукурузы, так и в лизате хлороплатов полученных из зеленых листьев ячменя, подчеркивает его важную и универсальную роль и его участие в транскрипционный контроль во всех типах пластид [Brovko et al 2010].
Исследования последних лет показывают, что белки - регуляторы этонгации транскрипции имеют важнейшее значение в регуляции экспрессии генов у эукариот [Lis et al 2007; Mavrich et al 2009]. Активация нескольких сот ядерных генов, участвующих в контроле и ответе на внешний сигнал контролируется на уровне элонгации транскрипции [Aiyar et al 2004; Muse et al 2007;
Zeitlinger et al 2007]. К настоящему времени идентифицировано большое количество эукариотических ядерных факторов элонгации транскрипции, активирующих или репрессирующих транскрипцию РНК полимеразами I и II [Aiyar et al 2004; Yik et al 2005; Komori et al 2009; Zhang et al 2009].
Факторы элонгации транскрипции хлоропластов изучены весьма плохо, только несколько сигма-подобных транскрипционных факторов, регулирующих инициацию транскрипции идентифицированы и исследуются [Lysenko 2007]. Наиболее исследованным является цинк содержащий фактор элонгации транскрипции хлоропластов кукурузы (ET1) [Costa e Silva et al 2004]. Он структурно похож на эукариотический фактор элонгации транскрипции TFIIS, регулирующий РНК полимеразу II в ядре. Точный молекулярный механизм функционирования фактора ET1 не установлен.
Представляется важным, что ЦСБ70 активировал элонгацию транскрипции in vitro как в системе содержащей хроматин [Бровко и др 1996; Kulaeva et al 1998; Brovko et al 2007], так и так и в системе содержащей лизат этиоплатов кукурузы и хлоропластов ячменя [Brovko et al 2010].
Имеющиеся на настоящее время данные не позволяют однозначно говорить об идентичности этих белков, они могут различаться как по структуре, так и по постсинтетическим модификациям.
Похожая картина описана для стероидных рецепторов, в частности для рецептора эстрогенов. На протяжении длительного времени эти рецепторы рассматривались только как ядерные, но как показано сейчас в результате различного сплайсинга одной мРНК получаются набор рецепторов, как транскрипционных факторов ядерно-цитоплазматической локализации, митохондриальных транскрипционных факторов и мембранных рецепторов [Zhou et al 2005; Yager abd Chen 2007].
6. Заключение.
Совокупность методов фракционирования белков, а также набора биохимических и иммунохимических методов, позволила выделить и охарактеризовать цитокинин-связывающий белок этиолированных проростков кукурузы, участвующий в цитокинин-зависимой регуляции транскрипции. Важным явилось изучение взаимодействия ЦСБ70 с цитокининами и другими гормонами растения, а также аденином. Удалось показать, что взаимодействие ЦСБ70 с цитокининами находится в соответствии с их активностью, определенной в других функциональных для цитокининов тестах. Используя иммунохимические методы, мы впервые определили распределение ЦСБ70 по растению кукурузы. Обнаружено, что ЦСБ70 присутствует во всех типах клеток. Это говорит о его жизненной необходимости для растения. При этом основное содержание ЦСБ70 оказалось в зонах клеточных делений - меристематических тканях корня и стебля. Обнаружена динамика содержания ЦСБ70 и ее корреляция с активностью клеточных делений в органах. При помощи использования иммуноцитохимических методов в сочетании со световой и электронной микроскопией установлена локализация ЦСБ70 в ядре и ядрышке. Причем в ядрышке меристематических клеток кончика корня и листа была наибольшая концентрация ЦСБ70. Ядрышко в клетке является компартментом, в котором синтезируется предшественники рРНК и локализуется РНК полимераза I. Колокализация в ядрышке ЦСБ70 и РНК полимеразы I является важным аргументом того, что ЦСБ70 является участником цитокининзависимой регуляции синтеза рРНК, являющегося основой цитокинеза [Gaudino and Pikaard, 1997].
