Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Белов Алексей Алексеевич
РАЗРАБОТКА ПРОМЫШЛЕННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ МАТЕРИАЛОВ НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ВОЛОКНООБРАЗУЮЩИХ ПОЛИМЕРОВ, СОДЕРЖАЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ БЕЛКОВЫЕ ВЕЩЕСТВА
03.00.23 - биотехнология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук
МОСКВА - 2009
Работа выполнена в отделе биотехнологии ОАО Научно - Исследовательского института текстильных материалов, г. Москва.
Научные консультанты: доктор химических наук, Казанская Новелла Федоровна доктор технических наук, профессор Филатов Владимир Николаевич
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович доктор биологических наук, профессор Максименко Александр Васильевич доктор биологических наук, профессор Донова Марина Викторовна
Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
Защита состоится л 2009 г. в 10 часов 30 мин. на заседании диссертационного совета ДМ 212.204.13 в РХТУ им. Д.И. Менделеева (125047 Москва, Миусская пл., д. 9) в аудитории 443.
С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ имени Д.И. Менделеева.
Автореферат диссертации разослан л ______________ 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13 Шакир И.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Полимерные системы с иммобилизованными белками и другими разнообразными биологически активными веществами (БАВ) находят все более широкое применение в биотехнологии и различных областях медицины. Уникальные свойства ферментов, такие как высокая специфическая активность, непревзойденная субстратная специфичность и другие, предопределили перспективность их практического применения. Несмотря на высокую эффективность использования различных ферментов в медицине и промышленности, следует учитывать их лабильность, антигенные и пирогенные свойства. Нативные ферментные препараты дороги и многие из них дефицитны, они быстро выводятся из организма, либо утилизируются им, что ограничивает их широкое применение. Преодолеть эти недостатки удается иммобилизацией ферментов на различных природных и синтетических носителях.
Важной предпосылкой к интенсивному внедрению энзимологии в медицину и фармацевтику явилось решение теоретических и практических вопросов модификации ферментов с приданием им новых свойств, причем именно таких, которые имеют практическое значение для терапии человека. При этом возникает необходимость изучения методов иммобилизации, свойств носителя и его влияния на свойства иммобилизованного биологически активного вещества, а также исследования полученных иммобилизованных препаратов в модельных эксплуатационных условиях.
Известно, что с древнейших времен и до настоящего времени для изготовления медицинских перевязочных средств во всем мире используются материалы из природной целлюлозы. Изделия из целлюлозы обладают прекрасными санитарно-гигиеническими свойствами, но при этом целлюлоза не взаимодействует химически с биологическими субстанциями, она пассивно участвует в процессе очищения раны: всасывает раневое отделяемое, защищает рану от аэрогенной контаминации и сохраняет термальный режим в раневой среде. Модифицированные текстильные материалы, даже не содержащие лекарственные вещества, взаимодействуют с раневым отделяемым, т.е. принимают участие в активном очищении раны. Наличие же лекарственного препарата в материале способствует заживлению раны. Ферменты, иммобилизованные на перевязочных материалах, активно участвуют в процессе заживления ран, не вызывая побочных эффектов. Необходимо учитывать, что перевязочные материалы - одноразовые средства с небольшим сроком эксплуатации (до 72 часов), поэтому их биологическая активность должна максимально реализоваться при наложении на рану. Введение в очаг поражения лекарственных средств, иммобилизованных на текстильных носителях, не вызывает побочных эффектов и позволяет одновременно решить несколько задач: повысить действенность препарата, снизить его расход, устранить нежелательное воздействие препарата на здоровые органы и ткани.
Работа выполнялась по планам и научно-техническим программам: Минлегпром СССР (1986-1989 гг.), ГКНТ и Министерства науки и технической политики РФ (1990-1993 гг.), Минпром РФ (1993 г), Миннауки РФ (1997-19гг.), Минпромнауки РФ (1999-2002 гг.), Минпромэнерго РФ (2004-2006), АО УМосковский комитет по науке и техникеФ при правительстве г. Москвы (19931994 г., 2000-2002 г.), в рамках ФЦНТП на 1996-2001 и 2002-2006 гг. Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, в рамках государственной научно-технической программы России Новейшие методы биоинженерии, в рамках исследовательских программ НИИ текстильных материалов (1986-2008 гг.).
Цель и задачи исследования. Цель работы - создание высокоэффективных раневых покрытий нового поколения, создание и разработка промышленной технологии их получения. Кроме того, нами были проведены многоплановые исследования полученных иммобилизованных БАВ на модифицированных текстильных носителях.
В связи с этим решались следующие задачи:
1. Разработка промышленных технологий получения иммобилизованных лекарственных препаратов.
2. Получение иммобилизованных биологически активных препаратов на текстильных носителях, которые сохраняют лечебные свойства и стерильность после высушивания на протяжении необходимого времени хранения (не менее 3-х лет) в стандартных условиях.
3. Разработка удобных и достоверных методов оценки содержания биологически активных веществ на нерастворимых текстильных носителях и методов определения биологической активности ферментных препаратов, иммобилизованных на этих носителях.
4. Исследование физико-химических свойств полученных препаратов.
5. Выявление связи между потерей протеолитической активности у моно- и полиферментных протеолитических препаратов и сроком их хранения. Установление максимально допустимого срока, в течение которого сохраняются достаточные лечебные свойства иммобилизованных препаратов.
6. Экспериментальное обоснование возможности эффективного биомедицинского использования иммобилизованных на текстильных носителях лекарственных препаратов.
7. Проведение токсикологических и санитарно-гигиенических испытаний разработанных материалов.
Научная новизна работы. Разработаны лабораторные и промышленные технологии получения текстильных материалов с иммобилизованными биологически активными веществами (протеиназами, ингибиторами и лекарственными препаратами) различного спектра действия.
Впервые получено новое поколение перевязочных средств - текстильных материалов комплексного действия, в состав которых входят хитозан и протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба (Патент RU № 2 323 748 C2).
Разработаны методы оценки содержания различных биологически активных веществ на нерастворимых модифицированных текстильных носителях и методы оценки биологической активности иммобилизованных препаратов.
Впервые установлена взаимосвязь между потерей протеолитической активности у иммобилизованных на нерастворимых модифицированных текстильных носителях моно- и полиферментных протеолитических препаратов и сроком их хранения в стандартных условиях.
Установлены радиопротекторные свойства диальдегидцеллюлозы (ДАЦ) высокой степени окисления (более 1,5 мгЭкв/г) и полиамидного текстильного материала в случае гамма-стерилизации.
Впервые проведено токсикологическое изучение текстильных материалов медицинского назначения (ДАЦ-коллитин, ДАЦ-ингибитор, УМультифермФ).
Доказано, что изученные материалы не обладают токсическим, гемолитическим, аллергенным действием, а также цитотоксическим эффектом и мутагенной активностью.
Практическая значимость работы. Разработанные технологии получения текстильных материалов медицинского назначения с иммобилизованными БАВ позволяют получить новое поколение перевязочных средств и покрытий для лечения гнойно-некротических ран.
Разработана технология производства полиферментных препаратов (на основе протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба и модифицированных текстильных носителей). Для полученных препаратов проведены клинические испытания и разработан необходимый комплект нормативнотехнической документации. Получены разрешающие документы на серийный выпуск медицинских изделий и их использование на территории РФ.
Организовано серийное производство и промышленный выпуск иммобилизованных форм различных биологически активных веществ на модифицированных текстильных носителях. Осуществляются поставки разработанных изделий в лечебно-профилактические учреждения Миндравсоцразвития РФ и клиники Минобороны РФ.
Практическая значимость работы подтверждается тем, что по ее результатам получено более 10 авторских свидетельств СССР и патентов РФ; результаты работы были отмечены дипломами и медалями ВВ - и других российских и международных выставок.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены: на 3-ей Всес. науч.-техн. конф. "Актуальные проблемы производства кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и органотерапевтических препаратов" (Москва, 1987); Всес. совещании "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов" (Владивосток, 1988); 5-ой Моск. конф. по органической химии и технологии (Москва, 1989);
1-ом Всес. Радиобиол. съезде (Москва, 1989); 1-ой Всес. конф. "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и шовных материалов" (Москва, 1989); 20-th FEBS Meet. (Budapest, 1990); 2-й Нац. конф. "Биоматериали" (Варна,1990); Всес. конф."Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990); VII Всес. симп. "Инженерная энзимология" (Москва, 1991); Всес. научной конф. "Проблемы модифицирования природных и синтетических волокнообразующих полимеров (Москва, 1991); I Рос. нац.
конгр. "Человек и лекарство", (Москва, 1992); 1, 2, 3-ей Межд.конф. "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и полимерных имплантантов" (Москва, 1992, 1995, 1998); 3, 4, 5, 6-th Int. Cong. on Wounds, Burns and Dressings, (Tel-Aviv, 1994, 1996,1998, 2000); IV, V, VI симп. "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1997, 2002, 2007); Int. conf. BIOCATALYSIS-98, 2000, 2002, 2005, Fundamentals & applications (Puschino on the Oka 1998, Moscow 2000, 2002, St. Petersburg 2005); Всерос. науч.-техн. конф.
"Современные технологии и оборудование текстильной промышленности" (Москва 1998, 2002, 2006); Моск. конф. Иммобилизация лекарственных средств на текстильные носители - современный подход к снижению лекарственной нагрузки (Москва, 2001); II Межд. науч.-техн. конф."Текстильная химия - 2004"; 1-м, 2-м, 3-м, 4-м Межд. конгрессах Биотехнология состояние и перспективы развития (Москва, 2002, 2003, 2005,2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 111 печатных работы, из них 12 авторских свидетельств СССР и патентов РФ и 25 статей.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных наблюдений, заключения, выводов, списка литературы и приложений.
Текст изложен на 421 стр., включает 116 таблиц, 38 рисунков и 27 приложений. Библиография содержит 368 публикаций.
Список использованных сокращений: БАВ - биологически активное вещество, ДА - - диальдегидцеллюлоза, ДМСО - диметилсульфоксид, Кл - коллитин, ЛВ - лекарственные вещества, ПА - протеолитическая активность, ПИП - поливалентный ингибитор протеиназ, ПК - протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба, ПКА - поликапроамид; ПКА-ГА - частично гидролизованный поликапроамид, модифицированный глутаровым альдегидом; Тр - трипсин, Хт - хитозан, BzArgNA - паранитроанилид N-бензоил-D,L-аргининa, BzArgOEt - этиловый эфир N-бензоил-D,L-аргининa, 2М - 2- макроглобулин, 1ПИ - 1- ингибитор протеиназ.
Работа выполнена в отделе биотехнологии ОАО НИИ текстильных материалов в рамках совместных исследований с Российским химикотехнологическим университетом им. Д.И.Менделеева (каф. биотехнологии), МГУ им. М.В.Ломоносова (Химический факультет, каф. химической энзимологии), Институтом экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ, НИИ лазерной медицины, Московской медицинской академией им. И.М.Сеченова, Московским государственным медико-стоматологическим университетом, Московской государственной текстильной академией им. А.Н.Косыгина, Всероссийским НИИ мясной промышленности, Государственным институтом кровезаменителей и медицинских препаратов.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
В главе I обобщены и проанализированы данные литературы по методам активации и свойствам некоторых волокнообразующих текстильных носителей на основе целлюлозы и поликапроамида для иммобилизации БАВ. Проведен анализ способов получения и свойств ферментов, иммобилизованных на альдегидсодержащих производных целлюлозы и поликапроамида. Рассмотрены результаты использования нативных и иммобилизованных ферментов для лечения ран различной этиологии.
В главе II описаны использованные материалы и методы.
Глава III посвящена разработке методов оценки функциональных свойств созданных материалов. Установление качества лекарственных средств регламентируемым нормам предполагает применение различных аналитических методов. При этом окончательный вывод о качестве лекарственного средства в значительной степени зависит от качества самого метода, который должен отвечать определенным требованиям. Общие принятые в мире рекомендации по производству лекарств в виде GMP - правил содержат требования к методам испытаний, которые используются для оценки соответствия медицинской продукции установленным спецификациям в отношении точности и достоверности. Поэтому необходимо оценить пригодность тех или иных аналитических методов для предполагаемого их применения в оценке качества лекарственных средств.
При работе с иммобилизованными на текстильных носителях БАВ необходимо большое внимание уделять правильному и точному определению как функциональных групп на носителе после его модификации и количеству иммобилизованного БАВ, так и методам определения ферментативной активности иммобилизованных препаратов. Модифицированные текстильные носители активно взаимодействуют с различными ионогенными веществами, и могут частично, а иногда и полностью деструктировать под действием окружающей среды (например, в ходе опыта или в условиях раны).
Нами были проанализированы и сравнены результаты 6 методов (по Лоури, Брэдфорду, Гурвичу (в разных модификациях), элементный анализ, аминокислотный анализ) определения количества белка, иммобилизованного на текстильных носителях. Особенностью работы с перевязочными материалами является то, часто приходится иметь дело с образцами, содержащими менее 0,масс.% (менее 1 мг/г) биоактивного компонента. Как было показано (табл.1), определению количества иммобилизованного белка с помощью общепринятых методов определения белка (по Лоури, Брэдфорду и т.д.), мешают "свободные" альдегидные и различные ионогенные группы, кроме того методы с использованием красителей из-за значительного взаимодействия (сорбции) красителя и матрицы могут привести к получению заниженных результатов. Следствием этого может быть кажущаяся "активация" биологически активного вещества после иммобилизации.
Таблица 1.
Сравнение методов определения белка на иммобилизованных текстильных носителях (мг белка/г носителя).
Метод Лоури- Бредфорда Гурвич Гурвич HCN Носитель Гартри отражение анализ** ДАЦ-Тр 3,050,30 3,180,90 3,151,15 3,251,20 2,351,* (0,75) ПКА-А-Тр - - ? 0,880,20 0,720,* (0,151) ПКА-А-Тр - - ? 0,720,20 1,060,* (0,083) * в скобках дано содержание карбонильных групп в мгЭкв/г;
? - метод нельзя использовать;
** расчет проводили, исходя из содержания азота в образцах.
Для рассматриваемых текстильных носителей (целлюлоза и поликапроамид) наиболее подходящим и дающим точное значение количества иммобилизованного белка был признан метод Лоури в модификации Гартри.
При измерении ферментативной активности иммобилизованного на текстильном носителе белка определение ее истинного значения также затруднено, т.к. выделяющийся в результате протеолиза хромофор сорбируется носителем как за счет ионогенных групп, так и за счет физической сорбции.
При определении активности с измерением в ультрафиолетовой области (например, при 280 нм) анализ осложняется не только из-за взаимодействия выделенных аминокислот с носителем, но и за счет влияния "осколков" матрицы, образующихся в результате гидролитической деструкции (рис.1) на измеряемую величину оптической плотности.
Д - оптическая плотность Длина волны, Рис. 1 УФ-спектр раствора, полученный после инкубации (37С, 24 ч) образца ДА - (навеска ДА - 0,15 г, в 5 мл в 1/15 ФБ (рН 7,8), степень окисления ДА - 0,75 мгЭкв/г).
Погрешность определения контрольного образца может в несколько раз превосходить значение изменения оптической плотности в ходе реакции, особенно при повышенных температурах (выше 37С). Нами показано, что не существует универсального метода, позволяющего определять ферментативную активность для всех типов носителя.
Таким образом, при работе с текстильными носителями необходимо всегда в контрольных опытах учитывать свойства носителя и влажность образцов.
Для модифицированных текстильных носителей- ДА - и ПКА- нами разработаны такие методики, в которых используются доступные реактивы и приборы.
На рис.2 приведена технологическая схема производства, которая типична для всех получаемых в настоящей работе изделий. Отличия заключаются в Подготовка текстильного ма териала Химическая модификация носителя Отмывание модифицированного носителя от остатков продуктов реакции Сушка полученного носителя Иммобилизация БАВ на модифицированном текстильном носителе.
Сушка полученного препарата Раскрой и упаковка готового изделия Гамма-стерилизация готового изделия Рис. 2. Технологическая схема производства.
выборе носителя, степени и методе модификации матрицы, концентрации БАВ и составе раствора для иммобилизации. Все выпускаемые нами изделия должны сохранять стерильность и величину ПА (по казеину) не менее 0,1 ПЕ/г в конце срока хранения (3 или 5 лет).
При подготовке текстильного материала его разрезают на куски требуемого размера и в случае необходимости отмывают от замасливателей. В зависимости от типа используемого носителя проводили его химическую модификацию перйодатом (при использовании целлюлозы - рис.3) или глутаровым альдегидом (в случае поликапроамида - рис.4).
CH2OH CH2OH O O H H ]- [ JO H OH.....
.....
H H O C C O H OH O n n O H H целлюлоза диальдегидцеллюлоза (ДАЦ) Рис. 3. Получение диальдегидцеллюлозы.
C N C C H N H H O O n поликапроамид (ПКА) а. гидролиз ПКА [Н]+ или R1NHCOR2 R1COОН + R2NH[ОН]- б. активация ПКА R2NH2 + OHC-CH2-CH2-CH2-CHO R2NHC-CH2-CH2-CH2-CHO +Н2О глутаровый альдегид (ГА) ПКА-ГА Рис. 4. Получение активированного поликапроамида.
После химической модификации носителя и отмывки его от продуктов реакции, модифицированный текстильный носитель высушивается на воздухе до остаточной влажности не более 10%.
Иммобилизацию БАВ на модифицированном текстильном носителе проводили (если это не оговорено) путем взаимодействия альдегидных групп модифицированного текстильного носителя с аминогруппами боковой цепи белка с образованием ковалентной азометиновой связи (рис.5).
O N E Pol C Pol + E C NH2 H2O + H H Рис. 5. Схема получения препаратов иммобилизованных ферментов.
После иммобилизации и высушивания материал разрезают на салфетки требуемого размера. Формируют изделие. Каждое готовое изделие запаивают герметично в полиэтиленовый пакет. Затем запаивают в пакет из ламинированной бумаги и укладывают в картонные коробки по ГОСТ 7333-89. Упакованные в картонные коробки салфетки стерилизуют гамма-облучением на установке МРХ-25 с использованием в качестве источника излучения 60Со.
Нами оформлена необходимая нормативно-техническая документация на промышленно выпускаемые модифицированные текстильные носители и полученные материалы на их основе. В Институте химической физики РАН РФ д.б.н. И.И.Пелевиной были проведены токсикологические, а во Всероссийском научно-исследовательском и испытательном институте медицинской техники - санитарно-химические исследования наших материалов. В остром и хроническом опытах изучено токсическое действие текстильных материалов на животных. При этом оценивалось их влияние на жизнеспособность клеток в культуре ткани и мутагенная активность по тесту Эймса. Проведённые исследования показали, что исследованные материалы обладают достаточными механическими, гигиеническими свойствами и по показателям нетоксичности могут быть с успехом использованы в клинике.
В главе IV подробно описана разработка технологии иммобилизации препаратов трипсина на модифицированных текстильных носителях (ДАЦ, ПКА-ГА и ПКА-А) и исследование свойств полученных препаратов.
Одной из важнейшая характеристик качества лекарственных форм, важной для производства медицинских материалов, является их стабильность.
Как известно, стабильность активного ингредиента лекарственной формы (в случае фермента - это активность) зависит не только от его физикохимических свойств, но и от свойств вспомогательных веществ, а также от технологических процессов получения лекарственной формы.
Функции белков, также как и их стабильность, определяются аминокислотной последовательностью, которая в свою очередь обусловливает коллективные взаимодействия, приводящие к формированию специфической конформации фермента. Химическая модификация приводит к структурным изменениям белка (иногда очень небольшим), которые обусловливают значительные изменения его стабильности. Модификация -аминогрупп в молекуле Тр приводит к разрыву ряда чувствительных (нековалентных) связей и изменению свойств иммобилизованного препарата.
Можно условно выделить три основных стадии изменения ПА иммобилизованного препарата: вследствие иммобилизации, в процессе высушивания и при хранении. В процессе иммобилизации на модифицированном текстильном носителе относительная ПА БАВ (отношение ПА БАВ, используемого для иммобилизации, к удельной ПА препарата, полученной в процессе иммобилизации) может, достигнув 100%, начать уменьшаться (за счет автолиза, денатурации, термоинактивации, связывания носителя с активным центром фермента или переход в раствор иммобилизованных конгломератов). Нами показано, что ПА полученных нами ферментов, иммобилизованных на модифицированных текстильных материалах, во влажном состоянии после иммобилизации, не меняется при подобранных оптимальных условиях иммобилизации в течении, как минимум, 70 часов при температуре 57С. Снижение ПА начинается при высушивании препаратов на воздухе при комнатной температуре (стадия 1). После высушивания иммобилизованных образцов остается от 30 до 90 % первоначального значения ПА, в зависимости от условий иммобилизации, использованных белков или носителей. Причем данное явление не связано с попаданием молекул белка в поры матрицы, т.к. типично как для целлюлозных, так и ПКА носителей (несмотря на отсутствие пор у последних), а является следствием потери воды во время высушивания (изменение микроокружения фермента). Как известно, дегидратация белка даже в процессе лиофилизации может приводить к его частичной денатурации. Таким образом, снижение ПА связано в основном с уменьшением влажности иммобилизованного препарата от 100 % до 2 6%.
Нами были найдены оптимальные условия, метод модификации и степень модификации текстильного носителя, при которых практически не происходит инактивации Тр в процессе иммобилизации. Показано, что для использования в качестве перевязочных средств наиболее пригодной является ДА - со степенью окисления до 1.5 мгЭкв/г (в виде аппликаций), 2.55 мгЭкв/г (в виде корпии) и более 7.5 мгЭкв/г (в виде порошка). Выбор оптимальных условий иммобилизации (рН раствора, температура, состав раствора для иммобилизации и т. п.) заключался в выборе таких параметров, при которых относительная ПА в процессе иммобилизации была максимальна и не изменялась до начала высушивания образцов, а падение ПА в процессе хранения оказывалось минимальным. На технологии получения иммобилизованного Тр, Кл, ПК, ПИП нами получены авторские свидетельства и патенты, в которых приведены эти оптимальные условия.
На рис. 6 и 7 представлены зависимости изменения протеолитической активности (оптимальные условия получения) иммобилизованных препаратов Тр в процессе иммобилизации, высушивания и хранения (при комнатной температуре 205С, в темноте). Происходящая дегидратация фермента при высушивании иммобилизованных препаратов Тр может приводить к изменению структуры белка. Как известно, инактивация фермента может происходить даже при хранении сухого препарата (например, из-за агрегации или окисления белка). Вторая стадия инактивации иммобилизованных препаратов характери- Ln(A/Ao) 2.А/Ао 0.0.0.0.1.0.0.0.0.0.0.0 20 40 60 80 100 120 140 160 10 10 20 30 40 Время хранения, мес.
Время хранения, мес.
Рис.6. Изменение ПА трипсина, иммоби- Рис. 7. Кинетика изменения ПА лизованного на модифицированные трипсина, иммобилизованного на текстильные носители, при хранении. модифицированные текстильные носители, при хранении.
зуется также относительно быстрой потерей ПА Тр. Для наших образцов эта стадия продолжается в течение 26-ти месяцев хранения в вышеприведенных условиях. Данная стадия характеризует лабильную фракцию образца. Третья, медленная стадия инактивации, происходит в течение последующего времени наблюдения. Полученные данные могут быть объяснены не только наличием "лабильной" и "стабильной" фракций иммобилизованного фермента, хорошо известными для иммобилизованных протеолитических ферментов. Вследствие высокой гигроскопичности носителя (влажность исследуемых целлюлозных препаратов ~ 5%, а полиамидных ~ 2%) и неустойчивости азометиновой связи, инактивация иммобилизованных препаратов в процессе хранения может быть вызвана, по-видимому, теми же причинами, что и в растворе фермента, но процесс протекает с меньшей скоростью. Иммобилизация фермента, как известно, ведет к изменению его конформационной подвижности, а ее снижение, в свою очередь понижает активность. С другой стороны, снижение конформационной подвижности препятствует процессам денатурации и автолиза и позволяет иммобилизованному ферменту сохранять работоспособность в экстремальных (для нативного фермента) условиях. Поэтому должна существовать некоторая оптимальная жесткость связывания, которая регулируется характером присоединения фермента к носителю, природой, длиной и жесткостью линкера, связывающего фермент с полимерным носителем, и природа самого носителя. Набухающий носитель при многоточечном связывании может вызывать денатурацию фермента, что наблюдается и для препаратов иммобилизованного Тр при хранении в стандартных условиях. На рис. 7 приведены кинетические данные изменения ПА Тр, иммобилизованного на модифицированных текстильных носителях, полученные в оптимальных условиях и представленные в полулогарифмических координатах. Кинетика инактивации иммобилизованных ферментов, в процессе хранения, описывается характерной для гидрогеназ сложной экспоненциальной (A/Ao=a1*e-k + a2*e-k ) зависимостью. В полулогарифми1 ческих координатах установленные зависимости имеют вид ломаной линии, каждая из которых описывается уравнением первого порядка. Значения эффективных констант скорости инактивации (kин) для препаратов ДАЦ-Тр, ПКА-ГАТр, ПКА-А-Тр полученных в оптимальных условиях соответственно равны 0,19 и 0,005; 0,15 и 0,005; 0,25 и 0,05 мес-1. Кинетические закономерности такого рода могут быть объяснены общим механизмом инактивации, включающим существование двух форм фермента, различающихся активностью и устойчивостью к денатурирующим воздействиям. То есть, вне зависимости от конкретных деталей механизма и соотношения элементарных констант, двухэкспоненциальный характер инактивации показывает, что механизм инактивации включает, по крайней мере, две различающиеся по активности или устойчивости формы фермента.
Облучение является общепринятым методом стерилизации медицинской продукции, который используется в промышленном масштабе. Как показывает многолетняя практика использования излучений для стерилизации, доза 25 кГр обеспечивает достаточный для безопасного применения уровень микробиологической чистоты, и, именно эта доза является достаточной для стерилизации изделий самого разного состава и медицинского назначения, хотя в ряде случаев допустимы меньшие, а иногда требуются большие дозы.
Стерилизацию немодифицированных ферментов и иммобилизованных препаратов, запаянных в полиэтиленовые пакеты, осуществляли на гаммаустановке МРХ--25М (с источником Со60, мощность 1,1 Гр/с) при 293 К в дозе 25 кГр. На рис.8 и в табл.2 приведены данные о действии гамма - облучения в дозе 25 кГр на ферментативную активность трипсина (измеренную с использованием различных белковых и синтетических субстратов). За 100% принято значение ПА данного образца до облучения.
Аобл/Ао Субстрат А/А 0.0.8 Казеин 0,800,0.ДАЦ-Тр Немод. Тр Азоколл 0,870,0.ПКА-ГА ПКА-А 0.BzArgNA 0,840,ПКА-А 0.0 2 4 6 8 10 BzArgOEt 0,840,Степень модиф. носителя, мгЭкв/г Рис.8. Действие гамма- облучения в дозе Таблица 2. Действие гамма- 25кГрей на ПА немодифицированного и им- облучения в дозе 25 кГрей на мобилизованного на текстильные ферментативные активности носители Тр. немодифицированного Тр.
Согласно экспериментальным данным доза излучения, допустимая для полимеров, сильно зависит от их структуры, но поглощенная доза 25 кГр обычно еще не вызывает значительного изменения их свойств, определяющих пригодность соответствующих изделий для медицинского применения.
Как видно из данных, приведенных на рис. 8, при степени окисления ДА - более 1 мгЭкв/г текстильный носитель оказывает на фермент защитное действие. Защитное действие модифицированного текстильного носителя при увеличении содержания альдегидных групп на матрице связано, на наш взгляд, не только с увеличением количества связей между альдегидными группами и белком, но и с радиопротекторными свойствами альдегид содержащего полимера. При увеличении степени модификации носителя остается большое количество свободных альдегидных групп, которые могут взаимодействовать с радикалами.
Анализ представленных в настоящем разделе данных свидетельствует о том, что процесс изменения ферментативной активности Тр, иммобилизованного на различных модифицированных текстильных носителях, - очень сложный и не до конца изучен. К тому же наличие различных ионов на текстильной матрице (которые могут остаться в ферментных препаратах после лосаждения белковой фракции или иммобилизации) может оказывать в процессе хранения разрушающее действие не только на ферментативную активность белка, но и на модифицированный текстильный носитель.
Кинетика инактивации иммобилизованного трипсина для препаратов белка, полученного после полного удаления солей (препараты для медицинских целей) приведена на рис. 6-7.
В системах иммобилизованных ферментов часто наблюдается смещение оптимума рН (по отношению к немодифицированному ферменту). Как следует из полученных нами данных, ДА - не сдвигает рН оптимум иммобилизованного трипсина (аналогичные данные были получены нами и для других исследованных ферментов: ПК, Кл, Кр и др.). Поликапроамидный носитель, обработанный глутаровым диальдегидом, сдвигает рН оптимум протеолитической активности в щелочную область рН. Сдвиг рН-оптимума иммобилизованного на ПКА Тр связан с отрицательным зарядом модифицированной полиамидной матрицы. ДА - также имеет небольшой отрицательный заряд за счет карбоксильных групп, но их количество очень мало и они не оказывают существенного влияния на положение рН-оптимума иммобилизованных препаратов (см. рис.9).
А/Аmax 1.0.0.0.0.Тр ДАЦ-Тр ПКА-ГА-Тр 0.5.50 6.50 7.50 8.рН Рис. 9. рН-зависимость ПА по казеину немодифицированного Тр и Тр, им- мобилизованного на текстильные носители.
Для перевязочных средств с иммобилизованными ферментами важно, чтобы фермент сохранял активность в течение времени лечения. Полученные в ходе выполнения данной работы данные для нативных и иммобилизованных ферментов показывают, что всегда существует две температурные области, где стабильнее или нативный фермент или модифицированный (рис.10).
А/Ао Тр (1.0 мг/мл) 0.Тр (0.005мг/мл) 0.ДАЦ-Тр 0.ПКА-ГА-Тр 0.ПКА-А-Тр 0.0.0.0.0.0 10 20 30 40 50 60 70 Время инактивации, ч Рис. 10. Изменение протеолитической активности модифицированного и немодифицированного трипсина (1/15 М ФБ, рН=7,8) в зависимости от времени (при 37 С).
ДАЦ-трипсин сохраняет при 37оС до 20 % от первоначальной активности в течение 3-х суток, что очень важно при обработке ран. Кроме того, ДА - содержит значительное количество пор, проницаемых для Тр (заполняемых ферментом в процессе иммобилизации). При длительных экспозициях иммобилизованных препаратов в жидкой среде происходит высвобождение ферментов во внешнюю среду (восстановление первоначальной ПА).
Таким образом, использование иммобилизованных ферментов на модифицированных текстильных носителях способствует значительному сохранению ПА Тр по сравнению с растворами фермента используемым в медицинских целях (лечебная концентрация Тр более 1 мг/мл).
Нами также было исследовано влияние ряда физиологически активных веществ на протеолитическую активность немодифицированного трипсина и трипсина, иммобилизованного на текстильных носителях. Целесообразность совместного применения ферментов и различных ЛВ обоснована способностью ферментов увеличивать проницаемость тканей, вследствие чего облегчается проникновение лекарственных препаратов в очаг воспаления, тогда как при отсутствии антибактериальных препаратов это свойство ферментов может привести к распространению воспалительного процесса.
Мочевина - одно из наиболее доступных и часто используемых веществ, действующих на струп для его разрыхления и последующего отторжения некротических тканей. Полученные нами данные о действии растворов мочевины на ПА ДАЦ-трипсина (рис. 11) показывают, что при использовании концентрированных растворов мочевины целлюлозный носитель защищает фермент.
Это может происходить благодаря действию нескольких факторов: присутствие как таковых углеводородов, модификация некоторых аминогрупп реакцией связывания, наличие большого количества связей белок-носитель.
В наших работах (совместно с проф. П.И.Толстых) было показано ускорение лечения гнойных ран препаратами иммобилизованного трипсина, обработанных 20% раствором мочевины по сравнению с трипсином, иммобилизованным на ДАЦ. Полученные данные приведены в таблице 3.
Средние сроки, Раневое покрытие, ис- сутки пользуемое для лече- Очище- Полное А/Ао ния ран ние ра- зажив0.ны ление 0.0.Медицинская марля 11,60,7 23,7 0.0,0.ДАЦ-Тр Дальцекс-трипсин 7,1 19,1 0.0,5 0,0.Тр Дальцекс-трипсин + 6,2 16,3 0., 20% раствор мочевины 0,2 0,0.0 Местное применение 8,5 21,6 0,1% раствора натив- 0,4 0,0 2 4 6 8 ного трипсина Концентрация, мочевины М Рис. 11. Влияние раствора мочевины Таблица 3. Результаты лечения (1/15М ФБ, рН 7,8) на ПА различных гнойных ран в эксперименте форм трипсина. in vivo (на крысах).
Получено разрешение МЗ РФ на промышленное производство волокнистых раневых покрытий, содержащих трипсин и мочевину, разработанных НИИ текстильных материалов совместно с МГТУ им. А.Н.Косыгина.
Одна из проблем, возникающих при использовании текстильных аппликаций, это их травматичность. К тому же, высыхая на воздухе или под повязкой, поверхность раны обезвоживается, и на ней образуется твердая корочка (струп). Подобный высохший слой представляет собой естественное препятствие для мигрирующих эпидермицитов, что значительно удлиняет время заживления. Нами было установлено, что 10%-ный раствор ДМСО не испаряется полностью с поверхности текстильного материала через 72 часа при 37С, что способствует сохранению атравматичных свойств аппликации.
Показано, что ДМСО и его водные растворы способствуют гидролитической деструкции ДАЦ, а это в свою очередь будет способствовать более легкому снятию салфетки с раны (повышение атравматичности текстильных препаратов). При изучении закономерностей воздействия растворов ДМСО на исследованные препараты выявлено, что изменение ПА наших образцов имеет пороговый вид аналогично данным других авторов. Увеличение температуры ускоряет снижение ПА иммобилизованных препаратов. ДМСО может быть использован в качестве растворителя на конечной стадии заживления раны, когда необходимо создание условий, благоприятных для восстановления кожного покрова.
Нами установлено, что растворы таких ЛВ, как мексидол (3-окси-6метил-2-этилпиридина сукцинат), фурагин, фурацилин, суперлимф, 20гидроксиэкдизон не оказывают влияния (в лечебной дозе) на протеолитическую активность как немодифицированного, так и иммобилизованного на текстильных носителях Тр.
Таким образом, проведённые физические, биофизические, микробиологические исследования показали, что раневые покрытия, в состав которых входит трипсин, обладают достаточными для раневого покрытия механическими, гигиеническими, свойствами и по показателям нетоксичности могут быть с успехом использованы в клинике для лечения гнойных ран.
Результаты исследований, полученных в настоящей главе, легли в основу опытно-промышленного регламента на получение медицинского (лекарственного средства) препарата Дальцекс-трипсин ПР 007891-01-2002 и салфетка с трипсином ТУ 9393-011-05824192-2003, а также ФС и ВФС на препараты Дальцекс-трипсин и Пакс-трипсин, на салфетки Протеокс-ТМ - соиммобилизованный трипсин и мексидол ТУ 9393-010-05824192-2003, выпускаемых в настоящее время для нужд медицины на опытном производстве НИИТМ.
Приказом Минздравсоцразвития России № 296 от 2.12.04 Дальцекс-трипсин (пункт 16) включен в перечень жизненно необходимых лекарственных средств.
В главе V описана разработка технологии получения препаратов протеолитических комплексов из отходов переработки пищевого сырья, иммобилизованных на модифицированных текстильных носителях, и исследование свойств полученных иммобилизованных композитов. Повышенное внимание к полиферментным препаратам объясняется их большей доступностью, простотой получения и выделения, более низкой стоимостью, а также тем, что смесь ферментов дает лучший результат при лечении ран. Протеолитические полиферментные препараты в настоящее время производятся из различного сырья.
В данной работе были использованы: Коллитин (Кл), Криллаза (Крз) - полиферментный препарат из отходов производства криля Bio Phausia (Uppsala, Швеция), ПК.
Полиферментный препарат коллитин получают из поджелудочной железы свиней (ВФС 42-2483-95). Кл применяется в качестве лекарственного средства для наружного применения и может найти широкое применение в медицине благодаря комплексному действию. Для более полной характеристики Кл нами были определены его элементный и аминокислотный составы. Определение молекулярных масс белков, входящих в состав Кл, проводили методами электрофореза и гель-хроматографии. Полученные данные подтверждают полиферментный состав Кл, выделенные белки имеют молекулярную массу в пределах 20-30 кДа. С использованием различных белковых и синтетических субстратов были определены ферментативные активности. Как нами установлено, Кл обладает трипсино-, химотрипсино- и эластазоподобной активностями.
Наибольшее распространение среди полиферментных протеолитических препаратов получил протеолитический комплекс, получаемый из гепатопанкреаса краба (ПК). Его физико-химические и биологические свойства изучены довольно хорошо. ПК содержит в своем составе помимо истинной коллагеназы другие сериновые протеиназы (как минимум 9), что и объясняет его широкую субстратную специфичность и уникальные терапевтические свойства. Характерным признаком ПК является его низкая изоэлектрическая точка (pI ниже 3,5). Для более полной характеристики ПК мы определяли ферментативные активности с использованием различных белковых и синтетических субстратов (табл.4).
Таблица 4.
Ферментативные активности коллитина и ПК.
Субстрат, активность Казеин, Азоколл, BzArgNA, BzArgOEt, BocAlaONp, BzTyrOEt, нМоль/мг/мин мкМоль/мг/мин нМоль/мг/мин мкМоль/мг/мин ПЕ/мг Ед/мг Кл 1,20,3 0,0530,003 60 3,6 280 7,ПК 3,20,3 0,0160,004 43 3,3 164 0,Кл был иммобилизован на ДАЦ, а ПК - на различные целлюлозные носители (Ц, ДА - разной степени модификации, Ц-Хт, ДАЦ-Хт). Полученные образцы высушивались на воздухе либо без отмывки, либо в случае необходимости отмывались водой и фосфатным буфером до отсутствия в промывных водах белка, либо сначала восстанавливались в кислых условиях бисульфитом натрия, затем отмывались водой и фосфатным буфером от продуктов реакции.
Кинетика изменения ферментативной активности образцов иммобилизованного Кл аналогична изменению ПА препаратов Тр, иммобилизованного на модифицированные текстильные носители.
При отмывке сорбированного белка после иммобилизации ПК на - или ДАЦ, из-за низкой pI протеиназ ПК, на матрице остается малое количество иммобилизованного белка. В связи с этим нами был синтезирован носитель, имеющий положительный заряд (Ц-Хт, ДАЦ-Хт). Для этого целлюлозная матрица (немодифицированная или окисленная перйодатом) была сначала обработана раствором хитозана, и на нее затем был иммобилизован ПК. К тому же хитозан (точнее - продукты его деградации) обладает ранозаживляющими и биоцидными свойствами.
На рис. 12 представлены полученные в настоящей работе зависимости изменения ПА ПК при иммобилизации на различные текстильные носители и изменение ПА иммобилизованных препаратов в процессе иммобилизации и хранения (при комнатной температуре, в темноте). Для всех рассматриваемых типов носителей (как и для иммобилизованного Тр) можно выделить три стадии инактивации ПК, иммобилизованного на текстильные носители (подробно обсуждено в разделе о Тр). Значения kин для препаратов ДАЦ-Кл, ДАЦ-Кр, ДАЦ-ПК, ДАЦ-Хт-ПК полученных в оптимальных условиях соответственно равны 0,39 и 0,07; 0,20 и 0,013; 0,28 и 0,06; 0,11 и 0,04 мес-1. В процессе хранения иммобилизованных препаратов происходит деструкция текстильного носителя из-за того, что коммерческие препараты полиферментных комплексов содержат разнообразные ионы, разрушающие текстильный носитель в процессе хранения и эксплуатации, поэтому скорость инактивации иммобилизованных комплексов выше скорости инактивации иммобилизованного Тр.
А/Ао 0.0.Ц-ПК ДАЦ(0,44)-ПК 0.ДАЦ(0,57)-ПК(6,0) 0.ДАЦ(0,57)-ПК(7,0) 0.ДАЦ(2,9)-ПК 0.Ц-Хт-ПК ДАЦ(0,41)-Хт-ПК 0.ДАЦ(2,9)-Хт-ПК 0.0.0 6 12 18 24 30 Время хранения, мес.
Рис. 12. Изменение ПА ПК, иммобилизованного на целлюлозных матрицах, в процессе хранения (в скобках дано содержание альдегидных групп мгЭкв/г).
Нами показано, что гамма-облучение в меньшей степени (~ на 2535%), влияет на амидазную активность ДАЦ-Кл (по BzArgpNA), чем на общую протеолитическую активность (субстрата казеин); аналогичные данные были получены и для ДАЦ-Тр. Это может быть связано с различным действием гамма облучения на иммобилизованные ферменты, входящие в состав полиферментной композиции Кл. Данные, приведенные в табл. 5, показывают, что действие гамма облучения (доза 25 кГрей) практически одинаково на исследованные немодифицированные протеолитические препараты.
Таблица 5.
Действие гамма облучения в дозе 25 кГрей на ферментативные активности (А/А ) Кл, панкреатической эластазы и Тр.
Фермент Кл Эластаза Тр Субстрат Казеин 0,830,10 0,870,10 0,800,Азоколл 0,860,10 0,860,10 0,870,Денатурированный коллаген 0,890,10 BzArgpNA 0,870,10 0,880,12 0,840,BzArgOEt 0,780,15 0,840,BzTyrOEt 0,980,20 BocAlaONp 0,830,15 0,790,10 измерения не проводились.
Образцы Кл обладают большей термостабильностью в растворе по сравнению с панкреатическим Тр. Особенно это касается щелочных значений рН и концентраций ферментов, используемых для медицинских целей.
pH оптимум ПА Кл сдвинут в щелочную сторону по сравнению с Тр (аналогично панкреатической эластазе). Иммобилизация Кл на ДАЦ, как и в случае с Тр, не сдвигает профиль рН оптимума ферментативной активности.
На рис. 13 приведены рН-зависимости протеолитической активности растворов ПК и иммобилизованного ПК (субстраты казеин по Гаммерстену и азоколл). Ни ДАЦ, ни - не сдвигают рН-оптимума иммобилизованного ПК (аналогично Тр). Как следует из полученных нами данных, рНЦоптимум действия протеиназ, входящих в состав ПК, лежит либо в нейтральной, либо в слабощелочной области рН, что согласуется с данными других авторов. Для хитозансодержащих матриц с иммобилизованным ПК отсутствует сдвиг рНоптимума ферментативной активности в кислую область значений рН, т.к. положительный заряд матрицы (за счет хитозана) при иммобилизации нейтрализуется за счет отрицательно заряженного комплекса.
А/А7.А/A7,А 0,0,Б 0,0,0,ПК 0,Ц-Хт-ПК ДАЦ(0,41)-Хт-ПК ПК 0,0,ДАЦ(0,75)-Хт-ПК ДАЦ-Хт-ПК ДАЦ(2,9)-Хт-ПК" 5 6 7 8 5 6 7 рН рН Рис.13. рН-зависимость протеолитической активности ПК и ПК, иммобилизованного на хитозансодержащих целлюлозных матрицах.
А - субстрат казеин по Гаммерстену, Б - субстрат азоколл.
При щелочных значениях рН (более 8,5) и модификации ДА - более 0,мгЭкв/г происходит частичное или полное растворение препарата, и раствор после совместной инкубации, приобретает желтый цвет (от светло-желтого до- ярко-оранжевого). Увеличение относительной ПА при этом может быть связано с образованием комплексов казеина, хитозана и (или) раствора ДАЦ, которые легче протеолизируются ПК. Изменение рН-оптимума может быть связано с изменением структуры белка (казеина) в зависимости от значения рН и с экспонированием ранее погруженных вглубь молекулы пептидных связей. При использовании азоколла профиль рН-зависимости ПК не меняется, что может быть связано с тем, что азоколл является суспензией. В целом иммобилизация ПК (и всех исследованных ферментов) на различные целлюлозные матрицы (независимо от их заряда) сужает профиль рН ферментативной активности в изученных диапазонах рН.
На рис.14 и 15 представлены данные о термоинактивации нативного и модифицированного ПК в растворе. ПК является более стабильным препаратом чем панкреатический Тр, особенно при рН 7,8 и лечебных концентрациях (более 1 мг/мл). Из данных, полученных нами, следует, что изменение ПА ПК р-р ПК (37С) р-р ПК (45С) Ц-Хт-ПК (37С) Ц-Хт-ПК (45С) р-р ПК 25С р-р ПК 37С р-р ПК 45С ДАЦ(0,44)-Хт-ПК (37С) ДАЦ(0,44)-Хт-ПК (45С) ДАЦ(0,75)-Хт-ПК (37С) ДАЦ(0,75)-Хт-ПК(45С) р-р ПК 55С Ц-ПК 25С Ц-ПК 37С ДАЦ(2,9)-Хт-ПК (37С) ДАЦ(2,9)-Хт-ПК (45С) Ц-ПК 45С Ц-ПК 55С A/Aо Ai/Ao 0.0.0.0.0.0.0.0.0 0.5 1 1.5 2 2.5 Время, ч. 0 5 10время, ч.15 20 Рис.14. Термоинактивация иммобилизо- Рис.15. Термоинактивация иммованного и немодифицированного ПК в билизованного на хитозансодер- растворе 1/15М ФБ (рН 7,8). жащие целлюлозные носители и немодифицированного ПК в 1/15М растворе ФБ (рН 7,8).
не зависит от концентрации комплекса, состава буферного раствора (ФБ, TRIS) или инактивационной среды (NaCl). Иммобилизация ПК на текстильных носителях также (как и в случае с Тр) не приводит ни к стабилизации, ни к дестабилизации фермента за исключением образцов с высокой степенью модификации ДА - (более 0,75 мгЭкв/г) и длительных экспозиций образцов (более 24 часов).
При высокой степени модификации ДА - носитель легче подвергается гидролитической деструкции, что может приводить к образованию стабильных конгломератов ПК, либо облегчать выход активного фермента в раствор.
Мы исследовали поведение ПК и иммобилизованного на текстильные носители ПК в присутствии различных ЛВ и изучили проявление защитных или деструктурирующих свойств текстильного носителя.
Показано, что мексидол (до конечной концентрации в пробе 1 мас.%), фурагин, фурацилин, 20-гидроксиэкдизон, суперлимф (до 60 мкг/мл), трилон Б (до 500 мг/мл) не оказывают заметного влияния на протеолитическую активность как модифицированного, так и немодифицированного ПК.
Важнейшей характеристикой ферментов, которые могут быть использованы в качестве лекарственных препаратов, является их устойчивость к действию ингибиторов, содержащихся в организме человека, и в особенности ингибиторов крови. При изучении взаимодействия иммобилизованного фермента с белками плазмы крови необходимо учитывать, что фермент, содержащийся на носителе после иммобилизации (в промышленно выпускаемых препаратах), можно условно разделить на три составляющие: 1-механически включенный, 2-сорбированный и 3-ковалентно связанный.
1 - механически включенный фермент остается после удаления влаги с носителя, он образуется за счет пропиточного раствора. Это тот фермент, который образует лударную дозу и выходит с носителя первым. Большая часть включенного фермента взаимодействует с тканевыми ингибиторами протеиназ, а оставшиеся свободными (не образовавшие комплекс с ингибиторами) ферменты начинают процесс протеолиза гнойного отделяемого. В зависимости от условий иммобилизации количество этой фракции может достигать 15%.
2 - сорбированный фермент, связанный с носителем за счет ионных, водородных, вандер-ваальсовых связей и за счет неспецифической сорбции (как молекулами диальдегидцеллюлозы, так и немодифицированной целлюлозы или другого носителя).
3 - ковалентно связанный фермент: это фермент, связанный азометиновой связью с альдегидными группами матрицы. Причем следует иметь в виду, что часть ковалентно связанного фермента может переходить в раствор вследствие гидролитической деструкции носителя, как в виде растворимых, так и нерастворимых высокомолекулярных конгломератов. Например, чем выше степень окисления ДА - и чем более щелочное значение рН среды, тем легче и быстрее идет процесс гидролитической деструкции. Также следует иметь в виду, что в процессе хранения модифицированный целлюлозный носитель деструктурирует.
Для изучения взаимодействия текстильных материалов и ингибиторов плазмы крови образцы носителей инкубировали с плазмой крови (соотношение носитель: плазма (вес/объем) = 1:6; 1:10; 1:18; 1:20) при комнатной температуре. Нами установлено, что изучаемые ингибиторы плазмы крови не подвергаются значительному протеолизу (с потерей ингибиторной активности) самим ПК.
Таблица 6.
Взаимодействие 1ПИ и 2М с целлюлозными носителями, не содержащими ПК.
Время взаимо- Целлюлоза ДА - (2,5 мгЭкв/г) действия, ч Носитель : плазма (вес/объем) 1:10 1:20 1:6 1:10 1:0,25 55 64 3510 127 7Сорбция 1ПИ,% 1 55 83 485 187 2524 0 - - 208 - Сорбция 0,25 0 0 255 73 102М,% 1 83 0 428 115 1024 96 - - 377 - - измерения не проводились.
Как видно из данных табл.6, сорбция ингибиторов на целлюлозных носителях зависит от соотношения концентраций плазмы и целлюлозного носителя.
Немодифицированная целлюлоза, в отличие от ДАЦ, в незначительной степени неспецифически сорбирует белковые молекулы. Процесс взаимодействия эндогенных ингибиторов протеиназ плазмы крови с иммобилизованным ПК растянут во времени, что связано, с защитным действием текстильного носителя (табл.7).
Таблица 7.
Взаимодействие иммобилизованного ПК с 1ПИ и 2М в плазме крови (соотношение матрица : плазма крови = 1:10 (вес/объем)) Время кон- ДА - ДАЦ-ПК ДАЦ-ПК + 0,такта, ч М NaCl 1 17.55,0 285 15Сорбция 1ПИ,% 24 205 606 35Сорбция 1 115 155 112М,% 24 375 728 49ДАЦ-ПК - образцы ПК, иммобилизованные на ДА - и содержащие 5.2 2.0 мг белка /г, ДАЦ-ПК + 0,1 М NaCl - образцы ПК, иммобилизованные на ДА - и отмытые от сорбированного белка водой и 0.1 М NaCl и содержащие 2.51.2 мг белка/г.
Аналогично панкреатическому Тр, иммобилизация ПК на модифицированные текстильные носители предохраняет его от инактивирующего действия ЛВ, особенно высокомолекулярных и белковой природы (ОПИТ, соевый ингибитор и др.).
Для ДАЦ-Кл и ДАЦ-Хт-ПК были проведены токсикологические, медикобиологические и клинические исследования. Иммобилизованный на модифицированных текстильных носителях Кл был разрешен к клиническому применению Комитетом по новой медицинской технике. ПК, иммобилизованный на хитозансодержащей матрице (ФМультифермФ, ТУ-9393-025-05824192-2006) разрешен к промышленному выпуску и применению в лечебных учреждениях РФ для лечения гнойно-некротических и ожоговых ран, пролежней и т.п.
Получены положительные результаты клинических испытаний ДАЦ-Кл на ожоговых ранах в Московском НИИ скорой помощи им. Склифосовского и на гнойных ранах в Московской медицинской академии им. Сеченова. Медикобиологические исследования препаратов иммобилизованного на модифицированные текстильные носители Кл и ПК были проведены в Институте лазерной медицины (отделение проф. П.И. Толстых). Изучение влияния раневых покрытий на течение раневого процесса и скорость очищения и заживления ран проведено на белых крысах самцах линии ФВистарФ массой 19010 г, которым наносили плоскостную кожно-мышечную инфицированную рану. Полученные данные приведены в табл. 8.
Таблица 8.
Сравнение результатов лечения гнойных ран у крыс с использованием иммобилизованных ферментов.
Материал и метод Количество Время, сутки Ускорение лечения животных, n заживления Очищение Полное % раны заживление Без лечения (контроль) 20 14,90,8 27,20,2 - Медицинская марля 20 13,30,6 24,20,5 11,Диальдегидцеллюлоза 20 11,60,7 23,70,5 12,ДАЦ-трипсин 20 7,10,5 19,10,5 29,ДАЦ-коллитин 20 4,90,5 15,11,3 44,Аппликация 20 3,00,2 12,10,1 55,Мультиферм Местное применение 0,1% 20 8,50,4 21,60,4 20,раствора трипсина Местное применение 0,1% 20 7,80,5 21,20,3 22,раствора коллитина Анализ сроков очищения ран от гнойно-некротических масс и полного заживления показал, что иммобилизованные формы ферментов значительно эффективнее, чем соответствующие нативные препараты. Это объясняется тем, что нативные (немодифицированные) ферменты быстро инактивируются и смываются в раневом отделяемом, в то время как иммобилизованные препараты более стабильны и обладают пролонгированным действием. Кроме того, лечебный эффект материалов, содержащих комплекс ферментов (Кл или ПК), выше по сравнению с моноферментными препаратами (например Тр).
Таким образом нами доказано, что замена моноферментного препарата трипсина на комплексный полиферментный препарат позволит не только снизить цену единицы изделия, но и сократит сроки лечения и расширит возможности терапии иммобилизованными ферментами.
В главе VI описана разработка технологии получения препаратов иммобилизованного поливалентного ингибитора протеиназ на модифицированных текстильных носителях и исследование свойств полученных препаратов иммобилизованного ингибитора.
Среди большого числа биологически активных веществ в ране особое место занимают системы протеаз и их ингибиторов. Протеолитические ферменты, вызывая расщепление белковых веществ, образовавшихся при распаде клеток, способствуют очищению раны и обеспечивают реутилизацию аминокислот. В то же время повышенная активность протеолитических ферментов может оказывать неблагоприятное действие на процессы регенерации. Можно ожидать, что ингибиторы протеолитических ферментов будут весьма эффективны в стимуляции репаративных процессов в ране.
Нами получены препараты поливалентного ингибитора протеиназ (ПИП), иммобилизованного на нерастворимых текстильных носителях (целлюлоза, ДА - и ПКА-ГА). Следует особо отметить, что ингибиторная активность полученных материалов на текстильных носителях в отличие от препаратов протеолитических ферментов не изменяются в течение наблюдаемого срока при хранении в стандартных условиях.
Для терапевтических целей необходимо знать кинетику выхода иммобилизованного вещества в рану. Благодаря стабильности ПИП в растворе можно оценить кинетику выхода биологически активных веществ с аналогичных текстильных носителей.
Нами показано, что препараты ДАЦ-ПИП обладают значительно большим пролонгированным действием по сравнению с полиамидным носителем, особенно в кислой области рН (рис.16,17). Время выхода заданного количества лекарственного препарата можно изменять, варьируя степень модификации носителя (содержание альдегидных групп указано в скобках, мыт - образцы, отмытые от сорбированного белка).
Из данных литературы следует, что в первые дни после вскрытия гнойника в раневом экссудате наблюдается высокая активность про- теолитических ферментов. По мере очищения раны от гнойно-некротического ДАЦ(0.2)-Инг(мыт.) 7.8 ДАЦ(0.2)-Инг(не мыт.) 7.8 ДАЦ(0.2)-Инг(мыт) 6.ДАЦ(0.2)-Инг(не мыт.) 6.0 ДАЦ(3,1)-Инг(мыт) 7,8 ДАЦ(3,1)-Инг(немыт) 7,ДАЦ(3,1)-Инг(мыт) 6,0 ДАЦ(3,1)-Инг(немыт) 6,It/Io 0,0,0,0,0 5 10 15 20 Время, ч Рис.16. Кинетика выхода активного ПИП с препаратов ДАЦ-ПИП (It/Io).
Ц-Инг (мыт) 7.8 Ц-Инг (не мыт) 7.8 Ц-Инг (мыт) 6.Ц-Инг (не мыт) 6.0 ПКА-ГА-Инг (мыт) 7.8 ПКА-ГА-Инг (не мыт) 7.ПКА-ГА-Инг (мыт)6.0 ПКА-ГА-Инг (не мыт) 6.It/Io 0.0.0.0.0 5 10 15 20 Время, ч.
Рис. 17. Кинетика выхода активного ПИП с препаратов Ц-ПИП и ПКА-ГАПИП (It/Io).
содержимого (с переходом раневого процесса в фазу регенерации) активность протеиназ значительно снижается, однако она не исчезает полностью до полного заживления раны. И, как было установлено в эксперименте, ингибиторы протеолитических ферментов не оказывают положительного влияния на течение раневого процесса в первой его фазе. Во второй фазе раневого процесса - регенерации - ингибиторы протеаз оказывали стимулирующее влияние на процессы регенерации. Аналогичные данные были получены при клинических испытаниях иммобилизованного на модифицированные текстильные носители ПИП (отделение лечения ожогов Института хирургии им. А.В. Вишневского).
ечебный эффект иммобилизованного ПИП был испытан на больных с ожогами от 15 до 65 % поверхности тела, препарат накладывали на гранулирующие раны. При применении иммобилизованного ингибитора в раневом экссудате к моменту готовности раны к дермопластике снижалась концентрация белка и активность катепсинов, в то время как в экссудате из контрольных участков эти показатели были повышены. Клинико-лабораторные испытания показали, что иммобилизованный ПИП оказывает благоприятное действие на течение раневого процесса, купирует воспалительную реакцию в ране и стимулирует рост грануляций.
Таким образом, если в первой фазе раневого процесса патогенетически обосновано применение тех или иных протеолитических ферментов, которые ускоряют очищение раны от гнойно-некротического содержимого и способствуют более раннему появлению грануляций и эпителизации (о чем подробно нами доложено в главах 4 и 5), то во второй фазе этого процесса угнетение активности протеолитических ферментов в ране с помощью ингибиторов является патогенетически обоснованным, стимулирующим процессы регенерации в ране, в несколько раз сокращает сроки заживления.
В главе VII приводится технико-экономическое обоснование использования препаратов иммобилизованных ферментов.
Оценка эффективности использования терапевтических систем на примере использования иммобилизованного Тр, которая базировалась на анализе лечения больных с различными гнойными воспалительными хирургическими заболеваниями приведена в табл.10.
Как видно из данных табл.10, иммобилизованный Тр эффективнее, чем нативный фермент или антисептики по всем показателям в 1,5-4 раза.
Таблица 10.
Клиническая эффективность применения иммобилизованного трипсина для лечения гнойно-некротических ран.
Эффективность метода лечения, сутки Иммобилизо- Нативный Гипертонический рас Показатели ванный трипсин трипсин твор, антисептики Полное очищение ран 4,5 7,6 8,Койко-день 3,0 10,3 11,Заживление от начала 15,0 19,3 25,лечения Выводы.
В результате выполненных исследований:
1. Решена важная народнохозяйственная и социальная задача по созданию нового ассортимента текстильных материалов медицинского назначения с заданными лечебными свойствами.
2. Разработаны технологические режимы получения новых раневых покрытий с заданными свойствами, в том числе соиммобилизацией лекарственных веществ разных классов на один носитель с учетом их совместимости и предполагаемого синергизма действия. Получены новые медицинские материалы на основе модифицированных волокнообразующих полимеров, содержащие биологически активные вещества, и определены их области применения. Создана гибкая универсальная технологическая линия, позволяющая выпускать медицинские изделия на стандартном технологическом оборудовании.
3. Разработаны удобные и достоверные методы определения содержания и активности биологически активных веществ на нерастворимых модифицированных текстильных носителях. Всесторонне исследованы энзиматические свойства полученных иммобилизованных ферментов.
4. Впервые выявлена взаимосвязь между потерей протеолитической активности у иммобилизованных на нерастворимых модифицированных текстильных носителях моно- и полиферментных протеолитических препаратов и сроком хранения в стандартных условиях.
5. Установлено, что разработанные иммобилизованные препараты не обладают токсическим, гемолитическим, аллергенным действием, а также цитотоксическим эффектом и мутагенной активностью.
6. Показано, что в условиях человеческого организма наиболее целесообразно для стабилизации иммобилизованных ферментов использовать комбинацию методов химической модификации и физической сорбции. Такой подход позволяет получать препараты с широким спектром действия.
7. Показано, что лечебный эффект материалов с полиферментными препаратами выше, чем у моноферментных препаратов (при сравнении сроков очищения и полного заживления ран). Кроме того, изделия, полученные на основе полиферментных препаратов, имеют меньшую себестоимость.
8. Иммобилизованные на нерастворимых текстильных носителях ферменты медицинского назначения демонстрируют в медико-биологических испытаниях высокую эффективность действия, применяются (иммобилизованные белки) в малых дозах, не вызывают токсико-алергических реакций, удобны для повседневного использования как в быту, так и в стационарах или военно-полевых условиях.
9. В экспериментах на животных показано, что использованная модификация ферментов не влияет существенно на их каталитические свойства, повышает стабильность в биологических системах и не сказывается радикальным образом на их удалении из организма. Модифицированные БАВ оказываются более эффективными терапевтическими средствами по сравнению с нативными препаратами при лечении различных заболеваний.
Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:
Авторские свидетельства и патенты:
1. Толстых П.И., Герцен А.В., Рыльцев В.В., Филатов В.Н., Белов А.А., Арутюнян Б.Н., Хусаинов Р.З. Способ лечения трофических язв. А.С. № 1598269 от 13.05.88. Решение от 08.06.90.
2. Пронин В.И., Рыльцев В.В., Вельшер Л.З., Филатов В.Н., Белов А.А., Шапошников Ю.Т., Игнатюк Т.Е., Розанов Ю.А., Шаборов В.М., Вирник Р.Б. Способ получения средства для лечения эрозивно-язвенных образований внутренних органов. А.С. № 4635886/14 от 24.01.89. Решение от 24.08.90.
3. Белов А.А., Игнатюк Т.Е., Рыльцев В.В., Филатов В.Н. Способ получения перевязочных целлюлозных материалов, содержащих иммобилизованный трипсин. А.С. № 1773067 от 24.11.89 Решение от 01.07.92.
4. Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е., Филатов В.Н., Стекольников Л.И., Пронин В.И., Толстых П.И., Гостищев В.К., Арутюнян Б.Н., Вельшер Л.З., Белов А.А. Способ получения перевязочного материала, содержащего фермент А.С. №1683323 от 20.06.89. Решение от 08.06.91.
5. Рыльцев В.В., Белов А.А., Гриценко С.И., Филатов В.Н. Способ получения текстильного поликапроамидного носителя для иммобилизации биологически активных веществ. А.С.
№-4855929/05/083643 от 31.07.90, Решение от 26.06.91.
6. Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е, Казанская Н.Ф., Ларионова Н.И., Донецкий И.Л..
Способ получения материала обладающего биологической активностью. Заявка №94004263/14 / 004399 от 09.02.94, Решение от 21.12.95.
7. Грачев С.В., Кассин В.Ю., Воробьева В.М., Павлова Л.А., Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е., Филатов В.Н. Способ получения перевязочного материала. Патент РФ № 2108077 от 30.06.93 Решение от 10.04.8. Промоненков В.К., Бурмака В.В., Рыльцев В.В., Филатов В.Н., Медушева Е.О., Белов А.А., Филатов Н.В., Толстых П.И., Толстых М.П., Мельниченко В.И., Петушков Д.В. Способ получения перевязочного материала. Патент РФ № 2203684, от 20.11.2000, выдан 10.05. 2003.
9. Белов А.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н., Филатов Н.В. Медицинская повязка, содержащая комплекс протеолитических ферментов, включая коллагенолитические протеазы из гепатопанкреаса краба. Патент RU № 2 268 751 C2.
10. Белов А.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н. Медицинская повязка, содержащая комплекс ферментов из гепатопанкреаса краба, и способ ее получения. Патент RU № 2 323 748 C2.
Статьи 11. Белов А.А, Плеханова Н.Ю., Вирник Р.Б., Игнатюк Т.Е. Сравнительная оценка методов определения количества трипсина, иммобилизованного на текстильных материалах //Сб.
науч. тр. ВНИИТГП, Разработка новых видов текстильных изделий мед. назначения, ЦНИИТЭИ Легпром. М, 1988, с. 25-29.
12. Игнатюк Т.Е., Белов А.А., Mедушева Е.О., Егорова И.Н. Инактивация трипсина, иммобилизованного на целлюлозных текстильных материалах //Сб. науч. тр. ВНИИТГП "Разработка новых видов текстильных изделий медицинского назначения", М.:ЦНИИТЭИЛегпром, 1988, с. 39-45.
13. Белов А.А., Белова Л.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е., Филатов В.Н. Влияние -облучения на ферментативную активность коллалитина в процессе хранения // Радиобиoлогия, 1990, т-30, №-4, с. 519-521.
14. Белов А.А., Рушайло Б.Е., Гриценко С.И., Рыльцев В.В. Прогнозирование измения протеолитической активности иммобилизованного трипсина в процессе хранения // Сб. науч. тр.
ВНИИТГП М., ЦНИИТЭИ Легпром, 1990, с. 21-15. Белов А.А., Игнатюк Т.Е., Ларионова Н.И., Казанская Н.Ф. Взаимодействие растворов трипсина с текстильными материалами, содержащими поливалентный ингибитор протеиназ //Сб. науч. тр. ВНИИТГП - М. ЦНИИТЭИлегпром, 1991, с. 36-16. Белов А.А., Гриценко С.И., Белова Е.Н. Применение простых аналитических реакций в контроле производства трипсина, иммобилизованного на текстильных носителях // Сб. науч. тр. ВНИИТГП М., ЦНИИТЭИ Легпром, 1991, с.42-48.
17. Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е., Филатов В.Н. Влияние текстильных носителей на свойства иммобилизованного трипсина //Хим. волокна 1992. №.4. C.33-34.
18. Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е. Методы определения протеолитической активности в промышленных образцах препаратов иммобилизованных протеиназ //Химикофармацевтический журнал 1992. №.11-12. C.101-103.
19. Белов А.А., Гриценко С.И., Таршиц Д.Л., Рыльцев В.В. Определение количества белка на текстильных носителях //Сб. науч. тр. НИИТМ М., ЦНИИТЭИ Легпром, 1992, с.22-27.
20. Белов А.А., Гриценко С.И., Рыльцев В.В., Рушайло Б.Е. Кинетика инактивации трипсина иммобилизованного на диальдегидцеллюлозе //Сб. науч. тр. НИИТМ М., ЦНИИТЭИ Легпром, 1992.с.27-30.
21. Белов А.А., Игнатюк Т.Е., Ларионова Н.И., Казанская Н.Ф., Рыльцев В.В. Кинетика выхода поливалентного ингибитора протеиназ с текстильного носителя //Сб. науч. тр. НИИТМ - М. ЦНИИТЭИлегпром - 1993. с. 22-27.
22. Белов А.А., Белова Л.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е. Исследование некоторых свойств коллитина //Сб. науч. тр. НИИТМ М., ЦНИИТЭИ Легпром, 1993, с.34-37.
23. Ignatyuk T.E., Larionova N.I., Belov A.A., Ryltsev V.V., Zaets I.L.Тhe immobilized proteinase inhibitors in burn treatment // Data Medica J., (Israel), 1994, V.2, № 1, p. 61.
24. Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е., Филатов В.Н. Влияние количества связанного с диальдегидцеллюлозой фермента на активность иммобилизованного трипсина после гамма-облучения и в процессе хранения //Радиационная биология Радиоэкология, 1994, т. 34, вып. 2, с. 306-310.
25. Апосталиди К.Г., Ильин В.К., Белов А.А., Рыльцев В.В. Использование трипсина и лизоцима, иммобилизованных на целлюлозном носителе, при лечении наружных отитов // Вестник отоларингологии 1994, №-2 (март-апрель), С. 42-43.
26. Белов А.А. Влияние текстильного носителя на свойства иммобилизованных биологически активных веществ //Юбилейный сб. трудов, посвященный 10-летию Международной и Российской инженерных академий, Москва, 2000, с. 68-77.
27. Белов А.А, Филатов В.Н., Рыльцев В.В., Медушева Е.О. Создание промышленной технологии и организация производства раневых покрытий на основе биологически активных текстильных материалов с учетом требований международных стандартов отчет о НИР/ НИИ текстильных матерралов.- № госрегистрации 01.200.2 05951; Инв. № 02.200.304026.- М., 2002. Госконтракт № 16.802.11.0005 от 18.03.2002.
28. Белов А.А, Белова Л.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н., Донских Г.Н., Горбунова М.Н.
Взаимодействие ингибиторов протеиназ плазмы крови с иммобилизованным на диальдегидцеллюлозе протеолитическим комплексом из гепатопанкреаса краба // Вестн. МГУ, сер.2. Химия, 2003, т.44, № 1, с. 16-19.
29. Филатов В.Н., Рыльцев В.В., Белов А.А, Медушева Е.О. Разработка промышленной технологии получения нового класса медицинской продукции // Наука и промышленность, № 2-3 (70-71), февр.-март, 2003, с. 40-48.
30. Толстых П.И., Дербенев В.А., Медушева Е.О., Филатов В.Н., Белов А.А, Филатов Н.В., Рыльцев В.В., Денисов В.В., Гостищев В.К., Липатов К.В., Овчарова Т.С. Лечение гнойных ран и язв различного генезиса с использованием терапевтических систем иммобилизованного трипсина. Пособие для врачей. Москва, 2004, 2005, 2008, 14 с.
31. Белов А.А. Влияние водных растворов диметилсульфоксида на немодифицированные и иммобилизованные ферменты //Химическая технология № 12, 2004, С. 35-40.
32. Белов А.А. Влияние физиологически активных веществ на протеолитическую активность немодифицированного трипсина и трипсина, иммобилизованного на текстильные носители //Сборник научных трудов ФГУП НИИТМ, М.: Дипак, 2006.- с. 12-28.
33. Белов А.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н., Кузьмина И.В. Новый текстильный ранозаживляющий материал с полиферментной активностью - мультиферм //Сборник научных трудов ФГУП НИИТМ, М.: Дипак, 2006.- с. 34-42.
34. Белов А.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н., Казанская Н.Ф. Изменение протеолитической активности трипсина иммобилизованного на альдегидсодержащие текстильные носители в процессе иммобилизации и хранения // Вестн. МГУ, сер.2. Химия, 2006, т.47, № 2, с. 87-35. Белов А.А., Кузьмина И.В., Белова Е.Н., Марквичев Н.С., Филатов В.Н. Разработка целлюлозных текстильных материалов, содержащих хитозан и протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба, исследование их свойств //Хим. волокна, 2007, № 4, с.3-6.
36. Белов А.А. Протеолитические ферменты, иммобилизованные на текстильных носителях для оказания помощи в чрезвычайных ситуациях //Медицинский алфавит. Скорая помощь и реанимация, 2007,10 (IV), С. 25-28.
37. Белов А.А. Синтез и исследование свойств альдегидсодержащих текстильных материалов с иммобилизованными протеиназами. Процессы старения альдегидсодержащих текстильных материалов //Сборник научных трудов НИИТМ, М.: Дипак, 2008, с. 40-48.
38. Белов А.А., Белова Е.Н., Филатов В.Н., Лебедева А.Н. Разработка и исследование свойств текстильных материалов, содержащих протеолитические ферменты //Хим. волокна, 2008, № 5, с.52-54.
39. Белов А.А., Белова Е.Н., Филатов В.Н. Текстильные материалы, содержащие хитозан и протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба, для медицинских целей //Биомедицинская химия, 2009, Т. 55.-№ 1, с.61-67.
Тезисы докладов (избранные) 40. Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е., Стекольников Л.И. Действие гамма облучения на ферментативную активность коллалитина и коллагеназы краба //Тез. докл. 3-й Всесоюз.
научно-технической конференции "Актуальные проблемы производства кровезаменителей, консервантов, крови, гормональных и органотерапевтических препаратов", Москва, 1987, с. 208.
41. Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е., Гриценко С.И. Инактивация -облученного трипсина // Тез. докл. Первого Всесоюзного Радиобиологического съезда, Москва, 1989, т.1, с. 17-18.
42. Белов А.А., Игнатюк Т.Е. Оценка специфических свойств перевязочного материала на основе диальдегидцеллюлозы с иммобилизованным трипсином // Тез. докл. Первой Всесоюзной конференции "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и шовных материалов" Москва, 1989, с. 135-137.
43. Ignatyuk T.E., Belov A.A., Ryltsev V.V., Filatov V.N. Тhe characteristics of the textile cellulose wound dressings with immobilized enzymes //Proc. 20-th FEBS Meeting, Budapest, Hungary, 1990, p.240.
44. Belov A.A., Ignatyuk T.E., Ryltsev V.V. The use of Bredford method for the analysis of textile biomaterials // Тез. докл. 2 Национальная конференция "Биоматериали", Варна, НРБ, 1990, s.102-103,176-177.
45. Белов А.А., Игнатюк Т.Е., Филатов В.Н. Влияние текстильных носителей на свойства иммобилизованного трипсина //Тез. докл., Всесоюзной научной конференции "Проблемы модифицирования природных и синтетических волокнообразующих полимеров Москва, 1991, с. 85-86.
46. Белов А.А., Игнатюк Т.Е., Толстых П.И., Герцен А.В. Использование азоколла для характеристики перевязочного материала, содержащего полиферментный препарат "Коллитин" //Тез. докл., Первая Международная конференция "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и полимерных имплантантов" Москва, 1992, с. 105107.
47. Belov A.A., Ryltsev V.V., Ignatyuk T.E., Filatov V.N. Antiproteinase and polyenzyme wound dressing // Proc. 3-th, Internal Congress on Wounds, Burns and Dressings, Tel-Aviv, 1994, p. 22, 111.
48. Belov A.A., Ignatyuk T.E., Filatov V.N., Ryltsev V.V. Study properties and immobilization to textile carriers of collagenolitic complex from hepatopancreas of crab // "Proc. 3-th, Internal Congress on Wounds, Burns and Dressings", Tel-Aviv, 1996, p. 104, 164.
49. Белов А.А., Рыльцев В.В., Филатов В.Н. Изучение свойств и иммобилизация на текстильных носителях полиферментных препаратов //Тез. докл., IV симпозиум "Химия протеолитических ферментов", Москва, 1997, с. 147.
50. Ryltsev V.V., Filatov V.N., Medusheva E.O., Belov A.A., Moroz N.A. Using of immobilized enzymes in medicine //"Proc. International conference BIOCATALYSIS-98: fundamentals & applications" Puscino on the Oka fundamentals & applications, 1998, Puscino on the Oka, Russia, p.53.
51. Белов А.А., Рыльцев В.В., Денисов В.В. Устойчивость текстильных материалов с иммобилизованным "Коллитином" к действию инактивирующих агентов //Тез. докл., Всероссийской научно-технической конференции "Современные технологии и оборудование текстильной промышленности" (Текстиль-98). Москва, 1998, c. 190-191.
52. Belov A.A., Ryltsev V.V., Medusheva Y.O., Filatov N.V. Сrillase immobilization on textile carriers //" Proc. 6-th, Internal Congress on Wounds, Burns and Dressings", Tel-Aviv, 2000.
53. Belov A.A., Ryltsev V.V., Filatov V.N., Filatov N.V., Donskikh G.N. Preparation and properties of krillase immobilized on dialdehidecellulose //"Proc. Intern. conf. BIOCATALYSIS- 2000:
fundamentals & applications", 2000, Moscow, p.72.
54. Belov А.A., Belova L.A., Filatov V.N., Lаgunov V.A., Filatov N.V., Donskikh G. N., Byelova Ye.N. Effects of blood plasma inhibitors on the activity of proteases immobilized on dialdehydecellulose //"Proc. International conference BIOCATALYSIS - 2002: fundamentals & applications", 2002, Moscow, p.71-72.
55. Белов А.А., Белова Л.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н., Филатов Н.В., Горбунова М.Н. Иммобилизация и исследование свойств протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба // Тез. докл., 1-й международный конгресс "Биотехнология состояние и перспективы развития". Москва, 2002, с.72.
56. Филатов В.Н., Белов А.А., Медушева Е.О., Рыльцев В.В., Белова Е.Н., Донских Г.Н., Лагунов В.А., Денисов В.В. Биологически активные текстильные материалы // Тез. докл., 1-й международный конгресс "Биотехнология состояние и перспективы развития", Москва, 2002, с-71.
57. Белов А.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н., Денисов В.В., Донских Г.Н. Использование хитозана для придания текстильным носителям специальных свойств // II Межд. научнотехн. конф. ФТекстильная химия-2004Ф, г. Иваново 7-9 сент. 2004, с.131.
58. Belov А.A., Kazanskaja N.F., Filatov V.N., Belova Ye.N. The change of proteolytic activity of trypsin immobilized on aldehyde Цcontaining textile matrix during storage and under model conditions of inactivation //"Proc. International conference BIOCATALYSIS - 2005: fundamentals & applications", St. Petersburg, 2005, p.68.
59. Белов А.А., Кузьмина И.В., Белова Е.Н., Марквичев Н.С., Филатов В.Н. Текстильные материалы, содержащие хитозан и протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба для медицинских целей // Тез. докл., VI симпозиум "Химия протеолитических ферментов", Москва, 2007, с. 147.
60. Белов А.А., Филатов В.Н., Белова Е.Н., Кузьмина И.В., Марквичев Н.С. Синтез и исследование свойств полиферментных препаратов на основе протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба, целлюлозы и хитозана // Тез. докл., IV -й международный конгресс "Биотехнология состояние и перспективы развития". Москва, 2007, с.220-221.