Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ПОПОВА
Вера Михайловна
РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
ПРИ ПРОМЫШЛЕННОМ ПРОИЗВОДСТВЕ
БИОПРЕПАРАТОВ
03.01.06-биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Щелково - 2011
Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук
Научный консультант: доктор биологических наук Нежута Александр Александрович
Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный ветеринарный врач РФ Мельник Николай Васильевич
доктор ветеринарных наук, профессор Владимир Викторович Субботин
доктор биологических наук Владимир Егорович Козлов
Ведущая организация - ФГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина
Защита состоится 9 декабря 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности Россельхозакадемии по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ВНИТИБП;
тел/факс: (495) 526-43-74; e-mail: vnitibp@mail.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (ВНИТИБП).
Автореферат разослан УЕ.Ф ЕЕЕЕ2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук Ю.Д. Фролов
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Развитие биотехнологии обусловлено общим прогрессом науки и техники. Совершенствование промышленной технологии производства биопрепаратов наиболее успешно осуществляется при совместном решении биотехнологических и технических вопросов. Разработка биотехнологических процессов при культивировании клеток, вирусов и бактерий, выделении энзимов является актуальной проблемой при получении эффективных биопрепаратов (Грачев В.М., 1985; Спиер Р.Е. и Гриффитс Дж., 1989; Елинов Н.П., 1995; Дьяконов Л.П., 2000; Хапчаев Ю.Х., 2003; Жарникова И.В., 2004; Беклемишев А.Б., 2004; Албулов А.И., 2004; Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., 2005; Соловьев Б.В., 2005; Тихонов И.В., 2005; Гуславский А.И., 2007; Жданова Н.А., 2009).
Разработка современных технологий в производстве биопрепаратов требует переоснащения оборудования, использования высокоэффективных методов и перспективных материалов, что обеспечит выпуск конкурентоспособной продукции.
Одной из важнейших задач производства биопрепаратов является совершенствование методов культивирования (клеток, вирусов и бактерий) с использованием отечественного оборудования и учетом качественных характеристик препарата. Способ управляемого глубинного культивирования нашел широкое применение в производстве бактерийных препаратов, который за короткое время позволяет получить максимальное количество бактериальной массы. Одной из проблем при культивировании клеток животных и вирусов является поддержание жизнеспособности клеток. Наряду с распространенными стационарным и динамичным (роллерным) способами культивирования клеток и вирусов суспензионное культивирование привлекает внимание исследователей при изготовлении вакцин и диагностических препаратов для максимального накопления клеток и получения вируссодержащего материала (Новохатский А.С., 1979; Лукина В.А., Слепенко Т.Б., Сенько Е.Ф., 1981; Рубан Е.А., Соловьев Б.В., Самуйленко А.Я, 2005). Суспензионный и псевдосуспензионный (на микроносителях) методы культивирования микроорганизмов создают равноценные условия по всему объему сосуда, позволяют контролировать и регулировать необходимые параметры (рН, рО2, еН, t), осуществлять контроль роста клеток, исключать возможность контаминации, способствовать экономии питательной среды (Сергеев В.А., 1976; Голубев Д.Б., Сомнина А.А., Медведева М.Н., 1976; Осидзе Д.Ф., 1976; Новохатский А.С., 1979; Тарасов В.П., 1990; Гаврилюк Б.К., Сафронов В.П., 1981; Ночевный В.Т., 1994; Дьяконов Л.П., Ситьков, 2000; В.И. Хапчаев Ю.Х., 2003; Тихонов И.В., Рубан Е.А., Самуйленко А.Я, 2005; Жданова Н.А., 2009). Осуществление крупномасштабного культивирования клеток в суспензии и на микроносителях в реакторах специального назначения отечественного производства связано со сложностью обеспечения стерильности процесса. Исключение контаминации культуральной жидкости посторонней микрофлорой и попадания продуктов биосинтеза в окружающую среду, поддержание, контроль и регулирование процессом являются важнейшими факторами.
В производстве вирусных вакцин при дезинтеграции клеток используют в основном импортный протеолитический ферментный препарат трипсин. Совершенствование технологии с целью получения фермента высокой активности сопряжено с использованием методов очистки и сушки препарата, что позволит создать конкурентоспособную продукцию с заданными свойствами и провести импортзамещение.
Важными этапами при приготовлении питательных и защитных сред, сывороток, ферментов в производстве вирусных вакцин и бактерийных препаратов являются их очистка, разделение и концентрирование, стерилизация. Выбор методов их осуществления представляет сложную задачу, и зависит от качественной характеристики жидкости (Тихонов И.В., 2005). Применение мембранных способов очистки, разделения и концентрирования позволяет создать экологически безопасные, энергосберегающие технологические процессы (Фридлянский И.И., 1976; Дытнерский Ю.И.; 1986, Платэ Н.А., 1999; Тимашов С.Ф., 2000; Шапошник В.А., 2001; Дубяга В.П., Бесфамильный И.Б., 2005; Свитцев А.А., 2007; Гуславский А.И., 2007; Андреева И.С., 2009).
Таким образом, совершенствование технологии культивирования в биореакторах вирусных и бактерийных препаратов, получение отечественного препарата трипсина, разработка различных способов очистки, разделения, концентрирования биологических жидкостей с учетом современных достижений биотехнологии (в настоящее время) являются актуальными.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка и совершенствование биотехнологических процессов в производстве ферментов и биопрепаратов, при получении трипсина и культивировании клеток, при очистке и фильтровании биологических жидкостей с использованием современного оборудования и материалов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- усовершенствовать технологию промышленного производства трипсина;
- разработать способ иммобилизации трипсина на полимерном носителе и получения теплостойких композиций; определить токсичность полимерных материалов с помощью пастерелл и культур клеток;
- усовершенствовать способы культивирования клеток животных при получении противовирусных препаратов с применением современного оборудования и материалов;
- усовершенствовать способ глубинного культивирования золотистого стафилококка St. aureus для получения биологически активного протеина А;
- усовершенствовать технологию различных методов очистки биологических растворов при микрофильтрации, ультрафильтрации и электродиализе:
определить область применения безасбестовых материалов и мембранных фильтров для предварительной, тонкой и стерилизующей фильтрации, при разделении и концентрировании жидкостей с использованием отечественного оборудования;
разработать технологию получения очищенного альбумина, применяемого в качестве компонента питательной среды при культивировании лептоспир с помощью ультрафильтрации и электродиализа.
Научная новизна. - Усовершенствована технология производства трипсина с применением способов центрифугирования при разделении суспензии после экстрагирования и высаливания фермента и последующего распылительного или сублимационного высушивания, обеспечивающих высокое качество препарата, не требующих его дополнительного измельчения и просеивания препарата.
- Разработана промышленная технологическая линия производства трипсина с использованием современного оборудования. Технология испытана в опытно-промышленных условиях, получен патент РФ № 2403285 от 04.06.2009 УСпособ получения трипсинаФ (оп. 10.11. 2010 бюл. № 31. - С. 743).
Усовершенствован способ очистки и концентрирования трипсина методом ультрафильтрации через разделительные модули на полых волокнах с обеспечением подачи жидкости центробежным насосом.
- Разработан способ иммобилизации протеолитического фермента трипсина, сохраняющего свойства при длительном хранении и обладающего активностью на уровне контроля, обеспечивающего получение жизнеспособных клеток, более высокий выход при культивировании в сравнении с нативной формой.
- Определены технологические параметры культивирования перевиваемых линий клеток ПТ-80 и ВНК-21/13 в суспензии и псевдосуспензии на микроносителях в биореакторах с магнитным приводом и аэрацией культуры.
- Разработан модуль технологической обвязки для биореакторов (0,005; 0,025; 0,1; 0,25м3). Отработана технология культивирования перевиваемых клеток в биореакторах с использованием специализированного отечественного оборудования, оснащенного фильтрами тонкой очистки воздуха и пара с фильтрующими элементами из пористого титана; запорной малогабаритной и регулирующей арматурой, обеспечивающей осуществление технологических операций в автоматическом режиме.
- Разработаны полимерные композиции, которые применены в биологическом оборудовании в качестве конструкционного материала, стойкие к биологическим и химическим средам, температурным факторам (авторские свидетельства: № 384361 бюл. - 1973. - № 43. - С.167; № 701129 бюл. - 1979. - № 44. - С.193; № 770126 бюл. - 1980. - № 37. - С.308; № 783311бюл. - 1980. - № 44. - С.110).
- Впервые в отечественной ветеринарной практике разработана технология и использован метод обессоливания альбумина с помощью электродиализа для повышения эффективности процесса очистки растворов от солей.
Практическая значимость. На основании проведенных исследований по разработке и усовершенствованию технологических процессов получения ферментов и биопрепаратов разработана нормативная и технологическая документация.
УТехнологический регламент производства трипсина сухого для вирусологических целейФ, утвержденный 01.06.1995 г., директором ВГНКИ и директором ГНУ ВНИТИБП.
УТехнические условия ТУ 9358.013.00008064-96 УТрипсин сухой для вирусологических целейФ, утвержденные 04.03.1996 г., директором ВГНКИ и согласованные 07.03. 1996 г. Департаментом ветеринарии МСХ РФ.
УНаставление по применению трипсина сухого для вирусологических целейФ, утвержденное 04. 03. 1996 г. № 13-6-2/540, Департаментом ветеринарии МСХ РФ.
Разработана технологическая схема производства трипсина. Технология изготовления трипсина освоена в ГНУ ВНИТИБП и НПО УСинтезФ (г. Курган), на Алма-Атинском и Омском биокомбинатах. Опытно-промышленные серии трипсина использованы для получения первичных и перевиваемых культур клеток при производстве противовирусных вакцин на Курской и Армавирской биофабриках, Омском и Алма-Атинском биокомбинатах.
Определены условия культивирования клеток в биореакторах, разработан Технологический регламент УКультивирование клеток и вирусов с использованием экспериментальных образцов оборудованияУ, утвержденный директором ГНУ ВНИТИБП 28.12.1985 г. Разработана технологическая схема процесса культивирования клеток и вирусов в аппаратах (реакторах). Технология культивирования клеток и вирусов использована в производстве противовирусных вакцин и диагностических препаратов при ИРТ, ПГ-3, РС, ВД-БС АВИ, бешенстве, болезни Марека (БМ).
- Разработаны и предложены в качестве конструкционного материала полимерные композиции, стойкие к биологическим и химическим средам, температурным факторам. Во ВНИТИБП организован участок по изготовлению полимерных материалов, предложен комплект пресс-форм для изделий биотехнологического назначения.
- Усовершенствована предварительная, тонкая и стерилизующая фильтрация биологических растворов с помощью материалов на безасбестовой основе. Определены условия и возможность использования в биопромышленности экологически безопасных, исключающих фазовые переходы, процессов микрофильтрации и ультрафильтрации; усовершенствован метод очистки альбумина с помощью электродиализа при получении питательной среды для культивирования лептоспир в промышленных условиях.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
- технологические процессы изготовления трипсина;
- разработка способа иммобилизации трипсина на полимерном носителе и получения теплостойких композиций; определение токсичности полимерных материалов с помощью пастерелл и культур клеток;
- усовершенствование технологии культивирования перевиваемых клеток животных при получении вирусных препаратов суспензионным и псевдосуспензионным способами (на микроносителях) в биореакторах;
- усовершенствование глубинного культивирования золотистого стафилококка St. aureus для получения биологически активного протеина А;
- усовершенствование предварительной, тонкой и стерилизующей фильтрации биологических растворов (питательных сред, раствора трипсина, сыворотки крови и других) с помощью фильтровальных материалов на безасбестовой основе;
- совершенствование процессов микрофильтрации и ультрафильтрации в биопромышленности с использованием современных фильтровальных материалов и оборудования;
- технология обессоливания альбумина с помощью электродиализа в условиях промышленного производства.
ичный вклад автора заключается в формулировании проблемы, постановке целей и задач исследований, решении поставленных задач, планировании эксперимента и выполнении исследований, обобщении результатов и использовании их в практике.
Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены:
- на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИТИБП (1980-2009 гг.) в виде ежегодных отчетов по заданиям научно-технической программы (НТП) (1980-2009 гг.), фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса (АПК) Российской Федерации (РФ) на 2006-2010 гг.;
- на 23 Всесоюзных, Республиканских, Международных и Всероссийских, совещаниях, семинарах, конференциях, посвященных научным и практическим проблемам технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов и биотехнологии, проводившихся в Москве, Владимире, Щелкове, Волжске, Курске, Сергиев-Посаде, Покрове, Краснодаре, (1981-2009 гг.);
- на секции УВетеринарная биотехнологияФ (2011 г).
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 71 научной работе, в том числе 11 в рецензируемых изданиях, входящих в перечень ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов докторской диссертации. Получено 6 авторских свидетельства и патентов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 292 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты, выводы и практические предложения, приложения, содержит 40 таблиц и 52 рисунка. Список литературы включает 457 наименований, из которых 358 отечественных и 99 зарубежных. В приложении представлены копии документов, подтверждающие достоверность работы, ее научную и практическую значимость.
Автор выражает признательность академику РАСХН А.Я. Самуйленко за научно-методическую помощь в организации и проведении исследований.
Искреннюю благодарность за руководство НИР и ОКР автор приносит А.И. Гуславскому, Е.Э. Школьникову, В.П. Гайденко, Б.В. Соловьеву, И.Н. Матвеевой, а также В.А. Лукиной, В.С. Иванову, Е.А. Рубану.
Практическую и консультативную помощь в выполнении некоторых разделов диссертации оказывали сотрудники института Н.И. Гвозденко, Н.М. Пухова, Л.А. Скороходова, В.Н. Егорова, А.А. Раевский, А.А.Потемкин, В.Н. Качалов, Е.И. Ярыгина, Е.П. Сапегина, Ю.Д. Фролов, В.Н. Еремец, Л.В. Анисимова, С.М. Панферова, Н.И. Назаркина, И.Б. Пивикова, А.Б Абрамов, В.Е. Васько, М.А. Фролова, а также сотрудники ВГНКИ В.Т. Ночевный, Н.А. Башашкина, Ставропольской биофабрики - А.П. Сурмило, НПО порошковой металлургии - М.П. Анащенко, ВНИИ ЦБП - А.В. Канарский.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2. 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена в 1980-2010 гг. согласно планам НИР и ОКР ГНУ ВНИТИБП в соответствии с отраслевыми научными программами, в рамках Российской научно-технической программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации.
Экспериментальные исследования осуществляли в лабораториях и отделах института, во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ВГНКИ). Практическую реализацию научно-исследовательских разработок осуществляли на Щелковском, Омском и Алма-Атинском биокомбинатах, Ставропольской, Курской, Краснодарской биофабриках, НПО УСинтезФ (г. Курган).
2.1. 1. Материалы
Питательные среды и растворы. В работе использовали культуральные среды Игла, 199, гидролизат лактальбумина; растворы Хенкса и Эрла; трипсин импортного (УDifkoФ, УFerakУ, УMerkУ) и отечественного производства ТУ 9358013.00008064Ц96; сыворотки крупного рогатого скота (КРС), овец; защитные среды: сахарозо-альбуминовую (СФГА) и сахарозо-желатозную (СФГЖ); разбавитель вируса и раствор концентрата разбавителя для противовирусных вакцин (ТУ 9384-001-93840700-00).
Для изготовления вакцины против лептоспироза животных применяли питательную среду ГНКИ, в которой использовали альбуминовую фракцию сыворотки крови овец; для культивирования Staphylococсus aureus - бульон Хоттингера и мясопептонный бульон (МПБ).
Культуры клеток. В экспериментах использовали первичные культуры клеток (ПКК) различного происхождения - почек крольчат (ПК), щенков (ПЩ), кошек (ПКШ), эмбрионов коров (ПЭК), фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) и перепелов (ФЭП); а также перевиваемые линии клеток: почки сирийского хомячка (ВНК-21), почки теленка (ПТ-80), почки крупного рогатого скота (MDBK), почки собаки (MDCK), почки свиньи (СПЭВ) (Ночевный В.Т., Башашкина Н.А., 1996-1999).
В качестве доноров были взяты: 1-4 - недельные крольчата, 1-2 - месячные щенки и котята, 3-9 - месячные эмбрионы коров, 6-10 - дневные перепелиные и 6-14 - дневные куриные эмбрионы.
Вирусы. Оценивали чувствительность тест-культур клеток к вирусам болезни Ауески (ВБА) штамма БУК-682, парагриппа -3 (ПГ-3) - штамма МВА 1/44, инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота - штамма МВА 1/80, энтерита собак (ПВЭС) - штамма С и Д, болезни Марека, вируса герпеса индеек (ВГИ) - штамма ФС-126, инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц - штамма УБио-92Ф, чумы плотоядных - штамма (ЭЛМ). Работы проводилась совместно с ВГНКИ.
Staphylococсus aureus (St. aureus). Штамм золотистого стафилококка А-676 использовали для выделения протеина А (Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича).
Микрофильтрационные мембраны УВладипорФ, изготовленные из ацетатацеллюлозы и регенерированной целлюлозы - МФА-А с размером пор 0,2-0,5 мкм, МФА-МА (0,2-0,5 мкм) и МФЦ (0,15; 0,2; 0,45 мкм), а также капроновые мембраны УМифиФ производства АН Белорусской ССР (г. Минск) и г. Таллин (5,0; 3,0 и 0,2 мкм), мембраны фирм УMilliporФ и УPallФ (0,45 и 0,22 мкм и микропористые ядерные фильтры (от 0,03 до 8 мкм) использовали для очистки биологических жидкостей и растворов.
Ультрафильтрационные мембраны УАМ-50, 100, 150, 200, 300, 500 с диаметром пор - 0,005; 0,01; 0,015; 0,02; 0,03; 0,05 мкм (ацетат целлюлозы) и полупроницаемые мембраны в виде полых волокон типа ВПУ-5ПА, ВПУ-15ПА, ВПУ-50ПА, ВПУ-100ПА из полиамида с пределом задержания по белку 5, 15, 50, 100 кДа применяли для очистки и концентрирования биологически активных веществ.
Глубинные фильтры. При фильтровании биологических жидкостей применяли материалы на безасбестовой основе в виде пластин и картона: - фильтр-пластины - ФП (предварительной очистки), ФТ (тонкой очистки), ФC (стерилизующие), ФД (для удаления пирогенов) и картон КФМП и КФБЖ, разработанные по нашим техническим требованиям Марийским филиалом Волжского научно-исследовательского института целлюлозно-бумажной промышленности для медико-биологических целей (Канарский А.В., 2000).
Ионообменные мембраны. В работе применяли катионитовые мембраны МК-40 и анионитовые мембраны МА-41 из полиэтилена и ионитов.
Полимерные композиции. Сополимеры винилиденфторида и гексафторпропилена (фторкаучуки СКФ-26) и винилиденфторида и перфторметилвинилового эфира (СКФ-260) использовали для получения полимерных композиций и при иммобилизации трипсина; и кремнийорганические фторсилоксановые каучуки CКТФТ-100, CКТФТ-50.
2.1.2. Оборудование
Оборудование для культивирования клеток, вирусов, микроорганизмов и ферментов. Для получения первичных культур клеток и выращивания вирусов использовали роллерные аппараты. Монослойное культивирование клеток осуществляли на многотрубчатом культиваторе V=0,006 м3 в отделе вирусологии и культур клеток. Культивирование клеток и вирусов в суспензии и на микроносителях осуществляли в спиннере объемом 0,001 м3 и ферментерах (биореакторах) объемом 0,005; 0,025; 0,1; 0,25 м3, разработанных ГНУ ВНИТИБП и Иркутским НИИХМ, выполненных из нержавеющей стали, оснащенных магнитным приводом / Гуславский А.И./, датчиками температуры, рН, еН, рО2 /Рубан Е.А., Раевский А.А., Абрамов А.Б., Потемкин А.А./.
В технологической обвязке использовали запорную, запорно-регулирующую арматуру (малогабаритные вентили сильфонные проходные МВСП и угловые вентили МВСУ, разработанные ЦКБарматуростроения; электроисполнительные механизмы ЭИМ и запорные клапаны с электромагнитным приводом ПТ 26525, разработанные ВНИИэлектропривод и ЦКБарматуры по технико-экономическим требованиям ГНУ ВНИТИБП и изготовленные ПО ФПензтяжпромарматураУ). Для очистки, стерилизации и обезвреживания отработанных газов использовали фильтры предварительной и тонкой очистки с фильтроэлементами диаметром 46; 75; 90; 120 мм из фторопласта - 4 и титана (с диаметром пор 12-20 мкм и 2-6 мкм).
Глубинное культивирование штамма St. aureus, применяемого для выделения протеина А, проводили в лабораторном биореакторе АК-210 (объемом 0,01м3), с автоматическим контролем и регулированием температуры, скорости перемешивания, аэрации, рН.
При получении трипсина использовали следующее оборудование: электромясорубку МП, эмалированные и нержавеющие реакторы (объемом 0,060-1,0м3), нутч-фильтры, центрифуги (осадительно-фильтрующие ОФСст 0,1 и 0,2 м3/час; суперцентрифугу ОТР-101К; шнековую ОГШ), саморазгружающиеся и камерные сепараторы. Сушку фермента проводили на распылительных установках РСЦ 1,2/09 БК РСЦ-10 и УМинорФ фирмы УНиро-АтомайзерФ и сублимационных - ТГ-15, ТГ-50.
Оборудование для фильтрования и разделения. Для тонкого и стерилизующего фильтрования водных растворов, биологических жидкостей, питательных сред, ферментных растворов с помощью мембранных фильтров использовали фильтродержатели диаметром 90, 142, 293 мм и мультиплетную установку УСФ-0,28/7. Мембранное разделение различных растворов осуществляли на фильтрационных ячейках ФМ-02 объемом 10, 200, 1000 мл с магнитной мешалкой, тонкоканальной установке ФТ-01, опытной ультрафильтрационной установке Уфильтр-прессФ УФ-5, и ультрафильтрационных разделительных модулях на полых волокнах фирмы Мем-Текс (РФ г. Мытищи): УВА-2-5ПА, УВА-2-15ПА, УВА-2-50ПА, УВА-2-100ПА и модифицированной установке УФУ с центробежным насосом марки ЦНГ-0,5/10. Электродиализатор типа ЭК-04-74 с ионообменными мембранами (катионитовыми МК-40 и анионитовыми МА-41) использовали при обессоливании альбумина в производственных условиях. При электродиализе происходит перенос ионов из одного раствора в другой через ионообменные мембраны. Движущей силой процесса является внешнее электрическое поле. Катионы двигаются к катоду, а анионы к аноду. Постоянный ток, проходящий через раствор, устанавливается в зависимости от природы растворенных веществ, их концентрации и подведенного напряжения.
Для разделения культуральных жидкостей, выделения клеток, вирусов, ферментов, сбора осадка, белка из надосадочной жидкости, осветления суспензий применяли различные центрифуги и сепараторы: S-23, S-24, S-70; ОФСст- 0,1; ОФСст- 0,2; ОТР-101К; сепаратор Ж5-АСГ-3М (Гуславский А.И.).
2.1.3. Методы
Методы культивирования клеток и вирусов. Пролиферативную активность клеточных культур оценивали с помощью индекса пролиферации. Концентрацию клеток определяли путем их подсчета в камере Горяева. Жизнеспособность клеток в суспензии выражали в процентом соотношении к общему количеству клеток. Титр вируса ВГИ определяли по количеству фокусообразующих единиц в 1 см3, титр вируса ИББ по методу Кербера (1931) в модификации Ашмарина И.П. (1959).
Методы контроля фермента. Физико-химические свойства трипсина определяли по ГОСТ 202642-89. Наличие фермента в суспензии осуществляли экспресс-методом на фотопленке; протеолитическую активность - по РСТ ЛССР 424-84 ТУ ОКП 921.828.1500 и ТУ 9358.013.00008064-96 - по Шоу-Петиколас. Диспергирующие свойства трипсина на тест-культуре клеток ФЭК оценивали по выходу клеток из 1 г, жизнеспособности, адгезивным и ростовым свойствам (урожаю, УК и индексу пролиферации, ИП).
Физико-механические свойства полимерных композиций. Свойства полимерных вулканизатов в исходном состоянии и после теплового старения определяли по ГОСТ 9024-74 и ГОСТ 9.029-74.
Статистическая обработка результатов. При статистической обработке экспериментальных результатов использовали метод регрессивного анализа. Достоверность результатов оценивали по критерию Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1980). Результаты считали достоверными при Р < 0,05.
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Производство биопрепаратов представляет собой комплекс взаимосвязанных биотехнологических процессов: приготовление компонентов среды и ее изготовление, получение фермента и его раствора для дезагрегации культур тканей; культивирование (клеток, вирусов и бактерий); выделение и очистка биологических растворов, питательных сред и растворов; сушка биопрепаратов. В связи с этим рассматривались вопросы получения отечественного ферментного препарата трипсина для вирусологических целей, процессы культивирования клеток при получении вирусных вакцин, осуществления крупномасштабного культивирования в стерильных условиях; получения бактерийной массы для получения протеина А, разработки мембранных способов очистки, разделения, концентрирования и стерилизации при использовании отечественного оборудования и материалов.
2.2.1. Усовершенствование технологии получения
фермента трипсина
2.2.1. 1. Разработка технологических процессов изготовления трипсина
В производстве противовирусных вакцин для дезинтеграции клеток используется протеолитический фермент трипсин, в основном импортного производства. Нами проведены исследования по разработке технологии получения фермента отечественного производства. Для этого необходимо было решить комплекс задач, таких как выделение, разделение и очистка фермента, его консервация, оценка физико-химических и биологических свойств. В качестве исходного сырья при получении фермента использовали поджелудочную железу (ПЖ) крупного рогатого скота (КРС), свиньи и птиц. ПЖ КРС была наиболее технологична. Исходное сырье использовали после 4-12 месяцев хранения, обеспечивающее активацию профермента трипсина. Двукратное замораживание, оттаивание и последующее измельчение ПЖ до частиц размером 8 мм, разрушающие клеточные оболочки ткани, исключали образование устойчивой суспензии и способствовали полному выделению фермента из исходного сырья и увеличению активности препарата на 40 ЕД (22-27%) по сравнению с сильно измельченной железой ( до частиц 2 мм). Максимальную активность фермента получали через 6 час экстрагирования и 12 час отстоя на первой стадии и в течение 2-3 час экстрагирования на второй стадии. Перемешивание суспензии в процессе экстрагирования проводили в автоматическом режиме (3 мин - перемешивание, 7 мин - простой), обеспечивающее незначительное пенообразование и исключающее получение устойчивой суспензии. Экстрагирование фермента проводили при температуре не выше 16оС, так как при более высокой температуре наблюдается инактивация и самопереваривание трипсина. Снижение температуры суспензии до 7+2 оС позволило получить препарат с максимально высокой активностью. РН на 1 этапе экстрагирования составлял 3,1 - 3,35, а на 2 этапе - 1,7 - 2,0. При осаждении балластных веществ в течение 6 час выход составил 9,5% от объединенного экстракта и 30% от исходного сырья. Выход балластных веществ в сухом виде составил 11% от его общей массы и 2,3% от исходного сырья. После 12-18 час второго этапа высаливания выход трипсина по отношению к фильтрату после удаления балластных веществ составил 2-2,5%. Процент выхода трипсина от исходного сырья колебался от 2,5% до 6%. В сухом виде выход фермента составил 60-80% от осажденного субстрата и 2,5-3,5% от массы исходного сырья.
Проведенные исследования позволили рекомендовать для разделения суспензии после экстрагирования следующее оборудование с учетом массы исходного сырья: до 70 кг - центрифуги ОФСст; от 70 до 100 кг - центрифуги Рапид, ОФСст, от 100 и более - шнековую центрифугу ОГШ отдельно или совместно с центрифугой ОФСст для последующего осветления фильтрата. При разделении суспензии после высаливания балластных веществ и трипсина использовали следующее оборудование: 20-50 кг - центрифугу ОФСст, 20-100 кг - суперцентрифугу ОТР-101К, более 100 кг - сепараторы для отделения балластных веществ и трипсина, и суперцентрифугу для извлечения трипсина после осаждения. Протеолитическая активность препарата после разделения суспензии с помощью центрифуг была на 20-40% выше, чем при использовании обычного фильтрования, при этом снизились потери, и улучшилось качество готового препарата. Кроме того, в 2-3 раза уменьшились затраты рабочего времени и количество обслуживающего персонала.
Остаточное содержание солей в высоле трипсина составляло 30-50%, удаление которых проводили с помощью ультрафильтрационных установок на полых полупроницаемых волокнах из полиамида при диафильтрации, что позволило в 6-7 раз снизить количество сульфата аммония до 3-5 %, при необходимости до полного обессоливания.
В связи с термолабильностью ферментного препарата изучали возможные способы его консервации при использовании различных методов высушивания и влияние их на ферментативную активность трипсина (табл.1).
Таблица 1
Сравнительная оценка влияния методов высушивания на
ферментативную активность трипсина
n=3
Метод высушивания | Температура высушивания, 0С | Время сушки, ч | Характеристика препарата | ||
на входе | на выходе | Массовая доля влаги,% | Активность, ЕД | ||
Распылительный | 130-140 | 60-75 | 2 | 1,56+0,37 | 443+28,6 |
Сублимационный | -40 | 30 | 30 | 2,30+0,24 | 455+9,0 |
Кондуктивный (калориферный) | 35-37 | 24-30 | 4,25+1,11 | 232+17,6 | |
Конвективный | 35-37 | 24-30 | 3,85+0,82 | 294+25,0 | |
Нативный препарат, контроль | - | - | - | 50,00+3,24 | 492+26,2 |
Результаты проведенных исследований по выбору метода высушивания конечного продукта показали, что кондуктивный и конвективный методы длительны и требуют дополнительных технологических операций измельчения и просеивания трипсина, кроме того кондуктивный метод повышает вероятность обсеменения фермента. Наиболее эффективным по производительности и экономичности для больших объемов является метод распылительного высушивания, позволяющий получить тонкодисперсный порошок трипсина, содержащий не более 3% массовой доли влаги, с активностью близкой к нативной форме трипсина, альтернативным для небольших партий - сублимационный метод. Преимуществом этих двух способов является получение трипсина с высокой протеолитической активностью, низкой массовой долей влаги, не требующих измельчения и просеивания ферментного препарата. Полученный трипсин соответствовал требованиям ТУ9358-013-00008064-96: протеолитическая активность не ниже 150 ЕД по Шоу-Петиколас; массовая доля влаги не более 3 %, значение буфера - 7,4 при растворении образца фермента; значение мутности не фильтрованного раствора не более 6,5х10-3 1/см или не более 0,05 ЕД оптической плотности (ОП); выход клеток из 1 г ткани КЭ в пределах 150-215 млн клеток при 90-96% жизнеспособности. Серия трипсина для получения культур клеток считают активной и нетоксичной, если изготовленный из него 0,25% раствор обеспечивает дезагрегацию и выход из 1 г ткани не менее 90 млн. клеток с жизнеспособностью не ниже 90%, без признаков дегенерации клеток в культуре.
2.2.1. 2. Разработка технологической линии промышленного
производства трипсина
Нами разработана технологическая линия промышленного производства трипсина, включающая эффективное современное оборудование: реакторы с автоматическим перемешиванием суспензии и регулированием температурного режима, оборудование для разделения суспензии после экстрагирования и высаливания, оборудование для высушивания конечного продукта. За счет применения современной техники обеспечен наиболее высокий уровень механизации, автоматизации процессов, что способствовало получению более активного трипсина, повышению производительности труда. Предполагаемый экономический эффект от организации производства трипсина сухого (ТС) для вирусологических целей на 1000 кг в год равен 118 млн. руб.
Освоение технологии изготовления трипсина проводили в ГНУ ВНИТИБП и НПО УСинтезФ (г. Курган), на Алма-Атинском и Омском биокомбинатах. Опытно-промышленные серии трипсина использованы для получения культур клеток при изготовлении вакцин против болезни Марека, чумы плотоядных, болезни Ауески и трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Пригодность опытно-промышленных серий трипсина для получения культур клеток противовирусных препаратов была подтверждена на Омском, Алма-Атинском биокомбинатах и Курской биофабрике.
2.2.1.3. Использование трипсина при культивировании клеток в производстве противовирусных вакцин
Опытно-промышленные образцы фермента проверялись при культивировании на широком спектре культур клеток совместно с сотрудниками ВГНКИ и на биопредприятиях. Установлена эффективность использования трипсина для получения различных видов первичных культур клеток (выход клеток с 1 г. ткани для ФЭК, ПЭК, ТБ, ПКЩ, ПЩ, ПК составил 137,2; 72; 166; 93,5; 57; 121 млн.кл. соответственно) и перевиваемых культур клеток MDBK, MDCK, СПЭВ.
Клеточные культуры, изготовленные с использованием растворов опытно-промышленных серий трипсина, по чувствительности и уровню накопления вирусов: штаммов: - БУК-628 вируса болезни Ауески; МВА 1/77 вируса парагриппа-3 (ПГ-3); МВА 1/80 вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота, штаммы С и Д парвовирусного энтерита собак (ПВЭС), по морфологии и срокам проявления ЦПД были сходны с контрольными культурами клеток (Дифко), что говорит о равноценности и перспективности растворов фермента для практического использования.
Трипсин был испытан на Омском биокомбинате для диспергирования ткани перепелиных эмбрионов (ПЭ) при получении культуры клеток ФЭП и вакцины против болезни Марека из штамма ФС-126 герпеса индеек. Фермент обладал равной с контролем диспергирующей активностью в отношении ткани ПЭ и обеспечивал выход 45,8-68,9 млн. кл/г, равноценный контролю, с жизнеспособностью клеток 95-97%. Опытные и контрольные культуры клеток ФЭП характеризовались равноценной чувствительностью и были пригодными для получения штамма УЭПМФ вируса чумы плотоядных в производственных условиях.
Таким образом, отечественный фермент трипсин, полученный по усовершенствованной технологии, пригоден для культивирования клеток и вирусов и не уступает по эффективности импортному препарату.
2.2.2. Разработка и применение полимерных композиций в
технологии производства биопрепаратов
2.2.2. 1. Разработка способа иммобилизации трипсина
на полимерном носителе
Для консервации трипсина, с целью сохранения его диспергирующих свойств и протеолитической активности, нами разработан способ иммобилизации на фторсодержащем полимерном носителе (СКФ-26 и СКФ-260 ВРТ) с высокой химической, биологической стойкостью и инертностью (табл. 2).
Таблица 2
Влияние иммобилизованного трипсина на получение клеточных культур n=5
N | Наименование фермента | Наименование носителя | Протеолитическая активность, ЕД | ПЭ | КЭ | ||
Выход клеток с 1 г. ткани млн. | Жизнеспособность клеток, % | Выход клеток с 1 г. ткани млн. | Жизнеспособно сть клеток, % | ||||
I | Нативный трипсин | 235 | 85 | 96 | 120 | 97 | |
II | Иммобилизованный трипсин | СКФ-26 | 235 | 125 | 97 | 150 | 97 |
СКФ-260ВРТ | 235 | 145 | 96 | 160 | 97 | ||
Испытания иммобилизованного фермента на полимерном носителе в качестве диспергирующего агента показали возможность использования его при дезагрегации тканей перепелиных и куриных эмбрионов (ПЭ и КЭ), выход клеток с единицы ткани превышал уровень контроля. Полученные клетки были жизнеспособны при монослойном культивировании. При соблюдении стерильности рост клеток КЭ был выше уровня контроля на 25-33%, а рост клеток ПЭ на 47-70%.
Таким образом, разработан способ иммобилизации трипсина на полимерном носителе, обеспечивающий сохранение свойств фермента, его протеолитическую и диспергирующую активность. Жизнеспособность клеток, полученных с использованием иммобилизованного фермента, была на уровне контроля, а выход клеток с единицы ткани превышал его.
2.2.2. 2. Разработка полимерных материалов для
биотехнологического оборудования
Полимеры с повышенной термической стабильностью, химической стойкостью и биологической инертностью, такие как фторкаучуки, использовали не только как носители при иммобилизации протеолитического фермента трипсина, но и как конструкционные материалы для биологического оборудования (авторские свидетельства: № 701129, УРезиновая смесь на основе фторуглеродных каучуковФ, бюл. - 1979. - № 44. - С.193.; № 770126, УРезиновая смесь на основе фторкаучукаФ, бюл. - 1980. - № 37. - С.308; № 783311, УРезиновая композиция на основе сополимера винилиденфторидаФ, бюл. - 1980. - № 44. - С.110).
Испытание деформационных свойств полимеров при длительном старении в течение 502 сут. при комнатной температуре показало, что накопление остаточной деформации у фторуглеродной резины составляло - 16 %, у силиконовой резины - 23 - 25 % (в зависимости от наполнения). Высокая сопротивляемость полимеров при 20% сжатии позволила рекомендовать их для уплотнительных и герметизирующих изделий.
В результате проведенных исследований были разработаны новые полимерные материалы, обладающие теплостойкостью, агрессивостойкостью, инертностью на основе фторкаучука СКФ-26 и СКФ-260 Д. Технологичность фтористых резиновых смесей улучшали при использовании совмещенных композиций с фторсиликоновыми смесями и олигомерными фторсодержащими соединениями, обладающими повышенной теплостойкостью при 200оС. Потеря массы при вуланизации у этих композиций составляли 4-2%. Усадка изделий была 2-1,5 %, в то время как у контрольной смеси с дибутилсебацинатом потери массы и усадка составили соответственно 12% и 10%. Применение совмещенных композиций на основе фторкаучуков и фтосиликоновых смесей, фторсодержащего пластификатора обеспечивало вулканизацию под давлением в прессе, в котле и в воздушной среде термостата или в трубе агрегата непрерывной вулканизации, с последующим термостатированием. В качестве совулканизата бифургина или его замены были предложены новые вулканизующие агенты: производные дитиомочевины и соединение 1,4 бис (2-меркаптобензтиазолилметилен) - пиперазина, позволяющие получать теплостойкие материалы. Для уплотнительных прокладок нами были разработаны пресс-формы, изготовленные на Ставропольском ОЗТО и испытанные во ВНИТИБП и Щелковском биокомбинате.
2.2.2.3. Определение токсичности полимерных материалов с использованием микроорганизмов и на культуре клеток
Разработка и применение конструкций и материалов, обеспечивающих стерильные условия культивирования клеток и микроорганизмов, являются важной задачей биотехнологии. Используемые при этом полимерные материалы должны быть не только прочными, устойчивыми к моющим средствам, химическим реагентам, температурным воздействиям, но и быть инертными. В связи с этим определение токсичности материалов необходимо для их оценки при конструировании технологического оборудования.
Определение токсичности с использованием микроорганизмов. Нами предложен метод определения токсичности полимерных материалов с использованием микроорганизмов. Испытания проводились в лаборатории микробиологии (Анисимова Л.В., Сапегина Е.П., Никитина Р.А, 1984) на культуре Pasteurella multocida, 2 авирулентный (пастеровский) штамм. Установлено, что резина на основе силиконового каучука, совмещенная композиция фторкаучука и фторсиликоновой смеси и резина на основе фторкаучука не оказывали ингибирующего действия на рост микроорганизмов Pasteurella multocida и могут быть использованы в конструкционных узлах технологического оборудования при производстве противобактерийных препаратов.
Определение токсичности на культуре клеток. Наряду с вышеуказанным методом проводили испытание токсичности полимеров на культуре клеток. Для оценки токсичности резиновых изделий использовали культуру клеток ПТ-80. Исследования проводили совместно с сотрудниками лаборатории культур клеток (Гвозденко Н.И., Пухова Н.М., Соловьев Б.В., 1990). Высокий прирост клеток был получен при испытании резин на основе силиконового каучука, совмещенной композиции фторкаучука и фторсиликоновой смеси и резины на основе фторкаучука. Клетки не прикреплялись к стеклу или формировали редкие очаги роста в случае использования токсичных материалов. Метод определения токсичности полимеров исключает использование животных, уменьшает трудозатраты и время проведения опытов.
2.2.3. Усовершенствование способов культивирования клеток при культивировании вирусов
В практике существуют несколько способов получения культур клеток для противовирусных препаратов, среди них: стационарный, динамичный, суспензионный и псевдосуспензионный на микроносителях. Использование роллерных аппаратов при монослойном культивировании клеток, особенно для первичных культур, позволяет экономить потребление питательной среды по сравнению со стационарным способом.
Для совершенствования монослойного культивирования клеток проведены испытания многотрубчатого культиватора V=0,006 м3 с использованием технологической обвязки биореактора. Технологическая обвязка к аппарату включала линии подачи, очистки, стерилизации газовой смеси и отвода отработанных газов; подачи пара; термостатирования и поддержания температурного режима в биореакторе; подачи компонентов (питательной среды, засевной культуральной жидкости) и обеспечивала контролируемый и управляемый процесс культивирования клеток в отличие от роллерной технологии. Первичные клетки куриных и перепелиных эмбрионов росли не только на внутренней, но и на внешней поверхности стеклянных трубок аппарата.
Увеличение площади ростовой поверхности клеток обеспечивалось также с помощью микроносителей, суспензируемых в питательной среде (псевдосуспензии), что способствовало регулированию и поддержанию параметров культивирования, получению однородной культуры и осуществлению контроля качества культуры и выхода клеточной биомассы. При культивировании клеток на микроносителях (МН) в биореакторе объемом 0,005 м3 установлено влияние режимов перемешивания на адсорбцию клеток к поверхности микроносителя, определен тип мешалки. Перемешивание микроносителя (акрилекса) проводили трехлопастной мешалкой с углом поворота лопастей 90о и 45о, а также шестилопастной турбинной мешалкой. Равномерному распределению микроносителя способствовало использование трехлопастной мешалки с углом поворота лопастей =90о при скорости перемешивания от 40 до 60 об/мин. При 80 об/мин распределение МН такое же, как при 40 об/мин. Клетки, снятые с микроносителя, являлись посевным материалом для 0,025 м3 реактора. Установлена оптимальная посевная концентрация клеток ПТ-80 на микроносителях (8-12 кл/МН). Равномерное распределение клеток после 3 час адсорбции наблюдали при концентрации 10-12 кл/МН, что позволило достичь 95% прикрепления клеток к микроносителю. Полученные результаты были взяты за основу при разработке культивирования клеток ФЭП и ФЭК псевдосуспензионным способом.
Концентрация клеток ПТ-80 в суспензии при скорости перемешивания 40 об/мин и 60 об/мин трехлопастной мешалкой с углом поворота =90 о изменялась незначительно и увеличивалась при 80 об/мин, процент мертвых клеток ПТ-80 при этом снижался на 12 - 15%.
Для осуществления суспензионного культивирования клеток в реакторах (объемом 0,005; 0,025; 0,1; 0,25 м3) разработана технологическая обвязка. Конструкция биореакторов имела вводы для датчиков контроля параметров процесса (рН, еН, рО2, tоC). При культивировании в биореакторе объемом 0,005м3 температурный режим культивирования обеспечивали системой термостатирования, а снабжение СО2 и воздухом осуществляли с помощью аппарата управляемой подачи газовой фазы (УПГФ).
Суспензионное культивирование клеток ВНК-21/13 в биореакторе (0,005м3) проводили в питательной среде Игла + 199 (1:1) с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота (10%) при посевной концентрации клеток 100000 кл/мл. Перемешивание суспензии осуществляли с помощью трехлопастной мешалки с углом поворота =90о со скоростью 220 об/мин. В результате получено максимальное накопление клеток после 67 час культивирования, процент мертвых клеток при этом составил 2%, а индекс пролиферации - 4,5.
Применение отъемно - доливного способа позволило продлить процесс деления клеток в суспензии. В процессе суспензионного культивирования ВНК-21/13 первый цикл длился 72 час, затем добавляли свежую порцию среды с сывороткой крови крупного рогатого скота (КРС) 10% в фазе логарифмического роста культуры. Второй цикл длился 71 час, а третий цикл после замены среды с сывороткой (10%) - 40 час. Индекс пролиферации в первом цикле составил 4,5; во втором - 4,2 и в третьем - 1,6.
Наряду с использованием среды Игла и 199 (1:1) применяли также питательную среду на основе мышечного гидролизата (рис. 1).
а) б)
Рис. 1. Суспензионное культивирование клеток ВНК-21/13 при использовании мышечного гидролизата:
а) - концентрация живых клеток в мл суспензии;
б) - процентное содержание мертвых клеток в мл суспензии.
Суспензионное культивирование клеток ВНК-21/13 в питательной среде мышечного гидролизата повысило индекс пролиферации до 7,4. После 67 час культивирования добавляли свежую питательную среду в объеме 1 л, и продолжали процесс культивирования до получения индекса пролиферации клеток 7,4. Процесс культивирования клеток проводили при поддержании постоянной температуры (37+0,1)Со; рН 7,0-7,2+ 0,1; концентрации рО2 9-17% (32-96 мм.рт.ст.), при регулировании объемной доли СО2 5-7 % во входящем газе и еН (+75 до +10мв), осуществляли контроль питательной среды и отобранных проб на МПБ, МПА, агаре Сабуро.
При культивировании в биореакторах использовали фильтры в виде фильтроэлементов из фторопласта и титана с диаметром пор 12-20 мкм и 2-6 мкм. Испытание разработанных фильтров показало, что срок службы титановых фильтроэлементов, обладающих устойчивостью к деформациям, был в 1,5-2 раза больше, чем фторопластовых. Для обеспечения стерильности процессов культивирования клеток использовали полимерные теплостойкие материалы в качестве уплотнительных изделий в реакторах и технологической обвязке.
В технологической обвязке биореакторов объемом 0,025; 0,1 и 0,25 м3 применена малогабаритная запорная арматура: вентили МВСП и МВСУ и запорные клапаны с электромагнитным приводом, которые позволили уменьшить в 2 раза габариты и в 8-10 раз вес арматуры по сравнению с серийными вентилями. Технологическая обвязка, состоящая из системы очистки поступающих и отходящих газов, термостатирования, подачи необходимых компонентов (питательной среды, засевного инокулята, титрантов), позволила осуществить культивирование клеток в биореакторах суспензионным и псевдосуспензионным способами при управлении процессом.
Полученные клеток ПТ-80 использовали при разработке биореакторной технологии получения вирусов ИРТ и ПГ-3 в псевдосуспензии (на микроносителях) и конструировании инактивированных вакцин и диагностических препаратов (Иванов В.С., Пухова Н.М., Васько В.Е.). Применение клеток ВНК-21/13 привело к повышению инфекционности вируса ИРТ в 10 раз, а иммуногенности в 3-4 раза, но репродуцированный вирус в монослое клеток ПТ-80 обладал большей активностью, чем вирус, полученный в клетках ВНК-21/13. Суспензионное культивирование клеток ВНК-21/13 было использовано при производстве инактивированной вакцины против бешенства из штамма Щелково-51 (Иванов В.С.).
Разработана технологическая схема культивирования клеток и вирусов, включающая технологические модули с аппаратами для культивирования клеток (объемом 0,005 м3; 0,025; 0,100; 0,250 м3) и вирусов (0,630 м3), а также технологический модуль с аппаратом для приготовления питательной среды (0,250м3), емкости для приготовления моющего раствора (1000м3) и емкости для обезвреживания отработанных жидкостей (1000м3).
Таким образом, нами впервые в производстве ветеринарных препаратов осуществлено культивирование клеток ПТ-80 и ВНК-21/13 в суспензии и псевдосуспензии на микроносителях при культивировании вирусов ИРТ и ПГ-3 с использованием специальных биореакторов, разработанных ВНИТИБП и ИркутскНИИхиммашем. В конструкции реакторов были предусмотрены вводы в среду культивирования датчиков контроля параметров процесса (рН, еН, рО2, tоC). Аппараты оснащены рубашкой для термостатирования и стерилизации, трубой передавливания и перемешивающим устройством с приводом мешалки через магнитную муфту, обеспечивающей герметичность узла в зоне привода. Для осуществления процесса культивирования в реакторах разработана технологическая обвязка. Использование малогабаритной запорной и регулирующей арматуры, а также фильтров из пористого титана для очистки и стерилизации воздуха, применение уплотнительных изделий из теплостойких материалов, выдерживающих воздействие различных химических сред, позволили обеспечить процесс культивирования клеток и вирусов в стерильных условиях.
Проведенные исследования послужили основой для разработки технологического регламента УКультивирование клеток и вирусов с использованием экспериментальных образцов оборудованияФ и технологической схемы процесса. Использование специализированного оборудования, средств механизации и автоматизации способствовало увеличению выхода продукции при производстве биопрепаратов.
В настоящее время разрабатываемые технологии согласуются с учетом требований международных стандартов ИСО серии 9000:2008 и Правил производства и контроля качества лекарственных средств GMP (ГОСТ Р 52249-2009) с применением аттестованных (валидированных) методов и оборудования.
2.2.4. Усовершенствование способа глубинного культивирования золотистого стафилококка St. aureus для получения протеина А
Глубинное культивирование в реакторе проводили также при получении бактерийной массы, используемой для выделения белка А.
При конструировании иммуносорбентов, диагностических препаратов особый интерес представляет иммобилизация биолиганда через спейсор - протеин А, который встречается у 99% штаммов золотистого стафилококка и составляет 1,7 % сухого веса клетки и 6,7 % веса клеточной стенки (Матвеева И.Н., 2008). В связи с этим осуществляли усовершенствование способа глубинного культивирования золотистого стафилококка St. aureus для получения протеина А.
Культивирование золотистого стафилококка St. aureus проводили в питательной среде на основе бульона Хоттингера и мясопептонного бульона (МПБ) в биореакторе АК-210 объемом 0,01м3. Длительность фазы приспособления культуры золотистого стафилококка St. aureus составила - 0,5-1,5 час, а фазы логарифмического роста - 3,2 - 4,6 час. Максимальная биологическая активность протеина А получена из культуры при сроке культивирования 8 час и посевной дозе 50 млн.кл/мл, скорости перемешивания 100 об/мин, при температуре 37оС, при поддержания рН 7,2 и конечной концентрации St. aureus - 1,9 млрд/мл. Процесс культивирования осуществляли в стерильных условиях, при использовании титановых фильтров для воздуха, системы автоматического контроля и регулирования параметров.
Бактерийную массу золотистого стафилококка инактивировали формалином (10%) или прогреванием при 60оС, 70оС, 80оС в течение 30 мин; и использовали для выделения протеина А после хроматографической очистки. Инактивированная прогреванием клеточная суспензия при ультразвуковой дезинтеграции в течение 10 секунд импульсивно 6 раз, позволила получить биологически активный белок А в количестве - 20 мг. Дезинтеграция же клеточной суспензии, инактивированной формалином, приводила к потере биологической активности белка А. Белок А из клеточной суспензии, инактивированной формалином, извлекали методом солевой экстракции, при этом получали активный препарат, но в небольших количествах (10 мкг).
Использование аффинного сорбента IgG КРС на BrCN-Сефарозе 4B при одноступенчатой обработке дезинтегрированной ультразвуком клеточной суспензии стафилококка, инактивированной прогреванием при 60оС в течение 30 мин, культуральной среды позволило получить протеин А. Анализ чистоты выделенного протеина А показал наличие единственной белковой полосы с ММ 42 кД. Хроматографически чистый протеин А конъюгировали с ферментом пероксидазы и использовали в биотехнологии компонентов диагностических тест-систем.
Таким образом, в результате проведенных исследований усовершенствован способ глубинного культивирования золотистого стафилококка St. aureus в реакторе АК-210 и получен, биологически активный протеин А. Определены, условия культивирования, при этом максимальная концентрация бактериальной массы составила 1,9 млрд. кл/мл. Отработаны методы инактивации культуральной суспензии и дезинтеграции клеток. Установлено, что инактивация клеточной суспензии формалином приводила к потере биологической активности белка А после дезинтеграции ее ультразвуком. Из инактивированной формалином клеточной суспензии протеин А выделяли методом солевой экстракции, но в малых количествах. Активный препарат получали при температурной инактивации клеточной суспензии, ультразвуковая дезинтеграция которой имела минимальные потери, и количество выделенного активного белка А в 20000 раз больше, чем в случае инактивированной формалином клеточной массы. Протеин А использовали для конструирования иммуносорбентов и получения диагностических препаратов.
2.2.5. Усовершенствование технологии различных методов очистки биологических растворов
Применение различных методов очистки при получении питательных сред и растворов для бактерийных и вирусных препаратов необходимо для осуществления культивирования в стерильной среде и повышения качества вакцин. В этой связи проводились исследования по использованию глубинных, мембранных фильтров, оборудования и выбору методов микрофильтрации, ультрафильтрации и электродиализа.
2.2.5.1. Применение материалов на безасбестовой основе для предварительной, тонкой и стерилизующей фильтрации
биологических растворов
При очистке растворов медико-биологического назначения к фильтрующим материалам предъявляются такие требования, как исключение подвижности матрикса, вымывание различных компонентов, в особенности канцерогенных веществ, таких как асбест, что характерно для асбестовых фильтр-пластин. Совместно с сотрудниками ВНИИ ЦБП проведены работы по созданию безасбестовых фильтровальных пластин и картона для фильтрации биологических растворов.
Установлено, что фильтрационные свойства пластин зависели от их состава. Так при увеличении содержания диатомита до 60% в фильтр-пластинах ФП-1 для предварительной очистки по сравнению с композицией (ФП), содержащей 50% этого сорбента, понижало в 4 раза удельную скорость фильтрации воды. Замена в стерилизующих пластинах (ФС) окиси алюминия на диатомит (ФС-1) незначительно снижала скорость прохождения воды, и повышала скорость прохождения сыворотки КРС. Картон марки КФБЖ, КФМП использовали для предварительной фильтрации и в качестве префильтра перед мембранами при очистке желудочного сока, при фильтровании питательных сред, растворов трипсина. Опытные образцы безасбестовых фильтр-пластин размером 200х200 мм, 300х300 мм, 400х400 мм, диаметром 293 мм испытывали по воде, биологическим, солевым и ферментным растворам, питательным средам.
Полученные результаты позволили рекомендовать фильтр-пластины ФП, ФТ, ФС, ФД и картон КФБЖ и КФМП для фильтрования, очистки, стерилизации биологических растворов разного назначения. Фильтровальные виды бумаги и картона освоены на бумажной фабрике (г. Косино, Московской обл.), Красногорском ЭЦБЗ и промышленном производстве ВНИИ ЦБП.
2.2.5.2. Применение микрофильтрации и ультрафильтрации
для очистки биологических растворов
Исследование процессов микрофильтрации. Для получения стерильных питательных сред, растворов трипсина, защитных сред, разбавителей использовали микропористые мембраны отечественного и импортного производства. Максимальную скорость процесса фильтрации наблюдали у комплекта капроновых мембран фирмы Pall. Двухслойные мембраны обладали устойчивостью к стерилизации в автоклаве. На рис. 2 представлена скорость стерилизующей фильтрации различных сред и растворов для вирусных препаратов через микрофильтрационные мембраны в сочетании с префильтрами на безасбестовой основе.
Использование микрофильтрационных мембран в сочетании с префильтрами обеспечило получение стерильных растворов: 3% глютамина, концентрата лактальбумина, защитных сред (СФГА и СФГЖ), концентрата разбавителя и 0,25% раствора трипсина, используемых при культивировании вирусов. Префильтры повышали производительность мембран (с размером пор 0,2 мкм) в 5 раз в процессе фильтрования глютамина 3% и концентрата лактальбумина. При фильтрации защитной среды СФГА производительность мембран возрастала в 4 раза при использовании одного слоя картона КФБЖ и в 7 раз при использовании двух слоев картона между слоями микрофильтрационных мембран. Для объемов до 5 л рекомендуется использовать комбинации КФБЖ и мембраны 0,2 мкм; для больших объемов сочетание КФБЖ + 0,2 мкм + КФБЖ + 0,2 мкм. В качестве префильтра перед стерилизующей мембраной 0,2 мкм при фильтровании защитной среды с желатином использовали микрофильтрационные мембраны большего диаметра пор (0,8 мкм), которые в сравнении с глубинными фильтрами повышали скорость фильтрования. Использование префильтра перед мембраной или между мембранами повышало удельную производительность при микрофильтрации концентрата разбавителя.
Рис. 2. Результаты стерилизующей фильтрации различных сред и растворов через микрофильтрационные мембраны в сочетании с префильтрами на безасбестовой основе:
глютамин 3%, концентрат лактальбумина; защитные среды - СФГА, СФГЖ; концентрат разбавителя; 0,25% раствор трипсина.
При стерилизации растворов трипсина использовали префильтры КФБЖ или КФМП между мембранами 0,8 мкм - 0,45 мкм - 0,2 мкм. Сыворотку крови фильтровали через мембраны с размером пор 0,45 мкм и 0,22 мкм после предварительной фильтрации через глубинные фильтры.
Технология микрофильтрации питательных сред, сывороток, растворов трипсина, в виде защитных сред, концентрата разбавителя вакцины отработана при производстве вакцины против болезни Марека и инфекционной бурсальной болезни птиц. При этом использовали комплект лабораторного стерилизующего фильтрационного оборудования ЛКСФ-1 с набором фильтродержателей диаметром 12, 25, 47, 90, 142, 293 мм и промышленные установки УСФ-293 и УСФ-0,28/7, которые испытывали на инертность и безвредность. После технических доработок, отечественные образцы были рекомендованы для использования при стерилизации питательных сред, сывороток крови, растворов трипсина.
Исследование процессов ультрафильтрации. Для очистки солевого раствора альбумина и его эффективного концентрирования использовали мембраны Владипор УАМ-300 и УАМ-200 (с селективностью по белку 98-99%), которые обеспечивали процесс ультрафильтраци с минимальными потерями белка. По сульфату аммония селективность этих мембран составила 0-2% и 5-10% соответственно. Процесс осуществляли на ячейке ФМ-02, тонкоканальной ультрафильтрационной установке ФТО-01 и рабочем макете аппарата УФ-5. На установке ФТО-01 концентрировали раствор альбумина до содержания белка 40-45%, а на аппарате УФ-5 - до 15%. В условиях производства Ставропольской биофабрики на установке ФТО-01 осуществляли обессоливание раствора альбумина диафильтрацией. Содержание соли в полученном растворе альбумина составляло 0,2% и белка 10%, что соответствовало требованиям инструкции по приготовлению питательной среды для культивирования патогенных лептоспир. Установка ФТО-01 рекомендована для очистки и концентрирования альбумина объемом до 6 л, а УФ-5 для больших объемов (6-10 л). Использование установки ФТО-01 в 4 раза сокращало время обессоливания альбумина, УФ-5 - в 6 раз по сравнению с простым диализом.
Очистку, концентрирование растворов белков, ферментов, вирусных, бактериальных суспензий осуществляли на ультрафильтрационных аппаратах на полых волокнах с целью снижения концентрационной поляризации на мембранах за счет прохождения потока жидкости. На рис. 3 представлен процесс обессоливания и концентрирование раствора трипсина (0,25%) при диафильтрации на ультрафильтрационных аппаратах разных марок.
Рис. 3. Обессоливание и концентрирование раствора трипсина при диафильтрации на ультрафильтрационных аппаратах разных марок.
0,25% раствор трипсина обессоливали на аппарате УВА-2-50 в 6 раз за 1-2 цикла диафильтрацииии через полые волокна ВПУ-50ПА при одновременном концентрировании. Разделительный модуль УВА-2-100 с полыми волокнами ВПУ-100ПА концентрировал фермент на всех циклах диафильтрации при постепенном удалении солей из раствора. Степень концентрирования фермента возрастала с 5 на первом цикле до 7 на четвертом цикле диафильтрации.
Замена системы подачи жидкости центробежным насосом марки ЦНГ-0,5/10 вместо перистальтического позволила эффективно использовать разделительные модули фирмы Мем-Текс типа АР-2 с площадью фильтрации 2 м2 различных марок УВА-2-5ПА, УВА-2-15ПА, УВА-2-50, УВА-2-100 ПА, с полыми волокнами типа ВПУ-5ПА, ВПУ-15, ВПУ-50, ВПУ-100 из полиамида с пределом задержания по белку 5, 15, 50, 100 кДа при очистке ферментных и других биологических растворов.
Метод ультрафильтрации использовали для концентрирования суспензии. вируса чумы плотоядных животных. С помощью ультрафильтрации концентрировали 12 л исходной суспензии в 40 раз за 2 часа, а 6 л вирусной суспензии концентрировали до 100 мл за 4 часа (в 60 раз). Метод ультрафильтрации способствовал концентрированию суспензии в 40-60 раз.
Таким образом, исследование процесса микрофильтрации позволило применить отечественные и импортные мембраны на основе ацетата целлюлозы, регенерированной целлюлозы, нейлона (капрона) и других полимеров, а также использовать оборудование для очистки и стерилизации питательных сред и растворов в производстве биопрепаратов. Усовершенствование метода ультрафильтрации за счет применения тонкоканального и плоскопараллельного аппаратов снизило концентрационную поляризацию на поверхности мембран в процессе очистки альбумина и вирусной суспензии. Ультрафильтрационные аппараты с полупроницаемыми полыми волокнами ускорили процессы фракционного разделения, обессоливания и концентрирования биологических жидкостей.
Разработка технологии очистки и концентрирования биологических растворов в настоящее время реализуется согласно требованиям ГОСТ Р 52249-2009 Правила производства и контроля качества лекарственных средств с применением валидированных методов и оборудования.
2.2.5.3. Применение электродиализа для очистки альбумина
от солей сульфата аммония
При сотрудничестве с Краснодарским государственным университетом (КГУ) и Ставропольской биофабрикой, нами исследована возможность применения электродиализа для обессоливания альбумина. Процесс электродиализа представляет собой направленный массоперенос ионов солей под действием электрического тока.
Работу на технологической электродиализной установке осуществляли в автоматическом циркуляционном режиме при параллельном включении рабочих камер электродиализатора типа ЭК-04-74 (КГУ) и напряжении 75-85В, температуре не выше 35оС. Содержание солей аммония в растворе альбумина после электродиализа не превышало 0,2%, что соответствовало требованиям инструкции на питательную среду для культивирования патогенных лептоспир. Максимальная производительность аппарата по целевому продукту составляла 4,5 л/час, по исходному продукту 8,1 л/час. Электродиализ сократил в 7,2 раза время обессоливания раствора альбумина по сравнению с ранее проводимым диализом.
3. ВЫВОДЫ
1. Усовершенствована технология промышленного производства трипсина с использованием центрифугирования для разделения суспензии после экстрагирования и высаливания фермента; и крупномасштабного способа высушивания методом распыления для больших объемов раствора фермента и сублимационного для небольших партий фермента.
Разработанная промышленная технологическая линия производства трипсина испытана в опытно-промышленных условиях, а полученные партии фермента рекомендованы для использования в производстве противовирусных вакцин.
2. Применение трипсина позволило получить первичные культуры клеток (ФЭК, ФЭП, ПЭК, ТБ, ПК, ПКШ, ПЩ) и перевиваемые линии клеток (MDBK, MDCK, СПЭВ), которые обладали равноценной чувствительностью к вирусам и обеспечивали максимальное их накопление в производстве вакцин против болезни Марека, инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 крупного рогатого скота и парвовирусного энтерита собак. Подтверждена пригодность трипсина при производственном получении культур клеток ФЭП и выращивании штамма ФС-126 вируса герпеса индеек и штамма ЭПМ вируса чумы плотоядных.
3. Разработан способ иммобилизации протеолитического фермента трипсина на полимерном носителе (сополимере винилиденфторида и гексафторпропилена, а также винилиденфторида и перфторметилвинилового эфира). Протеолитическая активность и диспергирующая способность фермента при этом не снижались; клетки ФЭП и ФЭК, полученные с его применением, обладали жизнеспособностью на уровне контроля, а выход клеток превышал значение контрольного опыта.
4. Получены теплостойкие полимерные материалы на основе фторкаучуков (СКФ-26 и СКФ-260Д), совмещенные композиции с фторсиликоновой смесью и фторсодержащим пластификатором, обладающие повышенной теплостойкостью к температуре 200оС, стойкостью к различным химическим средам (кислотам, щелочам и маслам) и деформационным воздействиям при сжатии.
Разработан способ оценки токсичности полимерных материалов с помощью микроорганизмов (пастерелл) и на культуре клеток (ПТ-80), исключающие использование животных, уменьшающие трудозатраты и время проведения опытов.
5. Усовершенствована технология псевдосуспензионного и суспензионного культивирования первичных и перевиваемых клеток в биореакторах (объемом - 0,005; 0,025; 0,100; 0,250 м3) с системой технологической обвязки.
Разработана технология суспензионного культивирования клеток ПТ-80 и ВНК-21/13 в биореакторах. Максимальный индекс пролиферации клеток ВНК-21/13 - 7,4 получен при использовании питательной среды на основе мышечного гидролизата.
6. Усовершенствована технология глубинного культивирования золотистого стафилококка St. aureus в биореакторе АК-210 объемом 0,01м3; определены условия получения культуры, используемой для выделения биологически активного протеина А: при температуре культивирования 37 оС, скорости перемешивания 100 об/мин, рН 7,2 и аэрации воздухом со скоростью 1,4 л/мин, посевной дозе культуры 50 млн.кл/мл и конечной концентрации St. aureus - 1,9 млрд/мл.
7. Усовершенствована предварительная, тонкая и стерилизующая фильтрация питательных сред, сыворотки крови, ферментных солевых растворов с помощью фильтр-пластин на безасбестовой основе ФП, ФТ, ФС, ФД, а также картона КФБЖ и КФМП. Отработана технология микрофильтрации питательных сред, сывороток, растворов трипсина, защитных сред, концентрата разбавителя вакцины при производстве вакцины против болезни Марека.
8. Усовершенствована система очистки и концентрирования раствора альбумина с помощью ультрафильтрации на мембранной тонкоканальной и Уфильтр-прессеФ установках. Для получения высокоочищенных и концентрированных растворов трипсина, вирусных суспензий и биологических жидкостей применены аппараты с полупроницаемыми мембранами в виде полых волокон типа ВПУ-5ПА, ВПУ-15ПА, ВПУ-50ПА, ВПУ-100ПА из полиамида с пределом задержания по белку 5, 15, 50, 100 кДа. Полые волокна ВПУ-50ПА за 1-2 цикла диафильтрации в 6 раз снижали содержание солей и обеспечивали концентрирование раствора трипсина. Полупроницаемые полые волокна ВПУ-100ПА эффективно концентрировали фермент в 7 раз при постепенном удалении солей из раствора. Метод ультрафильтрации на полых волокнах позволил концентрировать в 40-60 раз по объему вирусную суспензию чумы плотоядных.
9. Разработана технология глубокого обессоливания раствора альбумина методом электродиализа (до минимального содержания солей 0,2 %) в производстве вакцины против лептоспироза, обеспечивающим сокращение времени диализа в 7,2 раза.
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Результаты исследований включены в следующие документы.
1. По результатам исследований разработана и утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода Российской Федерации нормативно-технологическая документация:
- Технологический регламент производства трипсина сухого для вирусологических целей, 01.06.1995г.;
- Технические условия ТУ 9358.013.00008064-96 ТТ Трипсин сухой для вирусологических целейТТ, 04.03.1996г.;
- Наставление по применению трипсина сухого для вирусологических целей, 04.03.96г., № 13-6-2/540.
- Методические рекомендации по определению специфических антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной инфекции (РС), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной инфекции крупного рогатого скота (АВИ) в комплексной тест-системе иммуноферментного анализа (ИФА), рассмотренные и одобренные 21 сентября 2007 года на секции УВетеринарная биотехнологияФ ОВМ РАСХН, протокол №1, утвержденные 18.03.2008г.
2. Разработана технологическая схема производства трипсина. Предложена технология получения трипсина сухого для вирусологических целей, которая освоена на базе ГНУ ВНИТИБП, Омского и Алма-Атинского биокомбинатов, Курганского НПО УСинтезФ.
3. Технологический регламент УКультивирование клеток и вирусов с использование экспериментальных образцов оборудованияУ, утвержден директором ГНУ ВНИТИБП 28.12.1985г. Разработана технологическая схема процесса культивирования клеток и вирусов в аппаратах (реакторах).
4. Опытно-промышленный регламент на производство вакцины антирабической для животных, утвержден 20.09.2009г. директором ВНИТИБП.
5. Лабораторный регламент на производство антирабической вакцины сухой для крупного и мелкого рогатого скота, утвержден директором ВНИТИБП 22.10.2010 г.
6. Технологический регламент УВирус - вакцина сухая культуральная против болезни Марека из штамма ФС-126 М и вируса герпеса индеек, утвержден ВНИТИБП 28.12.1990 г.
7. Технологический регламент по изготовлению и контролю набора компонентов для определения уровня специфических антител к вирусам ИРТ, ПГ-3, РС, ВД-БС, АВ крупного рогатого скота в комплексной тест - системе иммуноферментного анализа, утвержден директором ВНИТИБП 21.07.2007г.
8. Разработаны полимерные композиции из теплостойких биологически инертных материалов для технологического оборудования биопроизводств. Получены авторские свидетельства (авт. св. № 701129, УРезиновая смесь на основе фторуглеродных каучуковФ, бюл. - 1979. - № 44. - С.193.; авт. св. № 770126, УРезиновая смесь на основе фторкаучукаФ, бюл. - 1980. - № 37. - С.308; авт. св. № 783311, УРезиновая композиция на основе сополимера винилиденфторидаФ, бюл. - 1980. - № 44. - С.110). Материалы использованы на Щелковском биопредприятии (акты об использовании предложения от 16.02.09г.).
9. Разработан способ переработки смесей, и вулканизации в ГНУ ВНИТИБП, на Щелковском биокомбинате и в ОКБ КП. Организован участок по изготовлению полимерных материалов.
10. Разработан и испытан с положительным результатом в условиях производства способ обессоливания методом ультрафильтрации и электродиализа раствора альбумина, используемого для приготовления питательной среды ГНКИ, предназначенной для культивирования патогенных лептоспир. На Ставропольской биофабрике получено 8 серий альбумина, общим объемом 167 л (Акт испытаний от 12.11.1981 г.).
5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК
Министерства образования и науки России
1. Попова В.М. Разработка биотехнологических процессов при получении биопрепаратов и ферментов /Попова В.М. //Труды Кубанского государственного аграрного университета. Серия: Ветеринарные науки. - Краснодар.- 2009. - № 1.-(Ч.1).- С. 80-81.
2. Попова В.М. Исследование методов очистки, концентрирования и разделения биологических жидкостей с использованием мембранной технологии в производстве ветеринарных препаратов /Попова В.М., Кочиш И.И., Беро И.Л., Самуйленко А.Я., Гуславский А.И.// Ветеринария и кормление. - 2009.- № 6.- С. 6-7.
3. Еремец Н.К. Современные биотехнологические методы получения и оценки качества протеина А золотистого стафилококка /Еремец Н.К., Матвеева И.Н., Беро Л.К., Киш Л.К., Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Попова В.М. //Ветеринарная медицина. - 2009.- С. 189-190.
4. Попова В.М. Разработка и оптимизация биотехнологий производства ветеринарных препаратов и ферментов /Попова В.М., Кочиш И.И., Беро И.Л., Самуйленко А.Я., Гуславский А.И. //Сельскохозяйственная биология. - 2010.- № 4.- C. 45-50.
5. Попова В.М. Использование трипсина для получения культур клеток и вирусов при изготовлении противовирусных препаратов Попова В.М., И.И. Кочиш И.И., Беро И.Л., Самуйленко А.Я., Гуславский А.И., Ночевный В.Т., Соловьев Б.В. //Ветеринария и кормление. - 2010.- № 3.- С. 14-15.
6. Попова В.М. Современные направления в развитии биотехнологии ветпрепаратов и ферментов /Попова В.М. //Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук.- 2010. - № 5. - С. 40-41.
7. Беро И.Л. Человек и биотехнология ХХI века /Беро И.Л., Ганяев А.М., Эрнст К.Л., Пурто Е.Е., Самуйленко А.Я., Раевский А.А., Попова В.М., Гринь С.А., Бондарева Н.А. Иванов А.В., Иванов А.А. //Ветеринарный врач. - 2010. - № 6. - С. 7-14.
8. Махлис Ф.А. Влияние многоядерных ароматических смол на свойства бутадиен-нитрильных каучуков /Махлис Ф.А., Попова В.М.//Каучук и резина. - 1973. - № 5. - С.29-32.
9. Махлис Ф.А. Изменение структуры бутадиен-нитрильных и фторкаучуков при облучении / Махлис Ф.А., Губанова Г.Г., Попова В.М. // Высокомолекулярные соединения. - 1973. - А15. - № 5. - С. 1995-2002.
10. Попова В.М. Разработка полимерных композиций для изделий, используемых в биопромышленности / Попова В.М. //Каучук и резина. - 2011. - № 5.- С. 28-29.
11. Попова В.М. Композиции на основе фторкаучуков, используемые в биопромышленности /Попова В.М., Матвеева И.Н., Самуйленко А.Я., Симаненкова Л.Б. // Каучук и резина, Матвеева И.Н., Самуйленко А.Я., Симаненкова Л.Б. - 2011- № 5. - С. 30-31.
Список авторских свидетельств и патентов
12. Попова В.М. Способ получения трипсина /Попова В.М., Самуйленко А.Я., Гуславский А.И., Беро И.Л., Школьников Е.Э.. Нежута А.А., Еремец В.И., Лукина В.А., Скотникова Т.А., Скороходова Л.А., Еремец Н.К., Кочиш И.И. Патент РФ № 2403285 от 04.06.2009. Опубликовано 10.11. 2010. - Бюл. № 31. - C. 743.
13. Попова В.М. Способ иммобилизации трипсина /Попова В.М., Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Скороходова Л.А., Гуславский А.И., Самуйленко А.Я., Кочиш И.И., Матвеева И.Н., Еремец В.И., Гринь С.А., Раевский А.А., Беро И.Л., Фролова М.А., Еремец Н.К. Заявка на патент № 2010124270/10 (034645) от 17.06.2010 (решение о выдаче патента на изобретение 28.07.2011).
14. Махлис Ф.А. Резиновая смесь на основе ненасыщенных каучуков /Махлис Ф.А., Попова В.М., Савин В.С., Клипиницер, Мирошина Т.В. Авт.св. № 384361. - Бюл. - 1973. - № 43. - С.167.
15. Задунайская М.К. Резиновая смесь на основе фторуглеродных каучуков / Задунайская М.К., Гринблат М.П., Попова В.М., Губанов В.А., Румянцев Д.Д., Долгопольский И.М., Фролов В.Г., Кирошко П.Б., Хазен Л.З., Кузьминова Н.М., Лундстрем А.М., Веретенников Н.В. Авт.св. № 701129. Бюл. - 1979. - № 44. - С.193.
16. Попова В.М. Резиновая смесь на основе фторкаучука /Попова В.М., Задунайская М.К., Кругликов А.М., Фролов В.Г., Гольберг Е.Л., Симаненкова Л.Б., Киро З.Б., Донцов А.А., Эйстраха Л.А. Авт. св. № 770126. Бюл. - 1980. - № 37. - С. 308.
17. Гринблат М.П. Резиновая композиция на основе сополимера винилиденфторида / Гринблат М.П., Лундстрем А.М., Кирошко П.Б., Кузьминова Н.М., Губанов В.А., Веретенников Н.В., Долгопольский И.М., Соколов С.В., Задунайская М.К., Попова В.М., Кругликов А.М., Фролов В.Г., Гольберг Е.Л., Худяков А.Д., Гилинская Н.С., Санкина Г.А., Галил-Оглы, Донцов А.А. Авт. св. № 783311. Бюл. - 1980. - № 44. - С. 110.
Публикации в других изданиях
18. Гайденко В.П. Изучение условий очистки и концентрирования раствора альбумина методом ультрафильтрации /Гайденко В.П., Марковская С.М., Попова В.М., Гребенюк С.М., Рейфман Л.С. // Доклады III Всесоюзной конференции по мембранным методам разделения смесей.Ц Ч. 2. - Владимир, 1981. - С. 187-188.
19. Денисенко Г.Ф. Очистка водных растворов методом электродиализа /Денисенко Г.Ф., Косикова А.М., Сурмило А.П., Гайденко В.П., Попова В.М., Гнусин Н.П., Заболоцкий В.И., Письменный В.Ф., Брод И.И., Киселев О.Б. //Доклады Второй Всесоюзной конференции УНаучные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратовФ. - М. - 1981.- С. 216-217.
20. Гайденко В.П. О применении резин в технологическом оборудовании биологического производства / Гайденко В.П., Попова В.М. // ЭИ Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности.- М.-1982.- №1. - С. 27-30.
21. Анисимова Л.В. Определение токсических свойств резин при культивировании пастерелл /Анисимова Л.В., Гайденко В.П., Попова В.М. // ЭИ Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. - М.- 1984.- №1. - С. 4-6.
22. Попова В.М. Очистка и стерилизация воздуха в процессе культивирования клеток с помощью пористого титана и пористого фторопласта /Попова В.М., Батуров В.И., Анащенко М.П. // Материалы Всесоюзной научно-практической конф. УСовременные направления в развитии технологии производства и повышения качества электроизоляционных и фильтровальных материалов на целлюлозной основеФ. - Волжск.- 1986. - С. 137-138.
23. Попова В.М. Биологическая оценка резиновых изделий на культурах клеток / Попова В.М., Гвозденко Н.И., Пухова Н.М., Соловьев Б.В. //УКультивирование клеток животных и человекаФ: Материалы III Всесоюзного совещания. - Пущино.- 1990. - С. 131-132.
24. Попова В.М. Исследование деформационных свойств полимеров, предназначенных для уплотнительных изделий /Попова В.М. //Доклады IУ Всесоюзной конференции УНаучные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратовФ. - М. - 1991.- С. 230-231.
25. Гуславский А.И. Исследование методов разделения при очистке желудочного сока лошадей /Гуславский А.И., Школьников Е.Э., Попова В.М., Домнина Н.И., Качалов В.Н., Сысолин А.С. //Доклады IУ Всесоюзной конференции УНаучные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратовФ. - М. - 1991.- С. 225.
26. Гуславский А.И. Процесс разделения и очистки хламидиосодержащей суспензии в технологии производства /Гуславский А.И., Школьников Е.Э., Попова В.М., Качалов В.Н., Самсонова Г.И. //Доклады IУ Всесоюзной конференции УНаучные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратовФ. - М. -1991.- С. 221.
27. Гуславский А.И. Исследование процесса получения ферментного препарата трипсина / Гуславский А.И., Школьников Е.Э., Попова В.М., Самсонова Г.И., Качалов В.Н., Ковальчук Л.И. //Доклады IУ Всесоюзной конференции УНаучные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратовФ. - М. -1991.- С. 226-227.
28. Попова В.М. Обессоливание альбумина методом электродиализа / Попова В.М., Сурмило А.П. //Доклады IУ Всесоюзной конференции УНаучные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратовФ. - М. - 1991.- С. 192-194.
29. Гуславский А.И. Совершенствование способа изготовления трипсина сухого для вирусологических целей / Гуславский А.И., Попова В.М., Ночевный В.Т. // Материалы Всероссийская конференции 25-27 июня 1996 г. Моск. акад. Ветмедицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина. - М. -1996. - С. 45-46.
30. Гуславский А.И. Освоение производства трипсина сухого для вирусологических целей /Гуславский А.И., Попова В.М., Ночевный В.Т., Башашкина Н.А. //Доклады У Всесоюзной конференции УНаучные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково. - 1996. - С. 324-325.
31. Гуславский А.И. Трипсин сухой для вирусологических целей / Гуславский А.И., Попова В.М. //Доклады научно-производственной конференции У100 лет Курской биофабрике и агропромышленности РоссииФ. - Курск. - 1996. - С. 100 - 101.
32. Попова В.М.. Исследование процесса ультрафильтрации и диафильтрации неочищенных ферментов с помощью полых волокон /Попова В.М., Гуславский А.И.// Доклады У Всероссийской конференции УНаучные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково. - 1996.- С. 209-210.
33. Попова В.М. Влияние процесса разделения на качество трипсина для вирусологических целей / Попова В.М., Гуславский А.И., Ночевный В.Т. //Доклады У Всероссийской конференции УНаучные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково. - 1996. - С. 211.
34. Попова В.М. Разработка термостойких прокладок / Попова В.М., Гуславский А.И. //Доклады У Всероссийской конференции УНаучные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково. - 1996. - С. 235.
35. Попова В.М. Усовершенствование технологии получения трипсина /Попова В.М., Гуславский А.И., Самсонова Г.И. //Доклады У Всероссийской конференции УНаучные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково. - 1996. - Щелково, 1996.- С. 322-323.
36. Попова В.М. Совершенствование способа изготовления трипсина сухого для вирусологических целей /Попова В.М., Гуславский А.И., Ночевный В.Т. //Доклады Всероссийской конференции УИнфекционные болезни молодняка с/х животныхУ. - М. - 1996. - С. 100-102.
37. Фролова М.А. Использование метода ультрафильтрации в технологии получения сывороточного гонадотропина /Фролова М.А., Попова В.М., Емельянов Н.И., Гуславский А.И. //Доклады У Всероссийской конференции. - Щелково. - 1996. - С. 212.
38. Попова В.М. Влияние разделения суспензии на качество ферментного препарата трипсина /Попова В.М., Гуславский А.И. //Материалы II Междунородной научно-практической конференции УАктуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля с/х продукции У - М. - 1997. - 1 ч. - С. 56.
39. Попова В.М. Усовершенствование технологии получения трипсина сухого для вирусологических целей /Попова В.М., Гуславский А.И. //Материалы II Международной научно-практической конференции УАктуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля с/а продукции У - М., 1997. - 1 ч. - С. 57.
40. Попова В.М. Очистка и стерилизация питательных сред и растворов трипсина / Попова В.М., Иванов В.С., Гуславский А.И. //Доклады Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 70-ю со дня рождения В.А. Першина УНаучные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратовФ (14 июля 1997). - Щелково. - 1998. - С. 48-49.
41. Попова В.М. Усовершенствование технологии изготовления трипсина сухого / Попова В.М., Гуславский А.И., Ночевный В.Т., Башашкина Н.А. //Доклады Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 70-ю со дня рождения В.А. Першина. Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов (14 июля 1997). - Щелково. - 1998. - С. 49-50.
42. Попова В.М. Очистка и стерилизация сред и растворов трипсина / Попова В.М., Иванов В.С., Гуславский А.И., Шишов П.В. //Доклады Всероссийской научно-практической конференции УНаучные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково. - 1998. - С. 203.
43. Попова В.М. Трипсин сухой и его применение для культур клеток в вирусологической практике / Попова В.М., Гуславский А.И., Ночевный В.Т., Башашкина Н.А. //Доклады Всероссийской научно-практической конференции УНаучные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково. - 1998. - С. 208.
44. Попова В.М. Изучение влияния технологических факторов на качество и активность трипсина сухого для вирусологических целей /Попова В.М., Гуславский А.И. // Материалы конференции УПроизводство и контроль медицинских, ветеринарных препаратов. Опыт применения реализации их в странах СНГФ. 27-28 мая 1999. ФУП Покровский з-д биопрепаратов 30 лет со дня основания.- п. Вольгинский. - 1999.- С. 13
45. Гуславский А.И. Разработка технологии и технологической линии производства трипсина сухого для вирусологических целей /Гуславский А.И., Попова В.М., Ночевный В.Т. //Материалы конференции УПроизводство и контроль медицинских, ветеринарных препаратов. Опыт применения реализации их в странах СНГФ. 27-28 мая 1999. ФУП Покровский з-д биопрепаратов 30 лет со дня основания. - п. Вольгинский. - 1999. - С. 14.
46. Гуславский А.И. Новые фильтрующие материалы для биотехнологии / Гуславский А.И., Попова В.М., Гуславская Т.А., Расчетнова Т.С.// Материалы конференции УПроизводство и контроль медицинских, ветеринарных препаратов. Опыт применения реализации их в странах СНГФ. 27-28 мая 1999. ФУП Покровский з-д биопрепаратов 30 лет со дня основания. - п. Вольгинский. - 1999. - С. 15.
47. Попова В.М.Усовершенствование технологии изготовления и изучение свойств трипсина сухого для вирусологических целей. Автореф. дисс. канд.биолог.наукЦМ.1999.24 с.
48. Шишов П.В. Испытание сухого трипсина, предназначенного для вирусологических целей / Шишов П.В., Попова В.М., Гуславский А.И., Ночевный В.Т.// Материалы Всероссийской конференции молодых ученых и аспирантов по птицеводству. - Сергиев-Посад. - 1999. - С. 38-39
49. Гуславский А.И. Вопросы очистки, разделения и концентрирования биологических жидкостей /Гуславский А.И., Попова В.М. //Доклады Всероссийской научно-практической конференции УНаучные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково, 2000. - С. 308-309.
50. Гуславский А.И. Процессы разделения и концентрирования жидких систем в биотехнологии /Гуславский А.И., Попова В.М., Гуславский А.И., Еремец В.И., Гуславская Т.А. //Сборник статей Международной научно-практической конференции УДиагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными экзотическими и зооантронозными болезнями животных У.- Покров. - 2000. - С. 124-125.
51. Гуславский А.И., Попова В.М., Гуславская Т.А., Канарский А.В. Состояние производства фильтрующих материалов для биотехнологии //Доклады Всероссийской научно-практической конференции УНаучные основы производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково - 2000. - С. 307-308.
52. Попова В.М. Фильтрация питательных сред, растворов и сывороток /Попова В.М., Гуславский А.И. //Доклады Всероссийской научно-практической конференции УНаучные основы производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково - 2000. - С. 312-313.
53. Попова В.М. Обессоливание белковых растворов /Попова В.М., Гуславский А.И., Сурмило А.П. //Доклады Всероссийской научно-практической конференции УНаучные основы производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково. - 2000. - С. 313-314.
54. Попова В.М. Технологические аспекты производства трипсина сухого для вирусологических целей /Попова В.М., Гуславский А.И. //Доклады Всероссийской научно-практической конференции УНаучные основы производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково. - 2000. - С. 314-315.
55. Попова В.М. Разработка технологии и технологической линии производства трипсина сухого для вирусологических целей /Попова В.М., Соловьев Б.В., Гуславский А.И., Ночевный В.Т. //Доклад на семинаре - презентации инновационных научно-технических проектов УБиотехнология - 2000У. - Пущино. - 2000. - С. 28.
56. Расчетнова Т.С. Процессы фильтрации жидких систем в биотехнологии / Расчетнова Т.С., Гуславский А.И., Попова В.М. //Сборник докладов Международной конференции молодых ученых УНаучные основы производства ветеринарных биопрепаратовФ. - Щелково. - 2001. - С. 130-132.
57. Гуславский А.И. Эффективность добавки в рацион птиц природных цеолитов / Гуславский А.И., Лукина В.А., Пухова Н.М., Ярыгина Е.И, Попова В.М., Расчетнова Т.С., Бобычев В.А. //Сборник докладов Международной конференции молодых ученых УНаучные основы производства ветеринарных биопрепаратовФ. - Щелково. - 2002. - С. 131-133.
58. Попова В.М. Аспекты валидации процесса фильтрации биологических жидкостей /Попова В.М., Гуславский А.И., Соловьев Б.В., Расчетнова Т.С. //Сборник докладов Международной конференции молодых ученых УНаучные основы производства ветеринарных биопрепаратовФ. - Щелково. - 2002. - С. 156-160.
59. Попова В.М. Разработка технологии производства трипсина сухого для биологических целей /Попова В.М., Соловьев Б.В., Гуславский А.И., Ночевный В.Т. // Сборник докладов Международной конференции молодых ученых УНаучные основы производства ветеринарных биопрепаратовФ. - Щелково. - 2003. - С. 162-163.
60. Попова В.М. Разработка технологии получения трипсина /Попова В.М., Гуславский А.И., Ночевный В.Т., Егорова В.Н.//Доклады Всероссийской научно-практической конференции УНаучные основы производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково. - 2005. - С. 289-294.
61. Попова В.М. Иммобилизованный трипсин /Попова В.М., Ярыгина Е.И., Лукина В.А., Скороходова Л.А.//Доклады Всероссийской научно-практической конференции УНаучные основы производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково. - 2005. - С. 294-297.
62. Матвеева И.Н. Выделение биологически активного протеина А для использования в биологических исследованиях /Матвеева И.Н., Гринь С.А., Кузнецов Д.П., Мальгин Ю.А., Мальгина Т.А., Попова В.М. //Материалы Международной конференции УНаучные основы производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково. - 2005. - С. 421-423.
63. Матвеева И.Н. Получение биологически активного протеина А из золотистого стафилококка /Матвеева И.Н., Гринь С.А., Кузнецов Д.П., Мальгин Ю.А., Мальгина Т.А., Попова В.М. //Материалы Международной конференции УНаучные основы производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково, 2005. - С. 423-425.
64. Попова В.М. Основные направления биотехнологии и систематизации биотехнологических процессов /Попова В.М. //Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 80-ю со дня рождения И.А. Хорькова, 15 декабря 2006 года, УНаучные основы производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково. -2006. - С. 170-172.
65. Попова В.М. Разработка технологии производства трипсина сухого для биологических целей /Попова В.М., Гуславский А.И., Ночевный В.Т. //Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 80-ю со дня рождения И.А. Хорькова, 15 декабря 2006 года, УНаучные основы производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково. - 2006. - С. 163-169.
66. Попова В.М. Испытание фильтра тонкой очистки биологических жидкостей / Попова В.М., Кочиш И.И., Гуславский А.И, Иванов С.Д. //Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 40-ю института, 9-10 декабря 2009г., УНаучные основы производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково, 2009. - С. 429-430.
67. Попова В.М. Оценка свойств трипсина при длительном хранении /Попова В.М., Гуславский А.И., Кочиш И.И.//Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 40-ю института, 9-10 декабря 2009г., УНаучные основы производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково, 2009. - С. 434-435.
68. Рубан Е.А. Совершенствование технологии производства противовирусных препаратов /Рубан Е.А., Раевский А.А., Гуславский А.И., Попова В.М., Кочиш И.И., Беро И.Л.// Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 40-ю института, 9-10 декабря 2009г., УНаучные основы производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково, 2009. - С. 413-418.
69. Попова В.М. Химическая очистка трипсина /Попова В.М., Гуславский А.И., Кочиш И.И. //Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 40-ю института, 9-10 декабря 2009 г., УНаучные основы производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково, 2009. - С. 432-434.
70. Попова В.М. Обеспечение стерильных условий при культивировании клеток животных и микроорганизмов в биореакторах /Попова В.М., Раевский А.А., Гуславский А.И., Беро И.Л., Кочиш И.И., Дадасян А.Я. // Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 40-ю института, 9-10 декабря 2009 г., УНаучные основы производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково, 2009. - С. 418-421.
71. Попова В.М. Фильтровальный картон для осветления и стерилизующей фильтрации биопрепаратов /Попова В.М., Гуславский А.И., Кочиш И.И., Канарский А.В. // Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 40-ю института, 9-10 декабря 2009г., УНаучные основы производства ветеринарных биологических препаратовФ. - Щелково, 2009. - С. 430-431.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АВИ аденовирусная инфекция крупного рогатого скота
БМ болезнь Марека
ВБА вирус болезни Ауески
ВГИ вирус герпеса индеек
ВД-БС вирусная диарея-болезнь слизистых
ВЧП вирус чумы плотоядных
ГЛА гидролизат лактальбумина
ИББ инфекционная бурсальная болезнь птиц
ИП индекс пролиферации
ИРТ инфекционный ринотрахеит
ИФА иммуноферментный анализ
КККЭ культура клеток куриных эмбрионов
ККПЭ культура клеток перепелиных эмбрионов
КРС крупный рогатый скот
КФБЖ картон фильтровальный для биологических жидкостей
КФМП картон фильтровальный для медицинских препаратов
МН микроносители
МПК микропроцессорный комплекс
MDBK перевиваемая линия почек телят
MDCK перевиваемая линия почек собак
НТД нормативная техническая документация
ОФС осадительно-фильтрующая центрифуга
ПВЭС парвовирусный энтерит собак
ПГ-3 парагрипп-3
ПК почка крольчат
ПКШ почка кошек
ПЛК перевиваемая линия клеток
ПС питательная среда
ПТ-80 перевиваемая линия клеток почки теленка
ПЩ почка щенка
ПЭК почка эмбрионов коров
РА рост (рост стимулирующая активность в баллах)
РС респираторно-синцитиальная инфекция
СК сыворотка крови
СК РТП система контроля и регулирования технологическим
процессом
СПЭВ перевиваемая линия почек свиней
ТБ текстулы быка
ТП трипсин
ТС трипсин сухой для вирусологических целей
УК урожай клеток
ФП фильтр-пластины для предварительной фильтрации
ФТ фильтр-пластины для тонкой фильтрации
ФС фильтр-пластины для стерилизующейфильтрации
ФЭК фибробласты эмбрионов кур
ФЭП фибробласты эмбрионов перепелов
ЦПД цитопатогенное действие вирусов
ЦПИ цитопатические изменения в культуре клеток
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии