Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине  

На правах рукописи

Клименко

Мария Петровна

РЕЦЕПЦИЯ ПОЛОВЫХ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ КАК КРИТЕРИЙ ПРОГНОЗА И ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ И ПЕРЕНОСА ЭМБРИОНОВ

14.01.01 Ц Акушерство и гинекология (мед. науки)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва - 2012

Рабонта вынполнненна в Гонсундарнстнвеннном бюджетном обнранзонвантельнном учнренжнденнии высншенго пронфеснсионнальннонго обнранзонванния Роснсийнский национальнный исследовательский мендинциннский унинвернсинтет им. Н.И. ПироговаМинистерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО РНИМУ Минздравсоцразвития России)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор КАППУШЕВА Лаура Магомедовна

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор КАРЕВА Елена Николаевна

Официальные оппоненты:

Зуев Владимир Михайлович - доктор медицинских наук, профессор

(ООО Клиника ЛМС, главный специалист по акушерству и гинекологии).

Калинина Елена Анатольевна - доктор медицинских наук, профессор

(ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В. И. Кулакова, руководитель отделения вспомогательных технологий по лечению бесплодия).

Ведущее учреждение:

ГБОУ ВПО Первый московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова Минздравсоцразвития России

Защита состоится л____ ___________ 2012 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.06 при ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России по адресу: 127473, Москва, ул. Делегатская д. 20 стр.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного медико-стоматологического университета (127206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а)

Автореферат разослан _____ ________________2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

  доктор медицинских наук, профессор                                М.М. Умаханова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Одним из современных методов лечения бесплодия является экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов в полость матки (ЭКО и ПЭ), который широко используется в мире с 1978 года [Macklon N.S. et al., 2006]. Но, несмотря на технологические успехи, использование различных модифицированных схем стимуляций суперовуляций с применением современных препаратов эффективность этого метода недостаточно высока - частота наступления беременности на перенос эмбрионов в среднем составляет 30-40% [РАРЧ. Регистр центров ВРТ. Отчет за 2009 год.; European IVF-Monitoring Program 2006].

Залогом успешной имплантации и последующего нормального развития беременности является полноценная подготовка эндометрия к приему бластоцисты, что характеризуется как морфофункциональная полноценность эндометрия [С.С.К. Йен, 1998].

В настоящее время признаками  морфофункциональной зрелости эндометрия и одновременно критерием прогноза эффективности ЭКО являются толщина и морфологическая структура эндометрия. Однако, нет абсолютной зависимости между благополучным исходом ЭКО и толщиной эндометрия [Klentzeris L.D., 1990, Noci I., 1997, Noyes N., 2001].

Основой подготовки эндометрия к имплантации является гормональная стимуляция, при этом способность клеток адекватно отвечать на гормональный сигнал зависит от представленности рецепторов прогестерона (РП) и рецепторов эстрадиола (РЭ) в клетках-мишенях. Поэтому, о функциональной состоятельности эндометрия можно судить не только по косвенным параметрам (морфометрическим), но и по рецепторному статусу ткани. В частности, уровень рецепторов эстрогенов (РЭ)  и рецепторов прогестерона (РП), а также соотношение их (РП/РЭ) в эндометрии перед имплантацией может влиять на эффективность переноса бластоцисты [Christin-Maitre S., 1998; Funder JW 2000; Яманова М.В. и др., 2003; Mertens H.J.M.M. et al., 2001].

В литературе имеются отрывочные данные о рецепции женских половых стероидов в эндометрии и отдельных фракциях клеток белой крови при имплантации [Chien E.J. et al., 2007; Dosiou C. et al., 2008]. Однако, данные авторов весьма противоречивы и носят преимущественно качественный характер. При этом, рецепция половых стероидов в МНФК в количественном аспекте крайне мало изучена, а для ЭКО такие данные в доступной литературе вообще отсутствуют. Детальное изучение реципрокных гормональных отношений в клетках эндометрия и иммунной системы имеет как фундаментальное, так и прикладное значение.

Ограниченность информации об экспрессии рецепторов стероидных гормонов в эндометрии и отсутствие в доступной литературе данных об экспрессии рецепторов этих гормонов на клетках мононуклеарной фракции периферической крови у пациенток программы ЭКО и ПЭ, предположение об их корреляции и отсутствие надежного неинвазивного предиктора имплантации послужили основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования

Улучшение результатов экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов путем разработки информативного неинвазивного метода прогноза успешной имплантации.

Задачи исследования

1. Изучить гистологическую картину эндометрия и количественную экспрессию рецепторов женских половых стероидов в цитозоле эндометрия пациенток накануне лечения в стандартном длинном протоколе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов.
2. Определить уровень рецепторов женских половых стероидов в клетках мононуклеарной фракции периферической крови в динамике у пациенток в цикле экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов.
3. Провести корреляционный анализ рецепции женских половых стероидов в клетках мононуклеарной фракции периферической крови и в цитозоле эндометрия пациенток включенных в цикл экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов.
4. Исследовать влияние гормональных и негормональных факторов на уровень рецепторов прогестерона и эстрадиола в клетках мононуклеарной фракции периферической крови.
5. На основании полученных данных предложить критерий эффективности длинного протокола экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов.

Научная новизна

Впервые исследована динамика уровня РЭ и РП в клетках МНФ периферической крови у пациенток в программе ЭКО и ПЭ. а

Впервые с целью улучшения результатов и прогноза эффективности ЭКО и ПЭ был применен радио-лигандный анализ уровня РЭ и РП в эндометрии и МНФК, проведен сравнительный анализ полученных данных и в результате предложен новый прогностический критерий исхода лечения.

В результате проведенного комплексного исследования получены данные о корреляции уровня РП в эндометрии и МНФК, дающие возможность малоинвазивного прогнозирования исходов лечения. Изучено также влияние различных клинических и лабораторных параметров на уровень РП в МНФК, не выявлено достоверной связи данного параметра с различными характеристиками пациенток.

Резервом повышения эффективности ВРТаявляется предгравидарная циклическая гормональная терапия пациенток с низким уровнем РП на МНФК. Применение разработанного алгоритма введения пациенток в длинный протокол ЭКО и ПЭ позволит повысить эффективность дорогостоящего метода лечения.

Практическая значимость работы

Результаты исследования позволяют неинвазивно прогнозировать успех лечения в стандартном длинном протоколе ЭКО и ПЭ. Полученные в ходе исследования данные дают возможность предложить рекомендации по тактике ведения пациенток с неблагоприятным прогнозом лечения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Гистологическое функциональное несоответствие картины эндометрия фазе менструального цикла встречается довольно часто (примерно в 30% случаев) и не оказывает существенного влияния на исход последующего лечения в цикле экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов.
2. У пациенток со сниженным количеством рецепторов к женским половым стероидам в цитозоле эндометрия лечение в последующем цикле экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов менее эффективно.
3. Снижение количества рецепторов к женским половым стероидам в цитозоле эндометрия и клетках мононуклеарной фракции периферической крови не связано с возрастом и причиной бесплодия
4. Имеется тесная положительная корреляционная связь между уровнем рецепторов прогестерона в цитозоле эндометрия и в клетках мононуклеарной фракции периферической крови, что дает возможность разработать неинвазивный метод оценки рецепции к прогестерону
5. Уровень рецепторов в клетках мононуклеарной фракции периферической крови к прогестерону имеет прогностическое значение для наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов. При значении свыше 1,3 фемтомоль/млн клеток можно с достаточно высокой вероятностью прогнозировать успех последующего лечения. При более низких значениях рецепции вероятна целесообразность проведения предгравидарной подготовки.

Внедрение полученных результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены в практику отделения ЭКО КДО ГБУЗ ЦПСиР ДЗ г. Москвы. Материалы диссертации используются в педагогическом процессе на кафедре акушерства и гинекологии педиатрического факультета ГОУ ВПО РНИМУ Минздравсоцразвития РФ в лекционном курсе для клинических ординаторов и курсантов ФУВ.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены на совместной научно - практической конференции коллектива сотрудников кафедры акушерства и гинекологии педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н. И. Пирогова Минзравсоцразвития РФ и сотрудников городской клинической больницы № 31 и Центра планирования семьи и репродукции человека г. Москвы 25 января 2012 года, протокол №9.

Публикации

Основные положения диссертации отражены в 4 публикациях, из них 2 - в изданиях, рекомендуемых ВАК Минобрнауки.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4-х глав: обзора литературы (глава 1), клинической характеристики больных и описания методов исследования (глава 2), результатов собственных наблюдений (глава 3), обсуждения полученных результатов (глава 4), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 1 рисунком, 10 диаграммами и 32 таблицами. Указатель литературы включает 164 наименований, в том числе 34 на русском и 130 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследовано 50 пациенток с бесплодием. Возраст обследованных колебался от 20 до 40 лет, средний возраст составил 33,463,48. 11 пациенток (22%), вошедших в наше исследование, были позднего репродуктивного возраста - от 37 до 39 лет. У 14 обследованных (28%) бесплодие было первичное, вторичное бесплодие встречалось чаще - у 36 пациенток (72%). Длительность бесплодия варьировала в широком диапазоне от 1 до 19 лет (5,9±4,3). Частотный анализ выявил что cтруктура бесплодия была полиэтиологична, что в целом отражает общепопуляционную картину: у 32 (64%) - трубно-перитонеальный фактор, причем у 25 (50%) пациенток это была единственная причина бесплодия. У 11 (22%) выявился мужской фактор, причем у 7 (14%) пациенток это была единственная причина бесплодия. Наружный генитальный эндометриоз I-III степени в анамнезе по данным лапароскопии встречался у 10 (20%) пациенток, причем у 4 (8%) это была единственная причина бесплодия, у других 6 пациенток в сочетании с мужским или трубным фактором бесплодия. 4-м из 10 пациенткам с эндометриозом в анамнезе ранее были выполнены резекции яичников по поводу эндометриоидных кист. У 8 пациенток (16%) было диагностировано 2 и более причины бесплодия. У 6 (12%) пациенток причину бесплодия установить не удалось. 27 пациенток вступали в 1-ую попытку, 12 - во 2-ую, 5 - в 3-ю, 3 - в 4-ю, 2 - в 5-ю и 1 - в 6-ю.

Диаграмма 1. Структура бесплодия обследованных пациенток

Распределение обследованных пациенток осуществлялось ретроспективно в зависимости от результатов лечения на 2 группы: в I группу вошли 28 пациенток с наступившей беременностью, во II - 22 пациентки с безуспешной попыткой ЭКО и ПЭ.

Табл. № 1. Клиническая характеристика пациенток обследуемых групп

Показатель	I группа	II группа
Количество пациенток	28	22
Средний возраст пациенток, лет	32,83,5	34,33,3
Индекс массы тела	23,20,92	24,10,86
Возраст наступления менархе, лет	12,40,2	12,20,3
Длительность менструального цикла, дней	28,61,3	28,62,0
Длительность менструации, дней	5,40,9	5,50,8
Частота первичного бесплодия, %(кол-во пац.)	25 (7)	31,8 (7)
Частота вторичного бесплодия, %(кол-во пац.)	75 (21)	68,2 (15)
Длительность бесплодия, лет	5,64,5	64,0
Оперативное лечение бесплодия в анамнезе, %	68 (19)	64 (14)
Репродуктивный анамнез, %(кол-во пац.)
- роды	10,7 (3)	9 (2)
- медицинский аборт,	28,6 (8)	27 (6)
- самопроизвольный выкидыш	21,4 (6)	18 (4)
- внематочная беременность	25 (7)	23 (5)
Факторы бесплодия, % (кол-во пац.)
- мужской	21 (6)	23 (5)
- трубно-перитонеальный	64 (18)	64 (14)
- эндометриоз	25 (7)	14 (3)
- неясного генеза	14 (4)	9 (2)
- поздний репродуктивный возраст (от 37 до 39 лет)	18 (5)	27 (6)
- сочетание нескольких факторов	21 (6)	9 (2)
Количество попыток ЭКО в анамнезе	1,11,5	0,71

Таким образом, как видно по представленной выше таблице, обе группы достоверно не отличались по изученным параметрам.

В нашей работе, помимо общепринятых методов обследования перед проведением ЭКО и ПЭ согласно 67 приказу Минздрава РФ, проводились дополнительные анализы: определение уровня рецепторов эстрадиола и прогестерона в цитозоле эндометрия и в клетках МНФК. Определение рецепторов прогестерона и эстрадиола в цитозольной фракции проводили по методу Л. С. Бассалык [19870. Связывание стероидных гормонов в цитозоле выражали в фемтомолях гормона, связанного одним мг цитозольного белка. Выделение мононуклеарной фракции крови по методу Boyum A. [1983].

Цитозольную фракцию получали из биопсийного материала эндометрия дифференциальным ультрацентрифугированием, в которой определяли уровень РЭ и РП.

В крови определяли уровень эстадиола и прогестерона твердофазным хемилюминесцентным иммуноанализом, а также выделяли МНФК.

Выделенную фракцию МНФК периферической крови оценивали с помощью проточной цитофлуорометрии. В МНФК определяли уровень рецепторов радио-лигандным методом с использованием 3Н-эстрадиола и 3Н-прогестерона по методу Л. С. Бассалык [1987]. Для отделения несвязанной метки использовали стеклянные фильтры GF/B. Все исследования проведены в триплетах. Белок в цитозольной фракции определяли методом Lowry O.H. [1951]. РП и РЭ в эндометрии определяли радио-лигандным методом с использованием 3H-эстрадиола-17бета  и 3H-прогестерона (лAmersham GB).

На 20-22 день менструального цикла, перед взятием пациентки в цикл ЭКО, проводилась пайпель-биопсия эндометрия (у 31 пациентки, т.е. у 62%, у остальных данная процедура оказалась технически невозможной). Часть материала сразу же замораживалась для последующего определения РЭ и РП, а часть - фиксировалась в формалине для последующего гистологического исследования. В этот же день производился забор венозной крови из кубитальной вены с последующим определением уровня эстрадиола, прогестерона и уровня рецепторов на клетках МНФ (контрольная точка), повторного клинического анализа крови. Дополнительно забор крови для определения уровня рецепторов на клетках МНФ осуществлялся также в день забора яйцеклеток (2-я точка определения и в день трансфера эмбрионов в полость матки (3-я точка определения).

ечение проводилось по стандартному длинному протоколу ЭКО. Предварительную десенситизацию гипофиза проводилась агонистом гонадотропин-релизинг-гормона (аГнРГ) трипторелином - Диферелином фирмы  УBeaufour Ipsen InternationalФ, Франция (Диферелин 0,1мг ежедневно подкожно или Диферелин 3,75мг однократно). После контроля УЗИ в начале менструального цикла, через 10-14 дней десенситизации аГнРГ начиналась cтимуляция суперовуляции препаратами гонадотропинов, рекомбинантными (фоллитропином альфа - ГонаФ фирмы УMerck SeronoФ, Швейцария, а также фоллитропином бета - Пурегон фирмы УOrganonФ, Нидерланды) или мочевыми (менотропинами - Менопур фирмы УFerringФ, Германия) в индивидуально подобранных дозах от 100 до 300 МЕ на фоне продолжающегося ежедневного подкожного введения Диферелина 0,1мг в половинной дозе, т.е. по 0,05мг. За 36-38 часов УовуляторнаяФ доза хорионического гонадотропина 10.000 МЕ (Прегнил фирмы УOrganonФ, Нидерланды). Поддержка лютеиновой фазы всем пациенткам назначалась одинаковая: микронизированный прогестерон (Утрожестан фирмы УBesinsФ) 600 мг/сут в 3 приема интравагинально до результата на ХГЧ, в случае наступления беременности - еще, как минимум, 2 недели.

Трансвагинальная пункция и аспирация преовуляторных ооцитов проводилась через 35-36 часов после инъекции ХГЧ. Перенос эмбрионов в полость матки осуществлялся через 48-120 часов после начала культивирования in vitro. Одной пациентке переносилось до 3-х эмбрионов под контролем УЗИ абдоминальным датчиком аппарата фирмы УBruel & KierФ (Дания). Эмбрионы на стадиях 2-10 бластомеров или на стадии бластоцисты набирались в специальный стерильный одноразовый катетер (мягкий катетер фирмы УWallaceФ, Великобритания или УLabotechФ, Германия). При невозможности пройти цервикальный канал мягким катетером использовались наборы Set TDT фирмы УC.C.D. InternationalФ, Франция.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета статистических программ Statistica 6.0. для каждой из непрерывных величин приведены -среднее (М) и стандартное отклонение (CD) или медиана и верхняя и нижняя квартили в зависимости от типа распределения исследуемой величины. Гипотеза о нормальном распределении изучаемого показателя проверялись с использованием критерия Шапиро-Вилкса. При сравнении групп пациентов по основным показателям, полученным при включении в исследование, в зависимости от характера распределений использовались  U- критерий Манна-Уитни. Для статистического изучения связи между различными параметрами применялся непараметрический метод - коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования гормонального статуса на 2 - 4-й дни менструального цикла до включения пациенток в протокол лечения показали, что уровни гонадотропинов, ТТГ, половых стероидов и их соотношение, у всех пациенток находились в пределах нормативных значений. Результаты проведенного исследования показали, что уровни исследованных гормонов и их соотношение у пациенток  обеих групп до начала процедуры ЭКО достоверно не отличались (p>0,05).

Стимуляция суперовуляции вызывала значительное увеличение концентрации и эстрадиола и прогестерона по сравнению с нормой (при овуляции в интактном половом цикле) в 5-7 раз. Избыток женских половых стероидов явился следствием роста большого количества фолликулов.

В момент трансфера эмбриона в полость матки концентрация эстрадиола была выше нормативных значений практически в 46 раз и составляла 4585,6±103,8 pmol/l и в 10 раз выше, чем в контрольной точке, до начала стимуляции. Концентрация прогестерона  составляла 428,1±19,3 nmol/l, что в 10 раз превышает значения в контрольной точке, и в 9 раз - нормативные значения.

Таким образом, при исследовании гормонального статуса нами было выявлено следующее:

1. Базальный уровень эстрадиола, ФСГ, ЛГ и их соотношение, уровень тестостерона, пролактина и ТТГ у пациенток репродуктивного возраста с регулярным менструальным циклом с трубно-перитонеальным, мужским и сочетанными факторами бесплодия, а также с эндометриозом и бесплодием неясного генеза достоверно не отличались у пациенток с удачным и неудачным исходами лечения в стандартном длинном протоколе ЭКО и ПЭ;
2. Не выявлено достоверной разницы в уровне эстрадиола и прогестерона по группам в динамике в цикле ЭКО и ПЭ.

Морфологическое исследование биоптатов эндометрия перед проведением цикла ЭКО показало, что соответствие морфологической картины эндометрия хронологической фазе цикла было выявлено у 50,0% больных I группы (с успешной попыткой ЭКО) и у 30,8% во II группе с неэффективной попыткой ЭКО. Функциональное несоответствие эндометрия (а точнее, его отставание) фазе менструального цикла: у 44,5% пациенток в группе с успешной попыткой ЭКО и ПЭ и у 61,6% пациенток с неудачной попыткой ЭКО и ПЭ. Ни в одной группе не было выявлено ни одного случая опереженного созревания эндометрия.

Таким образом, наши данные иллюстрируют ненадежность критериев NoyesТ для оценки полноценности эндометрия, что также подтверждается другими исследователями. Так, по данным Coutifaris et al. 2004, у 49% фертильных и 43% бесплодных женщин по данным пайпель-биопсии эндометрий оказывается Уне в фазеФ. Если к этому прибавить сведения о том, что несовпадение оценок морфологии эндометрия среди гистологов встречается в 20-40% случаев [Duggan et al. 2001; Gibson et al. 1991; Scott et al. 1993; Smith et al. 1995], то целесообразность проведения данного вмешательства для оценки функционального состояния эндометрия и вовсе ставится под сомнение.

Нами также не было выявлено влияния самой процедуры взятия пайпель-биопсии эндометрия на последующий результат лечения, что идет вразрез с имеющимися в настоящее время литературными данными (Barash A et al. 2003; Raziel A et al. 2007; Zhou L et al. 2008). Возможно, отсутствие доказательства влияния данной процедуры на результат связано с малым объемом выборки (пайпель-биопсию удалось произвести лишь у 31 женщины) и однократностью вмешательства (так, например, Barash A и соавторы в 2003 проводили ее четырежды [34]).

Разделение пациенток на группы по признаку успешной имплантации не привело к выявлению достоверной разницы в рецепции женских половых стероидов в цитозоле эндометрия в зависимости от эффекта терапии.

У пациенток с успешной имплантацией уровень цитозольных рецепторов эстрадиола был максимальным и равнялся 30,57±14,28 фемтомоль/мг белка цитозоля. У женщин с отсутствием имплантации величина этого показателя была ниже и равнялась 9,325±9,325 фемтомоль/мг белка. Средняя концентрация рецепторов прогестерона у пациенток с успешной имплантацией составляла 152,9±65,69 фемтомоль/мг белка, тогда как при ее отсутствии - 164,3±107,4 фемтомоль/мг белка.

Индивидуальный анализ полученных данных показал, что у пациенток с успешной имплантацией частота встречаемости нулевых значений уровня стероидных рецепторов в цитозоле эндометрия достоверно ниже по сравнению со второй группой: для РП - 37% против 57% (р0,05), для РЭ - 12% против 42% (р0,01). Не удивительно, что это правило распространяется и на отрицательные по обоим рецепторам образцы эндометрия: 12% в первой группе (успех имплантации) против - 29% во второй (р0,01).

Таким образом, окончательный анализ результатов нашего исследования не подтвердил гипотезу о достаточной информативности рецепции стероидов в эндометрии для прогноза успеха ЭКО. При этом, биопсия эндометрия является травматичной и болезненной процедурой, что в ряде случаев является причиной отказа пациенток от нее. Также не всем пациенткам удаётся произвести данную процедуру в связи со спазмом внутреннего зева, стенозом или особенностями направления хода цервикального канала. Так, в нашем исследовании у 19 (38%) из 50 пациенток биопсию эндометрия взять не удалось. Более того, массированная инфильтрация эндометрия иммунокомпетентными клетками в период имплантационного окна [Dekel N., 2010] позволяет переместить акценты нашего внимания на рецепцию женских половых стероидов именно в этих клетках.

Учитывая, что основным объектом нашего исследования являлась мононуклеарная фракция периферической крови, нами был проведен индивидуальный анализ данной фракции на содержание В- и Т-лимфоцитов и моноцитов с помощью проточного цитофлюориметра сортера FACSAria (Becton Dickenson Co). Полученные данные не отличаются от нормативных показателей мононуклеарной фракции периферической крови, все показатели периферического анализа крови пациенток сравнимы и достоверно не отличаются.

Значение клеток мононуклеарной фракции периферической крови (МНФК) в функционировании маточно-плацентарной единицы подробно изучено [Dekel N., 2010]. В частности, им отводится роль сдерживания системной иммунной реакции матери на аллогенный трансплантат (эмбрион) за счет продукции ингибирующих факторов. С другой стороны, мононуклеарные клетки крови находятся под гормональным контролем, т.к. в достаточном количестве экспрессируют рецепторы половых стероидов. Следовательно, нарушение рецепции половых стероидов на уровне МНФК может быть одной из причин бесплодия. Приведенные аргументы явились основанием для поиска критерия прогноза эффективности длинного протокола ЭКО и сравнения уровня рецепторов половых стероидов в МНФ периферической крови в группах больных с наступившей имплантацией и без таковой.

Кроме того, сравнительный анализ позволил выявить достоверную положительную корреляцию между рецепцией прогестерона в МНФК и цитозоле эндометрия, для РП коэффициент корреляции Spearman r = 0,71 (P=0,0032, alpha=0.05). В то же время не обнаружено корреляции в рецепции эстрадиола, что может быть следствием недостаточности объема выборки для данного параметра.

Приведенные нами данные свидетельствуют о том, что введение пациенткам препаратов для суперовуляции вызывает изменение плотности рецепторов прогестерона и эстрадиола в клетках периферической крови. Так, в день пункции фолликулов величина этого параметра и РЭ увеличилась в 1,3 раза по сравнению с контрольной точкой и составила для РП в среднем 36,48 ± 7,42 фемтомоль/млн.клеток с индивидуальными колебаниями от 4,3 до 63,4 фемтомоль/млн.клеток, а для РЭ - 7,28 ± 1,8 фемтомоль/млн.клеток с индивидуальными колебаниями от 1,4 до 20,6 фемтомоль/млн.клеток А в момент трансфера для РП равнялась 32,37 ± 9,2 фетомоль/млн.клеток с изменениями от 1,1 до 78,9 фемтомоль/млн.клеток, а для РЭ - увеличилась практически в 2 раза и равнялась 9,64 ± 3,65 фемтомоль/млн.клеток с изменениями от 1,0 до 26,4 фмоль/млн.клеток..

Анализ полученных данных показал, что средняя концентрация РП/РЭ в контрольной точке равнялась 10,96 ± 3,45, в день пункции яичников величина этого параметра составила в среднем 7,06 ± 1,26, в момент трансфера - 14,21 ± 7,8.

Таким образом, введение пациенткам препаратов для стимуляции суперовуляции (гонадотропинов на фоне агонистов гонадолиберинов) вызывает у них увеличение соотношения РП/РЭ в момент переноса эмбриона и снижение - в момент пункции и увеличение уровня РП и РЭ в МНФК периферической крови, что не удивительно, так как первую (начало протокола) и вторую (забор яйцеклеток) точки разделяет введение высоких доз гонадотропинов, что как видно из приведенных данных, отражается не только на рецепторном профиле тканей репродуктивного тракта женщины, но и влияет на плотность рецепторов иммунокомпетентных клеток и тем самым увеличивая чувствительность мононуклеаров к прогестерону и эстрадиолу, что необходимо для инициации, координации и поддержки процесса имплантации. Обращает на себя внимание резкое снижение РП/РЭ в МНФК при отсутствии успеха.

Среднее значение уровня РП в МНФК у пациенток I группы (с наступившей в результате лечения беременностью) в середине лютеиновой фазы предшествующего ЭКО цикла составило 4,78 фемтомоль/млн клеток. У пациенток II группы (в случае неудачной попытки ЭКО) данный параметр был в 1,8 раза ниже и составил 2,8 фемтомоль/млн. клеток, что оказалось статистически значимо ниже, чем в I группе (р=0,043).

Еще более информативные данные получены при анализе концентрации рецепторов прогестерона в МНФК пациенток включенных в программу ВРТ в зависимости от успеха имплантации с поправкой на внеэндометриальные причины отсутствия имплантации, в частности такого фактора, как лэмбрионы сомнительного качества. Уровень рецепторов прогестерона в группе пациенток с наступившей беременностью был достоверно выше по сравнению с уменьшенной на 7 пациенток II группой (р=0,0024).

При этом уровень рецепторов эстрадиола в МНКФ у пациенток I группы с наступившей в результате лечения беременностью в середине лютеиновой фазы предшествующего ЭКО цикла составил в среднем 2,79 фемтомоль/млн клеток. В случае неудачной попытки ЭКО (II группа) данный параметр остался на том же уровне и составил 2,59 фемтомоль/млн. клеток. Даже с учетом фактора лэмбрионы сомнительного качества уровень рецепторов эстрадиола статически достоверно не различался в группах обследованных больных.

Так как нашей целью было разработать критерий эффективности длинного протокола ЭКО и ПЭ, а уровень РП и соотношение РП/РЭ на МНФК в контрольной точке (середине лютеиновой фазы цикла перед назначением аГнРГ) оказались единственно прогностически ценными для наступления беременности, то уровень рецепторов МНФК к прогестерону и был выбран таким критерием.

В нашей работе проверка основной гипотезы позволила сделать следующее заключение - рецепция прогестерона в МНФК может служить прогностическим признаком эффективности ЭКО. Пограничным значением рецепции прогестерона в МНФК является 1,3 фемтомоль/млн клеток. То есть, если накануне предполагаемого лечения (включения в длинный протокол ЭКО) значение данного параметра ниже пограничного значения, то вероятность успешной имплантации недопустимо мала и начало лечения должно быть отложено на срок от 3 до 6 месяцев, во время которого будет проведена предгравидарная подготовка. По данным некоторых отечественных работ предварительная подготовка эндометрия с помощью ЗГТ значительно повышает эффективность ЭКО и ПЭ [Алиева К.У. 2007; Дюжева Е.В. 2010].

Уровень экспрессии РП на клетках МНФ периферической крови в контрольной точке положительно коррелирует только с уровнем экспрессии РП в цитозоле эндометрия и, по результатам нашего исследования, не коррелирует с возрастом, видом и фактором бесплодия и другими характеристиками пациенток, т.е. является достаточно независимым показателем. При его значении свыше 1,3 фемтомоль/млн клеток можно с чувствительность 86,9% и специфичностью 54,5% прогнозировать успех последующего лечения.

Для выявления возможной связи уровня рецепции стероидных гормонов в иммунокомпетентных клетках с различными причинами бесплодия разделение пациенток осуществляли по признаку причины бесплодия или известных факторов риска снижения эффективности ВРТ (трубно-перитонеальный фактор, поздний репродуктивный возраст, эндометриоз и т.д.). Группу сравнения в каждой аналитической серии составили лостальные (пациентки без рассмативаемого признака из общей выборки = II группа).

Табл. № 2. Рецепция эстрадиола и прогестерона в МНФК периферической крови пациенток с трубным фактором бесплодия и в группе сравнения.

	Трубный фактор	Остальные	р
РП МНФК	5.086 1.157	1.541 0.6312	0,0104
РЭ МНФК	2.892 0.7628	1.883 0.5485	0,2889

Приведенные данные свидетельствуют о том, что у пациенток с трубным фактором бесплодия уровень РП в МНФК был достоверно выше, чем у женщин с иными причинами бесплодия, что отражает факт наибольшей эффективности ВРТ в лечении пациенток именно этой нозологической группы.

Cтатистической значимости различий рецепции эстрадиола и прогестерона в МНФК периферической крови у пациенток позднего репродуктивного возраста, с наружным генитальным эндометриозом и бесплодием неясного генеза достигнуто не было. Однако, обращает на себя внимание очевидная тенденция к снижению уровня РП у пациенток старшей возрастной группы, что перекликается с данными о снижении вероятности положительного результата ВРТ у этих пациенток. Также можно отметить тенденцию к снижению уровня РП у пациенток с бесплодием неясного генеза и повышению уровня РП в МНФК у пациенток с эндометриозом, что вполне ожидаемо, так как эндометриоз является эстрогенозависимым заболеванием и развивается на фоне относительной гиперэстрогеногистии. В свою очередь, эстрадиол является фактором промотирующим экспрессию РП в ткани (в том числе на МНФК).

В отношении динамических процессов более надежными (объективными) показателями будут не столько абсолютные значения плотности рецепторов, сколько их количественное соотношение или наличие корреляционной связи, поэтому для оценки стабильности (предсказуемости, управляемости) системы мы использовали корреляционный анализ. Результаты анализа приведены в таблице:

Табл. № 3. Результаты корреляционного анализа соотношения плотности рецепторов эстрадиола и прогестерона в МНФК у пациенток включенных в длинный протокол ВРТ в зависимости от причины бесплодия.

Причины бесплодия	признак		остальные
	r	р	r	р
Трубный фактор	0,386	0,039	0,048	0,854
Возрастной фактор	0,107	0,651	0,349	0,08
Эндометриоз	0,191	0,573	0,236	0,172
Неясного генеза	0,222	0,662	0,303	0,061

       Из приведенных данных видно, что относительная стабильность (положительная корреляция между РП и РЭ) наблюдается только у пациенток с трубным бесплодием. Тенденция к лучшей управляемости системы выявлена у пациенток более молодого возраста и у пациенток с четко определенной причиной бесплодия. Эти результаты соответствуют литературным данным о факторах риска низкой эффективности ВРТ.

Что касается параметров проведенного цикла ЭКО и ПЭ, то пациентки обеих групп достоверно не отличались по следующим показателям: суммарной введенной дозе гонадотропинов (p>0,05), длительности стимуляции (p>0,05), количеству полученных при пункции яичников ооцитов (p>0,05), доле циклов с проведением ИКСИ (p>0,05), количеству 2рn зигот (p>0,05), количеству перенесенных в полость матки эмбрионов (p>0,05), суткам переноса (p>0,05), толщине эндометрия в момент проведения трансфера (p>0,05) и количеству криоконсервированных эмбрионов (p>0,05).

Табл. № 4. Результаты лечения пациенток I группы:

Показатель
Количество пациенток	28
Одноплодная беременность	17 (61%)
Бихориальные двойни	11 (39%)
Замершие беременности в I триместре	2 (7%)
Поздние самопроизвольные  аборты (на 20 неделе беременности)	2 (7%)
Роды	24 (86%)
Из них срочные роды	18 (75%)
Из них срочные роды одним плодом	12 (63%)
Из них срочные роды двумя плодами	7 (37%)
Преждевременные роды (от 32 до 37 нед.)	6 (25%)
Из них преждевременные роды одним плодом	4 (67%)
Из них преждевременные роды двумя плодами	2 (33%)
Неоперативные роды	9 (37,5%)
Плановое кесарево сечение	11 (45,8%)
Экстренное кесарево сечение	4 (16,7%)
Количество живых рожденных детей	32
Из них из двоен	16

Пациентки II группы были также ретроспективно (спустя 2 года) разделены на 2 группы: к группе А были отнесены 10 забеременевших самопроизвольно или с помощью позднее проведенных циклов ВРТ, а к группе В 12 так и не забеременевших (ни самопроизвольно, ни в результате повторно проведенного лечения) пациенток.

Интересным оказался тот факт, что пациентки этих ретроспективно выделенных подгрупп имели различия по рецептивности МНФ в 1-й точке исседованного нами цикла.

На клетках МНФ периферической крови в последующем забеременевших пациенток содержалось большее количество как РП (среднее значение 3871 против 647), так и РЭ (среднее значение 5072 против 1468), а соотношение количества этих рецепторов имело сдвиг в сторону преобладания РП над РЭ (в среднем 4,05 против 1,96). Однако, несмотря на такую тенденцию, разница не достигла статистически значимых отличий (p=0,456; p=0,203 и p=0,628 соответственно). 

8 пациенткам группы А перед проведением криоПЭ и повторных попыток ЭКО и ПЭ назначалась циклическая гормональная терапия в течение 2-3-х месяцев препаратом трансдермального эстрадиола Дивигель фирмы УORION CORP.Ф (Финляндия) по 1,0 2р/сут в 1-ую фазу менструального цикла (c 5-го по 16-й дни) и препаратом микронизированного прогестерона Утрожестан фирмы УBESINS HEALTHCAREФ (Бельгия) 0,2 2р/сут во 2-ю фазу (с 16-го по 25 дни).

В результате проверки работы алгоритма, наблюдается информативное определение пациенток с отрицательным прогнозом успеха ЭКО в 91,3% случаев. Это позволит не допускать таких пациенток до включения в протокол, тем самым предотвратив финансовые потери и риск негативных последствий воздействия высоких доз гонадотропинов на организм пациентки, провести адекватную предгравидарную подготовку и, после повторного рецепторного анализа, провести потенциально эффективную попытку ВРТ.

ВЫВОДЫ

1. Готовность эндометрия к имплантации не зависит от соответствия гистологической картины эндометрия фазе менструального цикла в предшествующем процедуре ЭКО цикле и от содержания в цитозоле эндометрия рецепторов эстрадиола и прогестерона. Несоответствие гистологической картины эндометрия фазе менструального цикла выявлено у 44,5% пациенток с наступившей беременностью и у 61,6% пациенток с отсутствием эффекта от лечения. Разницы в уровне рецепции эстрадиола и прогестерона в цитозоле эндометрия у обследованных пациенток обеих групп не выявлено.
2. Эффективный цикл ЭКО сопровождался достоверным повышением уровня рецепторов прогестерона (РП) в мононуклеарной фракции периферической крови в сравнении с безуспешной попыткой ЭКО. Различий в рецепции эстрадиола в МНФК не выявлено.
3. Обнаружена тесная положительная корреляция между рецепцией прогестерона в цитозоле эндометрия и МНФК и отсутствие таковой в рецепции эстрадиола.
4. Корреляционный анализ показал отсутствие связи между рецепцией стероидных гормонов в эндометрии и МНФК и причиной бесплодия.
5. Новым неинвазивным критерием эффективности  ЭКО может являться уровень прогестерона в мононуклеарной фракции периферической крови (пограничное значение - 1,3 фемтомоль/млн клеток). У пациенток с уровнем РП ниже пограничного значения для повышения эффективности ЭКО необходима предварительная предгравидарная подготовка.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При исключении патологии эндометрия при УЗИ перед попыткой ЭКО и ПЭ прогностическая ценность гистологического исследования эндометрия, полученного путем неприцельной биопсии, невысока.
2. Оценка рецепторного статуса эндометрия радиолигандным методом не может служить маркером эффективности ЭКО и проведение данного, достаточно сложного, исследования не представляет собой практической значимости
3. Пациенткам, готовящимся к ЭКО, целесообразно проводить исследование уровня РП в МНФК радиолигандным методом перед взятием их в стандартный длинный протокол ЭКО и ПЭ. При уровне рецепции прогестерона в МНФК ниже 1,3 фемтомоль/млн клеток рекомендуется проведение предгравидарной подготовки  в течение 2-3х месяцев до нормализации данного показателя.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Савельева Г.М., Карева Е.Н., Клименко (Крамаренко) М.П., Каппушева Л.М., Сукновалова М.В. Состояние рецепции женских половых гормонов и эффективность экстракорпорального оплодотворения // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии - 2011. - том 10 - №1 - С. 24-28.
2. Савельева Г.М., Шимановский Н.Л., Клименко П.А., Карева Е.Н., Каппушева Л.М., Сукновалова М.В., Клименко (Крамаренко) М.П. Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции. Патент № 2430379 от 27.09.2011 // Изобретения. Полезные модели - 2011. - №27 - С. 1-7.
3. Сукновалова М.В., Клименко (Крамаренко) М.П., Карева Е.Н. Связывающие свойства рецепторов прогестерона и эстрадиола с Дюфастоном у пациенток включенных в программу экстракорпорального оплодотворения // Вестник Российского государственного медицинского университета. Специальный выпуск - 2011. - №1 - С. 217.
4. Большакова К.Б., Клименко (Крамаренко) М.П., Карева Е.Н., Тихонов Д.А. Экспрессия генов рецепторов стероидных гормонов в мононуклеарной фракции периферической крови у женщин старшего возраста, включенных в программу ЭКО // Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний. Материалы XXIV международного конгресса с курсом эндоскопии - 2011 - С. 159-160.

  Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине