Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Гельперина Светлана Эммануиловна
РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ К СОЗДАНИЮ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ АНТИБИОТИКОВ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРНЫХ НАНОЧАСТИЦ
03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук
Москва - 2010
Работа выполнена в Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, научно-исследовательской лаборатории ООО НПК Наносистема и Институте молекулярной медицины Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова.
Научный консультант: доктор химических наук, профессор, академик РАМН Швец Виталий Иванович
Официальные оппоненты: академик РАН и РАМН, доктор биологических наук, профессор Ткачук Всеволод Арсеньевич член-корр. РАН, доктор химических наук, профессор Костров Сергей Викторович доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович
Ведущая организация: Институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН
Защита диссертации состоится л19 апреля 2010 г. в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В.
омоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, д. 86.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В.
омоносова.
С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ВАК РФ:
http//vak.ed.gov.ru Автореферат разослан л__________________2010 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник __________________Лютик А.И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
U
Актуальность проблемыU. Современная фармакотерапия располагает арсеналом мощных лекарственных средств, однако результаты лечения часто остаются неудовлетворительными. Среди факторов, снижающих эффективность лекарственных веществ (ЛВ), следует отметить неблагоприятное биораспределение, которое может быть обусловлено трудностями при проникновении в очаг патологии. Причинами этого могут быть затрудненный доступ в орган-мишень из-за структурных особенностей тканей (например, изза наличия гистогематических барьеров) или недостаточный внутриклеточный транспорт ввиду физико-химических свойств ЛВ. Тривиальным способом преодолеть эти препятствия и повысить эффективность лечения является увеличение дозы ЛВ. При этом терапевтический эффект часто достигается ценой повышения неспецифической токсичности. Проблема приобретает особую остроту в случае сильнодействующих ЛВ, таких как, например, противоопухолевые агенты и антибиотики, применение которых сопряжено с побочными эффектами, выраженными настолько, что они значительно снижают терапевтическую ценность этих препаратов. Актуальность этой проблемы послужила стимулом для разработки подходов к созданию разнообразных систем направленной доставки ЛВ. Особый интерес среди таких систем представляют полимерные наночастицы (НЧ), то есть частицы размером от до 1000 нм, сочетающие такие важные для носителей качества, как стабильность и высокая емкость в отношении широкого спектра ЛВ.
К настоящему времени можно считать доказанным, что включение в НЧ может существенно изменять профиль распределения ЛВ в организме, и накоплен значительный опыт по разработке и исследованию наносомальных форм различных ЛВ. Однако некоторые аспекты этой технологии изучены недостаточно. Так, несмотря на очевидную целесообразность использования НЧ для доставки антибиотиков, систематические исследования в этой области не проводились. Транспорт НЧ через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) к началу данного исследования также оставался практически неизученным.
UЦель работыU состояла в выявлении закономерностей, определяющих способность полимерных НЧ влиять на фармакологическое действие различных антибиотиков. В частности, представлялось необходимым изучить влияние состава наносомальных форм на параметры биораспределения антибиотиков.
Преодоление ГЭБ является важнейшей проблемой химиотерапии; в связи с этим одна из наиболее существенных задач состояла в изучении возможности использования полибутилцианоакрилатных (ПБЦА) НЧ для доставки противоопухолевого антибиотика доксорубицина через ГЭБ в мозг и оценке эффективности наносомальной формы доксорубицина на модели интракраниальной глиобластомы. Наконец, для достижения цели исследования необходимо было изучить влияние наносомальной формы на активность антибактериальных антибиотиков в отношении экспериментальных инфекций, в том числе туберкулеза.
UНаучная новизна 1. Впервые выявлены закономерности, позволяющие осуществить направленный транспорт антибиотиков, связанных с полимерными наночастицами, через гематоэнцефалический барьер.
2. Разработана технология получения наносомальной формы доксорубицина на основе ПБЦА НЧ. Изучено влияние условий полимеризации на свойства наночастиц. Изучено влияние состава наночастиц на биораспределение и противоопухолевый эффект доксорубицина.
3. Показано, что модификация ПБЦА НЧ полисорбатом 80, позволяет доставить в мозг терапевтически эффективные концентрации доксорубицина при внутривенном введении. При этом связанный с наночастицами доксорубицин после внутривенного введения проникает в мозг так, как если бы он не был защищен ГЭБ.
4. Показано, что наносомальная форма доксорубицина оказывает выраженное противоопухолевое действие на интракраниальную глиобластому у крыс, тогда как его стандартная лекарственная форма малоэффективна.
Выявлено влияние состава наночастиц на фармакологический эффект.
5. На примере доксорубицина и лоперамида показано, что модификация ПБЦА НЧ полоксамером 188 (Pluronicо F68) позволяет при внутривенном введении доставить в мозг терапевтически эффективные концентрации ЛВ, не способных преодолеть ГЭБ в свободном виде.
6. Впервые изучена сорбция белков плазмы на поверхности ПБЦА НЧ, нагруженных доксорубицином и модифицированных полоксамером 188 или полисорбатом 80, и найдена корреляция между профилями сорбции белков и фармакологическим эффектом наносомальных форм. Предложен новый механизм транспорта НЧ через ГЭБ, основанный на взаимодействии аполипопротеина А-I, найденного на поверхности НЧ, со скавенджер-рецептором SRBI, экспрессируемым эндотелиальными клетками капилляров мозга.
7. Показано, что наносомальная форма доксорубицина на основе ПБЦА НЧ обладает радиационной устойчивостью, то есть может быть стерилизована радиационными методами.
8. Разработана технология получения наносомальных формы антибактериальных антибиотиков - рифампицина, моксифлоксацина и стрептомицина. На примере наносомальных форм рифампицина изучено влияние структуры полимера на кинетику выделения ЛВ из наночастиц.
9. Впервые изучено влияние модификации наночастиц поверхностноактивными веществами (ПАВ) на фармакокинетику рифампицина и его распределение по органам. Показано, что влияние ПАВ на распределение наночастиц зависит от типа полимера.
10. Показана возможность снижения терапевтических доз рифампицина и моксифлоксацина при лечении экспериментального туберкулеза путем создания наносомальных форм этих антибиотиков.
11. Показана высокая эффективность наносомальных форм антибиотиков различных классов - рифампицина и стрептомицина - при лечении острых бактериальных инфекций.
12. Предложен и реализован на примере наносомальной формы лоперамида и паклитаксела в ПБЦА НЧ подход, позволяющий значительно повысить содержание в водной фазе нерастворимых в воде субстанций.
UПрактическая значимость 1. Показано, что, в отличие от стандартной лекарственной формы доксорубицина, его наносомальная форма на основе ПБЦА НЧ, модифицированных полисорбатом 80, проявляет высокий противоопухолевый эффект в отношении высоко злокачественной интракраниальной глиобластомы. Этот результат позволяет расширить спектр действия доксорубицина и наряду с установленной более низкой кардиотоксичностью наносомальной формы свидетельствует о перспективности этой формы для лечения опухолей мозга.
2. Для наносомальных форм рифампицина и моксифлоксацина показана возможность снижения терапевтических доз по сравнению со стандартными лекарственными формами при лечении экспериментального туберкулеза.
3. Для наносомальных форм стрептомицина и рифампицина показана возможность снижения терапевтических доз по сравнению со стандартными лекарственными формами при лечении острых бактериальных инфекций.
4. Применение ПБЦА наночастиц позволит создавать парентеральные формы для нерастворимых субстанций.
5. Создана технология, практическая ценность которой определяется возможностью создавать наносомальные формы на основе носителей, сочетающих селективность, безопасность и емкость, а также использованием фармацевтических ингредиентов и мягкими условиями получения, позволяющими сохранять структуру биологически активных веществ.
UОсновные положения, выносимые на защитуU:
1. Создана технология, позволяющая с помощью полимерных наночастиц достичь в головном мозге терапевтически значимых концентраций доксорубицина и реализовать его противоопухолевый эффект в отношении интракраниальной опухоли.
2. Разработаны и применены подходы, позволяющие с помощью полимерных наночастиц усиливать фармакологическое действие антибактериальных антибиотиков различных классов за счет повышения их концентрации в органах-мишенях. При этом параметры биораспределения можно в определенной степени регулировать путем изменения состава наночастиц.
Uичный вклад автораU. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах исследования - от постановки задачи, планирования и проведения ключевых экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов.
UАпробация работыU. Основные результаты работы были доложены на Российском Национальном конгрессе Человек и лекарство (1996, 1997, 1998, 2000, 2004; Москва), Международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (2005, 2006, 2009; Москва), VIII Съезде фтизиатров России (2007, Москва), III Международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике (2008, Москва), ХХ симпозиуме Современная химическая физика (2008, Туапсе), Роснанофоруме (2008, Москва), Gordon Research Conference (2002, Tilton, U.S.), Nano Science and Technology Institute (NSTI) BioNanoConference (2006, Boston, U.S.), 5th Conference on Formulation Technology (2007, Potsdam, Germany), World Meetings of Pharmaceutics & Biopharmaceutics (1998, 2000, 2002, 2004, 2006, 2008), Annual Meetings of Controlled Release Society (2000, 2001, 2002, 2004, 2006-2008), International Symposium on Microencapsulation (2005), 6th Congress of the Global College of Neuroprotection & Neuroregeneration / 5th Congress of the Society for the Study of Neuroprotection and Neuroplasticity (2009, Vienna, Austria).
UОбьем и структура работыU. Диссертационная работа изложена на 3страницах машинописного текста, содержит 133 рисунка, 43 таблицы и состоит из введения, литературного обзора, изложения и обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы (258 наименований).
UПубликацииU. По теме диссертации опубликовано 2 главы в монографиях, 2 патента, 29 оригинальных статей, в том числе 16 в зарубежной печати, более 40 тезисов докладов на российских и международных конференциях.
Работа выполнена при участии НИИ морфологии человека РАМН (Москва), НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН (Москва), ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (Оболенск), Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения, Еврейского медицинского и исследовательского центра (Денвер, США) и Института фармацевтической технологии Университета им. Гёте (Франкфурт/Майн).
Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова по госконтракту с Роснаукой № 02.512.11.2328 Разработка субмикронных носителей и новых лекарственных форм биологически активных субстанций таргетного действия для терапии распространенных болезней человека (онкология, внутриклеточные инфекции) в рамках федеральной целевой программы Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы.
Работа выполнена при поддержке гранта №2440 по программе БиоПромышленная Инициатива (BII) Государственного Департамента США, грантов INTAS №№ 94-310 и 00-838 и грантов DFG.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ ДОКСОРУБИЦИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛИОБЛАСТОМЫ Как отмечалось во введении, причиной неэффективного проникновения ЛВ в орган-мишень могут быть гистогематические барьеры. В частности, мозг является одним из наименее доступных объектов для фармакотерапии из-за наличия ГЭБ. Применяемые в настоящее время способы доставки ЛВ в мозг, в том числе интрацеребральное введение, а также повышение проницаемости ГЭБ с помощью гиперосмотических растворов или вазоактивных веществ, часто не дают желаемых результатов и сопряжены с большим риском для пациента.
Ранее путем фармакологических тестов было показано, что включение ряда веществ, не способных преодолевать ГЭБ (в том числе даларгин, киоторфин и тубокурарин) в ПБЦА НЧ, поверхность которых модифицирована полисорбатом 80 (Твин 80, полиоксиэтилен (20) сорбитан моноолеат), приводит к их воздействию на центральную нервную систему (ЦНС). Эти результаты послужили основанием для создания концепции о том, что НЧ могут служить средством доставки ЛВ в мозг. Однако практическая значимость этой концепции для терапии заболеваний ЦНС, а также ее важнейшие аспекты, такие как количественные параметры биораспределения, токсикологические особенности наносомальных форм и механизм доставки в мозг оставались неопределенными.
Соответственно, целью настоящего исследования являлось изучение возможности применения ПБЦА НЧ для доставки в мозг цитостатиков и определение потенциала таких наносомальных форм для лечения глиобластомы - одного из наиболее тяжелых заболеваний ЦНС. С точки зрения безопасности для парентерального введения благоприятными свойствами ПБЦА являются низкие молекулярные массы, способствующие быстрому выводу полимера из организма, а также быстрая биодеградация до нетоксичных метаболитов полицианоакриловой кислоты и бутанола.
В качестве модельного препарата для исследования выбрали противоопухолевый антибиотик доксорубицин [(8S-цис)-10-(3-амино-2,3,6тридезокси--L-ликсо-гексопиранозил)окси-7,8,9,10-тетра-гидро-6,8,11-тригидрокси-8-(гидроксилацетил)-1-метокси-5,12-нафтацендион], который не применяется для лечения опухолей мозга, поскольку практически не проникает через ГЭБ при внутривенном введении. Технологическими достоинствами доксорубицина для целей данного исследования является амфифильный характер, предопределяющий возможность сорбции наночастицами, а также установленная нами устойчивость в условиях образования НЧ и флуоресцентные свойства, обусловливающие возможность определения антибиотика in vitro и in vivo, используя стандартные методы.
В задачи настоящего исследования входили: 1) разработка наносомальной формы доксорубицина на основе ПБЦА НЧ; 2) изучение влияния состава наносомальной формы на ее биологические свойства, в том числе биораспределение, противоопухолевую активность при лечении экспериментальной глиобластомы у крыс и токсичность; 3) изучение механизма доставки в мозг с помощью наночастиц.
1.1. Разработка наносомальной формы доксорубицина на основе ПБЦА.
ПБЦА НЧ, нагруженные доксорубицином (Докс-ПБЦА), получали методом полимеризации 2-n-бутилцианоакрилата в кислой водной среде в присутствии стабилизаторов (Рис. 1). С целью оптимизации процесса получения было изучено влияние рН полимеризационной среды (в пределах рН = 13), концентрации Докс (0,1 0,25%) и времени введения его в реакцию (через или 40 мин после начала полимеризации), концентрации мономера (0,52%), а также концентрации и типа стабилизатора (декстран или полоксамер 188) на основные параметры - размеры НЧ, эффективность сорбции Докс и устойчивость при лиофилизации. В качестве криопротектора использовали Dманнит.
Рис. 1. Реакция полимеризации 2-n-бутилцианоакрилата Показано, что наиболее заметное влияние на эффективность сорбции оказали тип стабилизатора и рН среды. Устойчивая наносуспензия с высоким выходом ПБЦА образовывалась при введении Докс в полимеризационную среду через 40 мин после начала мономера. Наибольшая степень сорбции Докс 71% и наибольшая нагрузка его на полимер 0,33 мг Докс/мг ПБЦА достигаются при следующих условиях: рН2, концентрация Докс 0,25%, концентрация мономера 1%, стабилизатор - декстран (1%). Размеры НЧ, определенные методами трансмиссионной электронной микроскопии и фотонной корреляционной спектроскопии, составляли 200 - 250 нм.
Кинетика выделения доксорубицина из НЧ в водной среде при 37С имеет двухфазный характер. Быстрое выделение Докс в начале эксперимента (50% в течение 30 мин) и последующая фаза медленного выделения предполагает, что антибиотик адсорбирован как на поверхности, так и внутри частиц.
1.2. Биораспределение наносомальной формы доксорубицина.
1.2.1. Биораспределение доксорубицина в составе наносомальной формы.
Для обоснования возможности использования Докс, включенного в ПБЦА НЧ, модифицированные полисорбатом 80 (Докс-ПБЦА+Пс), при лечении опухолей мозга необходимо было, прежде всего, установить, доставляют ли НЧ в мозг терапевтически значимые концентрации этого антибиотика. Контрольным группам вводили растворы Докс в воде (Докс) или в 1% растворе полисорбата 80 (Докс+Пс), а также НЧ с немодифицированной поверхностью (Докс-ПБЦА).
Препараты вводили в хвостовую вену здоровых крыс однократно в дозе 5 мг/кг.
Показано, что включение Докс в НЧ приводит к существенному изменению его фармакокинетики. В начальной фазе распределения (10 мин - ч) уровень концентраций Докс-ПБЦА в крови был в 1,4 - 2 раза ниже уровня свободного антибиотика (Рис. 2). Докс-ПБЦА задерживается в организме крыс дольше, чем свободный: константы периода полувыведения (Т1/2) и среднего времени удерживания (MRT) увеличиваются в 3,5 и 4 раза, соответственно, по сравнению с Докс, что свидетельствует о значительном накоплении антибиотика в тканях. Для Докс-ПБЦА отмечено также характерное для НЧ повышение концентраций в печени.
Концентрации доксорубицина в печени Докс Докс+Пс Докс Докс-ПБЦА Докс+Пс Докс-ПБЦА+Пс Докс-ПБЦА Докс-ПБЦА+Пс 0 2 4 6 0 1 2 Время, ч Время, час А Б Рис. 2. Концентрации различных форм доксорубицина в плазме (А) и печени (Б) крыс (n = 6) 0 2 4 6 0 2 4 6 Время, час Время, ч Докс Докс+Пс Докс-НЧ Докс-НЧ+Пс Рис. 4. Концентрации ДоксРис. 3. Концентрации различных ПБЦА+Пс, в головном мозге форм доксорубицина в сердце крыс здоровых крыс Влияние полисорбата на фармакокинетические параметры наносомальной формы (Докс-ПБЦА+Пс) проявилось в снижении клиренса на 30% по сравнению с Докс-ПБЦА; при этом интегральный показатель AUC возрос примерно Доксорубицин, мкг / мл Коцентрация Докс, мкг / г Концентрация, мкг / г Концентрация, мкг / г в 1,5 раза, а показатели Т1/2 и MRT снизились на ~30%. Кроме того, несколько уменьшилось накопление Докс в органах РЭС - печени, селезенке и легких.
Как известно, применение Докс часто ограничивается высокой кардиотоксичностью, обусловленной его значительным поступлением в сердечную мышцу, причем особую роль в развитии этого побочного эффекта играет пиковая концентрация. Действительно, максимальная концентрация Докс в сердечной мышце достигалась через 2 ч и составляла 6,57 0,55 мкг/г (Рис. 3). В то же время при введении наносомальных форм концентрация Докс уже через 1 ч после введения была ниже предела чувствительности измерений (< 0,1 мкг/г), то есть пиковая концентрация Докс в сердце снижалась в 22 раза.
Наиболее интересные данные, полученные при изучении фармакокинетики наносомальной формы Докс, относятся к способности модифицированных НЧ доставлять антибиотик через ГЭБ. При ассоциации с НЧ, модифицированными полисорбатом 80, значимые концентрации Докс в мозге (> 1 мкг/г) определялись в течение 8 ч после введения. При этом максимальная концентрация достигала весьма значительного уровня - 6 мкг/г - через 2 ч после введения и поддерживалась на этом уровне в течение последующих 2 ч (Рис. 4). При введении остальных форм (Докс, Докс+Пс, Докс-ПБЦА) уровень антибиотика в ткани мозга оставался ниже предела чувствительности измерений (<0,1 мкг/г) в течение всего периода наблюдения.
1.2.2. Биораспределение полибутилцианоакрилатных наночастиц. Задачей исследования было определить, существует ли корреляция между биораспределением Докс и самих НЧ. Кроме того, интерес представляло изучение распределения НЧ в мозге в условиях развивающейся глиобластомы.
Для решения этих задач исследовали распределение полибутил-2-циано[3C]акрилата (14C-ПБЦА) в составе НЧ, покрытых полисорбатом 80 - пустых (ПБЦА) или нагруженных Докс (Докс-ПБЦА+Пс), а также пустых НЧ с немодифицированной поверхностью (ПБЦА). В качестве модели опухоли головного мозга использовали глиобластому 101/8 (из коллекции Института морфологии человека РАМН), имплантированную интракраниально крысам Wistar. Наночастицы вводили крысам через 5, 8 и 10 дней после имплантации опухоли в дозе 20 мг/кг.
Все НЧ обладали близкими параметрами (ср. размер 220-260 нм, заряд поверхности -27 -29 мВ). При этом состав НЧ оказывал определенное влияние на профиль их биораспределения (Рис. 5), что, по-видимому, объясняется изменениями свойств поверхности (см. раздел 1.7). В целом полученные результаты коррелируют с данными описанного выше исследования распределения наносомального Докс. Распределение НЧ по изученным органам у здоровых крыс и крыс с опухолью (на рисунке не показано) не различалось.
Кровь Сердце Легкие Печень Селезенка Почки ПБЦА ПБЦА+Пс80 Докс-ПБЦА+Пс Рис. 5. Биораспределение [14C]-ПБЦА наночастиц через 1 ч после введения крысам (n = 10) 0,0,День День 0,0,0,0,0,0,ПБЦА НЧ ПБЦА НЧ Докс-ПБЦА +Пс80 НЧ + ПсПБЦА НЧ ПБЦА НЧ Докс+Пс80 ПБЦА НЧ Нормальная ткань Глиобластома + ПсРис. 7. Концентрации [14C]-ПБЦА в Рис. 6. Концентрации [14C]-ПБЦА в опухоли и нормальной ткани мозга ткани мозга крыс с глиобластомой через 1 ч после введения крысам с 101/8 (полушарие с опухолью) на 5-й глиобластомой 101/8: 10-й день и 10-й дни после имплантации (через после имплантации 1 ч после введения) Распределение наночастиц в мозге крыс. Концентрации НЧ определяли на 5, 8 и 10 дни после имплантации глиобластомы 101/8. К 10-ому дню в полушарии мозга с опухолью наблюдалась тенденция к росту концентраций всех НЧ (Рис. 6 и 7). При этом максимальное значение - ~ 0,93 % дозы - наблюдалось при введении Докс-ПБЦА+Пс80. Кроме того, концентрация НЧ в полушарии с имплантированной опухолью на 10-й день после имплантации была значительно выше, чем в контралатеральном полушарии (Рис. 7), что % дозы / г ( мл ) % дозы / г ткани % дозы / г ткани свидетельствует о тенденции к росту концентрации по мере роста опухоли и объясняется повышением проницаемости ГЭБ.
Итак, исследование биораспределения показало, что ПБЦА НЧ, модифицированные полисорбатом 80, проникают через ГЭБ и доставляют связанный с ними Докс в мозг. При этом количество Докс (~ 1% введенной дозы), доставленное в мозг, пропорционально относительной массе мозга (1% массы тела), то есть наносомальный Докс после внутривенного введения распределяется так, как если бы мозг не был защищен ГЭБ. В случае интракраниальной опухоли проникновению НЧ в мозг способствует нарушение ГЭБ в зоне опухолевого роста, однако НЧ эффективно доставляют Докс и в здоровый мозг. Уровень концентраций Докс в ткани мозга (6 мкг/г) в 15-25 раз превышает уровень IC50, определенный нами для клеток экспериментальных глиом крысы (0,24 - 0,38 мкг/мл).
1.3. Изучение противоопухолевой активности наносомальных форм доксорубицина на модели интракраниальной глиобластомы 101/8 у крыс.
Противоопухолевую активность оценивали по продолжительность жизни и числу животных с длительной ремиссией. Животные получали следующие препараты: 1) модифицированную полисорбатом 80 наносомальную форму (Докс-ПБЦА+Пс), 2) немодифицированную наносомальную форму (ДоксПБЦА); 3) пустые НЧ, модифицированные полисорбатом 80 (плацебо), 4) субстанцию доксорубицина в водном растворе (Докс), 4) субстанцию доксорубицина в 1% растворе полисорбата 80 (Докс+Пс). В качестве контроля использовали нелеченных животных. Препараты вводили трехкратно в хвостовую вену крыс на 2, 5 и 8 день после перевивки опухоли в дозе 1,5 мг/кг.
Наиболее высокий противоопухолевый эффект был достигнут в группе животных, леченных Докс-ПБЦА+Пс. В этой группе отмечено статистически значимое увеличение продолжительности жизни как по сравнению с нелеченным контролем (УПЖ = 85%), так и по сравнению с группой, получавшей эквивалентные дозы субстанции Докс (УПЖ = 24%). Кроме того, у 20% животных (5/23), получавших Докс-ПБЦА+Пс наблюдалась длительная ремиссия (Рис. 8). Патоморфологическое обследование животных, выживших к 180-ому дню, не выявило признаков опухоли. Эффект был подтвержден в трех независимых экспериментах (всего 156 животных, n = 8 10). Умеренный противоопухолевый эффект наблюдали также в группах Докс-ПБЦА и Докс+Пс, что объясняется, вероятно, повышением проницаемости ГЭБ в процессе роста опухоли. Введение эквивалентных доз пустых НЧ не оказывало противоопухолевого действия.
Выраженный противоопухолевый эффект Докс-ПБЦА+Пс коррелирует с результатами, полученными при изучении биораспределения: НЧ, модифицированные полисорбатом, могут доставлять антибиотик в опухоль на ранней стадии роста, когда ГЭБ еще сохраняет свои функции.
1.4. Влияние состава наночастиц на противоопухолевую активность доксорубицина. Целью эксперимента было сравнение влияния полоксамера 1и полисорбата 80 на противоопухолевый эффект наносомального доксорубицина. В опыте использовали НЧ, стабилизированные декстраном (Докс-ПБЦА/Dex) и покрытые полоксамером 188, и НЧ, а также НЧ, стабилизированные полоксамером 188 (Докс-ПБЦА/Р188), покрытые полисорбатом 80 или без покрытия. Для того чтобы обеспечить возможность сравнения результатов, в качестве модели использовали глиобластому 101/8 и аналогичный режим лечения (3 х 1,5 мг/кг в дни 2,5 и 8 после имплантации опухоли). Для выявления роли наночастиц животным вводили также доксорубицин в 1% растворе полисорбата 80 или полоксамера 188 (Докс+Пс80, Докс+Р188). Все наночастицы имели сходные физико-химические параметры.
Результаты этого эксперимента обнаруживают влияние состава наносомальной формы Докс на его эффективность. Наносомальные формы, содержащие полоксамер 188 в качестве стабилизатора (Докс-ПБЦА/Р188) или модификатора поверхности (Докс-ПБЦА/Декс+Р188), не только увеличили продолжительность жизни, но и обеспечили длительную ремиссию у 20% животных (2/10 и 4/20, соответственно) (Рис. 8). Таким образом, по эффективности эти формы сравнимы с Докс-ПБЦА/Декс+Пс, обеспечившим длительную ремиссию 22% (5/23) животных.
Способность ПБЦА НЧ, модифицированных Р188, доставлять вещества в мозг была показана также для другого субстрата P-gp, агониста опиатных рецепторов лоперамида, наносомальная форма которого проявила выраженный анальгезирующий эффект.
Следует отметить, что включение лоперамида в ПБЦА НЧ позволило повысить его содержание в водной фазе в 400 раз - от 2 мкг/мл до 800 мкг/мл.
Аналогичный эффект наблюдали при получении наносомальной формы другой малорастворимой субстанции - паклитаксела (растворимость в воде 1 мкг/мл):
содержание его в водной фазе повысилось в 450 раз. Эти результаты могут свидетельствовать о целесообразности использования ПБЦА НЧ при разработке парентеральных форм малорастворимых субстанций.
Контроль Контроль Докс Докс-ПБЦА/Декс+Пс11Докс+ПсДокс-ПБЦА/P1Докс+P1Докс-ПБЦА/P188+ПсДокс-ПБЦА/Декс+P1Докс-ПБЦА/Декс+Пс0 20 40 60 80 10 20 40 60 80 1Дни после имплантации опухоли Дни после имплантации опухоли Б А Рис. 8. Выживаемость крыс с глиобластомой 101/8 после в/в введения наносомальных форм доксорубицина на основе ПБЦА НЧ, стабилизированных декстраном (А) и полоксамером 188 (Б): влияние ПАВ.
1.5. Углубленные исследования противоопухолевой активности наносомального доксорубицина в отношении глиобластомы 101/8. Для получения более полного представления о противоопухолевой активности наносомального доксорубицина (Докс-ПБЦА+Пс/Декс) в отношении глиобластомы 101/8 было проведено углубленное исследование, целью которого являлась патоморфологическая оценка динамики роста опухоли, а также оценка результатов химиотерапии с помощью гистологических и иммуногистохимических методов.
Патоморфологические исследования: динамика роста опухоли.
Патоморфологические исследования позволили проследить за влиянием лекарственных форм Докс и Докс-ПБЦА+Пс на динамику роста глиобластомы.
Как показали исследования срезов мозга контрольных и опытных животных на 10, 14 и 18 день после имплантации, наносомальная форма Докс-ПБЦА+Пс тормозит рост глиобластомы значительно эффективнее, чем свободный Докс (Рис. 9 и 10). К 14-ому дню в контрольной группе у всех животных наблюдались обширные опухоли с очагами некроза; средний размер опухолей достигал 24,9 7,6 мм2. В группе, получавшей Докс-ПБЦА+Пс, у 4/6 животных % выживших % выживших опухоли обнаружено не было. У остальных животных размер опухолей не превышал 0,4 0.2 мм2.
Рис. 9. Средний размер опухолей после введения Докс и ДоксПБЦА+Пс (без учета большой опухоли).
- размер большой опухоли Режим лечения 3 х 1,5 мг/кг (n = 6) Рис. 10. Репрезентативные гистологические срезы мозга крыс на 10, 14 и день после имплантации (окрашивание гематоксилин - эозином). Режим лечения:
3 x 1.5 мг/кг на 2, 5 и 8 дни (n = 6) К 18-ому дню средний размер опухолей в группе, леченной ДоксПБЦА+Пс, был в ~50 раз меньше, чем в группе, получавшей стандартный препарат. У 2/6 животных введение Докс-ПБЦА+Пс предотвратило развитие опухоли. У 3/6 животных размер опухолей на срезе был менее 1 мм2 и лишь у одного животного развилась опухоль размером 45 мм2. Без учета этого животного средний размер опухолей составил 0,48 0,29 мм2 и был достоверно ниже, чем в группе Докс, где средний размер опухолей достигал 23,0 13,5 мм(p 0.0005). Контрольные животные к этому сроку погибли. Таким образом, противоопухолевый эффект наносомального доксорубицина выражался в значительном торможении роста опухоли.
Иммуногистохимические критерии. Иммуногистохимическими критериями оценки противоопухолевой активности доксорубицина в различных лекарственных формах служили пролиферативная активность опухолевых клеток, а также активность ангиогенеза в опухоли и микроваскулярная пролиферация.
UПролиферативная активностьU. Для выявления пролиферативной активности клеток глиобластомы использовали моноклональные антитела к антигену пролиферирующих клеток Ki67. Пролиферирующие клетки были обнаружены во всех группах, при этом в группе Докс-ПБЦА+Пс доля клеток, экспрессирующих Ki67+, была достоверно ниже, чем в контрольной группе и группе, получавшей Докс (Рис. 11А). Таким образом, наносомальный доксорубицин эффективно тормозил пролиферацию опухолевых клеток.
100 6 8 10 12 14 6 8 10 12 14 Дни после имплантации опухоли Дни после имплантации опухоли Контроль Докс Докс-ПБЦА+Пс Контроль Докс Докс-ПБЦА+Пс Б А Рис. 11. Влияние лекарственных форм доксорубицина на количество клеток глиобластомы, экспрессирующих маркер пролиферативной активности Ki67 (А) и маркер эндотелиальных клеток изолектин B4 (Б) Плотность сосудов. Плотность сосудов в опухоли оценивали по площади на срезе, занятой эндотелиальными клетками, экспрессирующими антиген к изолектину В4 (т.е. по площади, занятой сосудами). Как видно из Рис. 11Б, на 14-ый день плотность сосудов в группе Докс-ПБЦА+Пс была ниже предела чувствительности измерений. В группе Докс и в контроле плотность сосудов составляла 8 6% и 9 4%, соответственно.
На 18-ый день плотность сосудов в группе Докс-ПБЦА+Пс была ниже, чем в группе Докс (3 5 % и 6 1 %, соответственно). Без учета единственного животного с большой опухолью средняя плотность сосудов в этой группе + KiIsolectin B% клеток, экспрессирующих % клеток, экспрессирующих составляла 0.85 0.28 %; в этом случае различие межу Докс-ПБЦА+Пс и Докс было статистически достоверным (p 0.0005).
Таким образом, данные иммуногистохимического исследования предполагают, что противоопухолевый эффект наносомального доксорубицина в отношении глиобластомы в значительной мерее обусловлен ингибированием роста сосудов в опухоли. Сравнение Рис. 8 и 11 позволяет видеть, что данные патоморфологического и иммуногистохимического исследований коррелировали с данными по выживаемости животных.
1.6. Токсикологическое исследование наносомальной формы доксорубицина. Очевидно, что именно оценка безопасности наносомальных форм позволит окончательно решить вопрос о целесообразности их практического применения, поскольку изменяя биораспределение ЛВ, наночастицы неизбежно влияют и на их токсикологические характеристики.
Первые данные о благоприятном влиянии НЧ на токсические свойства доксорубицина появились еще в 80-е годы, однако систематические исследования с тех пор не проводились. О токсикологических характеристиках НЧ, модифицированными ПАВ, было практически ничего не известно.
Соответственно, целью настоящего исследования являлось изучение токсических свойств наносомальной формы Докс-ПБЦА+Пс. Для получения объективной оценки исследование носило сравнительный характер: во всех экспериментах в качестве контроля использовали стандартную лекарственную форму (субстанцию) Докс. Для выявления роли полисорбата 80 исследовали также токсичность формы Докс-ПБЦА, для выявления роли других ингредиентов - токсичность пустых ПБЦА НЧ (плацебо). Исследование проводили на крысах Wistar.
Прежде всего, следует отметить, что пустые НЧ (плацебо) не обнаружили ни острой и субхронической токсичности. Оценка острой токсичности не выявила существенных различий между наносомальной и стандартной формами доксорубицина. При исследовании субхронической токсичности различия проявились в наибольшей степени при оценке воздействия на сердце и семенники, причем наименее токсичной была наносомальная форма, содержащая полисорбат 80.
Значительное ослабление кардиотоксичности доксорубицина в результате связывания его с НЧ, зафиксированное как функционально, так и морфологически, является наиболее важным наблюдением. При введении наносомальных форм количество и размеры очагов атрофии миокарда существенно уменьшалось, лимфоидные инфильтраты отсутствовали (Рис. 12 и 13). Функциональный тест (ЭКГ) показал, что в группе, получавшей ДоксПБЦА+ПС, частота пульса и интервал QT не отличались от контроля, что свидетельствовало об отсутствии признаков декомпенсации сердечной деятельности.
Рис. 12. Миокард крысы. ДОКС. 30 Рис. 13. Миокард крысы. ДОКС- сутки после курса. Очаги ПБЦА+ПС. 30 сутки после курса.
деструкции кардиомиоцитов, Уменьшение количества и сильный отек, лимфоидные ин- размеров очагов отека и атрофии фильтраты в области атрофии мышечных волокон. Отсутствие мышечных волокон. х 20 лимфоидных инфильтратов. х По кардиотоксическим свойствам формы доксорубицина можно расположить следующим образом: ДОКС>>ДОКС-ПБЦА>ДОКС-ПБЦА+ПС.
Это феномен определенно объясняется изменением биораспределения доксорубицина. Действительно, если расположить формы в порядке убывания концентраций в сердце (Рис. 3), то этот ряд в точности совпадет с приведенным выше.
Важно отметить также значительно менее выраженную тестикулярную токсичность наносомальной формы. Не отмечено также повышения токсичности наносомального доксорубицина в отношении органов ретикулоэндотелиальной системы, а именно печени и селезенки. Более того, токсичность Докс-ПБЦА+Пс в отношении печени даже снизилась по сравнению с Докс.
1.7. Исследование механизмов доставки веществ в мозг с помощью наночастиц 1.7.1. Оценка проницаемости ГЭБ после введения наночастиц. Прежде всего, было важно установить, не является ли проникновение ЛВ в мозг результатом неспецифического повышения проницаемости ГЭБ в результате токсического действия НЧ и/или ПАВ. Следует отметить, что этот механизм сразу казался маловероятным, поскольку ни в одном из многочисленных экспериментов in vivo мы не наблюдали клинических признаков нейротоксичности. С другой стороны, если бы при введении НЧ в кровь барьерные функции ГЭБ действительно нарушались, то в связывании веществ с НЧ не было бы необходимости: при ведении после НЧ эти вещества могли бы проникать через нарушенный ГЭБ в результате простой диффузии.
Для того чтобы проверить эту гипотезу, мы провели эксперимент, позволяющий судить о состоянии ГЭБ после введения покрытых полисорбатом ПБЦА НЧ (ПБЦА НЧ+Пс). В этом эксперименте определяли анальгезирующее действие даларгина, свободного или включенного в ПБЦА НЧ, при различных режимах введения. Даларгин является субстратом опиатных рецепторов, однако не оказывает анальгезирующего действия при в/в введении, поскольку практически не проникает в мозг. Показано, что значительное понижение порога болевой чувствительности достигалось только при введении даларгина, включенного в ПБЦА НЧ+Пс. Анальгезирующее действие даларгина или ПБЦА НЧ, введенных по отдельности или последовательно, было незначительно.
Результаты этого эксперимента позволяют сделать два важных вывода:
1) в/в введение ПБЦА НЧ+Пс, не приводит к повышению проницаемости ГЭБ, достаточному для проникновения через него низкомолекулярных субстратов Pgp; 2) субстраты P-gp проникают в мозг, только будучи связанными с НЧ, покрытыми полисорбатом 80.
Кроме того, целостность ГЭБ при контакте с ПБЦА НЧ была исследована нами в опытах in vitro. В опытах использовали модель ГЭБ, состоящую из совмещенных слоев эндотелиальных клеток капилляров мозга быка и астроцитов крысы. В качестве маркеров проницаемости ГЭБ использовали [3H]-инулин и [14C]-сахарозу. Было показано, что количество этих гидрофильных маркеров, проникающих через ГЭБ, не изменяется после инкубации клеток с НЧ.
1.7.2. Изучение сорбции белков плазмы на поверхности наночастиц.
Согласно современным представлениям, среди факторов, определяющих распределение НЧ в организме при в/в введении, ключевым является профиль белков, адсорбируемых частицами в плазме. В связи с этим мы провели исследование состава белков плазмы, адсорбирующихся на поверхности ПБЦА НЧ, нагруженных Докс и покрытых полисорбатом 80 или полоксамером 188.
НЧ инкубировали в плазме крыс, затем белки отделяли и анализировали методом двухмерного электрофореза в акриламидном геле (2-D PAGE).
Несмотря на различную химическую структуру ПАВ, использованных для модификации, профили белков на поверхности ПБЦА НЧ, нагруженных Докс, обнаружили как количественное, так и качественное сходство (Рис. 14). При этом на поверхности обоих типов частиц в значительном количестве присутствовал ApoA-I (24 % от общего количества).
Химическая структура полоксамера 115 (а = 52, b = 30, MM 8400) Химическая структура полисорбата Докс-ПБЦА+Пс Докс-ПБЦА+P1Рис. 14. Сходство состава белков плазмы крысы, адсорбированных на поверхности ПБЦА наночастиц, нагруженных доксорубицином и модифицированных полисорбатом 80 (Докс-ПБЦА+Пс) и полоксамером 1(Докс-ПБЦА+Р188) (n = 4) Сопоставление этих результатов с данными о противоопухолевом эффекте Докс-ПБЦА+Пс и Докс-ПБЦА+Р188, позволяет предположить, что аполипопротеин ApoA-I играет важную роль во взаимодействии НЧ с эндотелиальными клетками, формирующими ГЭБ. Так возможно, что доставка веществ в мозг осуществляется путем взаимодействия ApoA-I, адсорбированного на поверхности частицы, со скавенджер-рецептором BI (SRBI), экспрессированным на поверхности эндотелиальных клеток. ApoA-I участвует в переносе липидов; при этом ApoA-I связывается с клеточной мембраной посредством SR-BI, который и передает липид клетке. Возможно, что поступление НЧ в эндотелиальные клетки осуществляется по той же схеме:
ApoA-I взаимодействует с рецептором SR-B1, но вместо липида в клетку поступает частица. Позже мы показали, что модификация альбуминовых НЧ ApoA-I позволяет осуществить транспорт этих носителей в мозг, что подтверждает гипотезу об участии этого белка в преодолении ГЭБ.
% Vol I I s I J a n n V I i i I n o t A i m a m p C o a A t m u o A p h o s a b p c p l A o g i t A A A h h G T g g i I l g I Сопоставление данных, полученных при исследовании белков на поверхности НЧ в отсутствие полисорбата, а также пустых и нагруженных Докс частиц показало, что свойства поверхности в значительной степени зависят от всех компонентов системы доставки.
1.8. Радиационная стерилизация наносомальной формы доксорубицина.
Стерилизация лекарственных форм на основе ПБЦА НЧ является сложной задачей, поскольку возможность применения традиционных методов стерилизации, таких как термическая или химическая обработка, а также стерильная фильтрация, ограничена физико-химическими свойствами НЧ.
Принципиальная возможность радиационной стерилизации НЧ была показана нами ранее на примере наносомальной формы ампициллина. Ампициллин после гамма-облучения в дозах до 27,4 кГр не терял антибактериальной активности; также не наблюдалось достоверных различий в кинетике выделения антибиотика из НЧ до и после облучения.
Задачей настоящего исследования являлось определение максимально переносимой и оптимальной стерилизующей доз излучения для наносомальной формы Докс, а также определение влияния ионизирующего излучения на основные ингредиенты формы - Докс и ПБЦА. Облучение проводили двумя способами - гамма-облучением и потоком ускоренных электронов в дозах 10, 15, 25 и 35 кГр.
Микробиологическое исследование показало, что после облучения в дозах 15 кГр и выше все образцы были стерильны независимо от типа излучения. Для определения влияния облучения на свойства лекарственной формы и ее основных ингредиентов - доксорубицина и ПБЦА - в образцах определяли содержание Докс и родственных примесей, размеры НЧ, а также ММР ПБЦА и концентрацию стабильных при комнатной температуре радикалов, оставшихся в образцах НЧ после облучения.
Облучение при максимальной поглощенной дозе 35 кГр не выявило образования побочных продуктов. Содержание Докс в образцах после облучения практически не изменялось. Облучение также не влияло на средний размер НЧ и не вызывало их агломерации независимо от дозы и использованного метода облучения. При дозах до 25 кГр оба типа облучения не оказали существенного влияния на ММР ПБЦА, входящего в состав НЧ.
Таким образом, показана радиационная устойчивость наносомальной формы Докс и установлена оптимальная стерилизующая доза - 15 кГр.
2. РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОСОМАЛЬНЫХ ФОРМ РИФАМПИЦИНА Целесообразность применения наносомальных форм при лечении внутриклеточных инфекций обусловлена эффективным транспортом НЧ в макрофаги. Однако возможность применения наносомальных форм при лечении такого распространенного и опасного заболевания, как туберкулез легких, остается мало изученной проблемой.
В задачи данного этапа исследований входили: разработка наносомальных форм противотуберкулезного антибиотика I ряда рифампицина (Риф); изучение влияния состава наносомальной формы на биораспределение рифампицина;
оценка эффективности наносомальных форм на модели экспериментального туберкулеза и острых инфекций; оптимизация наносомальных форм в соответствии с результатами биологических экспериментов. Так же, как и в случае Докс, возможность использования рифампицина обусловлена установленной нами устойчивостью в условиях образования НЧ и амфифильный характер, предопределяющий возможность сорбции различными наночастицами.
2.1. Влияние технологических параметров на свойства полимерных наночастиц, содержащих рифампицин 2.1.1. Полибутилцианоакрилатные наночастицы. Устойчивая наносуспензия с размером частиц 350 - 450 нм образуется только в диапазоне рН - от 1,5 до 3, при этом наибольшая степень сорбции Риф достигается при рН 2 (Рис. 15). Так же как и в случае Докс, введение мономера в среду, содержащую Риф, приводило к образованию аморфной полимерной массы.
Видимо, Риф, обладая нуклеофильными свойствами, влияет на процесс полимеризации, ускоряя его и приводя к агломерации полимера.
Введение Риф в реакционную среду через 30 мин после начала полимеризации позволяло избежать агломерации и получать пригодные для в/в введения НЧ размером 350 - 450 нм. Следует отметить эффективную сорбцию Риф: при относительно высоком соотношении Риф - полимер (1 : 6) степень сорбции Риф составляла не менее 60% (Рис. 16). Нагрузка Риф на полимер составляла ~ 170-180 мг Риф /г ПБЦА.
600 1400 200 30 0 1,5 2 2,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 рН Концентрация рифампицина, мг/мл Размер Степень сорбции Рис. 15. Влияние рН Рис. 16. Влияние исходной полимеризационной среды на размер концентрации рифампицина на ПБЦА НЧ и степень сорбции степень сорбции (рН 2, n = 3) рифампицина (Сриф = 1 мг/мл).
2.1.2. Полилактидные наночастицы. Полилактидные НЧ получали методом гомогенизации (эмульгирования) под давлением с последующим испарением растворителя. Поскольку как полилактиды, так и Риф хорошо растворимы в дихлорметане или этилацетате, получали простые эмульсии типа масло в воде, Раствор полимера и Риф в дихлорметане или этилацетате прибавляли к водному раствору стабилизатора - поливинилового спирта (ПВС) или человеческого сывороточного альбумина (ЧСА); затем смесь гомогенизировали с помощью высокоскоростного гомогенизатора.
Полученную первичную эмульсию дополнительно гомогенизировали при давлении 400 бар.
2.1.2.1. Влияние структуры полимера на эффективность сорбции рифампицина. Эффективность сорбции Риф полилактидными НЧ может быть обусловлена: 1) образованием водородных связей между гидроксильными группами Риф и карбонильными группами полилактидов; 2) гидрофобным взаимодействием Риф с полимерной матрицей (можно было ожидать более выраженного сродства Риф к НЧ из гомополимеров PLA, поскольку, по сравнению с PLGA, эти полимеры более гидрофобны из-за дополнительных метильных групп (Рис. 17А и Б).
% рифампицина, % Степень сорбции Размер частиц, нм C тепень сорбции рифампицина, PLA PLGA Рис. 17А. Химическая Рис. 17Б. Химическая структура гомополимера структура рифампицина молочной кислоты (PLA) и сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA) Наконец, поскольку молекула Риф представляет собой цвиттер-ион (pKа 1,7 для 4-гидроксигруппы и pKа 7,9 для азота 3-пиперазина), то в растворах с близким к нейтральному значением рН часть азот-содержащих групп протонирована, что может обеспечить дополнительное электростатическое взаимодействие этих групп с концевыми карбоксильными группами полимеров.
Таблица 1. Влияние природы стабилизатора и органического растворителя на эффективность сорбции рифампицина наночастицами полилактидов (полимер : Риф = 20 : 1, в/в) Полимер Орг. Степень ПАВ* (лактид : гликолид) растворитель сорбции**, % нм PLA CH2Cl2 ПВС нм PLA CH2Cl2 ЧСА нм PLA EtOAc ПВС нм PLA EtOAc ЧСА нм PLA-COOH CH2Cl2 ПВС 83 1,1# нм PLA-СООН CH2Cl2 ЧСА нм PLA-СООН EtOAc ПВС нм PLA-СООН EtOAc ЧСА нм PLGA (50 : 50) CH2Cl2 ПВС нм PLGA (50 : 50) CH2Cl2 ЧСА нм PLGA (50 : 50) EtOAc ПВС нм PLGA (50 : 50) EtOAc ЧСА нм PLGA-COOH (50 : 50) CH2Cl2 ПВС 88 0,8# нм PLGA-COOH (50 : 50) CH2Cl2 ЧСА нм PLGA-COOH (50 : 50) EtOAc ПВС нм PLGA-COOH (50 : 50) EtOAc ЧСА * концентрация стабилизатора 0,5%, ** во всех случаях, кроме отмеченных (#), приведены репрезентативные данные из двух серий экспериментов; для (#) приведены средние значения sd (n = 3) В связи с этим для исследования влияния структуры полимера на сорбцию Риф были выбраны следующие полилактиды (Lactelо): высокомолекулярный PLA (вм PLA, 85-160 кДа) и низкомолекулярный PLA (нм PLA, 40 кДа), высокомолекулярный PLGA (вм PLGA, 90-126 кДа) и низкомолекулярный PLGA (нм PLGA, 14 кДа) PLGA, а также полимеры с дополнительными концевыми СООН-группами (PLA-СООН и PLGA-СООН).
Наиболее значимым из исследованных факторов оказалось наличие дополнительных концевых COOH-групп как для гомополимера PLA-COOH, так и для сополимера PLGA-COOH (степень сорбции Риф > 80) (Табл. 1%).
Влияние таких параметров, как гидрофобность и ММ полимеров, оказалось менее выраженным, равно как и влияние органического растворителя и ПАВ.
2.1.2.2. Исследования смеси рифампицина с полилактидами методами ИК-спектроскопии и дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК).
Данные ИК-спектроскопии указывают на то, что и PLA и PLGA эффективно связывают Риф благодаря его взаимодействию с карбонилом в сложноэфирных группах основных цепей полимеров.
D D 1,2,RIF 1,RIF 1,1,1,2 b 1,1,COOH 0,0,RIF 0,b 0,0,4 RIF a a 0,cm-cm-1600 1650 1700 1750 1800 1600 1650 1700 1750 18Рис. 18. ИК-спектры PLA(a) и смеси Рис. 19. ИК-спектры PLA-СООН (a) PLA/RIF (10:1) (b) в области и смеси PLA-СООН/RIF (10:1) (b) в поглощения C=O области поглощения C=O В случае полимеров с концевыми ЦСООН группами это взаимодействие усиливается. Так на ИК-спектрах смеси Риф-PLA-COOH отчетливо видно появление полос от группы ЦСООН в области 1700-1715 см-1; в спектре исходного PLA-COOH эти полосы имеют малую интенсивность (Рис. 19). Повидимому, столь резкое увеличение интенсивности этих полос связано с участием концевых групп ЦСООН в водородном связывании с Риф, в пользу чего свидетельствует также и возрастание интенсивности полос C=O. В то же время в случае PLA никаких изменений в спектре под влиянием Риф не происходит (Рис. 18). Аналогичные данные получены для PLGA (не показано).
Взаимодействие Риф с PLA-COOH было показано также при изучении поведения смеси методом ДСК. Показано, что температура стеклования PLACOOH существенно понижается в присутствии Риф (Риф : полимер = 1:10 в/в), составляя 6С против 44,8С для чистого полимера (Рис. 20). Этот факт свидетельствует об увеличении подвижности макромолекул полимера в присутствии Риф, то есть Риф фактически является пластификатором для полимера. Таким образом, при содержании до 10% Риф образует с полимером гомогенную смесь, при этом пластификация полимера указывает на взаимодействие компонентов.
T g = 44,8oC T g = 6,1oC Рис. 20.
ДСК-спектры PLA-COOH (1) и -1 0 0 -5 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 смеси PLA-COOH / RIF (10:1) (2) T, oC 300 1400 1322110 0 0 2 4 0 2 4 Концентрация рифампицина, мг/мл Концентрация рифампицина, мг/мл Cредний диаметр НЧ Степень сорбции Средний диаметр НЧ Степень сорбции А Б Рис. 21. Влияние концентрации рифампицина на параметры наночастиц на основе низкомолекулярных PLA-СООН (А) и PLGA-COOH (Б) (n = 3) EXO> Средний диаметр НЧ, нм Степень сорбции Риф, % Степень сорбции Риф, % Средний диаметр НЧ, нм 2.1.2.3. Влияние концентрации рифампицина в реакционной смеси на параметры наночастиц. Влияние концентрации Риф в реакционной среде на размеры НЧ и степень сорбции было изучено для PLA-COOH и PLGA-COOH.
Для обоих типов НЧ изменение концентрации Риф в пределах от 1 до 5 мг/мл (Риф : полимер = от 1 : 50 до 1 : 10, в/в) практически не влияло на размер частиц; их средний диаметр составляет 200-250 нм (Рис. 21). В то же время степень сорбции Риф с увеличением его исходной концентрации достоверно уменьшалась, что свидетельствует о насыщении полимерной матрицы антибиотиком при концентрациях выше 1,7 мг/мл (Риф : полимер = 1 : 30, в/в).
В последующих экспериментах использовали НЧ, полученные при соотношении Риф - полимер = 1 : 10 или 1 : 20. Нагрузка Риф на полимер составляла в среднем 70 мг/г ПБЦА и 35 мг/г ПБЦА, соответственно.
2.1.2.4. Исследование кинетики высвобождения рифампицина из наночастиц.
Моделирование профиля выделения ЛВ из НЧ in vitro является неотъемлемой частью исследований по разработке наносомальной формы, поскольку позволяет сравнивать различные лекарственные формы между собой и оптимизировать их в соответствии с конкретной фармакологической задачей. В данной работе изучение кинетики выделения Риф из НЧ позволило выявить влияние типа полимера и химического состава полилактидов на этот процесс.
120 1140 0 1 2 3 0 2 4 6 8 Время, час PLGA PLGA-COOH Время, час PLA PLA-COOH Рис. 22. Кинетика выделения Рис. 23. Кинетика выделения рифампицина из ПБЦА НЧ рифампицина из полилактидных НЧ (Риф : ПБЦА = 1,5 : 10 в/в, n = 3). (Риф : полимер = 1:20 в/в, n=3) Эксперимент проводили в условиях, близких к физиологическим (PBS, рН7,4; 37С), при 25-кратном разбавлении. Поскольку известно, что Риф легко окисляется кислородом воздуха с образованием соответствующего хинона, в среду добавляли 0,1% аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта.
свободный Риф, % % свободного Риф Исследование кинетики ограничивали временным интервалом 0 - 24 часа. В качестве нулевой точки использовали данные, полученные при определении степени сорбции Риф, то есть без дополнительного разбавления суспензии НЧ.
Основное количество Риф выделялось в течение 2 ч; через 4 ч антибиотик полностью переходит в приемный раствор (Рис. 22). Профили выделения Риф из полилактидных НЧ различаются в зависимости от структуры полимера. PLA и PLGA, не имеющие дополнительных карбоксильных групп, под влиянием градиента концентрации при разбавлении суспензии высвобождают Риф практически сразу (Рис. 23). В то же время PLA-СООН и PLGA-СООН, как и ожидалось, позволяют замедлить скорость выделения антибиотика из НЧ. При этом если высвобождение Риф из НЧ на основе PLGA-COOH завершается практически полностью за 2 ч, то в случае PLA-COOH антибиотик выделяется существенно медленнее: через сутки эти НЧ продолжают удерживать около 20% рифампицина. Как и в случае доксорубицина, двухфазный характер выделения Риф предполагает, что антибиотик адсорбирован как на поверхности, так и внутри частицы.
2.2. Влияние состава наносомальной формы рифампицина на его биораспределение. Исследование проводили на мышах линии BALB/c. Все формы вводили в дозе 27 мг/кг. В качестве препарата сравнения использовали лекарственную форму Рифампицин Ферейн для в/в инъекций (Риф).
2.2.1. Внутривенное введение 2.2.1.1. Наносомальная форма на основе ПБЦА наночастиц. Связывание Риф с ПБЦА НЧ (РифЦПБЦА) привело к значительному повышению накопления антибиотика в печени и селезенке: интегральные показатели AUC выросли на 100% и 150%, соответственно (Рис. 25). Влияние наносомальной формы на концентрации антибиотика в плазме и легких было менее выраженным: значения AUC выросли всего на 30% и 13%, соответственно.
2.2.1.2. Наносомальные формы на основе полилактидов. В исследовании использовали наносомальные формы Риф на основе PLGA (75:25), стабилизированные ПВС (Rif-PLGA/PVA) или ЧСА (Rif-PLGA/HSA), а также НЧ из PLA-СООН, стабилизированные ПВС (Rif-PLA-СООН/PVA). Степень сорбции рифампицина в этих образцах составляла 60-70%. Нагрузка на полимер составляла 60-70 мг/г полимера.
НЧ из PLGA также значительно повлияли на биораспределение рифампицина (Табл. 2, Рис. 24-25). По сравнению со стандартным препаратом, интегральный показатель AUC для плазмы вырос, а скорость клиренса упала;
при этом накопление в печени, селезенке и легких возросло. Параметры распределения значительно изменялись в зависимости от используемого полимера PLGA или PLA-COOH и стабилизатора - PVA или HSA.
Концентрации Rif-PLGA/PVA в органах были выше, чем в случае RifPLGA/HSA. К тому же форма Rif-PLGA/PVA также обеспечила двукратное увеличение AUC в легких по сравнению с субстанцией Риф. Распределение НЧ из PLA-COOH/PVA отличалось еще более высоким, по сравнению с PLGA/PVA, накоплением в печени и селезенке, в то время как концентрации в плазме и легких практически не изменились. Этот феномен, вероятно, можно объяснить тем, что НЧ из полимера PLA-COOH/PVA, несущие более отрицательный заряд, быстрее накапливаются в печени, поскольку в большей степени активируют комплемент сыворотки крови. Кроме того, НЧ из PLGACOOH лучше удерживают Риф, что приводит к более эффективному его удерживанию в органах (Рис. 24 и 25).
335302252201151105Плазма Легкие Печень Селезенка Плазма Легкие Печень Селезенка RIF PBCA NP PLGA/HSA PLGA/PVA Риф-PLGA/PVA Риф-PLA-COOH/PVA Риф Рис. 25. Относительные значения Рис. 24. Значения интегральных интегральных показателей (AUC показателей AUC рифампицина в наночастиц/AUC рифампицина) для плазме и органах мышей для различных типов наночастиц наночастиц из PLGA/PVA и PLGA(в/в, 27 мг/кг, n=6).
СООН/PVA (в/в, 27 мг/кг, n = 6).
Итак, при внутривенном введении наносомальная форма оказывает значительное влияние на распределение рифампицина в организме, приводя к повышению его концентраций в плазме и изученных органах; при этом количественные параметры распределения зависят от типа НЧ.
AUC NP/AUC Rif, % AUC, мкг / г ( мл ) х ч Сравнение относительных интегральных показателей наносомальных форм (AUC Риф-НЧ/ AUC Риф) на основе НЧ из полилактидов и ПБЦА показало, что состав наносомальной формы, в частности тип носителя и стабилизатора, значительно влияют, как на способность частиц циркулировать в плазме, так и на их накопление в органах, богатых макрофагами. При этом ПБЦА НЧ в большей степени накапливаются в печени и селезенке; в то же время доставка Риф в легкие с помощью этих частиц менее эффективна. PLGA НЧ, стабилизированные ПВС, повысили накопление Риф в легких в 2 раза, при этом накопление в печени и селезенке было значительно ниже, чем в случае ПБЦА НЧ. Важным наблюдением является совпадение относительных значений AUC плазмы и легких для всех изученных форм, предполагающее, что для достижения более высоких концентраций рифампицина в легких необходимо повысить концентрации НЧ в плазме, а также время их циркуляции.
2.2.2. Оптимизация биораспределения наносомальных форм рифампицина при внутривенном введении. Анализ литературных данных и собственный экспериментальный опыт позволили предположить, что наиболее простым способом оптимизировать биораспределение наносомального рифампицина, то есть повысить его концентрации в плазме и легких, является понижение накопления в печени с помощью ПАВ, обеспечивающих стелс-эффект.
Рис. 26а. Химическая структура Рис. 26б. Химическая структура полоксамера 407 (n = 98, m = 67) полоксамина 908 (n = 119, m = 17) Соответственно, задачей настоящего исследования было изучение возможности повышения легочных концентраций Риф путем модификации поверхности частиц полоксамером-407 (Р407) и полоксамином-908 (Р908) (Рис.
26). В эксперименте использовали следующие наносомальные формы рифампицина: 1) РифЦПБЦА+P407, 2) РифЦПБЦА+P908, 3) Rif-PLA/HSA+Р407.
Модификацию поверхности ПБЦА НЧ проводили путем ресуспендирования лиофилизованных НЧ в 1% водном растворе ПАВ. Для модификации полилактидных НЧ при получении в водную фазу наряду с ЧСА прибавляли 0,% Р407.
Модификация ПБЦА НЧ полоксамером P407 и полоксамином 908 привела к снижению накопления рифампицина в печени и повышению концентрации в плазме и селезенке (Рис. 27). Одновременно выросли и показатели AUC в легких. Влияние ПАВ было несколько более выраженным для РИФ-ПБЦАP407: показатель AUC в плазме вырос на 40%, для легких - на 80%. Поведение НЧ из РLA-COOH, стабилизированных смесью альбумина и Р407, было парадоксальным: они хорошо накапливались в легких показатель AUC на 50% выше, чем для Риф, при этом вырос также показатель AUC в печени (Рис.
41), а AUC в плазме снизился.
445403353022520115105Риф Риф-ПБЦА Риф- РифПБЦА+407 ПБЦА+9РИФ РИФ-ПБЦА РИФ- РИФПБЦА+407 ПБЦА+9Легкие Плазма печень селезенка А Б Рис. 27. Влияние полоксамера 407 и полоксамина 908 на биораспределение наносомальной формы рифампицина на основе ПБЦА: А: AUC рифампицина в печени и селезенке; Б: AUC рифампицина в плазме и легких.
егкие Плазма Селезенка Печень 4303202101Рис. 28. Корреляция между Рис. 29. Соотношение параметров изменениями параметров AUC в AUC в печени и селезенке при в/в легких и плазме при в/в введении введении AUC, g*h/ml AUC, мкг * ч / г ткани AUC, g*h/g AUC, g*h/g(ml) F А A I S V.
R F A H P I A / P / V R S + P A H / H P A / O + G H S A A L O O G H S P O / C L H C / H P A H A O L O L O P O P C C A A L L P P 2.2.3. Пероральное и подкожное введение. Наносомальная форма RifPLGA/PVA влияет на распределение Риф и при пероральном введении. Так применение НЧ позволяет значительно повысить концентрации Риф в легких и селезенке: интегральные показатели площади под фармакокинетической кривой (AUC), найденные для наносомальной формы, на 100% превышали показатели субстанции. При этом концентрации в легких поддерживались на уровне 30-мкг/г в течение 3 ч после введения (лплато), что не отмечалось при в/в введении.
С другой стороны, в сравнении с в/в введением формы Rif-PLGA/PVA, при пероральном введении отмечены более низкие концентрации в плазме крови и печени, что отражает процесс поступления антибиотика из ЖКТ в системный кровоток.
Сравнение биораспределения наносомальной формы при различных способах введения показало, что концентрации Риф в селезенке и легких при подкожном введении Rif-PLGA/PVA достоверно в 2-2,5 раза ниже, чем при пероральном или внутривенном. При этом концентрации в плазме практически одинаковы. По сравнению с пероральным при подкожном введении отмечена тенденция к более медленному снижению концентрации Риф в органах в период наблюдения 3-5 ч, что указывает на пролонгированное всасывание препарата при подкожном введении.
2.3. Активность наносомальной формы рифампицина в отношении внутриклеточных бактерий in vitro. Антибактериальную активность РифПБЦА, изучали в экспериментах in vitro, когда внутри изолированных макрофагов находились фагоцитированные, но сохраняющие жизнеспособность бактерии Mycobacterium avium и Staphylococcus аureus. Показано, что антибактериальная активность РИФ-ПБЦА в отношении микобактерий, локализованных во внутриклеточной среде моноцитов крови человека, превышает активность стандартной лекарственной формы приблизительно в раз.
Антибактериальная активность РИФ-ПБЦА в отношении St. aureus также превышала активность субстанции в течение всего периода наблюдения (Табл.
2). В опыте использовали клинический изолят St. aureus, чувствительный к рифампицину (МПК 1,56 мкг/мл).
Очевидно, высокая активность наносомального рифампицина объясняется эффективным транспортом НЧ в макрофаги: применение НЧ позволило повысить внутриклеточные концентрации в 2,4-3,2 раза (Табл. 3). Кроме того, результаты этого эксперимента позволяют заключить, что: 1) Риф, включенный в НЧ, сохраняет антибактериальную активность, 2) НЧ не ограничивают биодоступность Риф во внутриклеточной среде.
Таблица 2. Влияние различных форм рифампицина на жизнеспособность Staphylococcus аureus, локализованных в легочных макрофагах кролика (n = 6) Колониеобразующие единицы, % от контроля Препарат Время инкубации клеток с препаратом 3 ч 20 ч РИФ-ПБЦА 21 Рифампицин 68 13 18 Таблица 3. Накопление рифампицина в легочных макрофагах кролика (n=8) Коэффициент распределения между Время инкубации, внутриклеточной и внеклеточной средой мин Рифампицин РИФ-ПБЦА 5 3,30 (2,29-4,31) 8,90 (7,40-10,40) 30 3,61 (3,10-4,12) 11,50 (9,70-13,30) 240 4,20 (3,69-4,71) 10,20 (8,10-12,30) 2.4. Оценка эффективности наносомальных форм рифампицина на модели экспериментального туберкулеза у мышей. Как показали описанные выше фармакокинетические исследования, наносомальные формы обеспечивают повышение концентрации рифампицина в печени, легких и селезенке по сравнению со стандартным препаратом. Как известно, при туберкулезе эти органы являются очагами инфекции.
Задача исследования - установить, сопровождается ли повышение концентрации наносомальной формы антибиотика в печени, легких и селезенке повышением антибактериального эффекта.
Исследование проводили на модели экспериментального туберкулеза (M.
tuberculosis) у мышей. Антибактериальный эффект оценивали по количеству микобактерий (число колониеобразующих единиц, КОЕ) в легких, селезенке и печени. Для выявления влияния наносомальной формы во все серии экспериментов включали группу, получавшую стандартную форму рифампицина (Риф). В качестве контроля использовали инфицированных животных, не получавших лечение.
2.4.1. Внутривенное введение. Первую серию экспериментов проводили по следующей схеме: 1-й день эксперимента внутривенное заражение; 2-4 дни эксперимента лечение; 5-й день эвтаназия мышей и высев из легких.
ечение начинали через 24 ч после заражения. В связи с высокой противотуберкулезной активностью рифампицина для выявления различий между лекарственными формами все формы вводили в субтерапевтической дозе - 3 х 5 мг/кг с интервалом 24 ч. В исследовании использовали следующие наносомальные формы рифампицина: Риф-ПБЦА, Риф-ПБЦА+Р407, РифPLGA, Риф-PLGA-COOH.
2.4.1.1. Полибутилцианоакрилатные наночастицы. Как показали результаты этой серии экспериментов, наиболее эффективной оказалась наносомальная форма на основе ПБЦА НЧ, модифицированных Р407 (РифПБЦА+Р407). Число КОЕ в легких мышей, получавших Риф-ПБЦА+Р407, снизилось более чем в 5 раз по сравнению с Риф (Рис. 30).
Немодифицированная наносомальная форма показала промежуточный результат. Та же тенденция наблюдалась и в селезенке, однако в этом случае различия между наносомальными формами были недостоверны.
Lungs 24,25 332216,12,Контроль РИФ РИФ-НЧ Риф-НЧ-407 RIF RIF-NP RIF-NP+P4Рис. 31. Интегральные показатели Рис. 30. Число КОЕ в легких мышей, накопления рифампицина в легких инфицированных M. tuberculosis, мышей после внутривенного через 24 ч после лечения наносомальными формами рифампи- введения наносомальных форм рифампицина на основе ПБЦА цина на основе ПБЦА (в/в, 3 х 5 мг/кг (доза 27 мг/кг, n = 6) в дни 2, 3 и 4 после заражения, n = 3).
Сопоставление данных, полученных в данном исследовании, с данными по биораспределению (Рис. 30 - 33) позволяет видеть, что, стерилизующий эффект различных форм рифампицина коррелирует с их КОЕ x AUC, g/g x h фармакокинетическими параметрами. Во-первых, максимальный стерилизующий эффект достигается при использовании Риф-ПБЦА+Р407 лекарственной формы, обеспечивающей также наивысший показатель AUC в легочной ткани. Во-вторых, выраженность стерилизующего эффекта также коррелировала со значениями максимальных концентраций рифампицина в исследованных органах.
4103251Контроль РИФ РИФ-PBCA РифРиф Риф-PBCA РифPBCA+P4PBCA+Р4Рис. 32. Число КОЕ в селезенке Рис. 33. Интегральные показатели мышей, инфицированных M.
AUC рифампицина в селезенке tuberculosis, через 24 ч после лечения мышей после в/в введения наносомальными формами наносомальных форм рифампицина рифампицина (в/в, 3 х 5 мг/кг, n = 3).
на основе ПБЦА (27 мг/кг, n = 6) Рис. 34. Число КОЕ в органах мышей, инфицированных M.
tuberculosis, после лечения Риф Риф-ПБЦА+ Риф-PLGA Риф-PLGAразличными формами Р407 COOH рифампицина (в/в 3 х 5 мг/кг) Легкие Печень Селезенка В целом, полученные данные свидетельствуют о высокой активности и биодоступности наносомальных форм рифампицина на основе ПБЦА.
КОЕ х AUC, g*h/ml КОЕ х 2.4.1.2. Наночастицы на основе полилактидов. По эффективности полилактидные НЧ не уступали стандартному препарату. Тем не менее, в целом антибактериальный эффект полилактидных НЧ при в/в введении был менее выражен по сравнению с ПБЦА НЧ (Рис. 34). Поскольку параметры биораспределения наносомальных форм схожи, можно предположить, что более низкая эффективность наносомальной формы на основе полилактидных НЧ вызвана значительно более медленной, по сравнению с ПБЦА, скоростью их деградации, что, в свою очередь, обусловливает меньшую биодоступность Риф, заключенного в эти частицы. С другой стороны, не исключено, что эффект полилактидных НЧ мог бы проявиться при более длительных сроках лечения, достаточных для их деградации и полного выделения антибиотика.
2.4.2. Пероральное и подкожное введение. Это предположение подтверждают результаты, полученные при пероральном и подкожном путях введения. При проведении 4-недельного курса лечения (введение 1 раз в неделю) наносомальная форма оказалась значительно более эффективной, чем свободный антибиотик; причем преимущество наносомального рифампицина наблюдалось как при пероральном, так и при подкожном введении (Табл. 4).
При введении препаратов 2 раза в неделю достоверных различий между свободным и наносомальным антибиотиком не было.
Taблица 4. Число КОЕ в органах мышей Balb/c, инфицированных M.
tuberculosis, после лечения различными формами рифампицина: подкожное и пероральное введение Число КОЕ x 1Риф Риф-PLGA/PVA Риф Риф-PLGA/PVA Орган Подкожно Рer os Контроль Режим лечения: 8 x 20 мг/кг, два раза в неделю в течение 4 недель Легкие 50,2 2,8 1,9 1,2 1,1 0,53 0,210,03 0,13 0,Селезенка 2,3 0,92 1,5 0,89 0,83 0,21 0,280,1 0,23 0,Режим лечения: 4 x 20 мг/кг, один раз в неделю в течение 4 недель Легкие 50,2 2,8 39,233,2 5,57 0,56 20,122,0 3,7 2,Селезенка 2,3 0,92 3,073,7 0,49 0,21 0,260,07 0,41 0, Высокий стерилизующий эффект Риф-PLGA, наблюдавшийся в легких при пероральном введении снижение числа КОЕ в 6 - 7 раз по сравнению со стандартным препаратом хорошо коррелирует с данными, полученными при изучении биораспределения этой формы. Концентрации Риф-PLGA/PVA в легких значительно превышали концентрации свободного Риф в течение 15 ч после введения, при этом в течение первых 5 ч концентрации удерживались на высоком уровне до 35 мкг/г; концентрации Риф, напротив, снижались уже через 1 ч.
2.5. Изучение эффективности наносомальной формы рифампицина при лечении острых бактериальных инфекций. Наиболее подходящими для лечения острых инфекций, очевидно, являются ПБЦА НЧ, которые, подвергаясь быстрой внутриклеточной деградации, также быстро выделяют антибиотик.
Эффективность наносомальной формы Риф на основе ПБЦА в отношении острых инфекций ранее не изучалась. Сравнительное изучение эффективности этой формы проводили на моделях стафилококкового сепсиса (St. аureus) и сальмонеллеза (S. typhimurium) у мышей.
Введение стандартной формы Риф в дозе 50 мг/кг и РИФ-ПБЦА в дозе мг/кг обеспечивало излечение 90% и 100% животных, соответственно (Табл. 5).
Снижение доз препаратов рифампицина до 10 мг/кг и РИФ-ПБЦА до 5 мг/кг приводило к излечению 50% животных. Таким образом, при лечении острого стафилококкового сепсиса наносомальная форма повысила эффективность Риф в 2 раза по сравнению со стандартной формой.
Таблица 5. Эффективность различных лекарственных форм рифампицина при лечении экспериментальных инфекций у мышей (n = 10) Суммарная Доза, Кол-во выживших продолжительность Препарат мг/кг животных* жизни, дни Стафилококковый сепсис Контроль - 0/10 50 9/10 Рифампицин 10 5/10 25 10/10 1Риф-ПБЦА 5 5/10 Сальмонеллез Контроль - 0/10 Рифампицин 50 1/10 25 8/10 1Риф-ПБЦА 5 5/10 1* при стафилококковом сепсисе - на 10-е сутки, при сальмонеллезе на 15-е сутки.
Влияние наносомальной формы было еще более значительным при химиотерапии сальмонеллеза. Стандартная лекарственная форма оказалась малоэффективной: даже введение очень высокой дозы - 50 мг/кг - защищала от гибели лишь 10% животных. РИФ-ПБЦА был значительно более эффективен:
введение его в дозах 25 мг/кг и 5 мг/кг привело к выживанию 80% и 50% зараженных животных, соответственно. Таким образом, при сальмонеллезе эффективность наносомальной формы рифампицина более чем в 10 раз превышала эффективность стандартного препарата.
3. РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ СТРЕПТОМИЦИНА Аминогликозидный антибиотик стрептомицин активен в отношении большинства возбудителей опасных инфекционных заболеваний. Среди недостатков, снижающих эффективность стрептомицина при лечении острых инфекций, следует отметить медленное проникновение в клетку.
Задача настоящего исследования - получение наносомальной лекарственной формы стрептомицина на основе ПБЦА НЧ и изучение ее активности на модели септической инфекции.
3.1. Влияние технологических параметров на характеристики наносомальной формы стрептомицина. Для изучения влияния рН на свойства ПБЦА НЧ, содержащих стрептомицин, полимеризацию проводили в интервале рН от 1,4 до 3.
Синтез НЧ в присутствии стрептомицина позволяет достичь ~ 20% (1726%) сорбции стрептомицина; при этом степень сорбции практически не зависела от концентрации антибиотика, соотношения стрептомицин : мономер в диапазоне 1 : 3 - 1 : 10, а также от рН среды. Нагрузка стрептомицина возрастала по мере увеличения его исходной концентрации от 0,5 до 3 мг/мл;
при этом значение рН практически не влияла на характер этой зависимости. В исследованном диапазоне концентраций стрептомицина насыщения полимерной матрицы не наблюдали. При снижении рН среды с 3 до 1.происходило укрупнение НЧ с 250 нм до 570 нм.
Невысокие значения степени сорбции стрептомицина по сравнению с рифампицином и доксорубицином, очевидно, объясняются его более высокой гидрофильностью по сравнению с этими антибиотиками.
3.2. Оценка эффективности наносомальной формы стрептомицина на модели острой септической инфекции. Эффективность наносомальной формы стрептомицина исследовали на модели острой септической инфекции, вызванной внутрибрюшинным введением вирулентного штамма Е. coli 0157.
Применение наносомальной формы стрептомицина привело к значительному повышению его эффективности при лечении септической инфекции по сравнению со стандартным препаратом (Рис. 35). Введение наносомальной формы в дозе 25 мг/кг через 4 ч после заражения обеспечило выживание 50% животных (5/10), в то время как в группе, получавшей стандартную лекарственную форму, выжило лишь 20% животных (2/10). В группе животных, получивших эквивалентную дозу пустых НЧ (плацебо), выживаемость не отличалась от контрольной группы (на рисунке не показано).
1Конт роль СТР 1СТР-ПБЦА Рис. 35. Выживаемость мышей, инфицированных E. coli, после лечения различными формами стрептомицина 0 5 10 (1 x 25 мг/кг внутрибрюшинно) Дни после зараж ения (n = 10) Полученные данные подтверждают концепцию о возможности повышения эффективности антибактериальной химиотерапии с помощью наносомальных препаратов. Действительно, значительное преимущество наносомального стрептомицина в данном эксперименте получено при содержании в наносомальной форме лишь 20% связанного антибиотика.
4. РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ МОКСИФЛОКСАЦИНА Моксифлоксацин (Мокс), фторхинолоновый антибиотик с высокой активностью в отношении M. tuberculosis, обладает весьма благоприятными биологическими свойствами; биодоступность его достигает 86-92%, при этом Мокс эффективно проникает в клетки: равновесная внутриклеточная концентрация превышает экстраклеточную в 4 - 10 раз.
Ставя своей целью разработать и изучить наносомальную форму этого антибиотика, мы полагали, что в совокупности с описанными выше % выживших животных результатами полученные данные помогут точнее определить влияние наночастиц на эффективность ЛВ с различной биодоступностью.
В задачи данного исследования входили: 1) разработка наносомальной формы Мокс на основе ПБЦА, 2) оценка активности наносомальной формы в отношении микобактерий, локализованных в макрофагах in vitro, 3) исследование активности наносомальной формы на модели экспериментального туберкулеза in vivo.
4.1. Влияние технологических параметров на характеристики наносомальной формы моксифлоксацина. ПБЦА НЧ получали методом анионной полимеризации в водной среде в присутствии Мокс, как описано выше. С целью оптимизации процесса получения наносомальной формы было изучено влияние рН полимеризационной среды и концентрации Мокс на степень сорбции и размер частиц.
100 43240 Рис. 36. Зависимость степени 100 сорбции моксифлоксацина и размера наночастиц от рН 0 0 Мокс =1мг / мл с 1 2 3 4 исх (, СПБЦА = 1%;
рН n = 3; Р = 0,95) степень сорбции средний размер НЧ 4.1.1. Выбор рН реакционной среды. Результаты изучения влияния рН полимеризационной среды на степень сорбции Мокс и размеры НЧ представлены на Рис. 36. Максимальная степень сорбции достигается при рН2.
В интервале рН 1,5 - 2,5 образуются близкие по размеру НЧ (350 - 400 нм). При рН 3 размер НЧ уменьшается до ~250 нм.
4.1.2. Выбор концентрации моксифлоксацина. Влияние исходной концентрации Мокс на эффективность сорбции и размер НЧ изучали в диапазоне 0,25Ц2 мг/мл при рН2. Степень сорбции возрастает с уменьшением концентрации Мокс, достигая максимального значения при концентрации 0,мг/мл. При этом независимо от исходной концентрации Мокс, получают НЧ приблизительного одного размера (350 - 400 нм) (Рис. 37). Максимальная C тепень сорбции, % Средний размер частиц, нм сорбция достигается в интервале концентраций 0,25 - 0,5 мг/мл, однако нагрузка на полимер при концентрациях <1 мг/мл невысока (Рис. 38).
Таким образом, оптимальные параметры лекарственной формы (степень сорбции ~45% и нагрузка 50 мкг Мокс/мг ПБЦА) достигаются при концентрации Мокс в полимеризационной среде 1 мг/мл.
100 500 80 80 460 340 220 10 0 0 1 2 0 1 2 Концентрация Мокс, мг/мл Концентрация Мокс, мг/мл Рис. 37. Влияние концентрации Мокс Рис. 38. Зависимость сорбции и на степень сорбции и размеры НЧ нагрузки Мокс на полимер от его (рН2; СПБЦА=1%; n = 3; р = 0,95) концентрации (рН2; СПБЦА = 1%) 1Рис. 39. Кинетика высвобождения 0 10 20 30 40 моксифлоксацина из наночастиц Время, ч (n = 3; p = 0,95) Мокс Мокс-НЧ 4.1.3. Исследование кинетики выделения моксифлоксацина из наночастиц.
Как видно из Рис. 39, около 55 % Мокс оказывается в водной фазе практически сразу после разбавления наносуспензии. Очевидно, в первые минуты опыта в водную фазу переходит несвязанный с НЧ Мокс, содержание котрого в наносомальной форме и составляет ~ 55%. В течение первых суток скорость ПБЦА Степень сорбции, % Степень сорбции, % Нагрузка, мкг Мокс на мг Средний размер частиц, нм % свободного Мокс выделения Мокс составила 37 мкг/сутки, в течение последующих суток - мкг/сутки. При этом через 48 ч в НЧ остается около 26% Мокс.
4.2. Исследование наносомальной формы моксифлоксацина на культуре макрофагов THP-1. В первой серии экспериментов было показано, что связывание Мокс с НЧ значительно увеличивает его поступление в макрофаги (THP-1). В то время как концентрация свободного Мокс достигла максимального значения 125 мкг/мл через 5 мин, наносомальный Мокс продолжал накапливаться в клетках в течение часа, при этом его концентрация достигла 325 мкг/мл. Примечательно также, что наносомальный Мокс значительно дольше удерживался в клетках.
На следующем этапе оценивали активность наносомального Мокс в отношении M. tuberculosis, локализованных в макрофагах THP-1.
Инфицированные макрофаги подвергали периодическому воздействию антибиотика. Как видно из Рис. 40, наносомальный Мокс проявил более высокую активность, чем свободный антибиотик, что коррелирует с более эффективным накоплением наночастиц в клетках.
Рис. 40. Активность наносомального моксифлоксацина (Mox-NP) в отношении внутриклеточных M.
tuberculosis.
Периодическое воздействие на макрофаги: зависимость величины бактерицидного эффекта от:
а) времени воздействия;
b) концентрации моксифлоксацина в среде (n = 3, р < 0.05 [*]) 4.3. Эффективность наносомального моксифлоксацина при лечении экспериментального туберкулеза у мышей. Как видно из Рис. 41, число КОЕ в легких мышей, леченных наносомальным Мокс, уменьшилось в 2,2 раза по сравнению со стандартной лекарственной формой. Этот результат коррелирует с повышенной активностью Мокс-ПБЦА в отношении M. tuberculosis, найденной в опытах in vitro.
Рис. 41. Число колониеобразующих единиц (КОЕ) в легких мышей, 1,инфицированных M. tuberculosis, после лечения стандартной (Мокс) и наносомальной (Мокс-НЧ) формами моксифлоксацина.
0,Режим лечения: в/в, 3 х 10 мг/кг в дни 4, 5 и 6 после заражения (n = 10; р = 0,95).
Контроль Мокс Мокс-НЧ Заключение. Полученные результаты уточняют наши представления о сфере применения наночастиц как носителей ЛВ, а также свидетельствуют о высокой практической ценности этой технологии.
Так на примере доксорубицина показано, что способность наночастиц преодолевать ГЭБ не только позволяет расширить спектр действия этого известного препарата, но и открывает новые возможности для неинвазивной химиотерапии опухолей мозга. Впоследствии мы показали, что ПБЦА НЧ, модифицированные полисорбатом, доставляют в мозг не только низкомолекулярные вещества, но и белки, такие как, например, фактор роста нервов, что предполагает возможность применения этой технологии для лечения нейродегенеративных заболеваний.
Успех будущей наносомальной лекарственной формы зависит от множества факторов, наиболее важными из которых являются правильная постановка фармакологической задачи и выбор лекарственной субстанции.
Последний, в свою очередь, определяется свойствами субстанции, как биологическими (особенности распределения в организме, фармакокинетические параметры, способность проникать в орган-мишень, клетки и пр.), так и технологическими (устойчивость в условиях образования наночастиц, достаточная растворимость, способность к сорбции и пр.). Важную роль играет также выбор носителя.
Основой рационального дизайна наносомальных форм является показанная нами корреляция фармакокинетических и фармакодинамических параметров включенных в наночастицы лекарственных веществ, свидетельствующая также КОЕ х 10*о том, что наночастицы не ограничивают биодоступность этих веществ. Так на примере доксорубицина и рифампицина хорошо видно, что, изменяя состав наночастиц, можно в значительной степени контролировать/оптимизировать биораспределение и эффективность наносомальных форм. Действительно, наносомальная форма позволяет повысить эффективность рифампицина при лечении туберкулеза путем оптимизации его биораспределения и повышения концентрации в легких, печени и селезенке. При этом обнаружена корреляция между концентрацией антибиотика в легких и антибактериальным эффектом.
Примечательно, что наносомальная форма обеспечивает двукратное повышение эффективности антибактериальных антибиотиков при лечении экспериментального туберкулеза и в том случае, когда эти антибиотики, как рифампицин и моксифлоксацин, быстро и хорошо проникают в клетки.
Данные, полученные при оценке эффективности наносомальных форм рифампицина на моделях септических инфекций и сальмонеллеза, также свидетельствуют об эффективности химиотерапии острых инфекций с помощью наносомальных препаратов.
ВЫВОДЫ 1. Разработана технология получения наносомальной формы доксорубицина на основе ПБЦА НЧ. Изучено влияние условий полимеризации на свойства НЧ.
2. ПБЦА НЧ, модифицированные полисорбатом 80, являются эффективным средством доставки доксорубицина в мозг при внутривенном введении. НЧ доставляют в мозг ~1% дозы введенной дозы, то есть проникают в мозг так, как если бы он не был защищен ГЭБ.
3. Наносомальная форма доксорубицина оказывает выраженное противоопухолевое действие на интракраниальную глиобластому у крыс, тогда как его стандартная лекарственная форма малоэффективна. Выявлено влияние состава наносомальной формы на фармакологический эффект.
3. Модификация ПБЦА НЧ полоксамером 188 позволяет при внутривенном введении доставить в мозг терапевтически эффективные концентрации ЛВ, поступление которых в мозг ограничивается ГЭБ.
4. Найденная корреляция между профилями сорбции белков и фармакологическим эффектом наносомальных форм доксорубицина предполагает, что проникновение в мозг ПБЦА НЧ, модифицированных полоксамером 188 или полисорбатом 80, происходит при участии аполипопротеина А-I, который эти частицы адсорбируют при введении в кровь.
5. Показано, что наносомальная форма доксорубицина на основе ПБЦА НЧ обладает радиационной устойчивостью, то есть может быть стерилизована радиационными методами. Определена стерилизующая доза 15 кГр.
6. Разработана технология получения наносомальных форм рифампицина на основе наночастиц ПБЦА и полилактидов. Кинетика выделения рифампицина из наночастиц зависит от структуры полимера.
7. Показано, что легкие не накапливают изученные НЧ с рифампицином. При этом концентрации наносомальных форм в легких зависят от градиента концентраций между кровью и легкими.
8. Модификация ПБЦА НЧ полоксамером 407 приводит к повышению концентрации связанного с НЧ рифампицина в легких. Показано, что влияние полоксамера 407 на распределение НЧ зависит от структуры полимера.
9. Включение рифампицина и моксифлоксацина в НЧ приводит к повышению их эффективности при лечении экспериментального туберкулеза по сравнению со стандартными лекарственными формами 10. Включение рифампицина и стрептомицина в НЧ приводит к повышению их эффективности при лечении острых бактериальных инфекций по сравнению со стандартными лекарственными формами.
11. Включение в ПБЦА НЧ нерастворимых в воде субстанций позволяет значительно повысить их содержание в водной фазе.
12. Использование исключительно фармацевтических ингредиентов, мягкие условия получения, позволяющие сохранять структуру биологически активных веществ, емкость, стабильность и возможность стерилизации предопределяют технологичность лекарственных форм на основе полибутилцианоакрилатных и полилактидных наночастиц.
Автор выражает искреннюю признательность проф. Й. Кройтеру (Университет им. Гёте, Франкфурт/Майн, Германия) и проф. Л.Б. Хейфецу (Еврейский медицинский исследовательский центр, Денвер, США), оказавшим неоценимую поддержку при выполнении работы и получении грантов INTAS, DFG и BII, благодаря которым работу удалось успешно завершить.
Автор сердечно благодарит к.б.н. А.С. Халанского, к.х.н. О.М.
Максименко, к.б.н. И.И. Любимова, д.м.н. Э.Р. Переверзеву, к.м.н. И.Д.
Трещалина и А.П. Будько за высокопрофессиональное содействие в процессе выполнения работы и ценные советы при ее написании.
Публикации по теме диссертации 1. Парамонов Д.В., Антонова Е.А., Жарова Н.Г., Гельперина С.Э., Столбова Г.А., Васин В.Б., Васильев А.Е., Трофимов В.И. О радиационной устойчивости лекарственной формы ампициллина на основе полиалкилцианоакрилатных наночастиц. //Хим.-фарм. ж. - 1996. - Т.30. - С.42-45.
2. Gulyaev A.E., Gelperina S.E., Skidan I.N., Antropov A.S., Kivman G.Ya., Kreuter J.
Significant transport of doxorubicin into the brain with Ps 80-coated nanoparticles.
//Pharm. Res. - 1999. - V.16. - P.1564Ц1569.
3. Гельперина С.Э., Гуляев А.Е., Иванов А.А., Пальцев М.А., Северин Е.С., Северин С.Е., Скидан И.Н. Композиция для лечения легочных инфекций. Патент РФ № 2185818, приоритет от 10.07.204. Скидан И.Н., Бобрускин А.И., Гуляев А.Е., Шалхарбаева С.Д., Северин С.Е., Штайнигер С., Кройтер Й., Гельперина С.Э. Оптимизация фармакокинетики препарата Фотосенс с помощью биодеградируемых наночастиц. //Антибиотики и химиотерапия. - 2001. - T.46, №4. - С. 6-10.
5. Gelperina S., Khalansky A.S, Skidan I.N., Smirnova Z.S., Bobruskin A.I., Severin S.E., Turowski B., Zanella F.E., Kreuter J. Toxicological studies of doxorubicin bound to polysorbate 80-coated poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles in healthy rats and rats with intracranial glioblastoma. //Toxicol. Lett. - 2002. - V.126, No 2. - P.131-141.
6. Скидан И., Гельперина С., Северин С., Гуляев A. Повышение антибактериальной активности рифампицина в отношении внутриклеточных инфекций с помощью биодеградируемых наночастиц. // Антибиотики и химиотерапия - 2003. - Т.48, №1. - С.23-26.
7. Kreuter J., Ramge P., Petrov V., Hamm S., Gelperina S., Engelhardt B., Alyautdin R., von Briesen H., Begley D.J. Direct evidence that polysorbate-80-coated poly(butylcyanoacrylate) nanoparticles deliver drugs to the CNS via specific mechanisms requiring prior binding of drug to the nanoparticles. //Pharm. Res. - 2003. - V.20, No3. - P.409-416.
8. Гельперина С.Э., Смирнова З.С., Халанский А.С.,. Скидан И.Н, Северин С.Е., Кройтер Й. Исследование наносомальной лекарственной формы доксорубицина. // Рос. биотерапевт. ж. - 2004. - Т.3. - С. 56-9. Гельперина С.Э., Оганесян Е.А., Свешников П.Г., Северин Е.С., Хейфец Л.Б.
Применение наносомальных лекарственных форм для лечения внутриклеточных инфекций. //Ремедиум. - 2004. - Т.12. - С.43-10. Steiniger S., Kreuter J., Khalansky A., Skidan I., Bobruskin A., Smirnova Z., Severin S., Uhl R., Kock M., Geiger K., Gelperina S. Chemotherapy of glioblastoma in rats using doxorubicin-loaded nanoparticles.//Int. J. Cancer. - 2004. - V.109.- P.159-167.
11. Ванчугова Л.В., Максименко О.О., Шипуло Е.В., Любимов И.И., Стукалов Ю.В., Свешников П.Г., Бикетов С.Ф., Хейфец Л.Б., Гельперина С.Э. Разработка наносомальной формы стрептомицина и изучение ее активности на модели септической инфекции мышей. //Антибиотики и химиотерапия. - 2005.- Т.50. - С.
13-19.
12. Оганесян Е.А., Будько А.П., Максименко О.О., Стукалов Ю.В., Любимов И.И., Бикетов С.Ф., Свешников П.Г., Хейфец Л.Б., Гельперина С.Э. Разработка и изучение наносомальной лекарственной формы рифампицина. //Антибиотики и химиотерапия. - 2005. - Т.50.- С.15-19.
13. Gelperina S., Kisich K., Iseman M.D., Heifets L. The potential advantages of nanoparticle drug delivery systems in chemotherapy of tuberculosis. Am. J. Respir. Crit.
Care Med. //2005. - V.172, No12. - P.1487-1490.
14. Gelperina S. Brain delivery by nanoparticles. In: Nanoparticle Technology for Drug Delivery. Ed. Gupta R, Kompella U: Taylor & Francis, NY, US, 2006, 273-318.
15. Басел А.А., Петров В.Е., Балабаньян В.Ю., Гельперина С.Э., Трофимов С.С., Воронина Т.А., Аляутдин Р.Н. Транспорт прозерина в головной мозг при помощи поли(бутил)цианоакрилатных наночастиц, покрытых полисорбатом. //Рос. мед. ж.
Ц 2006. - Т.4. - С.28-32.
16. Северин Е.С., Свешников П.Г., Гельперина С.Э., Максименко О.О., Шипуло Е.В., Ванчугова Л.В. Антибактериальное средство для лечения внутриклеточных инфекций. Патент РФ № 2308970, приоритет от 10.03.2017. Ambruosi A., Khalansky A.S., Yamamoto H., Gelperina S.E., Begley D.J., Kreuter J.
Biodistribution of polysorbate 80-coated doxorubicin-loaded [14C]-poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles after intravenous administration to glioblastoma-bearing rats. //J. Drug Target. - 2006. - V.14, No2. - P.97-105.
18. Gelperina S. Nanocarriers and drug delivery. In: Regional Cancer Chemotherapy.
Eds. Schlag P.M., Stein U. Humana Press, USA, 2007, 163-180.
19. Kisich K.O., Gelperina S., Higgins M.P., Wilson S., Shipulo E., Oganesyan E., Heifets L. Encapsulation of moxifloxacin within poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles enhances efficacy against intracellular Mycobacterium tuberculosis. //Int. J. Pharm. - 2007. - V.345, No 1-2. - P.154-162.
20. Kreuter J., Hekmatara T., Dreis S., Vogel T., Gelperina S., Langer K. Covalent attachment of apolipoprotein A-I and apolipoprotein B-100 to albumin nanoparticles enables drug transport into the brain.//J. Control. Release. - 2007. V.118, No1 - P.54-58.
21. Petri B., Bootz A., Khalansky A., Hekmatara T., Mller R., Uhl R., Kreuter J., Gelperina S. Chemotherapy of brain tumour using doxorubicin bound to surfactantcoated poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles: revisiting the role of surfactants. //J.
Control. Release. - 2007. - V.117, No 1. - P.51-58.
22. Pereverzeva E., Treschalin I., Bodyagin D., Maksimenko O., Langer K., Dreis S., Asmussen B., Kreuter J., Gelperina S. Influence of the formulation on the tolerance profile of nanoparticle-bound doxorubicin in healthy rats: focus on cardio- and testicular toxicity. //Int. J. Pharm. - 2007. - V.337, No1-2. - P.346-356.
23. Kreuter J., Gelperina S. Use of nanoparticles for cerebral cancer. //Tumori. - 2008. - V.94, No2. - P.271-277.
24. Maksimenko O., Pavlov E., Toushov E., Molin A., Stukalov Y., Prudskova T., Feldman V., Kreuter J., Gelperina S. Radiation sterilisation of doxorubicin bound to poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles. //Int. J. Pharm. - 2008. - V.356.- 325-332.
25. Pereverzeva E., Treschalin I., Bodyagin D., Maksimenko O., Kreuter J., Gelperina S.
Intravenous tolerance of a nanoparticle-based formulation of doxorubicin in healthy rats.
//Toxicol. Lett. - 2008. - V.178, No1. - P. 9-19.
26. Максименко О.О., Павлов Е.П., Тушов Э.Г., Молин А.А., Стукалов Ю.В., Прудскова Т.Н., Кройтер Й., Гельперина С.Э. Радиационная стерилизация лекарственной формы доксорубицина на основе полибутилцианоакрилатных наночастиц. //Хим.-фарм. ж. - 2008. - Т. 6. - С.52-56.
27. Трещалин И.Д., Переверзева Э.Р., Бодягин Д.А., Трещалин М.И., Максименко О.О., Кройтер Й., Гельперина С.Э. Сравнительное экспериментальное токсикологическое исследование доксорубицина и его наносомальных лекарственных форм. //Рос. биотерапевт. ж. - 2008. - Т. 7. №3. С. 24 - 33.
28. Шипуло Е.В., Любимов И.И., Максименко О.О., Ванчугова Л.В., Оганесян Е.А., Свешников П.Г., Бикетов С.Ф., Северин Е.С., Хейфец Л.Б., Гельперина С.Э.
Получение и исследование наносомальной формы моксифлоксацина на основе полибутилцианоакрилата. //Хим.-фарм. ж. - 2008. - Т.42. - С.43-47.
29. Hekmatara T., Gelperina S., Vogel V., Yang ShЦR., Kreuter J. Encapsulation of water-insoluble drugs in poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles. J. Nanosci.
Nanotechnol. //2009. - V.9. - P.5091-5098.
30. Гельперина С.Э., Швец В.И. Системы доставки лекарственных веществ на основе полимерных наночастиц. //Биотехнология. - 2009. - Т.3. - С. 8-31. Hekmatara T., Bernreuther C., Khalansky A., Theisen A., Weissenberger J., Matschke J., Gelperina S., Kreuter J., Glatzel M. Efficient systemic therapy of rat glioblastoma by nanoparticle-bound doxorubicin is due to antiangiogenic effects. // Clin.
Neuropathol. - 2009. - V.28. - P.153-164.
32. Wohlfart S., Bernreuther C., Khalansky A.S., Theisen A., Weissenberger J., Gelperina S., Glatzel M., Kreuter J. Increased numbers of injections of doxorubicin bound to nanoparticles lead to enhanced efficacy against rat glioblastoma 101/8. // J Nanoneuroscience. - 2009. - V.1. - P.1Ц8.
33. Гельперина С.Э., Максименко О.О., Ванчугова Л.В., Шипуло Е.В., Шандрюк Г.А., Бондаренко Г.Н., Швец В.И. Влияние технологических параметров на физико-химические свойства полилактидных наночастиц, содержащих рифампицин. //Хим.-фарм. ж. в печати
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии