Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по техническим специальностям  

На правах рукописи

КОЛОТВИНА СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА

РАЗРАБОТКА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА В ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ

МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ

Специальности	05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ
	05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата технических наук

Воронеж - 2012

Работа выполнена на кафедре Технология мяса и мясных продуктов федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московский государственный университет пищевых производств (ФГБОУ ВПО МГУПП)

Научный руководитель:	академик РАСХН, д.т.н., профессор Титов Евгений Иванович (ФГБОУ ВПО Московский государственный университет пищевых производств)
Официальные оппоненты:	доктор технических наук, профессор Кудряшов Леонид Сергеевич (главный научный сотрудник ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова РАСХН)
	кандидат технических наук Молочников Михаил Владимирович (директор отдела MEAT Группа Компаний Протеин. Технологии. Ингредиенты)
Ведущая организация:	ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт птицеперерабатывающей промышленности РАСХН

Защита диссертации состоится л25 декабря 2012 года в 13 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д 212.035.04 при ФГБОУ ВПО Воронежский государственный университет инженерных технологий по адресу: 394036, г. Воронеж, проспект Революции, 19, ауд. 035.

Отзывы на автореферат (в двух экземплярах), заверенные гербовой печатью учреждения, просим направлять по адресу: 394036, г. Воронеж, пр. Революции, 19, ФГБОУ ВПО ВГУИТ, ученому секретарю диссертационного совета Д 212.035.04.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО Воронежского государственного университета инженерных технологий.

Автореферат размещен в сети Интернет на официальном сайте Министерства образования и науки РФ vak2.ed.gov.ru и на официальном сайте ФГБОУ ВПО ВГУИТ л23 ноября 2012 г.

Автореферат разослан л23 ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета на соискание ученой степени кандидата технических наук, на соискание ученой степени доктора технических наук

В.С. Слободяник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работ

Согласно распоряжению Правительства Российской Федерации № 1873-р от 25 октября 2010 г. Основы государственной политики Российской Федерации в области здорового питания населения на период до 2020 г потребление пищевых продуктов, содержащих большое количество жира животного происхождения, приводит к росту избыточной массы тела и ожирению, распространенность которых за последние 8Ц9 лет возросла с 19 до 23 %, увеличивая риск развития сахарного диабета, заболеваний сердечно-сосудистой системы и других болезней. Максимальная суточная норма поступления холестерина в организм человека составляет 300 мг, только в мясе и мясных продуктах может содержаться в среднем 60Ц73 мг/100 г продукта. В связи с этим получение мясных продуктов с пониженным содержанием холестерина является актуальным и перспективным направлением современной мясной промышленности.

Имеются сведения (M. Juskiewicz, A.A. Lafraya, H. Panfil-Kuncewicz, E. Sekyl, M. Ziarno) о способности молочнокислых микроорганизмов, используемых в качестве заквасочных культур при производстве кисломолочных продуктов, в том числе йогуртов, снижать содержание холестерина в процессе производства продукта.

В настоящее время в мясной промышленности производство ферментированных мясных продуктов (сырокопченых и сыровяленых изделий) предусматривает целенаправленное использование биотехнологических методов, основанных на применении различных видов микроорганизмов. Теоретическим и практическим работам в области пищевой биотехнологии посвящены научные труды ряда ученых:  Л.В. Антиповой, В.И. Ганиной, А.А. Жаринова, Ю.Г. Костенко, Л.С. Кудряшова,  Н.Н. Липатого мл., А.Б. Лисицына, Н.Г. Машенцевой, Л.Ф. Митасевой, И.А. Рогова,  Е.И. Титова, В.В. Хорольского. Однако в доступных литературных источниках данных о влиянии микроорганизмов на уровень содержания холестерина в мясных продуктах не обнаружено.

Мясные продукты являются благоприятной средой для развития санитарно-показательной микрофлоры, поэтому при их производстве и хранении существуют высокие риски возникновения опасности для здоровья потребителя. Для гарантии безопасности мясопродуктов, не подвергающихся тепловой обработке, Институт питания РАМН обязательно рекомендует в технологиях их производства предусматривать добавление в рецептуру эффективных в отношении санитарно-показательной микрофлоры стартовых культур (Шевелева С.А., 2007). Все это требует от производителей поиска новых современных высокоспецифичных и чувствительных методов для оценки санитарно-гигиенической картины мясных изделий, а также мониторинга динамики развития стартовых культур. Одним из таких методов является метод ПЦР в реальном времени. Наряду с этим возросшие потребительские требования к качеству готовой мясной продукции делают актуальным применение в производственном процессе систем и принципов управления качеством и безопасностью продукции.

Цель и задачи исследования

Целью работы является разработка бактериальной композиции, снижающей содержание холестерина при производстве сыровяленого продукта из свинины, с учетом обеспечения безопасности мясного продукта.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Провести скрининг стартовых культур из коллекции МГУПП, способных снижать содержание холестерина in vitro.
2. Выбрать штаммы с максимальными холестеринснижающими свойствами, сгруппировать их в бактериальную композицию и протестировать на отсутствие антагонизма внутри композиции.
3. Адаптировать метод ПЦР в реальном времени для прямой детекции санитарно-показательной микрофлоры и стартовых культур в мясном сырье и мясных продуктах, разработать способ пробоподготовки мясных образцов, определить условия выделения ДНК микроорганизмов.
4. Установить влияние бактериальной композиции на снижение содержания холестерина и уровня введения нитрита натрия при производстве сыровяленого продукта из свинины.
5. Провести комплексное исследование физико-химических, биохимических, микробиологических, в т.ч. методом ПЦР-РВ, и органолептических показателей сыровяленого мясного продукта с бактериальной композицией.
6. Разработать проект технической документации на сыровяленый мясной продукт с бактериальной композицией.
7. Изучить риски, характерные для производства сыровяленого продукта из свинины с добавлением бактериальной композиции, влияющие на качество и безопасность готового продукта, и разработать предупреждающие действия для предотвращения рисков.

Научная новизна работы

• Установлено, что способность изученных стартовых культур снижать уровень холестерина in vitro является штаммоспецифичным признаком. Выявлены штаммы, обладающие максимальными холестеринснижающими свойствами: Lactobacillus  curvatus 1, Pediococcus pentosaceus 28 и Staphylococcus carnosus 108, которые сгруппированы в бактериальную композицию с учетом отсутствия антагонизма между штаммами внутри композиции.

• Адаптирован метод ПЦР в реальном времени с флуоресцентной схемой детекции для идентификации санитарно-показательной микрофлоры и мониторинга стартовых культур, а именно подобраны методика выделения ДНК и тест-системы для идентификации ДНК микроорганизмов, проведена оптимизация разработанных тест-систем по температурному и временному профилю реакции.
• Разработан способ пробоподготовки исследуемых мясных образцов для их анализа методом ПЦР в реальном времени.
• Разработан олигонуклеотидный зонд на 16S рРНК ген для выявления Staphylococcus carnosus методом ПЦР в реальном времени.
• Установлено, что введение бактериальной композиции, содержащей штаммы Lactobacillus curvatus 1, Pediococcus pentosaceus 28 и Staphylococcus carnosus 108, в технологию сыровяленого мясного продукта, обеспечивает снижение содержания холестерина в продукте на 21,4%.

Практическая значимость работы

• Разработана бактериальная композиция, снижающая содержание холестерина в сыровяленом продукте из свинины. Установлено, что введение бактериальной композиции позволяет интенсифицировать процесс сушки до 20 сут, а также способствует формированию насыщенного цвета, плотной структуры, придает специфический вкус, аромат готовому продукту, обеспечивает микробиологическую стабильность продукта и замедляет окислительные процессы.
• На типовых штаммах стартовых культур и мясном сырье, искусственно обсемененном санитарно-показательной микрофлорой, подтверждена чувствительность и специфичность разработанных тест-систем для идентификации ДНК микроорганизмов методом ПЦР в реальном времени.
• Разработан план ХАССП, обеспечивающий контроль и управление за всеми технологическими рисками при производстве сыровяленого продукта из свинины с использованием бактериальной композиции. Показано, что применение метода ПЦР-РВ позволяет проводить своевременный контроль в ККТ № 2 (сушка), а введение бактериальной композиции - повысить микробиологическую безопасность в этой точке. Денитрифицирующий штамм Staphylococcus carnosus 108, содержащийся в бактериальной композиции, дает возможность снизить введение нитрита натрия с рассолом до 0,03% и гарантировать безопасность в ККТ № 1.1 и 1.2 (приготовление и внесение в рассол раствора нитрита натрия).
• Разработано и опубликовано учебно-методическое пособие по идентификации санитарно-показательной микрофлоры и стартовых культур в мясных изделиях методами ПЦР в реальном времени и ПЦР с электрофоретической детекцией.
• Разработан проект технической документации на сыровяленый продукт из свинины с пониженным содержанием холестерина.

Работа выполнялась в рамках Гранта Президента Российской Федерации  МД-3302.2012.4 Поиск и идентификация биорегуляторов систем гомеостаза организма человека, входящих в состав функциональных продуктов питания.

Апробация работы

Основные положения работы и результаты исследований были представлены на следующих конкурсах и конференциях: VI, VII, IX Международная научная конференция студентов и молодых ученых Живые системы и биологическая безопасность населения (Москва, 2007, 2008, 2011); Международная научно-практическая конференция Биотехнология. Вода и пищевые продукты (Москва, 2008); 11-ая Международная научная конференция памяти В.М. Горбатова Тенденции и перспективы развития инновационных и информационных технологий перерабатывающей промышленности (Москва, 2008); V, VI Московский международный конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 2009, 2011); I Всероссийская студенческая научная конференция Молодежная наука - пищевой промышленности России (Ставрополь, 2009); 15-ая Международная выставка химической промышленности и науки Химия - 2009 (Москва, 2009); Международная научная конференция студентов и молодых ученых Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания (Москва 2009); Международная научно-практическая конференция Биотехнология: экология крупных городов (Москва, 2010); VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием Молекулярная диагностика - 2010 (Москва, 2010); 13-ая Международная научная конференция, посвященная памяти Василия Матвеевича Горбатова и 80-летию ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии Инновационные аспекты переработки мясного сырья и создания конкурентоспособных продуктов питания (Москва, 2010).

Результаты работы отмечены дипломом на конкурсе проектов молодых ученых Химия - 2009 (Москва, 2009); дипломом и медалью за научную работу по оценке безопасности мясных продуктов на основе видоспецифической ПЦР и ПЦР в реальном времени, представленную на конкурсе молодых ученых на лучшую научно-исследовательскую работу в рамках VI международного конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, 2011); грамотой за участие в IX международной конференции студентов и молодых ученых Живые системы и биологическая безопасность населения (Москва, 2011).

Публикации

По результатам исследований, изложенных в диссертационной работе, опубликовано 19 печатных работ, в т.ч. статей в журналах, рекомендованных ВАК - 4; одно учебно-методическое пособие для студентов направления подготовки уровня магистратуры 260200 и 110500; получен патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, экспериментальной части с обсуждением результатов исследований, выводов, списка литературы, содержащего 149 источников, в том числе 79 работ зарубежных авторов, и 9 приложений. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 34 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность темы диссертационной работы и изложена ее общая характеристика.

Глава 1. Обзор литературы. Представлен анализ научно-технической литературы по оценке способности молочнокислых бактерий снижать уровень холестерина в питательной среде in vitro и в ферментированных пищевых продуктах, описан механизм использования холестерина микроорганизмами в процессе их метаболизма. Перечислены основные аспекты производства ферментированных мясных продуктов. Освещены современные молекулярно-генетические методы, используемые для идентификации ДНК микроорганизмов. Показана возможность использования молекулярно-генетических методов для оценки санитарно-гигиенической картины мясных изделий. Обоснован выбор метода ПЦР в реальном времени и способа выявления продуктов амплификации в режиме реального времени. Рассмотрены основные вопросы управления качеством и безопасностью пищевых продуктов, приведены существующие методы оценки рисков и подходы к управлению рисками.

Глава 2. Организация постановки эксперимента и методы исследований.

Представлена схема проведения эксперимента (рис. 1), дана характеристика объектов исследований, указаны исследуемые показатели и изложены методы их определений.

В работе использовались следующие методы исследований: 1 - определение массовой доли белка на полуавтоматическом приборе Kjeltec System 1002 Tecator, Швеция; 2 - массовой доли влаги по ГОСТ Р 51479; 3 - массовой доли жира методом Сокслета по ГОСТ 23042; 4 - массовой доли золы по ГОСТ Р 53642; 5 - массовой доли хлорида натрия по ГОСТ 9957; 6 - величины рН потенциометрическим методом (Журавская Н.К., 1985); 7 - массовой доли нитрита натрия по ГОСТ 29299;  8 - нитрозопигментов (Hornsey H.C., 1956); 9 - активности воды на автоматическом анализаторе Roremeter RM-10, Германия; 10 - степени окисления жира по перекисному числу по ГОСТ 8285; 11 - кислотного числа по ГОСТ Р 50457; 12 - органолептическая оценка по ГОСТ 9959; 13 - бактериологического анализа по  ГОСТ 9958; 14 - выделение ДНК с использованием набора реагентов AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit производства компании Axygen Scientific, Inc., США;  15 - постановка ПЦР в реальном времени на амплификаторе Rotor-Gene 3000;  16 - содержания холестерина in vitro колориметрически по методу Златкиса-Зака;  17 - антагонистической активности методом перпендикулярных штрихов (Лысак В.В., 2002); 18 - массовой концентрации холестерина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на жидкостном хроматографе Knauer со спектрофотометрическим детектором K-2500, Германия; 19 - статистическая обработка экспериментальных данных (Журавская Н.К., 1985).

Объектами исследований являлись:

стартовые культуры Lactobacillus curvatus 1 (B-8889), 2 (B-8906), 102 (В-8900), 301-1 (В-8954), CDN (В-8948); Lactobacillus sakei 35 (В-8886), 45 (В-8896), 101 (В-8939), 103 (В-8932), 104 (В-8936), 105 (В-8905), 306-1 (В-8952); Lactobacillus casei 10 (В-8890), Lactobacillus plantarum 19 (В-8907), 100 (В-8899), 7K (В-2663), 22/2 (В-1615), 2П (В-1616), 31 (В-1617), 32 (В-1618); Pediococcus acidilactici 3 (В-8891), 8 (В-8897), 15 (В-8895), 25  (В-8892), 27 (В-8893), 33 (В-8903), 34 (В-8887), 38 (В-8902); Pediococcus pentosaceus 23  (В-8894), 28 (В-8888), 31 (В-8901), 39 (В-8898), 106 (B-8935); Pediococcus claussenii 9 (B-8908), Staphylococcus carnosus 108 (B-8953), SAL-1 (B-8946), 96-2 (B-8947), Staphylococcus carnosus 301-2 (B-8950), 111-2 (B-8951); Staphylococcus xylosus 45 (B-8945), P-1 (B-8944);

Рис. 1 Схема проведения эксперимента

санитарно-показательные микроорганизмы Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P (В-6646), Escherichia coli К 12 С 600 (В-1010), Proteus vulgaris АТСС 13315 (В-1667), Salmonella typhimurium LT2 (В-3533) и Listeria monocytogenes 766 из ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика и ГКПМ ГИСК им Л.А. Тарасевича;

бактериальные препараты Бактоферм T-SP и Бактоферм LL-1 производства компании Христиан Хансен, Германия;

свинина в охлажденном состоянии (длиннейшая мышца спины) и сыровяленый мясной продукт, изготовленный с использованием бактериальной композиции.

Глава 3. Исследование способности стартовых культур снижать уровень холестерина in vitro. Способность стартовых культур снижать уровень холестерина обусловлена деструкцией холестерина бактериями в процессе их метаболизма. Для подтверждения этого был проведен скрининг 41 штамма стартовых культур из коллекции МГУПП. Измерение содержания холестерина в среде осуществляли колориметрическим методом Златкиса-Зака, основанным на появлении красно-фиолетового окрашивания при взаимодействии холестерина с уксусной и серной кислотами в присутствии хлорного железа (рис. 2).

Рис. 2 Снижение холестерина стартовыми культурами

Установлено, что из 41 исследуемого штамма холестеринснижающей способностью не обладали всего 3 микроорганизма, остальные микроорганизмы снижали холестерин от 2,8% до 24,3%, при этом штамм Lactobacillus curvatus 1 снизил содержание холестерина в среде на 32%.

Учитывая полученные результаты, а также технологические свойства штаммов, обладающих максимальной холестеринснижающей способностью, были выбраны три штамма: Lactobacillus curvatus 1 (32%), Pediococcus pentosaceus 28 (22%), Staphylococcus carnosus 108 (15,2%), при этом штамм Staphylococcus carnosus 108 также обладает денитрифицирующей способностью, что позволит не только снизить содержание холестерина, но и получить продукт со стабильной окраской и с пониженным содержанием остаточного нитрита натрия в готовом продукте за счет более полного его восстановления до NO. Выбранные штаммы были сгруппированы в бактериальную композицию. В данной работе было принято соотношение штаммов 1:1:1 с учетом значимости технологических свойств каждого в отдельности штамма и их способности снижать содержание холестерина.

Для микроорганизмов, входящих в бактериальную композицию, необходимо учитывать способность культур сосуществовать между собой, не подавляя рост друг друга. Для изучения отсутствия антагонизма между этими штаммами использовался метод перпендикулярных штрихов (рис. 3).

а	б

Рис. 3 Совместный рост штаммов стартовых культур:

Lactobacillus curvatus 1 (В-8889), Pediococcus pentosaceus 28 (В-8888)

и Staphylococcus carnosus 108 (В-8953)

По активному и равномерному росту, отсутствию зон задержки роста микроорганизмов в области их соприкосновения, установлена возможность совместного использования этих штаммов в бактериальной композиции.

Глава 4. Адаптация метода ПЦР в режиме реального времени для выявления санитарно-показательной микрофлоры и стартовых культур. Адаптация метода ПЦР-РВ заключалась в разработке способа пробоподготовки исследуемых мясных образцов, применении современных способов выделения ДНК, подборе и разработке тест-систем для идентификации ДНК микроорганизмов, оптимизации разработанных тест-систем по температурному и временному профилю реакции.

В работе предлагается новый подход, осуществляющий комплексное выявление как санитарно-показательной микрофлоры, так и стартовых культур в мясном сырье и готовых продуктах [патент № 2460801].

Разработанный подход позволяет упростить стадию обогащения исследуемых образцов за счет исключения использования двух скрининговых питательных сред для отдельного выявления санитарно-показательных микроорганизмов и стартовых культур в мясных продуктах, а также обнаружить нормируемые в мясных продуктах Salmonella typhimurium и Listeria monocytogenes в пороговых дозах, соответствующих гигиеническим требованиям СанПиНа (отсутствие в 25 г продукта).

Для выделения ДНК из бактериальных клеток использовался набор реагентов AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit производства компании Axygen Scientific, Inc. (США).

На основе анализа литературных источников был осуществлен подбор видоспецифических праймеров и олигонуклеотидных зондов на консервативные 16S и 23S участки генов для выявления бактерий видов Lactobacillus curvatus, Staphylococcus carnosus и Pediococcus pentosaceus. Специфичность разработанных праймеров и зондов была проверена с помощью программы BLAST on-line.

В связи с тем, что ранее исследований по выявлению Staphylococcus carnosus с помощью ПЦР-РВ не проводилось, была выбрана стратегия подбора олигонуклеотидного зонда, которая основана на компьютерном анализе нуклеотидных последовательностей 16S рРНК гена в базе данных GenBank с учетом выбранных праймеров. Последовательность зонда тестировали, используя on-line базу данных BLAST.

Для выявления Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus spp. и Listeria monocytogenes методом ПЦР с флуоресцентной детекцией результата в режиме реального времени применяли готовые наборы КОЛИПОЛ-РВ, СТАФИПОЛ-РВ, ПРОТЕПОЛ-РВ и ЛИСТЕРОПОЛ-РВ производства НПФ Литех (Россия). Для выявления Salmonella typhimurium использовали набор АмплиСенсо Salmonella typhi-FL производства ЦНИИ эпидемиологии (Россия).

Постановка ПЦР-РВ для выявления стартовых культур и санитарно-показательной микрофлоры проводилась на приборе Rotor-Gene 3000 производства Corbett Research (Австралия).

Подтверждение эффективности применяемой методики выделения ДНК и протоколов ПЦР-амплификации осуществлялось на типовых штаммах стартовых культур: Staphylococcus carnosus 108, Lactobacillus curvatus 1, Pediococcus pentosaceus 28 и мясном сырье с искусственным обсеменением санитарно-показательной микрофлорой: Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P, Escherichia coli К 12 С 600, Proteus vulgaris АТСС 13315, Salmonella typhimurium LT2, Listeria monocytogenes 766 (рис. 4).

а 1) Staphylococcus carnosus; 2) Lactobacillus curvatus; 3) Pediococcus pentosaceus; 4) отрицательный контроль.

б 1) Salmonella typhimurium; 2) Staphylococcus aureus; 3) Escherichia coli; 4) Proteus vulgaris; 5) Listeria monocytogenes 6) отрицательный контроль.

Рис. 4 Результаты ПЦР-РВ при анализе ДНК типовых штаммов стартовых культур и санитарно-показательных микроорганизмов в мясном сырье с искусственным обсеменением

В ходе исследования ДНК штаммов стартовых культур и санитарно-показательной микрофлоры в контаминированном сырье в каждом случае были получены положительные результаты, т.к. в процессе амплификации регистрировали кинетические кривые, которые поднимались выше флуоресцентного шума с выходом на плато к концу реакции.

Следует отметить, мясное сырье (охлажденная свинина) было искусственно обсеменено микроорганизмами для того, чтобы показать, что тест-системы позволяют идентифицировать не только чистые культуры микроорганизмов, но и бактерии, содержащиеся непосредственно в сырье.

Полученные результаты подтверждают специфичность разработанных тест-систем и возможность использования коммерческих наборов для анализа мясных продуктов.

Для относительной количественной оценки ДНК микроорганизмов был применен метод калибровочного графика. Этот метод предполагает построение калибровочных графиков с серией разведений ДНК микроорганизмов, которые впоследствии используются для определения концентрации микроорганизмов в экспериментальных образцах. Для создания калибровочных графиков были использованы 24-часовые жидкие культуры микроорганизмов с известным значением КОЕ/мл, полученные по стандарту мутности и подтвержденные в посевах на плотной среде. Результаты количественного анализа штаммов с концентрацией 103Ц109 КОЕ методом ПЦР-РВ представлены на рисунке 5Ца на примере Escherichia coli.

Известно, что момент заметного усиления сигнала и отрыв его от базовой линии, так называемый пороговый цикл, зависит от исходного количества ДНК-мишени. Чем больше количество ДНК в образце, тем раньше наблюдается начало роста сигнала флуоресценции. Рост кинетической кривой (рис. 5Ца) детектируется приблизительно на 15 цикле для концентрации микроорганизма 109 КОЕ, и постепенно при снижении концентрации микроорганизма до 103 КОЕ, детекция продуктов реакции регистрируется на 35 цикле. Подобная картина наблюдалась для всех штаммов исследуемых микроорганизмов.

На основании полученных кривых программа Rotor Gene 3000 сама строит калибровочный график, показывающий зависимость концентрации ДНК от уровня флуоресценции, а также выдает цифровое значение цикла, соответствующее исследуемой концентрации. Количественный анализ результатов представлен на рисунке 5Цб на примере Escherichia coli.

а анализ ДНК Escherichia coli концентрацией 103Ц109 КОЕ/мл

б график зависимости уровня флуоресценции от концентрации ДНК для Escherichia coli

Рис. 5 Результаты анализа ДНК Escherichia coli ПЦР-РВ

Аналогичным способом были проанализированы все исследуемые микроорганизмы и установлена зависимость цикла от концентрации микроорганизмов (табл. 2).

Значения, представленные в таблице 1, позволят определять относительное количественное содержание микроорганизмов, присутствующих в экспериментальных образцах.

Таблица 1

Зависимость цикла от концентрации микроорганизмов

Цикл амплификации для	Концентрация, КОЕ/мл
	109	108	107	106	105	104	103
Escherichia coli	14,20	17,63	21,23	25,01	28,61	32,01	35,65
Staphylococcus aureus	15,50	19,51	23,63	26,88	30,70	34,52	38,34
Proteus spp.	12,39	15,50	19,38	23,06	26,72	30,42	33,57
Listeria monocytogenes	16,67	18,12	21,08	24,85	29,00	34,97	39,10
Salmonella typhimurium	13,89	17,66	21,28	24,75	31,46	33,01	37,12
Lactobacillus curvatus	11,56	15,83	19,15	22,25	26,61	32,30	35,82
Staphylococcus carnosus	17,03	20,20	24,01	26,38	29,11	35,01	39,30
Pediococcus pentosaceus	15,66	16,52	19,76	22,63	26,89	32,36	35,62

Таким образом был адаптирован метод ПЦР-РВ для идентификации стартовых культур видов Staphylococcus carnosus, Lactobacillus curvatus, Pediococcus pentosaceus и выявления санитарно-показательной микрофлоры: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus spp., Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes в контаминированном сырье. Показана специфичность и чувствительность метода и определена зависимость результата реакции от концентрации микроорганизма.

Глава 5. Оценка эффективности использования бактериальной композиции в технологии сыровяленого мясного продукта. Для исследования влияния бактериальной композиции на уровень содержания холестерина и апробации метода ПЦР-РВ были выработаны пять экспериментальных образцов сыровяленого мясного продукта из свинины.

Образец № 1 не содержал бактериальные культуры.

Образец № 2 содержал культуры импортных бакпрепаратов Бактоферм T-SP (Staphylococcus carnosus и Pediococcus pentosaceus) и Бактоферм LL-1 (Lactobacillus curvatus) компании Христиан Хансен, Дания. Эти бакпрепараты вносили в образец № 2 в количестве 109 КОЕ/г в соотношении 2:1 (таким образом видовой состав вносимых микроорганизмов образца № 2 соответствовал видовому составу микроорганизмов образцов № 3Ц5).

В образцы № 3Ц5 вносили полученную бактериальную композицию (Lactobacillus curvatus 1, Pediococcus pentosaceus 28 и Staphylococcus carnosus 108) в количестве 109 КОЕ/г и соотношении 1:1:1. Отличие между образцами состояло в том, что для образцов № 4 и 5 была снижена концентрация нитрита натрия в рассоле с 0,075 до 0,05 и 0,03%, соответственно. Это связано с тем, что в бактериальную композицию входит денитрифицирующий штамм Staphylococcus carnosus 108. Снижение концентрации нитрита натрия при условии более полного его восстановления до NO позволит повысить безопасность готового продукта.

В течение всего технологического процесса проводили исследование микробиологических и физико-химических показателей мясного сырья и образцов мясного продукта.

При исследовании микробиологических показателей мясного сырья классическим бактериологическим анализом установлено, что общая обсемененность охлажденной свинины находится в пределах допустимых норм и соответствует требованиям СанПиНа 2.3.2.-1078.01, индекс 1.1.1.

Одновременно проводили контроль санитарно-гигиенического состояния мясного сырья методом ПЦР-РВ, который обнаружил присутствие Escherichia coli (рис. 6Ца). Это можно объяснить тем, что даже при наличии в сырье клеток бактерий в следовом количестве, которое невозможно выявить классическими микробиологическими методами, стадия обогащения позволяет повысить концентрацию микроорганизмов до уровня чувствительности метода ПЦР-РВ.

Полученные методом ПЦР-РВ результаты не являются основанием для выбраковки сырья, т.к. классический микробиологический анализ не выявил наличие Escherichia coli, однако служат индикатором его санитарно-гигиенической картины и позволят своевременно предпринять меры для исключения развития санитарно-показательной микрофлоры в продукте. Бактерии видов Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Proteus spp. и Listeria monocytogenes методом ПЦР-РВ в мясном сырье выявлены не были.

Микробиологическая оценка образцов мясного продукта в течение всего технологического процесса проводилась с помощью классического микробиологического анализа, а также методом ПЦР-РВ. Для этого в процессе сушки в асептических условиях отбирали пробы по 25 г от каждого образца на 0, 5, 10, 15 и 20 сут.

а 1) положительный контроль Ц Escherichia coli концентрацией 109;  2) Escherichia coli в мясном сырье; 3) положительный контроль Ц Escherichia coli концентрацией 103; 4) отрицательный контроль	б 1) положительный контроль Ц Escherichia coli концентрацией 109;  2) положительный контроль Ц Escherichia coli концентрацией 103; 3-7) Escherichia coli в процессе производства образца №1 на 0Ц20 сут сушки
в 1) положительный контроль Ц Escherichia coli концентрацией 109; 2) положительный контроль Ц Escherichia coli концентрацией 103; 3-7) Escherichia coli в процессе производства образца №2 на 0Ц20 сут сушки	г положительный контроль Ц Escherichia coli концентрацией 109; 2) положительный контроль Ц Escherichia coli концентрацией 103; 3-7) Escherichia coli в процессе производства образца №3 на 0 Ц 20 сут сушки

Рис. 6 Результаты ПЦР-РВ

Как видно из рисунка 6Цб, на 0 и 5 сутки в образце № 1 (не содержащем стартовые культуры) методом ПЦР-РВ было обнаружено присутствие Escherichia coli, такая же картина наблюдалась и на 10 сутки. Однако к 15 суткам данные бактерии не были идентифицированы, это можно объяснить тем, что в процессе сушки мясного продукта происходит уменьшение содержания влаги и понижение величины рН, ингибирующие рост Escherichia coli. В образце № 2 с культурами импортного производства регистрация Escherichia coli осуществлялась на 0 и 5 сутки, на 10 сутки бактерии вида Escherichia coli выявлены не были (рис. 6Цв). Полученные результаты показывают, что образец № 2 имеет наиболее благоприятную санитарно-гигиеническую картину по сравнению с образцом  № 1, это обусловлено тем, что микроорганизмы, входящие в состав бактериальных препаратов импортного производства, обладают антагонистическими свойствами по отношению к санитарно-показательной микрофлоре. При исследовании образца № 3 методом ПЦР-РВ Escherichia coli была идентифицирована только на 0 сутки, в ходе дальнейшего анализа эти бактерии не были выявлены (рис. 6Цг). Для образцов № 4 и 5 результаты были схожи с образцом № 3 (рисунки не приводятся).

Данные исследования иллюстрируют, что образцы № 1 и 2 уступают по санитарно-гигиеническому состоянию образцам № 3Ц5, это связано с тем, что стартовые культуры, входящие в состав разработанной бактериальной композиции, эффективнее ингибируют рост Escherichia coli.

Другие санитарно-показательные микроорганизмы видов Staphylococcus aureus, Proteus spp., Salmonella typhimurium и Listeria monocytogenes при производстве образцов мясного продукта методом ПЦР-РВ выявлены не были.

В ходе проведения классического микробиологического анализа в течение всего технологического процесса санитарно-показательной микрофлоры обнаружено не было. Образцы мясного продукта отвечали требованиям СанПиНа 2.3.2.-1078.01.

Для контроля развития стартовых культур на всем протяжении технологического процесса был проведен их мониторинг методом ПЦР-РВ с использованием видоспецифических тест-систем для исключения идентификации нежелательных близкородственных молочнокислых микроорганизмов, которые могут присутствовать в исходном сырье.

В образцах № 2Ц5 были выявлены стартовые культуры видов Lactobacillus curvatus, Staphylococcus carnosus и Pediococcus pentosaceus (рис. 7 на примере образца № 3).

а	б
в	Рис. 7 Результаты исследования методом ПЦР-РВ Lactobacillus curvatus (а), Staphylococcus carnosus (б), Pediococcus pentosaceus (в) в образце № 3 с 0 до 20 сут сушки

Как видно из рисунка 7, присутствие стартовых культур видов Lactobacillus curvatus, Staphylococcus carnosus и Pediococcus pentosaceus детектируется на 5 сутки сушки, рост кривых свидетельствует о наличии этих микроорганизмов. В процессе сушки наблюдается постепенное развитие стартовых культур в продукте, что позволяет проследить динамику роста микроорганизмов и подтверждает эффективность анализа ПЦР-РВ. Аналогичные данные были получены для образцов № 2, 4 и 5.

В образце № 1 (без добавления стартовых культур) при исследовании методом ПЦР-РВ бактерии видов Lactobacillus curvatus, Staphylococcus carnosus и Pediococcus pentosaceus не были идентифицированы, это объясняется тем, что образец не содержал целевую ДНК этих микроорганизмов. Таким образом, доказано отсутствие влияния конкурентных молекул ДНК на результат ПЦР-анализа, которые не снижают специфичность разработанных тест-систем при исследовании стартовых культур в мясных продуктах.

Наряду с микробиологическим контролем были определены показатели рН и влаги сырья и образцов мясного продукта в процессе сушки. Результаты исследований показали, что введение молочнокислых микроорганизмов в мясное сырье приводит к интенсивному снижению величины рН (рис. 8Ца) и обезвоживанию мясопродуктов (рис. 8Цб).

Из полученных данных видно, что у образцов № 2Ц5 общая динамика процесса сушки совпадает. Это, по всей видимости, обусловлено активностью стартовых культур - продуцентов молочной кислоты. У образца № 1 (без стартовых культур) к 20 сут сушки было самое высокое содержание влаги и значение величины рН.

В процессе производства образцов мясного продукта был исследован показатель активности воды (аw), который характеризует физико-химическое состояние влаги в продукте и позволяет судить о его микробиологическом состоянии (рис. 8Цв).

а	б
в

Рис. 8 а Ц Изменение величины рН в образцах мясного продукта в процессе производства; б Ц Динамика обезвоживания образцов мясного продукта в процессе производства; в Ц Динамика активности воды в образцах мясного продукта в процессе производства

При сопоставлении результатов молекулярно-генетических исследований и показателей активности воды видно, что в мясном сырье рост Escherichia coli обнаружен при аw = 0,957, это значение является оптимальным для жизнедеятельности многих санитарно-показательных микроорганизмов. В процессе производства мясного продукта происходит развитие стартовых культур, уменьшение содержания влаги в мясном сырье, снижение величины рН, что обуславливает снижение показателя активности воды. К 20 суткам сушки образцов мясного продукта рост санитарно-показательных микроорганизмов обнаружен не был, а значение активности воды снизилось до 0,831 в образце № 1, 0,809 - в образце № 2 и 0,815Ц0,819 у образцов № 3Ц5; эти результаты дают основание полагать, что продукт является микробиологически стабильным.

В связи с тем, что основным функциональным свойством содержащейся в образцах № 3Ц5 бактериальной композиции является способность снижать уровень холестерина, в готовых продуктах было определено содержание холестерина методом ВЭЖХ. Анализ образцов проводили с использованием хроматографической системы фирмы Knauer (Германия) со спектрофотометрическим детектором K-2500 и программным обеспечением Мультихром (рис. 9).

Рис. 9 Хроматограмма холестерина, содержащегося в: А Ц образце № 1; В Ц образце № 2; С Ц образце № 3. D Ц стандарт (холестерин)

В образце № 1 было выявлено наибольшее количество холестерина, которое составило 620,9 мг/кг. В связи с тем, что образец № 1 не подвергался воздействию стартовых культур, эти результаты были взяты за основу.

В образце № 2 с импортными стартовыми культурами содержание холестерина составило 547,9 мг/кг, что на 11,7% ниже, чем у образца № 1. Для импортных стартовых культур изучение способности снижать содержание холестерина in vitro не входило в задачи данной работы, однако согласно данным ВЭЖХ очевидно, что введение бактериальных препаратов Бактоферм T-SP (Staphylococcus carnosus и Pediococcus pentosaceus) и Бактоферм LL-1 (Lactobacillus curvatus) уменьшило количество холестерина в готовом продукте. Это можно объяснить тем, что ферментные системы входящих в состав препаратов микроорганизмов способны активно деструктурировать холестерин, содержащийся в мясном сырье.

Для образца № 3 с бактериальной композицией, содержащей штаммы, обладающие максимальными холестеринснижающими способностями, количество холестерина составило 487,8 мг/кг, что показывает преимущество по сравнению с образцами № 1 и 2. Так в образце № 3 уровень холестерина на 21,4% ниже, чем в образце № 1 без стартовых культур и на 10,9% ниже, чем в образце № 2 с культурами импортного производства. Эти данные подтверждают эффективность бактериальной композиции и позволяют позиционировать данный продукт как продукт с функциональной направленностью.

По общему химическому составу исследуемые образцы не имели принципиальных отличий (табл. 2).

Таблица 2

Физико-химические показатели готового продукта

Показатели	Образец № 1	Образец № 2	Образец № 3	Образец № 4	Образец № 5
Массовая доля, %:
Ц влаги	45,40 0,52	42,20 0,50	43,33 0,68	43,40 0,51	43,35 0,49
Ц белка	30,40 0,41	30,75 0,42	30,10 0,44	29,90 0,43	30,11 0,40
Ц жира	16,65 0,45	19,25 0,44	18,69 0,49	18,95 0,47	18,99 0,46
Ц золы, в т.ч. Ц хлористого натрия	6,1 0,10	6,4 0,09	6,3 0,09	6,3 0,08	6,3 0,10
	3,50 0,17	3,40 0,16	3,28 0,15	3,30 0,17	3,27 0,16
Ц нитрита натрия	0,0023 0,0002	0,0021 0,0002	0,0006 0,0002	0,0002 0,0002	Следы
Количество нитрозопигментов, %	81,4 0,09	82,2 0,09	88,5 0,08	83,6 0,08	80,7 0,08

Установлено, что за счет введения в рецептуру штамма Staphylococcus carnosus 108, обладающего денитрифицирующей активностью, в образце № 3 с традиционным уровнем введения в рассол нитрита натрия, существенно снижается массовая доля остаточного нитрита по сравнению с образцами № 1 и 2, при этом наблюдается максимальное содержание нитрозопигментов. Несмотря на уменьшение количества введения нитрита натрия у образцов № 4 и 5, содержание нитрозопигментов в них не уступает контрольным образцам, в то же время у данных образцов резко снижается массовая доля остаточного нитрита натрия.

Таким образом, применение бактериальной композиции, содержащей денитрифицирующий штамм Staphylococcus carnosus 108, позволяет снизить уровень вводимого в рассол нитрита натрия с 0,075% до 0,03%, при этом качество продукта не ухудшается в сравнении с продуктом, полученным без стартовых культур. Кроме того, за счет полного восстановления нитрита натрия исключается его поступление в организм человека, что придает продукту дополнительную безопасность.

При исследовании органолептических характеристик оценивали по 5-ти бальной системе внешний вид, вкус, цвет, аромат и консистенцию готовых мясных продуктов (рис. 10).

Рис.10 Органолептическая оценка образцов мясного продукта

Образец № 1 имел красноватый цвет на разрезе, приятный солоноватый вкус и слегка кисловатый аромат. Образец № 2 характеризовался ярко выраженным кисловатым запахом, при этом цвет и вкус соответствовали требованиям, предъявляемым к данному виду продуктов. Образцы № 3Ц5 были схожи по органолептическим показателям и имели хороший внешний вид, приятный вкус и аромат. Различия наблюдались в интенсивности окраски этих образцов, так образец № 3 обладал самой интенсивной красно-розовой окраской, при этом у опытных образцов № 4 и 5 окраска соответствовала традиционной, чуть бледнее - у № 5.

Принимая во внимание, что сыровяленые мясопродукты относятся к группе изделий с длительным периодом хранения, была изучена динамика основных (микробиологических, органолептических, физико-химических) показателей после завершения технологического процесса с целью обоснования сроков хранения продукта при стандартных параметрах (t=42 С; =755 %) согласно методическим указаниям Эпидемиологическая оценка обоснования сроков годности и условий хранения пищевых продуктов МУК 4.2.184704.

Сравнительная оценка органолептических показателей готовых продуктов показала, что образцы с использованием стартовых культур, в том числе импортного производства, имели преимущество перед образцом № 1 в течение всего периода хранения практически по всем сенсорным характеристикам.

Изучение динамики потерь массовой доли влаги и величины рН позволило установить, что в процессе хранения в образцах сыровяленого мясного продукта наблюдалось незначительное изменение рН и влаги (рис. 11Ца и б).

а Изменение массовой доли влаги	б Изменение величины рН
в Динамика накопления перекисных соединений	г Динамика увеличения кислотных чисел

Рис. 11 Исследование образцов сыровяленого мясного продукта в процессе хранения

Снижение величины рН в образцах со стартовыми культурами обусловлено, главным образом, образованием молочной кислоты в результате жизнедеятельности молочнокислой микрофлоры. Снижение рН у образца № 1 можно объяснить деятельностью спонтанной молочнокислой микрофлоры, которая способна образовывать, помимо молочной кислоты, побочные продукты метаболизма (уксусную, масляную кислоты, этиловый спирт и др. вещества), негативно влияющие на органолептические показатели готового продукта. Изменение рН среды до уровня, близкого к изоэлектрической точке мышечных белков, приводит к понижению их гидратации, чем объясняется потеря влаги в процессе хранения образцов мясного продукта.

Исследование процессов окисления липидов показало (рис. 11Цв), что применение стартовых культур из коллекции МГУПП ингибирует развитие окислительных процессов. Это объясняется тем, что используемые в бактериальной композиции микроорганизмы обладают антиоксидантными свойствами, а именно способностью ингибировать автоокисление аскорбиновой кислоты, связывать ионы Fe2+ и Cu2+, штаммы Lactobacillus curvatus 1 и Staphylococcus carnosus 108 обладают СОД-активностью.

Сравнительная оценка выбранных показателей, а также данных микробиологического анализа, позволила сделать заключение, что гарантированное сохранение качества мясных продуктов, изготовленных с использованием бактериальной композиции, может быть обеспечено при хранении в вышеназванных условиях в течение 30 суток.

На основании выполненных исследований обоснована целесообразность использования бактериальной композиции для производства сыровяленого продукта из свинины, технологическая схема представлена на рис. 12. Данные результаты могут быть перенесены и на другие ассортиментные группы ферментированных мясных продуктов.

Комплексная оценка полученных результатов свидетельствует о том, что введение бактериальной композиции при производстве мясного продукта способствует снижению содержания холестерина в продукте на 21,4%, улучшению органолептических и микробиологических показателей. Кроме того, использование денитрифицирующего штамма Staphylococcus carnosus 108 позволит снизить содержание нитрита натрия в рассоле до 0,03%.

Глава 6. Применение системы ХАССП для обеспечения безопасности сыровяленого мясного продукта. Проведен анализ рисков, влияющих на безопасность готового сыровяленого продукта из свинины, и составлен план ХАССП, в котором отражены действия, направленные на снижение рисков.

При разработке плана ХАССП учитывалось влияние бактериальной композиции на снижение рисков в критических контрольных точках технологического процесса сыровяленого продукта из свинины (приготовление и внесение в рассол раствора нитрита натрия (ККТ № 1.1 и 1.2) и сушка (ККТ № 2)). Так, денитрифицирующий штамм Staphylococcus carnosus 108, содержащийся в бактериальной композиции, дает возможность снизить введение нитрита натрия с рассолом до 0,03% и понизить риск в ККТ № 1.1 и 1.2 (приготовление и внесение в рассол раствора нитрита натрия). Кроме того, способность стартовых культур, входящих в состав бактериальной композиции, ингибировать рост санитарно-показательной микрофлоры позволит снизить риски микробиологического характера в ККТ № 2 (сушка).

Следует отметить, для того чтобы повысить скорость и эффективность микробиологического анализа при контроле санитарно-показательной микрофлоры и роста стартовых культур, антагонистов санитарно-показательных микроорганизмов, в ККТ № 2, в контрольной карте ХАССП предлагается использовать современный высокотехнологичный метод ПЦР в реальном времени.

Таким образом, составлен план ХАССП, обеспечивающий контроль и управление за всеми технологическими рисками при производстве сыровяленого продукта из свинины с пониженным содержанием холестерина с учетом влияния бактериальной композиции на снижение рисков в ККТ и применения ПЦР в реальном времени в качестве инструмента для микробиологического контроля.

Рис. 12 Технологическая схема производства сыровяленого продукта из свинины с использованием бактериальной композиции

При расчете экономической эффективности установлено, что за счет экономии на стоимости стартовых культур отечественного производства в сравнении с импортными бактериальными препаратами, а также с учетом социального эффекта от использования бактериальной композиции, дополнительный объем прибыли при производстве сыровяленого продукта из свинины с пониженным содержанием холестерина составит 42193,25 руб. на 1 т готовой продукции. Таким образом, данная технология является экономически целесообразной.

На основании проведенных исследований разработан проект технической документации на сыровяленый продукт из свинины с пониженным содержанием холестерина. Апробация разработанной технологии была проведена в условиях опытной станции ГОУ ВПО МГУПБ и ООО МПЗ Рублевский.

ВЫВОДЫ

1. Разработана бактериальная композиция, содержащая штаммы Lactobacillus curvatus 1, Pediococcus pentosaceus 28 и Staphylococcus carnosus 108 в соотношении 1:1:1, для снижения содержания холестерина при производстве сыровяленого продукта из свинины.

2. Установлено, что способность исследованных стартовых культур снижать уровень холестерина in vitro является штаммоспецифичным признаком. Выявлены штаммы, обладающие максимальными холестеринснижающими свойствами: Lactobacillus curvatus 1, Pediococcus pentosaceus 28 и Staphylococcus carnosus 108, которые сгруппированы в бактериальную композицию с учетом отсутствия антагонизма между ними.

3. Адаптирован метод ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентной схемой детекции для идентификации санитарно-показательной микрофлоры и мониторинга стартовых культур, а именно разработан способ пробоподготовки исследуемых мясных образцов; подобраны методика выделения ДНК и тест-системы для идентификации ДНК микроорганизмов, в т.ч. разработан олигонуклеотидный зонд на 16S рРНК ген для выявления Staphylococcus carnosus.

4. На типовых штаммах стартовых культур и мясном сырье, искусственно обсемененном санитарно-показательной микрофлорой, подтверждены чувствительность и специфичность разработанных тест-систем для идентификации ДНК микроорганизмов методом ПЦР в реальном времени.

5. Показано, что внесение разработанной бактериальной композиции в рецептуру сыровяленого мясного продукта обеспечивает снижение содержания холестерина в продукте на 21,4% за счет метаболических особенностей стартовых культур.

6. Определена целесообразность использования бактериальной композиции при производстве сыровяленого мясного продукта. Установлено, что введение бактериальной композиции позволяет интенсифицировать процесс сушки до 20 сут, а также способствует формированию насыщенного цвета, плотной структуры, придает специфический вкус, аромат готовому продукту, обеспечивает микробиологическую стабильность продукта и замедляет окислительные процессы, при этом гарантированное сохранение качества мясных продуктов обеспечивается в течение 30 суток.

7. Разработан план ХАССП, обеспечивающий контроль и управление за технологическими рисками при производстве сыровяленого продукта из свинины с использованием бактериальной композиции. Показано, что применение метода ПЦР-РВ позволяет проводить своевременный контроль в ККТ № 2 (сушка), а введение бактериальной композиции - повысить микробиологическую безопасность в этой точке. Денитрифицирующий штамм Staphylococcus carnosus 108, содержащийся в бактериальной композиции, дает возможность снизить введение нитрита натрия с рассолом до 0,03% и гарантировать безопасность в ККТ № 1.1 и 1.2 (приготовление и внесение в рассол раствора нитрита натрия).

8. Разработан проект технической документации на производство сыровяленого продукта из свинины с пониженным содержанием холестерина. Апробация технологии была проведена в условиях опытной станции ГОУ ВПО МГУПБ и ООО МПЗ Рублевский.

Научные положения, выносимые на защиту.

• Разработка бактериальной композиции на основе стартовых культур Lactobacillus curvatus 1, Pediococcus pentosaceus 28 и Staphylococcus carnosus 108, эффективно снижающих содержание холестерина в ферментированных мясных продуктах;
• Способ пробоподготовки исследуемых мясных образцов для их анализа методом ПЦР в реальном времени с флуоресцентной схемой детекции для идентификации санитарно-показательной микрофлоры и мониторинга стартовых культур;
• Оценка эффективности влияния разработанной бактериальной композиции на качественные показатели и безопасность сыровяленого продукта из свинины;
• План ХАССП, обеспечивающий контроль и управление за всеми технологическими рисками при производстве сыровяленого продукта из свинины с использованием бактериальной композиции

Соответствие темы диссертации паспорту научной специальности.

Диссертационная работа соответствует пунктам 6, 13 паспорта специальности 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ и пунктам 5, 7 паспорта специальности 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Титов Е.И. Разработка типового плана ХАССП для производства мясного продукта [Текст] / Е.И. Титов, Л.Ф. Митасева, С.В. Колотвина, А.О. Соломко // М.: Все о мясе, 2011. - № 4. - С. 54Ц58.
2. Колотвина С.В. Молекулярно-генетические и физико-химические методы для характеристики санитарно-гигиенического состояния ферментированных мясных продуктов [Текст] / С.В. Колотвина, Н.Г. Машенцева, Е.И. Титов, Л.Ф. Митасева // М.: Биотехнология, 2011. - № 4. - С. 88Ц94.
3. Титов Е.И. Стартовые культуры, снижающие содержание холестерина, в мясных продуктах [Текст] / Е.И. Титов, С.В. Колотвина, Н.Г. Машенцева, А.И.аСемёнышева, Нгуен Тхи Минь Кхань // М.: Мясная индустрия, 2012. - № 2. - С. 22Ц25.
4. Колотвина С.В. Адаптация и оптимизация метода ПЦР в реальном времени для микробиологического анализа мясных продуктов [Текст] / С.В. Колотвина //  М.: Биотехнология, 2012. - № 3. - С. 85Ц91.

Материалы конференций:

5. Абинскова С.В. К вопросу об использовании молекулярных методов при исследовании микробиологической обсемененности мясных продуктов [Текст] / С.В.аАбинскова, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2007. - С. 163Ц165.
6. Абинскова С.В. Использование ПЦР-диагностики в качестве бактериологического анализа мясных продуктов [Текст] / С.В. Абинскова, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, В.В. Колотвин // Материалы международной научно-практической конференции Биотехнология. Вода и пищевые продукты, Москва, 2008. - С. 37.
7. Абинскова С.В. Исследование санитарно-гигиенического состояния мясных продуктов методом ДНК-типирования [Текст] / С.В. Абинскова, Л.Ф. Митасева, Н.Г.аМашенцева, В.В. Колотвин, С.Г. Юзов // Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы VII Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2008. - С. 156Ц158.
8. Титов Е.И. Использование молекулярно-генетических методов при исследовании мясных продуктов в отношении санитарно-гигиенической безопасности [Текст] / Е.И. Титов, Н.Г. Машенцева, Л.Ф. Митасева, В.В. Колотвин, С.В. Абинскова // Тенденции и перспективы развития инновационных и информационных технологий перерабатывающей промышленности. Сборник докладов 11 Международной научной конференции памяти В.М. Горбатова. - М.: ВНИИМП им. В.М. Горбатова, 2008. - С. 138Ц142.
9. Абинскова С.В. Применение молекулярно-генетических методов в качестве контроля безопасности ферментированных мясных продуктов [Текст] / С.В. Абинскова, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, В.В. Колотвин // Материалы Пятого Московского международного конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития, Москва, 2009. - ч. 2. - С. 34Ц35.
10. Абинскова С.В. Использование методов ДНК-типирования при исследовании мясных продуктов в отношении санитарно-гигиенической безопасности [Текст] / С.В. Абинскова, Н.Г. Машенцева, В.В. Колотвин // Материалы I Всероссийской студенческой научной конференции Молодежная наука - пищевой промышленности России, г. Ставрополь: СевКавГТУ, 2009. - С. 3.
11. Абинскова С.В. Использование молекулярно-генетических методов для определения санитарно-гигиенической безопасности продуктов питания [Текст] / С.В.аАбинскова // Химия - 2009: Материалы 15-ой международной выставки химической промышленности и науки. - М.: ЦВК Экспоцентр, 2009. - С. 34Ц35.
12. Абинскова С.В. Альтернативные подходы к бактериологическому анализу мясных изделий [Текст] / С.В. Абинскова, Е.И. Титов // Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания: Материалы Международной научной конференции студентов и молодых ученых. - М.: МГУПБ, 2009. - С. 110Ц112.
13. Абинскова С.В. Применение молекулярно-генетических методов для контроля санитарно-показательной микрофлоры в мясных изделиях [Текст] / С.В.аАбинскова, Е.И. Титов, Н.Г. Машенцева, Л.Ф. Митасева // Материалы Московской международной научно-практической конференции Биотехнология: экология крупных городов, Москва, 2010. - С. 507Ц508.
14. Абинскова С.В. Применение метода ПЦР-диагностики для санитарно-гигиенической оценки мясных продуктов [Текст] / С.В. Абинскова // Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием Молекулярная диагностика - 2010. - М.: ГК Космос, 2010. - Т. 2. - С. 4Ц6.
15. Титов Е.И. Комплексный подход к обеспечению безопасности ферментированных мясных продуктов [Текст] / Е.И. Титов, С.В. Колотвина // Материалы 13-ой Международной научной конференции, посвященной памяти Василия Матвеевича Горбатова и 80-летию ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии Инновационные аспекты переработки мясного сырья и создания конкурентоспособных продуктов питания. - М.: ВНИИМП им. В.М. Горбатова, 2010. - С. 153Ц154.
16. Колотвина С.В. Методика оценки безопасности мясных продуктов на основе видоспецифической ПЦР и ПЦР в реальном времени [Текст] / С.В. Колотвина, Е.И. Титов, Н.Г. Машенцева // Материалы VI Московского международного конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития. - М.: ЗАО Экспо-биохим-технологии, РХТУ им Д.И. Менделеева, 2011. - ч. 2. - С. 140Ц141
17. Колотвина С.В. Комплексный подход к созданию мясных продуктов профилактической направленности, снижающих риск возникновения сердечно-сосудистых заболеваний [Текст] / С.В. Колотвина, Е.И. Титов, Н.Г. Машенцева // Материалы IX международной научной конференции студентов и молодых ученых Живые системы и биологическая безопасность населения. - М.: МГУПП, 2011. - С. 144Ц147.

Изобретения:

18. Патент № 2460801 РФ. Способ выявления санитарно-показательных бактерий и стартовых культур в мясных продуктах [Текст] / Е.И. Титов, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, С.В. Колотвина - заявл. 15.04.2011; опубл. 10.09.2012. Бюл. № 25. - 7 с.

Другие публикации:

19. Рогов И.А. Идентификация санитарно-показательной микрофлоры и стартовых культур в мясных изделиях методами ПЦР в реальном времени и ПЦР с электрофоретической детекцией: учебно-методическое пособие для студентов направления подготовки уровня магистратуры 260200, 110500 [Текст] / И.А. Рогов, Е.И. Титов, Л.Ф. Митасева, Н.Г. Машенцева, С.В. Колотвина // М.: МГУПП, 2012. - 33 с.

Автор выражает искреннюю благодарность за помощь, оказанную в подготовке диссертации д.т.н. Машенцевой Наталье Геннадьевне,

к.т.н. Митасевой Людмиле Филипповне ФГБОУ ВПО МГУПП

Подписано в печать 22.11.2012. Формат 60 х 84 1/16

Усл. печ. л. 1,0. Тираж 150 экз. Заказ № 246

ФГБОУ ВПО Воронежский государственный университет инженерных технологий

(ФГБОУ ВПО ВГУИТ)

Отдел полиграфии ФГБОУ ВПО ВГУИТ

Адрес университета и отдела полиграфии:

394036, Воронеж, пр. Революции, 19

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по техническим специальностям