Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине
На правах рукописи
Ермакова Виктория Юрьевна
Разработка лекарственных форм
на основе гидрофильной и
гидрофобной фракции плодов клюквы
14.04.02 Ц Фармацевтическая химия, фармакогнозия
А в т о р е ф е р а т
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Москва Ц 2012
Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России
Научный руководитель:
доктор фармацевтических наук,
профессор Решетник Владимир Юрьевич
Официальные оппоненты:
Белобородов Владимир Леонидович, доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой органической химии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова
Даргаева Тамара Дарижаповна, доктор фармацевтических наук, профессор, главный научный сотрудник отдела стандартизации и сертификации ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений Российской Академии сельскохозяйственных наук
Ведущая организация:
ФБГУ Научный центр экспертизы средств медицинского применения
Защита состоится л____ ___________ 2012 г. в ____ часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.09 при Первом МГМУ им. И.М.Сеченова по адресу: 119019, Москва, Никитский бульвар, 13.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке Первого МГМУ им. И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, 49.
Автореферат разослан л____ ___________ 2012 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета,
доктор фармацевтических наук,
профессор Садчикова Наталья Петровна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Фитотерапия традиционно применяется в стоматологической практике для лечения и профилактики воспалительных заболеваний пародонта. Фармакологически-активные соединения, полученные из лекарственного растительного сырья (ЛРС), входят в состав различных лекарственных препаратов: зубных паст и ополаскивателей, гелей, спреев, растворов, которые широко используется в различных областях стоматологии. К комплексному действию, оказываемому лекарственными средствами на основе ЛРС в полости рта могут быть отнесены: регенерирующее, дезодорирующее кровеостанавливающее, противоотечное действие; противосполительная и антиоксидантная активность; способность оказывать бактерицидное, бактериостатическое и фунгицидное действие. Основными направлениями исследований в этой области являются поиск новых сырьевых лекарственных источников, имеющих широкий ареал распространения или широко культивируемых; создание на их основе недорогих и эффективных лекарственных препаратов с выраженной фармакологической активностью. Перспективным в этом отношении растением можно считать клюкву болотную (Oxycoccus palustris Pers., сем. Vacciniаceae), которая характеризуется доступностью сырьевой базы и достаточно большими объемами переработки в пищевой промышленности.
Опыт применения плодов клюквы народной медициной в РФ, а так же сведения, приведенные в литературе, о составе и свойствах данного вида сырья свидетельствует о широких терапевтических возможностях: настой из плодов используют как витаминное, тонизирующее, жаропонижающее средство. Мази с добавлением сока клюквы плодов обладают бактерицидным и противопаразитарным действием. Кроме того следует отметить изученную антиадгезивную активность в сочетании с выраженной антиоксидантной активностью. При этом, плоды клюква в настоящее время не являются фармакопейным видом и не находят официального медицинского применения в России. В доступной литературе имеются лишь единичные сведения по разработке лекарственных форм на ее основе. В то же время, исследования по изучению биологической активности веществ, выделенных из плодов клюквы, в зарубежной литературе представлены достаточно широко.
Все вышесказанное позволяет сделать вывод о том, что углубленное фармакогностическое исследование клюквы болотной, позволяет расширить возможности ее применения в медицинской (в частности, в стоматологической) практике и является своевременным и актуальным.
Цель исследования: создание на основе комплекса фармакогностических, физико-химических, химических, микробиологических и технологических исследований эффективной и стабильной лекарственной формы на основе экстракта плодов клюквы болотной.
Задачи исследования.
- Провести анатомо-морфологический анализ и уточнить основные диагностические признаки плодов клюквы;
- Провести сравнительный количественный анализ химического состава плодов клюквы в зависимости от различных способов переработки и хранения, оценить антиоксидантную активность и микобиологическую чистоту плодов клюквы;
- Выбрать оптимальные методики качественного и количественного определения биологически активных соединений плодов клюквы болотной и на их основе разработать проект фармакопейной статьи (ФС) на новый вид ЛРС;
- Оптимизировать технологическую схему получения сухих экстрактов из плодов клюквы болотной с учетом результатов качественного и количественного исследования химического состава, антимикробной активности и технологических характеристик различных партий сухих экстрактов;
- Провести сравнительный фитохимический анализ биологически активных веществ (БАВ) исходного сырья и полученного сухого экстракта, предложить проект нормативного докумeнта для стандартизации полученного сухого экстракта;
- Научно обосновать и разработать оптимальный состав и технологическую схему получения геля на основе сухого экстракта плодов клюквы;
- Провести оценку качества полученного образца состава стоматологического геля по основным показателям: доказать сохранность и способность к высвобождению БАВ в геле; исследовать антимикробную активность и осмотические свойства полученного геля.
Научная новизна. На основании макро- и микроскопического анализа плодов клюквы болотной обобщены и уточнены диагностические признаки сырья. Впервые проведено сравнительное фармакогностическое изучение клюквы болотной плодов свежезаготовленных, высушенных и свежезамороженных Установлена динамика изменения химического состава плодов клюквы болотной в зависимости от различных способов переработки и хранения. Разработана методика потенциометрического определения суммы органических кислот в плодах клюквы болотной, продуктах переработке и лекарственной форме. В лабороторных и заводских условиях получены и стандартизованы сухие экстракты. На основании проведенного сравнительное изучение технологических свойств и химического состава экстрактов оптимизирована технологическая схема получения сухого экстракта плодов клюквы болотной. На основе выбранного сухого экстракта получен гель стоматологические; разработаны основные показатели его качества, определены сроки хранения. Доказана идентичность химического состава и фармакологической активности гелей нативному сырью.
Положения, выносимые на защиту.
- результаты фармакогностического изучения плодов клюквы болотной;
- результаты сравнительного количественного изучения БАВ в плодах клюквы болотной в зависимости от способов переработки и хранения;
-результаты оптимизации методики потенциометрического определения органических кислот в нативном сырье и продуктах переработке плодов клюквы болотной;
- результаты изучения состава, определения содержания БАВ в сухих экстрактах плодов клюквы болотной;
- данные по изучению физических свойств, качественного и количественного состава БАВ, антимикробной и антиоксидантной активности сухих экстрактов плодов клюквы болотной и геля, полученного на основе сухого экстракта плодов клюквы болотной;
- данные по разработке технологии получения и стандартизации геля на основе сухого экстракта плодов клюквы болотной.
Внедрение результатов в практику. На основании проведенных исследований разработаны:
- проект ФС Клюквы болотной плоды свежие;
- проект ФС Плодов клюквы болотной экстракт сухой;
Апробация работы. Апробация работы проведена на совместной научной конференции кафедр общей химии стоматологического факультета, ботаники, аналитической, физической и коллоидной химии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (Москва, 29.12.2011 г.). Основные положения диссертационной работы доложены на научно-практической конференции Интеграция образования, науки и производства фармации (Ташкент, 2007 г.); ХV и XVI Российском национальном конгрессе Человек и лекарство (Москва, 2008 г.,2009 г.)
ичный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных экспериментальных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведен мониторинг основных параметров, аналитическая и статистическая обработка результатов, их научное обоснование и обобщение. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях, докладах и внедрения в практику.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведённого исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.
Связь задач исследования с проблемным планом. Диссертационная работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований (№ государственной регистрации 01220606352). Тема включена в план научных исследований кафедры общей химии с курсом стоматологического материаловедения Новые знания и подходы в оценке качества и сертификации биологически активных соединений синтетического и природного происхождения, лекарственных препаратов, изделий медицинской техники (технологические аспекты) (01.200.118796).
Публикации. По результатам диссертационного исследования опубликовано 6 печатных работ, в том числе 1 статья в издании, рекомендованном ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 169 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (первая глава), экспериментальной части (вторая, третья и четвертая главы), общих выводов, списка литературы из 205 источника (81 из которых зарубежные) и приложений. Работа иллюстрирована 30 рисунками и 34 таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Растительным сырьем исследования служили свежие, высушенные и замороженные плоды дикорастущей клюквы болотной, собранные в осенний вегетационный период в 2005-2007гг., в условиях естественного произрастания в местах, удаленных от автомагистралей и крупных предприятий. Заготовка сырья осуществлялась согласно общепринятым правилам сбора и плодов и требованиями ГОСТа 19215-73 Клюква свежая. Требования при заготовках, поставках и реализации.
На этапах разработки состава лекарственной формы объектами исследования являлись сухие экстракты плодов клюквы болотной, (ООО КиТ) и гели на основе сухого промышленного экстракта плодов клюквы на различных носителях (Гидроксипропилцеллюлоза (ГПЦ) и Гидроксиэтилцеллюлоза (ГЭЦ), Натрий карбоксиметилцеллюлоза (Na-KМЦ) (Hercules), Полиэтиленгликоли (ПЭГи) 400, ПЭГ 4000 (Medocur), Натрия альгинат (Fluka).
Макро- и микроскопическое изучение сырья проводили согласно ГФ XI Техника микроскопического анализа с использованием микроскопа МБИ-3 и цифровой видеокамеры Canon EOS 20D и микрофотонасадки МФН-12.
Для проведения фитохимических исследований использовали гомогенизированную взвесь, а также водные и водно-спиртовые извлечения (1:10) из плодов клюквы болотной.
Хроматографический анализ на основные группы БАВ проводили методами:
-ТСХ детектирование веществ в видимом и УФ свете до и после их обработки специфическими реактивами со стандартами: кофейная кислота, хлорогеновая кисолота, ферруловая кислота (Sigma) на пластинах Kieselgel 40 F254 (Меrck) в системе: н-бутанол - уксусная кислота - вода в соотношении 40:12:28.
-ВЭЖХ анализ проводили на базе исследовательской лаборатории НИИ Питания РАМН на высокоэффективном жидкостном хроматографе с УФ-детектором УAgilent 1100Ф (США) с компьютерной обработкой результатов исследования. Инжектор ввода пробы ручной; рабочий объемом петли 5 и 20 мкл. Спектрофотометрический детектор для ВЭЖХ УAgilentФ с проточной кварцевой кюветой и возможностью выбора длины волны в спектральным рабочем диапазоне от 190 до 700 нм. В качестве неподвижной фазы использована хроматографическая колонка Кромасил С18, Wakosil C18 RS, Thermo ODS-2 HYPERSIL или Phenomenex Luna 5мкм C18(2) размером 4,6х250 мм, с размером частиц 5 мкм. Калибровку прибора проводили с использованием внешнего стандарта с занесением результатов в базу данных обрабатывающей программы.
-ГХ-МС газовый хроматограф 6890N, снабженный автосемплером и квадрупольным масс-спектрометрическим детектором с ионизацией электронным ударом 5973N (Agilent technologies), капиллярная колонка HP-5-MS длиной 30 м, (Agilent technologies). Для идентификации соединений по масс-спектрам электронного удара использовали библиотеку масс-спектров NIST 2005.
Общую и активную кислотность в единицах рН в 10% водной суспензии измельченных свежих плодов клюквы регистрировали потенциометрическим методом на лабораторном иономере И-160 М.
Методом контроля общей антиоксидантной активности ОАА - DPPH-тест. Результат оценивали в TEAC единицах, выраженных в мкмоль/г сырья
Испытания на микробиологическую чистоту и антимикробнуюактивность проводились в соответствии с ГФ XI (вып.2), изменениями № 3 к ГФ ХI от 19.03.03.
Изучение физических свойств и технологических характеристик экстракта и качество разработанного геля проводили по методикам, приведенным в общих статьях ГФ XI.
В аналитических исследованиях применяли статистические расчеты принятые ГФ ХI (вып.1, С.199) с использованием критерия Стьюдента.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ
ОБСУЖДЕНИЕ
1. Фармакогностическое изучение и стандартизация плодов клюквы болотной.
В ходе исследования уточнены макро- и микродиагностические признаки ЛРС, а также установлены нормативы таких числовых показателей как влажность, содержание минеральной и органической примеси, золы общей и микробиологическая чистота.
К особенностям внешних диагностических признаков сырья плодов клюквы болотной может быть отнесено: наличие на продольном и поперечном срезах плода (рис. 1а,б,в) сочного мезокарпия, пронизанного сетью хорошо развитых жилок; на поперечном срезе (рис. 1в) - 4-х камер -семенных полостей с семязачатками (от двух до четырех). Цвет плодов блестящий от ярко-красного до буро-красного (недозрелая - беловатая с односторонним покраснением). Запах специфический. Вкус кислый.
а б в г
Рис. 1. Плод клюквы: морфология плода; продольный (а, б) и поперечный (в,г) срезы
При микроскопическом изучении эпидермиса плода с поверхности диагностически значимым является наличие изодиаметрических, неравномерно четковидно утолщенных клеток (особенно характерны утолщения в углах, имитирующие межклетники) округленно-полигональных в очертании с красным содержимым. Эпидермис подстилается одним рядом крупных колленхимных клеток (рисунок 2). Мякоть состоит из крупных тонкостенных паренхимных клеток, почти округлой формы образующие довольно крупные межклетники укрупняющихся к эндокарпию. В отдельных клетках мезокарпия, располагающихся ближе к центру плода имеются мелкие паренхимные клетки с друзами. Элементы сосудисто-волокнистых пучков располагаются по перефирии мезокарпия (рисунок 3). Экзокарпий состоит из клеток различной формы - от окрулых до вытянутых вдоль плода, со слабо волнистыми или прямыми стенками.
Рис. 2. Фрагмент экзокарпия плода клюквы: эпидермиальная клетка и один ряд колленхимных клеток, ув. 15х40
Рис.3. Фрагмент паренхимы периферии мезокарпа плода клюквы в поперечном разрезе: проводящий сосуд, ув. 10х40
Влажность свежего сырья - не менее 87%; свежезамороженного - не менее 85%; сухого - не более 14%. Содержание золы общей - не более 0,39%, 0,47%, 2,50% соответственно.
Установление подлинности, боснование выбора исследуемого сырья плодов клюквы и сравнительное изучение фитохимического состава плодов клюквы болотной в зависимости от способов переработки и хранения
Для установления подлинности плодов клюквы болотной предложено использовать качественную реакцию на антоцианы с 1% раствором основного ацетата свинца (синий аморфный осадок) и метод ТСХ для подтверждения гидроксикоричных кислот.
В результате идентификации и количественного определения основных групп БАВ методом ВЭЖХ в плодах клюквы болотной подтверждено наличие органических, в том числе гидроксикоричных и бензойной кислот (доминирующая группа), флаваноиды, катехины, антоцианы, проантоцианидины и антоцианы (табл. 1).
По результатам ВЭЖХ исследования химического состава сухих плодов клюквы болотной установлено, что получение сухого растительного сырья цельных плодов клюквы болотной является нецелесообразным вследствие значительных потерь в количественном составе БАВ при данном способе заготовке на хранение.
Таблица 1.
Динамика изменения химического состава плодов клюквы болотной в зависимости от различных способов переработки и хранения
Исследуемый показатель | Содержание, % к сухой массе; % от исходного содержания | ||||
Свежая | Сухая | Быстрозамороженная | |||
Органические кслоты | % к сух. массе | % к сух. массе | % от исх. сод-я | % к сух. массе | % от исх. сод-я |
хинная | 3,8200 | 3,2500 | 85,12 | 3,5646 | 93,31 |
яблочная | 10,0380 | 8,4320 | 84,46 | 10,4649 | 104,25 |
шикимовая | 0,0962 | 0,0619 | 64,30 | 0,0900 | 93,55 |
имонная | 10,9200 | 8,0722 | 73,92 | 10,6453 | 97,48 |
аскорбиновая | 0,1690 | 0,0039 | 20,3 | 0,0934 | 55,26 |
бензойная кислота | 1,0000 | 0,0813 | 8,13 | 0,7999 | 79,99 |
26,0474 | 19,9013 | 76,40 | 25,6547 | 98,49 | |
Оксикоричные кислоты | |||||
хлорогеновая | 0,2850 | 0,1966 | 68,98 | 0,2223 | 77,9 |
кофейная | 0,0006 | 0,0004 | 66,66 | 0,0006 | 96,6 |
феруловая | 0,0057 | 0,0048 | 84,21 | 0,0046 | 80,7 |
коричная | 0,0005 | 0,00006 | 13,00 | 0,00035 | 76,0 |
0,2913 | 0,2018 | 69,27 | 0,5510 | 78,98 | |
Флавоноиды | |||||
рутин | 0,0050 | 0,0020 | 40,00 | 0,0030 | 60,00, |
гиперозид | 0,0055 | - | - | 0,0028 | 50,91 |
витексин | 0,0015 | - | - | 0,0006 | 40,00 |
астрагалин | 0,0002 | - | - | - | - |
кверцетин | 0,0669 | 0,0355 | 53,00 | 0,0319 | 47,68 |
0,0791 | 0,0375 | 4,70 | 0,0383 | 58,4 | |
Катехины | |||||
эпигаллокатехин | 0,0084 | 0,0035 | 42,61 | 0,0054 | 64,42 |
катехин | 0,0977 | 0,0443 | 45,37 | 0,0686 | 70,25 |
эпикатехин | 0,0684 | 0,0340 | 49,73 | 0,0407 | 59,52 |
эпигаллокатехин галлат | 0,1416 | 0,0758 | 53,60 | 0,1086 | 76,71 |
галлокатехин галлат | 0,0246 | 0,0105 | 42,75 | 0,0180 | 73,25 |
эпикатехин галлат | 0,0838 | 0,0285 | 34,04 | 0,0746 | 89,05 |
галловая кислота | 0,0015 | 0,0004 | 26,08 | 0,0011 | 76,81 |
0,4262 | 0,1970 | 46,24 | 0,3170 | 74,37 | |
проантоцианидины в пересчете на процианидин В2 | 2,4600 | 0,7400 | 29,90 | 1,3200 | 53,65 |
антоцианы, % | 1,3046 | 0,5441 | 41,86 | 0,8840 | 68,00 |
Отличительной особенностью плодов клюквы является обязательное присутствие в них пеонидин-3-арабинозида (Pnd-3-ara) - специфический маркер.
.
Рис. 4. ВЭЖХ - хроматограмма антоциановых пигментов свежих плодов клюквы болотной ( = 510 нм);* № пика соответстует названию, приведенному в таблице 2.
Таблица 2.
Химическое строение обнаруженных соединений из группы антоциановых пигментов (гликозиды катиона флавония)
№№ *соответстует номеру пика на хроматограмме (рис. 23) | Гликозид название | Агликон название | Химическая формула агликона |
1 | Cyd-3-gal Цианидин-3-галактозид | цианидин | |
2 | Cyd-3-glu Цианидин-3-глюкозид | ||
3 | Cyd-3-ara Цианидин-3-арабинозид | ||
4 | Pnd-3-gal Пеонидин-3-алактозид | пеонидин | |
5 | Pnd-3-glu Пеонидин-3- глюкозид | ||
6 | Pnd-3-ara Пеонидин-3- арабинозид |
Общее уменьшение суммы органических кислот составило 24%. Сохранность оксикоричных кислот не превышает 69% от исходного содержания.
В сухих плодах клюквы не идентифицированы большинство флавоноидов (гиперозид, витексин и астрагалин). Общие потери флавоноидов составляют 95%. При обезвоживании плодов клюквы происходит термическая деградация полифенольных соединений. Степень разрушения катехинов составила 53%; антоцианов и процианидинов - 59 и 70% соответственно.
Низкие показатели количественного содержания изученных БАВ могут быть объяснены значительными потерями клеточного содержимого, возникающими вследствие разрыва поверхностных оболочек плода и частичным истеканием сока.
Сопоставление химического состава свежих и подвергнутых шоковой заморозке с последующим хранением при пониженных температурах плодов клюквы показывает, что во всех группах исследуемых соединений наблюдается незначительное снижение их количества. Отмечено, что количество органических кислот практически не изменяется и составляет 98% от исходного количества. Падает содержание аскорбиновой и бензойной кислот: на 46% и 20%; снижение количественного содержания фенолкарбоновых кислот в среднем составляет 25%.
Под воздействием низких температур происходит уменьшение количества Р-активных соединений: количество катехинов снижается до 31,7 мг/100г в быстрозамороженных плодах, что составляет 74% от исходного уровня. Антоцианы и проантоцианидины разрушаются в большей мере и их количественное содержание не превышает 68% и 53%. Наибольшая деградация из всех групп БАВ отмечена для флавоноидных компонентов. В замораживаемом сырье не обнаружены гиперозид, витексин и астрагалин; содержание рутина падает в 1,5 раза; кверцетина - в 2 раза для плодов, подвергнутых шоковой заморозке.
Однако, наблюдаемые изменения в динамике химического состава быстрозамороженных плодов клюквы могут быть объяснены биохимическими процессами, протекающими при хранении и позволяют сделать вывод о возможности использования данного вида сырья для производства фитопрепаратов на его основе.
Оптимизация методики потенциометрического определения суммы органических кислот в плодах клюквы болотной и продуктах ее переработки.
С целью валидации метода потенциометрического титрования для исследуемого сырья на первом этапе были получены кривые титрования индивидуальных органических кислот, а также их смеси. Явных различий в кривых титрования не выявлено, что подтверждало целесообразность определения сумму органических кислот.
При определения выхода суммы органических кислот в зависимости от времени и кратности экстракции установлено, что равновесная концентрация достигается за 45 мин и до 96% органических кислот извлекается за 2 цикла (таблица 3; рис. 5).
Таблица 3.
Выход суммы органических кислот в зависимости от времени и кратности экстракции
Время экстракции, мин | Выход суммы органических кислот в пересчете на яблочную кислоту,% | ||||
кратность экстракции | |||||
1 | 2 | 1,2 | 3 | 1,2,3 | |
30 | 1,010,05 | 0,380,011 | 1,390,07 | 0,750,04 | 1,640,06 |
45 | 1,980,07 | 0,990,044 | 2,840,19 | 0,160,007 | 3,130,09 |
60 | 2,100,1 | 0,720,03 | 2,610,102 | 0,280,01 | 3,100,12 |
75 | 2,050,08 | 0,880,034 | 2,680,11 | 0,170,006 | 3,100,12 |
90 | 2,250,09 | 0,590,026 | 2,680,11 | 0,100,003 | 2,940,11 |
Рис. 5. Кривая потенциометрического титрования извлечения плодов клюквы болотной.
При сопоставлении результатов количественного определения суммы органических кислот методом ВЭЖХ и методом потенциометрического титрования для одного и того же образца получили идентичные результаты. Для определения правильности разработанной методики были проведены эксперименты со стандартными добавками органических кислот в исходное водное извлечение с учетом их количественного отношения в исходном образце. При кратном увеличении количества кислот, получали столь же кратное увеличение добавляемого объема титранта.
Таблица 4.
Метрологические характеристики методики количественного определения суммы органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в плодах клюквы обыкновенной
| n | f | Р% | t(Р,f) | _ Х,% | S2 | S | _ Sх | ΔХ | _ E% |
5 | 5 | 95 | 2,78 | 3,10 | 0,003 | 0,0545 | 0,0245 | 0,0681 | 2,20 |
Определение антиоксидантной активности свежих плодов клюквы болотной
Методом контроля ОАА был выбран DPPH-тест, позволяющий оценить общий уровень антиоксидантной активности. Аналитическим результатом явился тролоксовый эквивалент на 1г образца, который составил 91,950,93 мкмоль/г (ТАЕС) или 20,230,36 мг на 1г сырья. Высокая антиоксидантная активность обусловлена присутствием различных полифенольных соединений (флавоноиды, антоцианы, проантоцианидины, катехины).
Разработка нормативной документации на сырье плоды клюквы болотной
На основании проведенных исследований оформлен проект ФС на новый вид лекарственного сырья Клюквы болотной плоды. В данном НД установлены следующие показатели: содержание суммы органических кислот в пересчете на яблочную кислоту - не менее 3,1 %; содержание антоцианиновых пигментов - не менее 0,17%; влажность не менее 87 %; содержание золы общей не более 0,39%; содержание других частей растения (зеленых стеблей, черешков, листовых пластинок, недозрелых плодов), в т.ч. отделенных при анализе, не более 2 %; содержание органической примеси не более 1 % и минеральной примеси не более 0,5 %. Микробиологическая чистота - категория 4Б. Установлен срок годности свежего сырья 1 месяц (хранение в прохладном, хорошо проветриваем помещении при температуре не выше 5С).
2. Получение и стандартизация экстрактов плодов клюквы болотной.
Оптимизация способа получения сухого экстракта
Оптимизацию методики промышленного получения сухого экстракта начинали с выбора оптимального экстрагента. Сравнивали химический состав сухих экстрактов, полученных экстракцией водно-спиртовыми смесями различной концентрации.
Из результатов исследования химического состава сухих экстрактов плодов клюквы болотной, приведенных в таблице 5 видно, что максимальное количество полифенольных соединений извлекается 60% этанолом, который и был рекомендован в качестве экстрагента.
Таблица 5.
Содержания основных компонентов в сухих экстрактах, мг/г
Исследуемый показатель | Используемый экстрагент и содержание БАВ, мг/г | ||
60% этанол | 20% этанол | Вода очищенная | |
Оксикоричные кислоты | 74,08 | 63,06 | 5,87 |
Хлорогеновая кислота Кофейная кислота Ферулловая кислота Коричная кислота | 72,19 0,86 0,43 0,60 | 61,17 0,71 0,76 0,42 | 5,75 0,05 0,02 0,05 |
Органические кислоты | 235,09 | 329,22 | 270,77 |
Хинная кислота Яблочная кислота Шикимовая кислота Аскорбиновая кислота имонная кислота | 30,15 122,92 22,55 0,38 59,09 | 35,09 139,85 16,09 0,68 137,51 | 24,15 97,85 12,02 0,23 136,52 |
Катехины | 5,82 | 4,06 | 2,02 |
Эпигаллокатехин Катехин Эпикатехин Эпигаллокатехин галлат Галлокатехин галлат Эпикатехин галлат Галловая кислота | 2,94 0,78 0,89 0,36 0,49 0,36 0,24 | 1,55 1,03 0,23 0,35 0,37 0,53 0,38 | 1,18 0,27 0,06 0,31 0,09 0,11 0,08 |
Флавоноиды | 0,65 | 0,5 | 0,16 |
Рутин Гиперозид Кверцетин Гесперидин Витексин Астрагалин | 0,05 0,07 0,006 0,45 0,07 - | 0,09 0,04 0,004 0,36 - - | 0,06 0,04 0,003 - 0,05 0,01 |
Бензойная кислота | 0,15 | 1,86 | 0,19 |
Антоцианы: | 1,118(в %) | 0,634(в %) | 0,618(в %) |
Цианидин-3-галактозид Цианидин-3-глюкозид Пионидин-3-арабинозид Пионидин-3-галактозид Пионидин-3-глюкозид Пионидин-3-арабинозид | 0,296 (26,45) 0,036 (3,25) 0,230 (20,55) 0,311 (27,83) 0,090 (8,08) 0,155 (13,85) | 0,181 (28,52) 0,024 (3,81) 0,120 (18,96) 0,183 (28,87) 0,055 (8,64) 0,071 (11,20) | 0,186 (30,08) 0,027 (4,37) 0,116 (18,71) 0,172 (27,94) 0,052 (8,35) 0,065 (10,55) |
На основании изучения физических и технологических свойств сухих экстрактов в качестве дополнительного компонента (носителя) использован мальтодекстрин с максимальным дексрозным эквивалентом 5% в соотношении 1:10 по массе к жидкому экстракту.
На основании исследования антимикробной активности сухого экстракта носитель рекомендовано предварительно стерилизовать.
Рис. 6. Технологическая схема получения сухого экстракта клюквы.
Полученный по технологической схеме, приведенной на рисунке 6 сухой экстракт представляет собой мелкодисперсный порошок крано-бурого цвета со специфическим запахом; насыпная масса при свободном падении 0,71 г/см3, насыпная масса при уплотнении 0,87 г/см3; сыпучесть - 1,95 г/с; угол естественного откоса 36; хорошо растворимый в воде и мало растворимый в спирте этиловом. В спирто-водных смесях отмечалось разделение полученного экстракта на две фракции: растворимую в воде, которая окрашивала раствор в красно-бурый цвет и нерастворимую в спирте, которая после фильтрования и высушивая представляла собой белый аморфный порошок, хорошо растворимый в воде (мальтодекстрин).
Полученный сухой экстракт партии 2 (на основе обработанного носителя мальтодекстрина) плодов клюквы болотной обладает слабой бактерицидной активностью в отношении E. coli, Enterococcus spp; обладает бактерицидной активностью в отношении S. аureus, Neisseria sicca, P. Vulgaris, Ps. aeruginosa; не проявляют фунгицидную активность в отношении Candida utilis. Особо значимым можно считать наличие бактерицидной активности в отношении Streptococcus mutans - одного из основных патогенных микробов полости рта, имеющего значительную роль в развитии патогенных процессов при заболеваниях полости рта, что практически подтверждает возможность применения экстракта плодов клюквы болотной в стоматологической практике.
В ходе проведенных исследований установлена качественная идентичность (качественные реакции, ТСХ, ГХ-МС) сухого экстракта и нативного сырья и количественная зависимость перехода БАВ (ВЭЖХ, потенциометрия) из плодов клюквы в сухой экстракт.
В качестве специфического маркера подтверждения подлинности рекомендован антоциан пеонидин-3-арабинозида (определение методом ВЭЖХ); в качестве неспецифицеских макреров рекомендованы производные фурана (фурфурол, 2-фуранметанол), бензиловый спирт и бензойная кислота (определение методом ГХ-МС; таблица 6).
Таблица 6.
Обнаружение БАВ плодов клюквы и сухого экстракта методом ГХ-МС
время удерживания сырье/экстракт | детектируемое вещество | % совпадения со стандартом электронной базы сырье/экстракт |
16.138 / 19.662 | фурфурол | 97 / 97 |
16.277 / 19.737 | уксусная кислота | 91 / 91 |
19.268 / 24.584 | 2-фуранметанол | 99 / 99 |
24.351 /32.711 | диэтиловый эфир бутандиовой кислоты | 91 /86 |
22.275 / 22.275 | бензиловый спирт | 98 / 98 |
24.351 / - | диэтиловый эфир яблочной кислоты | 91 / - |
28.782 / 39.492 | бензойная кислота | 94 / 97 |
29.791 /- | этиловый эфир линолевой кислоты | 95 / |
34.113 / - | яблочная кислота | 84 / |
В результате определение антиоксидантной активности сухого экстракта плодов клюквы болотной установили, что среднее значение тролоксового эквивалента на 1 г сухого плодов клюквы болотной составляет 250 мг 4,84 на 1г сырья (ТАЕС: 113639,92мкмоль/г ) и в зачительной степени превышает абсолютное значение ОАА, измеренное для сырья плодов клюквы,что обусловлено увеличением концентрации полифенольных соединений в 1г исходного сырья и полученного сухого экстракта.
На основании полученных данных разработан проект фармакопейной статьи (ФС) Плодов клюквы болотной экстракт сухой
3. Получение и оценка качества гелей стоматологических на основе сухого экстракта плодов клюквы болотной.
Оценка физико - химической совместимости ингредиентов (скрининг основ).
При изготовлении стоматологических гелей придерживались общепринятой технологической схемы приготовления мягких лекарственных форм. В качестве гелеобразователей использовались производные целлюлозы (ГПЦ, ГЭЦ, МЦ) ПЭГи и альгинат натрия. При изготовлении стоматологических гелей придерживались общепринятой технологической схемы изготовления мягких лекарственных форм.
Все гели на Na-KМЦ и ПЭГах были отбракованы по причине явной несовместимости ингредиентов разрабатываемого геля (композиции жидкие, не образуют структуры геля; наблюдается выпадение осадка или образование зернистой структуры).
Полученные композиции на основе ГЭЦ и ГПЦ и МЦ имели необходимую структуру геля без значительного количества пузырьков, но распределение экстракта в основе было неравномерным к тому же, спустя 2-3 часа по завершению образования геля, в системе обнаруживались признаки фармацевтической несовместимости: высаливание основы, нитевидные конгломераты экстракта.
Отработанная на ГПЦ и ГМЦ методика изготовления геля была применена для изготовления гелей на альгинате натрия, за исключением того, что после образования гелевой структуры и добавления глицерина, композицию перемешивали и оставляли на 2 часа для лотстаивания (удаления пузырьков воздуха). Время на изготовление геля требовалось меньше (от 2 до 4 часов). Экстракт в полученной гелевой композиции был распределен равномерно.
Совершенствование прописи геля на основе экстракта плодов клюквы
При совершенствовании состава геля было установлено, что полученный состав имел рН, равный 3,3. Такой гель не применим для лечения и профилактики воспалительных заболеваний парадонта, т.к. рН ротовой полости в норме составляет 5,5 -6,5. Частичной нейтрализации кислотности добивались путем прибавления к сухому разведенному в воде экстракту гидроксида натрия. Выбор последнего обусловлен тем, что использование карбонатов и анионов слабых органических кислот, способных вызвать подщелачивание среды оказалось не возможно в данном случае: карбонаты вытеснялись суммой органических кислот, присутствующих в экстракте, а анионы слабых органических кислот (цитрат, бензоат) не способны увеличить водородный показатель на 2 единицы вследствие более низкого интервала перехода рН. Расчет необходимого количества сухой щелочи производили по результатам титрования геля с кислым значением рН стандарт-титром натрия гидроксида. Рассчитанное значение составило 0,05 г. сухой щелочи на 10 г геля.
В целях увеличения срока годности стоматологического геля в его рецептуру вводили консерванта (Гермаль Плюс), предотвращающей размножение микроорганизмов в основе и значительно потенцирующий общую антимикробную активность разработанного геля.
На основании проведенных исследований был выбран оптимальный состав геля с экстрактом плодов клюквы:
Экстракт плодов клюквы болотной сухой 10,0
Альгинат натрия 4,0
Натрия гидроксид 0,5
Гермаль плюс 0,5
Глицерин 13,0
Вода очищенная до 100,0
Полученные гели представляют собой полупрозрачную однородную массу красно-фиолетового цвета с характерным клюквенным запахом.
Разработка характеристик показателей качества и стабильности геля с сухим экстрактом плодов клюквы
Результаты проведенных качественных реакций и ВЭЖХ анализа показали, что в сухом экстракте и в извлечениях из гелей обнаружены идентичные БАВ из групп: органические кислоты, катехины, флаводоиды, и антоцианы.
При разработке метода стандартизации по показателю количественное определение полученного стоматологического геля использовали группу органических кислот (3,343 мг/г).
Для разработанной лекарственной формы и гидрофильной основы определена осмотическая активность. Исследования показали, что введение в гидрофильную основу растительного экстракта и сопутствующих компонентов геля приводит к повышению осмотической активности, что связано с содержанием кинетически-активных частиц добавляемого экстракта. Измеренное осмотическое давление составило более 2968 мОсм для образца геля, что оценивается как высокое.
По величине задержки роста исследование антимикробной активности геля с сухим экстрактом плодов клюквы болотной показало, что разработанная композиция геля обладает выраженной бактерицидной активностью в отношении E. coli (16,0мм), Enterococcus spp (15,0мм); S. аureus (15,0мм), Streptococcus mutans (19,0мм), Neisseria sicca (14,0мм), P. Vulgaris (18,0мм), Ps. Aeruginosa (17,0мм); так же обладая выраженной фунгицидную активностью в отношении Candida utilis (10,0мм), что, вероятно, обусловлено введением в состав консерванта.
Определение срока годности геля проводили методом ускоренного старения при повышенной температуре и в условиях хранения при комнатной температуре (202 С) в закупоренных алюминиевых тубах. Качество геля в процессе хранения при повышенной и комнатной температуре оценивали по показателям: внешний вид, цвет, запах, вкус, водородный показатель (рН), суммарное содержание органических кислот в пересчете на яблочную кислоту и микробиологическую чистоту. Определенный срок годности составил 270 суток при 20 С.
Проведенные физико-химические и микробиологические исследования сухого экстракта плодов клюквы болотной и геля на его основе, позволяют предположить, что соединения, входящие в состав полученной лекарственной формы способны оказать комплексное терапевтическое воздействие на слизистую полости рта, антимикробное, антиаксидантное и каилляроукрепляющее. При этом быть хорошо переносим больными независимо от возраста с возможностью применения как с профилактической целью, так и для продолжительных курсов лечения.
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
- Проведен анатомо-морфологический анализ, уточнены и обобщены основные диагностические признаки плодов клюквы. продольном срезе в мякоти плода идентифицируется сетью хорошо развитых жилок; экзокарпий плода состоит из крупных, многоугольных клеток, с четковидно утолщеными в углах оболочками. Наружная стенка эпидермальных клеток значительно утолщена и имеет красный цвет. Под эпидермой располагается 1 слой колленхимных клеток. Мякоть плода состоит из тонкостенных клеток, увеличивающих свой размер к эндокарпию. Проводящая система представлена сосудами. Эндокарпий представлен многослойной склеренхимой.
- Проведен сравнительный количественный анализ химического состава плодов клюквы в зависимости от различных способов переработки и хранения: идентифицированы органические, в том числе оксикоричные и бензойная кислоты, флавоноиды, катехины, проантоцицианидины и антоцианы. Подтвержден специфический маркер (пеонидин-3-арабинозид) и предложены неспецифические (фурфурол, 2-фуранметанол, бензиловый спирт и бензойная кислота) маркеры, позволяющие стандартизовать не только исходное сырье - плоды клюквы болотной, но и продукты их переработки. Определена антиоксидантная активность исходного сырья плодов клюквы, которая составила 91,950,93 мкмоль/г ТАЕС;
- Оптимизирована методика потенциометрического определения суммы органических кислот плодов клюквы болотной, доказана достоверность и сходимость с результатами ВЭЖХ-исследования. Полученные результаты легли в основу разработанного проект фармакопейной статьи (ФС) на новый вид лекарственного растительного сырья (ЛРС);
- Модифицирована технологическая схема получения сухих экстрактов из плодов клюквы болотной в условиях промышленного предприятия. В качестве экстрагента рекомендован 60% этанол; на стадии подготовки сырья и вспомогательных веществ рекомендовано ввести дополнительных этап стерилизации носителя сухого экстракта.
- Проведен сравнительный фитохимический анализ БАВ исходного сырья и экстракта. В полученном экстракте методами качественного и количественного анализа подтверждено присутствие органических, в том числе оксикоричных и бензойной кислот, флавоноиды, катехины, проантоцицианидины и антоцианы; обнаружены специфические и неспецифические маркеры, тем самым установлена идентичность в фитохимическом составе исходного сырья и полученного сухого экстракта. Разработан проект нормативного докумeнта для стандартизации полученного сухого экстракта.
- Разработан и научно обоснован оптимальный состав и технологическая схема получения геля на основе сухого экстракта плодов клюквы болотной частично нейтрализованного по содержанию органических кислот натрия гидроксидом с использованием в качестве гелеобразователя натрия альгината; в качестве пластификатора и коррегента вкуса - глицерина, консерванта - Гермаль плюс .
- Проведена оценка качества полученного геля по основным показателям. - внешний вид, величина рН (5,5-5,8), осмотическая (не менее 2968 мОсм) и антимикробная активности, подлинность (метод ВЭЖХ) и количественное определение суммы органических кислот методом ВЭЖХ (33,43мг/г) и потенциометрии (0,05% в пересчете на яблочную кислоту).
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Ермакова В.Ю., Решетняк В.Ю., Нестерова О.В. Оценка актуальности создания новых фитопрепаратов на основе экстрактов плодов клюквы // Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации / Материалы научно-практической конференции. - Ташкент, 2007. - С. 213 - 214.
- Ермакова В.Ю., Решетняк В.Ю., Нестерова О.В., Кондрашев С.В. Изучение химического состава, антимикробной и антиоксидантной активности клюквы болотной (Oxycoccus palustris) - перспективного сырья для создания стоматологических препаратов // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции / Сборник научных трудов. - Вып. 63. - Пятигорск, 2008. - С. 248 - 250.
- Ермакова В.Ю., Решетняк В.Ю., Нестерова О.В., Кондрашев С.В. Фитохимическое изучение состава плодов клюквы. // Сборник тезисов XY Российского национального конгресса Человек и лекарство. М.: Медицина, 2008.ЧС.569-570.
- Ермакова В.Ю., Решетняк В.Ю., Кузьменко А.Н., Дунин А.С. Сравнительное изучение химического состава плодов и сухого экстракта клюквы болотной. // Сборник тезисов XYI Российского национального конгресса Человек и лекарство. М.: Медицина, 2009.ЧС.657.
- Ермакова В.Ю., Решетняк В.Ю., Нестерова О.В., Абизов Е.А. Морфолого-анатомическое исследования плодов и семян клюквы болотной. // Сборник тезисов XYI Российского национального конгресса Человек и лекарство. М.: Медицина, 2009.ЧС.657.
- Ермакова В.Ю., Решетняк В.Ю., Нейман П.Л., Кондрашев С.В. Сравнительное изучение фитохимического состава плодов клюквы болотной в зависимости от способов переработки и хранения // Естественные и технические науки. Ц 2011. Ц № 6 (56). Ц С. 245 Ц 249.
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по медицине