Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по техническим специальностям
На правах рукописи
КАНОЧКИНА МАРИЯ СЕРГЕЕВНА
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ АКТИВНЫХ ПОЛИМИКРОБНЫХ ПОСЕВНЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ДРОЖЖЕ-БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПРОДУКТОВ
Специальность: 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук
Москва - 2012
Работа выполнена на кафедре УБиотехнологияФ ФГБОУ ВПО Московский государственный университет пищевых производств
Научный консультант: доктор технических наук, профессор Борисенко Евгений Георгиевич
Официальные оппоненты: Тулякова Татьяна Владимировна доктор технических наук, ФГБОУ ВПО Московский государственный университет пищевых производств, профессор кафедры Управление качеством и безопасностью пищевых продуктов и производств Тихомирова Ольга Ильинична кандидат технических наук, доцент, ЗАО СЖС Восток Лимитед, менеджер по развитию направления обучения по России
Ведущая организация: ФГУ Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А.Тимирязева
Защита состоится: л __ мая 2012 г. в ____ ч. в ауд. 302 на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.04 при ФГБОУ ВПО Московский государственный университет пищевых производств по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГУПП.
Отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью учреждения, просим направлять по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, ФГБОУ ВПО МГУПП.
Автореферат разослан л___ апреля 2012 г.
Ученый секретарь Совета, к.т.н., доцент Тимофеев Д.В.
1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Современное состояние промышленности и окружающей среды требует создания эффективных технологий продуктов функционального назначения, направленных на укрепление защитных функций организма человека и животных. Роль активных ингредиентов в них могут играть клетки дрожжей и лактобактерий. Дрожжевые клетки обладают лакто- и бифидогенными, а также сорбционными свойствами и при попадании в кишечник стимулируют рост собственной микрофлоры организма, выводя оттуда патогенные бактерии и их токсичные метаболиты. Кроме того, в процессе ферментации пищевых субстратов, дрожжи обогащают их различными физиологически активными веществами.
Таким образом, производство дрожжевых пребиотических препаратов и продуктов, удовлетворяющих ежедневные потребности организма в необходимых компонентах и обладающих свойством регулировать и нормализовать микробиоценозы желудочно-кишечного тракта, является перспективным и актуальным направлением.
Продукты питания, содержащие дрожжи и их метаболиты, на современном российском рынке представлены в основном кисломолочными напитками смешанного бактериально-дрожжевого брожения типа кефира, тана, катыка. Содержание дрожжевых клеток в таких продуктах не превышает уровня 104-105 кл/г. Технология подобных напитков предусматривает прямое внесение бактериальных и дрожжевых культур без использования микробных консорциумов или полимикробных посевных материалов. Другие известные напитки дрожжевого брожения (квас, пиво) представляют собой, как правило, фильтрованные продукты. В то же время значимые клинические эффекты, связанные с лечебно-профилактическим действием дрожжевых клеток, показаны только для биологически активных добавок с концентрацией - 109 кл/г.
Не менее актуальной проблемой является защита окружающей среды от отходов агропромышленных предприятий (далее АПК) (спиртзаводов, молзаводов, мукомольных предприятий и т.п.). В пищевых отраслях России образуется до 45 млн. т вторичных ресурсов и отходов в год, из которых значительная часть используется неэффективно, тем самым нанося огромный вред окружающей среде.
В связи с вышеизложенным, разработка технологии активных полимикробных посевных материалов, в том числе заквасок, на базе отходов агропромышленных предприятий для производства ферментированных напитков и других продуктов общественного питания, доступных для потребления широким слоям населения, актуальна и экономически привлекательна.
Цель и задачи исследования.
Целью диссертационной работы стала разработка технологии активных посевных материалов для производства функциональных продуктов на основе жизнеспособных клеток дрожжей и лактобактерий. В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:
- выявить наиболее перспективные штаммы дрожжей для получения активных полимикробных посевных материалов и провести подбор растительных субстратов для накопления ими биомассы;
- выбрать способ культивирования дрожжей, подобрать жидкие и твердые питательные среды для роста и накопления биомассы выделенными дрожжами на основе отходов АПК;
- получить микробные консорциумы на основе выбранных дрожжевых культур и промышленного штамма L. acidophilus La 5 и изучить процесс взаимного влияния культур;
- получить активные полимикробные посевные материалы в сухом, замороженном виде и исследовать выживаемость клеток дрожжей и лактобактерий в процессе их получения, определить физико-химические и биохимические характеристики, установить сроки и условия их хранения;
- получить жидкие полуфабрикаты на основе активных полимикробных посевных материалов и определить их характеристики и сроки хранения;
- установить возможность использования полученных натуральных, высушенных, замороженных активных посевных материалов и жидких полуфабрикатов для глубинной ферментации жидких субстратов с целью получения питьевых ферментированных продуктов питания;
- разработать рецептуры новых ферментированных продуктов на основе полученных активных полимикробных посевных материалов. Дать физико-химическую и микробиологическую характеристику новых продуктов, оценить их пищевую и биологическую ценность.
Научная новизна.
Впервые установлена возможность производства активных посевных материалов из дрожжей вида Pichia anomala на растительном сырье. Показано, что в качестве сырья для производства дрожжевых посевных материалов могут быть использованы различные виды твердого растительного сырья, как первичного, так и вторичного.
Универсальным субстратом для этих целей являются зерновые отруби. Для доведения влажности этих субстратов до оптимального уровня могут быть использованы как вода, так и различные жидкие вторичные продукты.
Наиболее рациональным признано получать активные посевные материалы методом твердофазного культивирования отселекционированных дрожжевых культур.
На различных твердых растительных субстратах констатирована способность дрожжей и лактобактерий к симбиозу без выраженного взаимного ингибирования.
Установлена возможность получения хранимых активных полимикробных посевных материалов путем высушивания и замораживания комплексных микробных культур.
Получены хранимые посевные материалы в виде жидких полуфабрикатов, установлена зависимость их физико-химических и микробиологических показателей от длительности хранения.
Результаты анализа выявленных зависимостей послужили обоснованием предложенных в работе технологий производства новых ферментированных продуктов, обогащенных биомассой дрожжей и лактобактерий, и подтверждением их функциональных свойств.
Практическая значимость результатов работы.
Из коллекции дрожжевых культур МГУПП, отобраны штаммы дрожжей, наиболее активно накапливающие биомассу при росте на первичных и вторичных сырьевых ресурсах АПК. Выявлено несколько перспективных штаммов дрожжей относящихся к роду Pichia, из них максимальную продуктивность по биомассе показал штамм Pichia anomala Р1. В результате проведенных исследований установлено, что данный штамм обладает некоторой антагонистической активностью по отношению к условнопатогенным микроорганизмам.
Показано, что в условиях твердофазного культивирования наблюдается большее накопление биомассы выбранными штаммами дрожжей, чем при глубинной ферментации.
Впервые получены активные полимикробные посевные материалы на основе дрожжей Pichia anomala Р1 и лактобактерий Lactobacillus acidophilus La 5 в натуральном, высушенном, замороженном состояниях, а также в виде жидких полуфабрикатов.
Показана возможность сушки при 40С. Разработаны технологический регламент и технические условия на сухие активные полимикробные посевные материалы. Подана заявка на патент РФ Способ получения активного полимикробного сухого посевного материала для производства продуктов функционального питания рег. №2012110630 от 21.03.2012г. Разработана технология получения активных посевных материалов.
Проведен расчет экономической эффективности разработанной технологии, который показал, что оптовая цена полученного посевного материала составляет 60 руб за 1 кг.
Определены физико-химические и биохимические характеристики полученных активных полимикробных посевных материалов. Установлены сроки и условия их хранения: 40 сут - для жидких полуфабрикатов и 100 сут - для других видов посевных материалов.
Получены новые ферментированные напитки на базе активных полимикробных посевных материалов. Дана физико-химическая и микробиологическая характеристика новых продуктов, оценена их пищевая ценность, доказано их соответствие требованиям безопасности, предъявляемым к продуктам питания. Наработаны опытные партии новых ферментированных напитков на стендовой установке ГНУ ВНИИПБТ РАСХН.
Результаты проведенной работы подтверждены актами. Проведена органолептическая оценка образцов на кафедре Технология общественного питания МГУПП.
Полученные результаты также подтверждены актами.
Апробация работы.
Основные положения работы докладывались на российских и международных конференциях и симпозиумах: Первой научно-практической конференции с международным участием УБезопасность и экология предприятий пищевой промышленности. Инновационные решения использования отходов пищевых производствФ (Москва 2009); VII международная научно - практическая конференция УТехнологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продуктыФ (Москва 2009); Первой международной научно-практической конференции УИдентификация фальсифицированных пищевых продуктов. Контроль содержания и безопасность наночастиц в продукции сельского хозяйства и пищевых продуктахФ (Москва 2009); EurasiaBio 2nd International Congress-Partnering & Exhibition on Biotchnology and Bioenergy, Moscow 2010; III межведомственной научно-практической конференции УТовароведение, экспертиза и технология продовольственных товаровФ, (Москва 2010); IX Международной научной конференции Живые системы и биологическая безопасность населения (Москва 2011).
Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликовано печатных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК, заявка на патент РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 228 источников (в том числе 68Ц на иностранных языках) и приложений. Работа изложена на 174 страницах, содержит 30 рисунков, 25 таблиц.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В обзоре литературы рассмотрены современные способы переработки растительного и животного сырья. Дана характеристика основных сырьевых ресурсов, использование которых возможно для биоконверсии в целевые продукты, оценена их перспективность. Приведены примеры использования микробной конверсии в производстве продуктов питания. Освещена роль функционального питания в качестве средства оздоровления населения. Определены основные виды заквасок и посевных материалов, используемых в биотехнологии ферментированных продуктов.
Рассмотрены функциональные свойства дрожжей и молочнокислых бактерий.
Приведены примеры их симбиотического использования в пищевой промышленности.
Анализ данных литературы выявил проблемы, существующие в данной области, и позволил сформулировать цели и задачи настоящего исследования.
3. ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Исследования проводились на кафедре Биотехнология МГУПП, в испытательном лабораторном центре Биотест МГУПП, а также в лаборатории Молекулярные основы патогенности ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России.
3.1 Материалы и методы исследований Объектом исследования были различные штаммы дрожжей рода Pichia, взятые из коллекции культур микроорганизмов кафедры Биотехнология МГУПП. В работе также применяли бактериальную закваску прямого внесения промышленного изготовления в лиофильно-высушенной форме: термофильную моноштаммовую Lactobacillus acidophilus (Chr. Hansen, Дания). В качестве контроля использовали штамм Candida famata T8, уже более 10 лет, использующийся для производства функциональных продуктов Фервитал и Фервистим.
В качестве компонентов для создания питательных сред использовалось сырье:
сенная мука ГОСТ 4808-87, отруби пшеничные ГОСТ 7169-66, сухая сыворотка ТУ 10.02.927-91, морковь ГОСТ Р 51782-2001, кукуруза и ее растительные компоненты ГОСТ 13634-90, послеспиртовая барда сухая ТУ 9182-082-00334586-2007.
Для поддержания культур лактобактерий и дрожжей, их учета и определения антагонистической активности применяли питательные среды производства ФГУП ГНЦПМ, г. Оболенск.
Глубинную ферментацию вели в качалочных колбах на круговых лабораторных качалках при 180-220 об./мин. Продолжительность ферментации - 24 - 48 ч, температура 302С. ТФФ в лабораторных условиях проводили в чашках Петри и в качалочных колбах при высоте слоя 1-3 см и влажности субстрата 50-55%. Чашки Петри или колбы помещали в термостат на 48 ч при температуре воздуха 302С и влажности 90-95%.
Титруемую кислотность определяли в соответствии с ГОСТ 3624-92, ГОСТ 27493-87, активную кислотность - потенциометрическим методом на рН-метре НАNNA рН 2Содержание общего белка проводили в соответствии с ГОСТ 23327-98, ГОСТ 10846-91, сырого протеина - по методу Несслера, Антагонистическую активность дрожжей изучали методом лунок в соответствии с МУ 2.3.2.2789-10. 2.3.2., определение подавления токсинообразования St.aureus FRI 722 дрожже-бактериальными ассоциациями проводили в ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.
Определение содержания молочнокислых микроорганизмов проводили в соответствии с ГОСТ 10444.11Ц89, дрожжей - в соответствии с ГОСТ 10444.12-Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли по программе Excel 2007 Microsoft Office, вычисляя среднее значение и стандартное отклонение для каждой величины, а также доверительный интервал при уровне значимости 95%.
3.2 Результаты исследований и их обсуждение.
3.2.1 Тестирование коллекционных дрожжевых культур МГУПП на различных субстратах С целью выявления наиболее перспективных штаммов дрожжей для получения активных полимикробных посевных материалов было проведено тестирование коллекционных дрожжевых культур МГУПП, выделенных из женского грудного молока.
Таблица Продуктивность дрожжей при твердофазной ферментации (ТФФ) на различных субстратах № Штамм Накопление биомассы дрожжевыми культурами в течение 48 ч, при п/п дрожжей температуре 30 С на различных растительных субстратах, P. anomala увлажненных водой до уровня влажности 55%, 109 кл/г на отрубях сенной муке натуральной высушенной кукурузе кукурузе 1 H1 2,44 2,76 2,68 1,2 A1 1,28 2,20 2,08 0,3 25 0,96 0,60 0,44 0,4 A2 0,44 0,08 0,52 0,5 I1 2,68 2,68 3,32 1,6 12 0,44 0,32 0,44 0,7 13 0,96 0,52 0,60 0,8 L1 1,36 0,12 0,84 0,9 9B 3,80 3,28 3,48 2,10 T1 0,40 1,04 0,32 0,11 19 3,08 3,48 2,56 2,12 11 0,44 0,28 0,32 0,13 14 1,04 1,96 1,68 1,14 Р1 5,36 4,40 4,60 3,15 8 2,84 2,32 2,68 1,16 17 0,60 1,00 1,04 0,17 9A 4,84 4,04 4,08 3,контроль C. famata 2,56 1,68 2,84 1,TВ данном исследовании (табл. 1) в качестве субстратов использовали отруби, сенную муку, растительные компоненты сельскохозяйственных культур (в основном стебли и початки кукурузы, как в натуральном виде, так и в высушенном).
В процессе тестирования были выделены несколько штаммовЦI1,9В,9а,19,Р1, превосходящие контрольный штамм C. famata(Harrison)T8 по продуктивности.
Для более детального изучения влияния состава комплексной питательной среды из растительного субстрата и увлажняющего (до уровня влажности -55%) материала на прирост дрожжевой биомассы было предложено в качестве жидкого компонента среды использовать послеспиртовую барду (П.Б.) и молочную сыворотку (М.С.) (табл. 2).
Выявлена определенная зависимость продуктивности дрожжей от добавляемого жидкого компонента питательной среды, причем для каждого растительного субстрата этот компонент свой.
Таблица Продуктивность дрожжей при ТФФ на растительных субстратах с добавлением различных увлажняющих компонентов Штамм м/о Накопление биомассы дрожжевыми культурами, 109 кл/г на отрубях с сенной муке с натуральной кукурузе высушенной кукурузе с с П.Б. М.С. вода П.Б. М.С. вода П.Б. М.С. вода П.Б. М.С. вода P.anomala Р1 3,64 5,68 4,36 5,68 5,32 4,92 4,64 5,68 5,96 3,76 3,92 3,P.anomala 9а 4,8 5,46 4,2 4,48 3,84 3,6 4,56 4,96 5,08 2,6 3,64 3,9в 3,88 4,2 3,80 3,48 3,60 3,28 3,32 3,24 3,48 2,4 2,68 2,19 2,08 2,56 3,08 3,84 3,32 3,48 2,88 3,4 2,56 1,32 1,24 2,P.guilliermondii 2,74 1,24 2,08 2,60 2,80 2,68 2,56 2,6 3,32 2,0 2,08 1,IДля дальнейших исследований были выбраны более продуктивные штаммы Pichia anomala 9а, Р1, 9в и 19. В качестве перспективного субстрата для получения активных посевных материалов пищевого назначения были выбраны отруби, увлажненные либо водой, либо 6% молочной сывороткой. Этот выбор обоснован универсальностью отрубей в качестве компонента пищевых продуктов, а также адаптированностью населения к их применению.
3.2.2 Выбор способа культивирования наиболее перспективных штаммов дрожжей При поверхностном культивирований дрожжей контрольного штамма C.
famata(Harrison)T8 и P. anomala 9а, P. anomala P1 при дозе посевного материала на уровне 107 кл/г основной прирост дрожжевой биомассы приходился на первые двое суток культивирования и составил более двух порядков, достигая 5,68*109кл/г (рис.1).
При глубинном культивировании (ГФ) на средах из воды с добавлением различного процента отрубей в условиях аэрации была отмечена зависимость в накоплении биомассы данных штаммов от степени гетерогенности среды для культивирования (рис.2). При добавлении пшеничных отрубей биомасса незначительно, но все-таки нарастала: максимум достигался при 8% содержания отрубей в жидкой среде и составил 0,62*109кл/см3. При добавлении большего количества отрубей (10%) видимого увеличения численности C. famata Т8, P. anomala 9а, P.anomala P1 не наблюдалось.
Рис. 1 Накопление биомассы дрожжевыми Рис. 2 Накопление биомассы дрожжевыми культурами при ТФФ в течение 72 ч культурами при ГФ в течение 48 ч Проведенные исследования позволили выбрать твердофазный способ культивирования, при котором продуктивность дрожжей на порядок больше, чем при глубинной ферментации. При этом осуществление ТФФ более реально и целесообразно, так как при данном способе ферментации отсутствуют сложные и дорогостоящие операции, связанные с выделением и концентрированием продукта.
3.2.3 Определение антагонистической активности наиболее перспективных дрожжей.
В литературе имеются сведения об антагонистической активности дрожжей вида Pichia anomala (Greame M. Walker, 2011; Jijakli MH,2010; Laitila A et al,2007) по отношению к различным видам условно-патогенных микроорганизмов. С целью определения функциональных свойств отобранного штамма дрожжей Pichia anomala Рпроводились исследования по определению антагонистической активности вышеуказанного штамма по отношению к условно-патогенным культурам микроорганизмов: E.coli, E. cloacae B 2073, K. oxytoca sypi, E.aerogenes. Зоны задержки роста при использовании всех использованных условно-патогенных культур, с учетом диаметра самой лунки - 7 мм, не превышали 11-12 мм, такой штамм дрожжей в соответствии с МУ 2.3.2.2789-10. 2.3.2 относят к слабым антагонистам.
3.2.4 Развитие микробных консорциумов в аэробных условиях С целью получения активных полимикробных посевных материалов с более выраженными функциональными свойствами была поставлена задача создать микробный консорциум на основе отобранных дрожжевых культур и лактобактерий и изучить взаимное влияние его составляющих. В данной работе был использован характерный представитель пробиотиков - промышленный штамм лактобактерий Lactobacillus acidophilus La 5.
Для изучения влияния лактобактерий на отобранные дрожжевые культуры была поставлена твердофазная ферментация в течение 48 ч, при температуре 302С, на выбранных в п.3.2.1 субстратах (рис. 3). Ингибирующее и стимулирующее влияние бактериальной составляющей на накопление биомассы дрожжей установлено не было.
Рис. 3. Продуктивность выбранных дрожжевых культур при ТФФ в зависимости от состава субстрата и присутствия L. аcidophilus La5.
Варианты состава субстратов и культивируемых на них микроорганизмов:
1- натуральная кукуруза + М.С. + Pichia anomala Р1 2- натуральная кукуруза + вода+ Pichia anomala Р3- отруби + М.С. + Pichia anomala Р1 4- отруби +вода + Pichia anomalaР1a 5- натуральная кукуруза + М.С. + Pichia anomala 9а 6- натуральная кукуруза + вода+ Pichia anomala 9а 7- отруби + М.С. + Pichia anomala 9а 8- отруби +вода + Pichia anomala 9а 9- натуральная кукуруза + М.С. + дрожжи 9в 10- натуральная кукуруза + вода+ дрожжи 9в 11- отруби + М.С. +дрожжи 9в 12- отруби +вода + дрожжи 9в 13- натуральная кукуруза + М.С. + дрожжи 19 14- натуральная кукуруза + вода+ дрожжи 15- отруби + М.С. + дрожжи 19 16- отруби+ вода+ дрожжи На накопление биомассы клеток L. acidophilus La 5 на отрубях, увлажненных 6% молочной сывороткой, выбранные дрожжевые культуры влияли очень незначительно (рис.4).
Максимальный результат был достигнут при внесении в субстрат штамма Pichia anomala Р1 и составил 5,2*1КОЕ/г.
Рис.4 Влияние дрожжей на жизнеспособность и накопление биомассы L. acidophilus La Оптимальное соотношение дрожжевых культур и вносимых лактобактерий составило 1:1. Установлено, что внесение лактобактерий в дрожжевые культуры практически не снижает уровень рН полученных активных посевных материалов по всем вариантам, указанным в рис. 3.
3.2.5 Развитие микробных консорциумов в анаэробных условиях.
актобациллы являются облигатными обитателями кишечника, поэтому благоприятными условиями являются температура 37С, отсутствие аэрации и содержание в среде достаточного количества питательных веществ. Для глубинного культивирования выбрали жидкую среду, состоящую из молочной сыворотки и 8% отрубей, при этом были созданы анаэробные условия путем использования матрацев с резиновыми пробками или завязывания полиэтиленовой пленкой качалочных колб.
Присутствие дрожжевых культур стимулировало развитие культуры L. acidophilus La5(рис.5), прирост биомассы при совместном развитии увеличился в 1,5 раза. Таким образом, в условиях, частично имитирующих условия пищеварительного тракта, т.е. in vitro, показано, что клетки дрожжей P.
anomala P1 и P. anomala 9а являются потенциальным регулятором микрофлоры пищеварительного тракта.
Рис.5 Динамика изменения жизнеспособных клеток дрожжей и лактобактерий в анаэробных условиях Дрожжи при совместном развитии с L. acidophilus La5 в анаэробных условиях практически не изменяли свою численность и к концу ферментации содержание жизнеспособных клеток дрожжей P.anomala Р1 составило 5,2*107КОЕ/см3, P. anomala 9а - 5,4*107КОЕ/см3.
3.2.6. Выживаемость микробных консорциумов при получении сухих посевных материалов.
Полученные активные полимикробные посевные материалы на основе пшеничных отрубей, увлажненных водой или молочной сывороткой, содержат жизнеспособные клетки дрожжей и лактобактерий на уровне 109КОЕ/г. Рекомендуется хранение при температуре 4С не более 30 суток. Для увеличения сроков хранения и возможности транспортировки посевных материалов, их сушат. При этом важно подобрать такой режим сушки, чтобы наименее травмировать живые клетки микроорганизмов в составе посевных материалов. Было предложено несколько температурных режимов сушки - при 35 С, 40 С и 50 С.
Экспериментальные данные (рис.6) позволили выбрать режимы сушки при температуре 35 С и 40 С когда действие на жизнеспособные клетки дрожжевых культур не так травматично, погибло всего 10 - 20 % дрожжевых клеток.
Рис. 6 Влияние температурного режима сушки на число жизнеспособных клеток дрожжей Однако, высушивание при температуре 40С происходило быстрее, соответственно целесообразно применять данный режим сушки. Высушивание при 50С приводило к почти полному отмиранию дрожжевых клеток - живыми оставалось менее 0,1%.
Рис. 7 Влияние температурного режима сушки на число жизнеспособных клеток лактобактерий При изучении влияния различных температурных режимов сушки на лактобактерии установлена та же зависимость, что и для дрожжевых культур. Действие высоких температур на жизнеспособные клетки лактобактерий более травматично, чем на жизнеспособные клетки дрожжей, погибло 22- 59 % клеток лактобактерий (рис.7).
Однако, оставшееся количество жизнеспособных клеток лактобактерий, которое составило 0,13-0,29*109 КОЕ/г, вполне достаточно для дальнейших ферментаций 3.2.7. Выживаемость микробных консорциумов при получении замороженных посевных материалов.
Для увеличения сроков хранения и возможности транспортировки посевных материалов их замораживали при температуре -18С в течение 12 ч. Установлено, что уровни выживаемости дрожжевых культур при воздействии низких температур (-18С) на 10% меньше, чем при воздействии высоких (40С )(рис. 8).
Рис.8 Влияние заморозки при -18 С на Рис.9 Влияние заморозки при -18 С на число жизнеспособных клеток дрожжей число жизнеспособных клеток лактобактерий Количество жизнеспособных клеток дрожжевых культур после воздействия температуры -18 С в течение 12 ч в процентном соотношении к изначальному числу составляет 46,2-81,8 % в зависимости от штамма дрожжей.
При изучении влияния низких температур на лактобактерии установлено, что уровень выживаемости L. acidophilus La5 при воздействии низких температур (-18С) на 15% больше, чем при воздействии высоких (40С )(рис. 9). Количество жизнеспособных клеток лактобактерий после воздействия температуры -18 С в течение 12 ч в процентном соотношении к изначальному числу составило 80-92,3 %.
3.2.8. Определение сроков и условий хранения полученных активных замороженных и сухих посевных материалов.
При хранении сухих активных полимикробных посевных материалов при температуре 10С установлена зависимость количества жизнеспособных клеток лактобактерий и дрожжей от длительности хранения (рис. 10). При хранении в течение 100 сут сухих посевных материалов выживаемость активных культур составила 80-85%, что соответствует 2,5*109КОЕ/г дрожжей и 0,34*109 КОЕ/г лактобактерий для штамма P.anomala P1 и L.acidophilus La5, 1,8*109КОЕ/г и 0,2*109КОЕ/г - для P.anomala 9а и L.acidophilus La5.
Рис. 10 Влияние длительности хранения сухих активных полимикробных посевных материалов на активность культур микроорганизмов При хранении замороженных посевных материалов в морозильнике (-18С) динамика изменения жизнеспособных клеток лактобактерий и дрожжей такая же, как и при хранении сухих посевных материалов (рис. 11). Установлено, что хранение сухих и замороженных активных полимикробных посевных материалов без снижения жизнеспособности культур микроорганизмов возможно в течение 100 сут. Полученные посевные материалы могут быть использованы для глубиной или твердофазной ферментации различных субстратов с целью получения новых ферментированных продуктов.
Рис. 11 Влияние длительности хранения замороженных активных полимикробных посевных материалов на активность культур микроорганизмов 3.2.9. Определение физико-химических характеристик полученных посевных материалов Установлено, что активная кислотность полученных посевных материалов варьировалась в диапазоне 6,92-7,30 ед. рН, титруемая в диапазоне 24-30 Т (рис.12), что не влияло на органолептические свойства получаемых продуктов.
Рис. 12 Активная и титруемая кислотность полученных посевных материалов Содержание сырого протеина в посевных материалах составило 10,8-20,0 %, что характеризует полученные посевные материалы как потенциальные обогатители пищевых продуктов.
3.2.11. Динамика изменения количества жизнеспособных клеток микробного консорциума при производстве жидкого полуфабриката Помимо натуральных, сухих и замороженных посевных материалов возможно получение жидких полуфабрикатов, которые также имеют длительные сроки хранения и могут стать основой для новых ферментированных продуктов. В отличие от сухих и замороженных посевных материалов, в жидких полуфабрикатах, которые получаются путем разбавления жидким компонентом натуральных посевных материалов (гидромодуль 4:1) создаются благоприятные условия для развития L.acidophilus La 5.
актобактерии подкисляют среду, тем самым играя роль натурального консерванта, делают невозможным развитие посторонней микрофлоры.
Экспериментально установлено, что в жидких полуфабрикатах с течением времени количество клеток лактобактерий резко увеличивалось (рис. 14), в то время как дрожжи прекращали свой рост и постепенно их количество сокращалось более чем на порядок (рис. 13), из этого можно сделать вывод, что дрожжи являлись источниками питательных веществ для роста и развития молочнокислых бактерий.
Рис. 13 Влияние длительности хранения Рис. 14 Влияние длительности хранения жидких жидких полуфабрикатов на количество полуфабрикатов на количество жизнеспособных жизнеспособных клеток дрожжей клеток L.acidophilus La 3.2.12. Определение физико-химических показателей жидких полуфабрикатов В процессе хранения жидких полуфабрикатов наблюдалось значительное закисление среды до уровня 4,0-4,5 ед. рН(рис. 15). При этом важно отметить, что интенсивное понижение активной кислотности наблюдалось в первые 5 сут. Основное увеличение титруемой кислотности происходило также в первые 5 сут и составило 80112Т (рис. 16). При дальнейшем хранении отмечено незначительное изменение титруемой и активной кислотности - не более 5%.
Рис. 15 Влияние длительности хранения Рис. 16 Влияние длительности хранения жидких полуфабрикатов на активную жидких полуфабрикатов на титруемую кислотность среды кислотность среды В полученных жидких полуфабрикатах содержался сырой протеин на уровне 1,83-2,02 г на 100 мл, что позволило использовать их в качестве обогатителей пищевых продуктов. Содержание сухих веществ (СВ) в жидком полуфабрикате составило 16,8018,75 %.
3.2.13. Характеристики продуктов, полученных при ферментации молочной основы активными полимикробными посевными материалами Приготовление нового молочного ферментированного продукта осуществляли методом глубинной ферментации молока питьевого с массовой долей жира 0,5% сухими, замороженными, натуральными активными полимикробными посевными материалами (гидромодуль 10:1) и жидкими полуфабрикатами (гидромодуль 3:1).
Установлено, что в процессе получения нового ферментированного напитка количество жизнеспособных клеток дрожжевых культур уменьшается (рис. 17) пропорционально увеличению количества активных клеток лактобактерий (рис.18). При этом длительность ферментации можно изменять в зависимости от необходимых показателей выживаемости культур микроорганизмов.
Рис. 17 Влияние длительности ферментации Рис. 18 Влияние длительности ферментации на жизнеспособность дрожжевых культур на жизнеспособность лактобактерий Варианты вносимых посевных материалов:
1- натуральный посевной материал на основе P.anomala 9a +La2- сухой посевной материал на основе P.anomala 9a +La3- замороженный посевной материал на основе P.anomala 9a +La4- жидкий полуфабрикат на основе 6% М.С. и P.anomala 9a +La5- натуральный посевной материал на основе P.anomala P1 +La6- сухой посевной материал на основе P.anomala P1 +La7- замороженный посевной материал на основе P.anomala P1 +La8- жидкий полуфабрикат на основе 6% М.С. и P.anomala P1 +LaПри этом наилучшие результаты вне зависимости от вида вносимого посевного материала показали микробные консорциумы на основе лактобактерий и P.anomala P1.
В процессе ферментации активная кислотность уменьшалась до уровня 4,52 ед. рН (рис. 20), титруемая - возрастала и составила через 48 ч ферментации 120Т, при дальнейшей ферментации изменение титруемой и активной кислотности незначительно - не более 3 % (рис. 19).
Рис. 19 Влияние длительности ферментации Рис. 20 Влияние длительности ферментации на титруемую кислотность полученных на активную кислотность полученных новых ферментированных напитков новых ферментированных напитков Физико-химические, микробиологические и органолептические показатели полученных продуктов представлены в табл. 3.
Таблица Органолептические, химические и микробиологические показатели разработанных новых ферментированных напитков на молочной основе Наименование показателя Значение показателя для молочных напитков (питьевых йогуртов) 1. Массовая доля белка, % не менее 3,2. Содержание СВ, % не менее, в том числе отруби, не более 3. Активная кислотность среды, рН не менее 4,4. Титруемая кислотность среды, в С Тернера не 1более 5. Содержание дрожжей, КОЕ/г не менее 116. Содержание молочнокислых бактерий, КОЕ/г не менее 117. БГКП (колиформы), КОЕ в 0,01г Не допускается 8. Патогенные м/о, в т.ч. сальмонеллы, КОЕ в 25 г Не допускается 9. Споры грибов, КОЕ в 1 г Не допускается 10. Внешний вид, цвет и консистенция Однородная, в меру вязкая, молочно-белая с наличием включений зерновых отрубей 11. Запах и вкус Свойственный молочнокислым продуктам 12. Масса нетто, упакованной единицы, л, не менее 0,3.2.14. Сравнение полученных новых молочных ферментированных продуктов питания с уже представленными на рынке РФ Для определения конкурентоспособности полученных новых молочных ферментированных продуктов были исследованы образцы молочных напитков с добавками зерновых культур, закупленные в торговой сети г. Москвы с целью определения их состава и свойств (табл. 4).
Таблица Сравнительная характеристика питьевых йогуртов, представленных на рынке г.Москвы и полученных новых ферментированных молочных продуктов № Измеряемый параметр п/ Наименование продукта Активная Титруе- Содер Содер В том Мас- Содер п кислот- мая жание жание числе совая жание ность кислот- дрож- МКБ, лактоба доля белка среды,ед. ность жей, КОЕ/г ктерии, СВ, % в г на рН среды, Т КОЕ/г КОЕ/г 100 г 1 Биойогурт Юнимилк со 4,32 104 0,2*107 1,1*109 1,5*107 18,3 3,злаками 2 Биойогурт Лакомо злаки 4,46 86 3*103 4,0*109 - 16,3 2,3 Йогурт питьевой 4,48 95 - 2,5*108 3,6*106 17,9 3,Эрмигурт prebiotic злаков 4 Йогурт лактивиа со 4,56 88 2*104 1,2*109 - 17,6 2,злаками 5 Йогурт Большая кружка 4,51 89 1*104 4,2*108 1,6*105 19,1 2,злаки и земляника 6 Питьевой йогурт, 4,52 92 1,3*107 4,2*109 4,2*109 18,3 3,полученный с использованием сухого посевного материала на отрубях P.anomala 9a+ L.acidophilus La7 Питьевой йогурт, 4,6 96 3*107 5,0*109 5,0*109 17,9 4,полученный с использованием сухого посевного материала на отрубях P. anomala P1+ L.acidophilus LaУстановлено, что полученные новые ферментированные молочные продукты превосходят существующие аналоги молочных напитков с добавками зерновых культур по всем определяемым показателям 3.2.15 Показатели безопасности полученного нового ферментированного напитка При производстве пищевых продуктов на основе молока предъявляются жесткие требования, изложенные в нормативной документации (СанПиН 2.3.2.1078-01, 88-ФЗ от 12 июня 2008 г.). Анализ содержания токсичных элементов, радионуклеидов и пестицидов в новом ферментированном молочном продукте на основе микробного консорциума, содержащего P. anomala P1 и L.acidophilus La5, был выполнен в испытательном центре пищевой продукции ЗАО Ростест-Москва. Результаты (табл. 5) подтверждены протоколом химико-аналитических исследований.
Таблица Показатели безопасности полученного нового ферментированного молочного напитка Фактическое Наименование Единица измерения Норматив значение Токсичные элементы: ртуть менее 0,002 не более 0,0мышьяк менее 0,002 не более 0,мг/кг кадмий менее 0,005 не более 0,свинец менее 0,06 не более 0,Пестициды: ГХЦ менее 0,008 не более 0,мг/кг ДДТ менее 0,005 не более 0,Радионуклиды:Cs-137 менее 5 не более 1Бк/л Sr-90 менее 10 не более Полученные результаты свидетельствуют о соответствии нового разработанного ферментированного напитка на молочной основе требованиям Федерального закона Российской Федерации от 12 июня 2008 г. N 88-ФЗ "Технический регламент на молоко и молочную продукцию" и возможности его реализации в качестве пищевого продукта.
3.2.16 Взаимодействие полученных комплексных культур и патогенных микроорганизмов Исследования, проведенные в лаборатории Молекулярные основы патогенности (группы Стафилококковых инфекций) ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России, показали, что инактивированные комплексные дрожжебактериальные культуры ингибирующего действия на выбранный нами модельный штамм патогенного стафилококка и его токсинообразование не оказывали, они даже несколько стимулировали рост модельной культуры и ее токсинообразование (табл. 6).
Таблица Показатели роста и функциональных свойств токсинообразующих St.aureus FRI 722 при совместном выращивании с полученными комплексными культурами ФосфолиКонцентрация токсина № lg пазная п/ Штамм КОЕ/ pH б/ активность, 1:10 1:50 1:100 1:2п см3(г) р % 7,+ + + - - 1 Контроль S. aureus FRI 722 10,8 1Контроль 2 S. aureus FRI 72 10,2 25 5,0 + + - - - +отруби.
3 Контроль S. boulardii живые 9,5 100 8,4 + + + + - Контроль S. boulardii инакт.* 10 100 8,2 + + + + + 4 P. anomala 9а + La 5 на отрубях 10 90 8,6 - - - - - P. anomala 9а +La5 на отрубях + + + + - 5 инакт*. 12,3 100 8,*инакт - инактивированный (прогретый при 100С 15 минут) Эти данные позволили сделать заключение, что дрожжи являются в основном нутриентами - стимуляторами роста бактерий. Таким образом, позитивное действие дрожжей при токсикоинфекциях в макроорганизме достигается их непрямым влиянием на токсигенный микроб через стимулирование активности собственной полезной микрофлоры кишечника. Роль же прямых биокорректоров принадлежит, скорее всего, бактериальной составляющей микробного консорциума, а значит, разработанные в настоящей работе пищевые продукты должны содержать живые комплексные культуры и прежде всего культуры лактобактерий.
3.2.17. Характеристики продуктов полученных при ферментации 7% сахарного раствора активными полимикробными посевными материалами Приготовление нового ферментированного напитка осуществляли методом глубинной ферментации 7% сахарного раствора сухими, замороженными, натуральными активными полимикробными посевными материалами (гидромодуль 10:1) и жидкими полуфабрикатами (гидромодуль 3:1) в течение 72 ч. Для получения лучших органолептических свойств проводили фракционирование напитков на твердую (может использоваться в качестве обогатителя пищевых продуктов) и жидкую (питьевой напиток) фазы.
Физико-химические, микробиологические и органолептические показатели полученных продуктов представлены в табл. 7.
Таблица Органолептические, химические и микробиологические показатели разработанных новых ферментированных напитков и обогатителей пищевых продуктов Наименование показателя Значение показателя для пищевого обогатителя для питьевого напитка (жидкая (твердая фаза) фаза) 1. Массовая доля белка, % не менее 5 0,2. Содержание СВ, % не менее, 35 3. Содержание дрожжей, КОЕ/г не менее 1106 не менее 114. Содержание молочнокислых бактерий, не менее 1108 не менее 11КОЕ/г 5. БГКП (колиформы), КОЕ в 0,01г Не допускается Не допускается 6. Патогенные м/о, в т.ч. сальмонеллы, КОЕ в 25 г Не допускается Не допускается 7. Споры грибов, КОЕ в 1 г Не допускается Не допускается 8. Внешний вид, цвет и консистенция Однородная влажная Однородная, прозрачнокрупка от светло - бежевая жидкость коричневого до коричневого цвета 9. Запах и вкус Свойственный зерновым Свойственный сахаристым продуктам напиткам 10. Масса нетто, упакованной единицы, л, не менее - 0,кг, не менее 0,9 - 3.2.18 Наработка опытных партий новых ферментированных напитков.
На основании лабораторных исследований был разработан технологический регламент и технические условия на сухой активный полимикробный посевной материал. Разработана технологическая схема получения сухих посевных материалов (рис 21). Проведен расчет экономической эффективности разработанной технологии, который показал, что оптовая цена полученного посевного материала составляет 60 руб за 1 кг.
Наработаны опытные партии новых ферментированных напитков на основе полученных сухих посевных материалов на стендовой установке ГНУ ВНИИПБТ РАСХН. Проведена органолептическая оценка образцов полученных питьевых напитков на кафедре Технология общественного питания МГУПП.
Рис.21 Блок-схема процесса получения сухих активных посевных материалов ВЫВОДЫ 1. Установлена возможность производства активных посевных материалов из дрожжей рода Pichia, выделенных из женского грудного молока, на первичных и вторичных сырьевых ресурсах АПК. Выявлено несколько перспективных штаммов дрожжей, из которых самые высокие результаты показал штамм Pichia anomala Р1. Установлено наличие антагонистической активности у данного штамма по отношению к E.coli, E.
cloacae B 2073, K. oxytoca sypi, E.aerogenes.
2. Показано, что в условиях твердофазного культивирования наблюдается максимальное накопление биомассы выбранными штаммами дрожжевых культур, которое составляет 3,36- 5,68 *109 кл/г.
3. Получены микробные консорциумы на основе выбранных дрожжей и промышленного штамма L.acidophilus La5. На различных твердых растительных субстратах констатирована способность дрожжей и лактобактерий к симбиозу без выраженного взаимного ингибирования. In vitro показано, что дрожжи стимулируют рост лактобактерий.
4. Впервые получены хранимые активные полимикробные посевные материалы путем высушивания и замораживания комплексных культур. Установлена возможность сушки при 40С. Рекомендовано хранение в течение 100 сут при температуре 10С.
5. Разработана технология получения активных полимикробных посевных материалов.
Оптовая цена сухого посевного материала составляет 60 руб за 1кг.
6. Установлена зависимость физико-химических и микробиологических показателей качества посевных материалов в виде жидких полуфабрикатов от длительности их хранения. Рекомендовано хранение в течение 40сут.
7. Получены новые ферментированные напитки на базе активных полимикробных посевных материалов в различном виде. Проведены испытания технологий новых ферментированных напитков на стендовой установке ГНУ ВНИИПБТ РАСХН, оценены их органолептические свойства и показатели безопасности. Новые молочные ферментированные напитки превосходят существующие аналоги молочных напитков с добавками зерновых культур по всем определяемым показателям.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Каночкина М.С. Жидкие агропромышленные поллюанты как сырье для производства микробной биомассы / Борисенко Е.Г., Горин К.В.// Безопасность и экология предприятий пищевой промышленности. Инновационные решения использования отходов пищевых производств: тезисы докл. Первой научнопрактической конференции с международным участием (Москва, 23 сентября 2009 г.). - М., 2009. - С. 57-62.
2. Каночкина М.С. Целлюлозосодержащие материалы как сырье для производства дрожжевой биомассы / Борисенко Е.Г., Горин К.В,// Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты: тезисы докл. VII международной научно - практической конференции и выставки (Москва, 7-8 октября 2009 г.). - М., 2009.Ц С.
157-161.
3. Kanochkina M.S. The yeast-bacterial edible products based on the primary and secondary agroindustrial raw materials / Borisenko E.G., Gorin K.V., Nguen Chyong Zang // EurasiaBio: 2nd International Congress-Partnering & Exhibition on Biotchnology and Bioenergy (Moscow, 13-15 April 2010). - Moscow, 2010. - Р. 236-237.
4. Каночкина М.С. Нутриенты - биокорректоры на базе нетрадиционного сырья /Борисенко Е.Г., ГоринК.В., Нгуен Ч.З.// Товароведение, экспертиза и технология продовольственных товаров: Сборник докладов III межведомственной научнопрактической конференции (Москва, 2010г.). - М., 2010. - С. 81-85.
5. Каночкина М.С. Выживаемость дрожжей в твердофазных культурах// Пищевая промышленность.- 2011. - №6. - С.54-55.
6. Каночкина М.С. Повышение питательной и биологической ценности растительных нутриентов с помощью микроорганизмов/ Борисенко Е.Г., ГоринК.В., Нгуен Ч.З., Чан В.Т., Гулимова Л.А., Максимушкин А.Ю.// Живые системы и биологическая безопасность населения: тезисы докл. IX Международной научной конференции студентов и молодых ученых (Москва,2011г.). - М., 2011 - С.380-382.
7. Каночкина М.С. Функциональные свойства дрожжей и бактерий, входящих в состав микробных корректоров пищевого и кормового назначения/ Борисенко Е.Г., ГоринК.В., Нгуен Ч.З., Чан В.Т., Максимушкин А.Ю., Борисенко Е.А., Флуер Ф.С.// Хранение и переработка сельхозсырья.-2012. - №3.- С. 46-49.
8. Каночкина М.С. Исследование оптимальных условий культивирования перспективных штаммов дрожжей Ч источников биологически активных веществ на основе растительного сырья и отходов его переработки/ Борисенко Е.Г., Горин К.В., Нгуен Ч.З., Чан В.Т., Борисенко Е.А., Гулимова Л.А.// Производство спирта и ликероводочных изделий.- 2012.- №1.- С. 18-20.
9. Заявка на патент №2012110630 Способ получения активного полимикробного сухого посевного материала для производства продуктов функционального питания/Борисенко Е.Г., Каночкина М.С.//-заявлено 21.03.2012.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по техническим специальностям