Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине  

  На правах рукописи

Межнева Валентина Васильевна

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ГЕМОСТАТИЧЕСКИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ КЛЕЕВ ДЛЯ ИМПЛАНТИРУЕМЫХ МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ

14.00.41 Ц трансплантология и искусственные органы

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва-2009

Диссертационная работа выполнена в Научном Центре

сердечно-сосудистой хирургии имени А.Н. Бакулева  РАМН.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Бокерия Леонид Антонович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор  Адамян Арнольд Арамович

Доктор медицинских наук, профессор  Иванов Виктор Алексеевич

Доктор биологических наук Перова Надежда Викторовна 

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:  Российский Университет Дружбы Народов

Защита диссертации состоится л_____ __________________2009 года в л 15  часов на заседании диссертацинного совета Д.208.055.01 при ФГУ Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий по адресу: 123182, Москва, ул. Щукинская, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий

Автореферат разослан л_____ __________________  2009г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета Д.208.055.01.,

доктор медицинских наук ,  профессор Ольга Павловна. Шевченко

Актуальность проблемы

Кровотечение в раннем послеоперационном периоде при сложных оперативных вмешательствах является одним из частых осложнений. Для его устранения нередко требуется трансфузия препаратов крови, дорогостоящих гемостатических средств и нередко реторакотомия. Возникают проблемы в сердечно-сосудистой хирургии и с остановкой диффузных кровотечений, в связи с увеличением в последние годы количества и объема оперативных вмешательств. Часто кровотечения связаны с нарушениями свертывающей системы крови.

Применение различных механических способов (ушивание, различные варианты электрической и инфракрасной коагуляции, применение лазеров), с одной стороны, и  физических способов, способствующих нормальному свертыванию крови (переливание кровозамещающих средств (плазмы, криопреципитата и т.д.), лекарственных препаратов и т.п.), с другой стороны, не всегда достаточно надежно. При их использовании на измененных тканях аорты и сердца нередко возникают нежелательные побочные эффекты (прорезывание швов). Во многих случаях, использование местных гемостатических средств (губки, клеи, пленки, тампоны с лекарственным средством и т.п.), может быть альтернативой для остановки кровотечения. Клеи, благодаря удобству их использования и скорости достижения желаемого эффекта, являются наиболее привлекательными.

Использование имплантатов на основе компонентов крови для остановки кровотечений известно давно. А с 60-х годов прошлого столетия появились синтетические клеи по использованию в целях гемостаза. Основой синтетического клея, чаще всего, являлись цианакрилат и полиметакрилат, с различными модифицирующими добавками. Отечественные синтетические клеи изготавливаются исключительно на цианакрилатной основе (циакрин, МК-7М, Сульфакрилат, Силакрилат, Аргакол). Эти клеи удобны в употреблении и обладают высокой скоростью полимеризации. Главными недостатками синтетических клеев является отсутствие эластичных свойств после полимеризации, низкая адгезия на влажных поверхностях и некротическое воздействие, с развитием картины асептического воспаления биологических тканей с исходом в соединительно-тканный рубец.

Биологические клеи, в отличие от синтетических, обладают высокой эластичностью и биосовместимостью. Анализ зарубежных исследований по применению медицинских клеев показывает, что при сложных оперативных вмешательствах в сердечно-нсосудистой хирургии нашли распространение клеи на основе белков животного происхождения - желатина или альбумина (полимеризация которых происходит за счет сшивающих агентов, например, GRFG и Bioglue), а также на основе компонентов крови (фибриногена, тромбина животного происхождения, например, Tissucol). Однако они тоже не лишены недостатков. В качестве недостатков этих клеев следует отметить возможную некротизацию тканей и пирогенность, а для фибриновых клеев возможное инфицирование, вследствие переноса инфицирующих агентов компонентов крови, их многокомпонентность и высокую стоимость. Общим недостатком синтетических и биологических хирургических клеев является их эффективность на сухой биоткани.

Анализ литературы по рассматриваемой проблеме, теоретическая и экспериментально-клиническая оценка применения гемостатических клеев в кардиохирургии показали, что они не удовлетворяют в полной мере всем предъявляемым к ним требованиям. Быстро останавливать кровотечение, легко рассасываться в организме, не вызывая побочных явлений, быть нетоксичными, апирогенными, не задерживать репаративные и регенеративные процессы, быть удобными в употреблении, чтобы отсутствовал дефицит и высокая стоимость сырья и оборудования при изготовлении, постоянство качества - вот перечень этих требований. Все это создает объективные предпосылки как для разработки новых, так и усовершенствования существующих кровоостанавливающих клеев для повышения эффективности борьбы с послеоперационными кровотечениями при сложных оперативных вмешательствах.

Учитывая современные требования кардиохирургии, полагаем, что разработка и внедрение в клиническую практику эластичного биологического клея, сравнимого с лучшими зарубежными аналогами, лишенного их недостатков и доступного по цене, а также эффективного при кровотечении, является актуальной задачей и в настоящее время.

Цель и задачи исследования.

Повышение эффективности профилактики послеоперационных кровотечений при кардиохирургических операциях с использованием гемостатических биологических клеев

Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:

1. Разработка биологических гемостатических клеев на основе различных природных материалов для применения в кардиохирургии.
2. Изучение функциональных свойств разработанных клеев с целью выбора оптимальной рецептуры.
3. Оценка экспериментального использования разработанных клеев для отработки технологии их нанесения.
4. Разработка ускоренного способа экспериментальной оценки гемостатической активности разработанных клеевых композиций.
5. Анализ клинического опыта применения клея "Биоклей-ЛАБ" при сложных хирургических вмешательствах на восходящем отделе и корне аорты.

Основные положения, которые выносятся на защиту:

1. Создание гемостатических биологических клеев, обладающих высокими адгезионно-когезионными, эластичными, репаративными и регенеративными свойствами, биосовместимостью, нетоксичностью и апирогенностью как на основе улучшения существующих клеев, так и путем разработки их новых рецептур.
2. Применение гемостатических клеев при кардиохирургических операциях повышает эффективность профилактики кровотечений за счет снижения кровопотери и количества, переливаемых трансфузионных препаратов, сокращения времени оперативных вмешательств, количества повторных операций, времени реабилитации больных и летальности.

Научная новизна и практическая значимость диссертации

Современное развитие кардиохирургии и отсутствие отечественных, серийно выпускаемых, эластичных клеев явились предпосылкой для проведения исследований по разработке биологических клеев в Н - ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН.

В результате проведенных научных и экспериментальных исследований было впервые доказана возможность получения устойчивого геля на основе желатина со спирализованной структурой молекулы и с разной степенью деструкции (низкой и высокой молекулярной массой), сшитого альдегидами. На основе этих данных, впервые создан и изучен желатино-резорциново-глутарово-формальдегидный клей, имеющий высокие прочностные, адгезионные и эластичные свойства. Преимуществом разработанного клея, получившего фирменное название Биоклей-ЛАБ, в отличие от зарубежных аналогов, является его низкая вязкость, позволяющая исключить стадию подогрева основы клея, улучшить смешивание компонентов, наносить клей тонким слоем в труднодоступные места и, самое главное, снижено количество токсичного компонента в клее - формальдегида.

Проведена клиническая оценка эффективности применения этого клея для профилактики послеоперационных кровотечений при выполнении сложных кардиохирургических операций на корне и восходящем отделе аорты. Показано, что клей в 1,5 раза сокращает кровопотерю, снижает количество переливаемых трансфузионных препаратов в среднем на 27%, сокращает время оперативного вмешательства и количество реопераций. Применение клея способствует повышению регенеративных и репаративных процессов за счет увеличения количества клеток и роста коллагена. Он нетоксичен, апирогенен, обладает биосовместимостью.

Разработаны технология получения клея и рекомендации по его использованию. Клей внедрен в клиническую практику и  освоено его мелкосерийное производство в Н - ССХ им. А.Н. Бакулева.

Впервые, учитывая высокие гемостатические и адгезионные свойства феракрила и способность альгината натрия к набуханию и гелеобразованию, ускорению регенеративных и репаративных процессов, был создан Гемостатический клей - клей нового типа. Преимуществом разработанного клея, в отличие от других клеев, является его способность  останавливать кровотечение в условиях повышенной влажности без подготовки поверхности тканей перед его применением. Показана высокая эффективность клея при различных оперативных вмешательствах (время остановки кровотечения на ранах различных биотканей 30 - 100 секунд) и отсутствие токсичных свойств в ближайшем послеоперационном периоде в результате экспериментального изучения.

Оценка влияния Гемостатического клея на ткани в отдаленные послеоперационные сроки с положительными результатами позволит внедрить клей в клиническую практику.

Впервые, разработан экспресс-способ качественной оценки in vitro гемостатической эффективности новых жидких гемостатиков. Разработанный способ позволяет значительно ускорить исследование новых гемостатиков, а использование крови человека, а не животного, сделать его приближенным к естественным условиям, учитывая их разный биохимический состав. Способ успешно применяется в лаборатории клеев Н - ССХ им. А.Н. Бакулева для оценки гемостатической активности новых рецептур клеев и может быть использован другими заинтересованными организациями.

Реализация результатов работы

Освоение мелкосерийного выпуска биологического клея Биоклей-ЛАБ в Н - ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН и его клиническая оценка позволяют использование клея в кардиохирургических клиниках страны и ближайшего зарубежья при сложных хирургических вмешательствах. Его ежегодное потребление только в Н - ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН составляет 1000-1200 упаковок.

Способ in vitro качественной оценки гемостатической активности жидких кровоостанавливающих средств используется в Центре при разработке новых гемостатических средств и может быть рекомендован для использования в других организациях, занимающихся разработкой жидких гемостатиков.

Апробация работы

Апробация работы состоялась л19 сентября 2008 г. в Н - ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН на заседании Ученого Совета по экспериментальным исследованиям. Результаты исследований докладывались на: Всероссийских съездах сердечно-сосудистых хирургов Н - ССХ им. А.Н. Бакулева (2001-2007 г.г.), Всесоюзных ежегодных сессиях Н - ССХ им. А.Н. Бакулева (2001-2008 г.г.), Всероссийской конференции "Биопротезы в сердечно-сосудистой хирургии", Кемерово (2001 г.), Научно-практической конференции Актуальные вопросы сердечно-сосудистой хирургии, Нижний Новгород (2003 г.), 1-ой  Международной научно-практической конференции Современные полимерные материалы в медицине и медицинской технике, Санкт-Петербург (2005 г.), Всероссийских научных конференциях Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии, Н - ССХ им. А.Н. Бакулева (2003, 2005, 2007 г.г.).

Публикации в научных изданиях: по теме диссертации опубликовано 42 печатная работа, из них 12 - в центральной печати (получено 3 патента) и одна работа в печати.

Объем и структура работы.

Общий объем работы - 192 стр., 20 таблиц и 34 рисунка. Состоит работа из введения, четырех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы из 256 наименований и приложения на 12 стр.

Анализ литературных данных по проблеме борьбы с послеоперационными кровотечениями и, в частности, с использованием гемостатических средств - хирургических клеев показал три их основных направления исследований, их достоинства и недостатки. Одно из направлений - создание биологических многокомпонентных фибриновых клеев на основе компонентов крови, другое - биохимических двухкомпонентных клеев, содержащих природные материалы и химические - сшивающие добавки, и, третье - синтетических клеев - чаще всего однокомпонентных цианакрилатных, получивших наибольшее распространение в этой группе клеев.

Двухкомпонентные клеи среди хирургических клеев занимают промежуточное положение. Наличие в их составе природных материалов и химических  сшивающих добавок выгодно отличает их от других клеев и позволяет им сохранить высокую эластичность, присущую фибриновым клеям и достаточно хорошую адгезионно-когезионную прочность, сравнимую с синтетическими клеями. Однако, при нарушении технологии применения двухкомпонентных клеев, возможны и недостатки, присущие тем и другим клеям. Анализ клинического применения двухкомпонентных клеев в кардиохирургии показал их преимущества для остановки кровотечений и упрочнения измененных тканей (высокая эластичность и прочность пленки). Но вместе с тем были отмечены возможные недостатки при нарушении технологии их применения (некроз и стенозирование тканей). Оценка влияния этих клеев на биоткани и возможных причин их негативного воздействия, позволили разработать практические рекомендации для устранения этих недостатков.

Учитывая огромный положительный опыт применения зарубежного аналога клея GRFG в кардиохирургии, экономические и технологические аспекты производства медицинских клеев, определяющими условиями для проведения исследований по разработке двухкомпонентного желатино-резорцинового глутарово-формальдегидного клея явились доступность и достаточно невысокая стоимость исходных компонентов, а так же сравнительно несложная технология их производств.

Материалы и методы исследования

В работе исследованы различные рецептуры клеев как в лабораторных условиях, так и в экспериментах на животных. После завершения комплекса необходимых исследований и выбора оптимальной рецептуры клея исследование проводилось в клинике на однородной группе пациентов.

Для разработки рецептуры желатино-резорцинового глутарово-формальдегидного клея Биоклей-ЛАБ использовали следующие материалы: желатин пищевой марки П-11 ГОСТ 11293-89 и 10%-ный раствор желатина ТУ 9365-001-00480359-98; резорцин марки ч или ло.с.ч.; глутаровый альдегид 25%-ный раствор марки ло.с.ч.; формалин 37%-ный раствор марки ло.с.ч.; дистиллированная вода.

При разработке Гемостатического клея использовали: натрия альгинат ФС 42-3383-97; феракрил; дистиллированная вода.

Оценку функциональных свойств опытных рецептур клеев проводили при использовании различных методов исследования: физико-химических, физико-механических и биологических, причем применялись как стандартные, так и нестандартные методы, разработанные в процессе выполнения исследования.

Физико-химическими методами определялись: внешний вид компонентов клея Биоклей-ЛАБ, его вязкость и плотность желатино-резорциновой основы, молекулярная масса желатина, толщина клеевой пленки, содержание альдегидов и резорцина в вытяжках, жизнеспособность и время полимеризации клеев, условия стерилизации сырья и компонентов биологических клеев.

Физико-механическими методами оценивали влияние клея Биоклей-ЛАБ на упруго-прочностные свойства нативной ткани и ксеноперикарда, стабилизированного глутаровым альдегидом, а также прочность на разрыв для склеенных образцов ткани (нестандартным методом). Использовались стандартные методы испытаний образцов биоткани ксеноперикарда с клеем и без клея на растяжение и определения модулей упругости при растяжении (ГОСТ 9550-81, ГОСТ 11262-80). Эти испытания проводили на стенде фирмы Instron 1112 с регулируемым усилием закрепления образцов в пневмозажимах.

Биологическими методами исследования определяли:

- In vitro - гемостатические и антимикробные свойства клея, цитотоксичность экстрактов на культуре фибробластов мыши линии NIH 3Т3 и гемолитическое действие экстрактов на изолированных эритроцитах кролика и человека;

- In vivo - гемостатические свойства клея, его воздействие на ткани аорты, легкого, печени, кишечника, желудка (гистологические исследования), раздражающее действие при внутрикожном введении, сенсибилизирующее действие вытяжки по реакции дегрануляции тучных клеток и провокационной кожной пробе, острую токсичность на мышах при внутрибрюшинном введении, пирогенность при внутривенном введении вытяжки кроликам.

Гемостатические свойства клеев определяли двумя способами: общепринятым в экспериментах на животных и новым разработанным способом в лабораторных условиях на стабилизированной крови больных после проведения необходимых для пациента коагулологических анализов.

Для этого к 1 мл стабилизированной крови прикапывают 0,1 - 0,2 мл биологического клея, все смешивают, включают секундомер и отмечают, в случае наличия гемостатического эффекта клеевой композиции, образование сгустков крови за время в течение 1 минуты. Чем выше гемостатические свойства клея, тем быстрее происходит образование кровяного сгустка. По виду получаемого сгустка можно судить о наличии или отсутствии эластичных свойств у клея.

Антимикробность биологических клеев оценивалась по методике, аналогичной дискодиффузионному методу определения активности антибиотиков. Использовались как референтные штаммы, так и клинические штаммы, выделенные при раневой инфекции.

Экспериментальные методы исследования биологических клеев проводили на различных группах животных: беспородных белых крысах, кроликах породы Шиншилла и беспородных собаках. Эксперименты на животных проводились с целью оценки гемостатической активности клеев, выбора оптимальной рецептуры и отработки технологии их применения при различных типах хирургических вмешательств, оценки воздействия клеев на различные ткани (гистологические исследования), их токсичности и пирогенности.

Разработка двухкомпонентных хирургических клеев

Огромный опыт применения в кардиохирургии зарубежного аналога двухкомпонентного желатино-резорцинового глутарово-формальдегидного клея GRFG показал его эффективность при использовании при аневризмах аорты, как для профилактики кровотечений, так и для укрепления ее измененной стенки. Однако были выявлены возможные негативные воздействия клея на ткани и причины, способствующие этому воздействию, которые настораживали хирургов. В качестве основной причины негативного воздействия клея на ткань указывали большое содержание формальдегида. Учитывая все эти факты, разработку рецептуры клея проводили с целью устранения известных недостатков, характерных для клея GRFG. Полагали, что высокая вязкость желатино-резорциновой основы, обусловленная ее высокой концентрацией, и структура молекул желатина, находящихся в состоянии клубка, затрудняют смешивание компонентов клея и их сшивку альдегидами и, видимо, частично они могли оставаться в свободном состоянии, что приводило к некрозам ткани.

В научно-производственном отделе Медицинской биотехнологии в научно-производственной группе по разработке медицинских клеев Н - ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН были исследованы более 60 рецептур желатино-резорциновой основы и 20 рецептур глутарово-формальдегидного отвердителя с целью выбора оптимальной рецептуры клея.

Учитывая анализ литературных данных о структуре желатина и условиях его гелеобразования, разработка рецептур клея проводилась исходя из следующих соображений:

1. Образование упорядоченного состояния спиральных молекул желатина при гелеобразовании происходит при температуре ниже 350С;
2. Снижение исходной концентрации геля желатина способствует увеличению набухаемости полученной пленки при ее попадании снова в растворитель;
3. Спирализованное состояние молекул желатина увеличивает количество сшивок формальдегидом главным образом за счет межмолекулярных взаимодействий, но при этом возрастает вероятность и внутримолекулярных связей.

Таким образом, концентрация разработанной рецептуры клея должна быть близкой к 20% (оптимальная степень набухания пленки), температура гелеобразования около 250С (исключение стадии нагрева). Это позволит снизить вязкость желатино-резорциновой основы и количество формальдегида, при повышении прочности и эластичности пленки.

При выборе оптимальной рецептуры клея руководствовались следующими критериями: наличие гемостатических свойств, высокой эластичности и хороших адгезионных свойств клеевой пленки, отсутствие токсичных и пирогенных свойств, биодеградируемость и биосовместимость продуктов биодеградации, жизнеспособность более 30 секунд, время полимеризации - не более 3-5 минут, удобство в применении, доступность и невысокая стоимость исходного сырья, воспроизводимость клея с теми же свойствами, сохранность всех свойств клея после стерилизации его компонентов и при хранении клея в течение срока его годности. При разработке отвердителя исходили из того, что содержание формальдегида в рецептуре должно быть минимальным, при сохранении всех выше перечисленных свойств.

Для достижения поставленной цели, автору удалось предположить, что использование монопептидов и полипептидов желатина в определенной пропорции за счет применения желатина с разной степенью денатурации (молекулярная масса 96270145 и 1468068) при использовании сшивки альдегидами позволит получить клей с низкой вязкостью и сниженным содержанием альдегидов. В результате проведенных исследований был получен клей, первый компонент (средняя молекулярная масса  44580139) которого состоит из высокомолекулярного и низкомолекулярного желатина (~ 6-7 % и 8,5-9,5 % соответственно), резорцина (~ 4,5 %) и остальное - дистиллированная вода (~ 80 %). В состав второго компонента входят глутаровый альдегид, формальдегид и дистиллированная вода в соотношении 1:2:3.

Таблица 1

Концентрация основы клея и содержание альдегидов в 1 мл отвердителя.

Марка клея, страна		Биоклей-ЛАБ, Россия	GRFG, Франция	GRFG, Япония
Количество, мг	формальдегида	123	166,5	333
	глутаральдегида	41	25	50
Концентрация основы, %	желатино- резорциновой	~ 20	~ 50-60	~ 70

Результаты исследования физико-химических клея и упруго-прочностных свойств ксеноперикарда показали, что клеевая пленка обладает высокой эластичностью и оказывает незначительное влияние на упруго-прочностные свойства ксеноперикарда.

Таблица 2

Влияние двухкомпонентного биологического клея Биоклей-ЛАБ

на упруго-прочностные характеристики биоткани (n=5)

№ п/п группы	Предел прочности, МПа		Максимальные деформации		Модуль упругости, МПа
	σпчрад	σпчос	εрад	εос	Екасрад	Екасос
1	11,13±1,12	16,25±1,76	0,47±0,01	0,40±0,01	56,0±4,0	83,0±4,0
2	15,52±1,25	22,08±2,09	0,21±0,01	0,19±0,01	81,0±7,42	118,8±11,7
3	13,64±0,89	16,27±1,62	0,16±0,01	0,18±0,01	75,0±6,63	75,2±7,72
4	11,53±0,97	28,05±2,47	0,23±0,01	0,24±0,01	40,2±3,31	89,2±5,33

Примечание: рад. - радиальное направление; ос. - осевое направление; кас. - касательное направление.

Следует отметить, что, как и ожидалось, низкая вязкость желатино-резорциновой основы (330,1спз) позволяет не только исключить необходимость подогрева основы до 450С, в отличие от зарубежных аналогов, но и улучшить смешивание компонентов, снизить содержание альдегидов, наносить клей в виде тонкой пленки в труднодоступные места, легко удалив его избыток (табл. 1).

В таблице 2 показано, что нанесение хирургического шва (группа №2) на ксеноперикард несколько увеличивает, а обработка клеем (группа №3) практически не меняет предела прочности ксеноперикарда. Одновременное применение хирургического шва и клеевого покрытия (группа №4) на биоткани достоверно увеличивает предел прочности ксеноперикарда в осевом направлении (р < 0,05). Контроль (группа №1) - стабилизированный глутаровым альдегидом ксеноперикард.

Получение герметизирующего покрытия клея Биоклей-ЛАБ происходит при смешении 2 мл желатино- резорциновой основы (компонент №1 - флакон) клея (рис. 1) и 4-5 капель (0,05 мл) глутарово-формальдегидного отвердителя (компонент №2 - шприц-тюбик). Клей наносят на биологическую ткань, тщательно осушенную салфетками и предварительно обработанную 2-3 каплями отвердителя.

Оценку физико-химических показателей компонентов клея и самого клея проводят поэтапно: во время изготовления компонентов и после их получения.

Характеристика клея: Компонент №1 (желатино-резорциновая основа) - однородная, вязкая жидкость светло-желтого цвета, стерильная; Компонент №2 (отвердитель) - прозрачная, бесцветная жидкость с содержанием альдегидов не более (16±1) %.

Жизнеспособность клея более 30 секунд, время полимеризации клея на биологической ткани или стекле не более 3-5 минут. Срок хранения клея не менее 3х лет при температуре (0-8)оС.

Рис. 1 Набор желатино-резорциновой основы в одноразовый шприц и введение отвердителя в одноразовый шприц с желатино-резорциновой основой клея.

Санитарно-химические исследования экстрактов клеевой пленки Биоклей-ЛАБ показали, что изменение значения рН вытяжки различных партий клея (n=5) в сравнении с контролем составил 0,32-0,48 ед. рН при допустимом - 1,00 ед. рН. Методом жидкостной хроматографии установлено, что содержание резорцина в вытяжке не более 0,0046 мг/л, а оксида этилена не обнаружено в пределах чувствительности определения - 0,1 мг/л при допустимом - 2 мг/л. Содержание альдегидов в вытяжке по данным ацидометрического метода составило не более 0,0038 мг/л.

При ускоренном методе (время экспозиции через 0, 30, 60, 120, 180, 240 мин, 24 час, до разрушения пленки, в отличие от стандартной методики, где рекомендуемая экспозиция 7, 14, 21, 30, 60 суток) оценки содержания продуктов в вытяжке из клеевой пленки оказалось, что в течение 3 часов после склеивания весь резорцин выделяется из нее, а альдегидов - их максимальное количество. Изучение деструкции клеевой пленки в дистиллированной воде может указать на возможные пути метаболических превращений клея в живом организме. Эти данные показали, что вначале происходит разрушение резорцино-формальдегидного олигомера, а затем уже полипептидов желатина, сшитых альдегидами. Как и ожидалось, чем больше время отверждения клея, тем медленнее происходит деструкция клеевой пленки (при отверждении в течение 5 мин. - через 4 суток, а 10 мин. - через 6 суток).

Окончательный выбор оптимальной рецептуры клея и отработка технологии его применения проводились в экспериментах на животных. Для этого под наркозом у животного выполнялась хирургическая операция, обеспечивающая доступ к внутренним органам (печени, аорте, легкому и т.д.), затем наносилась кровоточащая рана и после наложения негерметичных швов производилась остановка кровотечения при помощи исследуемого клея или тампона, в случае контроля.

Качественная оценка in vitro гемостатического эффекта клеев проводилась разработанным лабораторным способом, который отличался как гуманными соображениями, так и экономическими от эксперимента на животных. При его выполнении, не требовалось содержание большого количества животных (приобретение, уход, кормление и т.п.), подготовки операционных, наркотизирующих и другие лекарственных препаратов, необходимых при проведении эксперимента на животных. Хирургическая операция - это стрессовая ситуация для животного, что может повлиять на достоверность получаемых результатов. Использование нового способа позволило значительно сократить количество опытов на животных, ускорить исследования по отбору оптимальной рецептуры (10-15 минут для 5-10 рецептур клея). Использование крови человека (после проведения обязательных коагулологических анализов, не производя при этом ее специальный забор), а не животного позволяет исследование сделать более приближенным к естественным условиям оценки гемостатического эффекта клея. На рис. 2 представлены результаты оценки гемостатического эффекта феракрила, обладающего высоким гемостатическим эффектом.

Чем выше гемостатическая активность разрабатываемого средства, тем выше скорость образования кровяного сгустка. Вид образующегося сгустка позволяет судить о наличии или отсутствии эластичных свойств клея.

Рис. 2 1 мл стабилизированной 3,8%-ным раствором цитрата натрия крови больных

с 0,1 мл 1%-ного раствора феракрила (эластичный сгусток образовался

в течение 5 секунд).

После предварительного выбора 3-х рецептур клея Биоклей-ЛАБ, обладающих наилучшими показателями, дальнейшее исследование их эффективности для остановки кровотечения и отработка технологии их применения проводилась в эксперименте на животных на артериях, венах, аорте и легком. Эксперименты на беспородных собаках (n=10) обоего пола, массой 12-18 кг, проводили под тиопенталовым наркозом (вначале в/в вводили 400 мг тиопентала, затем по 50 мг через каждые 20 минут и вводя в/в Гепарин в дозе 15 ЕД/кг/ч). Выполняли разрез грудной клетки в области сердца, затем выделяли аорту и проводили разрез аорты. На место разреза накладывали кетгутовые швы и восстанавливали общий кровоток. При изучении влияния клеевой композиции на ткань легкого проводили интубацию, подключали к аппарату искусственного дыхания, выделяли легкое и на нем проводился разрез ткани 2.5х1 см, затем наносили 1 мл клея на рану, укрывая всю рану. Легкое при этом выполняло свою физиологическую функцию.

Имплантация третьей рецептуры клея на хирургические швы на артерии, аорте и легком показали лучший гемостатический эффект по сравнению с другими рецептурами клея. При использовании рецептуры №3 клея время остановки кровотечения на бедренной артерии составило 60 сек., на аорте -100 сек., легком - 150 сек., тогда как при применении рецептур №1 и №2 это время составило 100 и 120 сек. - на артерии, 150 и 210 сек. - на аорте и 230- и 280 сек. - на легком соответственно. В контроле, где место разреза ушивалось без применения клея, кровотечение прекратилось через 250 сек. на бедренной артерии, а на аорте и легком через 400 и 450 сек. Это достоверно больше, чем при применении рецептуры № 3 (р<0.05). Именно третья рецептура клея получила фирменное название Биоклей-ЛАБ.

Эксперимент на животных показал, что при неглубоких ранах легкого менее 1 мл, после нанесения клея на место разреза для достижения гемостаза и аэростаза, достаточно было прижать эту область в течение 2-3 мин. без ушивания. В случае ран с их глубиной более 1 мл, необходимо было вначале наложение хирургического шва, а затем его герметизация клеем.

Гистологическое исследование влияния клея "Биоклей-ЛАБ" на ткани показало, что при его подкожной имплантации белым крысам (группа по 3 особи, массой 250-300 г, наркоз внутрибрюшинно кетамин 15 мг/кг, тиопентал - 30-40 мг/кг) тканевая реакция не выявила агрессивного изменения тканей по истечению 21 суток (рис. 3). В опытном образце лейкоцитарная инфильтрация выражена незначительно, в основном в глубоких слоях дермы. В контрольном образце, напротив, видны обширные участки выраженной инфильтрации дермы и подкожной клетчатки лейкоцитами; сосуды расширены и полнокровны, с развитием стаза.

 

  а)  б)

Рис. 3. Гистологический срез тканей кожи и подкожной клетчатки в области

  разреза у белых крыс на 21 сутки: а) контроль - без нанесения клея.

  б) опыт - после нанесения клея. Окраска гематоксилином и эозином, ув. 200.

Оценка антимикробных свойств клея, проведенная для референтных штаммов Escherichia coli АТСС 25922, Staphylococcus aureus АТСС 25923 и клинических штаммов Acinetobacter baumannii', Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, выделенных при раневой инфекции, показала наличие устойчивых зон задержки роста микроорганизмов вокруг капли клея, несмотря на ужесточение условий эксперимента. Концентрация микробных тел была увеличена с 103 кое/мл до (1-2)107 кое/мл. Диаметр зоны лизиса составлял 11-12 мм для всех штаммов, как это показано на рис. 4.

Рис. 4. Зона задержки роста референтного штамма Escherichia coli ATCC 25922

  вокруг капли биологического клея Биоклей-ЛАБ (показано стрелкой).

Образовавшиеся зоны лизиса вокруг капли клея сохранялись в течение 3-х суток наблюдения. Этот факт подтверждает наличие антимикробных свойств у биологического клея "Биоклей-ЛАБ".

Разработка однокомпонентного Гемостатического клея

Разработка Гемостатического клея проводилась в соответствии с такими требованиями, как наличие адгезионно-когезионных, эластичных и гемостатических свойств, стерильности, низкой вязкости, отсутствие токсичности и пирогенности. В основу создания клея на основе полисахарида - альгината натрия ФС 42-3383-97 и феракрила (моножелезная соль полиакриловой кислоты), были положены такие свойства как набухание и гелеобразование, высокие репаративные и регенеративные свойства с одной стороны, и наличие адгезионно-когезионных и гемостатических свойств, с другой стороны, соответственно. Наличие ионов железа в рецептуре клея способствует образованию нерастворимого комплекса с альгиновыми кислотами. Эта работа проводилась совместно с сотрудниками лаборатории патологии и фармакологии гемостаза ГН - РАМН (руководитель - проф., д.м.н. В. А. Макаров).

Характеристика клея: Гемостатический клей представляет собой высоковязкий водный раствор, содержащий 5 - 20% альгината натрия и 15-30% феракрила, рН 4,0-6,0. Приготовленный клей после радиационной стерилизации по внешнему виду представляет собой неоднородный с отдельными включениями, высоковязкий, водный раствор светло-коричневого цвета. При его нанесении на кровоточащую рану в течение 30 сек образуется эластичный кровяной сгусток.

Клей, наносится на рану из одноразового шприца, удалив иглу и равномерно заполняя раневую поверхность, без ее осушения. После остановки кровотечения его избыток можно осторожно удалить, а на поверхности раны образуется тонкая пленка. Клей может храниться при температуре (0-8)0С в течение 3 лет по результатам оценки его свойств после хранения.

Оценку функциональных свойств гемостатического клея проводили в эксперименте на животных. В экспериментах на кроликах породы Шиншилла, массой 3-4 кг под тиопенталовым наркозом (2-4 мл 0,1% раствор внутривенно, а затем до 6-10 мл внутрибрюшинно) выполняли лапаратомию, используя продольный разрез по белой линии живота. В рану выводили переднюю поверхность печени. Затем на печень наносили поверхностную рану около 1,5 см2 и глубиной около 0,1 см. Оценку гемостатической активности клея, проводили путем остановки развившегося капиллярно-паренхиматозного кровотечения при нанесении клея на всю площадь раневой поверхности, перекрывая ее края. Эксперимент проводили в условиях гипокоагуляции, вводя в/в капельной инфузией Гепарин в дозе не менее 15 ЕД/кг/ч.

Аналогичным образом проводили эксперимент на желудке (гастротомическое отверстие ушивали двурядными швами с последующим нанесением 0,1 мл клеевой композиции) и кишечнике (oграничивая его салфетками, смоченными теплым физиологическим раствором, производили разрез на двух сегментах толстой кишки и накладывали анастомоз бок в бок, на шов равномерно наносили 0,1 мл гемостатического клея). Полученные результаты исследования представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Гемостатическая активность Гемостатического клея

в условиях эксперимента на кроликах (n=3).

Исследуемый орган кролика	Время остановки кровотечения, секунды		Достоверность показателей
	Контроль	Опыт
Печень	32019	3015	р<0.05
Желудок	24021	237	р<0.05
Толстая кишка	24021	155	р<0.05

Гистологическое исследование по оценке влияния нового Гемостатического клея на печень кролика после его воздействия в течение 30 и 60 минут (рис.6) показало, что структура ткани печени в опыте полностью сохранена. Вся поверхность операционной раны покрыта эритроцитарно - фибриновым тромбом, в синусоидных капиллярах вблизи раневой поверхности - агглютинированные эритроциты. Признаков токсического воздействия в виде дистрофических изменений гепатоцитов не выявлено, также отсутствует накопление какого-либо субстрата в клетках Купфера. Контролем служили интактные кусочки печени.

 

  а) б)

Рис. 6 Структура ткани печени кролика: а) - контроль (операционная

рана - интактная); б) опыт (операционная рана с воздействием клея

в течение 60 минут). Окрашено - гемотоксилин-эозином.

При выполнении операции на аорте у беспородной собаки при обработке гемостатическим клеем анастомоза остановка кровотечения произошла в течение 20-30 секунд, контроль - более 300 секунд (рис.7).

При использовании гемостатического клея на ушитой ране легкого собаки (глубина раны 1 см, длина 3 см), легкое при этом выполняло свою физиологическую функцию, кровотечение было остановлено через 60 секунд после контакта его с раневой поверхностью, контроль - 400 секунд (рис. 8).

а)  б)

Рис. 7 Анастомоз на аорте собаки: а) до нанесения и б) после

нанесения Гемостатического клея.

Результаты гистологического исследования ткани аорты после применения клея при выполнении хронического эксперимента в течение 3 месяцев на собаке представлены на рисунке 9. В контроле в области лигатуры - единичные клетки инородных тел, петрификация, фиброз наружных отделов медии. В опыте в области подшивания двух фрагментов был отмечен фиброз ткани и крупноочаговая петрификация. Полученные результаты не показали негативного влияния клея на ткани, поскольку петрификация возможна в результате наложения швов. Однако необходимо продолжение исследований по изучению влияния клея на ткани в отдаленные послеоперационные сроки.

 

а)  б)

Рис. 8 Операция на легком у беспородной собаки: а) - хирургический швов

на ране легкого; б) - шов после его герметизации клеем

Для разработанного Гемостатического клея оценивалось влияние паровой (1200 С - 20 минут) и радиационной (0,5 рад/час - 2 часа) стерилизации на его функциональные свойства. Основным критерием работоспособности разработанной Гемостатической композиции после стерилизации явилась сохранность гемостатической активности, как сразу же после нее, так и при длительном хранении (не менее 6 - 12 месяцев). Приемлемой оказалась радиационная (0,5 рад/час - 2 часа) стерилизация.

 

  Опыт  Контроль 

Рис. 9 Результаты хронического эксперимента (в течение 3 месяцев) после

  операции с использованием Гемостатического клея на аорте собаки.

Клинические испытания клея Биоклей-ЛАБ

Исследование проводили у пациентов, которым выполнялись сложные кардиохирургические вмешательства на корне аорты. Эти операции проводятся с наложением нескольких анастомозов, требуют длительного ИК, пережатия аорты и сопровождаются большой кровопотерей в послеоперационном периоде. Для наблюдения были выбраны две однородные группы пациентов, перенесших операции: Бенталл - Де Боно (протезирование восходящего отдела аорты синтетическим кондуитом, содержащим механический протез и ксеноперикардиальную ткань), Росса (в аортальную позицию имплантировали легочный аутографт, а в выводной тракт правого желудочка - легочный алло- или ксенографт) и протезирование аортального клапана криосохраненным аортальным аллографтом свободным корнем. При выполнении этих операций устья коронарных артерий выделялись на площадках и реимплантировали в стенку кондуита.

Все операции с искусственным кровообращением выполнялись в режиме умеренной гипотермии при 26-28С. Кардиоплегию выполняли кристаллоидными кардиоплегическими растворами: калиевый, Кустодиол или кровяная по Бакбергу в устья обеих коронарных артерий и/или ретроградно через коронарный синус. Во время операции использовалось наружное охлаждение сердца ледяной кашицей из физиологического раствора. Пациентам проводили многокомпонентную анестезию по методике, принятой в Н - ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН с учетом характера патологии. Клиническая характеристика пациентов (группа 1 - операции с применением клея, группа 2 - контроль, без имплантации клея) представлена в таблице 4.

Таблица 4

Клиническая характеристика больных.

Характеристика групп	Группа 1 (%)	Группа 2 (%)
Число больных: - мужчин - женщин	42 23 (54,7) 19 (45,3)	39 28 (71,8) 11 (28,2)
Средний возраст, годы	32,6 14,7	34,6 15,1
Недостаточность кровообращения 1 2А 2Б	7 (16,7) 20 (47,6) 15 (35,7)	8 (20,5) 21 (53,8) 10 (25,7)
Функциональный класс по NYHA: 2 3 4	9 (21,4) 18 (42,9)   15 (35,7)	8 (20,5) 17 (43,6) 14 (35,9)

У всех пациентов было поражение аортального клапана. У большей части 1-ой и 2-ой групп больных был выявлен инфекционный эндокардит 22 (52,4%) и 20 (51,3%) случаев соответственно. Возраст наблюдаемых больных колебался от 6 до 66 лет в 1-ой и от 4 до 64 лет во 2-ой группах.

Типы перенесенных операций и сопутствующая кардиальная патология прооперированных пациентов представлена в таблице 5.

Имплантация клея, пациентам 1 группы, проводилась в условиях сухого сердца: при пережатой аорте и опорожненных камерах сердца. После наложения анастомоза, перед нанесением клея Биоклей-ЛАБ, поверхность операционного шва тщательно осушали салфетками. Несколько капель отвердителя добавляли на биоткань и сразу же осушали поверхность. В шприце смешивали оба компонента клея, в необходимой пропорции, встряхивали и сразу же тонким слоем наносили на линию шва анастомозов аорты, легочной артерии и места реимплантации коронарных артерий, как показано на рисунке 10.

Таблица 5

Типы перенесенных операций и сопутствующая кардиальная патология.

Типы операций и сопутствующая патология	Группа 1 (%)   n = 42	Группа 2(%)   n = 39
Операции: - Росса - Бенталл - Де Боно - протезирование корня аорты аллографтом	23 (54,7) 9 (21,5) 10 (23,8)	15 (38,4) 12 (30,8) 12 (30,8)
Сопутствующая патология: - Ишемическая болезнь сердца - Митральная недостаточность - Трикуспидальная недостаточность - Дефект межжелудочковой перегородки - Открытый аортальный проток	1(2,4) 2(4,8) 1(2,4) 3(7,1) 2 (4,8)	2(5,1) 3(7,7) 1 (2,6) 1 (2,6) -

Выжидали 3-5 минут, это время, необходимое для полимеризации клея. После пуска кровотока и восстановления адекватной гемодинамики, оценивали герметичность анастомозов. При необходимости, накладывали дополнительные швы прямо по отвержденному клею, так как "Биоклей-ЛАБ" после отверждения дает прочную и эластичную пленку.

Сравнивая показатели температуры тела больных в течение 10 суток после операции не было достоверной разницы в двух группах. Причем в течение первых 4-5 суток средние цифры температуры держались до субфебрильных цифр: в 1-ой группе - (37,6 0,4)С, во 2-ой - (37,5 0,35)С. Далее температура снижалась, и все больные выписывались с нормальной температурой.

Рис. 10. Нанесение клея "Биоклей-ЛАБ" на дистальный шов аорты во время операции.

Анализ результатов наблюдений показал, что среднее время пережатия аорты в исследуемых группах не отличалось (в 1-ой группе - 147,8 39,4, во 2-ой группе - 148,3 43,8 мин), однако время искусственного кровообращения хоть и недостоверно, но больше в контрольной группе. В группе пациентов с применением клея это время составило 211,3 53,4 мин., а в контрольной группе 247,4 148,4 мин. Вероятно, что после снятия зажима с аорты, при кровотечении из аортальных швов, требуется больше времени для гемостаза.

Объем кровопотери в раннем послеоперационном периоде (в течение 24 ч.) в 1-ой группе пациентов варьировал от 100 до 1500 мл, в среднем (397,9 38,3) мл, причем кровопотеря до 500 мл (32 случая, 76,2%), от 500 до 1000 мл у 9 пациентов (21,4%) и 1 больной (2,4%) потерял более 1000 мл. Тогда как во 2-ой группе пациентов потери крови по дренажам составили от 150 до 2000 мл, в среднем (579,5 70,4) мл: у 22 пациентов (56,4%) - менее 500 мл, у 12 пациентов (30,8%)  Ц  от 500 - 1000 мл и у 5 больных (12,8%) - более 1000 мл. В группе пациентов с применением клея достоверно меньше кровопотеря в течение первых суток после операции (р = 0,02).

Для устранения гиповолемических состояний у прооперированных больных использовался трансфузионный метод. Средний объем перелитой СЗП оказался достоверно меньше в группе с применением клея Биоклей-ЛАБ (708 46,1) мл, чем в контрольной группе - (950 86,8) мл, (р < 0,05).

При показаниях уровня фибриногена в крови менее 1 г/л, а так же при необходимости продолжения заместительной терапии факторов свертывания на фоне ограничивающих факторов для трансфузий СЗП, применяли криопреципитат. В 1-ой группе пациентов в среднем было перелито (43,7 4,3) мл криопреципитата, а во 2-ой группе - (59,6 5,3) мл, (р = 0,02).

В исследовании у 4-х пациентов (9,5%) из группы пациентов с применением клея Биоклей-ЛАБ и у 11-ти (28,2%) - из второй группы в раннем послеоперационном периоде была проведена реинфузия отмытых аутоэритроцитов с помощью аппарата Cell Saver 5. Это различие в полученных данных статистически существенно (р = 0,03).

Повторные операции, по поводу массивного кровотечения в раннем послеоперационном периоде, проводились у 6 больных. Среди них оказались: 2 пациента (4,8%) из группы с применением клея и 4 больных (10,3%) из контрольной группы. Дифференцированный источник кровотечения был найден в 3 случаях: в двух случаях надкостница грудины, в одном - аортальный анастомоз. У 3 пациентов его не было найдено.

В результате проведенных исследований была получена достоверная разница в трансфузии свежезамороженной плазмы и криопреципитата и при проведении реинфузии отмытых аутоэритроцитов с помощью аппарата Cell Saver 5 в раннем послеоперационном периоде, что подтверждает экономическую эффективность применения клея Биоклей-ЛАБ при сложных кардиохирургических операциях.

Обсуждение результатов

Необходимо отметить, что для клея Биоклей-ЛАБ был проведен целый комплекс экспериментальных исследований согласно требованиям стандарта  ГОСТ Р ИСО 10993-99. Эти исследования показали наличие хороших адгезионно-когезионных, высоких эластичных, умеренных гемостатических и антимикробных свойств клея. Не проявлялась токсичность клея при действии его экстрактов на культуру фибробластов мыши линии NIH 3Т3 (морфология клеток оказалась аналогичной контролю, количество клеток отличалось от контроля в пределах допустимой погрешности <10%). Степень гемолиза экстрактов разных партий клея на изолированных эритроцитах кролика составила 0,06%, а человека - 0,02% (допустимое - 2%). Не было обнаружено раздражающего действия клея на ткани, при его внутрикожном введении. Сенсибилизирующее действие вытяжек, о котором судили по реакции дегрануляции тучных клеток, показало отрицательную реакцию. Острая токсичность клея не определялась при провокационной кожной пробе и оценке острой токсичности на мышах, при его внутрибрюшинном введении, макроскопически не было выявлено патологических изменений внутренних органов и тканей, коэффициенты масс внутренних органов опытных животных не имели статистически достоверных отличий от контрольных животных. Отсутствовали пирогенные реакции при внутривенном введении вытяжки кроликам, суммарное повышение температуры не превысило 1,40С и составило 1,10,10С. Клей Биоклей-ЛАБ, по полученным результатам, был признан медицинским изделием, который может длительно контактировать с внутренней средой организма (заключения ГУП ВНИИИМТ МЗ РФ и ФГУ НИИТ и ИО Росмедтехнологий).

Клинический анализ применения клея Биоклей-ЛАБ проводился на схожих по патологии группах больных, перенесших сложные операции на корне аорты, требующие наложения нескольких анастомозов, длительного ИК, пережатия аорты и сопровождающиеся большой кровопотерей в послеоперационном периоде. Особенностью проведенного исследования, было выполнение всех операций в одном периоде времени одним хирургом (заведующим отделением неотложной хирургии ППС, профессором Муратовым Р.М.). Решение о применении клея принималось во время операции и не носило направленного характера.

Среднее время пережатия аорты в наблюдаемых группах не отличалось, однако время искусственного кровообращения хоть и недостоверно, но больше в контрольной группе (опыт - 211,3 53,4 мин., контроль - 247,4 148,4 мин.). После снятия зажима с аорты в связи кровотечением из аортальных швов, по-видимому, требуется больше времени для гемостаза. Объем кровопотери в раннем послеоперационном периоде (24 ч.) оказался в 1,5 раза меньше в группе с применением клея. Аналогичные результаты были получены и у французских хирургов (Bachet J. еt al., 1982), использующих клей GRFG на операциях расслоения аорты.

При устранении гиповолемических состояний снизилось количество переливаемой СЗП в группе с применением клея Биоклей-ЛАБ (708 46,1 мл), в сравнении с контрольной группой (950 86,8 мл, р < 0,05). Не было отмечено достоверной разницы между группами в уровне гемоглобина как до, так и после операции (в первой - снизился в среднем на 28 г/л, а эритроцитов на 1 х 10 г/л, в контрольной группе - на 30 г/л и на 1,1 х 10 г/л соответственно).

При коррекции послеоперационной анемии переливание донорской эритроцитной массы проводили 39 пациентам (92,8%) в первой группе и 38 пациентам (97,4%) в контрольной группе, при этом средние объемы составили 462 35,2 мл и 590,3 59,8 мл соответственно. Из полученных данных, можно видеть, что в контрольной группе больше перелито эритроцитной массы, но это статистически недостоверно.

Средние значения уровня тромбоцитов до операции в 1-ой и во 2 -ой группах были в пределах нормы. Существенное снижение уровня тромбоцитов выявлено в двух группах в послеоперационном периоде, тогда как достоверной разницы между группами не обнаружено (в 1-ой группе -42,7 3,7 мл, во 2-ой группе - 50,1 4,8 мл).

При использовании криопреципитата для трансфузий так же его объемы были несколько снижены в группе пациентов с применением клея (в 1-ой группе в среднем перелито 43,7 4,3 мл, а во 2-ой группе - 59,6 5,3 мл криопреципитата (р = 0,02).

Аутогемотрансфузия (отмытых аутоэритроцитов с помощью аппарата Cell Saver 5) потребовалась 4-м пациентам (9,5%) в группе с применением клея Биоклей-ЛАБ и 11 больным (28,2%) из второй группы в раннем послеоперационном периоде. Это различие статистически существенно (р = 0,03) и экономически выгодно, учитывая, что применение аппарата Cell Saver 5 на одну операцию обходится в 500 долларов США. Не следует забывать, что аппаратная реинфузия аутоэритроцитов призвана вернуть больному только аутоэритроциты (для их сохранения) и не является средством лечения кровотечения.

Необходимо отметить снижение повторных операций по поводу массивного кровотечения в раннем послеоперационном периоде - у 2х пациентов (4,8%) из группы с применением клея и у 4х больных (10,3%) из контрольной группы.

По литературным данным (Kirsch M. et al., 2002), известен факт наблюдения некроза стенки аорты при введении большого количества клея GRFG в ложный просвет расслоенной аорты. Однако в нашем исследовании, при реоперации на корне аорты, через 10 месяцев, связанной с инфекционным эндокардитом, не было обнаружено некротических изменений стенки аорты в месте наложения клея. Полагаем, что это связано, во-первых, со сниженным содержанием альдегидов в составе "Биоклей-ЛАБ", во-вторых, клей был использован для наружной герметизации швов и, в-третьих, клей, вследствие низкой вязкости, наносили более тонким слоем.

Следует отметить, что в исследовании применение клея не вызывало выраженной общей и местной воспалительной реакции в послеоперационном периоде. У наблюдаемых больных, не было отмечено случаев длительной лихорадки, а выраженность послеоперационной экссудации из полости перикарда не отличалась от больных, у которых клей не применялся.

Наблюдали один случай, подтверждения антимикробных свойств у клея. В сентябре 2002 г. пациентке С. 40 лет с кальцинированным аортальным стенозом было выполнено протезирование корня аорты криосохраненным аллографтом, на дистальные и проксимальные анастомозы был имплантирован клей Биоклей-ЛАБ. В связи с развитием протезного эндокардита, в мае 2003 г. больная успешно реоперирована. Гистологическое исследование биотканей показало гнойное расплавление створок и стенки эксплантированного аллографта, тогда как в месте применения клея - отмечалась незначительная воспалительная реакция и фиброз ткани (рис. 12).

  а)  б)

Рис. 12  Гистологический срез аллографта у больной С., возраст 41 г., через 6 месяцев после операции. а) - створки эксплантированного аллографта; б) - участок шва аорты, обработанный клеем. Окраска гематоксилином и эозином, ув. 200.

Известен случай, сужения коронарных артерий после реконструкции корня аорты с применением клея GRFG (Martinelli L. et al., 2000). В нашем наблюдении аналогичный случай наблюдали у пациента Ч., 50 лет с инфекционным эндокардитом аортального клапана, который перенес 4 операции в условиях искусственного кровообращения. На 3-ей операции, больному был имплантирован бескаркасный ксенографт с реимплантацией устьев коронарных артерий. В связи с кровотечением из мест вколов, на участки реимплантации, дистальные и проксимальные анастомозы имплантировали Биоклей-ЛАБ. Через 14 месяца больной вновь реоперирован, по поводу протезного эндокардита. На операции у больного отмечается муфтообразный стеноз и гиперплазия устья левой коронарной артерии (рис. 13).

Можно предположить, что применение клея способствовало этому стенозу. Но, несомненно, перенесенные три операции с ИК, потребовавшие введение кардиоплегических растворов в устье коронарных артерий, могли вызвать гиперплазию интимы с последующим сужением этих артерий. Больше аналогичных случаев стеноза артерий с применением клея Биоклей-ЛАБ в клинике не наблюдалось.

Рис. 13. Ангиографическое исследование больного Ч., 50 л., после 4-х операций. Стрелкой указан стеноз устья левой коронарной артерии.

Оценивая экономическую эффективность клея Биоклей-ЛАБ, необходимо помнить следующие факты. Использование любого гемостатического клея приводит к экономии средств: за счет сокращения времени оперативного вмешательства, уменьшения переливаемых объемов трансфузионных средств, лекарственных и т.п., отсутствие необходимости использования дорогостоящей аппаратуры, способствующей восстановлению кровопотери. Что касается клея Биоклей-ЛАБ, то он выгодно отличается от зарубежных аналогов свой стоимостью (25 долларов США за 2 мл, против стоимости 1 мл фибринового клея Tissucol от 300 долларов США и 5 мл клея BioGlue - от 500 долларов США).

Заключение

Диссертационная работа посвящена повышению эффективности профилактики кровотечений с использованием разработанных биологических клеев, обладающих высокой эластичностью, прочностью пленки и гемостатическими свойствами. Она выполнена на стыке нескольких наук: медицины, биологии и химии. Такое слияние наук позволило разработку медицинских клеев вести целенаправленно и более эффективно результаты экспериментальных исследований доводить до клинического внедрения. Практически на стадии разработки рецептуры клея стало возможным провести ее доработку в соответствии с требованиями хирургов.

С целью обеспечения потребности Центра в биологических клеях, в Н - ССХ им. Бакулева А.Н. РАМН в мае 2001 года была начата разработка медицинского клея. В ходе экспериментальных исследований был разработан новый биологический двухкомпонентный клей Биоклей-ЛАБ (аналог зарубежного клея GRFG, имеющий огромный опыт применения). Оригинальность разработанного клея заключается в использовании желатина со спирализованной структурой молекулы и различной степенью денатурации. Это позволило снизить концентрацию желатина в растворе и тем самым повысить гидрофильность клеевой пленки, что весьма необходимо при биодеградации клея, а также вязкость клея при комнатной температуре, позволившее исключить стадию его подогрева  перед применением. Низкая вязкость клея при комнатной температуре обеспечила равномерное перемешивание обоих его компонентов, и сделало более доступным сшивку спирализованных молекул желатина за счет межмолекулярных связей, а также увеличило возможность внутримолекулярных связей. По этой причине стало возможным снижение концентрации альдегидов в сравнении с зарубежными аналогами (табл. 1). При этом адгезионно-когезионные и эластичные свойства клеевой пленки оставались высокими.

Высокая эластичность и прочность клеевой пленки облегчает наложение хирургических швов, способствует упрочнению измененных тканей и при этом исключает ее деформацию. Применение клея способствует остановке кровотечения из мест вколов, ускорению репаративных и регенеративных процессов тканей, а также сокращает общее время оперативного вмешательства и, как следствие, уменьшает послеоперационную летальность. Биоклей-ЛАБ выгодно отличается своей стоимостью от стоимости известных зарубежных аналогов.

Об отсутствии аллергической реакции на клей, может свидетельствовать показатели температуры тела в двух однородных группах больных в течение 10 суток после операции, поскольку не наблюдалось достоверной разницы в их значении (в течение первых 4-5 суток в 1-ой группе - (37,6 0,4)С, а во 2-ой - (37,5 0,35)С).

Кровопотеря у прооперированных больных снизилась практически в 1,5 раза. Как следствие этого факта, снизились объемы трансфузий, например, объем СЗП в группе с применением клея Биоклей-ЛАБ (708 46,1) мл, в контрольной группе - (950 86,8) мл. Было снижено время проведения операций с искусственным кровообращением  (211,3 53,4 мин. в 1-ой группе и в контрольной группе 247,4 148,4  мин.). Количество реопераций снизилось практически вдвое (2 пациента (4,8%) из группы с применением клея и 4 больных (10,3%) из контрольной группы).

Гистологические исследования тканей после применения клея как в эксперименте, так в клинике, не показали их некротических изменений и выраженного воспалительного процесса, наоборот, клей способствовал более быстрому заживлению раны, а ткани были устойчивы к инфекции (рис.3 и рис.12). Выраженность послеоперационной экссудации из полости перикарда практически не отличалось от больных, у которых клей не применялся. В месте применения клея отмечается увеличение количества клеток и рост коллагена, что хорошо согласуется с литературными данными (Nomori H. и Walker J.). Этот клеточный инфильтрат, в месте применения клея, имеет фибробластическую морфологию. После резорбции клея, в месте его применения, отмечается образование незначительного уплотнения.

В нашем наблюдении, не было отмечено значительных изменений гематологических, гемостазиологических, биохимических показателей у пациентов двух групп.

Один случай, наблюдения стеноза коронарной артерии (рис. 13) у тяжелейшего пациента, перенесшего 4 операции, не может дать однозначного утверждения, что это произошло из-за негативного влияния клея на биоткань артерии. Возможная причина может быть в большом количестве реопераций, а также и в нарушении технологии применения клея. Необходимо продолжить наблюдения для получения объективного ответа.

Изучение функциональных свойств клея Биоклей-ЛАБ, показало, что он так же как и другие известные хирургические клеи, максимально эффективен на сухой поверхности биоткани. В этой связи, была предпринята попытка создания клея, работающего на влажных поверхностях.

Совместные исследования ГН - РАМН и Н - ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН позволили разработать и получить однокомпонентный Гемостатический клей. Достоинством этого клея является остановка кровотечения без специальной подготовки поверхности перед его нанесением. Гемостатический клей сочетает в себе хорошую адгезию, высокую прочность - синтетического клея и способность к набуханию и гелеобразованию и наличию высоких репаративных и регенеративных свойств - биологического клея. Проведение экспериментальных исследований Гемостатического клея на животных, как при полостных операциях, так и при кардиохирургических операциях, показали эффективность его использования на кровоточащих ранах разных тканей (время остановки кровотечения составляло 30Ч100 секунд). Гистологические исследования различных тканей после воздействия клея на них указывали на отсутствие его негативного влияния. Однако, для внедрения клея в клиническую практику, необходимо продолжение исследований для оценки его воздействия на биоткани в отдаленные сроки.

Отсутствие экспресс-методов, для оценки свойств разрабатываемых клеев, позволили впервые разработать лабораторный способ для качественной оценки in vitro гемостатических свойств жидких гемостатиков. Применение этого способа позволило ускорить проведение оценки гемостатической активности опытных рецептур клеев без особых затрат на проведение этого исследования и сделало исследование более приближенным к реальным условиям (использование крови человека).

Оценка антимикробных свойств клея Биоклей-ЛАБ показала, что дискодиффузионный метод определения активности антибиотиков может использоваться и у клеев для этих целей и клей обладает антимикробными свойствами. Наличие антимикробных свойств выгодно отличает клей от фибриновых клеев и позволяет его использовать в условиях инфицированной раны, что и было подтверждено у больной с инфекционным эндокардитом (рис. 12).

Клеи применяются для наружной герметизации анастомозов, фиксации и склеивания тканей. Непосредственно в кровотоке они не используются. Изучение деструкции клея в ускоренном режиме при (261)0С, в отличие от стандартного исследования, показала, что в течение первых трех часов может произойти максимальное выделение резорцина и альдегидов (первым разрушается резорцино-формальдегидный олигомер), и это время можно считать негативным по его влиянию на живой организм. В результате экспериментально-клинического наблюдения, негативного влияния клея Биоклей-ЛАБ не отмечалось.

Таким образом, клинический анализ применения клея "Биоклей-ЛАБ" показал хирургическую и экономическую целесообразность его использования для профилактики послеоперационных кровотечений.

Практические рекомендации.

1. Основным показанием к применению двухкомпонентного желатино-резорцинового глутарово-формальдегидного клея Биоклей-ЛАБ при сложных операциях на корне аорты является его использование для профилактики и остановки послеоперационной кровопотери. Герметизация анастомозов и укрепление несостоятельных тканей может привести к сокращению продолжительности оперативного вмешательства и экономии кровозаменяющих средств.
2. Необходимо помнить, что перед применением клея Биоклей-ЛАБ целесообразно тщательно осушить место его нанесения, добавить несколько капель отвердителя на ткани (кроме ксеноперикарда) и сразу же осушить их салфеткой, нанести тонкий слой клея (смесь обоих компонентов), избыток клея необходимо удалить марлевой салфеткой и выждать 3-5 минут. В случае необходимости возможно наложение дополнительных швов прямо по отвержденному клею, т.к. "Биоклей-ЛАБ" после отверждения дает эластичную и прочную пленку.
3. Следует отказаться от применения большого количества клея Биоклей-ЛАБ в замкнутом пространстве и с большой осторожностью использовать его для гемостаза сосудов малого диаметра до получения новых результатов по этой проблеме.

Выводы.

1) Получены одно- и двухкомпонентные гемостатические клеи на основе гелеобразующих природных материалов: полисахарида (альгината натрия) и природного белка (желатина).

2) Показана возможность использования желатина со спирализованной структурой молекулы и различной степенью денатурации (в определенной пропорции 6-7% низкомолекулярный и 8,5-9,5% высокомолекулярный), низкой концентрацией раствора (~20%), низкой вязкостью, сниженной температурой сшивки до 2520С для получения желатино-резорцинового глутарово-формальдегидного клея.

3) Изучены in vitro функциональные свойства разработанных клеев, подтверждающие их гемостатическую эффективность, высокую эластичность и адгезионно-когезионную прочность. Клеи не вызывают деформацию биоткани и легко прокалываются иглой не нарушая целостности клеевой плаенки.

4) Выбрана оптимальная рецептура желатино-резорцинового глутарово-формальдегидного клея с низкой вязкостью (не более 33 cпз при комнатной температуре) и сниженным содержанием альдегидов (161%), обеспечивающая жизнеспособность клея не менее 30 секунд, время полимеризации 3-5 минут. Клей, получивший фирменное название Биоклей-ЛАБ, внедрен в клиническую практику и организовано его мелкосерийное производство.

5) Оценена безопасность применения разработанных клеев в эксперименте и подтверждена безопасность клея Биоклей-ЛАБ при его клиническом применении. Оценка биосовместимости клеев проводилась в соответствии с национальным стандартом ГОСТ Р ИСО 10993-99 Изделия медицинские. Оценка биологического действия.

6) Проведена в эксперименте отработка технологии применения разработанных клеев на различных тканях. Оценка прочностных показателей склеенных образцов in vitro показала необходимость тщательного осушения поверхности ткани перед нанесением клея Биоклей-ЛАБ для повышения адгезионной прочности. В экспериментах in vivo было показано, что время отверждения клея на различных тканях различно: на аорте, венах, артериях - 3-5 минут, а на легком - 7-10 минут в зависимости от глубины раны.

Гемостатический клей может наноситься непосредственно на рану, исключая подготовку поверхности. В экспериментах in vivo время отверждения клея на аорте, венах, артериях, печени, желудке, толстой кишке - 30-60 секунд, а на легком - 60-100 секунд в зависимости от глубины раны.

7) Предложен новый способ качественный оценки in vitro гемостатической активности жидких кровоостанавливающих средств, который позволяет сократить время исследования (до 1 минуты) и затраты на проведение экспериментальных исследований на животных для новых разрабатываемых композиций, а также проводить более приближенную к естественным условиям оценку гемостатической активности на крови человека.

8) Проанализирован четырехлетний опыт клинического использования клея Биоклей-ЛАБ при операциях на корне и восходящем отделе аорты и показано, что профилактическое применение клея в клинике позволило снизить кровопотерю в 1,5 раза, количество переливаемых трансфузионных препаратов на 27%, время оперативного вмешательства на 33% и количество реопераций вдвое.

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации.

1. Межнева В.В., Костава В.Т., Муратов Р.М., Бакулева Н.П., Кондратенко Ж.Е., Ефимов А.В., Новикова С.П. Влияние белкового биологического клея на упруго-прочностные характеристики стабилизированного ксеноперикарда. // Сб. тез. Всерос. Конф. "Биопротезы в сердечно-сосудистой хирургии", Кемерово.- 2001.- С. 58.
2. Межнева В.В., Бакулева Н.П., Керимов Б.Ч., Колосков И.О., Кондратенко Ж.Е., Соколов М.В., Муратов Р.М., Костава В.Т.Изучение возможностей применения нового желатино-резорцинового клея в сердечно-сосудистой  хирургии.// Сб. тез. 7-го Всерос. съезда серд.-сосуд. Хирургов. Бюлл. Н - ССХ.- 2001.- т.2.- №6.- С. 248.
3. Межнева В.В., Бакулева Н.П., Керимов Б.Ч., Муратов Р.М., Кондратенко Ж.Е., Соколов М.В., Костава В.Т., Колосков И.О.Экспериментальная оценка вариантов применения желатино-резорцинового клея при хирургической травме магистральных сосудов и  легкого. // Сб. тез. 7-го Всерос. съезда серд.-сосуд. хирургов, Бюлл. НЦССХ.- 2001.- т.2.- №6.- С. 256.
4. Межнева В.В., Муратов Р.М., Костава В.Т., Серов Р.А., Баранова М.В., Керимов Б.Ч.  Новый желатино-резорциновый клей обладает высокой степенью биосовместимости.// Сб. тез. 6-ой ежегодной сессии Н - ССХ, Бюлл. Н - ССХ.- 2002.- т.3.- №5.- С. 180.
5. Межнева В.В., Костава В.Т., Баранова М.В. Желатино-резорциновый клей "Биоклей-ЛАБ" - безопасный биодеградируемый клей.// Сб. тез. 8-го Всерос. съезда серд.-сосуд. хирургов Н - ССХ. Бюлл. НЦССХ.- 2002.- т. 3.- №11.- С. 324.
6. Межнева В.В., Костава В.Т., Баранова М.В., Лютова И.Г., Белобородова Н.В., Анучина Н.М. Антимикробность желатино-резорцинового клея "Биоклей-ЛАБ. // Сб. тез. 8-го Всерос. съезда серд.-сосуд. хирургов Н - ССХ. Бюлл. Н - ССХ.- 2002.- т. 3.- №11.- С. 256.
7. Бокерия Л.А., Муратов Р.М.,  Костава В.Т., Межнева В.В. Первые результаты клинической апробации двухкомпонентного желатино-резорцинового клея "Биоклея-ЛАБ". //Сб. тез. 8-го Всерос. съезда серд.-сосуд. Хирургов. Бюлл. Н - ССХ .-2002.- т. 3.- №11.- С. 318.
8. Бокерия.  Л. А., Межнева В. В., Муратов Р. М., Костава В. Т., Серов Р. А. Новый желатино-резорциновый биологический клей Биоклей-ЛАБ для профилактики кровотечений при оперативных вмешательствах. // Тромбоз, гемостаз и реология.- 2002.- №4.- С. 39-42.
9. Межнева В.В., Костава В.Т., Баранова М.В., Белобородова Н.В., Анучина Н.М. Метод оценки антимикробных свойств биологического клея Биоклей-ЛАБ. //Сб. тез. 1-ой Всерос. науч. конф. Клиническая гемостазиология и гемореалогия в серд.-сосуд. хирургии, Н - ССХ.-  2003.-С. 37.
10. Бокерия Л.А., Межнева В.В., Муратов Р.М., Скопин И.И., Костава В. Т. Первый опыт применения биологического клея Биоклей-ЛАБ. // Сб. тез. научно-практ. конф. Актуальные вопросы сердечно-сосудистой хирургии, Нижний Новгород.-  2003. - С. 137.
11. Межнева В.В., Муратов Р.М., Керимов Б.Ч., Бакулева Н.П., Костава В.Т., Кондратенко Ж.Е., Соколов М.В., Серов Р.А., Анучина Н.М., Белобородова Н.В. Экспериментальное изучение нового биологического желатино-резорцинового клея Биоклей-ЛАБ. // Бюлл. Н - ССХ.- 2003.- т.4.- № 2.- С. 45-50.
12. Межнева В.В., Гончарова Е.В., Костава В.Т., Анучина Н.М. Выбор метода стерилизации для нового медицинского клея Биоклей-ЛАБ.// Сб. тез. 7-ой ежегодной сессии Н - ССХ. Бюлл. НЦССХ.- 2003.- т. 4.- №6.- С.210.
13. Бокерия Л.А., Муратов Р.М., Межнева В.В., Костава В.Т. Результаты использования биологического клея Биоклей-ЛАБ при сложных операциях на корне аорты.// Сб. тез. 9-го съезда серд.-сосуд. хирургов Н - ССХ. Бюлл. Н - ССХ.-  2003.- т. 4.- №11.- С. 348.
14. Макаров В.А., Белозерская Г.Г., Малыхина Л.С., Жидков Е.А., Межнева В.В., Муратов Р.М., Костава В.Т., Крестинич И.М., Абасов М.М. Экспериментальные исследования гемостатической герметизирующей композиции. //Сб. тез. 9-го съезда серд.-сосуд. хирургов Н - ССХ. Бюлл. НЦССХ.- 2004.- т. 5.- №5.- С. 347.
15. Бокерия Л.А., Муратов Р.М.,  Межнева В.В., Костава В.Т., Крестинич И.М., Абасов М.М. Клиническое применение нового биологического клея "Биоклей-ЛАБ" при операциях на сердце в условиях искусственного кровообращения. //Хирургия.- 2005.- №1.- С. 18-20.
16. Белозерская Г.Г., Макаров В.А., Малыхина Л.С., Жидков Е.А., Межнева В.В., Муратов Р.М., Крестинич И.М., Абасов М.М. Экспериментальное исследование специфической активности новой клеевой гемостатической композиции. //Бюлл. Н - ССХ.-  2005.- т. 6.- №2.- С.17-21.
17. Муратов Р.М.,  Межнева В.В., Крестинич И.М., Абасов М.М., Макаров В.А., Белозерская Г.Н., Малыхина Л.С., Жидков Е.А. Биологическая характеристика новой гемостатической композиции. // Сб. тез. 10-ого съезда серд.-сосуд. хирургов НЦССХ.  Бюлл. Н - ССХ.- 2004.- т.5.- № 11.- С.342.
18. Межнева В.В., Ковбасенко О.М., Солонцова Н.В. Качественный метод оценки гемостатического эффекта в клеевых гемостатических композициях.// Сб. тез. 10-ого съезда серд.-сосуд. Хирургов Н - ССХ. Бюлл. Н - ССХ.- 2004.- т.5.- № 11.- С. 343.
19. Белозерская Г.Г., Макаров В.А., Малыхина Л.С., Жидков Е.А., Межнева В.В., Муратов Р.М., Крестинич И.М., Абасов М.М. Новая клеевая гемостатическая композиция. // Сб. тез. 2-ой Всерос. научн. конф. Клин. гемостазиология и гемореология в серд.-сосуд. хирургии  Н - ССХ.- 2005.- С. 31.
20. Бокерия Л.А., Муратов Р.М., Межнева В.В., Хаджабет Х.Ф., Абасов М.М. Гемостатический эффект Биоклея-ЛАБ при сложных операциях на корне аорты.// Сб. тез. 2-ой Всерос. научн. конф. Клин. гемостазиология и гемореология в серд.-сосуд. хирургии Н - ССХ.- 2005.- С. 41.
21. Межнева В.В., Солонцова Н.В. Оценка гемостатического эффекта медицинских клеев.// Сб. тез. 2-ой Всерос. научн. конф. Клин. гемостазиология и гемореология в серд.-сосуд. хирургии Н - ССХ.- 2005.- С. 220.
22. Абасов М.М., Межнева В.В., Мелконян Р.М., Муратов Р.М., Серов Р.А., Бокерия Л.А. Предварительные результаты гистологического исследования биологических тканей после применения Биоклея-ЛАБ. // Сб. тез. 9-ой ежегодной сессии Н - ССХ.  Бюлл. Н - ССХ . 2005. -т.6.- №3.- С.194.
23. Бокерия Л.А., Муратов Р.М., Межнева В.В., Костава В.Т., Серов Р.А., Абасов М.М.  Биоклей-ЛАБ - биосовместимый герметизирующий имплантат при кардиохирургических операциях. // Сб. тез. 1-ой Межд. научно-практ. конф. Совр. полимерные материалы в медицине и мед. технике. Санкт-Петербург. - 2005. - С. 154.
24. Межнева В.В. Опыт применения двухкомпонентных желатинно-резорциновых глутарово-формальдегидных клеев в кардиохирургии. // Сб. тез. 11-го съезда серд.-сосуд. хирургов Н - ССХ. Бюлл. Н - ССХ.- 2005.- т.6.- №5.- С. 311.
25. Абасов М.М., Межнева В.В. Экспериментально-клиническая оценка Биоклея-ЛАБ.// Сб. тез. 11-го съезда серд.-сосуд. хирургов Н - ССХ. Бюлл. Н - ССХ.- 2005.- т.6.- №5.- С. 313 .
26. Бокерия Л.А., Муратов Р.М., Межнева В.В., Абасов  М.М. Сравнительный анализ использования клеев GRF и Биоклея-ЛАБ в кардиохирургии. // Бюлл. Н - ССХ.- 2005.- т.6.- №4.- С. 59-66.
27. Абасов М.М., Муратов Р.М., Межнева В.В., Бокерия Л.А. Вопросы применения различных видов медицинского клея в кардиохирургии. // Информ. сб. Н - ССХ, серия Медицина, Серд.-сосуд. хирургия.- 2005.-  №4.- С. 20-27.
28. Муратов Р.М., Межнева В.В.,  Абасов М.М. Сравнительные результаты применения Биоклея-ЛАБ при операциях на корне и восходящем отделе аорты. // Сб. тез. 10-ой ежегодной сессии Н - ССХ.  Бюлл. Н - ССХ.- 2006.- т.7.- №3.-С. 35.
29. Межнева В.В., Костава В.Т. Изучение клеевых свойств различных биоматериалов. // Сб. тез. 10-ой ежегодной сессии Н - ССХ.  Бюлл. Н - ССХ.- 2006.- т.7.- №3.- С. 231.
30. Межнева В.В., Костава В.Т. Медицинские клеи в кардиохирургии. // Сб. тез. 12-го съезда сер.-сосуд. хирургов Н - ССХ.  Бюлл. Н - ССХ.- 2006.- т.7.- №5.-С. 289.
31. Муратов Р.М., Межнева В.В., Абасов М.М. Гемостатическая и экономическая эффективность применения клея Биоклей-ЛАБ. // Сб. тез. 12-го съезда сер.-сосуд. хирургов Н - ССХ.- Бюлл. Н - ССХ.- 2006.- т.7.- №5.- С. 39.
32. Межнева В.В., Муратов Р.М., Абасов М.М. Оценка гемостатической эффективности применения клея Биоклей-ЛАБ при операциях на корне и восходящем отделе аорты. // Сб. тез. 3-ей Всерос. науч. конф. Клиническая гемостазиология и гемореология в серд.-сосуд. хирургии Н - ССХ.- 2007.- С. 155.
33. Межнева В.В., Межнев В.В., Костава В.Т. Изучение гемостатических свойств различных клеевых композиций.  // Сб. тез. 11-ой ежегодной сессии Н - ССХ.  Бюлл. Н - ССХ.- 2007.- т. 8.- № 3.-С. 203.
34. Муратов Р.М., Межнева В.В., Абасов М.М., Бокерия Л.А. Гемостаз с применением клея Биоклей-ЛАБ при операциях на корне и восходящем отделе аорты. // Бюлл. Н - ССХ. - 2007. - т.8, №2.-С. 66-71.
35. Межнева В.В., Самсонова Н.Н., Плющ М.Г., Костава В.Т., Межнев В.В. Экспериментальные исследования гемостатической активности жидких кровоостанавливающих средств. // Бюлл. Н - ССХ. - 2007. -  т. 8, №2. - С.71-75. 
36. Муратов Р.М., Межнева В.В., Абасов М.М., Бокерия Л.А. 4х-летний опыт применения клея Биоклей-ЛАБ при операциях на корне и восходящем отделе аорты. // Грудная и серд.-сосуд. Хирургия.- 2007.- №3.-С.41-46 .
37. Патент RU 02236260  Россия, МКИ А61L24/10. Хирургический клей - Биоклей-ЛАБ. Бокерия Л.А., Межнева В.В., Муратов Р.М., Костава В.Т (Россия) - №122996/15; Заявл.28.08.02; Опубл. 20.09.04, Бюл. №24
38. Патент RU 2270016  Россия, МКИ А61К 31/734 (31/78, 31/225), А61Р 7/04. Гемостатический клей.  Белозерская Г.Г.*, Малыхина Л.С.*, Макаров В.А.*, Межнева В.В., Костава В.Т. (Россия) - №106691/15; Заявл.09.03.04; Опубл. 27.08.06, Бюл. №5
39. Патент RU 2286569 Россия, МКИ G01N 33/48, 33/49. Способ оценки гемостатического эффекта жидких кровоостанавливающих средств. Бокерия Л.А., Межнева В.В., Самсонова Н.Н., Плющ М.Г. (Россия)- №108926/15; Заявл.30.03.05; Опубл.  27.10.06 , Бюл.№30
40. Межнева В.В., Межнев В.В., Костава В.Т. Санитарно-химические исследования клея Биоклей-ЛАБ  в модельной среде. // Сб. тез. 13-го съезда  Н - ССХ.  Бюлл. Н - ССХ.- 2007.- т. 8.- № 6.-С. 313.
41. Межнева В.В., Муратов Р.М., Костава В.Т., Суходоев Ю.А. Шприц-пистолет для нанесения хирургического клея Биоклей-ЛАБ // Сб. тез. 12-ой ежегодной сессии Н - ССХ.  Бюлл. Н - ССХ им. А.Н. Бакулева, т.9, №3,  2008 г., г. Москва, с.33
42. Статья в печати Межнева В.В. Экспериментально-клиническая оценка биосовместимости клеев Биоклей-ЛАБ и GRFG . //Бюлл. Н - ССХ, т.9, №4, октябрь-ноябрь 2008 г.

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине