Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
ГАЕВА Анна Вячеславовна
РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К ГЕНОТИПИРОВАНИЮ ШТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА
03.02.03 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Саратов - 2012
Работа выполнена в ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт Микроб Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Научный консультант:
Кандидат медицинских наук Булгакова Елена Германовна Официальные оппоненты Щербаков Анатолий Анисимович доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.
Вавилова Минсельхоза Российской Федерации, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии Замараев Валерий Семенович доктор медицинских наук, профессор, ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, главный научный сотрудник лаборатории функциональной геномики
Ведущая организация: ФКУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ФГУЗ Иркутский ордена Трудового
Защита состоится л____________________2012 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт Микроб (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт Микроб
Автореферат разослан л___________________2012 г.
Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Чума - одна из наиболее опасных инфекционных болезней человека. На протяжении многих веков чумной микроб был причиной массовых эпидемий.
Документальные подтверждения о массовых поражениях людей во многих странах мира датируются с V века до нашей эры. И в настоящее время чума представляет реальную угрозу, так как является природно-очаговым заболеванием и периодически вызывает эпизоотии в 42 природных очагах Российской Федерации и ближнего зарубежья [Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., 2004], а также в других странах мира. По данным ВОЗ в мире ежегодно регистрируется более 2000 случаев заболеваний человека чумой [Plague, WHO, 2009].
Возбудитель чумы обладает высокой фенотипической и генетической изменчивостью, отмеченной рядом исследователей, как для штаммов из разных природных очагов, так и для штаммов, циркулирующих в одном природном очаге [Anisimov A.P. et al., 2004].
Зарубежные исследователи для внутривидовой дифференциации штаммов чумного микроба используют классификацию, предложенную R. Devignat (1951).
Классификация основана на биохимических различиях (способности к ферментации глицерина, редукции нитратов и окислению аммиака) и историкогеографическом происхождении штаммов. Согласно данной классификации, штаммы чумного микроба распределяют на три биовара: antiqua (античный), medievalis (средневековый) и orientalis (восточный). Эта классификация не учитывает разнообразие штаммов, выделяемых на территориях Центральной Азии, Кавказа, Западной Сибири, Африки. Об этом свидетельствуют опубликованные в последние годы сведения о рамнозопозитивных слабовирулентных штаммах из природных очагов полевочьего типа Китая, которые D. Zhou et al. (2004) выделили в новый биовар microtus, а также ряд публикаций отечественных ученых, описывающих разные подвиды чумного микроба из природных очагов на территории России и ближнего зарубежья [Тимофеева Л.А. с соавт., 1974; Елкин Ю.М. с соавт., 1977; Логачев Л.И., 1979; Вершинина Т.И., 1986].
Классификация, принятая в 1985 г. на Всесоюзном совещании по таксономии чумного микроба, основана на фенотипических свойствах, вирулентности по отношению к лабораторным животным и ландшафтноЦгеографической приуроченности штаммов. Согласно этой классификации все штаммы Yersinia pestis подразделяют на пять подвидов - основной и 4 неосновных (кавказский, алтайский, гиссарский и улэгейский) подвида. Штаммы основного подвида с высоким эпидемическим потенциалом вирулентны как для диких, так и для лабораторных животных. Фенотипические характеристики штаммов основного подвида, выделяемых в разных природных очагах, различаются и соответствуют характеристикам какого-либо из биоваров: antiqua, medievalis, orientalis. Штаммы неосновных подвидов избирательно вирулентны для лабораторных животных, их эпидемическая значимость ниже, чем у штаммов основного подвида.
До сих пор широко используются методы индикации, идентификации, типирования чумного микроба, основанные на определении различных фенотипических свойств. Нестабильность фенотипа затрудняет интерпретацию результатов, что может привести к ошибочным выводам. Бурное развитие молекулярной генетики в последнее время привело к разработке приемов детекции, идентификации и типирования микроорганизмов, основанных на анализе структуры генома. Использование более стабильной основы позволит повысить точность индикации, идентификации и типирования штаммов чумного микроба и усовершенствовать фенотипические схемы классификации.
В то же время, каждый молекулярноЦгенетический подход обладает разной информативностью и еще не описан единственный метод, позволяющий эффективно проводить типирование и служить основой для совершенствования таксономии чумного микроба. Поэтому возникает необходимость в комплексном подходе к решению данной проблемы.
Существуют разные мнения по поводу алгоритмов типирования штаммов чумного микроба. Ю.А. Попов с соавт. (2009), проанализировав материалы по генетическому типированию предложили комплексный алгоритм из четырех этапов генодиагностического анализа штаммов Y. pestis: 1-й этап - определение видовой принадлежности штамма (дифференциация чумного микроба от близкородственных иерсиний) путем проведения моно - и мультилокусных ПЦР и плазмидного скрининга; 2-й этап - выявление и определение распространенности генов, ассоциированных с вирулентностью возбудителя с помощью моно- и мультилокусных ПЦР; 3-й этап - выяснение параметров структурной изменчивости генов вирулентности у штаммов Y. pestis различного происхождения методом секвенирования; 4-й этап - определение принадлежности штаммов к конкретному подвиду, биовару, природному очагу посредством моно - и мультилокусных ПЦР, мультилокусного VNTR анализа и секвенирования генов, кодирующих дифференциальные признаки.
Для повышения эффективности этого алгоритма важен правильный выбор ДНК - мишеней, набор которых может пополняться по мере их выявления и изучения. На основе анализа литературных сведений можно говорить о перспективности сочетания таких высокодискриминирующих методов, как метод вычитающего рестрикционного фингерпринтинга (ВРФ), основанный на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов ДНК [Terletski V. et al., 2003, 2004], и метод мультилокусного VNTR анализа (ПЦР - VNTR, сиквенсЦVNTR) [Сучков И. Ю. с соавт., 2002, 2004; Pourcel C. et al., 2004; Lowell J. et al., 2005; Li Y.
et al., 2009]. ВРФ еще не применялся для типирования штаммов чумного микроба, а варианты VNTR анализа, апробированные на штаммах чумного микроба, обладают либо излишней (по-штаммовой), либо недостаточной (объединяющей штаммы разных подвидов в одну группу) дискриминирующей способностью.
Поэтому выбор ДНК мишеней с тандемными повторами, определяющими подвидовую и очаговую принадлежность штаммов весьма актуален. Сочетание методов, позволяющих судить о внутривидовых вариациях всего генома (вычитающий рестрикционный фингерпринтинг) и отдельных его локусов (VNTR анализ), позволит наиболее эффективно оценивать таксономическое положение изучаемых штаммов чумного микроба, выявлять их эволюционные связи, проводить паспортизацию штаммов.
Цель работы - разработка методических подходов для генетического типирования штаммов чумного микроба на основе VNTR анализа и метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга.
Задачи исследования:
1. Охарактеризовать штаммы чумного микроба, циркулирующие в природных очагах стран СНГ и Монголии, по наличию основных детерминант вирулентности и изучить их фенотипическое проявление. Подобрать штаммы, полноценные по составу детерминант вирулентности, на которых будет изучаться эффективность методов генетического типирования.
2. Выбрать потенциальные пары ферментов для проведения вычитающего рестрикционного анализа штаммов чумного микроба и вирулентных штаммов псевдотуберкулезного микроба. Проверить эффективность выбранных пар рестриктаз на референтных штаммах.
3. Получить фингерпринты вычитающей рестрикции репрезентативной выборки штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Провести компьютерный анализ данных вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и оценить эффективность дифференциации штаммов чумного микроба из разных очагов и вирулентных штаммов возбудителя псевдотуберкулеза.
4. Выявить новые вариабельные тандемные нуклеотидные повторы в геноме Y. pestis. Подобрать праймеры к обнаруженным областям с тандемными повторами и оптимизировать параметры амплификации этих областей.
5. Изучить вариабельность выявленных VNTR областей генома штаммов Y.
pestis разного происхождения и вирулентных штаммов Y. pseudotuberculosis.
Определить нуклеотидную последовательность фрагментов ДНК, содержащих вариабельные тандемные повторы.
6. Разработать способ VNTR-ПЦР дифференциации штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременным внутривидовым типированием штаммов чумного микроба. Разработать методический подход к мультиспейсерному сиквенс типированию для идентификации и генотипирования штаммов чумного и псевдотуберкулезного микроба.
7. Оценить эффективность использования метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга, разработанных мультиспейсерного сиквенс типирования и VNTR-ПЦР для дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов, генетического типирования, усовершенствования схем классификации чумного микроба и эпидемиологического анализа штаммов чумного микроба разного географического происхождения.
Научная новизна работы Получена характеристика штаммов Y. pestis из природных очагов стран СНГ и Монголии по особенностям фенотипа и распространенности детерминант вирулентности - области пигментации и плазмиды кальцийзависимости. Показано, что в некоторых природных очагах (Дагестанский равнинно-предгорный, Зауральский степной и Волго-Уральский песчаный) циркулируют группы штаммов с повышенной частотой утраты детерминант вирулентности как хромосомной, так и плазмидной локализации.
Впервые получены молекулярные портреты штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов с помощью метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и показана корреляция фингерпринтов штаммов чумного микроба с их подвидовой принадлежностью, а в ряде случаев - с очаговой принадлежностью.
Впервые на основе VNTR областей межгенных пространств hutGЦYPO1967, YPO1967ЦaruE, YPO1961ЦYPO1960 разработан способ мультиспейсерного сиквенс типирования штаммов чумного микроба, позволяющий проводить дифференциацию штаммов чумного и псевдотуберкулезного микроба и определять подвидовую, очаговую и мезоочаговую принадлежность штаммов чумного микроба.
Показано, что разработанный способ мультиспейсерного сиквенс типирования эффективен при типировании штаммов псевдотуберкулезного микроба.
Теоретически обосновано и экспериментально установлено, что усовершенствование классификационных систем, основанных на фенотипических характеристиках, не всегда позволяющих четко определить принадлежность штаммов чумного микроба к очагу и мезоочагу, возможно на основе комплексного использования методов мультиспейсерного сиквенс типирования и вычитающего рестрикционного фингерпринтинга.
Удачный выбор ДНК-мишеней и молекулярно-генетических методик, основанных на мультиспейсерном сиквенс типировании и вычитающем рестрикционном фингерпринтинге, позволили охарактеризовать особенности генетической структуры таласских штаммов чумного микроба. Определено, что генотипы таласских штаммов имеют уникальную генетическую формулу по строению вариабельных участков hutGЦYPO1967 и YPO1961ЦYPO1960. В ходе кластерного анализа методом попарного невзвешенного группирования с арифметическим усреднением (UPGMA) определена наибольшая близость штаммов таласской группы к штаммам неосновных подвидов.
По результатам работы получен патент на изобретение, зарегистрированное в государственном реестре интеллектуальной собственности Российской Федерации:
Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулёзного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба №2332464.
Практическая значимость работы Разработана VNTRЦПЦР, использующая в качестве ДНКЦмишени hutG - YPO1967 область, для дифференциации штаммов чумного и псевдотуберкулезного микроба и одновременного внутривидового типирования штаммов чумного микроба. Очевидно, что использование данного метода в практической работе учреждений Роспотребнадзора имеет экономическое преимущество.
По результатам работы составлены методические рекомендации: Выделение и очистка геномной ДНК Yersinia pestis, пригодной для тонких молекулярнобиологических экспериментов, Способ межвидовой и внутривидовой дифференциации патогенных иерсиний (Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis) с определением их потенциальной вирулентности, одобренные Учёным советом и утвержденные директором Российского научно-исследовательского противочумного института Микроб (протоколы № 2 от 17. 04. 2007 г., № 7 от 12.
12. 2008 г., соответственно).
Положения, выносимые на защиту:
1. Для оценки эффективности методов генетического типирования создана референс-панель штаммов чумного микроба, отобранных из различных ландшафтно-географических областей, с полным набором детерминант вирулентности.
2. Метод вычитающего рестрикционного фингерпринтинга эффективен для внутривидового типирования штаммов чумного микроба. Подобранная комбинация эндонуклеаз рестрикции EcoRI - PauI позволяет получать молекулярные портреты штаммов чумного микроба, отражающие их подвидовую и очаговую принадлежность.
3. Мультиспейсерное сиквенс типирование на основе трех VNTR областей хромосомы: hutGЦYPO1967, YPO1967ЦaruE, YPO1961ЦYPO1960 позволяет дифференцировать штаммы чумного и псевдотуберкулезного микроба, определять подвидовую, очаговую и мезоочаговую принадлежность штаммов чумного микроба.
4. VNTR - ПЦР с праймерами TAN1ЦTAN2 дифференцирует штаммы чумного и псевдотуберкулезного микроба, а также штаммы чумного микроба, принадлежащие к разным подвидам и циркулирующие в разных природных очагах.
5. Кластеры генотипов, полученные методами вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и мультиспейсерного сиквенс типирования, полностью коррелируют с существующей подвидовой классификацией чумного микроба и показывают неоднородность большинства подвидов в соответствии с очаговой принадлежностью.
6. Генотипы штаммов чумного микроба таласской группы, полученные методами вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и мультиспейсерного сиквенс типирования, имеют существенные отличия от генотипов штаммов известных подвидов, что позволяет выделить их в отдельный внутривидовой таксон.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на следующих конференциях: II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием Инфекции, обусловленные иерсиниями (Санкт - Петербург, 2006); IX съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); X Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье" (СанктЦПетербург, 2007); Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием Генодиагностика инфекционных заболеваний - 2007 (Молекулярная диагностика - 2007 Москва, 2007), Международная школа - конференция Генетика микроорганизмов и биотехнология (посвященная 40-летию создания ГосНИИгенетика, Москва - Пущино, 2008), XII Всероссийская медико - биологическая научная конференция молодых исследователей Фундаментальная наука и клиническая медицина (СанктЦПетербург, 2009). Так же результаты исследования были представлены и доложены на ежегодных итоговых конференциях РосНИПЧИ Микроб (Саратов, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009 гг.).
Публикации По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из которых опубликованы в рекомендованных ВАК РФ изданиях.
Структура и объем диссертации Диссертация представлена на 173 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, семи глав собственных исследований (в том числе, одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 21 рисунком.
Библиографический указатель содержит 163 источника, из них 51 отечественная и 112 зарубежных работ.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы. Работа выполнена на 214 штаммах Yersinia pestis и 68 штаммах Yersinia pseudotuberculosis (Государственная коллекция патогенных бактерий ФГУЗ РосНИПЧИ Микроб). Для работы были отобраны штаммы основного, алтайского, гиссарского, кавказского, улэгейского подвидов и таласской группы (в соответствии с классификацией, принятой на Совещании по таксономии и номенклатуре чумного микроба в Саратове, 1985 г.) из соответствующих природных очагов чумы. Все исследования на штаммах чумного и псевдотуберкулезного микробов проводились в соответствии с требованиями Санитарных правил 1.3.1285-03 Безопасность работы с микроорганизмами IЦII групп патогенности (опасности) и Санитарных правил 1.3.2322Ц08 Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней.
Методы.
Микробиологические методы Фенотипические свойства штаммов определяли в соответствии с рекомендациями руководства Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней (2009).
Признак пигментации (Hms) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов определяли, высевая взвесь 18-часовой агаровой культуры исследуемого штамма на поверхность полусинтетической среды с Конго красным (среда Hmsd).
Выделение геномной ДНК проводили лизоцим - фенольным методом с некоторыми модификациями и дополнениями [Terletski V. et al.,2003].
Генетические методы Скрининг плазмидной ДНК осуществляли по методике Kado C. и Liu S.-T.
(1981).
Рестрикционный анализ осуществляли в соответствии с рекомендациями Маниатиса Т. с соавт. (1984). Для генетического типирования штаммов методом ВРФ и получения маркеров использовали эндонуклеазы рестрикции фирмы MBI Fermentas (Литва).
Вычитающий рестрикционный фингерпринтинг проводили согласно процедуре, описанной Terletski V. et al. (2003). Подбор пар ферментов рестрикции проводили с помощью компьютерной программы Gene Runner (V.3.00).
Определение количества сайтов узнавания для ферментов вычитания проводили на известных нуклеотидных последовательностях геномов штаммов чумного микроба биовара Orientalis (CO92, AL 590842), биовара Medievalis (KIM, AE 009952) и псевдотуберкулезного микроба IP32953 (NC_006155) представленных в базе данных NCBI GenBank.
Приготовление проб ДНК проводили согласно методическим указаниям 1.3.2569-09. Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности (Москва, 2009).
Анализ геномов бактерий проводили с использованием нуклеотидных последовательностей генетической базы данных NCBI GenBank, программы Mega 4.0, алгоритма BLAST. Подбор праймеров осуществляли с помощью программы PrimerExpress. Праймеры синтезированы фирмами Литех, Биоссет (Россия).
ПЦР проводили в микропробирках объемом 0,6 мл на программируемых термоциклерах Терцик МС 2 (ДНК-технология, Россия) и БИС - 2 (Вектор, Россия).
Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 1 - 3 % агарозном или 6% полиакриламидном гелях. Для документирования полученных результатов гели сканировали с помощью системы GelDoc 2000 (лBioRad, США).
Определение нуклеотидной последовательности ПЦР-образцов проводили на генетическом анализаторе модели УCEQ 8000Ф (Beckman Coulter, США). В работе использовали необходимый набор реагентов и расходных материалов согласно руководству к прибору, методикам подготовки проб и постановки ПЦР с УDTCS Quick Start KitФ. Для проведения секвенирования и обработки полученных результатов использовалось программное обеспечение УCEQ 8000 Series Genetic Analysis System Software v. 9.0Ф, УMEGA 4.0Ф.
Компьютерно - математические методы обработки экспериментальных данных.
Для обработки графических данных ВРФ анализа и кластеризации штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов использовали программу Quantity One v 4.5. (лBioRad, США). Для кластеризации штаммов чумного микроба с учетом полиморфизма аллелей исследованных трех VNTR областей использовали программу Mega 4.0. Группирование штаммов и построение дендрограмм проводили при помощи невзвешенного парноЦгруппового метода (UPGMA).
Степень вариабельности локуса оценивали определением индекса разнообразия Нея (Nei`s Diversity Index, Di) [Adair D.M. et al., 2000]. Оценку разрешающей силы системы типирования (Discriminating Power, D) производили по формуле, определяющей индекс Симпсона [Hunter P., Gaston M., 1988].
Результаты исследований Для определения эффективности методов молекулярного типирования нами подобрана и охарактеризована коллекция штаммов чумного микроба по признакам, ассоциированным с вирулентностью: пигментсорбции, зависимости роста от ионов Ca2+, а также чувствительности к пестицину. Набор из 214 штаммов, циркулирующих в 39 природных очагах стран СНГ и 4 аймаках Монголии, включает практически все разнообразие штаммов чумного микроба, встречающихся на обозначенных территориях, а потому может быть использован при определении эффективности методов молекулярного типирования. Изученные штаммы неосновных подвидов, а также таласской группы проявляют высокую стабильность сохранения признаков, связанных с вирулентностью. Лишь небольшое количество штаммов неосновных подвидов утратило плазмиду кальцийзависимости. Штаммы основного подвида из разных природных очагов проявляют значительную разницу в стабильности сохранения признаков, связанных с вирулентностью и плазмидного состава. Выявлены природные очаги чумы (Дагестанский равнинно-предгорный, Зауральский степной, ВолгоУральский песчаный), в которых циркулируют группы штаммов с повышенной частотой утраты детерминант вирулентности (области пигментации и плазмидных репликонов).
Типирование патогенных иерсиний методом вычитающего рестрикционного фингерпринтинга (ВРФ) Вычитающий рестрикционный фингерпринтинг выбран нами из группы методов генетического типирования, основанных на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов, как наиболее удобный для оценки внутривидового геномного полиморфизма штаммов (высокая разрешающая способность, воспроизводимость, относительно низкая стоимость). Существенным моментом в данном методе генетического типирования является подбор комбинации эндонуклеаз рестрикции, которая позволит получить оптимальную картину распределения фрагментов ДНК и обеспечит высокий уровень дискриминации между штаммами. Подбор эндонуклеаз рестрикции, которые могут быть использованы в качестве вычитающего фермента, проводили с применением программы Gene Runner. Для анализа использовали последовательности генома штаммов биовара Orientalis (CO92) и биовара Medievalis (KIM), представленных в базе данных NCBI GenBank. При тестировании 26 ферментов вычитания на референтных штаммах чумного микроба установлено, что наиболее удачные варианты фингерпринтов получались при использовании комбинации рестриктаз детекции - вычитания EcoRI - PauI.
Для выяснения гетерогенности ВРФ профилей у штаммов, относящихся к одному подвиду, но выделенных в разных природных очагах, нами проведен анализ 101 штамма чумного микроба. Сравнение полиморфизма фингерпринтов чумного и псевдотуберкулезного микроба проведено с привлечением 27 штаммов псевдотуберкулезного микроба. В результате проведенной работы были получены ВРФ профили штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Штаммы основного подвида, выделенные в различных природных очагах (Джейранчельский равнинноЦпредгорный, Ленинаканский, Присеванский, Тувинский (горные), Сарыджазский, Муюнкумский пустынный, Прикаспийский песчаный), формировали различные геноварианты, соответствующие отдельному природному очагу. Исключение составили штаммы Верхненарынского, Аксайского и Алайского очагов, которые обнаружили идентичные ВРФ профили (рисунок 1 и 2).
При генотипировании 6 штаммов из ТерскоЦСунженского очага нами выявлено два геноварианта - один характерен для штаммов, относящихся к основному подвиду, а другой - штаммов кавказского подвида. Также различия в ВРФ профилях обнаружили штаммы из СевероЦПриаральского, Мангышлакского (по геноварианта) и ПриаральскоЦКаракумского (3 геноварианта) очагов.
Рисунок 1 - ВРФ профили штаммов чумного микроба основного подвида из разных природных очагов.
1 - 7937, 2 - 10439, 3 - КМ872, 4 - 550, 5 - 4635, 6 - 1252, 7 - А1763, 8 - 111, - М1245, 10 - 106, 11 - М956, 12 - 88/134, 13 - 4/692, 14 - 693, 15 - А1837, 16 - И3205, 17 - 1771, 18 - А744, 19 - М986, 20 - А1486. М - маркер / EcoRI+HindIII (фрагменты 564, 831, 947, 1375, 1584 п.н.) Для штаммов алтайского подвида выявлены два типа ВРФ профилей: один геновариант включал штаммы из Алтайского горного очага, второй геновариант определен для штамма из Монголии. У штаммов улэгейского подвида также определено два геноварианта, которые коррелировали с природными очагами (аймаками). Штаммы гиссарского подвида принадлежали к одному геноварианту, также как и группа таласских штаммов (рисунок 2).
А Б Рисунок 2 - Схема ВРФ профилей штаммов чумного микроба основного (А) и неосновных (Б) подвидов из разных природных очагов.
1 - 231(708) (Аксайский высокогорный), 2 - И3102 (Монголия), 3 - И32(Тувинский горный), 4 - КМ921 (С631) (Центрально-Кавказский), 5 - КМ8(С527) (Джейранчель), 6 - КМ873 (С528) (Прикаспийский песчаный), 7 - М9(Волго-Уральский песчаный), 8 - А1763 (Приаральско-Каракумский), 9 - И12(Забайкальский); Т - группа таласских штаммов, А - алтайский подвид, У - улэгейский подвид, Г - гиссарский подвид, К - кавказский подвид.
ВРФ профили штаммов псевдотуберкулезного микроба при использовании пары рестриктаз EcoRI - PauI отличались по распределению фрагментов от ВРФ профилей штаммов чумного микроба. Коэффициент подобия между штаммами псевдотуберкулезного микроба (от 60%) оказался ниже, чем между штаммами чумного микроба (от 78%).
Таким образом, проведенный анализ штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения показал возможность внутривидовой дифференциации штаммов этих микроорганизмов методом вычитающего рестрикционного фингерпринтинга при эпидемиологическом анализе вспышек и завозных случаев инфекции. Кластерные группы ВРФ фингерпринтов соответствуют подвидам штаммов чумного микроба по фенотипической классификации.
Типирование патогенных иерсиний на основе четырех VNTR локусов В настоящее время для исследования вида Y. pestis активно используется метод, основанный на анализе нескольких хромосомных локусов с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR локусов), называемый MLVA [Le Flche P. et al., 2001; Klevytska A. et al., 2001]. У выявленных в геноме чумного микроба VNTR локусов в работе Klevytska A. с соавт. (2001) обнаружен различный уровень полиморфизма. Рядом исследователей подобраны различные комбинации VNTR локусов для генотипирования и филогенетического анализа [Сучков И.Ю. с соавт., 2004; Lowell J. L. et al., 2007; Kingston J. et al., 2009; Li Y. et al., 2009]. Несмотря на высокую разрешающую способность данных систем генетического типирования, не всегда удается различать штаммы с одинаковым MLVA генотипом. В связи с этим, мы считаем целесообразным дополнение MLVA секвенированием полученных аллелей. Ранее в нашей лаборатории при сравнительном ПЦР-скрининге hutGЦYPO1950 региона области пигментации чумного микроба у референтных штаммов пяти подвидов и таласской группы штаммов, а также штаммов Y. pseudotuberculosis Mollaret I (I серотип) и A2526 (I серотип) выявлены два вариабельных участка, содержащие VNTR последовательности: hutGЦYPO1967 (I VNTR), расположенный перед областью пигментации, YPO1961ЦYPO1960 (III VNTR), расположенный в области пигментации [Сухоносов И. Ю., 2009]. Эти участки и, дополнительно, участок YPO1967ЦaruE (II VNTR) по данным NCBI GenBank, содержат тандемные повторы, поэтому были проверены нами в качестве ДНК - мишеней при MST типировании.
В данной работе методом MST типирования с помощью праймеров TAN1 - TAN2, HSI37ЦHSI38, HSI69ЦHSI70 на три VNTR области изучено распространение аллелей данных локусов и проведено типирование 170 штаммов чумного микроба, выделенных в 39 различных природных очагах стран СНГ и 4 аймаках Монголии.
Также было исследовано 68 штаммов псевдотуберкулезного микроба, выделенных в разное время в различных географических регионах из разнообразных источников.
При изучении области hutG - YPO1967 нами выявлено 20 аллелей в использованной выборке штаммов чумного микроба и 5 аллелей дополнительно при исследовании известных нуклеотидных последовательностей, депонированных в GenBank штаммов биоваров antiqua, medievalis, orientalis, microtus. На основе секвенирования данных аллелей у исследованных нами штаммов удалось провести дифференциацию на разных уровнях. Первый уровень - четкая дифференциация между видами Y. pestis и Y. pseudotuberculosis. Штаммы псевдотуберкулезного микроба отличаются от штаммов чумного микроба не только по количеству повторов первого и второго VNTR локусов I VNTR области и единичным нуклеотидным заменам в тандемных повторах, но и наличием уникальной вставки 363 п.н. между первым и вторым VNTR локусами этой области.
Второй уровень дифференциации - подвидовой. Для каждого подвида характерен свой набор аллелей. Штаммы основного подвида содержат только полные тандемные повторы. У штаммов основного подвида в первом локусе количество повторов варьировало от 4 до 9, во втором локусе всегда присутствовали 3 повтора; данная группа штаммов чумного микроба включала аллели IVN1 - IVN 6. Аллели всех штаммов неосновных подвидов отличаются от аллелей штаммов основных подвидов наличием разного количества неполных повторов. В зависимости от количества полных и неполных повторов у штаммов неосновных подвидов обнаружены разные аллели. Для штаммов алтайского подвида характерны аллели IVN 9, IVN 10, IVN 11, для штаммов улэгейского подвида - аллели IVN 7, IVN 8, IVN 12. Штаммы гиссарского подвида несут аллели IVN 14 и IVN 15. У штаммов таласской группы выявлен характерный аллель IVN 13. Особенность аллелей штаммов, относящихся к кавказскому подвиду, состоит в присутствии IS 285 элемента во втором локусе у всех штаммов, кроме выделенных в ВосточноЦКавказском высокогорном очаге. Для штаммов данного подвида определены аллели IVN 16, IVN 17, IVN 18, IVN 19, IVN 20.
Третий уровень дифференциации обеспечивает определение очаговой и мезоочаговой принадлежности. Ранее нами было показано, что каждому подвиду соответствует несколько аллелей I VNTR области. Установлена четкая корреляция VNTR аллелей с очаговой и мезоочаговой принадлежностью штаммов. Это касается в первую очередь штаммов неосновных подвидов, несколько в меньшей степени - штаммов основных подвидов.
Важно, что I VNTR область расположена вне области пигментации, поэтому ее можно определить у всех выделяемых штаммов, в том числе и Hms- мутантов чумного микроба.
На основе I VNTR области нами разработан способ дифференциации штаммов чумного и псевдотуберкулезного микроба и внутривидового типирования штаммов чумного микроба методом ПЦР. Полученные продукты амплификации разделяются в 3% агарозном или 6% полиакриламидном геле (рисунок 3).
Принадлежность штамма к виду Y.pestis, конкретному подвиду и природному очагу определяют по размеру образовавшегося фрагмента ДНК. Для того чтобы интерпретация результатов была максимально простой предложен набор маркеров из фрагментов ДНК референтных штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов известного размера.
Рисунок 3 - Электрофореграмма фрагментов ДНК, полученных при ПЦР анализе штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения с использованием праймеров TAN1-TAN2 (3% агарозный гель).
М1, М2 - маркеры из фрагментов ДНК референтных штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов, г - штамм гиссарского подвида, а - штаммы алтайского подвида, у - штамм улэгейского подвида, к - штаммы кавказского подвида, лосновной - штаммы основного подвида из разных природных очагов.
Вариабельную область I VNTR в MST системе дополняет II VNTR область (YPO1967 - aruE). Нами выявлены 6 аллелей этой области у штаммов чумного микроба, циркулирующих на территории стран СНГ и Монголии. Наиболее распространенным оказался IIVN 1 аллель. Введение этой области в MST систему усилило дифференцирующие возможности относительно штаммов основного подвида из Аксайского высокогорного очага, штаммов алтайского и кавказского подвида, позволило различать штаммы кавказского подвида из Ленинаканского горного и Терско-Сунженского низкогорного очагов.
Область III VNTR (YPO1960 - YPO1961) обладает достаточно высоким уровнем вариабельности для штаммов чумного микроба (выявлено 12 аллелей).
Используя эту область как ДНК - мишень можно проводить подвидовую дифференциацию, но не такую четкую, как при использовании I VNTR области. В тоже время, аллели штаммов улэгейского подвида коррелировали с географическим регионом выделения. Отдельные аллели обнаружены нами для штаммов таласской группы, а также для штаммов основного подвида из Таукумского пустынного очага. Необходимость включения III VNTR области в MST систему вызвана как ее дополнительными возможностями для дифференциации штаммов из разных очагов, так и для усиления дифференцирующих свойств системы на мезоочаговом уровне.
Проведенный нами анализ показал, что в качестве ДНК - мишени максимальными дифференцирующими свойствами обладает hutG - YPO19вариабельная область. Использование двух других областей повышает разрешающую способность метода, увеличивая количество аллелей, соответствующих очаговой и мезоочаговой принадлежности штаммов. Только сочетание трех VNTR областей в системе MST дает оптимальные результаты типирования. Индекс дискриминационной силы системы типирования штаммов чумного микроба с использованием MST метода с применением трех исследованных вариабельных областей оказался высоким и составил 0,83.
Впервые для каждого подвида (по фенотипической классификации) чумного микроба выявлены строго определенные MST типы, которые внутри подвидов дифференцируются в соответствии с очаговой и мезоочаговой принадлежностью (таблица 1). Использование предложенной MST системы с высокой степенью достоверности определяет источник происхождения изолята, дает возможность проводить быструю идентификацию свежевыделенных штаммов в чрезвычайных ситуациях.
Таблица 1. Распространение выявленных генотипов чумного микроба разных подвидов по природным очагам MST Формула генотипа Подвид Природный очаг тип 1 IVN 1, IIVN 1, IIIVN 1 Основной Таукумский пустынный 2 IVN 1, IIVN 1, IIIVN 2 Основной Все очаги песчаночьего и сусликового типа (кроме 37, 38) 3 IVN 1, IIVN 1b, IIIVN 2 Основной Прибалхашский пустынный 4 IVN 1, IIVN 1, IIIVN 3 Основной Кызылкумский пустынный 5 IVN 2, IIVN 1, IIIVN 3 Основной Забайкальский степной 6 IVN 2, IIVN 1, IIIVN 4 Основной -//- 7 IVN 2, IIVN 1, IIIVN 5 Основной Тувинский горный (Толайлыгский мезоочаг) 8 IVN 3, IIVN 1, IIIVN 5 Основной Тувинский горный (Саглинский мезоочаг) 9 IVN 3, IIVN 1, IIIVN 7 Основной Сарыджазский высокогорный (Кокпакский мезоочаг) 10 IVN 3, IIVN 1a, IIIVN 4 Основной Алайский высокогорный 11 IVN 3, IIVN 1a, IIIVN 5 Основной Аксайский высокогорный (Восточный Аксай) 12 IVN 3, IIVN 1а, IIIVN 5a Основной Аксайский высокогорный (Центральный Аксай) 13 IVN 4, IIVN 1, IIIVN 7 Основной Верхненарынский высокогорный (Болгартский мезоочаг) 14 IVN 5, IIVN 1, IIIVN 6 Основной Верхненарынский высокогорный (Акшийракский мезоочаг) 15 IVN 6, IIVN 1, IIIVN 6 Основной Верхненарынский высокогорный 16 IVN 6, IIVN 1а, IIIVN 5 Основной Аксайский высокогорный (Западный Аксай) 17 IVN 7, IIVN 1, IIIVN 4a Улэгейский Южно-Гобийский аймак, Монголия 18 IVN 8, IIVN 1, IIIVN 5b Улэгейский Баян-Улэгейский аймак, Монголия 19 IVN 9, IIVN 1c, IIIVN 3a Алтайский Алтайский горный (Кош-Агачский район) 20 IVN 10, IIVN 1c, IIIVN 3a Алтайский Алтайский горный (Уландрик) 21 IVN 11, IIVN 1c, IIIVN 3a Алтайский Аймак Убурхангай, Монголия 22 IVN 12, IIVN 1, IIIVN 3a Улэгейский Аймак Убурхангай, Монголия 23 IVN 13, IIVN 1, IIIVN 8 Таласская Таласский высокогорный группа 24 IVN 14, IIVN 1, IIIVN 3a Гиссарский Гиссарский высокогорный 25 IVN 15, IIVN 1, IIIVN 3a Гиссарский -//- 26 IVN 16, IIVN 2, IIIVN 2 Кавказский Восточно - Кавказский высокогорный 27 IVN 17, IIVN 2, IIIVN 4 Кавказский Ленинаканский горный 28 IVN 17, IIVN 3, IIIVN 3 Кавказский Терско-Сунженский низкогорный 29 IVN 18, IIVN 2, IIIVN 3 Кавказский Присеванский горный 30 IVN 19, IIVN 2, IIIVN 3 Кавказский Зангезуро-Карабахский горный 31 IVN 20, IIVN 2, IIIVN 3a Кавказский Приараксинский низкогорный Определение сиквенс типов на основе изученных вариабельных областей у штаммов псевдотуберкулезного микроба показало, что I VNTR область штаммов псевдотуберкулезного микроба состоит из двух локусов, как и у штаммов чумного микроба. Сравнение в программе BLAST аллелей штаммов, геномы которых представлены в GenBank, и анализ наших данных показали, что локус 1 содержит повтора с заменой седьмого нуклеотида A на C во втором повторе, локус 2 - уникальную вставку 363 п.н., характерную для всех штаммов псевдотуберкулезного микроба и несколько повторов. Однако, в отличие от аллелей штаммов чумного микроба, повторы второго локуса часто содержат единичные нуклеотидные замены, что создает дополнительные вариации аллелей данной области.
Среди изученных штаммов псевдотуберкулезного микроба по структурной организации региона hutG - aruE выделена группа штаммов, циркулирующих на холмогорье Бадхыз. Эти штаммы относят к O3 серотипу. ПЦР анализ показал, что у них, как и у остальных изученных штаммов O3 серотипа, отсутствуют гены YPO1967 и aruE. С помощью праймеров TAN2 (из области межгенного пространства hutG - YPO1967) и HSI61 (из области гена aruE) получены продукты ПЦР со всеми штаммами O3 серотипа и методом секвенирования определены границы делеции. Показано, что делеция не захватывает I VNTR область, но II VNTR область у данной группы штаммов отсутствует. Такая же делеция характерна еще для трех изученных штаммов O3 серотипа (Аст 2, Аст 207 и 343), выделенных в г. Астрахань и Карачаево-Черкесской области, соответственно.
Различия в структурной организации I VNTR области у исследованных штаммов псевдотуберкулезного микроба связаны не только с количеством и составом тандемных повторов, но с девятью единичными нуклеотидными заменами в уникальной вставке 363 п.н. Причем первые три замены встречаются только у штаммов O3 серотипа. Для того чтобы выяснить корреляцию сиквенс типов с географическим регионом или конкретной вспышкой нужны исследования свежевыделенных штаммов.
В аллелях II VNTR области штаммов псевдотуберкулезного микроба выявлены 15 нуклеотидных замен вне области повторов, которые отличают их от штаммов чумного микроба и между собой. Большинство штаммов псевдотуберкулезного микроба, как и доминирующая группа штаммов чумного микроба, содержит всего два повтора. По количеству повторов (от 2 до 6) и нуклеотидным заменам внутри них в данной вариабельной области нами выявлено 6 аллелей. Учет нуклеотидных замен вокруг II VNTR области увеличивает число аллелей. У штаммов O3 серотипа, как уже упоминалось, эта область отсутствует, что позволяет легко отличать их от штаммов других серотипов.
При секвенировании III VNTR области штаммов псевдотуберкулезного микроба нами обнаружено 9 аллелей, различающихся по количеству повторов (от до 11). Семь нуклеотидных замен и одна вставка нуклеотида увеличивают дискриминирующие качества этой области. Всего 2 повтора обнаружено у штамма, выделенного в Китае. Примечательно, что 11 повторов были характерны только для штаммов из Туркмении, выделенных на холмогорье Бадхыз. Среди бадхызских штаммов выделяют еще и группу штаммов с тремя повторами. Такое же количество повторов обнаружено у трех штаммов O3 серотипа, выделенных в других областях. При этом для всех бадхызских штаммов нуклеотидные последовательности областей, окружающих тандемные повторы, идентичны и отличаются от последовательностей у штаммов O3 серотипа, выделенных в других регионах. Таким образом, III VNTR области присущ полиморфизм как на уровне серотипов, так, вероятно, и на уровне географического распространения.
Индекс полиморфизма по изученным областям для штаммов псевдотуберкулезного микроба составил: для I VNTR - 0,6, для II VNTR - 0,5, для III VNTR - 0,84.
По трем VNTR областям без учета единичных нуклеотидных замен вне повторов штаммы Mollaret I, 7Арм., 3(71), выделенные в разных местах, имеют одинаковый генотип, но, учитывая единичные нуклеотидные замены, штамм 3(71) отличается от двух других. Штаммы, принадлежащие к одному серотипу, выделенные в одном регионе, имеют одинаковый MST тип (включая и единичные нуклеотидные замены). Это, например, штаммы, выделенные в Алма-Ате: А5, А17, А2526 и группа штаммов, выделенных во Владивостоке: 10В, 312, 50-73,15-73, а также бадхызские штаммы O3 серотипа, образующие группы из двух MST типов.
Штаммы O3 серотипа из Астрахани с тремя повторами имеют одно отличие в нуклеотидной последовательности от бадхызских штаммов.
MST типирование штаммов псевдотуберкулезного микроба на основе трех изученных VNTR областей обладает высокими дискриминирующими свойствами и позволяет выяснять серотип и географическую область распространения штаммов.
Таким образом, полученные на основании поиска in silico данные о ранее не использованных для генетического типирования VNTR областей генома чумного микроба hutG - YPO1967 (I VNTR), расположенной перед областью пигментации;
YPO1967 - aruE (II VNTR), YPO1961ЦYPO1960 (III VNTR), расположенных в области пигментации, позволили разработать праймеры для их амплификации и обнаружить разную степень вариабельности изучаемых локусов у изолятов как чумного, так и псевдотуберкулезного микробов из географически отдаленных областей. Анализ полученных данных показал, что использование комбинации трех изученных областей обеспечивает высокую разрешающую способность для генетического анализа и типирования штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Значительное разнообразие аллелей каждого локуса и их комбинации позволяют добиться большой точности в определении степени генетического родства изучаемых штаммов.
Сравнение фенотипических и генотипических схем классификации чумного микроба.
Сопоставление результатов проведенного генетического типирования методами ВРФ и MST с использованием трех изученных вариабельных областей с фенотипическими классификационными схемами вида Y. pestis показало, что штаммы каждого неосновного подвида, как и штаммы из разных природных очагов, принадлежащих к одному подвиду, демонстрировали отдельный MST тип.
Для штаммов основного подвида определены MST 1 - 16 типы, штаммы алтайского подвида отнесены к MST 19 - 21 типам, для штаммов гиссарского подвида установлены MST 24 и MST 25 типы, штаммы улэгейского подвида принадлежали MST 17, 18, 22 типам, а штаммы кавказского подвида - MST 26 - 31.
Особое внимание привлекает группа штаммов из Таласского высокогорного очага, которая не включена в существующую отечественную классификацию вида Y. pestis. Штаммы таласской группы из Бешташского участка Таласского высокогорного очага имеют MST генотип, близкий но не идентичный MST генотипам штаммов неосновных подвидов, сразу по двум вариабельным областям.
Результаты MST и ВРФ типирования и характерный фенотип (глицеринпозитивны, рамнозопозитивны, вирулентны для белых мышей и авирулентны или слабо вирулентны для морских свинок) позволяет говорить об этой группе штаммов как об отдельном внутривидовом таксоне.
На основе полученных данных по вариабельности трех VNTR областей построена дендрограмма, отражающая генетическое родство изученных штаммов.
Как видно на рисунке 4, штаммы чумного микроба распределились на две основные ветви: верхнюю, включающую штаммы основного, гиссарского, улэгейского, алтайского подвидов и группу таласских штаммов и нижнюю, в которую вошли штаммы только кавказского подвида. Всего определено 7 крупных групп. Первая группа содержит штаммы основного подвида из очагов степных и пустынных зон, а также равнинно-предгорных и горных очагов Кавказа. Вторая группа включает штаммы основного подвида из Забайкальского степного, Тувинского горного, Аксайского и Алайского высокогорных очагов. Третья группа представлена штаммом улэгейского подвида из Южно-Гобийского аймака Монголии. В четвертую группу вошли штаммы основного подвида из высокогорных очагов: Сарыджазского, Верхненарынского и Аксайского. Пятая группа включает штаммы неосновных подвидов: алтайского, гиссарского, улэгейского подвидов, а также штаммы кавказского подвида из ВосточноКавказского высокогорного очага. Шестая группа содержит только штаммы, выделенные на территории Бешташского участка Таласского очага. Кластеризация штаммов по данным MST анализа выделяет штаммы из Таласского очага в отдельную ветвь. В то время как штаммы из Гиссарского, Алтайского очагов и Монголии (улэгейской подвид) представляющие соответствующие неосновные подвиды входят в одну крупную группу и проявляют большее родство между собой, чем с таласскими штаммами. В седьмую группу вошли штаммы кавказского подвида из Присеванского горного, Приараксинского низкогорного, ЗангезуроКарабахского горного, Терско-Сунженского низкогорного и Ленинаканского горного очагов. Своеобразие штаммов кавказского подвида, которое ранее соотносилось, прежде всего, с отсутствием плазмиды пестициногенности и чувствительностью к пестицину, проявилось и при MST анализе, отделяя эти штаммы от остальных в самостоятельную ветвь. Кластеризация штаммов чумного микроба по данным MST анализа с использованием трех изученных VNTR областей отражает деление сначала на подвиды (основной - неосновные), затем на очаги и мезоочаги, показывая с одной стороны генетические различия, с другой - генетическую близость отдельных групп.
Рисунок 4 - Дендрограмма генетического родства и MST типы штаммов чумного микроба на основе трех изученных VNTR областей.
При использовании метода MST определены характерные генотипы для штаммов чумного микроба, которые позволяют проводить внутривидовую дифференциацию вида Y. pestis, устанавливать подвиды, а также проводить генетическое типирование штаммов из отдельных природных очагов и, в ряде случаев, мезоочагов, определяя с высокой степенью достоверности источник происхождения изолята. Подготовлены последовательности ДНК штаммов чумного микроба разного происхождения для создания компьютерной базы данных. Различия в составе данных участков у штаммов, относящихся к разным подвидам и выделенных из разных природных очагов, обеспечивают внутривидовую классификацию штаммов чумного микроба на генетическом уровне и возможность быстрой идентификации свежевыделенных штаммов в чрезвычайных ситуациях.
Таким образом, результаты, полученные с использованием двух предложенных методов молекулярного типирования (ВРФ и MST) подтверждают фенотипическую классификацию, подразделяющую штаммы чумного микроба на подвиды и открывают перспективы ее усовершенствования.
Подводя итоги выше сказанному, можно утверждать, что сочетание методов, определяющих внутривидовые вариации всего генома (вычитающий рестрикционный фингерпринтинг) и отдельных его локусов (VNTR анализ), позволяет наиболее эффективно оценивать таксономическое положение изучаемых штаммов чумного микроба. В эпидемиологических исследованиях применение данного сочетания позволит проводить паспортизацию штаммов, выявлять геномный полиморфизм штаммов чумного микроба из разных природных очагов.
Разработанная MST система не исключает дополнение другими ДНК-мишенями, увеличивающими ее типирующие свойства в отношении очаговой принадлежности штаммов из очагов сусликового и песчаночьего типа и мезоочаговой принадлежности из зарубежных очагов, а также определения наличия факторов вирулентности у исследуемых штаммов, а значит и степени их опасности.
ВЫВОДЫ 1. Предложенная референс-панель штаммов чумного микроба из природных очагов стран СНГ позволяет оценивать эффективность методов генетического типирования.
2. Впервые проведен анализ штаммов чумного микроба с использованием метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга. Полученные фингерпринты распределяют штаммы на группы, соответствующие подвидам по фенотипической классификации, и очаговой принадлежности. Показаны высокие дискриминирующие способности метода в определении очаговой принадлежности штаммов основного подвида.
3. Разработан методический подход мультиспейсерного сиквенс типирования, позволяющий проводить идентификацию, определение подвида, очаговой и мезоочаговой принадлежности штаммов чумного микроба и внутривидовое типирование штаммов псевдотуберкулезного микроба. Оптимальные дискриминирующие свойства установлены для штаммов неосновных подвидов и штаммов основного подвида из природных очагов Западной Сибири и ТяньШаня.
4. Разработана монолокусная VNTR - ПЦР, которая позволяет одновременно дифференцировать штаммы чумного и псевдотуберкулезного микроба, определять подвидовую и очаговую принадлежность штаммов чумного микроба.
5. Применение вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и мультиспейсерного сиквенс типирования позволяет эффективно оценивать таксономическое положение изучаемых штаммов чумного микроба, проводить паспортизацию штаммов, выявлять геномный полиморфизм штаммов чумного микроба из разных природных очагов. Каждому подвиду и таласской группе штаммов соответствуют строго определенные генотипы.
6. С помощью мультиспейсерного сиквенс типирования и вычитающего рестрикционного фингерпринтинга получены генетические доказательства обособленности штаммов таласской группы от штаммов известных подвидов и возможности выделения этой группы в отдельный внутривидовой таксон.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Гаева А.В., Видяева Н.А., Проценко О.А., Кутырев В.В. Особенности штаммов Yersinia pseudotuberculosis, выделенных в различных природных очагах // Проблемы особо опасных инфекций. - 2002. - № 1(83). - С. 5-(журнал из перечня ВАК).
2. Гаева А.В., Анисимова Л.В., Киреев М.Н, Булгакова Е.Г., Кутырев В.В.
Изучение типирующих возможностей метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга для штаммов чумного микроба // Инфекции, обусловленные иерсиниями: Матер. II Всерос. науч. - практ. конф. - С-Петербург, 2006. - С.61-62.
3. Булгакова Е.Г., Гаева А.В., Сухоносов И.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Киреев М.Н., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Молекулярно-генетические портреты штаммов возбудителя чумы // Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ. обва эпидемиол., микробиол. и паразитол. - М., 2007.ЦТ.3. - С.17-18.
4. Булгакова Е.Г., Гаева А.В., Сухоносов И.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Разработка способа дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба // Генодиагностика инф. болезней (Мол. диагностика): Матер.VI Всерос. науч.-практ. конф. - М., 2007. - Т. 1. - С. 353-354.
5. Гаева А.В., Булгакова Е.Г., Сухоносов И.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Индикация и внутривидовая дифференциация вирулентных и авирулентных штаммов Yersinia pestis // Вестник российской военно-медицинской академии. - СПб., 2008. - № 3(23) - Приложение 2. - Ч. II. - С. 322.
6. Булгакова Е.Г., Краснов Я.М., Гаева А.В., Сухоносов И.Ю., Гусева Н.П., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Молекулярное типирование штаммов чумного микроба разного происхождения // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными заболеваниями на территории государств участников СНГ: Матер. IX Межгос. науч.-практ. конф.
государств - участников СНГ. - Волгоград, 2008. - С. 40-42.
7. Гаева А.В., Булгакова Е.Г. Использование метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга для типирования штаммов чумного микроба // Генетика микроорганизмов и биотехнология: Матер. Междунар. школы-конф., посвященной 40-летию создания ГосНИИгенетика. - Москва - Пущино, 2008. - С.119-120.
8. Булгакова Е.Г., Гаева А.В., Сухоносов И.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Кутырев В.В. Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба. RU, № 2332464 С1, опубл. 27.08.2008, Бюл. № 24.
9. Гаева А.В. Мультилокусный сиквенс VNTR анализ штаммов чумного микроба полевочьей разновидности // Материалы XII Всероссийской медикобиологической науч. конференции молодых исследователей Фундаментальная наука и клиническая медицина. - Санкт-Петербург, 2009. - С. 80.
10. Гаева А.В., Булгакова Е.Г., Киреев М.Н., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Внутривидовая дифференциация и определение очаговой принадлежности штаммов чумного микроба методом вычитающего рестрикционного фингерпринтинга // Проблемы особо опасных инфекций. - 2010. - № 4 (106). - С.28-31(журнал из перечня ВАК).
11. Гаева А.В., Булгакова Е.Г., Сухоносов И.Ю., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Идентификация и внутривидовое типирование штаммов чумного микроба с определением их потенциальной вирулентности методом ПЦР // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - № 2 (108). - С.3641(журнал из перечня ВАК).
12. Булгакова Е.Г., Краснов Я.М., Гаева А.В., Сухоносов И.Ю., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Гусева Н.П., Кутырев В.В. Особенности проявления признака пигментации и структурные различия генов hms оперона у штаммов Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis разного происхождения // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - № 2 (108). - С.30-35(журнал из перечня ВАК).
13. Гаева А.В., Булгакова Е.Г., Краснов Я.М., Сухоносов И.Ю., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А, Кутырев В.В. MST типирование штаммов Yersinia pestis разного происхождения // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Матер. науч. - практ. школы - конф. молодых ученых и специалистов науч.-исслед. организаций Роспотребнадзора. - Оболенск, 2011. - С.98-100.
Подписано к печати 6.02.12. Формат 60х84 1/16. Бумага офисная.
Печать офсетная. Гарнитура Таймс. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз.
Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт Микроб Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.