Установлено участие ЦСБ70 в регуляции цитокинин-зависимой элонгации транскрипции.
Показано, что эта функция ЦСБ70 активируется функционально активными цитокининами, аденин и неактивные цитокинины не влияли на активность ЦСБ70 в тесте регуляции цитокининзависимой элонгации транскрипции. Интересным оказалось и то, что ряд моноклональных антител к ЦСБ70 обладал способностью регулировать транскрипционную активность ЦСБ70, как активируя, так и ингибируя ее.
Методами иммуноцитохимии с использованием световой и электронной микроскопии обнаружена локализация ЦСБ70 во всех типах пластид. Необходимо отметить, что содержание и концентрация ЦСБ70 в пластидах не являются постоянными. На примере анализа среза узла обнаружено, что из проанализированных четырех листьев ЦСБ70 определялся только во втором, более того: и в одном типе ткани пластиды различались по содержанию ЦСБ70. Эти результаты находятся в соответствии с биохимическими и морфологическими данными о гетерогенности пластид кукурузы [MacKender 1978]. Методами электронной микроскопии установлено, что наличие ЦСБ70 в пластидах коррелирует с развитием внутренних мембран в этих органеллах. Это позволяет предположить, что ЦСБ70 в пластидах может выполнять регуляторную функцию.
Пластиды - органеллы, имеющие собственный генетический аппарат, и тот факт, что ЦСБспособен принимать участие в цитокинин-зависимой элонгации транскрипции в лизатах пластид, подтверждает возможную роль ЦСБ70 в биогенезе и дифференцировке пластид. Наличие ЦСБ70 в хлоропластах зеленых листьев кукурузы, активация цитокинин-зависимой элонгации транскрипции в лизате хлоропластов зеленых листьев ячменя позволяют констатировать, что наряду с изменением содержания ЦСБ70 в процессе развития пластид он жизненно необходим этим органеллам и присутствует в них от начальных стадий пропластид до зрелых хлоропластов.
Вторым интересным фактом является отсутствие видовой специфичности ЦСБ70 как цитокининзависимого фактора - регулятора элонгации транскрипции. Он с одинаковой эффективностью работает как в лизате этиопластов, полученном из этиолированных растений кукурузы, так и в лизате хлоропластов, полученном из зрелых зеленых листьев ячменя. Важным фактором является и то, что ЦСБ70 определяется в органеллах, для которых показано, что они содержат цитокинины [Sossountzov et. al. 1986; Hare and Van Staden, 1997; Benkova et. al. 1999; Dewitte et al., 1999; Aloni 2004]. Совокупность данных иммунохимических и биохимических исследований ЦСБэтиолированных проростков кукурузы, обнаружение ЦСБ67 зеленых листьях ячменя, а также данные о ЦСБ ржи, овса и пшеницы позволяет предположить существование семейства цитокинин-зависимых транскрипционных факторов - регуляторов элонгации транскрипции. В настоящее время у растений установлен основной путь рецепции цитокининов через мембранные гистидиновые киназные рецепторные системы [Kakimoto et. al. 1996; Takei et al., 2001]. Описаны три белка рецептора, они различаются по структуре и функциональным особенностям.
Инактивация всех трех рецепторов приводила к значительным морфологическим изменениям в растении, но они сохраняли жизнеспособность и способность воспроизводства [Higuchi et. al.
2004, Nishimura et. al. 2004, Riefler et. al. 2006]. Инактивация следующих участников передачи сигнала с рецептора - белков фосфотрансмиттеров, которая также, как и инактивация мембранных рецепторов, должна блокировать передачу цитокининового сигнала, имела для растения менее драматические последствия, по сравнению с инактивацией всех трех рецепторов [Hutchison et. al.
2006]. Проведенные в лаборатории Kieber J. исследования показало, что перемещение AHP в ядерный компартмент клетки, при добавлении цитокининов, не происходит [Punwani et al 2010].
Вероятно, что кроме мембранной рецепторной системы существую какие-то другие механизмы восприятия цитокининов.
Мембранные рецепторы - гистидиновые протеинкиназы - способны воспринимать внеклеточные цитокининовый сигнал, между тем показано, что такие органеллы, как ядро, хлоропласты, амилопласты содержат цитокинины. Один из путей биосинтеза цитокининов в растительной клетке происходит в хлоропластах. Бактериальная изопентенил трансфераза локализуется и работает в хлоропластах. Все эти данные позволяют предположить существование в растительной клетке, наряду с мембранной сигнальной системой, другие системы восприятия и реализации цитокининового сигнала. Если обратиться к животным системам, то для них хорошо исследованной является система ядерных рецепторов. Название лядерные рецепторы предполагает скорее традиционность устоявшегося названия, отражающего исторический аспект изучения передачи сигнала стероидов в клетке. Как хорошо показано в настоящее время, в клетке одновременно могут существовать несколько типов рецепторов, различающихся по локализации, связи с определенным компартментом и, соответственно, результатом ответа на гормональный сигнал. Кроме классических рецепторов, имеющих ядерно-цитоплазматическую локализацию в клетке, присутствует мембранная форма рецептора. И если для ядерных рецепторов основная активность состоит в регуляции считывания генетической информации, то есть в биосинтезе гормон индуцируемых белков, то мембранные рецепторы участвуют в активации широкого спектра мембранных рецепторных систем, систем, которые не взаимодействуют с гормоном [Hammes and Levin 2007]. Активация мембранных рецепторных систем через мембранныую форму рецепторов стероидных гормонов позволяет клетке моментально отвечать на изменение содержания гормона. И, наконец, показано существование митохондриально-цитоплазматической формы рецептора. Этот тип рецептора способен регулировать как генетический аппарат митохондрий, участвуя в транскрипции митохондриальных генов, так и в комплексе с гормоном непосредственно регулировать апоптоз этих органелл [Levin 2005; Yager and Chen 2007].
Суммируя вышеизложенное, можно отметить, что при реализации сигнала одного гомона используется набор путей, которые и определяют полифункциональность ответа на гормон.
Экстраполируя данные о функционировании рецепторов стероидных гормонов на гормональные рецепторные системы растения, можно предположить возможность наличия в клетке, наряду с мембранной протеинкиназной рецепторной системой, дополнительных сигнальных систем, принимающих как внеклеточный сигнал, так и внутриклеточный. Уместно также предположить кооперацию гормональных систем - мембранной и внутриклеточной. В этом плане представляет несомненный интерес дальнейшее изучение цитокинин-связывающих белков, охватывающее как структурные исследования, так и молекулярные механизмы функционирования в растительной клетке.
ЦK Ответ клетки на цитокинины Рис. 26. Схема восприятия и передачи Плазмалема цитокининового сигнала в растительной AHKклетке. Обозначения:
AHK3 Белки CRE1/AHKфосфотрансмитеры ЦК - цитокинины;
ЦСБ 67;AHK/CRE1 - ЦK Я-Ц CRF мембранные рецепторы AHP ? цитокининов, гистидиновые протеинкиназы; AHP - белки переносчики ARR-B ARR-A ЦСБ64-Хл; ЦСБЦK фосфата с киназ на Хлоропласты регуляторы ответа и Ядро другие мишени; CRF транскрипционные ЦСБЦK факторы ответа на цитокинин; ARR-B и Амилопласты ARR-А белки регуляторы ответа;
ЦСБ67-ЦСБ70 - цитокинин-зависимые транскрипционные факторы ядерно-плазматической локализации; ЦСБ64-Хл-ЦСБ70 - цитокинин-зависимые регуляторы транскрипции этиоластнохлоропластной локализации; ЦСБ70 - цитокинин-зависимый регулятор транскрипции амилопластов.
Нельзя сказать, что при исследовании ЦСБ70, вернее семейства цитокининсвязывающих белков, участвующих врегуляции транскрипции [Селиванкина 2001 Kulaeva 1995 1998, 2002;
Brovko et al 2007; Brovko et al 2010] мы встретили полную аналогию с рецепторами стероидных гормонов, но есть достаточно аргументов, говорящих о сходстве систем. На основании уже предложенных в литературе схем передачи цитокининового сигнала в растительной клетке [To and Kieber 2008], данных, полученных в результате исследования хлоропластного белка ячменя, результатов проведенных нами исследований [Селиванкина и др. 1997; Kulaeva 1995; 1998; 2002;
Brovko et al 2007; Brovko et al 2010] можно представить следующую схему восприятия цитокининогвого сигнала (рис 26).
Схема учитывает мембранную рецепторную систему, наличие в компартментах клетки цитокининов и цитокинин-связывающих белков. Безусловно, главные открытия - впереди, и это, во-первых, определение структуры белка, и, исходя из нее, перевод исследований на молекулярный уровень.
7. Выводы:
1. На примере цитокинин-связывающего белка кукурузы исследованы функциональные аспекты рецепции цитокининов внутриклеточными белками. Из этиолированных проростков кукурузы выделен цитокинин-связывающий белок 70 кД (ЦСБ70). Доказано его специфическое взаимодействие с физиологически активными цитокининами и отсутствие взаимодействия с их неактивными аналогами, а также другими гормонами растений.
2. С помощью иммунохимических и иммуноцитохимических исследований на проростках кукурузы показано присутствие ЦСБ70 во всех типах тканей и клеток, что указывает на высокую значимость белка в жизни растения. Установлена преимущественная локализация ЦСБ70 в зонах клеточных делений (меристеме кончика корня и стебля), что соответствует регуляции цитокинином деления клеток и делает вероятным участие ЦСБ70 в этом процессе.
3. С помощью иммуноцитохимии, в сочетании со световой и электронной микроскопией доказана преимущественная локализация ЦСБ70 в клеточном ядре с наибольшим накоплением в ядрышке. В соответствии с локализацией ЦСБ70 в ядре установлено его участие в цитокининзависимой регуляции элонгации транскрипции в системе in vitro, содержащей хроматин и РНК полимеразу из этиолированных проростков и зеленых листьев ячменя.
4. Показано присутствие иммунохимически и функционально родственных ЦСБ70 кукурузы у растений ячменя, ржи, пшеницы и овса, что позволяет заключить, что ЦСБ70 является представителем семейства гомологичных цитокинин-связывающих белков злаков.
5. Установлено, с помощью иммунохимических исследований на проростках кукурузы, что ЦСБ70 присутствует во всех типах пластид, включая амилопласты корня, этиопласты этиолированных проростков и хлоропласты зеленых листьев. Доказано, что ЦСБ70 из этиопластов осуществляет цитокинин-зависимую регуляцию элонгации транскрипции in vitro в транскрипционных системах этиопластов и хлоропластов.
6. Получение представленных материалов стало возможным на основе разработки новых методов выделения и очистки ЦСБ70, разработки и модификации иммуноцитохимических методов для изучения локализации ЦСБ70 в тканях растений и изучения его функциональной активности.
7. Совокупность полученных данных позволяет заключить, что ЦСБ70 представляет собой цитокинин-зависимый фактор элонгации транскрипции или цитокинин-зависимый регулятор активности факторов транскрипции, который участвует в активации цитокинином элонгации транскрипции в чувствительных к фитогормону системах.
8. Список основных работ опубликованных по теме диссертации:
8.1. Статьи в рецензируемых журналах 1. Бровко Ф.А., Заграничная Т.К., Лисина О.И. Метод разделения белков и фенольных соединений растительного экстракта гидрофобной хроматографией на Toyopearl HW60 // Биотехнология 1994. Т. 9/10 С. 15-18.
2. Бровко Ф.А., Заграничная Т.К., Бозиев Х.М., Липкин В.М., Каравайко Н.Н., Селиванкина С.Ю., Кулаева О.Н. Выделение и характеристика цитокинин-связывающего белка молекулярной массой 70 кД из этиолированных проростков кукурузы. // Физиология растений.
1996. Т. 43 С. 533-540.
3. Бровко Ф.А., Заграничная Т.К., Бозиев Х.М.Разделение белков и фенольных соединений в растительном экстракте фракционированием сульфатом аммония в присутствии небольших концентраций полиэтиленгликоля. Биотехнология 1996. Т. 7. С. 36-41.
4. Заграничная Т.К., Бровко Ф.А., Шепеляковская А.О., Бозиев Х.М., Липкин В.М.
Моноклональные антитела к цитокинин-связывающему белку 70 кД из этиолированных проростков кукурузы. // Физиология растений. 1997. Т. С. 5-10.
5. Kulaeva O. N., Zagranichnaya T.K., Brovko F.A., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Zemlyachenko Ya.V., Hall M.A., Lipkin V. M., Boziev Kh. M. A new family of cytokinin receptors from cereales. // Febs Letters 1998. V. 423. P. 239-242.
6. Brovko F. A. and Zagranichnaya T.K. Separation of proteins from phenols in sereal leaf extract by hydrophobic interaction - ammonium sulfate fractionation. // Plant Physiol Biochem. 1998. V.36 P.773777.
7. Шепеляковская А.О., Доронина Н.В., Ламан А.Г., Бровко Ф.А., Троценко Ю.А. Новые данные о способности аэробных метилотрофных бактерий синтезировать Цитокинины // Доклады Академии Наук 1999. Т. 368. С. 555-557.
8. Иванова Е.Г., Доронина Н.В., Шепеляковская А.О., Ламан А.Г., Бровко Ф.А., Троценко Ю.А.
Факультативные и облигатные аэробные метилобактерии синтезируют цитокинины // Микробиология 2000. Т. 6 С. 764-769.
9. Бровко Ф.А., Шепеляковская А.О., Бурханова Э.А., Бозиев Х.М., Ламан А.Г., Васильева В.С., Холл М.А., Кулаева О.Н. Преимущественная локализация цитокининсвязывющего белка (70-кД) в апикальной меристеме корня. // Доклады Академии Наук 2002. Т.
381 №5 С. 684-686.
10. Шепеляковская А.О., Теплова И.Р., Веселов Д.С., Бурханова Э.А., Бозиев Х.М., Ламан А.Г., В.С.Васильева, Кудоярова Г.Р., Холл М.А., Бровко Ф.А., Кулаева О.Н.. Цитокинин-связывающий белок 70 кД преимущественно локализован в меристеме корня. Физиология Растений 2002. Т. 49.
С. 133-120.
11. Костеша Н.В., Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Зайцева И.С., Орлов В.П., Дыкман Л.А., Бровко Ф.А., Соколов О.И. Селекция и характеристика фаговых мини-антител к актинам различного происхождения. Биохимия 2005. Т.70 С. 1070-1077.
12. Brovko FA, Vasil'eva VS, Shepelyakovskaya AO, Selivankina SY, Kudoyarova GR, Nosov AV, Moshkov DA, Laman AG, Boziev KM, Kusnetsov VV, Kulaeva ON. Cytokinin-binding protein (kDa): localization in tissue and cells of etiolated maize seedlings and its putative function. // J Exp Bot.
2007 V. 58 Р. 2479-2490.
13. Васильева В.С., Лушникова А.Л, Павлик Л.Л., Мошков Д.А., Бровко Ф.А. Разработка метода для иммуноцитохимического исследования цитокинин-связывающего белка 70 кД и его локализация в тканях проростка кукурузы. // Физиология Растений 2008. Т.55 С. 552-559.
14. Brovko FA, Vasil'eva VS, Lushnikova AL, Selivankina SY, Karavaiko NN, Boziev KM, Shepelyakovskaya AO, Moshkov DA, Pavlik LL, Kusnetsov VV, Kulaeva ON.
Cytokinin-binding protein (70 kDa) from etioplast and аmyloplasts of etiolated maize seedlinds and chloroplast of green plants and its putative function. // J Exp Bot. 2010 V. 61 p.3461-74.
15. Романов Г.А., Таран В.Я., Оруджев Э.М., Кулаева О.Н., Бровко Ф.А., Липкин В.М. Способ обнаружения веществ с цитокиновой активностью. Патент SU 1808128 A3 (1993).
8.2. Статьи в научных сборниках и других изданиях 1. Romanov G.A., Orudgev B.M., Brovko F.A., Kulaava O.K. Cereal' сytokinin-binding proteins belonging to putative receptor family recognize purine as well as phenylurea cytokinins. //14th International Conference of Plant Growth Substances: Amsterdam, 1991. p. 44.
2. Orudgev B.M., Taran Y.Ya., Brovko.A., Romanov O.A. Temporal and spatial distribution of soluble cytokinin binding proteins in cereals: its relation to cytokinin content and sensitivity. // 14th' International Conference of Plant's Growth Substances: Amsterdam, 1991. -p.51.
3. Karavaiko N. N., Selivankina S.Yu., Brovko F.A., Zemlyachenko Ya.V., Shipilova S. V., Zagranichnaya T.K., Lipkin V. M., Kulaeva O. N. Zeatin-binding proteins participating in cytokinindependent activation of transcripton. // In Plant Hormone signal perception and signal transduction Ed by Smith A.R., Berry A.W., J. Harpharm N.V., Moshkov I.E., Novikova G.V., Kulaeva O.N. and Hall M.A.
Kluwer Academic Publ., Dordrecht. 1996 pp. 67-76.
4. Brovko F.A., Zagranichnaya T.K., Boziev Kh.M., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Lipkin V.M., Kulaeva O.N. A cytokinin-binding protein from maize coleoptiles. // International symposium on plant hormone signal perception and transduction 1994, P. 13. Moscow 5. Шепеляковская А.О., Заграничная Т.К., Бозиев Х.М., Бровко Ф.А. Тест-система для обнаружения цитокинин-связывающего белка (ЦСБ-70) в растительных экстрактах. // Физикохимические основы физиологии растений и биотехнология, 3-й Съезд общества физиологов растений 1997,. Москва Россия.
6. Заграничная Т.К., Шепеляковская А.О., Бровко Ф.А., Бозиев Х.М., Липкин В.М., Кулаева О.Н.
Моноклональные антитела против ЦСБ-70 конкурируют с транс-зеатином за место связывания с рецептором. // Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология, 3-й Съезд общества физиологов растений 1997,. Москва Россия.
7. Шепеляковская А.О., Заграничная Т.К., Бозиев Х.М., Бровко Ф.А. Тест-система для обнаружения цитокинин-связывающего белка (ЦСБ70) в растительных экстрактах. Физикохимические основы физиологии растений и биотехнология, 3-й Съезд общества физиологов растений 1997,. Москва Россия.
8. F.A.Brovko, T.K.Zagranichnaya, Kh.M.Boziev, A.O.Shepelyakovskaya, N.N.Anikeeva, O.N.Kulaeva. Investigation of structure and functuons of cytokinin-binding protein CBP-70 from etiolated maize shoots. // International Conference Molecular, Biochemical and Physiological Aspects of Plant Science, 1997, Moscow.
9. Шепеляковская А.О., Васильева В.С., Бозиев Х.М., Булгакова Е.В., Ламан А.Г., Бровко Ф.А., Кулаева О.Н. Иммунохимическое исследование рецептора цитокининов из этиолированных проростков кукурузы. Распределение по растению. IV Съезд общества физиологов растений России 1999, стр. 786. Москва, Россия.
10. Великов В.А., Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Ракова Н.Ю., Бровко Ф.А. Получение комбинаторных библиотек одноцепочных антител; селекция и характеристика миниантител к зеатин-рибозиду. // Иммуноанализ регуляторов роста в решении проблем физиологии растений, растениеводства и биотехнологии. 2000, стр. 5. Уфа, Россия.
11. Шепеляковская А.О., Васильева В.С., Бозиев Х.М., Ламан А.Г., Бурханова Э.А., Бровко Ф.А., Кулаева О.Н. // Иммуноанализ регуляторов роста в решении проблем физиологии растений, растениеводства и биотехнологии. 2000, стр. 12-13. Уфа, Россия.
12. The 12th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology. Budapesht p.110, 2000.
13. Vasileva V.S., Pavlik L.L., Shepelyakovskaya A.O., Brovko F.A., Moshkov D.A., Kulaeva O.N.
Immunocytochemical localization of cytokinin receptor CBP70 in root tips tissue of maize shoots. // Plant Signaling Systems of Plant Cells 2001 p. 56. Moscow.
14. V.A. Velikov, A.O. Shepelyakovskaya, A.G. Laman, P.G. Suvorova, F.A. Brovko. Production of miniantibodies against zeatin in bacterial cells. International Symposium Intracellular Signalling in Plant and animal Systems. Kyiv, Ukraine, 9-14 September, 2001.
15. Shepelyakovskaya A.O., Teplova L.P., Veselov D.S., Bukharova E.A., Boziev Kh.M., Kudoyarova G.R., Brovko F.A., Kulaeva O.N. Cytokinin-binding protein - CBP70: The content in the root tip of 4-day maize plants. // Plant Signaling Systems of Plant Cells 2001 p. 107. Moscow.
16. V.S.Vasilyeva, L.L.Pavlik, A.L. Senina, A.O.Shepelyacovskaya, F.A.Brovko, D.A. Moshkov, O.N. Kulaeva. Distribution of cytokinin receptor CBP-70 in maize shoot tissues and cells. International Symposium Intracellular Signalling in Plant and animal Systems. Kyiv, Ukraine, 9-14 September, 2001.
17. F.A.Brovko, A.O.Shepelyakovskaya, E.A. Burchanova, Kh.M. Boziev, A.G.Laman, V.S.
Vasilyeva, M.A. Hall, O.N.Kulaeva. Predominant localization of cytokinine-binding protein (CBP-70) in the cell division zone of the apical root meristem. International Symposium Intracellular Signalling in Plant and animal Systems. Kyiv, Ukraine, 9-14 September, 2001.
18. Сенина Ф.Л., Васильева В.С., Долгих Ю.И., Бровко Ф.А. Исследование локализации ЦСБ70 во фракциях клеток суспензионной культуры кукурузы. // Рецепция и внутриклеточная сигнализация. 2003, стр. 299. Пущино, Россия.
19. Васильева В.С., Сенина А.Л., Шепеляковская А.О., Долгих Ю.И., Бровко Ф.А., Кулаева О.Н. ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ ЦСБ-70 В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ ПРОРОСТКА КУКУРУЗЫ // V съезд Общества физиологов растений России, 2003, Пенза, Россия.
20. Васильева В.С., Лушникова А.Л., Шепеляковская А.О., Мошков Д.А., Павлик Л.Л., Бровко Ф.А., Кулаева О.Н. ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ ЦИТОКИНИН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА 70кД МЕТОДАМИ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ // VI съезд физиологов растений 2007, стр. 175-176. Сыктывкар, Россия.