Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
СУЛТАНОВ
Заман Зубаирович
РАЗРАБОТКА И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ
ПИТАТЕЛЬНЫХ ОСНОВ И СРЕД
03.00.07 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Махачкала Ц 2008
Работа выполнена в ФГУП НПО Микроген МЗ и СР РФ НПО Питательные среды
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор
Меджидов Магомед Меджидович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Лариса Петровна Блинкова
доктор медицинских наук, профессор
Виктор Михайлович Бондаренко
доктор медицинских наук, профессор
Станислав Степанович Афанасьев
Ведущая организация: ФГУН ГосНИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора
Защита диссертации состоится л25 сентября в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН по адресу: 105064, Москва, Малый Казенный переулок, д.5а.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН
Автореферат разослан л______________________
Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат биологических наук И.В.Яковлева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Задачи, стоящие перед отечественным здравоохранением по снижению уровня инфекционных болезней, тесно связаны с их бактериологической диагностикой, которая в значительной степени зависит от качества и ассортимента питательных сред.
Однако научные и практические учреждения нашей страны все еще недостаточно обеспечены стандартными питательными средами и поэтому вынуждены использовать среды лабораторного приготовления, которые получают с применением низкокачественных компонентов и не всегда проверяют с эталонными тест-штаммами, т.е. их применение происходит без необходимого контроля. Нестандартность питательных сред, приготовляемых в условиях лабораторий, отрицательно влияет на результаты диагностики инфекций. За рубежом используют только коммерческие питательные среды, имеющие соответствующие сертификаты качества (А.Г.Бойцов, О.Н.Ластова, А.А.Порин, 2000; National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1990).
Одним из факторов, определяющих качество питательных сред, является наличие в их составе стандартных белковых основ. Питательными субстратами большинства сред служат белковые гидролизаты различного происхождения. При этом в качестве белкового сырья используют чаще всего мясо, рыбу, рыбную муку и казеин.
Основным белковым сырьем в промышленном производстве питательных сред в НПО Питательные среды является каспийская килька (М.М.Меджидов, 2003). Однако из-за экологических проблем Каспия ее улов значительно снизился и стал ощущаться дефицит этого сырья. Поэтому необходимы резервные источники сырья, позволяющие осуществить замену кильки на другие источники сырья без изменения конечных характеристик получаемых препаратов и условий на всех стадиях технологического процесса.
Одним из наиболее используемых компонентов питательных сред является ферментативный пептон. Промышленный выпуск сухого пептона в РФ был прекращен и в незначительных объемах начинает возрождаться. Пептоны производства Семипалатинского и Винницкого мясокомбинатов не отличаются стабильностью, что вызывает необходимость закупки дорогостоящих пептонов фирм, использующих в качестве сырья мясо высшей категории (В.И.Артюхин, А.П.Шепелин, Н.В.Киселева, 1990). В этой связи разработка технологии получения отечественного пептона, не уступающего по качеству зарубежным аналогам с использованием более дешевого сырья, является актуальной задачей.
За рубежом в составе коммерческих питательных сред для культивирования и выделения микроорганизмов широко используются гидролизаты сои (Culture Media Manual, bioMerieux, 1994; Microbiology Manual Merck, 1990). В нашей стране до недавнего времени среды на основе сои не выпускались, что, прежде всего, связано с отсутствием разработок отечественных технологий получения соевых гидролизатов.
В приготовлении питательных сред в качестве стимулятора роста микроорганизмов широко используют экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) (А.К.Баранова, 1978; Б.М.Раскин, 1982). Однако существующие технологии его получения не обеспечивают прозрачность растворов (Н.А.Ковчик, И.И.Литвиненко, 1980). Данный показатель является важным, особенно при использовании ЭКД в составе жидких сред, т.к. о наличии роста микроорганизмов судят по помутнению среды. Кроме того, водные растворы ЭКД, представляющие собой полидисперсную коллоидную систему, быстро забивают поры фильтрующего материала и скорость фильтрации резко падает. Отсюда вытекает необходимость совершенствования технологии получения ЭКД на этапе фильтрации и повышения степени прозрачности растворов препарата.
Известно, что выделение чистых культур микроорганизмов значительно осложняется, если в микробной ассоциации присутствует протей, способный к роению. Для подавления роения протеев обычно используют различные химические вещества. Однако данные вещества, препятствуя роению протеев, могут ингибировать и рост выделяемых микроорганизмов. Вместе с тем, роение протеев может быть устранено на средах, содержащих питательную основу с минимальным содержанием минеральных веществ - электролит-дефицитную (G.H.Sandus, 1960). В РФ питательные среды на электролит-дефицитной основе не выпускались, что было связано с отсутствием технологии ее получения.
В мировой практике при бактериологическом анализе мочи, помимо неселективной среды - электролит-дефицитной, используют также селективную среду и среду для определения антибактериальных субстанций в моче (Culture Media bioMerieux, 1994). Данный комплекс питательных сред позволяет осуществить быструю идентификацию возбудителей уроинфекций и оценить эффективность антимикробной терапии. Аналогичные питательные среды в РФ отсутствуют.
В последние годы в ряде стран отмечают вспышки эшерихиоза, вызванного высокопатогенными для человека E. coli O157:H7, продуцирующими шигаподобный токсин (Ю.А.Ратинер, В.М.Бондаренко, A.Siitonen, 1998; Griffin P.M., Ciclak P.R., 1994). В связи с высокой патогенностью и глобальным распространением данной инфекции задача совершенствования способов индикации E. coli O157:H7 весьма актуальна. При этом особое внимание следует уделить исследованиям, направленным на разработку селективных сред, способствующих получению чистой культуры.
Ввиду неуклонного роста численности больных и высокой летальности при инфекционных заболеваниях бактериемия и сепсис являются одной из актуальных проблем современной медицины (В.Б.Белобородов, 1998; В.А.Руднов, 2000; В.С.Савельев, Б.Р.Гельфанд, 2006).
В диагностике бактериемии и сепсиса особое значение имеют микробиологические исследования крови, которые являются обязательным компонентом даже при подозрении на сепсис. Вместе с тем, ряд исследователей отмечают низкий процент высеваемости гемокультур при использовании сред лабораторного приготовления (В.Д.Бадиков, Л.Е.Журавлева, В.Н.Болехан, 1998; П.В.Кулагин, Р.П.Савченко, В.С.Иванова, 2001). В связи с этим, разработка коммерческих готовых к употреблению сред для выделения гемокультуры является актуальной задачей.
В последние десятилетия особое внимание клиницистов обращено на роль условно патогенных микроорганизмов в полиорганной патологии человека, требующих значительного увеличения ассортимента селективных питательных сред (В.М.Бондаренко, 2007). Возросли случаи пищевых отравлений, вызываемых Bacillus cereus (Д.Диксон, 1983; Ф.С.Флуер, 2007; Kramer J.M., Gilbert R.J., 1989). При выделении B. cereus из клинического материала и контаминированных пищевых продуктов возникают трудности, связанные с наличием в образцах разнообразных микробов-ассоциантов (Р.С.Джалилова, 1987). Поэтому для выделения B.cereus из материалов, содержащих смешанную микрофлору, требуются высокоселективные среды.
Приведенные данные свидетельствуют о необходимости изыскания новых источников сырья, разработок новых питательных основ и сред, и в первую очередь, таких, как ферментативный пептон, электролит-дефицитная питательная основа, соевый гидролизат, среды для выделения возбудителей при токсико-септическом состоянии, уроинфекции, селекции различных видов энтеробактерий и бацилл.
Цель работы. Экспериментальное обоснование разработки и усовершенствования технологий получения микробиологических питательных основ и сред.
Задачи исследования:
1. В результате исследований выявить альтернативные источники белкового сырья для производства питательных сред.
2. Экспериментально обосновать и разработать промышленную технологию получения ферментативного пептона из рыбного сырья, изучить физико-химические и биологические свойства препарата.
3. Создать промышленную технологию получения электролит-дефицитной питательной основы, с использованием которой сконструировать питательные среды: для выделения, дифференциации и количественного определения бактерий в моче; для выделения и дифференциации E. coli O157:H7; для выделения и дифференциации энтеробактерий, а также изучить из физико-химические и биологические свойства.
4. Разработать технологию получения ферментативного гидролизата сои, изучить физико-химические и биологические свойства препарата.
5. Изыскать новые технологические решения получения желточной эмульсии, готовой к употреблению, с длительным сроком хранения и экстракта кормовых дрожжей с высокой степенью прозрачности.
6. Экспериментально обосновать состав и разработать сухую селективную среду для бактериологического анализа мочи, а также питательную среду для определения антибактериальных субстанций в моче. Изучить физико-химические и биологические показатели созданных сред.
7. Разработать комплекс питательных сред для накопления, выделения и субкультивирования гемокультур, изучить физико-химические и биологические характеристики сконструированных сред.
8. Разработать новую селективную питательную среду для выделения B. cereus, изучить физико-химические и биологические свойства препарата.
Научная новизна. В экспериментальных исследованиях выявлены альтернативные источники белкового сырья для получения питательных сред, позволяющие полноценно заменить каспийскую кильку на другие источники белкового сырья без изменения конечных характеристик получаемых основ и стадий технологического процесса.
Впервые экспериментально обоснована и разработана технология получения сухого ферментативного пептона из рыбного сырья, который по физико-химическим и биологическим показателям не уступает аналогичным препаратам ведущих зарубежных фирм, но превосходит пептон производства Семипалатинского мясокомбината и фирмы HiMedia.
Разработана технология получения электролит-дефицитной питательной основы из рыбного сырья. Показана способность данной основы подавлять роение протеев и одновременно способствовать росту других патогенных и условно патогенных микроорганизмов.
Разработана технология получения сухой питательной основы из отходов производства мяса криля. Питательный агар, приготовленный на данной основе, полностью соответствовал требованиям Фармакопейной статьи предприятия на питательный агар - ФСП № 42-0504-5807-04.
Изучены закономерности и определены оптимальные технологические параметры процессов получения гидролизата сои. Среды на основе этого гидролизата обладали высокой чувствительностью, способны выявить рост микроорганизмов при минимальной посевной дозе, что указывает на его высокие ростовые свойства.
Усовершенствована технология получения ЭКД, обладающего ростстимулирующей активностью в отношении тест-штаммов ауксотрофных по витаминам группы В, а также полной прозрачностью и высокой фильтруемостью.
Разработана технология получения желточной эмульсии для определения лецитиназной активности микроорганизмов в готовом к употреблению виде с длительным сроком хранения.
Научно обосновано новое направление в разработке отечественных сред на электролит-дефицитной питательной основе. На этом субстрате разработаны новые питательные среды: электролит-дефицитный питательный агар для выделения, дифференциации и количественного определения бактерий в моче, питательная среда для выделения и дифференциации E. coli O157:H7 и электролит-дефицитный агар с эозин-метиленовым синим для выделения и дифференциации энтеробактерий. Экспериментально показаны преимущества электролит-дефицитных сред, которые заключались в способности подавлять роение протеев и одновременно поддерживать рост выделяемых микроорганизмов.
Разработана сухая селективная среда для выделения и предварительной идентификации микроорганизмов в моче. В экспериментах установлено, что созданная среда совместно с неселективной средой при посеве мочи позволяет ускорить идентификацию микроорганизмов.
Разработана новая питательная среда для определения антибактериаль-ных субстанций в моче, обладающая высокой чувствительностью и способностью выявлять в моче низкие концентрации антибактериальных препаратов.
Разработан комплекс питательных сред для накопления, выделения и субкультивирования гемокультур. Показано преимущество разработанных сред по чувствительности и эффективности накопления основных возбудителей гемоинфекций, что способствует выделению гемокультуры при низкой напряженности бактериемии.
Разработана селективная среда для выделения B. cereus в чистой культуре из клинического материала и пищевых продуктов.
Основные положения научной новизны исследований подтверждены 15 патентами и авторскими свидетельствами.
Практическая значимость работы и внедрение результатов в практику. Предложены альтернативные источники рыбного сырья, позволяющие расширить сырьевую базу для производства питательных сред.
В промышленное производство внедрены новые технологии получения белковых основ и питательных сред, повышающие эффективность производства и расширяющие номенклатуру питательных сред.
Новые питательные среды, позволяют улучшить бактериологическую диагностику инфекционных заболеваний.
По результатам выполненных исследований утверждены НД:
ФСП 42-0504-3426-04, ПР №58944705-03-06. Питательная среда для выделения и дифференциации E.coli O157:H7 и других энтеробактерий по признаку ферментации сорбита, сухая (ЭДКС-агар);
ФСП 42-0504-3162-04, ПР №58944705-02-06. Питательная среда для выделения, дифференциации и количественного определения бактерий в моче электролит-дефицитная сухая (ЭДПА);
ФСП 42-504-3427-04, ПР №58944705-01-06. Питательная среда для выделения и дифференциации энтеробактерий селективная, сухая (типа Макконки агара);
Промышленный регламент на производство питательного бульона для культивирования микроорганизмов (СПБ) №1681-05;
Регламент производства №148-88 - Питательный агар для культивирования микроорганизмов, сухой;
Регламент производства №1937-00, ФСП 42-3441-97, изменение 1. Экстракт кормовых дрожжей для микробиологических питательных сред, сухой.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Выявлены альтернативные источники белкового сырья для производства питательных сред, позволяющие осуществить замену одних видов сырья другими без изменений конечных характеристик препаратов и условий проведения стадий технологического процесса.
2. Экспериментально обоснована и разработана технология получения сухого ферментативного пептона из рыбного сырья.
3. Разработана сухая электролит-дефицитная питательная основа и научно обоснована целесообразность ее использования в составе сред для выделения, дифференциации и количественного определения бактерий в моче, для выделения и дифференциации различных видов энтеробактерий, включая энтерогеморрагические E.coli O157:H7 .
4. Сконструированы сухие питательные среды для бактериологического анализа мочи - селективная среда для выделения и дифференциации энтеробактерий и среда для определения антибактериальных субстанций в моче.
5. Экспериментально обоснованы и разработаны питательные среды для накопления и выделения гемокультур.
6. Создана селективная среда для выделения B.cereus.
Апробация материалов диссертации. Основные результаты проведенных исследований доложены на:
VII съезде - Всесоюзном совещании Биологически активные вещества гидробионтов - новые лекарственные, лечебно-профилактические и технические препараты. Владивосток. - 1992 г; Всероссийском обществе эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., - 1997 г; Международной научной конференции Разработка и производство диагностических питательных сред и микротест-систем, Махачкала, - 1998г; VI-Российском национальном конгрессе Человек и лекарство. М., - 1999 г; 3-й Международной научно-практической конференции Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем; Махачкала, - 2001 г; VIII Съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., - 2002 г; 4-й Международной научно-практической конференции Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем, Махачкала, - 2003 г; Научно-практической конференции Новые технологии в медицине, Махачкала, - 2003 г; Всероссийской научной конференции посвященной 105-летию Пермского НПО Биомед, Пермь, Ц 2003 г; Международном конгрессе Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы, институт им. Л. Пастера Санкт-Петербург, - 2003 г; Всероссийской научной конференции Актуальные вопросы разработки, производства и применение иммунобиологических и фармацевтических препаратов, Томск, - 2004 г; III Съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова. М., Ц 2005 г; Всероссийской научно-практической конференции Вакцинология. М., - 2006г; I Всероссийской конференции: Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты, Пущино, - 2007 г. Диссертация апробирована 05.10.07 г. на конференции в НПО Питательные среды.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 47 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 271 странице и состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 205 источников, и приложения. Материалы исследований иллюстрированы 52 таблицами и 8 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования.
В работе использовали следующие материалы: каспийскую кильку, минтай, хек, путассу, ставриду, панцирь криля мороженый, (ТУ 15-04-545-87), а также поджелудочную железу крупного рогатого скота ГОСТ 11285-93, пепсин ТУ 9219-560-00419779-2000, сухую желчь КРС ТУ-4970-85, панкреатин ОСТ 49-167-81, соевую муку СОПРО-УТБ фирмы ВОБЕКС-интерсоя, панкреатический гидролизат казеина РП №816-98, гидролизат казеина средней степени расщепления ФС 42-3528-98, питательный агар ФСП 42-0504-5807-04, питательный бульон ФС 42-0504564, пептоны и питательные среды фирм Difco, Oxoid, Merck, HiMedia, Serva, bioMerieux, экстракт кормовых дрожжей ФС 42-3441-97.
При проведении контроля разрабатываемых питательных сред использовали музейные тест-штаммы, полученные из ГИСК им. Л.А.Тарасевича: S.aureus FDA 209P, S.aureus Wood-46, S.aureus ATCC 25923, S.saprophiticus CCM 883, S.epidermidis ATCC 14990, S.pyogenes Dick 1, S.pyogenes 1521, S.pneumoniae LD, S.viridans 22, С.xerosis 1911, E.faecalis 775, S.enterica Typhi H901, S.enterica Typhimurium 79, S.enterica Paratyphi A525, S.enterica Paratyphi B506, S.flexneri 1a 8516, S.sonnei S-form, P.mirabilis 71/2, P.mirabilis 3177, P.mirabilis 46, P.vulgaris HX19, P.vulgaris 4636, K. pneumoniae 51, K.pneumoniae 4140, E.aerogenes 418, P. aeruginosa 27/99, S.marcescens 1, E.coli 3912/41 (O55:K59), E.coli ATCC 25922, E.coli Ewing (O124K72), E.coli 675, E.coli 168/59 (0111:K58), E.coli O157:H7-№4; 9; 12; 20; 25; 10; 63; 120; 122; 904; 23; 1282; 1330; 214, C.freundii 101/57, E.cloacae A-186, B.abortus 19BA, C.albicans ATCC 885/653, B.cereus 8035, B.cereus 2010, B.cereus 2527, B.subtilis ATCC 6051, B.megaterium 89, B.polymyxa 26, B.mycoides 587, H.influenzae 55, C.perfringens TAB6K28.
Биологический контроль качества экстракта кормовых дрожжей проводили с помощью микроорганизмов ауксотрофных по витаминам группы В: Pichia fermentans Lodder BKM 1375-ауксотроф по витамину В1, Debaryomyces disporus BKM 1575-ауксотроф по витамину В6, Saccharomyces cerevisiae BKM 1168-ауксотроф по витамину В3, Kluyveromyces marxianus BKM 1148-ауксотроф по витамину В5. Тест-штаммы получены из коллекции непатогенных микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.
Физико-химические свойства питательных основ и сред оценивали в соответствии с ФС 42-3874-99 и МУК 4.1/4.2.588-96. Содержание пептонов определяли в биуретовой реакции (Л.Я.Телишевская, 2000), углеводов фенольным методом (О.А. Максименко, Л.А. Зюкова, Ф.М.Федорович, 1975), триптофана по Уденфриду (А.Н.Савицкий, В.М.Беликов, М.О. Рожанский, 1967). Аминокислотный состав препаратов изучали на автоматическом анализаторе фирмы Биотроник (ФРГ) по стандартной методике.
Биологические свойства разработанных питательных сред и основ проводили согласно Методическим рекомендациям к контролю питательных сред по биологическим показателям (М., 1980). Чувствительность среды оценивали по максимальному разведению культуры, при котором на засеянных чашках, пробирках обнаруживали рост микроорганизмов.
Для стандартизации посева определенного количества микробных клеток в жидкую или плотную питательную среду использовали бактериальный стандарт мутности (ОСО 42-28-85-07) ГИСК им. Л.А.Тарасевича на 10 ед.
При этом определяли характер роста культур в жидких средах, рост бактерий с равномерным помутнением среды, придонный рост, поверхностный рост бактерий, а также размер, форму, цвет, рельеф и структуру колоний на плотных средах. Дифференцирующие свойства среды определяли по выраженности изменения цвета колоний или цвета среды под колониями, ореол вокруг них, диаметр последнего. Показатель эффективности (кратность увеличения числа микробных клеток после инкубации посевов) определяли как отношение среднего количества колоний, выросших при высеве из среды обогащения, к среднему количеству колоний, выросших из посевной дозы:
Рэ=(nt-nо)К
nо
где Рэ - показатель эффективности;
nt - количество колоний, выросших на плотных средах после высева суспензии из среды обогащения;
no - количество жизнеспособных клеток в посевной дозе;
К - степень разведения суспензии.
Споровую культуру тест-штамма B. subtilis 6051 получали согласно ГФ XI СССР М., (1990).
Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам определяли согласно МУК 4.2.1890-04.
Для определения ростстимулирующей активности экстракта кормовых дрожжей к синтетической среде Ридер с сахарозой добавляли 0,3% препарата. Посев ауксотрофных микроорганизмов осуществляли из разведения 10-5. Учет результатов производили через 48 ч инкубации посевов при 280С путем измерения оптической плотности при длине волны 540 нм. Контролем являлась сахарозо-минеральная среда Ридер без добавления витаминного препарата.
Разработку основных режимов получения питательных основ и сред осуществляли в экспериментально-производственных условиях. Гидролиз сырья проводили в реакторах емкостью 1000 л, высушивание гидролизатов осуществляли на распылительной сушке ОС-20В НСШ-16. Для получения агаровых сред концентрированный гидролизат смешивали с агаром, гранулировали и высушивали в псевдокипящем слое в сушилке СП-100 при 700С в течение 1 ч (А.М. Алиев и др., авт. свид. №638614). Для получения многокомпонентных сред сухие компоненты в определенной последовательности загружали в мельницу-смеситель согласно разработанной рецептуре и перемешивали в течение 1,5-2 ч.
Результаты полученных исследований обрабатывали статистически с использованием параметрических методов статистики, применяя компьютерную программу Stat. Достоверность различий (р) между средними арифметическими (м) определяли с помощью критерия Стьюдента. Достоверным считали результаты при р≤0,05.
Результаты исследований и их обсуждение.
Разработка технологий получения питательных основ
из различных видов белкового сырья
Анализ литературных данных по химическому составу различных видов рыб (И.М.Скурихин, М.Н.Волгарев, 1987) позволил выявить источники рыбного сырья, которые могут служить альтернативой каспийской кильке.
Для подтверждения возможности использования выявленных источников рыбного сырья в производстве питательных основ проведен комплекс исследований по изучению химического состава и биологических свойств панкреатических гидролизатов минтая, хека, путассу и ставриды. При этом в основу получения панкреатических гидролизатов из данных видов рыб положены те же технологические приемы и режимы, что и при получении панкреатического гидролизата кильки.
Химический состав полученных гидролизатов из различных видов рыб представлен в табл. 1.
Из данных таб. 1 видно, что полученные препараты по содержанию общего, аминного азота, пептонов и по аминокислотному составу отвечают требованиям, предъявляемым к питательным основам и по этим показателям не отличаются от панкреатического гидролизата кильки.
Биологический контроль качества питательных агаров, сред Эндо, Левина на основе панкреатических гидролизатов из различных видов рыб показал, что по чувствительности, форме и размеру колоний, а также по дифференцирующим и селективным свойствам, они не отличались от контрольных сред и полностью соответствовали требованиям ФСП 42-0504-5807-04, ФСП 42-3504-98 и ФСП 42-3576-98.
Таким образом, полученные результаты исследований показали, что испытанные виды рыбного сырья могут служить полноценной заменой каспийской кильки в производстве питательных основ. Данная разработка защищена патентом РФ №2232187.
Таблица 1
Физико-химические свойства сухих панкреатических гидролизатов
из различных видов рыб
Показатели, % | Панкреати-ческий гидролизат минтая (Мm) | Панкреати-ческий гидролизат хека (Мm) | Панкреати-ческий гидролизат путассу (Мm) | Панкреати-ческий гидролизат ставриды (Мm) | Панкреати-ческий гидролизат кильки (Мm) |
Влажность | 5,90,4 | 6,20,3 | 6,20,2 | 5,80,2 | 5,80,3 |
Зола | 15,51,0 | 14,40,85 | 13,21,2 | 14,51,0 | 13,51,2 |
Хлориды | 9,71,2 | 7,01,5 | 8,01,0 | 9,11,3 | 8,51,3 |
Аминный азот | 4,90,3 | 5,00,3 | 4,90,4 | 5,10,3 | 4,90,25 |
Общий азот | 12,20,7 | 12,10,6 | 10,20,5 | 11,50,6 | 10,50,5 |
Углеводы | 1,20,15 | 1,20,18 | 0,90,1 | 1,10,1 | 1,20,12 |
Пептоны | 481,5 | 49,01,2 | 51,02,0 | 502,0 | 48,01,8 |
рН 2-% раствора | 7,10,2 | 7,00,2 | 7,00,1 | 7,10,2 | 7,00,2 |
Аминокислоты: Аспарагиновая кислота | 1,20,25 | 1,060,2 | 1,30,2 | 1,250,3 | 0,960,2 |
Треонин | 1,20,1 | 0,850,09 | 0,60,15 | 0,780,08 | 0,80,15 |
Серин | 0,450,1 | 0,350,08 | 0,440,1 | 0,360,06 | 0,50,08 |
Глутаминовая кислота | 1,30,15 | 1,30,1 | 1,50,15 | 1,460,18 | 1,30,2 |
Глицин | 0,270,09 | 0,250,1 | 0,290,1 | 0,30,09 | 0,550,1 |
Аланин | 1,00,2 | 1,30,2 | 0,90,2 | 1,10,2 | 0,60,12 |
Валин | 1,60,2 | 1,80,2 | 1,20,3 | 1,50,4 | 1,70,3 |
Метионин | 0,90,3 | 1,20,2 | 0,90,1 | 1,10,2 | 0,850,1 |
Изолейцин | 1,30,25 | 1,50,3 | 1,20,2 | 1,40,3 | 1,30,2 |
ейцин | 3,50,4 | 3,20,4 | 3,50,2 | 3,80,5 | 3,20,4 |
Тирозин | 1,70,25 | 2,00,3 | 1,80,25 | 1,60,2 | 1,50,3 |
Фенилаланин | 2,20,2 | 2,60,2 | 2,10,15 | 2,40,25 | 1,80,2 |
изин | 3,00,25 | 2,70,2 | 2,50,3 | 2,60,2 | 2,50,3 |
Гистидин | 0,500,1 | 0,390,09 | 0,350,08 | 0,350,09 | 0,90,1 |
Аргинин | 3,00,4 | 3,20,35 | 3,20,4 | 3,30,4 | 2,60,3 |
Триптофан | 0,240,05 | 0,370,04 | 0,330,08 | 0,340,05 | 0,350,07 |
Следующий этап работы включал разработку технологии получения сухого ферментативного пептона из рыбного сырья.
На основании экспериментальных данных по оптимизации процесса гидролиза установлено, что для получения пепсинового гидролизата с высоким содержанием пептонов 4,0-5,0% необходима предварительная термическая обработка сырья, инактивирующая содержащиеся в рыбном сырье ферменты типа пептидаз (Р.В.Берзинь-Берзит, П.М.Путера, 1991; Т.Н.Пивненко, Л.М.Эпштейн, 1991; Л.Я.Телишевская, 2000). При этом выявлены оптимальные соотношения компонентов гидролизуемой смеси (субстрат:фермент:вода) равные - 1,0:0,01:2,0, определена оптимальная продолжительность процесса гидролиза (18-20 ч), обеспечивающая необходимую степень расщепления белка, оптимизирован процесс очистки пептона, включающий обработку его при различных значениях рН - сначала в кислых условиях при pH-3,8- 4,2, а затем в основных при pH-7,8-8,2, с последующей термической обработкой при каждом из указанных значений pH и фильтрацией, что гарантировало высокую степень прозрачности пептона и отсутствие осадка после стерилизации. Отработаны оптимальные режимы сушки: 180-2000С на входе в сушильную камеру и на выходе 100-1100С, обеспечивающие получение продукта с влажностью не более 7,0 %.
В табл. 2 представлена сравнительная физико-химическая характеристика разработанного пептона и пептонов различных фирм.
Таблица 2
Сравнительная физико-химическая характеристика разработанного пептона и пептонов различных фирм
Показатели в % | Пептон разработан-ный (Mm) | Bacto Peptone Difco (Mm) | Peptone Oxoid Р (Mm) | Peptone HiMedia (Mm) | Пептон Семипала-тинский (Mm) |
рН - 2% раствора | 6,9±0,1 | 7,0±0,1 | 7,1±0,1 | 6,6±0,1 | 6,5±0,2 |
Аминный азот | 2,56±0,25 | 3,0±0,3 | 2,8±0,3 | 4,5±0,2 | 3,5±0,2 |
Общий азот | 11,9±0,9 | 13,0±1,0 | 12,0±1,0 | 12,0±1,2 | 12,0±1,0 |
Пептоны | 81,0±3,0 | 80,9±2,5 | 79±2,5 | 70,5±3,0 | 72,7±2,6 |
Триптофан | 0,35±0,04 | 0,36±0,04 | 0,34±0,03 | 0,15±0,02 | 0,4±0,05 |
Углеводы | 0,9±0,1 | 2,8±0,2 | 1,0±0,16 | 1,5±0,15 | 1,2±0,12 |
Индол | отсутствует | отсутствует | отсутствует | отсутствует | отсутствует |
Степень расщепления белка | 23,0±1,5 | 23,0±1,0 | 23,3±1,6 | 34,8±2,2 | 29,0±2,0 |
Из данных табл. 2 видно, что полученный препарат характеризуется высоким содержанием пептонов (81,0±3,0%) и неглубокой степенью расщепления белка (23,0±1,5%), что характерно для пепсиновых гидролизатов (Л.Я. Телишевская, 2000). По количественному показателю пептонов, а также по уровню аминного и общего азота разработанный препарат статистически сопоставим с пептонами фирм Difco и Oxoid. Аминокислотный состав полученного пептона представлен 17 аминокислотами.
Результаты изучения биологических свойств разработанного пептона и некоторых коммерческих препаратов пептонов представлены в табл. 3.
Из данных табл. 3 видно, что разработанный пептон, присутствующий в питательном бульоне, по чувствительности не уступает пептонам фирм Difco, Oxoid и превосходит пептон Семипалатинский и HiМedia.
Полученный пептон обеспечивал в бульоне четкое образование индола тест-штаммом S.flexneri 1a 8516 и сероводорода штаммами S.typhi H901 и P.vulgaris HХ19. Наиболее слабое образование индола отмечено в бульоне с пептоном HiМedia, что объясняется низким содержанием в нем триптофана (0,15±0,02%).
Таблица 3
Сравнительная характеристика роста тест-штаммов в питательных бульонах, приготовленных на основе различных пептонов
Тест-штаммы | Чувствительность бульонов с различными пептонами | ||||
Пептон разработан-ный | Peptone Oxoid | Пептон Семипала- тинский | Peptone HiMedia | Peptone Difco | |
S.pyogenes Dick 1 | 10-4 | 10-4 | 10-3 | 10-3 | 10-4 |
S. aureus Wood-46 | 10-6 | 10-6 | 10-5 | 10-5 | 10-6 |
E. faecalis 775 | 10-6 | 10-6 | 10-5 | 10-5 | 10-5 |
S. epidermidis 14990 | 10-6 | 10-6 | 10-5 | 10-5 | 10-6 |
S.entericaTyphi H901 | 10-7 | 10-7 | 10-6 | 10-6 | 10-7 |
S. flexneri 1a 8516 | 10-6 | 10-6 | 10-5 | 10-5 | 10-6 |
P. aeruginosa 27/99 | 10-7 | 10-7 | 10-6 | 10-6 | 10-7 |
S.sonnei S-form | 10-6 | 10-6 | 10-6 | 10-6 | 10-6 |
E. coli 3912/41 (O55:K59) | 10-7 | 10-7 | 10-6 | 10-6 | 10-7 |
C. xerosis 1911 | 10-6 | 10-6 | 10-5 | 10-5 | 10-6 |
При сравнительном изучении показателей эффективности различных пептонов в отношении тест-штаммов E. coli 3912/41, S. flexneri 1a 8516, S. enterica Typhi H901, E. faecalis 775, S. aureus 209P, S. epidermidis 1499 выявлено, что разработанный пептон превосходил пептон Семипалатинский и HiMedia в 1,8-2,0 раза в зависимости от вида микроорганизмов и не уступал пептонам фирм Oxoid и Difco.
Таким образом, комплекс проведенных исследований показал, что разработанный пептон может быть использован для выращивания микроорганизмов различных таксономических групп. На разработанный пептон составлена нормативная документация (НД) - регламент производства (РП) и фармакопейная статья предприятия (ФСП). Разработка защищена патентом РФ №2235770.
Существующие технологии получения питательных основ в виду использования в технологическом процессе кислот и щелочей предопределяют наличие в них солей. Поэтому для получения электролит-дефицитных питательных сред в первую очередь необходимо было разработать питательную основу с минимальным содержанием солей.
Указанная цель достигнута путем модификации существующей технологии обработки рыбного сырья (Промышленный регламент №1681-05 на производство питательного бульона), при которой из технологического процесса исключались вещества, способствующие минерализации основы, в частности соляной кислоты на стадии подкисления и первой фильтрации, а также замене едкого натрия на водный раствор аммиака на стадии подщелачивания и второй фильтрации.
Модифицированная технология включала следующие основные операции: гидролиз рыбного сырья при гидромодуле 1:2 с помощью поджелудочной железы или панкреатина в течение 5,0-6,0 ч до содержания аминного азота 0,5-0,6%; кипячение смеси в течение 15-20 мин и фильтрацию; подщелачивание фильтрата водным раствором аммиака до рН - 8,2-8,4; кипячение гидролизата в течение 15-20 мин и фильтрацию; концентрирование гидролизата до 12-15% сухих веществ; высушивание концентрированного гидролизата на распылительной сушилке при температуре на входе 180-2000С, на выходе 100-1100С.
Полученная по модифицированной технологии сухая питательная основа содержала 5,40,2% аминного азота, 9,50,46% общего азота, 52,04,0% пептонов, 1,00,1% минеральных веществ, рН 2% раствора 7,10,1. Аминнокислотный состав был представлен 17 аминокислотами (в %): аспарагиновая кислота - 0,860,07, треонин - 0,80,08, серин - 0,70,06, глутаминовая кислота - 1,050,15, глицин - 0,70,04, аланин - 0,450,02, цистин-следы, валин - 1,40,08, метионин - 0,80,06, изолейцин - 1,20,08, лейцин - 2,80,4, тирозин - 1,60,08, фенилаланин - 1,750,2, лизин - 2,50,2, гистидин - 1,00,15, аргинин - 2,20,3, триптофан - 0,350,05.
В целом, по химическому составу полученная основа равноценна классическим ферментативным основам (Л.Я. Телишевская, 2000).
Однако низкое содержание минеральных веществ (1,00,1%) позволило нам рассматривать ее как электролит-дефицитную, что было подтверждено в биологических опытах при посеве тест-штаммов роящихся форм протеев (табл. 4).
Из данных табл. 4 видно, что на разработанной основе тест-штаммы P. vulgaris HX19 и 4636, P. mirabilis 71/2, 3177 и 46 росли в виде отдельных колоний в О-форме (отсутствие роения), в то время как на питательном агаре они образовали сплошной вуалеобразный налет (роение, Н-форма). Подавляя роение протеев, полученная основа одновременно способствовала росту других патогенных и условно патогенных бактерий E.coli 3912/41 (055:К59), S.aureus FDA 209-Р, S.enterica Typhi Н901, S.sonnei S form, E.faecalis 775, S.epidermidis 14990, P.aeruginosa 27/99, S.flexneri 1а 8516, не уступая по количеству и размеру выросших колоний питательному агару.
Уникальная способность данной основы подавлять роение протеев и поддерживать при этом рост широкого круга микроорганизмов позволили в последующих исследованиях использовать ее при разработке новых электролит-дефицитных питательных сред.
При переработке морепродуктов образуется большое количество отходов, представляющих серьезную экологическую и экономическую проблему. Одним из направлений утилизации отходов рыбной промышленности является использование их в качестве сырья для производства питательных сред.
Таблица 4
Рост тест-штаммов из разведени1 10-6на электролит-дефицитной основе и питательном агаре
| Тест-штаммы | Рост тест-штаммов на электролит-дефицитной основе (Мm) | Рост тест-штаммов на питательном агаре Контроль (Мm) | ||
КОЕ | Форма и размер (d) колоний | КОЕ | Форма и размер (d) колоний | |
P. vulgaris HX19 | 42,03,0 | О 1,00,2 | сплошной вуалеобразный налет | Н (роение) |
P. vulgaris 4636 | 39,04,0 | 1,10,15 | сплошной вуалеобразный налет | Н |
P. mirabilis 71/2 | 46,05,0 | О 1,20,3 | сплошной вуалеобразный налет | Н |
P. mirabilis 46 | 38,03,0 | О 2,10,2 | сплошной вуалеобразный налет | H |
P. mirabilis 3177 | 44,05,0 | О 1,80,15 | сплошной вуалеобразный налет | Н |
E. coli 3912/41 (O55:K59) | 41,03,0 | S 2,20,25 | 40,03,0 | S 2,30,2 |
S. aureus FDA 209Р | 36,03,0 | S 2,10,2 | 35,03,0 | S 2,20,2 |
S. flexneri 1a8516 | 32,04,0 | S 1,40,2 | 33,03,0 | S 1,30,15 |
S.enterica Ttyphi H901 | 39,05,0 | S 1,60,25 | 40,05,0 | S 1,70,2 |
S. sonnei S form | 45,05,0 | S 1,90,2 | 42,05,0 | S 2,00,2 |
E. faecalis 775 | 32,04,0 | S 2,20,15 | 30,03,0 | S 2,30,18 |
S. epidermidis ATCC 14990 | 38,05,0 | S 2,00,2 | 40,05,0 | S 2,00,2 |
P. aeruginosa 27/99 | 32,04,0 | S 1,80,2 | 30,04,0 | S 1,90,2 |
K.pneumoniae 4140 | 35,03,0 | 2,00,2 | 37,04,0 | 2,10,2 |
Нами проведены исследования по изучению возможности использования в производстве питательных сред отходов, образующихся при производстве мяса криля. При исследовании процесса ферментативного гидролиза отходов мяса криля с помощью поджелудочной железы и панкреатина установлены оптимальные соотношения сырья : фермент : вода - 1,0:0,1:3,0, обеспечивающие через 4,0-5,0 ч гидролиза содержание общего азота 0,9-1,0 %, аминного азота - 0,26-0,32 %, что соответствовало степени расщепления белка 29,0-32,0 %.
Однако при испытании полученного гидролизата в составе питательного бульона и питательного агара, отмечено отсутствие роста контрольных тест-штаммов S.flexneri 1а 8516, S.enterica Typhi Н901, S.pyogenes Dick 1.
Высказано предположение, что ингибирующий эффект гидролизата связан с присутствием в нем ионов кальция, которые образуются в результате взаимодействия соляной кислоты, используемой при подкислении гидролизата, с углекислым кальцием из панциря криля. Анализ гидролизата на наличие ионов кальция подтвердил данное предположение. Содержание ионов кальция в гидролизате составляло довольно высокую величину - 1,2±0,2 % в сравнении с рыбным аналогом - 0,1±0,015 %.
Для очистки гидролизата использовали способность ионов кальция образовывать с фосфат - ионами нерастворимые соединения в виде фосфатов кальция. При этом оттитрована доза фосфорнокислого натрия (0,45 кг на 100 л гидролизата), а также значения рН гидролизата (7,8-8,2), температура (1000С) и время термической обработки (10 мин), обеспечивающие полное осаждение ионов кальция. Дальнейшая обработка гидролизата включала известные технологические приемы получения сухих питательных основ. Полученный сухой гидролизат по содержанию общего азота - 10,2±0,5%, аминного азота - 4,0±0,4%, пептонов - 52,0±2,0%, углеводов - 0,9±0,2% и по аминокислотному составу (16 аминокислот) отвечал основным требованиям, предъявляемым к питательным основам, что подтверждено результатами биологического контроля питательного агара на основе гидролизатов из отходов переработки мяса криля (табл. 5).
Из данных табл. 5 видно, что питательный агар на основе панкреатического гидролизата отходов переработки мяса криля полностью соответствовал требованиям ФСП на препарат. Разработка защищена авторским свидетельством №1587678 и внедрена в производство.
Задачей следующего этапа исследований явилась разработка промышленной технологии получения гидролизата сои.
В сое содержится пять и более ингибиторов протеаз (В.Б.Толстогузов, 1987).
Для инактивации ингибиторов протеаз применяли термическую денатурацию. Установлено, что обработка суспензии соевой муки при 70-800С в течение 20-30 минут обеспечивала полную инактивацию ингибиторов протеаз. Так, при гидролизе с помощью поджелудочной железы суспензии соевой муки, предварительно подвергнутой термической обработке, содержание аминного азота в гидролизате составляло 0,23-0,25 %, пептонов - 2,5-3,0 %, тогда как без термической обработки было соответственно
0,13-0,15 %, 0,5-0,6 %.
Таблица 5
Биологический контроль качества питательного агара на основе панкреатического гидролизата из отходов переработки мяса криля
Тест-штаммы | Биологические показатели роста на средах | |
Питательный агар на основе гидролизата из отходов мяса криля | Сухой питательный агар (Контроль) ФСП-42-0504-5807-04 | |
S. flexneri 1а 8516 | Рост тест-штамма при посеве 0,1мл микробной взвеси из разведения 10-6 в виде бесцветных прозрачных колоний d-1,0-1,5 мм в S форме. | Рост тест-штамма при посеве 0,1мл микробной взвеси из разведения 10-6 в виде бесцветных прозрачных колоний d-1,0-1,5 мм в S форме. |
S. sonnei S-form | Рост тест-штамма при посеве 0,1мл микробной взвеси из разведения 10-6 в виде бесцветных прозрачных колоний d-1,0-1,5 мм в S форме. | Рост тест-штамма при посеве 0,1мл микробной взвеси из разведения 10-6 в виде бесцветных прозрачных колоний d-1,0-1,5 мм в S форме. |
S. enterica Typhi Н901 | Рост тест-штамма при посеве 0,1мл микробной взвеси из разведения 10-6 в виде бесцветных прозрачных колоний d-1,0-1,5 мм в S форме. | Рост тест-штамма при посеве 0,1мл микробной взвеси из разведения 10-6 в виде бесцветных прозрачных колоний d-1,0-1,5 мм в S форме. |
P. aeruginosa 27/99 | Сплошной рост с образованием сине-зеленого пигмента при посеве 0,1 мл микробной взвеси по стандарту мутности 10 ед. | Сплошной рост с образованием сине-зеленого пигмента при посеве 0,1 мл микробной взвеси по стандарту мутности 10 ед. |
S. marcescens 1 | Сплошной рост с образованием красного пигмента при посеве 0,1 мл микробной взвеси по стандарту мутности 10 ед. | Сплошной рост с образованием красного пигмента при посеве 0,1 мл микробной взвеси по стандарту мутности 10 ед. |
При разработке технологии получения ферментативных гидролизатов одной из сложных задач является очистка гидролизата от балластных веществ. Использование традиционных методов очистки, включающих обработку гидролизатов при различных значениях рН, не обеспечивало получение гидролизата сои с высокой степенью прозрачности. Очевидно, это связано с тем, что в сое, помимо белковых веществ, содержится целый комплекс высокомолекулярных соединений (целлюлоза, гемицеллюлоза, анионные полисахариды), которые могут образовывать с белком электростатические комплексы, снижающие величину рН (В.Б.Толстогузов, 1987). В результате часть белков и других высокомолекулярных веществ, растворимых при повышенных температурах, проходят сквозь фильтровальную перегородку и при охлаждении выпадают в осадок. Изучение влияния рН и термической обработки на полноту осаждения белковых и других высокомолекулярных веществ показало, что подщелачивание гидролизата после первой фильтрации до рН 8,3-8,6, термообработка при 70-800С в течение 15-30 минут и охлаждение перед фильтрацией до 20-400С обеспечивало высокую прозрачность гидролизата. Отклонение от указанных параметров исключало возможность получения препарата заданного качества. Очищенный гидролизат получали в виде сухого препарата путем концентрирования и высушивания методом распыления, при температуре на входе в сушильную камеру 180-2000С, на выходе - 100-1100С.
Сухой гидролизат сои содержал 2,30,2% аминного азота, 9,20,2% общего азота, 56,05,0% пептонов, 0,450,1% триптофана, 20,03,0% углеводов, 7,30,8% хлоридов, 5,40,8% влаги. Аминокислотный состав был представлен 17 аминокислотами.
Наличие в соевом гидролизате такого комплекса питательных веществ характеризовало его как высокопитательную основу, что было подтверждено данными биологических исследований (табл. 6).
Из данных таб. 6 видно, что разработанный гидролизат обладал высокой чувствительностью по отношению к штаммам, относящимся к различным таксономическим группам и не уступал по качеству соевому гидролизату фирмы Merck.
Разработка защищена патентом №2295249. Промышленный выпуск сухого гидролизата сои позволит расширить ассортимент коммерческих питательных сред на его основе.
При внедрении технологии получения экстракта кормовых дрожжей (ЭКД) по способу, предложенному рядом авторов (Л.Б.Бендас, Б.М.Раскин, А.К.Баранова, 1974; А.К.Баранова, 1978) выявлены следующие недостатки: длительность процесса фильтрации и невысокая степень прозрачности растворов препаратов. С целью их устранения проведен комплекс исследований по усовершенствованию технологии получения экстракта кормовых дрожжей.
Таблица 6
Сравнительные показатели чувствительности жидкой среды на основе созданного гидролизата сои при культивировании различных тест-штаммов
Тест-штаммы | Разработанный гидролизат сои | Соевый гидролизат фирмы Merck (контроль) | ||
чувствитель-ность | время инкубации посевов (ч) | чувствитель-ность | время инкубации посевов (ч) | |
S.pyogenes Dick 1 | 10-4 | 36-40 | 10-4 | 36-40 |
E. faecalis 775 | 10-6 | 20-22 | 10-6 | 20-22 |
S. epidermidis ATCC 14990 | 10-6 | 20-22 | 10-6 | 20-22 |
S. entericaTyphi H901 | 10-6 | 20-22 | 10-6 | 20-22 |
S. flexneri 1a 8516 | 10-6 | 18-20 | 10-6 | 18-20 |
S. aureus Wood-46 | 10-6 | 20-22 | 10-6 | 20-22 |
S. enterica Typhimurium 79 | 10-6 | 18-20 | 10-6 | 18-20 |
C. albicans 885 | 10-6 | 40-48 | 10-6 | 40-48 |
B. cereus 2010 | 10-6 | 18-20 | 10-6 | 18-20 |
C. xerosis 1911 | 10-6 | 36-48 | 10-6 | 36-40 |
S.sonnei S-form | 10-6 | 18-20 | 10-6 | 18-20 |
L. monocytogenes 56 | 10-6 | 20-24 | 10-6 | 20-24 |
P. aeruginosa 27/99 | 10-7 | 18-20 | 10-7 | 18-20 |
E. coli 3912/41 (O55:K59) | 10-7 | 18-20 | 10-7 | 18-20 |
K. pneumoniae 3534 | 10-7 | 18-20 | 10-7 | 18-20 |
E. aerogenes 1006 | 10-7 | 18-20 | 10-7 | 18-20 |
Для удаления основной массы взвешенных частиц использовали метод отстаивания, который обычно применяют в качестве первичного процесса разделения неоднородных систем. Установлено, что в течение 18-24 ч происходило полное расслоение экстракта на уплотненный осадок и осветленную жидкость, которая представляла собой тонкодисперсную систему. Для очистки экстракта от мелкодисперсных частиц использовали гель фосфата кальция. Известно, что он снимает заряд коллоидных частиц, в результате чего между частицами возникают силы сцепления, приводящие к образованию крупных пористых частиц и процесс разделения существенно ускоряется (Я.Я.Шкоп, Н.В.Фомченко, 1981). Нами определены оптимальные концентрации хлористого кальция и фосфорнокислого натрия, обеспечивающие образование геля фосфата кальция в количестве достаточном для коагуляции частиц дисперсной фазы (3-4г Na2HPO4 и 2,1-2,8г CaCl2 на 1 л экстракта).
Испытания разработанного способа предварительной очистки экстракта в производственных условиях показали его высокую эффективность, что выражалось в увеличении скорости фильтрации от 80 до 200 л/час с м2 фильтрующей поверхности и в получении продукта высокой степени прозрачности.
Сухой экстракт содержал 1,60,3% аминного азота, 6,00,2% общего азота, 8,01,5% углеводов, 7,21,2 % хлоридов, 5,21,2 % влаги, рН-0,5% раствора 6,50,3.
Экстракт кормовых дрожжей, полученный по разработанному способу, обладал ростстимулирующей активностью в отношении микроорганизмов ауксотрофных по витаминам В1, В3, В5, В6 и не уступал по данному показателю экстракту, полученному по традиционному способу (табл. 7). В настоящее время препарат выпускается в НПО Питательные среды согласно регламенту производства №1937-00. Разработка защищена патентом РФ №227158.
Таблица 7
Сравнительные данные по ростстимулирующей активности
экстрактов кормовых дрожжей в отношении тест-штаммов ауксотрофных по витаминам группы В
Тест-штаммы | Оптическая плотность культуральной жидкости через 48 ч инкубации посевов при 280С | ||
Экстракт дрожжей, полученный по разработанному способу | Экстракт дрожжей, полученный традиционным способом | Контрольная среда Ридер с сахарозой | |
Saccharomyces cerevisiae 1168 (В1) | 0,280,02 | 0,260,02 | 0,02 |
Debaryomyces disporus 1575 (В6) | 0,140,01 | 0,150,01 | 0,02 |
Kluyveromyces marxianus 1148 (В3) | 0,320,03 | 0,340,3 | 0,02 |
Pichia fermentans 1375 (В5) | 0,130,02 | 0,120,02 | 0,02 |
Зарубежные фирмы Oxoid, Merck для определения лецитиназной активности микроорганизмов выпускают желточную эмульсию в виде коммерческого препарата - Egg-Yolk Emulsion Sterile. В РФ аналогичный препарат не выпускается, что вынуждает бактериологов использовать желточную эмульсию, изготовляемую непосредственно в условиях лаборатории. При этом она не контролируется на микробиологическую чистоту и имеет ограниченный срок хранения.
В связи с этим проведена разработка технологии получения стерильной желточной эмульсии в готовом к употреблению виде с длительным сроком хранения.
Первый этап работы включал подбор оптимальных соотношений желтка и физиологического раствора для получения гомогенной эмульсии. Выявлено, что соотношения желтка и физиологического раствора равное - 1:2,0-2,5 обеспечивало получение желточной эмульсии заданного свойства. При других соотношениях получались сильно разбавленные эмульсии, в результате чего происходило ее расслоение, либо концентрированные, затрудняющие технологический процесс на стадии фильтрации.
Следующий этап включал разработку способа стерилизации препарата, основываясь на методе химической стерилизации с помощью хлороформа, который обычно используется для консервирования биологических жидкостей, содержащих белки (М.О.Биргер, 1982; Л.Я.Телишевская, 2000).
Суть разработанного способа заключалась в следующем: эмульсию яичного желтка фильтровали через 4 слоя стерильной марли, фильтрат разливали в стерильные флаконы, добавляли 1,0% хлороформа, оставляли на сутки при температуре окружающей среды, затем прогревали при 56-580С в течение 2 ч для удаления хлороформа. Флаконы закрывали стерильными пробками, герметизировали металлическими колпачками и повторяли режим прогрева.
В табл. 8 представлены результаты определения лецитиназной активности микроорганизмов на питательном агаре, содержащем желточную эмульсию, после 6-ти месячного хранения.
Таблица 8
Определение лецитиназной активности микроорганизмов на питательном агаре, содержащем желточную эмульсию после 6-ти месячного хранения
Тест-штаммы | Наличие зон лецитиназной активности |
S. aureus Wood-46 | + |
S. aureus FDA 209 P | + |
S. aureus 25 923 | + |
B. cereus 8035 | + |
B. cereus 2010 | + |
B. cereus 96 | + |
Cl. perfringens TAB6K28 | + |
S. epidermidis 14а990 (отрицательный контроль) | - |
B. subtilis 6051 (отрицательный контроль) | - |
Из данных табл. 8 видно, что желточная эмульсия, полученная по разработанной технологии, способствует проявлению лецитиназной активности тест-штаммами, которые продуцируют этот фермент. Вокруг колоний микроорганизмов, не обладающих лецитиназой, зоны ее активности отсутствовали.
Таким образом, разработанная технология обеспечивает получение желточной эмульсии с длительным сроком хранения. Использование ее в готовом к употреблению виде позволит сократить сроки предварительной подготовки к анализу. Разработка защищена патентом №2203958.
Разработка сухих питательных сред на электролит-дефицитной питательной основе
Зарубежные фирмы Oxoid, Merck, bioMerieux для бактериологического анализа мочи выпускают цистин-лактоза электролит-дефицитный агар (CLED-агар), который выявляет рост основных возбудителей уроинфекций и подавляет роение протеев, что позволяет определить степень бактериурии.
До настоящей разработки в РФ среду аналогичного назначения не выпускали. Это послужило основанием к проведению исследований по созданию электролит-дефицитной среды для бактериологического анализа мочи.
В качестве питательной основы разрабатываемой среды использовали электролит-дефицитную основу, полученную по оригинальной технологии. В качестве дифференцирующего маркера в состав среды включена лактоза, обеспечивающая в сочетании с индикатором бромтимоловым синим дифференцирующие свойства среде. Для стабилизации рН в состав среды включен трис-буфер, а качестве стимулятора роста микроорганизмов использовали L-цистеин (Manual of BBL Products and Laboratory Procedures. Sixth Edition).
На основании изучения биологических свойств более чем 100 образцов среды был определен оптимальный состав электролит-дефицитного питательного агара (ЭДПА) для выделения, дифференциации и количественного определения микроорганизмов в моче, содержащего в г\л: электролит-дефицитная питательная основа - 8,3; L-цистин - 0,128; лактоза - 10,0; трис-буфер - 0,2; агар - 12,0; бромтимоловый синий - 0,03.
Сравнительная характеристика роста тест-штаммов основных возбудителей уроинфекций на ЭДПА, CLED-агаре и питательном агаре показала, что разработанная среда полностью обеспечивала ростовые потребности основных возбудителей уроинфекций и ингибировала роение протеев, что позволяло провести количественный учет микроорганизмов и определить степень бактериурии, являющейся показателем наличия патологического процесса. Среда обеспечивала четкую дифференциацию микроорганизмов по признаку ферментации лактозы: микроорганизмы, ферментирующие лактозу, образовывали колонии желтого цвета, не ферментирующие - колонии голубого цвета (табл.9).
Испытания разработанной среды в практических условиях в лаборатории микробиологии НИИ урологии МЗ РФ г.Москвы, в бактериологическом отделе Центра санэпиднадзора №736 МО РФ и Дагестанском урологическом центре также подтвердили ее преимущества перед контрольной средой - питательным агаром (И.В.Гавристова, Г.А.Беляева, Ю.И.Обухова и др.,2001).
Разработанная среда по сравнению с CLED-агаром более проста по составу, не содержит дополнительных факторов роста в виде дрожжевого и мясного экстрактов. Данная разработка внедрена в практику здравоохранения и защищена патентом РФ№2145352.
Для выделения высокопатогенного штамма E. coli O157:H7 в нашей стране рекомендована модифицированная среда ЭндоЦСорбитол E. coli O157:H7 агар (Т.С.Шобухова, И.А.Гавристова, Н.М.Ландсман, М.В.Храмов, 1997). Ее недостатком является низкая селективность, и в случае наличия в клиническом материале роящихся форм протеев, выделение возбудителя инфекции в чистой культуре весьма затруднительно. За рубежом для выделения штамма E. coli O157:H7 используют селективные среды, содержащие дорогостоящие компоненты (Среды бактериоселективные, сухие Гем, М., - 1997). Аналогичные среды в РФ не выпускают, что обусловило целесообразность разработки сухой селективной среды для выделения и идентификации штамма E. coli O157:H7, которая являясь более простой по составу, не уступала бы по качеству зарубежным аналогам.
При разработке среды исходили из способности электролит-дефицитной питательной основы подавлять роение протеев. Для решения вопроса о возможности использования этой основы в качестве питательного субстрата, в составе разрабатываемой среды, изучено влияние ее на рост 14 штаммов E. coli O157:H7.
Установлено, что электролит-дефицитная основа обеспечивала рост всех штаммов E. coli O157:H7 и по чувствительности, размеру и форме колоний не уступала сухому питательному агару, являющемуся питательной основой большинства питательных сред для энтеробактерий. Это послужило основанием для использования ее в составе разрабатываемой среды.
Одним из основных дифференцирующих признаков тест-штаммов серотипа E. coli O157:H7 от других серотипов E. coli является отношение к сорбиту: первые - сорбит отрицательны, вторые - сорбит положительны (Ю.А.Ратинер, В.М.Бондаренко, A.Siitonen, 1998). Поэтому данный углевод введен в состав разрабатываемой среды в качестве дифференциального маркера. Экспериментально оттитрована оптимальная концентрация сорбита (1,2%), обеспечивающая в сочетании с рН-индикатором бромтимоловым синим четкую дифференциацию тест-штаммов E. coli O157:H7 от других серотипов E. coli. Тест-штаммы E. coli O157:H7 образовывали голубые колонии, колонии других серотипов - желтые.
Таблица 9
Сравнительная характеристика роста тест-штаммов основных возбудителей уроинфекций из разведений 10-6 на ЭДПА, CLED агаре и питательном агаре (СПА)
Тест-штаммы | Рост тест-штаммов на ЭДПА | Рост тест-штаммов на CLED-агаре фирмы Serva | Рост тест-штаммов на СПА | ||||||
КОЕ Мm | форма колоний | цвет колоний | КОЕ Мm | форма колоний | цвет колоний | КОЕ Мm | форма колоний | цвет колоний | |
E. coli 3912/41 (O55:K59) | 40,04,0 | S | желтый | 42,04,0 | S | желтый | 43,05,0 | S | бесцветные |
K. pneumoniae 4140 | 45,04,0 | S | желтый | 49,05,0 | S | желтый | 46,05,0 | S | бесцветные |
S. aureus FDA 209 Р | 32,03,0 | S | желтый | 29,03,0 | S | желтый | 32,03,0 | S | бесцветные |
E. faecalis 775 | 22,02,0 | S | желтый | 24,02,0 | S | желтый | 28,03,0 | S | бесцветные |
E. aerogenes 418 | 28,03,0 | S | желтый | 30,03,0 | S | желтый | 32,03,0 | S | бесцветные |
P. vulgaris HX19 | 45,05,0 | O | голубой | 46,05,0 | O | голубой | 48,05,0 | Н-(роение) | бесцветные |
P. vulgaris 4636 | 42,03,0 | O | голубой | 44,03,0 | O | голубой | 43,02,0 | Н-(роение) | бесцветные |
P. vulgaris 3307 | 44,05,0 | O | голубой | 42,04,0 | O | голубой | 46,05,0 | Н-(роение) | бесцветные |
P. mirabilis 3177 | 39,05,0 | O | голубой | 44,05,0 | O | голубой | 46,05,0 | Н-(роение) | бесцветные |
P. mirabilis 71/2 | 42,05,0 | O | голубой | 38,04,0 | O | голубой | 35,04,0 | Н-(роение) | бесцветные |
S. marcescens 1 | 25,02,0 | S | голубой | 26,03,0 | S | голубой | 28,03,0 | S | бесцветные |
P. aeruginosa 27/99 | 28,03,0 | S | светло-голубой | 25,03,0 | S | светло-голубой | 22,03,0 | S | бесцветные |
При создании селективных сред основной задачей является подавление ассоциативной микрофлоры. Данная задача была решена путем включения в состав разрабатываемой среды кристаллического фиолетового, обладающего избирательным бактериостатическим действием на грамположительные микроорганизмы (Microbiology Manual Merck, 1990). Внесение в среду 0,0001% кристаллического фиолетового ингибировало рост тест-штаммов S.aureus Wood-46, S.aureus АТСС 25923, S.aureus FDA 209Р, S.epidermidis 14990 из разведения 10-1.
На основании полученных результатов определен оптимальный состав среды для выделения и предварительной идентификации E.coli 0157:Н7 - электролит-дефицитный кристаллвиолет сорбитол агар (ЭДКС-агар), содержащий следующие компоненты в г/л: электролит-дефицитная питательная основа - 7,8, Д-(+)- сорбит - 12,0, бромтимоловый синий - 0,04, кристаллический фиолетовый - 0,001, трис-буфер - 0,36, агар - 11,5.
В табл. 10 представлены сравнительные данные роста тест-штаммов на ЭДКС-агаре и известных средах. По числу выросших колоний, селективным и дифференцирующим свойствам ЭДКС-агар не уступал МасСоnkеy-сорбитол агару, а по селективным свойствам, в частности, по способности подавлять роение протеев превосходил сорбитол E.coli 0157:Н7 агар отечественного производства.
Среда проста по составу и не содержит дорогостоящих компонентов. Она внедрена в производство и защищена патентом РФ №2157837.
Существующая схема выделения энтеробактерий предусматривает посев клинического материала на дифференциально-диагностическую среду с эозин-метиленовым синим - среду Левина. Однако среда не подавляет роение протея и не позволяет дифференцировать патогенные микроорганизмы от некоторых условно патогенных, не разлагающих лактозу.
С целью повышения селективных свойств в качестве основы разрабатываемой среды использовали электролит-дефицитную основу, а для улучшения дифференцирующих свойств в состав внесена дополнительно сахароза, что позволило дифференцировать лактозонегативные, но сахарозопозитивные условно патогенные энтеробактерии от патогенных, не ферментирующих эти углеводы. Однако при посеве смешанных культур микроорганизмов (E.coli 3912/41 и S.enterica TyphiH901; E.coli3912/41 и S.flexneri 1a 8516; E.coli3912/41 и S.sonnei S form), образующиеся в процессе ферментации лактозы и сахарозы органические кислоты диффундировали в соседние участки среды поэтому не ферментирующие эти углеводы патогенные энтеробактерии изменяли свою окраску, что не позволяло отличить их от условно патогенных микроорганизмов. С целью устранения указанного недостатка в состав разрабатываемой среды был включен трис-буфер в 0,04% концентрации. Это способствовало нейтрализации части кислот, образующихся в результате сбраживания углеводов, и они не диффундировали в соседние участки среды, в результате чего патогенные микроорганизмы не изменяли
Таблица 10
Сравнительная характеристика роста тест-штаммов из разведений 10-6
на ЭДКС-агаре и известных средах
Наименование тест-штаммов | Разработанная среда-ЭДКС-агар (Мm) | МасСоnkеy-сорбитол агар фирмы Oxoid (Мm) | Сорбитол E.coli 0157:Н7 агар ГНЦ ПМ (Мm) | ||||||
КОЕ | размер (d) и форма колоний | цвет колоний | КОЕ | размер (d) и форма колоний | цвет колоний | КОЕ | размер (d) и форма колоний | цвет колоний | |
E.coli 0157:Н7 № 4 | 38,03,0 | 2,20,2 S | голубые | 35,03,0 | 2,10,18 S | бесцветные | 35,03,0 | 2,20,2 S | бесцветные |
E.coli 0157:Н 7 №12 | 39,04,0 | 2,40,2 S | голубые | 40,04,0 | 2,50,2 S | бесцветные | 37,04,0 | 2,30,18 S | бесцветные |
E.coli 0157:Н 7 № 9 | 45,04,0 | 2,30,18 S | голубые | 42,04,0 | 2,20,18 S | бесцветные | 46,04,0 | 2,20,2 S | бесцветные |
E.coli 0157:Н 7 № 63 | 36,03,0 | 2,00,15 S | голубые | 36,03,0 | 1,90,15 S | бесцветные | 38,03,0 | 2,00,15 S | бесцветные |
E.coli 168\59 (0111:К58) | 40,04,0 | 2,40,19 S | желтые | 42,04,0 | 2,50,2 S | розовые | 39,04,0 | 2,40,2 S | красные |
E.coli №3912/41 (055:К59) | 32,03,0 | 2,30,15 S | желтые | 28,03,0 | 2,20,16 S | розовые | 34,03,0 | 2,20,16 S | красные |
S. enterica Typhimurium №79 | 52,06,0 | 2,20,2 S | желтые | 50,05,0 | 2,30,18 S | розовые | 50,05,0 | 2,20,18 S | красные |
P.mirabilis 71 (2) | 48,05,0 | 2,50,25 О | голубые | 49,05,0 | 2,40,2 О | бесцветные | роение | Н | бесцветные |
P.vulgaris HX19 | 54,05,0 | 1,30,1 О | голубые | 55,05,0 | 1,50,12 О | бесцветные | роение | Н | бесцветные |
S.aureus Wood 46 | нет роста | - | - | нет роста | - | - | нет роста | - | - |
S.epidermidis АТСС 14990 | нет роста | - | - | нет роста | - | - | нет роста | - | - |
Примечание: посев тест-штаммов S.aureus Wood-46,
S.epidermidis АТСС 14990 осуществляли из разведений 10-1.
свою окраску. Они были бесцветны, прозрачны и легко отличались от окрашенных в темно-фиолетовый цвет колоний условно патогенных энтеробактерий.
В результате полученных данных и на основании изучения более чем 150 образцов среды отработана оптимальная рецептура электролит-дефицитного агара с эозинметиленовым синим (ЭДЭМС-агара) для выделения и дифференциации энтеробактерий, включающая следующие компоненты, в г/л: электролит-дефицитная питательная основа - 11,0, лактоза - 7,5, сахароза - 7,5, эозин - 0,6, метиленовый синий - 0,065, трис-буфер - 0,4, агар - 11,0.
Сравнительные данные роста тест-штаммов на разработанной среде и на среде Левина, показали, что созданная среда имела существенное преимущество перед своим аналогом, поскольку обеспечивала рост бактерий протея в виде изолированных О-форм колоний, что в значительной мере облегчало выделение из микробной ассоциации энтеробактерий в чистой культуре. Кроме того, среда обеспечивала четкую дифференциацию патогенных энтеробактерий от условно патогенных, не ферментирующих лактозу, но ферментирующих сахарозу. Так, тест-штаммы P.vulgaris НХ19 и S.marcescens 1 на ЭДЭМС-агаре образовывали колонии темно-фиолетового цвета, тогда как на контрольной среде, они были бесцветны, как и патогенные энтеробактерии.
Таким образом, разработанный ЭДЭМС-агар по селективным и дифференцирующим свойствам превосходит известную среду Левина. Указанные преимущества позволяют рекомендовать разработанную среду для бактериологического анализа клинического материала на энтеробактерии. На разработанную среду составлена НД. Разработка защищена патентом РФ №2179582.
Разработка питательных сред для диагностики уроинфекций
В мировой практике для ускорения и предварительной идентификации уроинфекций рекомендуется производить посев мочи одновременно на две среды: электролит-дефицитную, поддерживающую рост всех основных возбудителей уроинфекций, и селективный MacConkey агар, используемый для роста только грамотрицательных микроорганизмов (Culture Media Manual bio Merieux, 1994).
В РФ отсутствует промышленный выпуск селективной среды для бактериологического анализа мочи, поэтому нами предприняты исследования по разработке отечественной сухой среды типа МасСоnkеy.
В качестве питательных основ разрабатываемой среды использовали сухой питательный агар, панкреатический и кислотный гидролизаты казеина производства НПО Питательные среды. Из испытанных основ только питательный агар полностью обеспечивал питательные потребности всех тест-штаммов, рекомендованных European Pharmacopoeia II, Chapter VIII.10. (1980), USP, National Formulary 16th.ed., Washington, D.C., (1985) для контроля Maс Conkey агара. На среде с кислотным гидролизатом казеина отсутствовал рост тест-штаммов, , S.enterica Typhi Н901, S. entericaТyphimurium 79, S.sonnei S form, S.flexneri 1a 8516, а на среде с панкреатическим гидролизатом казеина указанные штаммы образовывали мелкие колонии d-0,4-0,6 мм.
Испытания желчных солей производства НПО Питательные среды в качестве селективного компонента разрабатываемой среды показали, что они в концентрации 0,4-0,5% полностью подавляли роение протеев и не оказывали ингибирующего действия на рост других энтеробактерий.
Для подавления роста грамположительных микробов-ассоциантов в состав среды был включен кристаллический фиолетовый, а в качестве дифференцирующего маркера - лактоза и индикатор нейтральный красный.
На основании изучения биологических свойств 85 образцов определена рецептура сухой среды аналога МасСоnkеy агара, включающая следующие компоненты в г/л: питательный агар - 38,5, лактоза - 10,0, желчные соли - 4,5, нейтральный красный - 0,04, кристаллический фиолетовый - 0,001.
В табл. 11 представлены сравнительные данные роста тест-штаммов на полученной среде и МасСоnkеy агаре фирмы Merck, свидетельствующие, что разработанная среда по селективным и дифференцирующим свойствам не уступала МасСоnkеy агару фирмы Merck. Она ингибировала рост грамположительной микрофлоры и подавляла роение протеев, поддерживая при этом рост условно патогенных и патогенных энтеробактерий. Среда обладала дифференцирующими свойствами, основанными на способности микроорганизмов разлагать лактозу: лактозоположительные микроорганизмы образовывали на среде ярко-розовые колонии, лактозоотрицательные - бесцветные колонии.
Полученная среда проста по составу и содержит компоненты только отечественного производства. Среда внедрена в практику здравоохранения - Питательная среда для выделения и дифференциации энтеробактерий селективная сухая (типа Макконки агара). ФСП 42-0504-3427-04, ПР №58944705-01-06.
Бактериологическая диагностика уроинфекций включает постановку теста на наличие в моче антибактериальных субстанций (АБС).
В РФ препараты указанного назначения не выпускают. В связи с этим, были предприняты исследования по разработке сухой среды для определения АБС в моче.
Для решения указанной задачи, прежде всего, необходимо было выбрать тест-культуру, которая обладала бы высокой чувствительностью к антибактериальным препаратам, используемым при лечении уроинфекций. Исходя из того, что в этиологии инфекций мочевыводящих путей основную роль играют E. coli, Klebsiella, Proteus, Staphylococcus, Enterococcus и Pseudomonas (Л.З.Скала, С.В.Сидоренко, А.Г.Нехорошева, 1997; G.G.Zhanel, T.L.Hisanada, 2005) в набор антибактериальных препаратов для определения чувствительности были включены беталактамы, аминоглюкозиды, хинолоны. В качестве тест-культур использовали спорообразующие микроорганизмы B.cereus 5832, B. subtilis ATCC 6051. Установлено, что наибольшей чувствительностью к испытанным препаратам обладала, тест-культура B. subtilis ATCC 6051, что явилось основанием для использования ее в составе разрабатываемой среды.
Таблица 11
Сравнительные данные роста тест-штаммов из разведений 10-6 на
разработанной среде и МасСоnkеy агаре
Тест-штаммы | Разработанная среда | МасСоnkеy агар фирмы Merck | ||||||
количество колоний (Mm) | диаметр колоний, мм (Mm) | цвет колоний | форма колоний | количество колоний (Mm) | диаметр колоний, мм (Mm) | цвет колоний | форма колоний | |
E.coli 3912/41 (055:К 59) | 35,04,0 | 2,20,2 | ярко-розовые | S | 38,04,0 | 2,10,15 | ярко-розовые | S |
P.mirabilis 71/2 | 30,03,0 | 2,50,2 | бесцветные | О | 25,03,0 | 2,40,2 | бесцветные | О |
P.vulgaris HX19 | 32,04,0 | 2,20,18 | бесцветные | О | 28,04,0 | 2,00,16 | бесцветные | О |
K.pneumoniae №4140 | 36,04,0 | 2,40,25 | розовые | S | 40,05,0 | 1,50,3 | розовые | S |
P.aeruginosa 27/99 | 28,06,0 | 1,50,15 | бесцветные | S | 30,05,0 | 1,50,12 | бесцветные | S |
S.enterica Typhimurium 79 | 44,05,0 | 2,50,2 | бесцветные | S | 42,03,0 | 2,30,2 | бесцветные | S |
S.sonnei S form | 32,04,0 | 2,20,16 | бесцветные | S | 34,03,0 | 2,20,18 | бесцветные | S |
S.aureus FDA 209Р | нет роста | - | - | - | нет роста | - | - | - |
S. aureus Wood-46 | нет роста | - | - | - | нет роста | - | - | - |
S.epidermidis 14990 | нет роста | - | - | - | нет роста | - | - | - |
S.flexneri Iа 8516 | 30,03,0 | 1,10,1 | бесцветные | S | 32,04,0 | 1,30,1 | бесцветные | S |
B.cereus 2010 | нет роста | - | - | - | нет роста | - | - | - |
S enterica Typhi H901 | 38,04,0 | 2,00,15 | бесцветные | S | 34,05,0 | 2,10,15 | бесцветные | S |
Примечание: посев тест-штаммов S.aureus FDA 209Р, S.aureus Wood-46, B.cereus 2010, S.epidermidis 14990 осуществляли из разведений 10-1.
Дальнейшей задачей являлась разработка способа получения сухих спор указанной тест-культуры. Для ее решения использовали способность предварительно высушенного гигроскопического материала, например крахмала, поглощать большое количество влаги. При этом подобраны соотношения крахмала и споровой суспензии (14-15:1), которые обеспечивали получение спорового материала c влажностью не более 5%.
Следующий этап исследований включал подбор питательной основы, способствующей прорастанию спор. В качестве питательных основ испытаны питательный бульон, дрожжевой экстракт, панкреатический и кислотный гидролизаты казеина. Установлено, что сухой питательный бульон и экстракт кормовых дрожжей обеспечивали прорастание спор B.subtilis 6051 в течение 16-18 ч при 370С. Использование других основ лимитировалось удлинением сроков прорастания спор до 36-48 ч. Однако при испытании питательного бульона в составе среды, включающей споры B.subtilis на крахмальном носителе, глюкозу и индикатор феноловый красный, не наблюдали четкого перехода окраски индикатора из красной в желтую при прорастании спор. Очевидно, это объяснялось тем, что основным продуктом расщепления глюкозы тест-штаммом B. subtilis 6051 в присутствии пептонов является нейтральное соединение ацетилметилкарбинол (ацетоин), что было подтверждено при постановке реакции Фогеса-Проскауэра. При использовании дрожжевого экстракта, не содержащего пептонов, наблюдали четкое изменение цвета индикатора в результате образования кислых продуктов, что было подтверждено при постановке теста с метиловым красным (MR-тест).
Изучение влияния различных концентраций глюкозы в среде (от 0,5 до 2,0%) показало, что наиболее оптимальным количеством является содержание в среде 1,0-1,5% углевода, обеспечивающим наиболее интенсивную окраску среды при прорастании спор. Учитывая, что рН мочи может варьировать в широких пределах от кислой до основной, что может привести к искажению цветных реакций при посеве мочи, для стабилизации рН в состав среды в качестве буферной системы включили натрий фосфорнокислый и натрий углекислый.
На основании испытания 250 образцов экспериментальной среды, содержащих различные концентрации дрожжевого экстракта, глюкозы, спор на крахмальном носителе, индикатора и буферной системы определен оптимальный состав среды для определения АБС в моче, содержащей в г/л: дрожжевой экстракт - 4,5, глюкоза - 15,0, споры В.subtilis на крахмальном носителе - 1,2, феноловый красный - 0,045, натрий фосфорнокислый - 0,7, натрий углекислый - 0,045.
Сравнительные исследования чувствительности разработанной среды для определения АБС в моче и Urotest АВ фирмы Merck представлены в табл. 12.
Таблица 12
Сравнительные исследования чувствительности
созданной среды для определения АБС в моче и Urotest АВ Merck
Концентрация бензилпенициллина в моче (ЕД/мл) | Оценка изменения окраски среды | |
Созданная среда | Urotest АВ | |
64,0 | - | - |
32,0 | - | - |
16,0 | - | + |
8,0 | - | + |
4,0 | + | + |
2,0 | + | + |
1,0 | + | + |
0,5 | + | + |
Контрольные пробы без антибиотика | + | + |
Обозначения: л+ - изменение окраски среды - отсутствие антибиотика
л- - отсутствие изменения окраски среды - наличие антибиотика.
Из данных табл. 12 видно, что разработанная среда обладала высокой чувствительностью, выявляла низкие концентрации антибиотика в моче (8,0 ед/мл), в то время как Urotest АВ позволял регистрировать только высокие концентрации антибиотика (32,0 ед/мл).
Созданная среда удобна при рутинных исследованиях в клинической практике, поскольку не требует особых условий проведения теста. Использование данной среды будет способствовать улучшению бактериологических исследований при диагностике уроинфекций. На разработанную среду составлена НД. Разработка защищена патентом РФ №2164946.
Разработка питательных сред для накопления и выделения гемокультур
В настоящее время для выделения гемокультур сальмонелл используют среды лабораторного приготовления, которые не могут быть стандартными. Для устранения этого недостатка необходимо использовать коммерческие сухие питательные среды.
При разработке сухой среды для накопления и выделения гемокультур сальмонелл в качестве исходной использована рецептура среды Рапопорта, содержащая в качестве питательной основы мясопептонный бульон или бульон Хоттингера. Однако в виду того, что они не выпускаются в виде сухих препаратов, были испытаны коммерческие препараты - сухой питательный бульон и панкреатический гидролизат казеина. Исследования показали, что сухой питательный бульон по накопительному эффекту превосходил бульон Хоттингера и мясопептонный бульон в 2,0-2,5 раза, а панкреатический гидролизат казеина - более чем в 10 раз (р<0,05). Исходя из полученных данных, при разработке сухой среды в качестве основы использовали сухой питательный бульон.
Одним из важных компонентов питательной среды для выделения гемокультур сальмонелл является желчь, которая подавляет бактерицидные свойства крови и препятствует ее свертыванию, тем самым, создавая благоприятные условия для размножения брюшнотифозных и паратифозных бактерий (С.А.Блинкин,1963). В разрабатываемой среде мы заменили нативную желчь эквивалентным количеством сухой желчи (1,0-1,2%). Установлено, что образцы сред с сухой желчью по накопительному эффекту в отношении сальмонелл не отличались от сред, приготовленных с использованием нативной желчи. Так, показатель эффективности на среде, содержащей питательный бульон и сухую желчь, составлял при посеве тест-штаммов S. enterica Typhi H901 - 10,21,2105, S. enterica Paratyphi A 525 - 11,51,3105, S. enterica Paratyphi B 506 - 12,0105, на среде с нативной желчью, соответственно - 9,91,4105, 11,21,4105, 12,21,5105.
Для обеспечения в среде четких дифференцирующих свойств, определяемых по изменению ее окраски и газообразованию в процессе роста тест-штаммов, проведены исследования по изучению влияния различных индикаторов и углеводов на дифференциацию сальмонелл.
Установлено, что образцы сред с маннитом (2%) и феноловым красным (0,004%) по сравнению с образцами, содержащими глюкозу (2%) и тот же индикатор, обладали более четкими дифференцирующими свойствами по признаку кислотообразования и по интенсивности газообразования, что объяснялось большим количеством кислых продуктов, образующихся при ферментации маннита. Так, при наличии глюкозы рН среды после инкубации посевов в течение 18-20 ч составлял 6,3-6,5, а при внесении маннита - 5,5-5,8, что и обеспечивало более четкий переход окраски из красной в желтую.
На основании проведенных исследований определен оптимальный состав сухой среды для накопления, выделения и дифференциации гемокультур сальмонелл, содержащей в г/л: сухой питательный бульон-15,0, агар-1,5, желчь сухая-12,0, маннит-20,0, феноловый красный-0,04, натрий углекислый-0,3.
Характеристика биологических свойств разработанной среды, свидетельствовала (табл. 13), что она обладала значительным накопительным эффектом и по данному показателю превосходила жидкую среду Рапопорта в 2,5-3,0 раза (р<0,05).
Полученные результаты подтверждены в модельных опытах при посеве крови, предварительно зараженной тест-штаммами сальмонелл.
Таким образом, разработанная среда благодаря высокому накопительному эффекту делает возможным выявление сальмонелл при минимальном содержании их в крови, а также позволяет одновременно с обнаружением культур провести их дифференциацию по тесту газообразования.
Таблица 13
Сравнительная характеристика биологических свойств разработанной среды для накопления и выделения гемокультур сальмонелл при посеве тест-штаммов из разведений 10-7
Тест-штаммы | Разработанная среда | Среда Рапопорта | ||||
показатель эффектив-ности (Mm) | газообразо-вание | кислото-образование (изменение цвета среды) | эффектив-ность (Mm) | газообразо-вание | кислото-образование (изменение цвета среды) | |
S. enterica Typhi Н901 | 14,41,4105 | - | + | 5,21,2105 | - | + |
S. enterica Paratyphi А525 | 17,01,5105 | + | + | 5,61,5105 | + | + |
S. enterica Paratyphi В506 | 18,01,5105 | + | + | 7,01,2105 | + | + |
Обозначения: (-) - отсутствие газа
(+) - наличие газа или изменение цвета среды
Использование сконструированной сухой среды в клинической практике будет способствовать повышению эффективности диагностики тифо-паратифозной инфекции, позволит стандартизировать метод выделения гемокультур сальмонелл и получать сравнимые результаты в различных лабораториях страны. Разработка защищена патентом РФ №2175671.
Микробиологические исследования крови являются обязательными при подозрении на возможность развития бактериемии и сепсиса. Эффективность этих исследований во многом зависит от качества питательных сред.
Ранее нами совместно с В.Г.Гореловой (2005; патент №2265654; патент №2267537) разработаны готовые к употреблению питательные среды для накопления и выделения гемокультуры, содержащие в качестве инактиватора сульфаниламидных препаратов пара-аминобензойную кислоту.
В настоящее время, одним из препаратов выбора при этиотропной терапии бактериемии и сепсиса являются бета-лактамные антибиотики (В.С.Савельев, Б.Р.Гельфанд, 2006; В.А.Руднов, С.Н.Ложкин, Ф.С.Галеев и др., 2003). Поэтому для устранения антимикробного действия бета-лактамных антибиотиков, которые могут присутствовать в крови при проведении антибактериальной терапии, среды для гемокультур должны содержать специфические инактиваторы, нейтрализующие антибактериальное действие указанных препаратов.
В качестве инактиватора бета-лактамных антибиотиков использовали бета-лактамазу (Penicillinase, Cephalosporinase) производства фирмы Sigma (Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук, 2002-2003).
Для установления ее оптимальной инактивирующей концентрации исходили из данных литературы о содержании бета-лактамных антибиотиков в крови после введения препаратов (П.Р.Марри, И.Р.Шей, 2006).
В разработанную среду для накопления и выделения гемокультур (патент №2265654) вводили бета-лактамные антибиотики в максимальных концентрациях, согласно данным вышеуказанных авторов, и бета-лактамазу в диапазоне от 0,003 до 0,015 г/л среды.
Установлено, что фермент в концентрации 0,015 г/л полностью инактивировал в среде 160 ед/мл цефоперазона, 185 ед/мл цефазолина, 70 ед/мл цефтазидима, 45 ед/мл цефотаксима, что выражалось в наличии визуально видимого роста тест-штаммов E.coli3912/41, K.pneumoniae 51, P.mirabilis 71/2, S.aureus FDA 209 P, S.epidermidis 14990, S.pyogenes Dick 1. На контрольной среде, содержащей только антибиотики, рост указанных тест-штаммов не наблюдался.
На основании полученных данных в состав известной среды для накопления и выделения гемокультур дополнительно была введена бета-лактамаза в концентрации 0,015 г/л.
В табл. 14 представлены сравнительные данные по чувствительности и эффективности среды с бета-лактамазой и контрольных сред в отношении основных возбудителей бактериемии и сепсиса.
По чувствительности и эффективности новая среда не уступала контрольной и превосходила триптиказо-соевый бульон, рекомендованный ВОЗ для выделения гемокультуры (J.Vanderpitte, K.Engback, P.Piot, 1994).
Особенно высокий показатель эффективности среды отмечен в отношении условно патогенных микроорганизмов (E. coli 3912/41, S. aureus FDA 209P, K.pneumoniae 51, S.epidermidis ATCC 14990, E.faecalis 775, P.aeruginosa 27/99), являющихся основными возбудителями бактериемии и сепсиса.
Полученные показатели по эффективности среды подтверждены в модельных опытах при посеве крови, предварительно зараженной тест-штаммами E.coli 3912/41, K.pneumoniae 51, S.aureus FDA 209 P, S.pyogenes Dick 1, S.epidermidis 14990, E.faecalis 775.
Таблица 14
Сравнительные данные по чувствительности и эффективности разработанной среды, содержащий бета-лактамазу и контрольных сред через 18-20 ч культивирования при 370С
Наименование тест-штаммов | Показатель чувствительности | Показатель эффективности | ||||
разработанная среда, содержащая бета-лактамазу | контрольная среда по патенту №2265654 | контрольная среда-триптиказо-соевый бульон фирмы Merck | разработанная среда, содержащая бета-лактамазу | контрольная среда по патенту №2265654 | контрольная среда-триптиказо-соевый бульон фирмы Merck (Mm) | |
S.pyogenes Dick1 | 10-6 | 10-6 | 10-5 | 8,91,5105 | 7,61,4105 | 4,50,8105 |
S.aureus FDA 209 P | 10-7 | 10-7 | 10-6 | 16,22,0105 | 15,82,0105 | 8,21,2105 |
S.epidermidis АТСС 14990 | 10-7 | 10-7 | 10-6 | 18,52,5105 | 18,72,9105 | 9,51,5105 |
S. enterica Typhi H901 | 10-7 | 10-7 | 10-6 | 28,62,5105 | 27,53,0105 | 15,01,8105 |
S.pneumoniae LD | 10-5 | 10-5 | 10-4 | 7,81,5105 | 8,21,6105 | 4,01,2105 |
S.pyogenes 1512 | 10-5 | 10-5 | 10-4 | 7,941,5105 | 7,51,6105 | 4,01,0105 |
E.faecalis 775 | 10-6 | 10-6 | 10-6 | 14,81,5105 | 15,71,2105 | 7,01,2105 |
P.vulgaris Hx19222 | 10-7 | 10-7 | 10-6 | 29,52,5105 | 27,02,0105 | 14,02,5105 |
P.mirabilis 71\2 | 10-7 | 10-7 | 10-6 | 28,12,8105 | 27,23,0105 | 14,52,0105 |
K.pneumoniae 51 | 10-7 | 10-7 | 10-6 | 11,81,4105 | 12,81,5105 | 6,21,2105 |
P.aeruginosa 27\99 | 10-7 | 10-7 | 10-6 | 13,81,4105 | 14,11,2105 | 7,21,2105 |
S.aureus АТСС 25923 | 10-7 | 10-7 | 10-6 | 25,02,4105 | 24,11,5105 | 12,52,0105 |
S.aureus Wood 46 | 10-7 | 10-7 | 10-6 | 24,52,2105 | 25,42,0105 | 13,02,2105 |
S. enterica Typhimurium 79 | 10-7 | 10-7 | 10-6 | 29,82,2105 | 28,72,0105 | 15,02,5105 |
S.marcescens 1 | 10-6 | 10-6 | 10-6 | 14,01,5105 | 14,51,8105 | 7,51,8105 |
E.coli 3912\41(O55:К59) | 10-7 | 10-7 | 10-7 | 29,52,2105 | 27,82,5105 | 15,02,5105 |
C.albicans 885\653 | 10-6 | 10-6 | 10-5 | 17,82,0105 | 18,02,0105 | 9,01,5105 |
Схема выделения гемокультур предусматривает высев из среды обогащения на соответствующие плотные питательные среды.
Для этого чаще всего используют питательный агар. За рубежом субкультивированияе гемокультур проводят на кровяном агаре на основе Columbia agar.
В РФ не выпускают среду, аналогичную Columbia agar. Поэтому нами проведены исследования по получению среды - аналога Columbia agar.
Одним из компонентов Columbia agar является гидролизат сердечной мышцы крупного рогатого скота. Для получения панкреатического гидролизата сердечной мышцы использовали рекомендации ряда авторов по получению ферментативных гидролизатов из животного сырья (Б.И. Антонов, 1986; А.Д. Неклюдов, А.В. Бердутина, А.Н. Иванкин, 2002; Л.Я. Телишевская, 2000). При этом подобраны оптимальные соотношения компонентов гидролизуемой смеси, обеспечивающие в течение 4,0-5,0 ч гидролиза содержание аминного азота - 0,530,05%, общего азота - 0,950,08%, пептонов - 1,80,2%, степень расщепления белка - 55,70,3%.
Учитывая наличие в Columbia agar специальной смеси пептонов (Polypepton, Biosat), взамен указанных компонентов, в состав разрабатываемой среды включили панкреатический гидролизат казеина, питательный бульон и экстракт кормовых дрожжей, которые выпускаются отечественной промышленностью как коммерческие.
Комплекс биологических испытаний различных образцов среды, включающий посев тест-штаммов S.pyogenes 1512, S.pyogenes Dick 1, S.pneumoniae LD, рекомендованных для контроля Columbia agar, позволил определить ее оптимальный состав, включающий в г/л: панкреатический гидролизат казеина - 12,0, сухой питательный бульон - 5,0, панкреатический гидролизат сердечной мышцы - 3,0, экстракт кормовых дрожжей - 3,0, крахмал - 1,0, хлористый натрий - 3,0, агар - 10,0-11,0.
В табл. 15 представлена сравнительная характеристика роста тест-штаммов на разработанной среде, на Columbia agar и питательном агаре. Предлагаемая среда по чувствительности, количеству и размеру колоний высокотребовательных тест-штаммов S.pyogenes Dick 1, S.pyogenes 1512, S.pneumoniae LD не уступала Columbia agar фирмы Merck и превосходила питательный агар (р<0,05).
Учитывая, что Columbia agar рекомендуется в качестве основы кровяного агара, проведены биологические исследования разработанной основы на модели указанной среды. Установлено, что кровяной агар на основе разработанной среды по количеству и размеру колоний контрольных тест-штаммов не уступал кровяному агару на основе Columbia agar и обеспечивал проявление β-гемолиза тест-штаммами S. pyogenes Dick 1, S. pyogenes 1512 и -гемолиза у S.pneumoniae LD и S. viridans 22.
Таким образом, разработанная среда обеспечивала рост высокотребовательных микроорганизмов, что позволяет рекомендовать ее для субкультивирования гемокультур.
Таблица 15
Сравнительная характеристика роста тест-штаммов из разведений 10-6
на разработанной среде, Columbia agar и питательном агаре
Тест-штаммы | Рост тест-штаммов на предлагаемой среде (Mm) | Рост тест-штаммов на Columbia agar фирмы Merck (Mm) | Рост тест-штаммов на питательном агаре (Mm) |
КОЕ и размер (d) колоний | КОЕ и размер (d) колоний | КОЕ и размер (d) колоний | |
S. pyogenes Dick 1 | 14,02,0 d-1,00,1 | 16,02,0 d-1,00,1 | 5,01,0 точечные |
S. pyogenes 1512 | 22,03,0 d-1,00,1 | 24,04,0 d-1,00,1 | 6,01,0 точечные |
S. pneumoniae LD | 22,02,0 d-0,80,1 | 26,03,0 d-0,80,1 | нет роста |
S. viridans 22 | 24,02,0 d-1,20,1 | 22,02,0 d-1,20,1 | 20,02,0 d-1,20,1 |
S. aureus Wood-46 | 36,03,0 d-2,00,15 | 32,03,0 d-2,00,2 | 29,02,0 d-1,60,2 |
Разработка сухой селективной среды для выделения B. cereus
Практические лаборатории РФ для диагностики инфекций, вызываемых B.cereus используют среды лабораторного приготовления, которые обладают слабыми селективными свойствами в отношении микробов-ассоциантов.
Исходя из вышеизложенного, была поставлена задача - разработать селективную среду для выделения B.cereus, способную ингибировать рост сопутствующих грамотрицательных и грамположительных микробов и подавлять роение протеев.
В качестве питательной основы использовали сухой питательный агар.
Для выделения B.cereus из клинического материала и продуктов питания, которые могут содержать большое количество микробов-ассоциантов (S.aureus, E.coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Bacillus spp.), необходимо наличие в среде селективных компонентов.
Исходя из литературных данных об ингибирующем действии солей лития на рост грамотрицательных бактерий и лимоннокислого натрия на рост грамположительных бактерий (Р.С.Джалилова, 1987; Van Netten, 1989), эти соли были введены в состав разрабатываемой среды. Установлено, что сернокислый литий в концентрации 0,5% полностью подавлял рост E.coli 3912/41 и K.pneumoniae 4140 из разведения 10-3, а лимоннокислый натрий в такой же концентрации ингибировал рост S.aureus FDA 209 Р, В.subtilis 6051, B.megaterium 89, B. mycoides 587 из разведений 10-3, не влияя на рост B.cereus. Меньшие концентрации солей не оказывали необходимого ингибирующего эффекта на их рост, а более высокие - подавляли рост B.cereus. Однако данные соли не подавляли роение протеев, и в случае их наличия в клиническом материале выделение B.cereus в чистой культуре не представлялось возможным. Основываясь на литературных данных о подавлении роения протеев с помощью некоторых сульфаниламидных препаратов (Smith B.A., Baird-Parker A.C., 1964), были проведены исследования по изучению влияния сульфадимизина и сульфадиметоксина на рост B.cereus и на их способность подавлять роение протеев. Установлено, что указанные препараты в концентрациях 0,004-0,005% полностью подавляли роение протеев и не оказывали существенного влияния на рост тест-штаммов B.cereus. Отмечено лишь незначительное снижение диаметра колоний. Более низкие концентрации препаратов роение протеев не подавляли, а более высокие ингибировали рост B.cereus.
Одним из основных дифференцирующих признаков при идентификации B.cereus является проявление ее лецитиназной активности (З.М.Андреева, М.Н.Лебедева, 1986; Ю.В.Езепчук, Ф.С.Флуер, 1971). Продукция фермента, имеющего таксономическое значение, изучается на средах с добавлением желточной эмульсии. Под действием фосфолипазы-С B.cereus происходит расщепление лецитина яичного желтка с образованием жирных кислот и щелочного продукта фосфохолина (Г.Б.Герасимене, А.А.Глемжа, 1980). Для определения изменения рН среды, происшедшего в результате ферментативного расщепления лецитина, в состав среды введен индикатор бромкрезоловый пурпуровый в общепринятой концентрации (0,004%).
Результаты исследований показали, что все испытанные тест-штаммы B.cereus образовывали круглые матовые колонии d-2,0-2,4 мм, окруженные зоной коагулята (d-3,0-4,0 мм) светло-фиолетового цвета, что свидетельствовало о проявлении лецитиназной активности.
На основании проведенных исследований составлена рецептура среды для выделения B.cereus, включающая следующие компоненты в (г/л): питательный агар - 35,0, натрий лимоннокислый - 5,0, литий сернокислый - 5,0, сульфадимезин или сульфадиметоксин - 0,05, бромкрезоловый пурпуровый - 0,04.
В табл. 16 представлена сравнительная характеристика роста тест-штаммов B.cereus и микробов-ассоциантов на разработанной среде и среде Пивоварова (контроль).
Из табл. 16 видно, что полученная среда имеет существенное преимущество по сравнению с контрольной средой, она подавляет рост не только грамотрицательных микробов-ассоциантов, но и грамположительных: B.polymyxa 26, S.aureus FDA 209P, В.subtilis 6051, B.megaterium 89, B.mycoides 587. На контрольной среде рост данных микробов-ассоциантов не подавлялся. Кроме того, учет результатов посевов на предлагаемой среде можно проводить уже через 18-20 ч, а на контрольной не менее чем через 48 ч.
Таким образом, разработанная среда, благодаря своим высоким селективным свойствам обеспечивает выделение B.cereus в чистой культуре в сравнительно короткие сроки.
Внедрение данной среды в практику позволит улучшить бактериологическую диагностику пищевых отравлений, вызываемых B.cereus. На среду составлена НД. Разработка защищена патентом РФ №2201965.
Таблица 16
Сравнительная характеристика роста тест-штаммов B.cereus и микробов-ассоциантов
на разработанной среде и среде Пивоварова (контроль)
Тест-штаммы | Посевная доза | КОЕ на разработанной среде (Мm) | КОЕ на контрольной среде Пивоварова (Мm) | Наличие зон лецитиназной активности | |
На разработанной среде | На контрольной среде | ||||
B.cereus 2010 | 10-6 | 32,04,0 | 28,03,0 | + | + |
B.cereus 8035 | 10-6 | 30,03,4 | 35,03,0 | + | + |
B.cereus 2527 | 10-6 | 35,04,5 | 36,05,0 | + | + |
В.subtilis АТСС 6051 | 10-3 | нет роста | сплошной рост | - | - |
B.megaterium 89 | 10-3 | нет роста | сплошной рост | - | - |
B.mycoides 587 | 10-3 | нет роста | сплошной рост | - | - |
B. polymyxa 26 | 10-3 | нет роста | сплошной рост | - | - |
E.coli 3912/41 | 10-3 | нет роста | нет роста | - | - |
K.pneumoniae 4140 | 10-3 | нет роста | нет роста | - | - |
S.aureus FDA 209-Р | 10-3 | нет роста | сплошной рост | - | + |
S.aureus Wood-46 | 10-3 | нет роста | сплошной рост | - | + |
S.aureus ATCC 25923 | 10-3 | нет роста | сплошной рост | - | + |
E.faecalis 775 | 10-3 | нет роста | сплошной рост | - | - |
P.vulgaris HX19 | 10-5 | 50,03,0 (О-форма) | 48,03,0 (О-форма) | - | - |
P.mirabilis 71/2 | 10-5 | 48,04,0 (О-форма) | 42,04,0 (О-форма) | - | - |
Примечание: на контрольной среде учет результатов посевов проводили через 36-48 ч, так как через 18-20 ч рост B.cereus отсутствовал
ВЫВОДЫ
1. Выявлены альтернативные источники белкового сырья для получения питательных основ, позволяющие осуществить замену одних видов сырья другими без изменения конечных характеристик препаратов и условий их производства на всех стадиях технологического процесса.
2. Экспериментально обоснована и впервые разработана технология получения сухого ферментативного пептона из рыбного сырья, который по физико-химическим и биологическим свойствам не уступает аналогичным препаратам ведущих зарубежных фирм.
3. Разработана технология получения сухого ферментативного гидролизата сои, содержащего комплекс питательных веществ в виде аминокислот, пептонов, углеводов, позволяющих выявлять рост различных микроорганизмов при минимальной посевной дозе.
4. Предложены новые технологические решения получения компонентов питательных сред: желточной эмульсии, готовой к употреблению, с длительным сроком хранения и экстракта кормовых дрожжей с высокой степенью прозрачности.
5. Создана сухая электролит-дефицитная питательная основа из рыбного сырья и научно обоснована целесообразность ее использования в составе сред для подавления роения протея.
6. На электролит-дефицитной питательной основе разработаны новые сухие питательные среды: электролит-дефицитный питательный агар для выделения, дифференциации и количественного определения бактерий в моче; электролит-дефицитный кристаллвиолет сорбитол агар для выделения и дифференциации E. coli O157:H7 и других энтеробактерий по признаку ферментации сорбита; электролит-дефицитный агар с эозин-метиленовым синим для выделения и дифференциации энтеробактерий.
7. Сконструирована сухая селективная среда для выделения и дифференциации энтеробактерий, применение которой совместно с электролит-дефицитным питательным агаром при бактериологическом анализе позволяет ускорить идентификацию микроорганизмов в моче.
8. Разработана новая сухая питательная среда для определения антибактериальных субстанций в моче, обладающая высокой чувствительностью и способная регистрировать низкие концентрации антибактериальных препаратов в моче.
9. Экспериментально обоснованы и разработаны новые питательны среды для накопления и выделения гемокультур, обладающие высокой чувствительностью и значительным накопительным эффектом в отношении основных возбудителей бактериемии и сепсиса, что позволяет выделить гемокультуру при минимальном содержании возбудителя в крови.
10. Создана новая селективная питательная среда для выделения B.cereus. Среда полностью ингибирует рост микробов-ассоциантов, что способствует выделению B. cereus в чистой культуре.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Джалилова Р.С., Кириленко О.А., Султанов З.З.. Сухая питательная среда для определения лецитиназной активности B.cereus //Лабораторное дело. Ц1985. - №2. - С. 117-119.
2. Султанов З.З., Кириленко О.А., Джалилова Р.С.. Питательная среда для выделения B.cereus. Авт.свид. №1277613.
3. Меджидов М.М., Султанов З.З.. Использование непищевого сырья в производстве микробиологических питательных сред. Махачкала, - 1986, 71 с.
4. Кириленко О.А., Джалилова Р.С., Султанов З.З., Правниченко Л.И.. Выделение B.cereus из консервов пищевых концентратов на сухих питательных средах. //Ж. Пищевая промышленность. - 1988. - №5. - С. 33-35.
5. Султанов З.З., Джалилова Р.С., Кириленко О.А.. Сухой селективный агар для выделения B.cereus. //Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционной клинике. Тезисы докладов II Всесоюзной конференции. Барнаул, 1988. Ч. I, 21-22 июля. - С. 20.
6. Султанов З.З., Джалилова Р.С.. Технология получения сухой питательной среды для определения лецитиназной активности B.cereus. //Тезисы конференции Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии. Махачкала, 1988. Ч. I. - С. 91-92.
7. Меджидов М.М., Султанов З.З., Костенко Л.С., Смирнова Е.А., Сулименко И.М.. Использование концентрата кормового лизина в получении питательных сред. //Журн. Микробиол. - 1988. - №7. - С. 103.
8. Рогожин С.В., Вайнерман В.Е., Гамзазаде А.И., Быков В.П., Быкова В.М., Немцев С.В., Меджидов М.М., Султанов З.З., Степанова Э.Д., Мамцис А.М.. Способ переработки панцирьсодержащих отходов ракообразных. Авт.свид. №1587678. Для служебного пользования.
9. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Меджидов М.М., Кулакова Л.С., Какулина Е.А., Эпштейн Л.М., Жданюк В.М., Пивненко Т.Н.. Отходы переработки гидробионтов в производстве сухих питательных сред. //Материалы Всесоюзного совещания. Биологически активные вещества гидробионтов - новые лекарственные, лечебно-профилактические и технические препараты. Владивосток, - 1991. - С. 13-14.
10. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Кулакова Л.С.. Производство микробиологических сред из отходов промышленности. //Ж. Рыбное хозяйство. - 1991. - №6. - С. 74-75.
11. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Какулина Е.А., Перепелица Л.Г.. Сухие питательные среды для диагностики уроинфекций. //Материалы VII Всероссийского общества эпидемиологов и паразитологов. М., 1997. Т. I. - С. 502-503.
12. Султанов З.З.. Средство для подавления роения бактерий рода протея. Патент №2145352. Бюлл.. Изоб. полезные модели. М., 2000, - №4 (2 ч). - С.412.
13. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Какулина Е.А., Кулакова Л.С., Перепелица Л.Г., Рамазанова Н.Р.. Разработка комплекса питательных сред для бактериологического исследования мочи. //Разработка и производство диагностических питательных сред и микротестсистем. Материалы Международной научно-практической конференции. Махачкала, - 1998. - С. 56-57.
14. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Гриднева Н.И., Какулина Е.А.. Бактериологическая диагностика эшехириозов, вызываемых энтерогеморрагическим штаммом Escherichia coli O157:H7. //Тезисы докладов VI Российского конгресса Человек и лекарство. М., 1999. - С. 334.
15. Меджидов М.М., Гриднева Н.И., Султанов З.З.. Справочник по микробиологическим питательным средам и микротестсистемам. Махачкала, 1999. - 98 с.
16. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Какулина Е.А.. Селективная питательная среда для выделения клинических штаммов E.coli O157:H7. //Журн. Микробиол., - 2000. - №1. - С. 48-50.
17. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Какулина Е.А.. Питательная среда для выделения и предварительной идентификации E.coli O157:H7. Патент №2157837. Бюлл. Изоб. полезные модели. М., 2000, - №19 (1 ч). - С.103.
18. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Какулина Е.А.. Питательная среда для выделения гемокультур при диагностике брюшного тифа и паратифов. Патент №2175671. Бюлл. Изоб. полезные модели. М., 2001, - №31 (2 ч). - С.345.
19. Султанов З.З., Кулакова Л.С., Перепелица Л.Г.. Тест-система для определения антибактериальных субстанций в моче. Патент №2164946. Бюлл. Изоб. полезные модели. М., 2001, - №10 (2 ч). - С.245.
20. Султанов З.З., Кулакова Л.С., Перепелица Л.Г., Абдулганиева С.К.. Тест-бульон для определения антибактериальных субстанций в моче. //Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем. Материалы 3-й Международной научно-практической конференции. Махачкала. - 2001. - С. 72-73.
21. Султанов З.З., Кулакова Л.С., Перепелица Л.Г., Абдулганиева С.К.. Способ получения желточной эмульсии для определения лецитиназной активности микроорганизмов. Патент №2203958. Бюлл. Изоб. полезные модели. М., 2003, - №13 (2 ч). - С.370.
22. Султанов З.З., Кулакова Л.С., Какулина Е.А.. Разработка и использование электролит-дефицитной питательной основы в производстве сухих питательных сред. //Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем. Материалы 3-й Международной научно-практической конференции. Махачкала. - 2001. - С. 10-12.
23. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Какулина Е.А.. Питательная среда для выделения и предварительной дифференциации гемокультур сальмонелл. //Материалы VIII съезда всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002. - Т.3.Ц С. 341.
24. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Какулина Е.А.. Питательная среда для выделения патогенных энтеробактерий. Патент №2179582. Бюлл. Опуб. Изоб. полезные модели. М., 2002, - №5 (1 ч). - С.193-194.
25. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Кулакова Л.С., Горелова В.Г.. Двухфазная питательная среда для накопления и выделения гемокультуры. //Материалы 4-ой Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию НПО Питательные среды МЗ РФ. Махачкала, 2003. - С. 30-32.
26. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Алиев А.З., Какулина Е.А., Перепелица Л.Г., Рамазанова Н.Р.. Разработка технологии получения сухого пептона из рыбного сырья. //Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем. Материалы 4-ой Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию НПО Питательные среды МЗ РФ. Махачкала, 2003. - С. 38-39.
27. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Какулина Е.А.. Повышение эффективности диагностики кишечных инфекций с помощью модифицированной среды Левина. //Материалы республиканской научно-практической конференции Новые технологии в медицине. Махачкала, 2003. - С. 349-350.
28. Султанов З.З., Алиев А.З., Какулина Е.А., Перепелица Л.Г.. Основные технологические аспекты производства гидролизатов сои. //Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем. Материалы 4-ой Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию НПО Питательные среды МЗ РФ. Махачкала, 2003. - С. 40-41.
29. Султанов З.З., Кулакова Л.С., Перепелица Л.Г., Абдулганиева С.К.. Питательная среда для выделения Bacillus cereus. Патент №2201965. Бюлл. Изоб. полезные модели. М.,- 2003, - №10 (2 ч). - С.402-403.
30. Султанов З.З., Меджидов М.М., Степанова Э.Д., Какулина Е.А., Горелова В.Г.. Повышение эффективности диагностики брюшного тифа и паратифов с помощью новой сухой питательной среды для выделения и предварительной дифференциации гемокультур сальмонелл. //Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке. Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 105-летию Пермского НПО Биомед. Пермь, - 2003. - С. 187-189.
31. Султанов З.З., Кулакова Л.С., Абдулганиева С.К., Перепелица Л.Г.. Усовершенствование бактериологической диагностики B.cereus. //Международный конгресс. Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы. Санкт-Петербург, - 2003. - С. 180.
32. Султанов З.З., Меджидов М.М., Степанова Э.Д., Кулакова Л.С., Горелова В.Г.. Совершенствование лабораторной диагностики бактериемии и сепсиса. //Международный конгресс. Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы. Санкт-Петербург, - 2003. - С. 180.
33. Султанов З.З., Кулакова Л.С., Перепелица Л.Г., Абдулганиева С.К.. Селективная среда для выделения B.cereus. //Журн. Микробиол. - 2004. - №4. - С. 74-76.
34. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Меджидов М.М., Горелова В.Г.. Сравнительная характеристика питательных сред для накопления и выделения гемокультур. //Материалы Всероссийской научной конференции Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов. Томск, - 2004. - С. 233-236.
35. Омарова Э.Б., Меджидов М.М., Султанов З.З.. Способ получения стимулятора роста микроорганизмов из кормовых дрожжей. Патент №2227153. Бюлл. Изоб. полезные модели. М., 2004, - №11 (3 ч). - С.516.
36. Меджидов М.М., Султанов З.З., Степанова Э.Д.. Способ получения питательной основы микробиологических питательных сред. Патент №2232187. Бюлл. Изоб. полезные модели. М., 2004, - №19 (3 ч). - С.477.
37. Султанов З.З., Меджидов М.М., Алиев А.З., Какулина Е.А., Степанова Э.Д.. Способ получения пептона Каспий. Патент №2235770. Бюлл. Изоб. полезные модели. М., 2004, - №25 (3 ч). - С.453-454.
38. Султанов З.З., Меджидов М.М., Степанова Э.Д., Кулакова Л.С., Горелова В.Г., Абдулганиева С.К.. Питательная среда для выделения гемокультур. Патент №2265654. Бюлл. Изоб. полезные модели. М., 2004, - №11 (3 ч). - С.516.
39. Султанов З.З., Меджидов М.М., Алиев А.З., Какулина Е.А., Перепелица Л.Г., Рамазанова Н.Р., Султанова Э.И.. //Разработка технологии получения гидролизата сои. Материалы третьего съезда общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова. М., - 2005. - С. 157-158.
40. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Кулакова Л.С., Рамазанова Н.Р.. Разработка и экспериментальное изучение основы питательной среды для культивирования фастидиозных микроорганизмов. //Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение. Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня основания филиала ФГУП НПО Микроген МЗ и СР РФ Иммунопрепарат. Уфа, - 2005, часть I, - С. 106-108.
41. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Кулакова Л.С., Горелова В.Г., Рамазанова Н.Р., Гаджиева С.М.. Разработка и оценка диагностической ценности питательной среды для накопления и выделения гемокультуры. //Журн. микробиол. - 2005. - №3. - С. 19-22.
42. Горелова В.Г., Меджидов М.М., Омарова С.М., Султанов З.З., Степанова Э.Д.. Клинические испытания опытного образца коммерческой двухфазной среды для выделения гемокультуры. //Ж. Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. - №2. - С. 38-40.
43. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Меджидов Ш.М., Кулакова Л.С., Горелова В.Г.. Питательная среда для микробиологического исследования крови. Патент №2267537. Бюлл. Опуб. Изоб. полезные модели. М., 2004, - №36 (3 ч). - С.497.
44. Меджидов М.М., Степанова Э.Д., Султанов З.З., Омарова С.М., Горелова В.Г., Кулакова Л.С., Какулина Е.А.. Новые питательные среды в бактериологической диагностике бактериемии и сепсиса. //Тезисы Всероссийской научно-практической конференции Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических препаратов, средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней. М., - 2006. - С. 64.
45. Султанов З.З., Степанова Э.Д., Кулакова Л.С., Какулина Е.А., Перепелица Л.Г., Рамазанова Н.Р.. Электролит-дефицитная питательная среда для лабораторной диагностики острых эшерихиозов, вызываемых тест-штаммом E.coli O157:H7. //Острые кишечные инфекции: актуальные вопросы в клинике и эксперименте. Материалы юбилейной Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 70-летию кафедры инфекционных болезней им. академика Г.П.Руднева. Махачкала, - 2006. - С. 134-135.
46. Султанов З.З.. Основные технологические аспекты получения микробиологических питательных сред. //Материалы I Всероссийской конференции Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты. Пущино, - 2007. - С. 26-27.
47. Султанов З.З., Меджидов Ш.М., Меджидов М.М., Какулина Е.А.. Способ получения гидролизата сои. Патент №2295249. Бюлл. Изоб. полезные модели. М., 2007. - №8 (2 ч) - С. 885.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии