Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Колышкин Владимир Михайлович
Разработка и внедрение технологии промышленного производства и системы управления качеством ассоциированной паротитно-коревой вакцины
03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва - 2010
Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина (ФГОУ ВПО МГАВМиБ) и в Московском подразделении по производству бактерийных препаратов (МПБП) ФГУП научно-производственного объединения МИКРОГЕН Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Научный консультант: Доктор биологических наук, доцент
Васильев Алексей Васильевич
Официальные оппоненты:
1. Доктор ветеринарных наук, профессор Белоусова Раиса Васильевна;
2. Доктор биологических наук, профессор Еремец Владимир Иванович;
3. Доктор биологических наук, профессор Тихонова Нина Тимофеевна.
Ведущая организация: Государственное Учреждение НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН
Защита состоится л __________ 2010 года в ____ часов на заседании Диссертационного совета Д.220.042.01 при ФГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина по адресу: 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел. (495) 377-93-83
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И.Скрябина.
Автореферат разослан л____ _______ 2010 года.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
профессор Грязнева Т.Н.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Борьба с инфекционными болезнями, составляющими 60-70% общей патологии человека, является важнейшей задачей современной медицины. Система мер профилактики и борьбы с инфекционными заболеваниями многообразна, но ведущее место в ней принадлежит вакцинации (В.Ф. Учайкин, 2001, Н.В. Медуницын, 2004). Именно с прививками связаны достигнутые в борьбе с инфекциями успехи, на них строятся и перспективы ликвидации некоторых из них. Иммунопрофилактика получила широкое распространение в мировой медицинской и ветеринарной практике. Так, ежегодно в мире вакцинируется около 1,5 млрд. человек, что составляет около 1/4 населения планеты (Г.Г. Онищенко, 2006) и до 70 % поголовья животных (И.А. Бакулов, 1998). В РФ вакцинация взята под контроль Государства (Федеральный Закон от 17 сентября 1998г. № 157-ФЗ "Об иммунопрофилактике инфекционных болезней", Приказ от 27.06.2001 № 229 МЗ РФ).
Стратегия и тактика вакцинопрофилактики вирусных инфекций затруднена в ряде случаев из-за перегруженности календаря прививок. Одним из радикальных решений данной проблемы является разработка и рациональное использование вместо моно препаратов ассоциированных вакцин, применение которых имеет несомненные преимущества в плане сокращения количества инъекций, снижения уровня аллергизации населения, создания напряженного иммунитета одновременно к нескольким инфекциям (Б.Ф.Семенов 2003, В.В.Зверев, 2005).
При разработке и апробации ассоциированных вакцин предварительно оцениваются совместимость и оптимальное соотношение исходных антигенов, дозы и схемы вакцинации и ревакцинанции, а также клинико-иммунологическое обоснование возможности и эффективности применения препаратов. Каждая новая разработка ассоциированных вакцин оценивается с учетом указанных требований (Попов В.Ф., 2002).
Важность проблемы стабильного производства иммунобиологических препаратов, используемых для выполнения Национального календаря профилактических прививок, связана с тем, что Всемирная Организация Здравоохранения поставила перед национальными органами здравоохранения задачу ликвидации заболеваемости корью и резкого снижения заболеваемости эпидемическим паротитом в мире к 2010 году (Бектемиров Т.А., 2002).
В настоящей работе приведены материалы исследований по разработке технологии производства ассоциированной вакцины против кори и эпидемического паротита (АПКВ), созданию и внедрению системы управления качеством, включая анализ стабильности производства вакцинных препаратов с помощью статистических методов управления качеством.
Цель и задачи исследований:
Целью настоящей работы явилась разработка технологии промышленного производства ассоциированной паротитно-коревой вакцины, изучение безопасности и эффективности нового вакцинного препарата и внедрение его в практику. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Определить пригодность вакцинного штамма эпидемического паротита Ленинград-3 (Л-3) для включения его в АПКВ.
2. Создать систему управления качеством и проведения анализа технологических процессов производства препаратов, изготавливаемых на предприятии в соответствии с требованиями стандартов надлежащей производственной практики GMP.
3. Провести оценку стабильности промышленного производства моновакцин для создания ассоциированного препарата.
4. Разработать методы контроля и мониторинга, позволяющие получить доказательства стабильности производства монопрепаратов.
5. Создать промышленную технологию производства АПКВ, провести производственные испытания в соответствии с требованиями программы, утвержденной ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ГИСК).
6. Провести оценку стабильности производства АПКВ с использованием современных специализированных программных пакетов по статистической обработке и анализу данных производственно-технологических процессов.
7. Разработать и утвердить нормативную документацию на производство АПКВ.
8. Оценить эпидемиологическую эффективность применения АПКВ по разработанной технологии в медицинской практике.
9. Оценить экономическую эффективность внедрения новой технологии производства АПКВ.
Научная новизна:
1. Впервые на основе существующей аппаратурно-технологической базы создано промышленное производство АПКВ, для обеспечения потребности РФ в средствах защиты от кори и эпидемического паротита.
2. На основе созданной производственной базы осуществляется выпуск АПКВ для обеспечения национального календаря профилактических прививок (Приказ от 27.06.2001 № 229 МЗ РФ).
3. Разработаны методы контроля клеточных линий, используемых для производства АПКВ. Внедрена система управления качеством при производстве монопрепаратов и АПКВ.
4. Проведена оценка эпидемиологической эффективности АПКВ в условиях массового применения (более 20 млн. доз, 2001-2009 г.г.)
Научно - практическая новизна результатов работы подтверждена получением патентов:
- Патент РФ на изобретение № 2158134 от 27.10.2000г. Способ получения ассоциированной паротитно-коревой вакцины. Зайцев И.З., Колышкин В.М., Сидоренко Е.С., Попов В.Ф., Юминова Н.В., Красильников И.В., Дорофеева Л.В.
- Евразийский патент № 002387 от 25.04.02г. Способ получения ассоциированной паротитно-коревой вакцины. Зайцев И.З., Колышкин В.М., Сидоренко Е.С., Попов В.Ф., Юминова Н.В., Красильников И.В., Дорофеева Л.В.
Практическая значимость и внедрение результатов научных исследований в производство:
1. Ассоциированная вакцина, производимая по разработанной технологии, используется для профилактики кори и паротита у детей соответствующих возрастов.
2. Разработана и утверждена в установленном порядке нормативная документация (НД) на производство АПКВ.
3. Вакцина АПКВ включена в Национальный календарь профилактических прививок РФ.
4. На предприятии-изготовителе действует система управления качеством в соответствии с требованиями ГОСТ Р 52249-2004.
5. Результаты научных исследований по разработке технологии приготовления АПКВ используются в учебном процессе по дисциплине Биотехнология в ФГОУ ВПО МГАВМиБ.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты работы доложены и обсуждены на:
- Международном конгрессе Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы. (СПб., 2003 г);
- I-ом Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству. (Москва, 2005 г.);
- IX - XV Международных конференциях Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (Гурзуф 2001-2007);
- VIII, IX съездах Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. (Москва, 2006,2007 г.г.);
- Российском симпозиуме с международным участием БИОФАРМА-2009. (Анталия, 2009 г.).
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 296 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, собственных исследований, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 155 источника (83 отечественных и 72 зарубежных) авторов и приложения на 25 листах. Работа иллюстрирована 197 рисунками и содержит 57 таблиц.
Публикации
Основные научные результаты по материалам, изложенным в диссертации, опубликованы в 62 работах, из них в рецензируемых научных изданиях и журналах, рекомендованных ВАК, опубликовано 15 работ, получено 2 патента.
Основные положения и результаты, выносимые на защиту:
1. Впервые созданная технология промышленного производства АПКВ на основе аттенуированных вакцинных штаммов вируса эпидемического паротита Л-3 и кори Л-16, позволяет обеспечить выпуск препарата в требуемых объемах для проведения профилактических мероприятий.
2. Критерии оценки пригодности клеточных систем культивирования и контроля, позволяющие осуществлять стабильное промышленное производство вакцин надлежащего качества с полноценными иммунобиологическими свойствами, обеспечивающее безопасное и эффективное применение.
3. Разработанная система управления качеством, включающая контроль сырья, материалов, полуфабрикатов, готовой продукции, мониторинг показателей технологических процессов при производстве АПКВ позволяет получить объективную оценку качества продукции.
4. В результате созданной технологии производства и системы управления качеством в период с 2001 года по настоящее время выпущено более 20 млн. доз АПКВ.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы исследований
Для создания ассоциированной паротитно-коревой вакцины использовали вакцинные штаммы, применяемые для изготовления моновакцин: Ленинград -16 (Л-16) вируса кори; Ленинград - 3 (Л-3) вируса эпидемического паротита. Их культивировали в первично-трипсинизированных фибробластах эмбрионов японского перепела. Перепелиные яйца и перепелиные эмбрионы соответствовали требованиям ФСП 42-01450431- 00 Эмбрионы японского перепела для производства вирусных вакцин.
Процесс изготовления АПКВ включает получение вируссодержащей жидкости (ВСЖ) кори и эпидемического паротита, сведение их с защитной средой (получение жидкого полуфабриката), с последующим объединением жидких полуфабрикатов. Стабильный выпуск моновакцин против кори и эпидемического паротита надлежащего качества позволил разработать новую оригинальную технологию производства ассоциированной паротитно-коревой вакцины.
Из эмбрионов перепелов за один производственный цикл готовят клетки для засева 24 роллерных культуральных флаконов, 20 из которых заражают вакцинным вирусом кори, штамм Л-16, в дозе от 0.01 до 0.001 ТЦД50 на клетку и инкубируют при температуре 360,2о С, 4 флакона оставляют контрольными. Из 20 зараженных роллерных флаконов получают около 6 литров вируссодержащей жидкости 1-4 сливов. Каждый полученный слив в объеме около 0,3 л контролируют на отсутствие контаминантов и определяют величину специфической активности титрованием в культуре клеток Vero.
Состояние перевиваемых линий клеток контролировали с помощью проточной цитометрии с использованием проточного цитофлуориметра EPICS-5 (Coulter Electronics, США). Учет специфической активности вируса проводили по цитопатическому действию вируса и рассчитывали по методу Reed L.J., Muench H.A., (1938).
Не содержащие контаминантов жидкие полуфабрикаты, полученные за один технологический цикл, со специфической активностью более 4,2 lg ТЦД50/0,5 мл хранят при температуре минус 50-56оС в течение необходимого времени, затем размораживают, повторно титруют, сводят в один пул и используют для сведения с полуфабрикатом вакцины против эпидемического паротита.
Технология производства паротитной моновакцины очень близка к технологии производства коревой вакцины и различается в деталях. В соответствии с регламентом и ФС 42-0038-00 Вакцина паротитная культуральная живая сухая производится из отечественного штамма Л - 3. Отличия в технологии изготовления паротитной вакцины касаются дозы заражения, времени съема и количества сливов. Контроль над качеством титрования вирусных сборов проводится с помощью отраслевого стандартного образца (ОСО) вакцинного вируса эпидемического паротита.
Главным достижением в технологии производства ассоциированной паротитно-коревой вакцины является разработка способа сведения полуфабрикатов кори и эпидемического паротита, обеспечивающего в сухом препарате преобладание паротитного компонента над коревым приблизительно на 1 lg.
Жидкие полуфабрикаты кори и эпидемического паротита, являющиеся полуфабрикатами для моновакцин, сводят в определенном соотношении, как указано в патенте, тщательно перемешивают, разливают в ампулы и лиофилизируют.
Одна прививочная доза АПКВ содержит:
- не менее 1000 ТЦД50 - 3 lg тканевых цитопатогенных доз (ТЦД50/0.5 мл) вируса кори;
- не менее 20 000 ТЦД50 - 4. 3 lg ТЦД50/0.5 мл вируса эпидемического паротита;
- антибиотик - гентамицина сульфат не более 25 мкг;
- стабилизатор - смесь ЛС-18 - 0,08 мл., и 0,002 г. желатина.
С целью стандартизации процесса титрования обоих вирусов на предприятии создан банк перевиваемых культур клеток, который аттестован ГИСК им. Л. А. Тарасевича.
С целью управления производством с использованием процессного подхода на основе реальной информации, на предприятии создана система обеспечения качества в соответствии с требованиями стандартов ИСО серии 9000 (Колышкин В.М., 2004).
Стабильность производства компонентов и готового продукта АПКВ изучали с использованием статистических методов (Митрохин И.Н., Орлов А.И., 2007; Орлов А.И., 1997). Анализу подвергали записи маршрутных листов технологического процесса получения коревой и паротитной вакцин, имеющиеся на предприятии в электронном виде.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
Учитывая, что технология создания суммирует технологии создания коревой и паротитной моновакцин, нами рассмотрены вопросы создания моновакцин, а затем приведены данные по готовому продукту - ассоциированной паротитно-коревой вакцине.
Характеристика универсального субстрата для промышленного производства полуфабрикатов коревой и паротитной вакцин.
Фибробласты перепелов являются единым субстратом для производства вакцин против кори и эпидемического паротита. Все операции по получению культуры регистрировали в разработанных маршрутных картах. Эффективность и стабильность процесса трипсинизации оценивали по выходу клеток на 1 г. ткани. В табл. № 1, 2 приведены результаты оценки выхода клеток в период с 2002 по 2005 годы на участках по производству коревой и паротитной вакцин.
Таблица № 1
Анализ данных по выходу клеток на участке по производству коревой вакцины за 2002-2005 г.г.
Год | Количество колб | Выход клеток 106/г. | ||||
M | Мин. | Макс. | Размах | С v % | ||
2002 | 19 | 65,35,0 | 55,7 | 72,2 | 16,5 | 7.66 |
2003 | 26 | 63,94,3 | 53,6 | 70,1 | 16,5 | 6.72 |
2004 | 36 | 60,74,0 | 51,5 | 71,8 | 20,3 | 6.59 |
2005 | 50 | 60,75,5 | 46,6 | 82,9 | 36,4 | 9.06 |
Как видно из приведенных данных выход клеток составил ~ 61-65 млн. на 1 грамм ткани. Аналогичные данные были получены по оценке процесса получения клеток на участке по производству паротитной вакцины.
Таблица № 2
Анализ данных по выходу клеток на участке по производству паротитной вакцины за 2003-2005 г.г.
Год | Количество колб | Выход клеток 106/г. | ||||
M | Мин. | Макс. | Размах | С v % | ||
2003 | 32 | 76,64,3 | 68,0 | 83,4 | 15,4 | 5.61 |
2004 | 39 | 74,73,6 | 67,0 | 80,2 | 13,2 | 4.82 |
2005 | 23 | 75,13,1 | 71,4 | 85,3 | 13,9 | 4.13 |
Как видно из приведенных в табл. 1,2 данных, процесс трипсинизации и на паротитном и на коревом участках проходит в стабильном режиме. Однако судя по выходу клеток, эффективность трипсинизации на участке по производству паротитной вакцины выше (на 20%), а коэффициент вариации ниже.
Низкие и близкие по значению показатели размаха и коэффициента вариации в период 2002-2008 гг. свидетельствуют о стабильности процесса промышленного получения культур клеток. В 2005 г. в связи с увеличением необходимого объема получения клеток для производства коревой вакцины, вариабельность процесса трипсинизации возросла в среднем на 2%, что хорошо согласуется со случайным характером воздействий, ответственных за разброс. Более наглядные выводы были получены после обработки всего массива данных с использованием программного продукта компании Stat Soft Статистика-5.5.
В качестве примера приведены результаты за 2004 г. на участке по производству коревой вакцины (Рис. 1).
Контрольная Х- карта Шухарта по выходу клеток на грамм ткани на коревом участке за 2004 год (по порциям при n=2)
Рисунок № 1. Х-карта выхода клеток на коревом участке
Анализ контрольной карты свидетельствует о стабильности процесса трипсинизации в коревом подразделении, так как колебания показателей укладываются в рамки 3 . Сходные данные получены и при анализе стадии получения фибробластов эмбриона перепела в паротитном подразделении. Полученные результаты демонстрируют стабильность приготовления клеток для производства вакцин как в паротитном, так и в коревом подразделениях, а повышенный выход клеток при производстве паротитной вакцины обосновывает необходимость создания единого подразделения для трипсинизации клеток, что и было реализовано с 2006 г.
Анализ поствакцинальных осложнений при использовании вакцинных штаммов вирусов эпидемического паротита и кори.
По данным ВОЗ, ретроспективный анализ остаточной нейровирулентности, проведенный Galazka A.M., et all., 1999 указывает на наличие высокой частоты возникновения поствакцинальных асептических менингитов, 20-100 случаев на 100.000 доз вакцины, произведенной с использованием штамма Л-3 Загреб.
Эти данные расходятся с результатами, наблюдаемыми при массовой вакцинации против эпидемического паротита в РФ вакциной произведенной с использованием отечественного штамма Л-3, 0-4 случая на 100.000 доз вакцины.
Только при анализе многолетних накопленных данных можно получить статистически значимые результаты. Мы изучили совместно с проф. С.М. Харит (НИИ детских инфекций, г. С-Петербург) частоту серозного менингита, возникающего при массовой вакцинации штаммом Л-3 вируса паротита. Расчет частоты подтвержденных вакциноассоциированных серозных менингитов на число доз использованной вакцины в г. Санкт-Петербурге показал, что в 2001 г. был 1 случай на 97.178 доз (показатель 1,03 на 100.000), а в 2002 г. - 3 случая на 114391 дозу (2,6 на 100.000). Полученные результаты практически совпадают с представленной в литературе частотой менингитов при использовании штамма Jeryl Lynn и свидетельствуют о высокой безопасности отечественного вакцинного штамма Л-3.
По эффективности штамм Л-3, по нашим совместным с проф. С.М. Харит исследованиям, не уступает японскому штамму Urabe, а по степени реактогенности (из-за отсутствия куриного белка) штамм Л-3 находится на более низком уровне, чем другие вакцинные штаммы вируса эпидемического паротита. Учитывая, что у всех вакцинных штаммов вируса паротита, за исключением швейцарского штамма Rubini, определена последовательность нуклеотидов полного генома, мы смогли провести сравнение всех опубликованных полных геномов вирусов паротита в сравнении с вакцинными штаммами Л-3 и Л-3-Загреб.
Построенное дерево родственных взаимоотношений указывает, что штаммы Л-3, Л-3-Загреб, Jeryl Lynn, Urabe значительно различаются.
Исследования, проводимые согласно регламенту с периодичностью 3-5 лет на обезьянах, при использовании внутримозгового инфицирования, свидетельствуют об отсутствии нейровирулентности штамма Л-3 в сравнении с другими вакцинными штаммами.
Коревой вакцинный штамм Л-16, как и другие используемые для производства противокоревых вакцин, принадлежат к генотипу А.
Сравнение вакцинных штаммов вирусов кори, используемых при производстве за рубежом, и штамма Л-16, применяемого для производства коревой вакцины в России, позволило нам вместе с сотрудниками ГИСК им. Л.А. Тарасевича выявить, что вакцина на основе штамма Л-16 не уступает по эффективности и безопасности вакцинам, применяемым в развитых странах, и характеризуется меньшей реактогенностью по сравнению с ними. В табл. 3 приведены обобщенные данные.
Таблица № 3
Сравнительная характеристика вакцин против кори, произведенных за рубежом и в РФ.
Страна, фирма | Штамм | Кол-во наблюдений | Номер серии | Специфическая активность, lg ЦПД50 / 0,5 мл | Кол-во реакций, % |
Франция, Пастер-Мерье | Шварц | 62 | 631 1054 | 3,80 3,97 | 15 |
Япония, Eisai | Кам-70 | 68 | 352 353 | 4,52 4,27 | 18 |
Россия, МПБП | -16 | 51 | 310 347 | 3,95 4,32 | 3 |
Контроль | Без вакцинации | 52 | - | - | 3 |
Проведенный нами анализ показывает, что применяемые в РФ вакцинные штаммы Л-16 вируса кори и Л-3 вируса эпидемического паротита отвечают всем требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам.
Оценка стабильности промышленного производства моновакцин против кори и эпидемического паротита для создания ассоциированного препарата.
Технология производства полуфабрикатов паротитной и коревой вакцин включала следующие стадии:
- получение первично-трипсинизированных фибробластов японского перепела;
- инфицирование клеточной суспензии и культивирование вируса в роллерных аппаратах;
- отмывание зараженных монослоев клеток и культивирование вируса на клетках в бессывороточной среде;
- получение индивидуальных сборов вакцинных вирусов;
- объединение индивидуальных сборов;
- осветляющую фильтрацию, добавление криопротектора и получение жидкого полуфабриката.
Полученные полуфабрикаты использовали как для приготовления моновакцин против кори и паротита, так и для приготовления ассоциированной вакцины. Предпринимаемые ранее попытки создания АПКВ не увенчались успехом из-за невозможности получения компонентов вакцины с требуемыми параметрами. С целью устранения выявленных недостатков нами была предложена методология описания производственных процессов с фиксированием измеряемых характеристик и величин. Для этого мы провели статистический анализ параметров технологического процесса, контролируемых при производстве моновакцин.
Подбор линии клеток для контроля специфической активности вирусов кори и эпидемического паротита.
Оценку биологической активности полученных вирусов, согласно регламенту, проводили в монослойной культуре клеток Vero. Мы проанализировали 4 трофоварианта линии клеток VERO, полученные из Института вирусологии им Д.И.Ивановского (РФ), США, Канады и Англии.
Были отобраны 2 трофоварианта клеток VERO B и VERO WHO, которые были аттестованы в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и ЕСАСС соответственно.
Изготовление и паспортизация эталонного и рабочего банка линий клеток VERO.
Снижение уровня апоптоза в клетках, культивируемых in vitro, требует создания и использования эталонного и рабочего банков линий клеток, сохраняемых длительное время в жидком азоте и периодического их обновления. Банк клеток был создан в период с 2001 по 2003 г.г. в рамках выполнения исследований по данной диссертации на предприятии, что соответствует требованиям ВОЗ (1988) и РД 42-28-10-89. Для изготовления эталонного и рабочего банков использовали суспензии клеток линий VERO B и VERO WHO. Полученные культуры были размножены, культивированы стационарным и роллерным методами, проконтролированы на отсутствие возможных контаминантов, в т.ч. микоплазм. Были изучены ростовые свойства и морфология клеток при культивировании. Клетки были расфасованы в криопробирки, заморожены и заложены на длительное хранение в жидкий азот. Эталонные и рабочие банки линий VERO B и VERO WHO были изготовлены на изолированных площадях из клеток 140 и 141, 179 и 181 пассажей соответственно. После размораживания жизнеспособность клеток в суспензии линии VERO B и VERO WHO составила 87-92 и 89-94% . Клетки обладали удовлетворительными адгезивными и ростовыми свойствами, формировали монослой на 5-7 сутки инкубирования, а полученные культуры были стерильными, не содержали микоплазменной контаминации и не отличались морфологически от исходных клеток. Морфологические и культуральные свойства линий клеток VERO восстанавливались через 2-3 пассажа после криоконсервирования. Следует также отметить, что клетки линий VERO B и VERO WHO сохраняли на исходном уровне жизнеспособность и культуральные свойства в течение 2-х лет хранения (срок наблюдения) в жидком азоте.
При повседневном контроле специфической активности вирусных сборов и вакцин против кори и паротита использовали клетки Vero. и отраслевые стандартные образцы вирусов паротита штамм Л-3 (серия ОСО-8) и вируса кори штамм Л-16 (серия ОСО-347), аттестованные в ГИСК.
Для постоянного контроля активности вирусов кори и паротита лаборатория контроля использует в год не менее 10 ампул культур. Созданный рабочий банк позволил обеспечить производственные потребности в стандартном клеточном сырье на последующие, как минимум, 15 лет.
По материалам выполненных исследований созданы и паспортизированы эталонные и рабочие банки наиболее перспективных для контроля производства линий клеток VERO.
Статистическая оценка технологических процессов производства моно вакцин против кори и эпидемического паротита.
Статистическая оценка отраслевых стандартных образцов вакцинных вирусов на примере отраслевого стандартного образца (ОСО) 8 вакцинного вируса эпидемического паротита, штамм Л-3.
Стандартизовав линию клеток, пригодных для определения биологической активности, мы провели оценку технологических процессов производства моновакцин против кори и эпидемического паротита. С этой целью мы изучили процесс определения биологической активности. Для этого использовали данные по титрам специфической активности отраслевого стандартного образца ОСО 8 вакцинного вируса эпидемического паротита штамм Л-3 за 2004 год.
При анализе ОСО 8 было проанализировано 118 наблюдений. Среднегеометрический показатель значения титра равен 5,19 lg ТЦД50/0,5 мл, минимальный титр - 4,37 lg ТЦД50/0,5 мл., максимальный - 5,54 lg ТЦД50/0,5 мл., - 0,21. Полученные результаты позволяют с помощью величины показателя стандартного отклонения оценить разброс данных от среднего значения и выявить характер распределения.
При нормальном распределении 68% всех наблюдений лежит в диапазоне М 1 , 95 % в диапазоне М 2 и 99,73% значений в диапазоне М 3 .
В нашей выборке М3 (5,190,63) , все показатели должны располагаться в интервале от 4,56 lg ТЦД50/0,5 мл до 5,82 lg ТЦД50/0,5 мл. Фактически в выборке только одно значение выходит за рамки М 3 , т.е. диапазон нормального распределения содержит 99,15% значений, что является доказательством нормального распределения. Для дальнейшей оценки использовали ГОСТ Р ИСО 5479-2002 Статистические методы. Проверка отклонения распределения вероятностей от нормального распределения.
Для подтверждения нормальности распределения строили нормальный вероятностный график с помощью программы STATISTICA.
При построении графика по оси Y откладывали вычисленные значения zj (ожидаемые нормальные вероятностные значения), а по оси X - наблюдаемые значения специфической активности. Если наблюдаемые значения специфической активности распределены нормально, то все значения на графике должны быть на, или вблизи прямой линии. На рис. 4 приведен нормальный вероятностный график значений специфической активности ОСО 8 вакцинного вируса эпидемического паротита.
Рисунок № 2. Нормальный вероятностный график для значений специфической активности отраслевого стандартного образца вируса паротита ОСО 8.
Как видно из рис. 2, основная часть показателей находится на прямой линии, что свидетельствует о близости распределения данных по специфической активности стандартного образца вакцинного вируса эпидемического паротита к нормальному распределению, т.е. вариабельность титра ОСО 8 вакцинного штамма вируса паротита имеет случайный характер.
Аналогичное заключение было сделано и при анализе определения биологической активности ОСО 347 вакцинного вируса кори Л 16.
Эти данные позволяют сделать заключение о возможности внедрения статистической системы контроля производства для оценки стабильности производственных процессов.
Статистическая оценка стабильности производства жидких полуфабрикатов вакцин против кори и эпидемического паротита.
Статистической оценке подвергали результаты анализа сливов вакцинного вируса кори, полученного на клетках фибробластах эмбрионов перепела (ФЭП), в период с 2002 по 2005 г.г. Установлено, что биологическая активность каждого слива (с первого по четвертый) подчиняется нормальному распределению. Результаты анализа образцов культуральных жидкостей первого слива в 2002 г.г. приведены на рис. 3.
Рисунок № 3. Нормальный вероятностный график для значений специфической активности 1 слива вируса кори за 2002 год.
Проведенный статистический анализ специфической активности 1-4 сливов в период с 2002 по 2005 год представлен в табл. 9.
Таблица № 9
Специфическая активность сливов вируса кори в зависимости
от номера слива по годам.
№ слива | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | ||||
n | Х+ | n | Х+ | n | Х+ | n | Х+ | |
1 | 391 | 5,37 0,44 | 487 | 5,28 0,41 | 736 | 5,40 0,42 | 1175 | 5,24 0,56 |
2 | 408 | 6,03 0,42 | 476 | 5,64 0,53 | 734 | 5,70 0,62 | 1178 | 5,52 0,64 |
3 | 408 | 6,20 0,44 | 466 | 6,10 0,45 | 723 | 6,31 0,45 | 1160 | 6,18 0,55 |
4 | 296 | 6,30 0,40 | 429 | 6,36 0,40 | 219 | 6,20 0,38 | 925 | 6,22 0,48 |
По результатам, представленным в табл. 9 можно сделать следующее заключение: - с увеличением номера слива увеличивается биологическая активность собираемой культуральной жидкости, процесс накопления вакцинного вируса кори в каждом сливе стабилен.
Далее мы оценили вариабельность процесса накопления вируса кори с помощью контрольных карт Шухарта и кусум-карт. Только среди первых сливов на карте удалось выявить выпадение единственной точки из допустимых границ.
Несмотря на стабильность значений специфической активности вакцинного вируса кори в целом, выявлены различия в титрах между колбами. Одним из регистрируемых факторов, оказывающих влияние на величину титров, является показатель множественности заражения, который выражается в ТЦД50 на клетку. Анализ данных за 2002-2004 гг. приведен в табл. 10.
Таблица № 10
Показатели множественности заражения клеток ФЭП вирусом кори
№ п/п | Год | n | Min., ТЦД50/кл | Маx. ТЦД50/кл | Маx/Min | Размах | М | М/ |
1 | 2002 | 19 | 0,0040 | 0,093 | 23,25 | 0,0890 | 0,0240,023 | 1,04 |
2 | 2003 | 26 | 0,0050 | 0,037 | 7,40 | 0,0320 | 0,0160,009 | 1,77 |
3 | 2004 | 34 | 0,0001 | 0,030 | 300,00 | 0,0299 | 0,0140,008 | 1,75 |
Как видно из табл. 10 множественность заражения на клетку вирусом кори в азные годы колебалась в широких пределах - от 0,0001 ТЦД50/кл до 0,093 ТЦД50/кл. Вполне вероятно, что различия в множественности заражения сказываются на биологической активности вирусных сливов. Действительно, анализ данных показал, что в 2002 году, когда вариабельность заражающих доз была максимальной, наблюдалась определенная тенденция снижения накопления вакцинного вируса кори в сливах с высокой множественностью заражения (табл. 11).
В дальнейшем были проведены корректирующие действия по уменьшению вариабельности множественности заражения на стадии заражения клеток ФЭП. Максимальная заражающая доза была снижена с 0,09 (в 2002 году) до 0,04-0,03 в 2003 - 2008 году, соответственно. В результате биологическая активность третьих и четвертых сливов (определяющих биологическую активность объединенных сливов) меньше варьировала.
Таблица № 11
Анализ данных по влиянию множественности заражения на титры
сливов по данным за 2002 год
№ п/п | ТЦД50/кл. | По всем сливам в целом, М | СЛИВЫ | |||
I | II | III | IV | |||
М | М | М | М | |||
1 | Тысячные доли | n = 511 5,920,49 | n = 137 5,440,37 | n = 135 6,010,32 | n = 135 6,070,45 | n = 104 6,220,39 |
2 | 0,01 | 140 5,990,50 | 40 5,510,36 | 40 5,990,35 | 40 6,320,42 | 20 6,300,32 |
3 | 0,02 | 390 6,09 0,64 | 100 5,260,40 | 99 6,090,41 | 99 6,490,36 | 92 6,550,30 |
4 | 0,03 | 134 5,930,68 | 38 5,230,36 | 38 6,140,69 | 38 6,190,48 | 20 6,350,48 |
5 | 0,04 | 57 5,910,34 | 19 5,790,29 | 19 5,980,39 | 19 5,950,33 | Ц |
6 | 0,06 | 51 6,000,41 | 17 5,740,27 | 17 6,410,27 | 17 5,860,36 | Ц |
7 | 0,09 | 80 5,820,55 | 20 5,200,51 | 20 5,900,44 | 20 6,060,36 | 20 6,130,30 |
На следующем этапе производства, после проведения всех контрольных операций, проводили объединение вируссодержащих сборов. Индивидуальные вирусные сборы последовательно собирали из флаконов в 50-литровый пакет. Полученный с помощью осветляющей фильтрации полуфабрикат после замораживания, хранения и контроля качества размораживали, смешивали со стабилизатором ЛС-18, разливали по ампулам и лиофилизировали. Ампулы с сухой вакциной маркировали и контролировали по показателям, изложенным в ФС. Эти показатели были подвергнуты статистической обработке. Данные за 2002 и 2004 гг. суммированы в табл. 12.
Таблица № 12
Значения показателей, контролируемых при выпуске
коревой моновакцины, (М)
| Показатель | Требование ФС | 2002 год | 2004 год |
n = 81 | n = 65 | ||
Концентрация белка на дозу, мкг | Не более 2 | 0,680,28 | 0,0140,0065 |
Спец.активн.серий, lg ТЦД50/0.5 мл | Не менее 3 | 3,690,2 | 4,160,13 |
Точность розлива, % | Не выше 10 | 1,390,61 | 0,970,43 |
Кол-во антибиотиков, мкг/доза | Не более 20 | 3,70,3 | 3,50,64 |
Потеря массы при высушивании,% | Не более 2 | 0,840,27 | 0,980,26 |
Остаточный кислород, % | Не выше 1 | 0,380,07 | 0,340,05 |
рН, ед. рН | 7.2 -7.8 | 7,560,09 | 7,60,09 |
Проведенный статистический анализ позволил осуществить корректирующие воздействия, которые способствовали стабилизации показателей качества выпускаемой вакцины, при этом увеличилась биологическая активность, повысилась точность разлива, снизилась концентрация белка, резко снизилась вариабельность всех исследованных параметров.
Исследуемые показатели специфической активности коревой вакцины представлены в виде Х-карты Шухарта (рис.4)
Рисунок № 4. Контрольная Х-карта Шухарта индивидуальных значений для специфической активности коревой вакцины (2004 год)
Статистическая оценка, проведенная с использованием контрольных карт, свидетельствует о стабильности производства коревой вакцины.
Аналогичная статистическая оценка технологических процессов была проведена при производстве паротитной вакцины.
В табл. 13 приведены суммарные данные по статистическому анализу активности сливов культуральной жидкости при производстве паротитной вакцины в 2003 - 2005 годах.
Таблица № 13
Специфическая активность сливов вируса паротита в зависимости
от номера слива по годам.
Параметр | 2003 г. | 2004 г. | 2005 г. | |||||
слив 1 | слив 2 | слив 3 | слив 1 | слив 2 | слив 1 | слив 2 | ||
N наблюдений | 1845 | 1841 | 158 | 2121 | 2134 | 1499 | 1490 | |
Среднее | 6,50 | 6,62 | 5,99 | 6,58 | 6,77 | 6,58 | 6,42 | |
Доверит. -95,00% | 6,48 | 6,60 | 5,94 | 6,56 | 6,76 | 6,56 | 6,40 | |
Доверит. -+95,00% | 6,51 | 6,64 | 6,05 | 6,59 | 6,78 | 6,60 | 6,44 | |
Стандартное отклонение | 0,35 | 0,42 | 0,36 | 0,35 | 0,28 | 0,35 | 0,38 | |
Коэффициент вариации(%) | 5,38% | 6,28% | 6,05% | 5,34% | 4,20% | 5,29% | 5,94% | |
На основании анализа 8099 производственных сливов за 2003-2005 годы видно, что специфическая активность первых и вторых сливов в процессе производства паротитной вакцины статистически не имела достоверных различий по годам. Коэффициент вариации находился в пределах 4.2-6.28%. Показатели специфической активности третьих сливов были значительно ниже, что явилось основанием для дальнейшего их исключения из этапов производства. О стабильности получения полуфабриката паротитной вакцины свидетельствуют карты Шухарта (на примере Х-Карты), рис 5.
Рисунок № 5. Контрольная Х-карта Шухарта индивидуальных значений для специфической активности паротитной вакцины (2004 год).
Представленные данные по статистическому анализу распределения активности паротитной вакцины, произведенной, в 2004 году, показывают стабильность технологических процессов
Средние показатели множественности заражения клеток вакцинным вирусом эпидемического паротита в 2003 и 2004 г.г. были статистически неотличимы, однако вариабельность заражающей дозы в 2003 г. по сравнению с 2004 г. была выше в 2,2 раза. После введения элементов статистического управления процессом вариабельность удалось оптимизировать на уровне 2004 года. (Табл. 14).
Таблица № 14
Вариабельность инфицирующей дозы (ТЦД50 на клетку) при заражении клеток ФЭП вакцинным вирусом паротита
Статистические параметры | 2003 год | 2004 год |
n | 89 | 110 |
M | 0,00074 | 0,00075 |
Доверит.- 3 | 0,00057 | 0,00068 |
Доверит. +3 | 0,00091 | 0,00082 |
V, (%) | 111,81% | 49,43% |
Специфическая активность сливов вакцинного вируса паротита при внесении минимальных доз (0,00012 ТЦД50 на клетку в 2003 году и 0,00026 ТЦД50 на клетку в 2004 г) и максимальных доз (0,0078 и 0,0019) не отличалась, что позволяет сделать заключение, что принятые дозы заражения являлись оптимальными.
Значения параметров, контролируемых при производстве готовой моновакцины против эпидемического паротита, не отличались статистически в 2003 и 2004 году. (Табл. 15).
Таблица № 15
Значения показателей, контролируемых при выпуске
паротитной моновакцины, (М)
Показатель | Требование ФС | 2003 год | 2004 год |
n = 93 (19) | n = 196 (27) | ||
Концентрация белка на дозу, мкг | Не более 2 | 0,440,13 | 0,660,28 |
Спец.активн.серий, lg ТЦД50/0.5 мл | Не менее 4,3 | 5,100,18 | 5,140,18 |
Точность розлива, % | Не выше 10 | 0,660,25 | 0,970,43 |
Кол-во антибиотиков, мкг/доза | Не более 20 | 3,730,69 | 4,961,17 |
Потеря массы при высушивании, % | Не более 2 | 1,140,29 | 1,170,25 |
Остаточный кислород, % | Не выше 1 | 0,310,06 | 0,240,04 |
рН, ед. рН | 7,2 -7,8 | 7,420,09 | 7,430,7 |
Вариабельность контролируемых показателей, предусмотренных ФС, в 2005 году сохранилась на уровне 2003-2004 годов. Проведенный статистический анализ технологических процессов производства паротитной моновакцины не выявил параметров, вариабельность которых была бы не случайна. Единственным корректирующим действием была отмена сбора третьих сливов.
Проведенные исследования доказали, что производство коревой и паротитной вакцин в МПБП стабильно, однако уровень стабильности полуфабрикатов, достаточный для выпуска моновакцин против кори и эпидемического паротита, обеспечивающий необходимый для надежной защиты от этих инфекций, был недостаточен для обеспечения выпуска качественной ассоциированной вакцины.
Полученные при анализе производства в 2002 году данные сделали возможным сузить диапазон множественности заражения при производстве полуфабриката для коревой вакцины, в результате чего увеличилась специфическая активность и снизилась вариабельность данного показателя.
Таким образом, комплекс данных, полученных при изучении вариабельности специфической активности полуфабрикатов вакцинных вирусов кори и эпидемического паротита, позволил нам в 2002 году сделать вывод, что сведение этих полуфабрикатов с таким расчетом, чтобы разница между активностью вируса паротита и активностью вируса кори составляла не менее 0,9 lg ТЦД50, позволит создать технологию производства ассоциированной вакцины.
Создание технологии производства ассоциированной паротитно-коревой вакцины (АПКВ).
Статистический анализ процессов приготовления вируссодержащих культур вакцинных вирусов эпидемического паротита и кори привел не только к существенной стандартизации выпускаемых моновакцин, но и создал необходимые предпосылки создания ассоциированной вакцины на базе этих вакцинных вирусов.
Специфическая активность компонентов АПКВ имеет решающее значение для эффективности и безопасности препарата. Многолетняя разработка способа оптимизации специфической активности компонентов ассоциированной паротитно-коревой вакцины привела к научному открытию - созданию технологии производства АПКВ. Новизна данной разработки подтверждена выдачей патентов РФ и Евразийского патента.
В табл. 16 приведены данные по специфической активности компонентов созданной АПКВ за 2003-2005 гг. По ФС титр коревого компонента в дозе (0,2 мл) должен быть не ниже 3 lg ТЦД50/0,5 мл, паротитного - не ниже 4,3 lg ТЦД50/0,5 мл, превышение титра паротитного компонента над коревым - не ниже 0,9 lg ТЦД50/0,5 мл.
Таблица № 16
Показатели специфической активности компонентов АПКВ
Титр компонентов lg ТЦД 50/0,5 мл | Превышение активности, паротит/корь | |||||
Год | n | Коревой | Паротитный | |||
М | Min-max | М | Min-max | |||
2003 | 122 | 3,87 0,21 | 3,37 - 4,44 | 5,010,18 | 4,60 - 5,37 | 1,140,19 |
2004 | 108 | 3,740,19 | 3,27 - 4,23 | 5,07 0,13 | 4,77 - 5,37 | 1,340,23 |
2005 | 113 | 3,960,25 | 3,34 - 4,37 | 5,020,19 | 4,44 - 5,37 | 1,09 0,20 |
Как видно из табл. 16, специфическая активность как коревого, так и паротитного компонентов за исследуемый период различались незначительно и была более высокой, чем установлена в ФС, специфическая активность паротитного компонента значительно превышала активность коревого. Стабильность показателей специфической активности была подтверждена результатами, представленными в контрольных Х-картах Шухарта обоих компонентов вакцины. На рис. 6 приведены Х-карты специфической активности коревого и паротитного компонентов АПКВ.
2003 г
Рис. № 6-1 Х-карта специфической Рис. № 6-2 Х-карта специфической
активности паротита активности кори
2004 г
Рис. № 6-3 Х-карта специфической Рис. № 6-4 Х-карта специфической
активности паротита активности кори
2005 г
Рис. № 6-5 Х- карта специфической Рис. № 6-6 Х-карта специфической
активности паротита активности кори
Анализ приведенных контрольных карт показал, что все значения параметров находятся не только в границах, установленных нормативными документами, но и в статистических границах, что свидетельствует о стабильности процесса производства АПКВ за исследуемый период. Что касается остальных показателей, контролируемых по ФС, то их значения не превышают допустимых границ, (табл. 17), что подтверждает высокую воспроизводимость процесса производства ассоциированной паротитно-коревой вакцины с использованием разработанной и внедренной системы статистического управления качеством.
Таблица № 17
Значения показателей, контролируемых при выпуске АПКВ, (М)
| Показатель | Требование ФС | 2003 год | 2004 год | 2005 год |
n =122 (18) | n = 108 (24) | n = 113 (16) | ||
Концентрация белка на дозу, мкг | Не более 8 | 0,400,1 | 0,480,16 | 0,410,13 |
Точность розлива, % | Не более10 | 0,860,69 | 0,690,30 | 1,180,43 |
К-во антибиотиков, мкг/доза | Не более 25 | 4,20,59 | 4,380,57 | 5,490,42 |
Потеря массы при высушивании, % | Не более 2 | 1,180,24 | 1,120,28 | 1,120,24 |
Остаточный кислород, % | Не более 1 | 0,260,03 | 0,280,05 | 0,250,40 |
рН, ед. рН | 7,2-7,8 | 7,480,03 | 7,490,06 | 7,480,07 |
Наряду с приведенными контрольными картами нами использовались многомерные контрольные карты Хоттелинга, позволяющие провести единый интегральный анализ (рис. 7).
Рисунок № 7. Многомерная контрольная карта Хоттелинга при производстве АПКВ 2005 г.
Анализ приведенных материалов (рис. 7) показывает, что процесс производства АПКВ стабилен. Только один показатель выходит за рамки статистических границ, им является показатель точности розлива. Это обусловлено тем, что фактические значения этого показателя намного ниже допускаемых границ, (0.86 - 1.18%, при допустимых не более 10%).
Профилактическая эффективность ассоциированной вакцины не отличалась от эффективности моновакцин. Достигалось это тем, что содержание вирусных компонентов кори и паротита в АПКВ практически не отличалось от моновакцин и между компонентами вакцины не наблюдалось конкуренции антигенов, табл. 18.
Таблица № 18
Содержание коревого и паротитного компонентов в моновакцинах
против кори и паротита и в АПКВ
Год | Вакцина | Коревой компонент | Паротитный компонент | ||||
n | M | Min-max | n | M | Min-max | ||
2003 | моно | 118 | 3,920,23 | 3,34Ц4,57 | 93 | 5,100,18 | 4,64Ц5,47 |
АПКВ | 122 | 3,870,21 | 3,37Ц4,44 | 122 | 5,010,18 | 4,60Ц5,37 | |
2004 | моно | 65 | 4,160,13 | 3,70Ц4,37 | 196 | 5,14 0,18 | 4,57Ц5,44 |
АПКВ | 108 | 3,740,19 | 3,27 - 4,23 | 108 | 5,070,13 | 4,77Ц5,37 | |
2005 | моно | 191 | 4,250,31 | 3,64Ц4,90 | 41 | 4,930,17 | 4,61Ц5,44 |
АПКВ | 113 | 3,960,25 | 3,34Ц4,37 | 113 | 5,020,19 | 4,44Ц5,37 | |
Анализ разработанной в МПБП технологии производства ассоциированной паротитно - коревой вакцины методом контрольных карт Шухарта и многомерных карт Хотеллинга показал стабильность как самого процесса, так и показателей качества. Испытания, в соответствии с Программой, утвержденной Комитетом МИБП МЗ РФ (протокол № 9 от 04 ноября 1999 г.), предусматривали вакцинацию детей, не привитых и не болевших корью и эпидемическим паротитом, в возрасте от 12 до 24 месяцев АПКВ, а контрольные группы детей - моновакцинами против кори и паротита. Сведения о вакцинах, использованных для изучения иммуногенных свойств, представлены в табл.19.
Результаты серологического изучения вакцинированных показали, что количество отреагировавших на введение вакцинного вируса кори не зависит от того, вводился ли вирус кори в моновакцине, или же в составе АПКВ.
Таблица № 19
Характеристика вакцин, использованных для испытания
Вакцина | Серия, № | Контрольный номер | Шифр | Активность, lg ТЦД50 в одной дозе | Корь/паротит, | |
Вирус кори | Вирус паротита | |||||
АПКВ | 003 | 2292 | 400 | 4,4 | 4,5 | 0,1 |
АПКВ | 011 | 2295 | 403 | 4,2 | 4,8 | 0,6 |
АПКВ | 024 | 3752 | 404 | 3,3 | 4,5 | 1,2 |
Паротитная | 0884 | 2298 | 406 | - | 4,7 | - |
Коревая | 564 | 3182 | 564 | 3,7 | - | - |
Число отреагировавших появлением антител на введение вакцинного вируса эпидемического паротита зависело от величины превышения титров паротитного компонента над коревым и было оптимальным если превышение составляло 0,9 lg ТЦД50 и выше. Такие серии АПКВ обеспечивали сероконверсию от 92% до 100% у вакцинируемых детей, т.е. практически сопоставимы с результатами, полученными при использовании моновакцин.
Экономическая эффективность технологии производства АПКВ
Учитывая, что при массовом применении вакцины, входящей в национальный календарь профилактических прививок, стоимость вакцинации в целом играет существенную роль, немаловажным являлась оценка экономической эффективности от внедрения на МПБП технологии промышленного производства и системы управления качеством ассоциированной паротитно-коревой вакцины. Проведенный экономический анализ производства моновакцин в сравнении с АПКВ показал снижение себестоимости производства по основным показателям: сырью и материалам, энергетическим затратам, рис. 10.
Рисунок № 10. Цеховая себестоимость производства моновакцин и АПКВ в сравнении.
Также вдвое снижаются трудо- и материальные затраты на применение вакцины за счет сокращения количества прививок.
Выводы:
- Установлено, что вакцинный штамм Ленинград-3 вируса паротита является оптимальным как для вакцинации детей, так и для конструирования ассоциированной вакцины, и по безопасности не уступает американскому штамму Jeryl Lynn (1-2 случая асептического менингита на 100.000 вакцинированных), а по иммуногенности соответствует штамму Urabe, вызывая сероконверсию не менее чем у 80% привитых.
- Проведенные исследования по оценке стабильности промышленного производства моновакцин установили, что технология воспроизводима и может быть использована для создания ассоциированного препарата.
- Разработана и внедрена система управления качеством на основе использования статистических методов контроля соответствия параметров продукта заданным критериям, анализа стабильности производственных процессов и своевременных корректирующих воздействий, обеспечивающая получение серий иммунобиологических препаратов надлежащего качества с вероятностью не ниже p =0,95.
- Разработана ассоциированная вакцина против кори и эпидемического паротита и технология ее производства, обеспечивающая получение МИБП с биологической активностью 4,3 lg ТЦД50/0,5мл. паротитного и 3,0 lg ТЦД50/0,5мл. коревого компонентов, и соответствующая требованиям национального органа контроля, в том числе и правилам производства и контроля качества лекарственных средств ГОСТ Р 52249-2004.
- Использование статистической обработки показателей производственно-технологических процессов позволило стабилизировать производство АПКВ на МПБП, и снизить процент внутрипроизводственных потерь до 3%.
- Исследования реализованы разработкой утвержденных в установленном порядке регламентов производства, фармакопейной статьи и инструкции по применению препарата.
- Внедрение АПКВ позволило полностью обеспечить реализацию национального календаря прививок против кори и эпидемического паротита и сократить в два раза количество инъекций, и за период с 2001 года привить более 10 млн. детей.
Перечень публикаций по теме диссертации
Патенты
1. Зайцев И.З., Колышкин В.М., Сидоренко Е.С., Попов В.Ф., Юминова Н.В., Красильников И.В., Дорофеева Л.В. Патент РФ на изобретение № 2158134 от 10.03.2000 г. Способ получения ассоциированной паротитно-коревой вакцины.
2. Зайцев И.З., Колышкин В.М., Сидоренко Е.С. Попов В.Ф., Юминова Н.В., Красильников И.В., Дорофеева Л.В. Евразийский патент №002387 от 25 апреля 2002 г. Способ получения ассоциированной паротитно-коревой вакцины.
Публикации в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК:
- Зайцев И.З. Детекция РНК вируса кори в образах коревой вакцины методом полимеразной цепной реакции./ Зайцев И.З., Колышкин В.М. Юминова Н.В., А.М. Ведяков, О.Е. Потехин, Е.С. Сидоренко, А.Г. Тоневицкий. // Биотехнология. 2001. № 1.- С. 76-82.
- Попов В.Ф. Разработка отечественной комбинированной вакцины против кори и паротита. / Попов В.Ф., Зайцев И.З., Колышкин В.М., Сидоренко Е.С., Юнасова Т.Н., Шитикова О.Ю., Каплунова О.П., Юминова Н.В., Лыткина И.Н., Михеева И.В. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2002. № 2. - С. 31-34.
- ященко В.А. Влияние миелопептида 2 на результаты иммунизации морских свинок живой коревой вакциной. /Ляшенко В.А., Михайлова А.А., Александер С.К., Юминова Н.В., Фонина Л.А, Колышкин В.М. // Вопросы вирусологии. 2004. № 2. - С. 18-20.
- Голева О.В. Вирусологическая характеристика серозных менингитов у детей, иммунизированных вакциной против эпидемического паротита. / Голева О.В., Харит С.М., Черняева Т.В., Аксенов О.А., Davidkin I., Колышкин В.М. // Вопросы вирусологии. 2004. № 5. - С. 28-32.
- Колышкин В.М. Состояние вакцинопрофилактики кори и эпидемического паротита в РФ на современном этапе. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2004. № 5. - С. 8-10.
- Колышкин В.М. Иммуногенез при комбинированной вакцинации против кори и эпидемического паротита взрослых отечественной ассоциированной паротитно-коревой вакциной производства МПБП "НПО "Микроген". // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2004. № 6. - С. 18-20.
- Колышкин В.М. Роль отечественных коревых вакцин в программе элиминации кори на территории Российской Федерации. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2004. № 6. - С. 20-21.
- Колышкин В.М. Проточная цитометрия для стандартизации линии клеток фибробластов и эмбрионов кур. / Колышкин В.М., Ночевный В.Т., Юрков С.Г., Хайдуков С.В., Виолин Б.В. // Аграрная наука. 2004. № 3. - С. 27-29.
- Колышкин В.М. Апоптоз клеток в культуре: особенности проявления и влияния на эффективность биотехнологического производства. / Колышкин В.М., Ночевный В.Т., Новохатсткий А.С.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005. № 6. - С. 99-105.
- Колышкин В.М. Некоторые аспекты транспортировки и хранения МИБП в системе Холодовой цепи. / Колышкин В.М., Балдин С.Ю., Ночевный В.Т. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2006. № 5. - С. 59-63.
- Юминова Н.В. Многолетняя пострегистрационная оценка качества отечественных моно- и комбинированных паротитных вакцин из штамма Ленинград-3. / Юминова Н.В., Колышкин В.М., Россошанская Н.В., Наретя Н.Д., Юминова Е.О., Зверев В.В. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2006. № 6. - С. 8-10.
- Колышкин В.М. Оценка стабильности производства коревой вакцины. / Колышкин В.М., Васильев А.В. // Биотехнология. 2008. № 1 - С. 57-63.
- Колышкин В.М. Оценка стабильности производства ассоциированной паротитно-коревой вакцины. / Колышкин В.М., Васильев А.В. // Биотехнология. 2008. № 4. - С. 64-68.
- Колышкин В.М. Оценка стабильности производства паротитной вакцины. / Колышкин В.М., Васильев А.В. // Биотехнология. 2008. № 5. - С. 68-75.
- Волкова Р.А. Определение показателей точности тест-системы для оценки паротитной и коревой вакцин. / Волкова Р.А., Устинникова О.Б., Звонарев А.Ю., Кулякина М.Н., Колышкин В.М. // Фармация. 2008. № 6. - С. 5-7.
Публикации в научных журналах, сборниках научных статей и научных докладов:
1. Попов В.Ф. Отечественная ассоциированная паротитно-коревая вакцина создана. / Попов В.Ф., Зайцев И.З., Колышкин В.М, Сидоренко Е.С., Юнасова Т.Н., Михеева И.В, Лыткина И.Н., Шитикова О.Ю, Каплунова О.П.// Биопрепараты. 2001. № 2. - С. 22.
2. Колышкин В.М. Опыт внедрения Правил GMP в производстве вакцин. // Технология чистоты. 2003. № 1. - С. 21.
3. Юминова Н.В. Отечественные вакцины против кори и эпидемического паротита: успехи применения. / Юминова Н.В., Колышкин В.М. // Вакцинация. 2006. № 4(46). - С. 8-9.
4. Юминова Н.В. Проблемы вакцинации взрослых против кори. / Юминова Н.В., Колышкин В.М., Юминова Е.О. // Главврач. 2004. № 12. - С. 101-104.
5. Колышкин В.М. Стандарты ИСО 9000 как составная часть внедрения GMP на предприятии по производству МИБП. // Технология чистоты. 2004. № 2. - С. 9-10.
6. Колышкин В.М., Берзигияров П.К., Сухомлин И.Г. Референтные модели производственно-технологических процессов при создании системы качества на основе стандартов семейства ГОСТ Р ИСО 9000-2001. // Технология чистоты. 2005. № 1. - С. 17-21.
7. Колышкин В.М. Реализация современных мировых тенденций управления качеством при производстве лекарственных средств в проекте национального стандарта Производство лекарственных средств. Система и менеджмент качества. Основополагающие требования. / Колышкин В.М., Сухомлин И.Г., Мешковский А.П. // Фармацевтическая промышленность. 2006. № 6. - С. 18-23.
8. Костинов М.П. Клиническое течение поствакцинального периода при введении отечественной дивакцины с иммуномодуляторами. / Соловьева И.Л., Куссельман А.И., Микава Е.И., Костинов М.П., Калманова В.П., Лукачев И.В., Юминова Н.В., Колышкин В.М. // Иммунокоррекция вакцинального процесса у лиц с нарушенным состоянием здоровья. Под ред. М.П.Костинова. М. МдВ. 2006. - С. 86- 101.
9. Сухомлин И.Г. Важность отраслевой модели системы менеджмента качества (СМК) в рамках внедрения GMP на предприятиях по производству лекарственных средств. Государственное нормативное обеспечение. /Сухомлин И.Г., Колышкин В.М. // Чистые помещения и технологические среды. 2006. №1. - С. 30-35.
10. Колышкин В.М. Еще раз о МУ 64-04-002-2002 Производство лекарственных средств. Документация. / Колышкин В.М. Семченко А.В., Богатиков С.А. и др. // Фармацевтическая промышленность. 2006. № 4. - С. 73-75.
11. Юминова Н.В. ИФА-тестирование вируса эпидемического паротита в вируссодержащих сливах, предназначенных для приготовления живой паротитной вакцины. / Юминова Н.В., Скворцова О.И., Колышкин В.М., Александер C.аК. // Материалы конференции Вирусные инфекции на пороге XXI века: эпидемиология и профилактика. Всероссийское научно-практическое общество эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. СПб.: РАМН 1999.- С. 168-169.
12. Юминова Н.В. Отечественная ассоциированная паротитно-коревая вакцина в практике здравоохранения России. / Юминова Н.В., Александер С.К., Сидоренко Е.С., Колышкин В.М. // Сборник Проблемы инфекционных болезней. Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.М. Габричевского. М.: 2000. ч. 1. - С. 139-142.
13. Юминова Н.В. Использование ассоциированной паротитно-коревой вакцины в практике здравоохранения РФ. / Юминова Н.В., Александер С.К., Сидоренко Е.С., Колышкин В.М. // Актуальные вопросы разработки, производства, и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов. Сборник докладов. Уфа. Салават. 2000. ч. 1. - С. 42-44.
14. Ночевный В.Т. Фторхинолоны - перспективное антибактериальное средство для вирусологической практики. / Ночевный В.Т., Колышкин В.М. // Материалы 9-й Международной конференции: Новые информационные технологии в медицине, биологии фармакологии и экологии. Гурзуф. Изд. Запорожского национального университета. 2001. - С. 166.
15. Попов В.Ф. Создана отечественная ассоциированная паротитно-коревая вакцина. / Попов В.Ф., Зайцев И.З., Колышкин В.М, и др. // Материалы Всероссийской научной конференции. 16-18 апреля 2001 г. Всероссийское научно-практическое общество эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. СПб, 2001. - С. 89-91.
16. Колышкин В.М. Стандартизация тест-культур для контроля активности вакцин против кори и паротита. / Колышкин В.М., Ночевный В.Т., Сидоренко Е.С. // Материалы 10-й Юбилейной международной конференции Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. Гурзуф. Изд. Запорожского национального университета. 2002. - С. 274.
17. Попов В.Ф. Конструирование и оценка отечественной ассоциированной паротитно-коревой вакцины. / Попов В.Ф., Зайцев И.З., Колышкин В.М., Сидоренко Е.С., Юнасова Т.Н., Шитикова О.Ю., Каплунова О.П., Варданян Н.В., Серякова Л.И., Шевцов В.А., Лобастов С.П. // Тезисы доклада на VIII съезде эпидемиологов. М., 2002, т. 2. - C. 220-221.
18. Юминова Н.В. Иммунологические свойства новой отечественной ассоциированной паротитно-коревой вакцины. / Юминова Н.В., Зайцев И.З., Колышкин В.М., Сидоренко Е.С., Александер С.К., Н.Д.Наретя. // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М. РАМН 2002. - С. 248.
19. Юминова Н.В. Современное состояние вакцинопрофилактики кори в РФ. / Юминова Н.В., Александер С.К. Зайцев И.З., Колышкин В.М., Ляшенко В.А., Россошанская Н.В. // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М. РАМН. 2002. - С. 247.
20. Юминова Н.В. Современное состояние вакцинопрофилактики эпидемического паротита в РФ. / Юминова Н.В., Александер С.К, Зайцев И.З., Колышкин В.М., Ляшенко В.А., Наретя Н.Д., Цвиркун О.В. // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М. РАМН. 2002. - С. 246.
21. Колышкин В.М. Опыт внедрения Правил GMP в производство вакцин. // Тезисы доклада на XIII Внеочередной конференции АСИНКОМ. М. АСИНКОМ. 2002. - С. 27-28.
22. Попов В.Ф. Иммунологическая эффективность новой паротитно-коревой вакцины в практике здравоохранения России. / Попов В.Ф., Колышкин В.М., Юминова Н.В., Сидоренко Е.С., Дорофеева Л.В., Зайцев И.З. // Тезисы доклада на Международном конгрессе Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы. Институт имени Пастера. СПб. 2003. - С. 12.
23. Юминова Н.В. Перспективы использования новой отечественной ассоциированной паротитно-коревой вакцины (АПКВ) в России. / Юминова Н.В., Зайцев И.З., Колышкин В.М., Сидоренко Е.С., Россошанская Н.В., Наретя Н.Д.// Материалы научно-практической конференции Современные научные и практические проблемы инфекционной патологии у детей. НИИ детских инфекций. СПб. 2003. - С. 123-124.
24. Колышкин В.М. Проблемы стандартизации линии клеток Vero для контроля вакцин против кори и паротита. / Колышкин В.М., Ночевный В.Т., Хайдуков С.В., Сидоренко Е.С. // Материалы международной конференции Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии Гурзуф. Изд. Запорожского национального университета. 2003. - С. 241-242.
25. Колышкин В.М. Апоптоз как фактор отбора и стандартизации перевиваемых линий клеток. / Колышкин В.М., Ночевный В.Т. // Материалы Международной конференции. Клинические нейронауки: нейрофизиология, неврология,нейрохирургия. Гурзуф. Изд. Запорожского национального университета. 2004. - С. 71-72.
26. Симонова А.С. Детекция клеточных и инфекционных прионов в культурах клеток и биологических жидкостях с использованием поли- и моноклональных антител. / Симонова А.С., Савенко Н.Б., Дъяконов Л.П., Колышкин В.М. Мошков А.Е., Вольпина О.М. // Материалы международной конференции Сохранение генетических ресурсов / Клеточная биотехнология. Цитология. Том 46. № 9. СПб. 2004. - С. 854.
27. Колышкин В.М. О состоянии вакцинопрофилактики кори и эпидемического паротита в России. / Колышкин В.М., Юминова Н.В., Александер С.К., Сидоренко Е.С. // Сборник научных трудов Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. Выпуск 6. М. 2004. - С. 386-388.
28. Колышкин В.М. Характеристика новой отечественной ассоциированной паротитно-коревой вакцины производства УГ МПБП МЗ МП РФ. / Колышкин В.М., Юминова Н.В. Сидоренко Е.С., Зайцев И.З., Россошанская Н.В. // Сборник научных трудов Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. Выпуск 6. М. 2004. - С. 388-390.
29. Юминова Н.В. Популяционный иммунитет и его роль в защите населения от кори и эпидемического паротита. / Юминова Н.В., Александер С.К., Колышкин В.М., Неретя Н.Д. // Сборник научных трудов Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. Выпуск 6. М. 2004. - С. 390-393.
30. Юминова Н.В. Пути реализации программы элиминации кори в Российской Федерации. / Юминова Н.В., Колышкин В.М., Александер С.К., Ляшенко В.А. // Сборник научных трудов Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. Выпуск 6. М. 2004. - С. 407-409.
31. Юминова Н.В. Иммунологическая безопасность и целесообразность ревакцинации взрослых против кори и эпидемического паротита вакцинами на основе отечественных штаммов Л-16 и Л-3. / Юминова Н.В., Колышкин В.М., Александер С.К. Сидоренко Е.С. // Тезисы I Всероссийской конференции по вакцинологии МИБП для профилактики и лечения актуальных инфекций. М. 2004. - С. 78-80.
32. Юминова Н.В. Корь: новый этап вакцинопрофилактики. / Юминова Н.В., Колышкин В.М. // Сборник материалов межрегиональной научно-практической конференции Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней на региональном уровне. НИИ вирусных препаратов им. О.Г.Анджапаридзе РАМН; Отв. Ред. Д.м.н. Н.В. Юминова. Пенза. 2004. - С. 9-23.
33. Савин В.Ф. Влияние режимов замораживания на деформацию слоя высушиваемых лиофильно вакцин в ампулах. / Савин В.Ф., Колышкин В.М. // Материалы международной научно-технической конференции Сублимационная сушка в фармацевтической и пищевой промышленности. Московский государственный университет прикладной биотехнологии. М. 2005. - С. 73-76.
34. Юминова Н.В. Некоторые аспекты изучения популяционного иммунитета к кори, эпидемическому паротиту и краснухе на ряде территорий Российской федерации. / Юминова Н.В., Александер С.К., Колышкин В.М., Юминова Е.О., Зверев В.В. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции Терапия инфекционных заболеваний у детей: современные представления и нерешенные вопросы. Институт имени Пастера. СПб. 2005. - С. 134.
35. Юминова Н.В. Пострегистрационный мониторинг качества отечественной ассоциированной паротитно-коревой вакцины (АПКВ) из штаммов Л-16 и Л-3. / Юминова Н.В., Колышкин В.М., Сидоренко Е.С. Александер С.К., Россошанская Н.В. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции Терапия инфекционных заболеваний у детей: современные представления и нерешенные вопросы. Институт имени Пастера. СПб. 2005. - С. 135.
36. Колышкин В.М.. Методы получения и контроля СПФ-перепелиных эмбрионов, предназначенных для изготовления живых культуральных вакцин. / Колышкин В.М., Матюхин И.В., Шалунова Н.В. и др. // Материалы I-ого Международного ветеринарного конгресса по птицеводству. М. Минсельхоз России 2005. - С. 131-135.
37. Юминова Н.В. Современное состояние вакцинопрофилактики эпидемического паротита в РФ. / Юминова Н.В., Александер С.К, Зайцев И.З., Колышкин В.М., Ляшенко В.А., Наретя Н.Д., Цвиркун О.В. // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М. РАМН. 2002. - С. 246.
38. Юминова Н.В. Отечественный опыт иммунопрофилактики эпидимического паротита. / Юминова Н.В., Колышкин В.М., Александер С.К. Сидоренко Е.С. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием 23-26 мая 2006аг. Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней в России и странах ближнего зарубежья. Самара. Областной медицинский информационно-аналитический центр РФ. 2006. - С. 9-10.
39. Юминова Н.В. Программа элиминации кори и снижения заболеваемости эпидемическим паротитом: серомониторинг населения. / Юминова Н.В., Колышкин В.М., Александер С.К. Россошанская Н.В., Наретя Н.Д., Юминова Е.О. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием 23-26 мая 2006аг. Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней в России и странах ближнего зарубежья. Самара. Областной медицинский информационно-аналитический центр РФ. 2006. - С. 11-12.
40. Колышкин В.М. Стандартизация методов получения и контроля перепелиных эмбрионов - субстрата для производства парамиксовирусных вакцин. / Колышкин В.М., Шалунова Н.В., Смоленский В.И., Ночевный В.Т. // Материалы 13-й Международной конференции Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. Гурзуф. Изд. Запорожского национального университета. 2005. - С. 208-209.
41. Юминова Н.В. Качество отечественных коревых и паротитных вакцин в Российской федерации на современном этапе. / Юминова Н.В., Колышкин В.М., СидоренкоЕ.С., Россошанская Н.В., Суханова Л.Л. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием 23-26 мая 2006аг. Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней в России и странах ближнего зарубежья. Самара. Областной медицинский информационно-аналитический центр 2006. - С. 6-7.
42. Юминова Н.В. Многолетняя пострегистрационная оценка качества паротитных вакцин. / Юминова Н.В., Колышкин В.М., Юминова Е.О., Зверев В.В. // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М. РАМН. 2007. ч.1. - С. 119-120.
43. Юминова Н.В. Опыт иммунопрофилактики кори и эпидемического паротита в Российской Федерации и странах СНГ. / Юминова Н.В., Колышкин В.М. // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М. РАМН. 2007. ч.1. - С. 117-118.
44. Колышкин В.М. Система менеджмента качества - основа эффективного производства МИБП. / Колышкин В.М., Сухомлин И.Г., Ночевный В.Т. // Материалы 15-й Международной конференции Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. Гурзуф. Изд. Запорожского национального университета. 2007. - С. 159-160.
45. Колышкин В.М. Формирование системы производственных записей в соответствии с методологией нормализованных референтных моделей. / Колышкин В.М., Богатиков С.А., Подпругина М.В., Рязанова Е.М., Михайлов В.А. // Биофармацевтический журнал. 2009. № 2. т.1. - С. 42-56.
46. Колышкин В.М. Нормализованная референтная модель производственно-технологических процессов. / Колышкин В.М. Богатиков С.А., Протопопов А.С., Сухомлин И.Г. // Тезисы доклада Российского симпозиума с международным участием БИОФАРМА-2009. Турция. Анталия. 2009. - С. 18-19.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии