Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине  

На правах рукописи

 

Колик  Лариса  Геннадьевна

РАЗРАБОТКА ОРИГИНАЛЬНОГО АНКСИОЛИТИКА С АНТИАЛКОГОЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ НА ОСНОВЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ХОЛЕЦИСТОКИНИНА

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации  на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Науч-но-исследовательском институте фармакологии имени В.В.Закусова Российской академии медицинских наук (ФГБУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН)

Научные консультанты:

доктор медицинских наук,

профессор, академик РАН и РАМН                        Середенин Сергей Борисович

доктор биологических наук,

профессор, член-корр. РАМН                                Гудашева Татьяна Александровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор, член-корр. РАМН,

зав. кафедрой молекулярной фармакологии

и радиобиологии им. академика П.В. Сергеева

ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И.Пирогова

Минздравсоцразвития России                                Шимановский Николай Львович

доктор медицинских наук,

профессор, зав. кафедрой

клинической фармакологи

и доказательной медицины

СПбГМУ  имени акад.. И.П.Павлова

Минздравсоцразвития России                                Звартау Эдвин Эдуардович

доктор биологических наук,

профессор, главный научный сотрудник

аборатории психофармакологии ФГБУ НИИ

фармакологии имени В.В.Закусова РАМН                Островская Рита Ушеровна

Ведущая организация: 

ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России

Защита состоится  л ____ _____________  2012 года  в _____ часов на заседании диссертационного совета Д.001.024.01, созданного на базе ФГБУ НИИ фармаколо-гии имени  В.В. Закусова РАМН по  адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ФГБУ НИИ фармакологии имени В.В.Закусова РАМН по адресу: 125315, Россия, г. Москва, ул. Балтийская,  8.

Автореферат разослан  л  2012  г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

профессор                                                       Вальдман Елена Артуровна

ОБЩАЯ  ХАРАКТЕРИСТИКА  РАБОТЫ

Актуальность.  Согласно эпидемиологическим данным, тревожными расстройствами страдает от 7,9% до 14,5% населения (Lepine, 2002; Alonso, et al., 2007; Fullana, et al., 2010; Lenze, et al., 2011).  Значительно возрастает потребление алкоголя, одним из негативных действий которого является увеличение тревожности, что рассматривается в качестве элемента порочного круга, усиливающего алкоголизацию (Kiefer, et al., 2002; Breese, et al., 2005).

Патогенетические механизмы тревожных расстройств чрезвычайно гетерогенны. Сходный фенотип тревоги и страха может быть обусловлен изменениями в функционировании многочисленных нейрохимических систем ЦНС (Середенин С.Б., 2002, 2003; Morilak, et al., 2005; Adell, 2010; Sztainberg, et al., 2010; Tasan, et al., 2011; Riaza Bermudo-Soriano, et al., 2012), поэтому для лечения тревожных расстройств применяются препараты разных групп, транквилизаторы, антидепрессанты, психостимуляторы, ноотропы, природные адаптогены. При установленной эффективности каждая группа имеет определенные недостатки. Так, например, распространенные в 70-80-х гг. прошлого века и не утратившие значения до настоящего времени бензодиазепиновые транквилизаторы, наряду с анксиолитическим, обладают нежелательными гипноседативным и миорелаксирующим эффектами, нарушают когнитивные функции, вызывают зависимость и синдром отмены  (Ashton, 1994; Paterniti, et al., 2002; Landi, et al., 2005; Allison, et al., 2006; Licata, et al., 2008). Бензодиазепины купируют состояние тревоги при алкогольной абстиненции, но вызывают перекрестную зависимость, что резко ограничивает их использование по данному показанию (Myrick, et al., 2005; Leggio, et al., 2008; Caputo, et al., 2010; Bosshart, 2011). Доказано, что эффекты бензодиазепинов проявляются индивидуально и зависят от типа реакции на эмоционально-стрессовое воздействие (Середенин, С.Б. и соавт.,1979; Griebel, et al., 2000; do-Rego, et al., 2006). 

Поэтому поиск анксиолитиков с новыми механизмами действия является актуальной проблемой психофармакологии, поскольку их создание позволит расширить арсенал психотропных средств и индивидуализировать фармакотерапию тревожных расстройств с учетом особенностей патогенеза заболеваний (Воронина Т.А. и Середенин С.Б., 2002; Середенин С.Б., 2003). Для лечения расстройств, вызванных алкоголем, важной представляется разработка препарата, не взаимодействующего непосредственно с ГАМКА-рецептором, что позволит избежать перекрестной зависимости. В данном аспекте перспективной является фармакологическая регуляция холецистокининовой системы, играющей важную роль в анксиогенезе (Rotzinger, et al., 2010).

Нейропептид холецистокинин (ХЦК) в организме представлен рядом биологически активных форм (Rehfeld, 1986), происходящих от молекулы предшественника препро-ХЦК  (Deschenes, и др., 1984). ХЦК взаимодействует с ХЦК1- и ХЦК2-рецепторами, участвуя в регуляции многих поведенческих актов, включая тревогу и беспокойство (van Megen, et al., 1996), боль (Hebb, et al., 2005; Yoshinaga, et al., 2010), память (Daug, et al., 1998; Schneider, et al., 2009), депрессию (Derrien, et al., 1994) и зависимость от психоактивных веществ (Vaccarino, 1994; Alttoa, et al., 2004), а также насыщение (Fink, et al., 1998) и терморегуляцию (Szelenyi, 2001). Преобладающие в ЦНС ХЦК2-рецепторы в основном экспрессируются в лимбической системе (Hill, et al., 1987), вовлеченной в реализацию эмоциональных реакций (LeDoux, 2003; Damsa, et al., 2009). Активация ХЦК2-рецепторов вызывает анксиогенез и панические состояния, в то время как блокада ХЦК2-рецепторов - анксиолитический эффект (Daug, et al., 1998; Abelson, et al., 1999; Wang, et al., 2005). Минимальной последовательностью ХЦК, взаимодействующей с высокой аффинностью с ХЦК-рецепторами, является тетрапептид холецистокинина (ХЦК-4). Установлено, что ХЦК-4 имитирует свойства агониста ХЦК2-рецепторов, индуцируя тревожные состояния (Bradwejn, et al., 1994; Shlik, et al., 1997; Bertoglio, et al., 2005). Эти результаты определили задачу создания пригодного с позиций фармакокинетики соединения дипептидной структуры, химический дизайн которого позволяет прогнозировать взаимодействие с ХЦК-рецепторами и антагонистическое по отношению к ХЦК-4 фармакологическое действие.

В ФГБУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН  в отделе химии под руководством члена-корреспондента РАМН, д.б.н., проф. Т.А.Гудашевой выполнены работы, в процессе которых с использованием топохимического принципа конструирования новых соединений Шемякина-Овчинникова-Иванова (Shemyakin, et al., 1969), синтезирован ряд дипептидов на основе ХЦК-4. Осуществлен виртуальный переход от природного тетрапептида L-Trp-L-Met-L-Asp-L-Phe-NH2 к его ретро-аналогу L-Phe-L-Asp-L-Met-L-Trp-NH2. В результате дальнейших химических модификаций получены трипептоидные аналоги ХЦК-4 с общей формулой Ph(CH2)nC(O)-NH(CH2)mC(O)-L-Trp-NH2. Синтезированные соединения явились предметом фармакологического изучения в настоящей работе.

Цель работы. Создание фармакологического препарата с анксиолитическими и антиалкогольными свойствами на основе структуры тетрапептида холецистокинина.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи.

1. Исследовать структурно-функциональную зависимость в ряду вновь синтезированных аналогов тетрапептида холецистокинина с использованием стандартных методов оценки анксиолитических средств, отобрать наиболее перспективное соединение для углубленного психофармакологического анализа.
2. Выявить механизм действия отобранного соединения.
3. Оценить его фармакологическую активность в зависимости от фенотипа эмоционально-стрессовой реакции в сравнении с известными анксиолитиками.
4. Изучить  влияние соединения в условиях моделирования синдрома отмены психоактивных веществ.
5. Определить  спектр фармакологической активности  вещества  на основе  данных о его рецепторных взаимодействиях.
6. Провести анализ  возможных побочных эффектов отобранного соединения при однократном и длительном введении.
7. Выполнить работы по доклинической оценке безопасности рассматриваемого соединения.

Научная новизна. На основе анализа зависимости химическая структура-эффект установлена фармакологическая активность триптофан-содержащего дипептидного аналога ХЦК-4 Ph(CH2)5CO-Gly-L-Trp-NH2 (соединения ГБ-115), в спектре которой проявляются анксиолитические, антиалкогольные, антидепрессивные и анальгетические свойства. Установлено, что при функциональном взаимодействии  ГБ-115 проявляет эффекты антагониста тетрапептида ХЦК-4. Выявлены лигандные свойства ГБ-115 по отношению к ХЦК1-рецепторам, каппа-опиоидным и бомбезиновым рецепторам 3-го типа (bb3). Показано, что ГБ-115 проявляет анксиолитическое действие при пассивном фенотипе ответа на эмоциональный стресс. Действие препарата не сопровождается седацией, миорелаксацией, нарушением когнитивных функций. Установлено, что антидепрессивный эффект ГБ-115 не зависит от фенотипа эмоционально-стрессовой реакции. С использованием фармакологических анализаторов установлено участие опиоидных систем в анальгетическом действии ГБ-115. Доказана способность ГБ-115 восстанавливать поведенческие нарушения у животных со сформированной зависимостью при отмене этанола и бензодиазепинов. Выявлены изменения в дофаминергической системе, связанные с активацией поведения животных, длительно получавших диазепам при его резкой отмене. Охарактеризованы дозы ГБ-115, вызывающие анксиолитические, антиалкогольные, антидепрессивные и анальгетические эффекты. Показано, что ГБ-115 не вызывает патологического влечения и зависимости. В широком диапазоне доз доказано отсутствие проявления острых, хронических и специфических свойств токсичности.

Научно-практическая значимость. На основе выполненных исследований разработан фармакологический препарат ГБ-115, оригинальный  по химической структуре и механизму действия,  спектр фармакологической активности которого определяет преимущества по ряду показаний перед известными лекарственными средствами, применяемыми для лечения тревожных состояний и алкогольных расстройств. Препарат не имеет мировых аналогов. Полученные результаты включены в досье на  препарат ГБ-115 в Минздрав РФ для получения разрешения на клинические исследования. Получены патенты РФ №2227144 (приоритет от 15.11.2001г.) на изобретение Замещенные триптофан-содержащие дипептиды с холецистокининонегативной или холецистокининопозитивной активностью, №2429874 (приоритет от 16.04.2010г.) на изобретение Анальгетическое средство для купирования висцеральной боли. Результаты  исследований были использованы при составлении Методических основ поиска фармакологических средств для лечения алкоголизма и оценки их эффективности.

ичный вклад автора. Автором самостоятельно выполнены все поведенческие эксперименты по изучению анксиолитической, психостимулирующей, седативной, противосудорожной, миорелаксирующей, антидепрессивной, анальгетической и антиаддиктивной активности соединения ГБ-115. Выполнено моделирование состояний зависимости от психоактивных веществ. Проведена статистическая обработка и описание полученных результатов, сформулированы выводы. При непосредственном участии автора проанализирован и отобран спектр потенциальных рецепторных мишеней действия ГБ-115,  спланированы нейрохимические исследования, изучение возможного аддиктивного потенциала, определен дозовый диапазон для доклинической оценки безопасности ГБ-115, подготовлены публикации по результатам работы.

Положения, выносимые на защиту

1.        Анксиолитическая активность в ряду N-фенилалканоилзамещенных  триптофан-содержащих аналогов эндогенного ХЦК-4 определяется расстоянием между фенильной и индолильной группами в 13 -связей, что соответствует расстоянию между гидрофобными фрагментами в природном нейропептиде ХЦК-4, L-конфигурацией аминокислотного остатка триптофана и наличием амидной группы в качестве С-концевого заместителя.

2.        ГБ-115 взаимодействует с  ХЦК1-,  bb3  и КОР рецепторами, проявляя в микромолярных концентрациях свойства антагониста ХЦК1-и bb3 рецепторов и агониста КОР.

3.        ГБ-115 обладает  анксиолитическими свойствами, антиаддиктивной активностью, умеренно выраженными антидепрессивными и  антиноцицептивными эффектами. Препарат свободен от нежелательных побочных действий, свойственных бензодиазепиновым транквилизаторам.

4.        Анксиолитический эффект ГБ-115 не изменяется при  неселективной блокаде опиоидных рецепторов, суммируется при совместном введении с агонистом бомбезиновых рецепторов, не проявляется на фоне действия агониста ХЦК2-рецепторов.

5.        Дипептид ГБ-115 фармакологически активен при пероральном введении. 

6.        Данные по изучению механизма действия,  психотропной активности, общих фармакологических свойств и безопасности определяют целесообразность дальнейшей разработки ГБ-115 в качестве анксиолитика с антиалкогольными свойствами.

Основные сведения об апробации работы

Основные результаты диссертации доложены на 4-й Европейской конференции по биологии, биохимии и поведению (Морзин, Франция, 2000), 3-й Международной конференции Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам (Суздаль, Россия, 2001), международной конференции Новые лекарственные средства: синтез, технология, фармакология, клиника (Минск, Белоруссия,2001), 1-й, 2-й, 5-й, 6-й, 7-й, 9-й Ежегодных конференциях Фармакогенетика в психиатрии (Нью-Йорк, США, 2002, 2003, 2006, 2007, 2008, 2010), 27-м Европейском Пептидном симпозиуме (Сорренто, Италия, 2002), XIV Всемирном конгрессе по фармакологии (Сан-Франциско, США, 2002), 2-м Съезде Российского научного общества фармакологов (Москва, Россия, 2003), научной конференции Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты (Москва, Россия, 2005), 8-й Региональной конференции Европейской Коллегии по Нейропсихофармакологии (Москва, Россия, 2005), V съезде общества медицинских генетиков (Уфа, Россия, 2005), 4-й Международной конференции Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам (Москва, Россия, 2006), ХV Всемирном конгрессе по фармакологии (Пекин, Китай, 2006), 3-м Российском конгрессе фармакологов (Санкт-Петербург, Россия, 2007), Международной конференции по изучению наркотиков (Берлин, Германия, 2007), XXVI Всемирном Конгрессе по Нейропсихофармакологии (Мюнхен, Германия, 2008), 9-м Всемирном Конгрессе по Биологической Психиатрии (Париж, Франция, 2009), 1-м Российском Конгрессе по наркологии (Москва, Россия, 2009), 5-й Международной Конференция Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам (Москва, Россия, 2010), XVIII Российском Национальном Конгрессе Человек и лекарство (Москва, Россия, 2011), 11-й Региональной конференции Европейской Коллегии по Нейропсихофармакологии (Санкт-Петербург, Москва, 2011), 7-м Международном междисциплинарном конгрессе Нейронаука для медицины и психологии (Судак, Украина, 2011), 24-й Международной конференции Европейской Коллегии по Нейропсихофармакологии (Париж, Франция, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 54 работ, в том числе 16 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 36 тезисов в материалах российских и международных конференций,  2 патента РФ.

Объем и структура диссертации.   Диссертация изложена на 335 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 41 таблицей,  53 рисунками,  состоит из введения, обзора литературы (глава I), экспериментальной части (главы II-VI),  заключения, выводов, списка литературы и  приложения. Библиографический указатель включает 45  отечественных и  808 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования  проводились на инбредных мышах-самцах линий C57Bl/6 (n=450) и BALB/c (n=720), питомник Столбовая РАМН (Москва, Россия); инбредных крысах-самцах линий Maudsley Reactive (MR) (n=200) и Maudsley Non-Reactive (MNRA) (n=200), воспроизведенных из племенного ядра питомника Winston-Salem (Северная Каролина, США) в лаборатории биологических моделей РАМН Светлые горы (Москва, Россия);  крысах-самцах линии Wistar (n=12), питомник лабораторных животных Рапполово РАМН (Санкт-Петербург, Россия); беспородных белых мышах-самцах (n=930), питомник  Столбовая РАМН (Москва, Россия); беспородных крысах-самцах (n=1220), питомник Столбовая РАМН (Москва, Россия). Животных содержали в условиях вивария (температура воздуха 21-23оС, относительная влажность воздуха 40-60%) при естественной освещенности на стандартной диете лабораторных животных в соответствии с ГОСТ Р 50258-92 (1994г.) с соблюдением правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ, регламентированных ГОСТ Р 51000.3-96 и ГОСТ Р 51000.4-96 (1996г.),  приказом Минздравсоцразвития РФ от 23.08.2010 N 708н

Об утверждении Правил лабораторной практики и с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1986 г.)

Изученные соединения - N-феналканоилзамещенные триптофан-содержащие дипептиды (таблица 1). В качестве препаратов сравнения использовали: афобазол в дозе 1,0 мг/кг, в/б (ФГБУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН); антагонист ХЦК2-рецепторов L-360,265 в дозе 0,01 мг/кг, в/б (Sigma-Aldrich); антагонист ХЦК2-рецепторов GV150013 в дозе 0,005 мг/кг, в/б (любезно предоставлен фирмой GlaxoSmithKline);  феназепам в дозе 0,075 мг/кг, в/б (Физико-химический институт им.А.В.Богатского, Одесса); диклофенак натрия в дозе 20,0 мг/кг, п/о (Sigma-Aldrich); неселективный агонист опиоидных рецепторов морфина гидрохлорид в дозах 3,0 и 5,0 мг/кг, в/б (Минмедбиопром объединение Чимкентбиофарм); амитриптилин в дозе 10,0 мг/кг, в/б (Sigma-Aldrich); Для анализа механизмов фармакологических эффектов использовали:  агонист ХЦК2-рецепторов ХЦК-4 в дозе 4,0 г/кг, в/б (любезно предоставлен НИИ наркологии МЗ РФ); фрагмент бомбезина 8-14 Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 в дозе 0,015 мг/кг, в/б (Sigma-Aldrich); неселективный антагонист опиоидных рецепторов налоксон в дозе 1,0 мг/кг, п/к (Sigma-Aldrich); неселективный блокатор периферических опиоидных рецепторов налтрексона иодид в дозе 10,0 мг/кг, п/к (синтезирован в отделе химии ФГБУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН); антагонист каппа-опиоидных рецепторов нор-биналторфимин в дозе 5,0 мг/кг, в/б (Sigma-Aldrich); агонист каппа-опиоидных рецепторов пентазоцин в дозе 2,0 мг/кг, п/к (Sigma-Aldrich); пентилентетразол в дозах 30,0-140,0 мг/кг, п/к (Sigma-Aldrich); бикуккулин в дозе 4,0 мг/кг, п/к (Sigma-Aldrich); антагонист 2-адренорецепторов иохимбин в дозе 5,0 мг/кг, в/б (Sigma-Aldrich). Для моделирования патологических состояний использовали: феназепам в дозах 1,0-2,0 мг/кг, в/б (Физико-химический институт им.А.В.Богатского, Одесса); диазепам в дозе 4,0 мг/кг, в/б (Sigma-Aldrich); уксусную кислоту, разбавленную дистиллированной водой до 0,75% раствора (Sigma-Aldrich); спирт этиловый 96%, разбавленный  дистиллированной водой до 15 об.% и 25 об.% (ООО Главспирт). 

Способность отобранного соединения вытеснять высокоаффинные лиганды нейрорецепторов из мест связывания изучена на клеточных линиях СНО и НЕК-293. Исследования проведены совместно с фирмой Cerep (Франция), согласно стандартным протоколам.

Эмоционально-стрессовое воздействие моделировали в тесте лоткрытое поле (ОП) в соответствие с методом (Бородина П.М. и соавт.,1974 г.; Середенин С.Б. и Ведерников А.А., 1979).

Спонтанную двигательную активность регистрировали на приборе Optovarimex (Columbus Corpor., США) по методу, описанному ранее (Середенин С.Б. и соавт., 1992).

  Анксиолитическое действие оценивали в тесте приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) (Pellow S.E. et al., 1987) и  в условиях конфликтной ситуации (Vogel et al., 1971; Молодавкин Г.М., 1996). 

  Для суммарной оценки активности этанол-метаболизирующих систем и чувствительности ЦНС к этанолу использовали регистрацию продолжительности бокового положения в тесте лэтаноловый наркоз.

Потребление алкоголя у животных изучали в ситуации свободного выбора между растворами 15% этанола и водой с ежедневной регистрацией среднесуточного количества выпитых жидкостей в течение 12-ти месяцев. Уровень развития патологического влечения к алкоголю по мере хронической алкоголизации оценивали по алкоголь-депривационному эффекту (Салимов P. и соавт., 2005).

Для оценки антидепрессивного действия использовали тест вынужденное плавание у мышей (Porsolt et al., 1977).

Болевую  чувствительность животных оценивали в батарее тестов в опытах  in vivo с использованием стандартных моделей ноцицептивных реакций: лотдергивание хвоста при действии направленного сфокусированного теплового пучка с помощью анальгезиметра analgesia test, tail flick type 812 фирмы Hugo Sachs Electronic (Германия); горячая пластина (Ugo Basile, Италия) и уксусные корчи (Koster et al., 1977).

  Для выявления нарушений координации движений использовали общепринятую методику вращающегося стержня (Воронина Т.А. и соавт., 1982).

Способность предупреждать судороги изучали в тестах по антагонизму изучаемого вещества к действию  коразола и бикуккулина. (Германе С.К. и соавт., 1987).

Определение содержания моноаминов и их метаболитов в структурах головного мозга крыс проводили методом ВЭЖХ с электрохимической детекцией по методу, описанному Кудриным В.С. и соавт. (1988).

  Влияние соединений на мнестические функции изучалось в условиях модели УРПИ в установке Р.Адера  (лLafayette Instrument Co, США) (Трофимов С.С. и соавт., 2001).

Исследование аддиктивного потенциала проводили в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (Э.Э.Звартау и соавт., 2005) с оценкой изменений порогов электрической самостимуляции зон системы награды мозга, а также с использованием методики условно-рефлекторной реакции предпочтения места.

Для оценки возможных морфиноподобных побочных эффектов регистрировали частоту дыхания у наркотизированных кроликов и показатели ЭКГ наркотизированных крыс во II стандартном отведении.

При изучении психотропных эффектов отобранного соединения при длительном применении проводили оценку противотревожных свойств в тесте ПКЛ (Pellow, et al., 1985), ориентировочно-исследовательской активности - в тесте лоткрытое поле, оценку агрессивности, вызванной электроболевым раздражением пары крыс с предварительной регистрацией порогов болевой чувствительности,  по методу (Tedeshi, et al., 1959), оценку судорожной реакции  определяли по изменению ее порога при действии коразола. Возможное развитие толерантности к анксиолитическому действию оценивали в тесте ПКЛ.

Доклиническое изучение безопасности,  включающее оценку острой и хронической токсичности, а также специфических видов токсичности (мутагенности, аллергенности, иммунотоксичности и репродуктивной токсичности исследуемого соединения), выполнено в соответствии с методическими документами, представленными в Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2005).

Статистическую обработку данных проводили с  помощью стандартного пакета  программ Statistica 6.0 (StatSoft, Inc., США) с использованием непараметрического метода сравнения независимых групп Манна-Уитни (U-тест), теста Даннетта для межгрупповых сравнений, tЦкритерию Стьюдента,  критерия Фишера для альтернативных реакций, рангового однофакторного анализа Крускала-Уоллиса, критерия Вилкоксона для зависимых групп.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Исследование структурно-функциональной зависимости в ряду аналогов тетрапептида холецистокинина

Скрининг синтезированных соединений с общей формулой C6H5-(CH2)n-CO-NH-(CH2)m-CO-X-Trp-R, направленный на выявление их анксиолитической активности был проведен в опытах  in vivo с использованием стандартного теста приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) на беспородных крысах-самцах. Показано, что удлинение углеводородной цепочки фенилалканоильного радикала (лn от 3-х до 5-ти) способствует росту анксиолитической активности, что выражается в уменьшении величины пороговой дозы.  При увеличении длины центрального спейсера в соединениях с фенилгексанильным фрагментом за счёт замены аминокислотного остатка глицила на -аланин и ГАМК с соответствующим увеличением значения m от 1-го до 3-х  происходил постепенный спад активности (таблица 1).  Соединения ГБ-104 и ГБ-113, включающие в себя остаток D-триптофана, проявили ярко выраженную анксиогенную активность (таблица 1).  Согласно полученным данным, соединения ГБ-301 и ГБ-302, содержащие вместо триптофана аминокислотные остатки гистидина и фенилаланина оказались неактивными. Тем самым было показано, что индолильный заместитель в сконструированных аналогах ХЦК-4 является функционально важным фрагментом и, вероятно, играет роль фармакофорного элемента при взаимодействии с рецептором.

  Таблица 1.

Влияние длины спейсера, L или D- конфигурации и  природы С-концевого заместителя на проявление фармакологической активности ретро-аналогов ХЦК-4 с общей формулой C6H5-(CH2)n-CO-NH-(CH2)m-CO-X-Trp-R,

где n=1-5; m=1-3; X=L или D-конфигурация; R= OH, OCH3, OC2H5, NH2, NHCH3.

Соединение, шифр	n	m	X	R	Фармакологическая активность в тесте ПКЛ
ГБ-102	4	1	L	OC2H5	+
ГБ-101	4	1	L	NH2	+
ГБ-114	4	1	L	NHCH3	0
ГБ-103	4	1	L	OH	0
ГБ-104	4	1	D	NH2	-
ГБ-105	3	1	L	NH2	+
ГБ-107	3	1	L	NHCH3	0
ГБ-109	1	1	L	NH2	-
ГБ-111	5	1	L	OC2H5	+
ГБ-115	5	1	L	NH2	+
ГБ-113	5	1	D	NH2	-
ГЗ-517	5	2	L	NH2	+
ГЗ-518	5	3	L	NH2	+

Условные обозначения: л+ - снижение тревожности, л- - усиление тревожности, л0 - отсутствие влияния на поведение.

  Установлено, что замена концевой амидной группы на N-метиламидную (соединения ГБ-114 и ГБ-107) или на открытую карбоксильную группу (соединение ГБ-103) приводит к исчезновению анксиолитической активности (таблица 1). При введении вместо амидной группы эфирной (соединения ГБ-102 и ГБ-111) анксиолитическая активность сохраняется, при этом её уровень увеличивается вслед за увеличением длины фенилалканоильного спейсера.  Таким образом, на данном этапе работы из всех синтезированных дипептидов анксиолитической активностью обладали соединения ГБ-101, ГБ-102, ГБ-105, ГБ-111, ГБ-115, ГЗ-517 и ГЗ-518, из которых наиболее активными были соединения ГБ-115 (амид N-(6-фенилгексаноил)глицил-L-триптофана) и ГБ-111 (этиловый эфир N-(6-фенилгексаноил)глицил-L-триптофана). Однако, поскольку амиды являются структурами, более устойчивыми к протеолизу, чем сложные эфиры, в качестве наиболее перспективного потенциального анксиолитика из всей группы трипептоидных ретро-аналогов ХЦК-4 для дальнейшего углубленного изучения было отобрано соединение под шифром ГБ-115.

2. Исследование характера рецепторных взаимодействий ГБ-115

В результате радиолигандного анализа 109 предположенных фармакологических мишеней обнаружено, что ГБ-115 в диапазоне микромолярных концентраций взаимодействует с: ХЦК1-рецепторами  (IC50=8,1а⋅а10-5аM, Ki=6,1а⋅а10-5аM); каппа-опиоидными (КОР) рецепторами (IC50=1,6а⋅а10-5аM, Ki=1,0а⋅а10-5аM) и бомбезиновыми рецепторами 3-го типа (bb3) (IC50=1,6а⋅а10-5аM, Ki=9,7а⋅а10-6аM).

А. Б. В.

 

Рис.1.  Результаты клеточного функционального анализа по отношению к каппа-опиоидным рецепторам (А), бомбезиновым рецепторам 3-го типа (Б) и ХЦК1-рецепторам (В).

Согласно результатам клеточного функционального анализа, ГБ-115 проявляет свойства агониста по отношению к KOP в концентрации ЕС50 = 1,6⋅10-4 (рис.1А). На культуре клеток также показано, что ГБ-115 в концентрации IC50 = 3,7⋅10-5M, KB = 3,3⋅10-5M блокирует эффекты агониста bb3 рецептора (рис.1Б), и  препятствует проявлению эффектов агониста ХЦК1-рецепторов  в концентрации IC50 = 7,3⋅10-5M, KB = 5,8⋅10-6M  (рис.1В).

Таким образом, выявленные рецепторные взаимодействия и клеточные ответы определили необходимость расширения спектра фармакологических исследований.

3. Исследование психотропных свойств соединения ГБ-115
1. Изучение анксиолитической активности

Выявление анксиолитического действия  ГБ-115 проведено в соответствии с  фармакогенетической методологией (Середенин С.Б. и соавт., 1982), основанной  на использовании инбредных животных с различными  фенотипами поведения  в тесте ОП,  позволяющей  дифференцировать анксиоселективное действие и седативный эффект. 

Результаты, представленные в таблице 2  показывают, что ГБ-115 в диапазоне доз 0,006 - 0,1 мг/кг, в/б, вызывает анксиолитическое действие, увеличивая общую двигательную активность (ОДА) у мышей линии BALB/c. ГБ-115 (0,05-5,0 мг/кг) при пероральном введении проявляет максимальную анксиолитическую активность в дозе 0,1 мг/кг. Эффект ГБ-115 сопоставим с действием феназепама и селективных антагонистов ХЦК2-рецепторов GV150013 и L-360,265, выбранных в качестве препаратов сравнения.

В изученных дозах ГБ-115 не оказывает влияния на поведение мышей C57Bl/6, подобно антагонисту ХЦК2-рецепторов GV150013 (таблица 3). С увеличением дозы  при пероральном введении от 0,5 до 5,0 мг/кг ГБ-115 статистически значимо снижает ОДА, подобно феназепаму и антагонисту ХЦК2-рецепторов L-365,260, что указывает на развитие с увеличением дозы седативного действия у мышей C57Bl/6. Однако в случае с ГБ-115, в отличие от препаратов сравнения, имеется четкая диссоциация между диапазонами анксиолитических и седативных доз.

Таким образом, совокупность данных, полученных  на инбредных мышах BALB/c и C57Bl/6 свидетельствует о наличии у соединения ГБ-115 диапазона доз, в которых анксиолитическое действие, направленное на фенотип пассивной реакции на эмоционально-стрессовое воздействие, не сопряжено с седативным эффектом.

При изучении влияния ГБ-115 на спонтанную двигательную активность в отсутствии эмоционально-стрессового воздействия установлено, что ГБ-115 в изученном диапазоне доз (0,025 - 0,05 мг/кг, в/б, 0,1-5,0 мг/кг, п/о)  не изменяет уровень двигательной активности у беспородных и инбредных мышей, что позволяет исключить психостимулирующее действие при активации поведения животных в тесте ОП.

Таблица 2.

Влияние ГБ-115 на поведение инбредных мышей линии BALB/c в тесте ОП

Группы	Доза, мг/кг	Число животных	Показатели в ОП
			ОДА	ПДА	ЦДА	ВА
Внутрибрюшинное введение
Контроль	-	22	19,54,9	18,94,7	0,250,25	0,30,3
ГБ-115	0,001	8	21,85,3	19,33,4	1,91,0	0,50,3
	0,006	7	41,06,0*	32,15,4	8,24,3*	0,60,3
	0,01	8	50,56,7*	42,87,6*	7,33,1*	0,20,2
	0,025	8	59,18,0**	49,35,0**	9,15,1*	0,70,4
	0,05	8	58,56,7**	54,65,7**	3,61,7*	0,20,2
	0,1	8	61,39,2**	49,37,3**	11,24,1**	0,60,4
	0,25	7	29,76,3	27,86,2	1,51,0	0,40,4
Контроль	-	9	35,6 4,1	-	-	-
GV150013	0,005	9	82,614,6**	-	-	-
Контроль	-	10	27,74,9	23,03,4	3,72,8	0,10,0
L-360,265	0,01	10	82,18,3**	81,78,6**	0,30,3	0,00,0
Контроль	-	10	16,94,4	16,64,4	0,20,2	0,10,1
Феназепам	0,075	10	38,76,8**	37,26,7**	1,30,6*	0,10,1
Пероральное введение
Контроль	-	15	32,64,7	31,24,6	1,40,8	0,00,0
ГБ-115	0,05	8	34,610,2	28,98,4	1,61,2	0,00,0
	0,1	7	60,110,2*	55,99,8*	4,31,7	0,00,0
	0,25	11	26,55,7	23,95,7	2,51,1	0,10,1
	0,5	9	37,78,0	37,27,8	0,40,3	0,00,0
	1,0	10	26,911,4	26,911,4	0,00,0	0,00,0
	5,0	9	59,38,0*	59,07,9*	0,10,1	0,00,0

Данные представлены как МSEM; *, ** - р<0,05, p<0,01 статистически достоверные различия по сравнению с контролем согласно непараметрическому критерию Манна-Уитни; ОДА - общая двигательная активность, ПДА - периферическая двигательная активность, ЦДА - центральная двигательная активность, ВА - вертикальная двигательная активность.

Изучение анксиолитических свойств  ГБ-115 продолжено на крысах MR и MNRA. Установлено, что ГБ-115 в дозах 0,025 и 0,05 мг/кг, в/б, у крыс линии MR с высоким уровнем эмоциональности увеличивает ОДА за счет ЦА и ВА по сравнению с контрольными животными (таблица 4).

Таблица 3.

Влияние ГБ-115 на поведение инбредных мышей линии C57Bl/6 в тесте ОП

Группы	Доза, мг/кг	Число животных	Показатели в ОП
			ОДА	ПДА	ЦДА	ВА
Внутрибрюшинное введение
Контроль	-	8	94,114,1	52,09,3	33,05,7	9,11,6
ГБ-115	0,001	8	98,712,3	57,95,2	29,96,0	10,93,9
	0,006	8	111,215,6	66,67,6	33,26,9	11,42,9
	0,01	8	128,917,2	75,76,9	40,08,9	13,13,5
	0,025	8	131,215,3	69,28,4	52,46,6*	9,42,0
	0,05	8	120,714,2	72,29,3	35,45,5	13,11,6
	0,1	8	114,917,9	72,111,1	32,07,9	10,72,9
	0,25	7	118,110,5	73,912,2	31,56,8	12,63,2
Контроль	-	9	93,110,0	-	-	-
GV150013	0,005	9	96,214,9	-	-	-
Контроль	-	10	147,015,5	81,05,4	41,26,9	24,84,1
L-360,265	0,01	10	87,414,9*	46,36,6**	30,87,5	10,32,8*
Контроль	-	10	135,06,4	81,06,8	34,04,8	17,92,4
Феназепам	0,075	10	90,08,6**	63,96,3*	18,83,2**	6,51,6*
Пероральное введение
Контроль	-	15	87,311,2	53,86,9	21,53,2	12,02,6
ГБ-115	0,05	7	65,112,6	29,66,8	26,66,5	9,02,9
	0,1	6	90,810,6	54,09,3	30,25,1	6,72,1
	0,25	9	84,712,4	49,45,1	23,05,7	12,23,7
	0,5	8	25,516,5**	18,211,7*	2,41,8**	4,93,2*
	1,0	14	34,710,9**	22,97,5**	7,82,7**	3,91,6**
	5,0	11	36,49,7**	25,46,9**	7,22,0**	3,81,8**

Данные представлены как МSEM; *, ** - p<0,05, p<0,01 статистически достоверных различий по сравнению с контролем согласно непараметрическому критерию Манна-Уитни; ОДА - общая двигательная активность, ПДА - периферическая двигательная активность, ЦДА - центральная двигательная активность, ВА - вертикальная двигательная активность.

Выявленный эффект сопоставим с действием афобазола. В диапазоне изученных доз ГБ-115, также как и афобазол, не изменяет поведение крыс линии MNRA (таблица 4). Полученные результаты подтверждают наличие у ГБ-115 анксиолитического действия, проявляющегося у животных с пассивным фенотипом эмоционально-стрессовой реакции в ОП. Ранее подобные эффекты были описаны для дневного транквилизатора гидазепама,  атипичного анксиолитика мексидола (Середенин, и соавт., 1987; Kravtsova, et al., 2004), оригинального селективного анксиолитика афобазола и гептапептидного анксиолитика селанка (Середенин, и соавт., 1998).

Таблица 4.

Влияние ГБ-115 на поведение инбредных крыс линии MR/MNRA в тесте ОП

Группы	Доза, мг/кг	Путь введения	Число животных	Показатели в ОП
				ОДА	ПДА	ЦДА	ВА
Крысы линии MR
Контроль	-	в/б	10	32.93.3	21.02.5	9.01.9	2.92.5
ГБ-115	0,025	в/б	11	54.17.2*	31.62.8*	16.43.8	6.12.5
	0,05	в/б	10	55.77.9*	32.24.1*	17.12.6	6.41.7*
Контроль	-	в/б	10	22.82.5	15.81.8	0.50.5	6.51.8
Афобазол	1,0	в/б	11	34.43.5*	22.21.3*	2.00.8	10.02.1
Крысы линии MNRA
Контроль	-	в/б	11	59.43.5#	37.23.3#	18.11.9#	4.01.4
ГБ-115	0,025	в/б	9	66.13.4	31.72.6	25.72.4	8.62.18*
	0,05	в/б	9	55.63.8	29.91.9	21.72.1	4.01.2
Контроль	-	в/б	10	42.24.4	23.41.6	6.31.3	12.81.0
Афобазол	1,0	в/б	10	54.55.4	24.61.5	6.01.4	22.81.2

Данные представлены как МSEM; *- p<0,05 статистически достоверных различий по сравнению с контролем, #- p<0,05 статистически достоверных различий по сравнению с контролем линии MR согласно непараметрическому критерию Манна-Уитни; ОДА - общая двигательная активность, ПДА - периферическая двигательная активность, ЦДА - центральная двигательная активность, ВА - вертикальная двигательная активность.

В следующей серии экспериментов  анксиолитическое действие ГБ-115 установлено в тесте ПКЛ. Анксиолитический эффект ГБ-115 в дозе 0,05 мг/кг, в/б, обнаружен у крыс MR и  отсутствовал у животных линии MNRA. Далее показано, что  ГБ-115 (0,025-0,4 мг/кг, п/о) проявляет анксиолитическую активность у типированных в качестве пассивных в тесте ОП беспородных крыс в дозе 0,2 мг/кг, увеличивая время пребывания в открытых рукавах ПКЛ (p<0,05) и числа заходов  в открытые рукава (p<0,05), не влияя на общую двигательную активность.

У лактивных крыс ГБ-115 также проявляет анксиолитические свойства в дозе 0,1 мг/кг. Статистически значимо увеличивалось время нахождения животных в открытых рукавах (p<0,05), число вертикальных стоек (p<0,05) и значительно сокращалось количество дефекаций, что в целом свидетельствует о снижении уровня тревожности у животных. Таким образом, ГБ-115 в дозах 0,1-0,2 мг/кг обладает анксиолитическим действием у беспородных крыс.

В тесте ПКЛ исследовалась  зависимость противотревожного эффекта ГБ-115 от дозы (рис.2А) и установлены временные характеристики: купирование тревожной

реакции под действием ГБ-115 (0,1 мг/кг, п/о) развивается через 40 минут и сохраняется в течение последующих 40 минут (рис.2Б). Учитывая тот факт, что пептидные антагонисты ХЦК рецепторов предыдущих поколений отличались энзиматической неустойчивостью (Bork, 1991), выявленная способность дипептида оказывать эффект при пероральном введении подтверждает целесообразность его дальнейшей фармакологической разработки.

А. Б.

Рис.2. Влияние ГБ-115 при пероральном введении на поведение инбредных мышей BALB/c в тесте ПКЛ: (А) зависимость доза-эффект; (Б) продолжительность действия ГБ-115 при однократном введении в дозе 0,1 мг/кг. Данные представлены как MSEM; *, **, *** -p<0,05, p<0,01, p<0,001 статистически значимые отличия по сравнению с контрольной группой согласно непараметрическому критерию Манна-Уитни; число животных в каждой группе 8-11.

Для более полной сравнительной оценки ГБ-115 с бензодиазепиновыми транквилизаторами  противотревожное действия ГБ-115 изучено на крысах в условиях теста конфликтной ситуации. Как показано на рис.3, между крысами MR и MNRA в конфликтном тесте имеются статистически значимые различия, которые еще раз свидетельствуют о более высоком уровне тревожности крыс линии MR по сравнению с крысами линии MNRA. В этих условиях ГБ-115 при дозах 0,025 и 0,05 мг/кг проявляет анксиолитические свойства у крыс линии MR, не влияя на поведение крыс MNRA, что подтверждает ранее полученные данные об анксиолитической активности ГБ-115, направленной преимущественно на животных с изначально повышенным уровнем тревожности и отсутствии седативного влияния на лактивных животных.

Анксиолитическое  действие ГБ-115 в тесте конфликтная ситуация было также  выявлено на беспородных крысах при пероральном (0,1 мг/кг, p<0,05) и интраназальном (0,1 и 0,2 мг/кг, p<0,05) введениях.

  Таким образом, в спектре психотропной активности изучаемого дипептидного аналога ХЦК установлены анксиоселективные эффекты, не сопряженные с психостимулирующим и седативным действием.

Рис.3. Влияние ГБ-115 на поведение крыс MR и MNRA в тесте конфликтная ситуация (сила тока 0,5 мА). Данные представлены как M+SEM; **-p<0,01, ***-p<0,01 статистически значимые различия относительно группы контроля согласно t-критерию Стьюдента, в каждой группе 10-15 животных. В качестве препаратов сравнения использованы диазепам в дозе 4.0 мг/кг, в/б, и афобазол в дозе 1,0 мг/кг, в/б.

Для  анализа  механизма анксиолитического действия ГБ-115 в связи с выявленными рецепторными мишенями  изучено его влияние  на поведение инбредных мышей и беспородных крыс  в опытах in vivo с использованием фармакологических анализаторов: при совместном введении с агонистом ХЦК-рецепторов ХЦК-4 (4,0 мкг/кг, в/б), неселективным антагонистом опиоидных рецепторов налоксоном (1,0 мг/кг, в/б) и агонистом бомбезиновых рецепторов - фрагментом бомбезина 8-14 (0,015 мг/кг, в/б).

Установлено, что предварительное введение ХЦК-4 препятствует проявлению противотревожной активности дипептида ГБ-115 (0,025 мг/кг, в/б) у мышей BALB/с в тесте ОП (рис.4).

У беспородных крыс ХЦК-4 значительно сокращает время нахождения (p<0,05) и число заходов в открытые рукава (p<0,01) ПКЛ, что свидетельствует о вызываемой этим веществом тревожной реакции. При последующем введении ГБ-115 (0,05 мг/кг, в/б) препятствовал развитию анксиогенеза, сохраняя поведенческие показатели животных в ПКЛ на уровне контрольных значений. Таким образом, установлен функциональный антагонизм ГБ-115 и ХЦК-4 (рис.4).

В опытах с налоксоном  анксиолитический эффект ГБ-115 в ПКЛ сохранялся, что  позволяют предположить отсутствие прямой связи  опиоидергической системы с анксиолитическим действием препарата (рис.5).

Рис.4. Влияние ХЦК-4 и ГБ-115 на общую двигательную активность инбредных мышей линий BALB/c и C57Bl/6 в тесте лоткрытое поле.  Данные представлены как МSEM; **-p<0,01 статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой, ANOVA, тест Даннетта; число животных в каждой группе 9-11.

Активация бомбезиновых рецепторов вызывает анксиолизис, увеличивая время пребывания в открытых рукавах  ПКЛ в 3,2 раза.  ГБ-115 также увеличивает время нахождения на открытых площадках ПКЛ в 3,5 раза (рис.6). На фоне предварительной стимуляции бомбезиновых рецепторов действие ГБ-115 в отношении основного  показателя поведенческой активности в данном тесте возрастает вдвое,  что свидетельствует о суммации фармакологического  эффекта.

Рис.5.  Влияние ГБ-115 115 на поведение  беспородных крыс в тесте ПКЛ на фоне блокады опиоидных рецепторов налоксоном. Данные представлены как M+SEM; *-p<0,05, **-p<0,01 статистически достоверные различия по сравнению с контролем, согласно непараметрическому критерию Манна-Уитни.

Таким образом, совокупность представленных результатов, демонстрирующих, отсутствие влияния неселективной блокады опиоидных рецепторов на эффекты ГБ-115, усиление анксиолитической активности ГБ-115 при предварительной активации бомбезиновых рецепторов, а также выявленный функциональный антагонизм между ХЦК-4 и ГБ-115, свидетельствуют о функциональной зависимости  анксиолитических эффектов дипептида от ХЦК-рецепторов.

Рис.6. Влияние  неселективной активации бомбезиновых рецепторов гептапептидным фрагментом бомбезина8-14 на анксиолитическое действие ГБ-115 в ПКЛ у мышей линии BALB/c.  Данные представлены как МSEM; *, **, -p<0,05, p<0,01 статистически достоверные различия по сравнению с группой контроль, #, ## -p<0,05, p<0,01 по сравнению с группой ГБ-115, согласно непараметрическому критерию Манна-Уитни; число животных в каждой группе по 8-9.

2. Изучение антиалкогольной активности соединения ГБ-115

Значительным ограничением использования бензодиазепинов в фармакотерапии алкогольных расстройств является их способность потенцировать эффекты этанола. С другой стороны, многочисленные данные литературы свидетельствуют о непосредственной вовлеченности ХЦК в механизмы этаноловой зависимости, а антагонисты ХЦК-рецепторов рассматриваются в качестве потенциальных средств для коррекции вызываемых алкоголем расстройств (Gaviraghi, et al., 1994; Crespi, et al., 1997). Поэтому соединение ГБ-115 было  изучено на экспериментальных моделях алкогольной зависимости.

  Согласно результатам экспериментов, ГБ-115 в диапазоне анксиолитических доз 0,0125 - 0,05 мг/кг, в/б, не потенцирует наркотическое действие этанола (рис.7А). Феназепам в дозе 1,0 мг/кг, в/б,) увеличивает (p<0,01) продолжительность алкогольного наркоза по сравнению с контрольной группой (рис.7Б). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о преимуществе ГБ-115 перед бензодиазепиновым транквилизатором по критерию отсутствия потенцирования действия этанола, что позволяет использовать ГБ-115 в дальнейших исследованиях по изучению влияния препарата на эффекты алкоголя.

Ранее было показано отсутствие влияния соединения ГБ-101, одного из  N-феналканоилзамещенных дипептидов (таблица 1) на среднесуточное потребление 15% раствора этанола на всех трех стадиях экспериментального алкоголизма (через 10 дней, через 6 и 12  месяцев) (Колик Л.Г., 2002), поэтому в настоящей работе влияние ГБ-115 на алкогольное поведение животных изучали на 3-м этапе экспериментального алкоголизма после 8-ми месяцев добровольного потребления алкоголя в условиях свободного выбора между этанолом и водой, то есть во время сформировавшейся физической зависимости, у MR и MNRA крыс и изначально различавшихся по фенотипу эмоционально-стрессовой реакции в тесте лоткрытое поле  беспородных крысах.

А.  Б.

Рис.7. Влияние ГБ-115 на продолжительность этанолового наркоза (А) у инбредных мышей линий BALB/c и C57Bl/6; (Б) у беспородных мышей. Данные представлены как MSEM; # -p<0,05 статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой мышей линии BALB/c; **-p<0,01 статистически значимые отличия по сравнению с группой контроль; ANOVA, тест Даннетта; число животных в каждой группе по 10-12.

  Установлено, что ГБ-115 в дозе 0,025 мг/кг/день, в/б, 14 дней, снижает среднесуточное потребление этанола (р<0,05) и существенно ослабляет влечение к алкоголю по показателю алкоголь-депривационного эффекта (АДЭ) (р<0,01) у крыс MR. У крыс MNRA аналогичного эффекта не обнаружено (рис.8А, 8Б).

Рис.8. Влияние ГБ-115 на алкогольную мотивацию у крыс MR/MNRA после 12-ти месяцев добровольного потребления 15% раствора этанола.

Данные представлены в виде средних значений; *-p<0,05,**-p<0,01 по сравнению с фоном, критерий Вилкоксона для зависимых групп; в каждой группе по 7-9 животных.

При изучении влияния ГБ-115 при однократном введении на поведение беспородных крыс в период отмены этанола в тесте ПКЛ установлено, что ГБ-115 в дозах 0,0125 и 0,025 мг/кг, в/б, увеличивает время нахождения животных в открытых рукавах лабиринта; ГБ-115  в дозе 0,025 мг/кг увеличивает отношение числа заходов в открытые рукава к общему числу заходов в рукава лабиринта (%); ни в одной из изученных доз ГБ-115 не влияет на двигательную активность (рис.9А и 9Б).

Рис.9. Влияние ГБ-115 на поведение беспородных крыс в ПКЛ в условиях лотмены этанола. Данные представлены в виде средних значений; *, ** - p<0,05, p<0,01 статистически достоверные отличия по сравнению с контрольной группой, ANOVA, тест Даннетта; в каждой группе по 6-8 животных.

Установлено, что ГБ-115 в дозе 0,2 мг/кг, п/о,  купирует (p<0,05) анксиогенную реакцию, индуцированную отменой этанола, как у изначально пассивных, так и лактивных в стрессовой ситуации теста ОП животных со сформировавшейся в течение 15-ти месяцев алкогольной мотивацией. Полученные данные свидетельствуют о том, что ГБ-115 способен устранять анксиогенез, вызываемый отменой этанола, не уступая в этом отношении диазепаму.

3. Изучение антиноцицептивной активности ГБ-115

Исходя из результатов радиорецепторного анализа, выявившего КОР в качестве одной из первичных мишеней действия ГБ-115, в настоящем разделе исследовали антиноцицептивные свойства ГБ-115 при стимуляции ноцицепторов раздражителями различной модальности на спинальном, супраспинальном уровнях, а также на периферии.

При оценке эффектов ГБ-115 при химической стимуляции ноцицепторов 0,75% раствором уксусной кислоты, в/б,  в  тесте корчи установлено, что соединение ГБ-115 в диапазоне доз 0,1-20,0 мг/кг обладает выраженной анальгетической активностью (рис.10А).

Рис.10. Антиноцицептивные свойства ГБ-115 при химической стимуляции (А) в тесте луксусные корчи, при термической стимуляции  в тесте (В) горячая пластинка и  (С) лотдергивание хвоста.  Данные представлены в виде MSEM; статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой показаны при *-p<0,05, ** -p<0,01, ***-p<0,001 согласно непараметрическому критерию Манна-Уитни; МВЭ (максимально возможный эффект) = (латентный период реакции после введения соединения минус фоновый латентный период реакции)/(максимальное время экспозиции минус фоновый латентный период реакции) Х 100%; количество животных в группе по 9-14.

Развитие эффекта ГБ-115 отмечалось с увеличением дозы, достигая при введении препарата из расчета 10,0 мг/кг максимального угнетения реакций на 76,3% по сравнению с контролем (p<0,0001). Последующее увеличение дозы дипептида до 20,0 мг/кг приводит к ослаблению анальгезии до 43,9% (р<0,05). При сопоставлении эффекта ГБ-115 с опиоидными и неопиоидными анальгетиками показано, что ГБ-115 в максимально эффективной дозе 10,0 мг/кг уступает по силе морфину (5,0 мг/кг, в/б), уменьшавшему ноцицептивную реакцию на 95,5% (p<0,001),  но сопоставим с анальгетической активностью нестероидного противовоспалительного средства диклофенака (20,0 мг/кг, п/о).

В ответ на термическую стимуляцию в тесте горячая пластинка (лhot plate) ГБ-115 статистически значимо ослабляет ноцицептивную реакцию только в максимально изученной дозе 20,0 мг/кг (рис.10В), значительно уступая по силе действия морфину.

  ГБ-115 с возрастанием дозы постепенно увеличивает латентный период реакции в тесте лотдергивание хвоста (до 281,2% при дозе 10,0 мг/кг), при этом также уступает морфину (до 443,7%), по сравнению с контролем (рис.10С). При увеличении дозы до 20,0 мг/кг соединение ГБ-115 не проявляет антиноцицептивного эффекта в данном тесте.

Поскольку наиболее выраженные анальгетические свойства ГБ-115 проявляются в тесте луксусные корчи, изучение механизма действия дипептида продолжено в условиях химического раздражения ноцицепторов. Показано, что блокада КОР селективным антагонистом нор-биналторфимином (5,0 мг/кг, в/б) препятствует проявлению антиноцицептивной активности ГБ-115 в дозе 10,0 мг/кг. Пентазоцин (2,0 мг/кг, п/к), агонист КОР, снижает число абдоминальных сокращений (p<0,01). Данный эффект также устраняется на фоне предварительной блокады КОР нор-биналторфимином (рис.11А).

Рис.11. Влияние селективной блокады каппа-опиоидных рецепторов нор-биналторфимином (А) и неселективной блокады периферических опиоидных рецепторов налтрексоном иодидом (В) на проявление антиноцицептивной активности ГБ-115 в тесте корчи. Данные представлены в виде MSEM; **- p<0,01, ***-p<0,001 статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой, ## - p<0,01 по сравнению с группой ГБ-115, x-p<0,05 по сравнению с группой пентазоцин, p<0,05 различия между группой ГБ-115 и группой ГБ-115+налтрексона иодид (для рис.В) согласно непараметрическому критерию Манна-Уитни; количество животных в группе по 9-15.

Установлено, что периферический неселективный антагонист опиатных рецепторов налтрексона иодид препятствует проявлению анальгетической активности ГБ-115, восстанавливая порог болевой чувствительности до контрольных значений (рис.11В).  Далее, при оценке роли ХЦК-системы в реализации антиноцицептивной активности ГБ-115 установлено, что предварительная активация ХЦК2-рецепторов ХЦК-4 (4,0 г/кг, в/б) не влияет (p<0,01) на антиноцицептивный эффект ГБ-115. Селективный антагонист ХЦК2-рецепторов L365,260 (0,01 мг/кг, в/б), в отличие от ГБ-115, не оказывает анальгетического действия.

Полученные данные позволяют сделать вывод об участии  каппа-опиоидных рецепторов в реализации антиноцицептивной активности ГБ-115 в дозах 0,1 - 20,0 мг/кг per se.

  Установлено, что при сочетанном введении морфина и ГБ-115 в анксиолитической дозе 0,025 мг/кг, в/б, латентный период реакции у мышей в тесте горячая пластинка превышает самостоятельный эффект агониста опиоидных рецепторов. Указанное антиноцицептивное действие морфина и ГБ-115 при их комбинированном применении носит кратковременный характер и полностью блокируется налоксоном (рис.12). Рассматриваемый эффект соединения ГБ-115 проявляется в тесте горячая пластинка, который используется как метод оценки вмешательства нейротропных веществ в процессы функционирования центральной нервной системы на супраспинальном уровне  (Le Bars, et al., 2001).

Рис.12. Влияние налоксона на потенцирование ГБ-115  морфин-индуцированной анальгезии в тесте горячая пластинка. Данные представлены в виде средних значений; *** - p<0,001 по сравнению с контрольной группой; # - p<0,05 по сравнению с группой морфина; XX - p<0,01 по сравнению с группой морфин+ГБ-115 согласно непараметрическому критерию Манна-Уитни; в каждой группе по 8-12 животных.

В то же время на спинальном уровне в условиях теста лотдергивание хвоста соединение ГБ-115 не приводит к изменениям латентного периода реакции при действии морфина, что свидетельствует о потенцировании антиноцицептивного эффекта морфина преимущественно на супраспинальном уровне. Многочисленные работы свидетельствуют о том, что антагонисты ХЦК-рецепторов  потенцируют антиноцицептивный ответ опиатов (Roques and Noble, 1996, Singh L. et al., 1996), подтверждая существование функционального антагонизма между ХЦК- и опиоидной системами. Считается, что реализация действия пептидов холецистокинина осуществляется преимущественно через активацию ХЦК2-рецепторов, а ХЦК2-антагонисты, соответственно, потенцируют вызываемую опиатами анальгезию (Valverde, 1994; Friedrich, 2000).

4. Изучение антидепрессивной активности ГБ-115 

В тесте вынужденного плавания зафиксированы четкие межлинейные различия у мышей BALB/c и C57Bl/6 (p<0,001), что согласуется с данными литературы (Norcross, et al., 2008) (рис.13 А-Б).

 

Рис.13.  Влияние ГБ-115 на поведение мышей в тесте вынужденное плавание. Данные представлены в виде MSEМ; ** - p<0,01, ***-p<0,001 по сравнению с контрольной группой согласно непараметрическому критерию Манна-Уитни для независимых групп; в каждой группе по 8-10 животных.

Показано, что ГБ-115 в анксиолитических дозах 0,025 и 0,05 мг/кг, в/б,  уменьшает (p<0,05) время иммобилизации мышей BALB/c, и увеличивает (p<0,05) латентный период реакции зависания у беспородных и  инбредных мышей, уступая  по активности амитриптилину (рис.13 А-В). Диазепам не изменяет поведение животных в тесте вынужденного плавания. Представленные результаты согласуются с работой Offel. et al. (2006), показавших в опытах in vivo наличие анксиолитической и антидепрессивной активности у лиганда ХЦК1-рецептора. Учитывая выявленный функциональный антагонизм ГБ-115 с ХЦК-4 в опытах in vivo, полученные в настоящей работе данные позволяют высказать предположение о наличии антидепрессивных свойств в спектре активности ГБ-115,  которые, возможно, проявляются при взаимодействии с ХЦК-системой.

5. Оценка антиаддиктивных свойств ГБ-115

Сообщения о способности антагонистов ХЦК-рецепторов предотвращать развитие анксиогенеза, связанного с отменой психоактивных веществ (алкоголь, диазепам, кокаин и никотин), выявленная антиалкогольная активность непептидного антагониста ХЦК2-рецепторов GV150013 (Виглинская, 1997), а также собственные результаты исследования антиалкогольных свойств дипептидных аналогов ХЦК-4 (Колик, 2002) послужили основанием для изучения эффектов ГБ-115 на синдром отмены бензодиазепиновых транквилизаторов, одним из проявлений которого у животных является повышение тревожности. На рис.14А-Б показано, что у контрольных животных на фоне отмены феназепама (2,0 мг/кг/день, в/б, 21 день) развивается анксиогенная  реакция (p<0,05) по сравнению с крысами из группы плацебо (вода, в/б, 21 день). Установлено, что через 24 ч после отмены феназепама ГБ-115 в дозе 0,5 мг/кг увеличивает время в открытых рукавах и число заходов в открытые рукава лабиринта у MR/MNRA крыс, не влияя на время нахождения в центре и общую двигательную активность животных, что свидетельствует о противотревожном характере действия ГБ-115.

А. Б.

 

Рис.14А-Б. Влияние ГБ-115 на поведение инбредных крыс MR/MNRA в тесте ПКЛ в условиях лотмены феназепама. Данные представлены как MSEM; *, **-p<0,05, p<0,01 статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой, ANOVA, тест Даннетта; в каждой группе по 7-8 животных.

Аналогичные результаты получены в опытах с диазепамом. При оценке поведения беспородных животных после отмены диазепама (4,0 мг/кг/день, в/б, 30 дней) отмечается сокращение времени пребывания в открытых рукавах (в 3,5 раза) и уменьшения числа заходов в открытые рукава (в 3,7 раза, что согласуется с данными dos Santos, et al. (2010). ГБ-115 в дозе 0,1 мг/кг через 48 ч после отмены диазепама при однократном системном введении купирует индуцированную отменой диазепама тревогу у беспородных крыс, увеличивая время пребывания в открытых рукавах (р<0,01) и число заходов (р<0,05) в открытые рукава (рис.15).

Рис.15. Влияние ГБ-115 в дозе 0,1 мг/кг, в/б, на поведение беспородных крыс в тесте ПКЛ в условиях лотмены диазепама. Данные представлены как MSEM; *-p<0,05 статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой согласно непараметрическому критерию Манна-Уитни; в каждой группе по 6 животных.

 

Рассматривая состояние, вызванное отменой бензодиазепиновых транквилизаторов,  как модель тревоги, проведено исследование влияния ГБ-115 на содержание биогенных аминов в структурах головного мозга (фронтальной коре, гиппокампе, гипоталамусе и стриатуме). Наиболее значимые изменения выявлены в стриатуме.

При отмене диазепама статистически значимо уменьшалось содержание ДА (-22,4%), ДОФУК (-22,2%) по сравнению с контрольной группой.  Выявлено падение концентрации ДА (-20,3%) и увеличение содержания НА (+333,3%), а также достоверное увеличение индексов обмена ДА, ДОФУК/ДА (+14,2%) и (ДОФУК+ГВК)/ДА (+18,2%), по сравнению с животными, получавшими диазепам в течение 30-ти дней, что соответствует данным литературы (dos Santos L., et al., 2010). Установлено, что ГБ-115 в дозе 0,1 мг/кг при однократном введении на фоне отмены диазепама увеличивает содержания ДОФУК (+25%) и ДА (+31,6%) (рис.16), и  не влияет на показатели оборота ДА. Таким образом, моделирование тревоги отменой диазепама у животных со сформированной бензодиазепиновой зависимостью и введение ГБ-115 вызывают противоположные изменения в обмене дофамина.  Не исключено, что обнаруженные сдвиги в дофаминергической системе могут быть элементом нейрохимических изменений, вызванных соединением ГБ-115 при формировании анксиолитических эффектов и активации поведения животных после отмены длительно вводимого диазепама.

А.  Б.

Рис.16. Влияние ГБ-115 на синтез и метаболизм моноаминов в стриатуме у крыс в условиях лотмены диазепама. Условные обозначения: (А) черный фон - контроль (вода 30 дней), серый фон - диазепам-отмена; *-p<0,05; **-p<0,01 достоверные различия по сравнению с группой контроль (ANOVA; Фишер LSD) (Б) черный фон - диазепам-отмена, серый фон - диазепам-отмена + ГБ-115, * - p< 0,05; **-p< 0,01 достоверные различия по сравнению с группой диазепам-отмена (ANOVA; Фишер LSD); в каждой группе по 5 животных; NA-норадреналин, DOPAC- 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК), DA-дофамин, 5-HIAA- 5-гидрокси-3-индолуксусная кислота, HVA-гомованилиновая кислота (ГВК), 5-HT-5-гидрокситриптамин.

4. Исследование общей фармакологической активности соединения ГБ-115

  В стандартных фармакологических исследованиях установлено. что ГБ-115 в дозах 0,1, 1,0, 10,0 и 20,0 мг/кг, п/о, не вызывает нарушения координации движения у животных в тесте вращающийся стержень;  в анксиолитической дозе 0,025 мг/кг, в/б, не влияет на латентный период судорожных реакций и продолжительность жизни животных при судорогах, индуцированных коразолом и бикуккулином;  в дозах 0,025, 0,05 и 0,1 мг/кг не влияет на когнитивные процессы, о чем свидетельствует отсутствие эффекта при выработке УРПИ на фоне действия препарата. Последнее выгодно отличает препарат от бензодиазепиновых транквилизаторов, обладающих амнестическими свойствами.

  ГБ-115 в дозе 0,5 мг/кг, в/б, не изменял электрокардиограмму и не оказывал угнетающего влияния на дыхательный центр.

При длительном введении ГБ-115 в дозе 0,1 мг/кг, в/б, анксиолитическое действие препарата в тесте ПКЛ  полностью сохраняется (таблица 5). Как при однократном введении, при длительном применении не обнаруживается нежелательных эффектов в виде  седативного, психостимулирующего действия, увеличения агрессивности, повышения судорожной готовности. При длительном применении ГБ-115 не выявлено  отличий по спектру фармакологической активности и глубине эффекта от действия при  однократном введении. Это свидетельствует о том, что длительное введение ГБ-115 не приводит ни к кумуляции эффекта, ни к развитию толерантности и к возникновению  новых нежелательных эффектов.

Таблица 5.

Влияние ГБ-115 на поведение крыс в условиях однократного и хронического применения

Тест		Контроль	ГБ-115
			Однократное введение	Длительное введение (30 дней)
ПКЛ	Время в открытых рукавах, сек	3,21,6	8,52,0*	10,53,1*
	Кол-во заходов в открытые рукава	0,50,2	1,40,5	1,00,6
Суммарный показатель перемещений в тесте лоткрытое поле		31,01,8	30,92,3	33,63,13
Порог агрессивной реакции, мА		0,90,1	1,10,2	0,90,2

Данные представлены как MSEM; *- р<0.05 статистически достоверные отличия по сравнению с контрольной группой согласно t-критерию Стьюдента; в каждой группе по 12-15 животных.

  Отмена длительного введения ГБ-115 не вызывает анксиогенной реакции как это характерно для бенздиазепиновых транквилизаторов. Напротив, через 24 и 48 часов после отмены ГБ-115анксиолитический эффект сохраняется, о чем свидетельствует  время, проведенное крысами в открытых рукавах ПКЛ (рис.17).  В отличие от диазепама, не наблюдается изменения ориентировочно-исследовательского поведения, агрессивности, повышенной судорожной готовности (рис.17 и 18А-Б).

Рис.17. Поведение крыс в период отмены ГБ-115 и диазепама в ПКЛ. Данные представлены как MSEM; *- р<0.05 статистически достоверные отличия по сравнению с контрольной группой (для диазепама) согласно t-критерию Стьюдента; в каждой группе по 10-12 животных.

Таким образом, соединение ГБ-115 обладает выраженным анксиолитическим эффектом, который сохраняется при хроническом применении.

А.  Б.

Рис.18. Влияние ГБ-115 на (А) порог агрессивной реакции и на (Б) порог судорожной реакции, индуцированной коразолом. Данные представлены как MSEM; *- р<0.05 статистически достоверные отличия по сравнению с контрольной группой (для диазепама) согласно t-критерию Стьюдента; в каждой группе 10-12 животных; по оси абсцисс - время после последней инъекции ГБ-115 и диазепама в часах; по оси ординат - (А) минимальная сила тока, вызывающая стойку у пары крыс; (Б) степень выраженности судорожных реакций в баллах.

При изучении аддиктивного потенциала установлено, что ГБ-115 не изменяет порогов электрической самостимуляции зон награды мозга и не способствует выработке условно-рефлекторной реакции предпочтения/отвращения места в диапазоне анксиолитических и  анальгетических доз, что свидетельствует об отсутствии у дипептидного анксиолитика ГБ-115 первичных и вторичных подкрепляющих свойств, способствующих формированию патологического влечения и развитию лекарственной зависимости.

5. Доклиническая оценка безопасности соединения ГБ-115

  Результаты  исследования токсических эффектов ГБ-115 позволяют заключить, что соединение относится к низко токсическим веществам, при пероральном шестимесячном введении самцам и самкам крыс и кроликов не обладает выраженными токсическими эффектами, не проявляет местнораздражающего действия. Анализ специфических видов токсичности показал, что ГБ-115 не обладает иммунотоксической, аллергенной и мутагенной активностями, не проявляет репротоксических эффектов. Таким образом, совокупность данных оценки токсических эффектов не выявила препятствий для дальнейшей разработки фармакологического препарата  ГБ-115.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предпринятое исcледование направлено на изучение фармакологических свойств соединения ГБ-115, синтезированного на основе физиологически активного нейропептида холецистокинина. В основу рабочей гипотезы разработки положена возможность имитации ряда его эффектов с использованием фармакологически пригодного соединения. В результате выполненных экспериментов впервые выявлена  анксиолитическая активность N-феналканоил-замещенного триптофан-содержащего дипептида (ГБ-115). Полученные данные демонстрируют зависимость  эффекта ГБ-115 от типа реакции на эмоционально-стрессовое воздействие, что характерно для селективных анксиолитиков (Середенин С.Б., 2003). Установлено смещение диапазона анксиолитических доз препарата от 0,006-0,1 мг/кг при внутрибрюшинном введении до 0,1 и  5,0 мг/кг при пероральном использовании. Эти результаты, свидетельствующие о сохранении эффектов при введении препарата внутрь,  подтверждают предположение о возможности использования коротких пептидов для снижения повышенной тревожности (Ашмарин И.П. и соавт., 2005; Kanegawa, et al., 2010) и с предыдущими  фармакокинетическими исследованиями ГБ-115 (Бойко, и соавт., 2007). Имеются основания полагать, что высокая биодоступность устойчивых к эндопептидазам ди-/трипептидов при приеме внутрь определяется их взаимодействием с транспортерами пептидов, например, PEPT1, обеспечивающими их  перемещение через биологические мембраны посредством  протонного градиента и отрицательного мембранного потенциала  (Herrera-Ruiz, 2003). 

  При радиолигандном анализе на культурах клеток установлено, что соединение ГБ-115 обладает уникальным спектром рецепторных взаимодействий, проявляя свойства низкоаффинного антагониста бомбезиновых рецепторов 3-го типа, антагониста холецистокининовых рецепторов 1-го типа и агониста каппа-опиоидных рецепторов. Изучение фармакологической активности ГБ-115 выявило совокупность свойств (анксиолитических, антиалкогольных, антидепрессивных и анальгетических), которые полностью соответствуют данным о физиологической роли обозначенных рецепторных образований.

Лечение заболеваний, связанных с употреблением алкоголя, основано на комбинированных подходах, фармакотерапии, направленной на разные молекулярные мишени. Однако клиническое применение известных психотропных средств не всегда успешно. На современном этапе все большее внимание привлекают новые стратегии, фокусирующиеся на контроле функционирования нейропептидергических систем.

В настоящей  работе показано, что ГБ-115 ослабляет алкогольную мотивацию и снижает повышенную тревожность у инбредных и аутбредных животных  со сформированным влечением к этанолу в условиях алкогольной абстиненции. Имеются данные, что нейропептиды ХЦК и бомбезин угнетают потребление алкоголя у животных с алкогольной зависимостью (Kulkosky, et al., 1987; Kulkosky, et al., 1992; Kulkosky, et al., 1991), а антагонист ХЦК1-рецепторов MK-329 увеличивает объем выпиваемого  алкоголя у крыс (Carr, et al., 1993). Поэтому можно предположить, что  антиалкогольное влияние ГБ-115 опосредуется и реализуется путем модуляции иных механизмов, вовлеченных в процессы адаптации при злоупотреблении психоактивными веществами. Так, из литературы известно, что снижение активности  орексин-1 рецепторов уменьшает потребление этанола в условиях абстиненции у крыс  (Jupp, et al., 2011), при этом действие антагонистов орексин-1 рецепторов преимущественно направлено на снижение потребления этанола у животных с высоким уровнем  его предпочтения (Moorman, et al., 2009). Вместе с тем известно, что блокада бомбезиновых рецепторов снижает активность орексиновой системы (Furutani, et al., 2010). Поэтому  возможно, что ГБ-115, блокируя бомбезиновые рецепторы,  способствует снижению потребления алкоголя. С другой стороны, согласно одной из гипотез, ХЦК-система участвует в формировании влечения к психоактивным веществам (Crespi F., 1998).  Не исключено, что ГБ-115 как антагонист ХЦК1-рецепторов снижает повышенный ХЦК-ергический тон, на фоне которого увеличено потребление этанола.  Судя по литературным данным, агонисты каппа-опиоидных рецепторов не участвуют в регуляции алкогольного поведения  (Kovacs, et al., 2005; Nealey, et al., 2011; Schank, et al., 2012; Valdez, et al.,  2012). Вероятно, что в анксиолитических дозах антиалкогольный эффект ГБ-115 не связан с каппа-рецепторами, поскольку зависимое от последних  анальгетическое действие проявлялось лишь при 100-кратном увеличении дозы.

В наших экспериментах были выявлены анальгетические свойства ГБ-115 при химической стимуляции на модели висцеральной боли, проявляющейся в виде серии лордозов. Поскольку в работе Holland K.L. et al. (1997) доказана  решающая роль стимуляции ХЦК1-рецепторов в medial preoptic nucleus для проявления лордозов  (Holland, et al., 1997 ), логично предположить, что антиноцицептивный эффект ГБ-115 реализуется за счет каппа-рецепторов на периферии и ХЦК1-рецепторов в ЦНС. Гипотеза об  участии блокады  ХЦК1-рецепторов в проявлении анальгетических свойств ГБ-115, возникающей при химической стимуляции ноцицепторов,  согласуется с работами Kania B.F. et al., в которых пептидный антагонист ХЦК1-рецепторов PD 140.548 предотвращал повышение уровня кортизола, адреналина, норадреналина и дофамина в плазме крови  при моделировании висцеральной боли (Kania, et al., 2006).

Обнаруженные антиноцицептивные эффекты ГБ-115 перспективны для дальнейшего фармакологического изучения.  Использование агонистов опиатных рецепторов и антагонистов ХЦК-рецепторов  в рамках би- и мультифункциональных пептидных препаратов рассматривается в литературе как  новое решение для устранения болевого синдрома с минимизацией побочных эффектов опиатов за счет антагонизма  с ХЦК-системой (Agnes, et al., 2008; Schiller, 2010). Вероятно, что антагонисты ХЦК-рецепторов, проявляющие антиноцицептивную активность как при самостоятельном введении, так и при взаимодействии с опиатной системой, могут быть применимы  для купирования боли различного генеза у тревожных и/или депрессивных больных, а также для снижения эффективных доз наркотических анальгетиков.

  Совокупность данных общей фармакологической и токсикологической оценки не выявила препятствий для дальнейшей разработки фармакологического препарата ГБ-115.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлена фармакологическая активность вновь синтезированного дипептидного аналога ХЦК Ph(CH2)5CO-Gly-L-Trp-NH2 (соединения ГБ-115), в спектре которой выявлены анксиолитический, антиалкогольный, анальгетический и антидепрессивный эффекты, основанные на взаимодействии с ХЦК1-,  бомбезиновыми 3-го типа и каппа-опиоидными рецепторами. Уникальный фармакологический профиль и отсутствие побочных действий, характерных для других соединений, применяющихся для лечения тревожных состояний и алкогольных расстройств,  определяют отличие и возможные преимущества перед ними ГБ-115 (таблица 6).

Таблица 6.

Сравнительная характеристика фармакологических эффектов ГБ-115, диазепама, афобазола и селанка

Виды активности	ГБ-115	Диазепам	Афобазол	Селанк
Анксиолитическая -эффективные дозы, мг/кг, в/б -терапевтическая доза, мг -активность при пероральном использовании	+ 0,006-1,0 0,1 +	+ 0,5-2,0 2,0 -10,0 +	+ 0,01-30,0 5,0 +	+ 0,1-3,0 0,3 -
Противосудорожная	-	+	-	-
Миорелаксирующая	-	+	-	-
Седативная	-	+	-	-
Амнестическая	-	+	-	-
Антидепрессивная	+	-	+	+
Анальгетическая	+	-	-	-
Аддиктивный потенциал	-	+	-	-
Потенцирование эффектов  этанола	-	+	-	-
Толерантность и синдром отмены	-	+	-	-
Острая токсичность, LD50, г/кг	Гибель не установлена в дозе  6,0	0,72	1,16	Гибель не установлена в дозе 0,05

Примечание: л+-наличие эффекта, л- -отсутствие эффекта

  Данные настоящей работы, являющейся фармакологическим этапом разработки ГБ-115 в качестве нового психотропного средства, позволяют сделать заключение о целесообразности проведения его клинических исследований в качестве анксиолитического и антиалкогольного лекарственного средства.

ВЫВОДЫ

1.        В ряду замещенных  триптофан-содержащих аналогов ХЦК-4 анксиолитическая активность определяется расстоянием между фенильной и индолильной группами в 13 -связей, L-конфигурацией аминокислотного остатка триптофана и наличием амидной группы в качестве С-концевого заместителя.

2.        Амид-(6-фенилгексаноил)глицил-L-триптофан (соединение ГБ-115) проявляет  анксиолитическую активность в тесте приподнятый крестообразный лабиринт в диапазоне доз от 0,05 до 0,2 мг/кг при внутрибрюшинном введении.

3.         Соединение ГБ-115 в диапазоне микромолярных концентраций является лигандом холецистокининовых рецепторов 1-го типа, бомбезиновых рецепторов 3-го типа  и каппа-опиоидных рецепторов, обладая свойствами агониста каппа-рецепторов, антагониста холецистокининовых рецепторов 1-го типа и бомбезиновых рецепторов 3-го типа.

4.        Соединение ГБ-115 проявляет функциональный антагонизм по отношению к анксиогенному эффекту тетрапептида холецистокинина.  При совместном введении соединений анксиолитическое действие ГБ-115 не проявляется.

5.        Анксиолитическое влияние соединения ГБ-115 селективно по отношению к фенотипу состояния тревоги и реакции страха. На экспериментальной модели повышенной тревоги - мышах линии BALB/c -  при парентеральном введении эффективными являются дозы от 0,006 до 1,0 мг/кг, при введении внутрь Ц  0,1 и 5,0 мг/кг. Дипептид ГБ-115 свободен от нежелательных и побочных действий бензодиазепиновых транквилизаторов.

6.        Соединение ГБ-115 в анксиолитических дозах 0,0125-0,025 мг/кг, в/б,  уменьшает добровольное потребление алкоголя и снижает уровень тревоги при моделировании синдрома отмены этанола.

7.        Соединение ГБ-115 в анксиолитических дозах 0,1 и 0,5 мг/кг, в/б,  купирует индуцированную отменой бензодиазепиновых транквилизаторов тревожную реакцию.

8.        Соединение ГБ-115 в дозах 0,025-0,05 мг/кг, в/б, обладает слабыми антидепрессивными свойствами.

9.        Соединение ГБ-115 в диапазоне доз 0,1-20,0 мг/кг при введении внутрь обладает анальгетическими свойствами, зависимыми от взаимодействия с периферическими опиоидными рецепторами.

10.        Соединение ГБ-115  в анксиолитических дозах не влияет  на функцию дыхания и сердечно-сосудистой системы, не обладает психостимулирующим действием, не нарушает когнитивные процессы, не вызывает патологического пристрастия, не потенцирует острые эффекты алкоголя, не вызывает развития толерантности и синдрома отмены.

11.        Соединение ГБ-115 относится к практически нетоксичным веществам (LD50>6000 мг/кг для мышей, LD50>3500 мг/кг для крыс) и не обнаруживает патологических проявлений в условиях изучения хронической и специфических видов токсичности.

Практические рекомендации

На основании совокупности полученных результатов обоснована целесообразность разработки ГБ-115 в качестве оригинального анксиолитического и антиалкогольного лекарственного средства, определены перспективы дальнейших научно-исследовательских работ по поиску и изучению соединений с анальгетическими свойствами в ряду производных холецистокинина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ 

1. Виглинская,  И.В. Исследование анксиолитического действия нового производного 2-меркаптобензимидазола у MR и MNRA крыс [Текст] / И.В.Виглинская, С.Б.Середенин, .Г.Колик // Эксп. и клин. фармакол. - 1997.- Т.60,  №3. - С.3-5.
2. Виглинская,  И.В. Исследование потребления этанола и антиалкогольных эффектов афобазола у MR и MNRA крыс [Текст] / И.В.Виглинская, С.Б.Середенин, .Г.Колик // Экспер. и клин. фармакол.- 2000.- Т.63, №3. - С.52-54.
3. Колик, Л.Г.  Фармакогенетическое  исследование анксиолитических свойств новых антагонистов холецистокининовых рецепторов  у животных с различным уровнем эмоциональности [Текст] / .Г.Колик, Т.А.Гудашева, С.Б.Середенин //  Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2003.- Т135, №5. - С.519-523.
4. Колик, Л.Г. Генетическая зависимость психотропных эффектов оригинального пептидного антагониста центральных холецистокининовых рецепторов [Текст] / Колик Л.Г., Гудашева Т.А., Середенин С.Б.// Мед. генетика. - 2005. - Т.4,  № 5. - С.206-207.
5. Гудашева, Т.А. Синтез, конформационный анализ и анксиолитическая активность ретропептидных аналогов холецистокинина-4  [Текст] / Т.А.Гудашева, В.П.Лезина, Е.П.Кирьянова, В.С.Троицкая, .Г.Колик, С.Б.Середенин // Хим.-фарм. журнал.  -  2006. - Т.40, №7. - C.367-372.
6. Гудашева, Т.А. Дизайн и синтез дипептидных аналогов холецистокинина-4 с анксиолитическими и анксиогенными свойствами [Текст] / Т.А.Гудашева, Е.П.Кирьянова, Л.Г.Колик, М.А.Константинопольский, С.Б.Середенин // Биоорг. химия. -  2007. - Т.33, №.4. - С.413-420.
7. Колик, Л.Г. Характер проявления антиноцицептивных и анксиолитических свойств соединения ГБ-115 в аспекте взаимодействия холецистокининовой и опиоидергической систем [Текст] / .Г.Колик, В.Н.Жуков, С.Б.Середенин //  Экспер. и клин.  фармакол. - 2007.- T.70, №2. - С.8-11.
8. Колик, Л.Г. Влияние соединения ГБ-115 на индуцированную морфином анальгезию [Текст] / Л.Г.Колик, В.Н.Жуков, С.Б.Середенин // Бюлл. экспер.  биол. и мед.  - 2007.- Т.143, №6. - С.645-647.
9. Шипаева, Е.В.  Иммуннокорригирующие свойства дипептида ГБ-115 [Текст] / Е.В.Шипаева, Л.П.Коваленко, С.Хайдуков, .Г.Колик и др. //  Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2008.- Т.145, №5. - С.548-551.
10. Сорокина,  А.В. Доклиническое исследование безопасности дипептидного соединения ГБ-115 [Текст] / А.В.Сорокина, С.В.Алексеева,  Е.П.Немова,  Л.П.КоваленкоЕ,  .Г.Колик и др, // Экспер. и клин. фармакол. - 2010.-Т.73, №6. - С.29-32.
11. Шипаева Е.В. Исследование противовоспалительных свойств глицинсодержащего ретропептидного аналога холецистокинина ГБ-115 [Текст] / Е.В.Шипаева, Л.П.Коваленко, А.В.Сорокина, Г.И.КовалевЕ, .Г.Колик и др. // Бюлл. экспер. биол. и мед. -  2010.- Т.150, №11. - С.529-532.
12. Колик, Л.Г. Экспериментальное изучение антидепрессивных свойств ГБ-115 [Текст] / .Г.Колик // Экспер. и клин. фармакол. -  2011.-Т.74, №1. - C.3-5.
13. Колик, Л.Г. Отсутствие толерантности и синдрома отмены у нового L-триптофан-содержащего дипептидного анксиолитика ГБ-115 [Текст] / .Г.Колик, Т.Л.Гарибова, С.А.Литвинова,  А.Л.Кузнецова и др. // Вестник РАМН. - 2011. - №7.- С.37-42.
14. Колик, Л.Г. Влияния дипептида ГБ-115  на тревожную реакцию у крыс при моделировании синдрома отмены бензодиазепинов [Текст] / .Г.Колик, И.А.Кадников, В.Н.Жуков, Т.А.Гудашева,  С.Б.Середенин // Экспериментальная и клиническая фармакология. -  2011.- Т.74, №10 . - C.52-56. 
15. Колик, Л.Г. Экспериментальное изучение антиноцицептивных свойств дипептида ГБ-115 при химической и термической  стимуляции  [Текст] /  Л.Г.Колик, Т.А.Гудашева, С.Б.Середенин // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2012.- Т.153, №4 . - С.455-59.
16. Колик, Л.Г. Об участии холецистокининовой системы в реализации анксиолитических эффектов дипептида ГБ-115 [Текст] /  .Г.Колик, Т.А.Гудашева, С.Б.Середенин // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2012.- Т.153, №6 . - С.28-32.

Тезисы в  сборниках материалов конференций

17. Viglinskaya, I.V. Experimental evaluation of alcohol dependence development. Efficacy of alcohol-induced disturbances pharmacological treatment [Текст] / I.V.Viglinskaya, S.B.Seredenin, L.G.Kolik // Biological Psychiatry. - 1997.- V.42, №1, Suppl.1.- P.32.
18. Kolik, L. The pattern of alcohol drinking in Russian Maudsley Reactive and Maudsley Non-Reactive rats [Текст] / L.Kolik // Abstract book from 4th Morzine meeting. - France,  Morzine, 2000. - P.18.
19. Kolik, L. Psychopharmacological properties of the novel anxiolytic antagonis CCK2 receptors - GV150013 [Текст] / L.Kolik, G.Gaviraghi, D.Triest, E.Ratti // Abstract book of the 3-d International Conference УBiological Basis of Individual Sensitivity to psychotropic DrugsФ.- Russia, Suzdal, 2001. - M., 2001. - P.233.
20. Колик, Л.Г.  Изучение анксиолитических свойств антагониста ССК-2 рецепторов [Текст] / .Г.Колик, Т.А.Гудашева, С.Б.Середенин // Тез. Докладов  международной конференции Новые лекарственные средства: синтез, технология, фармакология, клиника. - Белоруссия, Минск, 2001. - Минк, 2001. - С.71.
21. Kolik, L. CCK-2 receptor antagonists effects on the behavior of inbred animals with different levels of emotionality [Текст] / L.Kolik // Abstract book from 1t Annual Meeting УPharmacogenetics in PsychiatryФ. - USA, New York, 2002. - NY, 2002. - P.25.
22. Philippova, E. Design of novel dipeptides with anxiolytic activity on the base of CCK-4 [Текст] / E.Philippova, T.Gudasheva, V.Briling, L.Kolik, M.Konstantinopolsky, S.B.Seredenin // Abstract book from 27th European Peptide Symposium. -  Italy, Sorrento, 2002. - P.508-509.
23. Kolik, L. Genetic dependence of CCK2 antagonists effects [Текст] / L.Kolik, T. Gudasheva, S.Seredenin // Abstract book from the 14th World Congress of Pharmacology, San Francisco. - USA, San Francisco, 2002. - P.489
24. Kolik, L. Experimental study of the genetic dependence of CCK-2 antagonists and agonists psychotropic effects [Текст] / L. Kolik, T. Gudasheva, S.Seredenin // Abstract book from 2d Annual Meeting УPharmacogenetics in PsychiatryФ. - USA, New York, 2003. - NY, 2003. - P.28.
25. Колик, Л.Г.  Экспериментальное изучение психофармакологических свойств пептидного антагониста центральных холецистокининовых рецепторов [Текст] / .Г.Колик, Т.А.Гудашева, С.Б.Середенин // Тез. Докладов 2-го Съезда Российского научного общества фармакологов. - Россия, Москва, 2003. -  М., 2003. - С.57.
26. Гудашева, Т. Ретропептидные аналоги холецистокинина-4 с селективной анксиолитической активностью [Текст] / Т.Гудашева, .Колик, С.Середенин // Тез. Докладов научной конференции Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты. - Россия, Москва, 2005. - М., 2003. - С.90.
27. Kolik, L. Genetic dependence of CCK-2 antagonists and agonists psychotropic effects [Текст] / L. Kolik, T. Gudasheva, S.Seredenin // Eur. Neuropsychopharmacology. - 2005. - V.15 (Suppl.2). - S146.
28. KirТyanova, E.P. Genetic dependence of CCK-2 antagonists and agonists psychotropic effects [Текст] / E.P.KirТyanova, L.G. Kolik, T.A. Gudasheva // Eur. Neuropsychopharmacology. - 2005. - V.15 (Suppl.2). - S152.
29. Колик, Л.Г. Психофармакологические свойства нового пептидного антагониста центральных холецистокининовых рецепторов [Текст] / Колик Л.Г., Гудашева Т.А., Середенин С.Б.// Тез. Докладов 2-го Российского симпозиума  по химия и биология пептидов. -  Россия, Санкт-Петербург, 2005. - СПб., 2005. - С.67.
30. Kolik, L.G.The antagonism of ethanol and benzodiazepine withdrawal effects by GB-115, a compound with selective аnxiolytic properties [Текст] / L.G.Kolik, T.A.Gudasheva, S.B.Seredenin // Abstract book from 5th Annual Meeting УPharmacogenetics in PsychiatryФ. - USA, New York, 2006. - NY, 2006. - P.23.
31. Кирьянова, Е.П.  Пространственно ограниченные аналоги селективного анксиолитика ГБ-115 и его предполагаемая биологически активная конформация [Текст] / Е.П.Кирьянова, .Г.Колик, Т.А.Гудашева // Тез. Докладов IV Международной научной конференции Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам. - Россия, Москва, 2006. -  М., 2006. - C.112.
32. Колик, Л.Г. Фармакогенетическая оценка эффективности антагонистов ХЦК-2 рецепторов [Текст] / .Г.Колик, Т.А.Гудашева, С.Б.Середенин // Тез. Докладов 1V Международной научной конференции Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам. - Россия, Москва, 2006. -  М., 2006. - C.113.
33. Kolik, L.G. Enhancement of antinociceptive effect of morphine by GB-115, a novel short peptide antagonist of CCK2 receptors [Текст] / L.G.Kolik, V.N.Zhukov, S.B. Seredenin // 15th World Congress of pharmacology, China, Beijing,  2006. - Beijing, 2006. - P.85.
34. Бойко, С.С. Доклиническое изучение фармакокинетики нового дипептидного селективного анксиолитика ГБ-115 [Текст] / С.С.Бойко, В.П.Жердев, Г.В.Колыванов, Т.А.Гудашева, .Г.Колик // Тез. Докладов 3-го Российского конгресса фармакологов. - Россия,  Санкт-Петербург,  2007. - С.1615-1616.
35. Вичужанин, Е.В. Дибензоазепиновые аналоги холецистокинина-4 с анксиолитической активностью [Текст] / Е.В. Вичужанин, Е.П.Кирьянова, .Г.Колик, Т.А.Гудашева // Тез. Докладов  3-го Съезда российских фармакологов. - Санкт-Петербург, Россия, 2007. -  СПб., 2007. - С.1640-1641.
36. Гудашева, Т.А. Дипептидные аналоги холецистокинин-4 как перспективная группа селективных анксиолитиков [Текст]  / Т.А.Гудашева,  .Г.Колик, С.Б.Середенин // Тез. Докладов  3-го Съезда российских фармакологов. - Россия,  Санкт-Петербург, 2007. -  СПб., 2007. - С.1670.
37. Кирьянова, Е.П. Биологически активная конформация селективного анксиолитика ГБ-115, дипептидного ретроаналога ХЦК4  [Текст] / Е.П.Кирьянова, В.П.Лезина, .Г.Колик, М.А.Константинопольский и др, // Тез. Докладов 3-го Съезда российских фармакологов. - Россия,  Санкт-Петербург,  2007. - СПб., 2007. - С.1723.
38. Колик, Л.Г.  Экспериментальное изучение влияния антагонистов центральных ХЦК2-рецепторов на лекарственную зависимость [Текст] / .Г.Колик, Т.А.Гудашева // Тез. Докладов  3-го Съезда российских фармакологов. - Россия,  Санкт-Петербург, 2007. - СПб., 2007. -  С.1737.
39. Kolik, L.G. The enhancement of antinociceptive effect of morphine by L-Trp-containing analogue of endogenous cholecystokinin CCK4 [Текст] / L.G.Kolik, V.N.Zhukov, S.B.Seredenin // Abstract book of International Narcotic Research Conference. - Germany, Berlin, 2007. - P.78.
40. Kolik, L. Pharmacogenetic study of the novel dipeptide anxiolytic GB-115 targeted on УfreezingФ phenotype of emotional stress reaction [Текст] / L.Kolik, T.Gudasheva, S.Seredenin //  Abstract book from 7th Annual Meeting УPharmacogenetics in PsychiatryФ. - USA, New York, 2008. Ц  NY, 2008. - C.35.
41. Kolik, L.G. Psychopharmacological study of the novel dipeptide аnxiolytic GB-115 in animals with different phenotype of emotional stress reaction [Текст] / L.G.Kolik, T.A.Gudasheva, S.B. Seredenin // Int.J.Neuropsychopharmacology. Abstracts from the XXVI CINP Congress. - Germany, Munich, 2008. -  P.274.
42. Kolik,  L.G. Modulation of anxiety-like  behaviors by dipeptide  analogue of endogenous cholecystokinin depends on emotional stress reaction phenotype [Текст] / L.G.Kolik,  K.S.Chekina,  T.A.Gudasheva, S.B. Seredenin //  Abstract book of 8th Annual Meeting УPharmacogenetics in PsychiatryФ. - USA,  New York, 2009. - NY, 2009. - P.34.
43. Kolik, L.G. New perspectives: atypical anxiolytics block the development of ethanol -and benzodiazepine withdrawal-induced anxiety in experiment [Текст] / L.G.Kolik, I.A.Kadnikov, T.L.Garibova, T.A.Gudasheva et al. // Abstracts from the 9th World Congress of Biological Psychiatry. - France, Paris, 2009. - P.406.
44. Колик, Л.Г. Влияние ГБ-115 на индуцированную отменой диазепама стрессовую реакцию у крыс [Текст] / .Г.Колик, И.А.Кадников, С.Б.Середенин // Тез. Докладов 1-го Российского конгресса по наркологии. -  Россия, Москва, 2009. -  М., 2009. - C.31-32.
45. Кирьянова,  Е.П. Исследования биологически активной конформации ГБ-115, дипептидного миметика холецистокинина-4 [Текст] / Е.П.Кирьянова, Т.А.Гудашева, .Г.Колик // Экспер. и клин. фармакол. - 2010. - №73. Прил. - с.51.
46. Колик, Л.Г. Влияние афобазола на содержание катехоламинов и их метаболитов в структурах мозга крыс в условиях отмены диазепама  [Текст] / .Г.Колик, И.А.Кадников // Экспер. и клин. фармакол. - 2010. - №73. Прил. - с.51.
47. Колик, Л.Г. Влияние атипичного анксиолитика ГБ-115 на проявления тревожной реакции у крыс после отмены диазепама [Текст] / .Г.Колик, И.А.Кадников // Экспер. и клин. фармакол. - 2010. - №73.Прил. - С.51.
48. Колик, Л.Г. Экспериментальная оценка антидепрессивных свойств  ГБ-115 [Текст] / .Г.Колик // Экспер. и клин. фармакол. - 2010. - №73.Прил. - С.51.
49. Колик, Л.Г. Перспективы использования дипептидного анксиолитика ГБ-115 для купирования повышенной тревожности при отмене диазепама. Экспериментальные исследования [Текст] / .Г.Колик, И.А.Кадников, Т.А.Гудашева, С.Б.Середенин // Тез. Докладов XVIII Российского национального конгресса Человек и лекарство. -  Россия, Москва, 2011. - М., 2011. - С.450.
50. Козловский, И.И. Сравнительное изучение антистрессорного действия пептидных производных и фрагментов холецистокинина и тафтсина на высоко-и низкотревожных мышах в тесте лоткрытое поле [Текст] / И.И.Козловский, .Г.Колик // Тез. Докладов VII Международного междисциплинарного конгресса Нейронаука для медицины и психологии. - Украина, Крым, Судак,  2011. -  М., 2011. - С.220-221.
51. Kolik, L.G. Dipeptide anxiolytic GB-115: new receptor targets [Текст] / L.G.Kolik, T.A.Gudasheva, S.B. Seredenin // Eur. Neuropsychopharmacology. - 2011. - V.21 (Suppl.2). - S146-147.
52. Kolik, L.G. Dipeptide anxiolytic GB-115: new receptor targets [Текст] / L.G.Kolik, T.A.Gudasheva, S.B. Seredenin // Abstracts of 24th ECNP Meeting. -  France, Paris, 2011. - Eur. Neuropsychopharmacology. - СD-ROM.

Патенты

53. Пат. РФ №2227144 С1 от 15.11.2001. Замещенные триптофан-содержащие дипептиды с холецистокининонегативной или холецистокининопозитивной активностью.  Середенин С.Б., Т.А.Гудашева, Н.И.Зайцева, Л.Г.Колик, В.К.Брилинг, М.А.Константинопольский.  Опубл.  20.04.2004; Бюл. №11.
54. Пат. РФ №2429874  С1 от 16.04.2010г. Анальгетическое средство для купирования висцеральной боли. Середенин С.Б., Колик Л.Г., Жуков В.Н. Опубл.  27.09.2011; Бюл. №27.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю искреннюю благодарность и глубокую признательность  к.м.н. В.Н.Жукову, И.А.Кадникову (лаборатория фармакогенетики ФГБУ НИИ фармакологии имени В.В.Закусова РАМН под руководством академика РАН и РАМН, д.м.н., проф. С.Б.Середенина), д.б.н. С.С.Трофимову (лаборатория психофармакологии ФГБУ НИИ фармакологии имени В.В.Закусова РАМН под руководством д.б.н., проф. Т.А.Ворониной),  зав. лаб. экспериментальной фармакологии аддиктивных состояний СПбГМУ им.И.П.Павлова, к.б.н. О.А.Драволиной, д.б.н. И.Б.Цорину (отдел химии ФГБУ НИИ фармакологии имени В.В.Закусова РАМН под руководством чл.-корр. РАМН, д.б.н, проф. Т.А.Гудашевой), д.б.н., проф.Т.Л.Гарибовой (лаборатория психофармакологии  ФГБУ НИИ фармакологии имени В.В.Закусова РАМН под руководством д.б.н., проф. Т.А.Ворониной),  руководителю отдела лекарственной токсикологии ФГБУ НИИ фармакологии имени В.В.Закусова РАМН, член-корреспонденту РАМН, д.м.н., проф. А.Д.Дурневу за  проведение совместных исследований, обсуждение и анализ результатов, подготовку научных публикаций.

Выражаю искреннюю благодарность Л.И.Белоусову (начальнику отдела разработки системного программного обеспечения ООО БФТ) за техническую поддержку в оформлении библиографии.

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

КОР - каппа-опиоидные рецепторы

ОП - тест лоткрытое поле

ПКЛ - тест приподнятый крестообразный лабиринт

ХЦК - холецистокинин

ХЦК-4 - С-концевой тетрапептид холецистокинина

ХЦК1 рецепторы - периферические рецепторы холецистокинина

ХЦК2 рецепторы - лцентральные рецепторы холецистокинина

bb3Ц орфановые рецепторы бомбезина 3-го типа

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по медицине